KR101900582B1 - 만성 통증에 대한 다중프로테아제 치료법 - Google Patents

만성 통증에 대한 다중프로테아제 치료법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 적어도 2 경쇄 엔도펩티다제 도메인을 함유하는 클로스트리듐 신경독소 유도체, 및 이러한 클로스트리듐 신경독소 유도체를 코딩하는 핵산을 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명은 염증성 질병(예컨대 관절염); 만성 통증, 예컨대 신경병증성 통증 및 염증성 통증을 LC/A 엔도펩티다제에 연결된 LC/E-유도된 엔도펩티다제를 갖는 온전한 BoNT/A에서 유도된 것을 포함하는, 이러한 클로스트리듐 신경독소 유도체의 사용을 통해 치료하기 위한 방법 및 조성물을 포함한다.

Description

만성 통증에 대한 다중프로테아제 치료법{MULTIPROTEASE THERAPEUTICS FOR CHRONIC PAIN}
본 발명은 침해수용기 또는 염증의 유도인자로부터 통증 및/또는 염증 매개인자의 엑소사이토시스를 파괴하는 강화된 능력을 가져, 통증을 예방하는 클로스트리듐 신경독소 유도체를 포함하는 방법 및 조성물에 관한 것이다.
클로스트리듐 보툴리늄(Clostridium botulinum)에 의해 생성되는 보툴리늄 신경독소(BoNT) 혈청형 A-G는 시냅스 소포체와 세포막의 융합을 매개하여, 뉴런으로부터 신경전달물질, 통증 펩타이드 및 사이토카인의 Ca2 +-자극된 엑소사이토시스에 필수적인, SNARE("Soluble NSF Attachment Protein Receptor") 단백질을 단백질가수분해적으로 절단하여 말초 신경으로부터 아세틸콜린의 방출을 특이적으로 차단하는 것으로 인해 알려진 가장 강력한 독소이다.
뉴런 전달을 억제하는 클로스트리듐 독소 예컨대 예를 들어 보툴리늄 신경독소(BoNT)(파상풍 독소 TeTx를 비롯하여, BoNT 혈청형 BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F 및 BoNT/G)의 능력은 광범위한 치료 및 미용 분야, 예를 들어 문헌[Ward AB and Barnes MP, Clinical Users of Botulinum Toxins (Cambridge University Press, Cambridge 2007)]에서 활용되고 있다. 예로서, BoNT/A-유도제 보톡스(BOTOX)(등록상표)는 1 이상의 국가에서 다음의 징후 각각에 대해 사용되고 있다: 무이완증, 성인 경직증, 치열, 요통, 안검경련, 이갈이, 경부 근긴장이상증, 본태성 진전, 미간선 또는 과운동성 얼굴선, 두통, 안면 경련증, 방광 과항진증, 다한증, 청소년 뇌성마비, 다발성 경화증, 간대성 근경련증, 비순선, 연축성 발성장애, 사시증 및 VII 신경 질환.
씨. 보툴리늄(C. botulinum)- 및 씨.테타누스(C. tetanus)-유도 독소 이외의 클로스트리듐 독소가 존재하고, 이들에는, 제한 없이, 씨. 퍼프린진스(C. perfringins), 씨. 셉티쿰(C. septicum), 씨 디피실(C. difficile), 씨. 스피로포르메(C. spiroforme), 씨. 부티리컴(C. butyricum) 및 씨. 바라티(C. barati)의 독소가 포함된다. 그러나, 본 명세서에서 "클로스트리듐 독소"에 대한 언급 또는 유사한 언급은 달리 특정하게 또는 개념적으로 언급하지 않으면, 씨. 보툴리늄 아형 및 씨. 테타니 아형의 신경독소를 의미하는 것으로 이해한다.
또한, 클로스트리듐 독소 치료는, 제한 없이, 다음의 병태를 치료하는데 사용하거나 또는 그의 치료를 목적으로 한다:
a) 신경근육 질환, 예를 들어, 다음의 문헌들을 참조한다: Kei Roger Aoki et al., Method for Treating Neuromuscular Disorders and Conditions with Botulinum Toxin Types A and B, 미국 특허 제6,872,397호(2005년 3월 29일); Rhett M. Schiffman, Methods for Treating Uterine Disorders, 미국 공개 특허 출원 제2004/0175399호(2004년 9월 9일); Richard L. Barron, Methods for Treating Ulcers and Gastroesophageal Reflux Disease, 미국 공개 특허 출원 제2004/0086531호(2004년 5월 7일); 및 Kei Roger Aoki, et al., Method for Treating Dystonia with Botulinum Toxin C to G, 미국 특허 제6,319,505호(2001년 11월 20일);
b) 안 질환, 예를 들어 다음의 문헌을 참조한다: Eric R. First, Methods and Compositions for Treating Eye Disorders, 미국 공개 특허 출원 제2004/0234532호(2004년 11월 25일); Kei Roger Aoki et al., Botulinum Toxin Treatment for Strabismus, 미국 공개 특허 출원 제2004/0151740호(2004년 8월 5일); 및 Kei Roger Aoki et al., Botulinum Toxin Treatment for Strabismus, 미국 공개 특허 출원 제2004/0126396호(2004년 7월 1일);
c) 통증, 예를 들어 다음의 문헌을 참조한다: Kei Roger Aoki et al., Pain Treatment by Peripheral Administration of a Neurotoxin, 미국 특허 제6,869,610호(2005년 3월 22일); Stephen Donovan, Clostridial Toxin Derivatives and Methods to Treat Pain, 미국 특허 제6,641,820호(2003년 11월 4일); Kei Roger Aoki, et al., Method for Treating Pain by Peripheral Administration of a Neurotoxin, 미국 특허 제6,464,986호(2002년 10월 15일); Kei Roger Aoki and Minglei Cui, Methods for Treating Pain, 미국 특허 제6,113,915호(2000년 9월 5일); Martin A. Voet, Methods for Treating Fibromyalgia, 미국 특허 제6,623,742호(2003년 9월 23일); Martin A. Voet, Botulinum Toxin Therapy for Fibromyalgia, 미국 공개 특허 출원 제2004/0062776호(2004년 4월 1일); 및 Kei Roger Aoki et al., Botulinum Toxin Therapy for Lower Back Pain, 미국 공개 특허 출원 제2004/0037852호(2004년 2월 26일);
d) 근육 손상, 예를 들어 다음의 문헌을 참조한다: Gregory F. Brooks, Methods for Treating Muscle Injuries, 미국 특허 제6,423,319호(2002년 7월 23일);
e) 두통, 예를 들어 다음의 문헌들을 참조한다: Martin Voet, Methods for Treating Sinus Headache, 미국 특허 제6,838,434호(2005년 1월 4일); Kei Roger Aoki et al., Methods for Treating Tension Headache, 미국 특허 제6,776,992호(2004년 8월 17일); 및 Kei Roger Aoki et al., Method for Treating Headache, 미국 특허 제6,458,365호(2002년 10월 1일); William J. Binder, Method for Reduction of Migraine Headache Pain, 미국 특허 제5,714,469호(1998년 2월 3일);
f) 심혈관 질환, 예를 들어 다음의 문헌을 참조한다: Gregory F. Brooks and Stephen Donovan, Methods for Treating Cardiovascular Diseases with Botulinum Toxin, 미국 특허 제6,767,544호(2004년 7월 27일);
e) 신경학적 질병, 예를 들어 다음의 문헌들을 참조한다: Stephen Donovan, Parkinson's Disease Treatment, 미국 특허 제6,620,415호(2003년 9월 16일); 및 Stephen Donovan, Method for Treating Parkinson's Disease with a Botulinum Toxin, 미국 특허 제6,306,403호(2001년 10월 23일);
g) 신경정신장애 , 예를 들어 다음의 문헌들을 참조한다: Stephen Donovan, Botulinum Toxin Therapy for Neuropsychiatric Disorders, 미국 공개 특허 출원 제2004/0180061호(2004년 9월 16일); 및 Steven Donovan, Therapeutic Treatments for Neuropsychiatric Disorders, 미국 공개 특허 출원 제2003/0211121호(2003년 11월 13일);
f) 내분비계 질환, 예를 들어 다음의 문헌들을 참조한다: Stephen Donovan, Method for Treating Endocrine Disorders, 미국 특허 제6,827,931호(2004년 12월 7일); Stephen Donovan, Method for Treating Thyroid Disorders with a Botulinum Toxin, 미국 특허 제6740321호(2004년 5월 25일); Kei Roger Aoki et al., Method for Treating a Cholinergic Influenced Sweat Gland, 미국 특허 제6,683,049호(2004년 1월 27일); Stephen Donovan, Neurotoxin Therapy for Diabetes, 미국 특허 제6,416,765호(2002년 7월 9일); Stephen Donovan, Methods for Treating Diabetes, 미국 특허 제6,337,075호(2002년 1월 8일); Stephen Donovan, Method for Treating a Pancreatic Disorder with a Neurotoxin, 미국 특허 제6,261,572호(2001년 7월 17일); Stephen Donovan, Methods for Treating Pancreatic Disorders, 미국 특허 제6,143,306호(2000년 11월 7일);
g) 암, 예를 들어, 다음의 문헌들을 참조한다: Stephen Donovan, Methods for Treating Bone Tumors, 미국 특허 제6,565,870호(2003년 5월 20일); Stephen Donovan, Method for Treating Cancer with a Neurotoxin to Improve Patient Function, 미국 특허 제6,368,605호(2002년 4월 9일); Stephen Donovan, Method for Treating Cancer with a Neurotoxin, 미국 특허 제6,139,845호(2000년 10월 31일); 및 Mitchell F. Brin and Stephen Donovan, Methods for Treating Diverse Cancers, 미국 공개 특허 출원 제2005/0031648호(2005년 2월 10일);
h) 귀 질환, 예를 들어 다음의 문헌들을 참조한다: Stephen Donovan, Neurotoxin Therapy for Inner Ear Disorders, 미국 특허 제6358926호(2002년 3월 19일); 및 Stephen Donovan, Method for Treating Otic Disorders, 미국 특허 제6265379호(2001년 7월 24일);
i) 자율신경계 질환, 예를 들어 다음 문헌을 참조한다: Pankai J. Pasricha and Anthony N. Kalloo, Method for Treating Gastrointestinal Muscle Disorders and Other Smooth Muscle Dysfunction, 미국 특허 제5,437,291호(1995년 8월 1일);
j) 다른 질병, 예를 들어 다음의 문헌들을 참조한다: William J. Binder, Method for Treatment of Skin Lesions Associated with Cutaneous Cell-proliferative Disorders, 미국 특허 제5,670,484호(1997년 9월 23일); Eric R. First, Application of Botulinum Toxin to the Management of Neurogenic Inflammatory Disorders, 미국 특허 제6,063,768호(2000년 5월 16일); Marvin Schwartz and Brian J. Freund, Method to Reduce Hair Loss and Stimulate Hair Growth, 미국 특허 제6,299,893호(2001년 10월 9일); Jean D. A. Carruthers and Alastair Carruthers, Cosmetic Use of Botulinum Toxin for Treatment of Downturned Mouth, 미국 특허 제6,358,917호(2002년 3월 19일); Stephen Donovan, Use of a Clostridial Toxin to Reduce Appetite, 미국 공개 특허 출원 제2004/40253274호(2004년 12월 16일); 및 Howard I. Katz and Andrew M. Blumenfeld, Botulinum Toxin Dental Therapies and Procedures, 미국 공개 특허 출원 제2004/0115139호(2004년 6월 17일); Kei Roger Aoki, et al., Treatment of Neuromuscular Disorders and Conditions with Different Botulinum, 미국 공개 특허 출원 제2002/0010138호(2002년 1월 24일); 및 Kei Roger Aoki, et al., Use of Botulinum Toxins for Treating Various Disorders and Conditions and Associated Pain, 미국 공개 특허 출원 제2004/0013692호(2004년 1월 22일).
하기 표 2는 다양한 현재 알려진 보툴리늄-관련(BoNT 및 TeTX) 클로스트리듐 독소의 아이소타입의 아미노산 서열을 제공한다. 이들 독소는 최소 대략 35%의 아미노산 동일성을 서로 보유하고 동일한 일반적인 기능적 도메인 구성 및 전반적인 구조적 구성을 공유한다. 천연 유래 클로스트리듐 독소는 각각 대략 150 kDa의 단일 사슬 폴리펩타이드로 번역되어서 이후에 천연 유래 프로테아제, 예컨대 내생성 클로스트리듐 독소 프로테아제 또는 환경에서 생산되는 천연 유래 프로테아제에 의하여 다이설파이드 루프내에서 단백질가수분해적 분할(proteolytic scission)에 의해 절단된다. 이러한 번역 후 프로세싱은 단일 사슬간 다이설파이드 결합 및 비공유적 상호작용에 의해 함께 유지되는 대략 50 kDa 경쇄(LC) 및 대략 100 kDa 중쇄(HC)를 포함하는 성숙한 이중 사슬 분자를 산출한다.
각각의 성숙한 이중 사슬 클로스트리듐 독소 분자는 다음의 3가지 기능적으로 구별되는 도메인을 포함한다: 1) 시냅스 소포체와 세포막의 융합을 매개하는 1 이상의 SNARE 단백질을 특이적으로 표적화하는 아연-의존적 엔도펩티다제 활성 함유 메탈로프로테아제 영역을 포함하는 LC에 위치된 효소 도메인; 2) 엔도솜에서 표적 세포의 세포질로 적어도 독소의 LC 사슬 방출을 촉진하는 H 사슬의 아미노 말단 절반("HN"이라고 함) 내에 함유된 전좌 도메인; 및 3) 독소의 결합 활성 및 결합 특이성을 결정하는 H 사슬의 카복실-말단 절반(HC) 내에 존재하는 결합 도메인.
HC는 HCN 및 HCC 서브 도메인(각각 HC의 N-말단부 및 C-말단부)을 포함한다. 대부분 또는 모든 BoNT/X 독소가 "이중 수용기"를 사용해 표적에 결합하는데, 여기서 HCN 및 HCC 서브도메인 둘 모두를 포함하는 독소의 HC 부분이 일정 세포 표면 강글리오시드 및 단백질 수용기(아마도 당화됨)에 결합하고; 단백질 수용기의 결합이 세포 내 독소의 국재화를 촉진한다는 실질적인 증거가 이제 존재한다. "X"는 보툴리늄 독소의 임의 혈청형을 의미한다. 용어 "BoNT/X"가 대체로 보툴리늄 독소의 아형을 의미하고자 사용되지만, 이 용어는 또한 이의 TeTX 영역을 포함한다. HCC는 표적 세포의 표면에 위치하는 수용기 복합체에 결합한다.
이들 독소의 각 혈청형의 아형 또는 종류가 존재함을 이해할 것이며, 이들은 표시된 독소 또는 독소 도메인의 동일성 또는 활성 특징에 실질적인 변화없이, 그들의 아미노산 서열, 특히(독점적이지는 않음) 중요치 않은 영역(소위 "가변" 영역)에서 어느 정도 가변적일 수 있다.
아래 표 1에서, 표준 1글자 및 3글자 아미노산 코드를 제공한다:
아미노산 3글자 코드 1글자 코드
알라닌 Ala A
아르기닌 Arg R
아스파라긴 Asn N
아스파르트산 Asp D
아스파라긴 또는 아스파르트산 Asx B
시스테인 Cys C
글루탐산 Glu E
글루타민 Gln Q
글루타민 또는 글루탐산 Glx Z
글리신 Gly G
히스티딘 His H
아이소류신 Ile I
류신 Leu L
리신 Lys K
메티오닌 Met M
페닐알라닌 Phe F
프롤린 Pro P
세린 Ser S
트레오닌 Thr T
트립토판 Try W
티로신 Tyr Y
발린 Val V
클로스트리듐 독소 기준 서열 및 영역(아미노에서 카복시 방향으로 식별; 아미노산 번호에서 아미노산 번호)
독소 서열번호 LC HN HC
BoNT/A 7 M1-K448 A449-K871 N872-L1296
BoNT/B 8 M1-K441 A442-S858 E859-E1291
BoNT/C1 9 M1-K449 T450-N866 N867-E1291
BoNT/D 10 M1-R445 D446-N862 S863-E1276
BoNT/E 11 M1-R422 K423-K845 R846-K1252
BoNT/F 12 M1-K439 A440-K864 K865-E1274
BoNT/G 13 M1-K446 S447-S863 N864-E1297
TeNT 14 M1-A457 S458-V879 I880-D1315
당분야의 숙련가(이하 "당업자"라 약칭함)는 상기 도시한 아미노산 서열(또는 이들 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열)에 변이를 갖는 클로스트리듐 아형 독소 변이체가 자연계에 존재할 수 있음을 인식한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "천연 유래 클로스트리듐 도메인 변이체"는, 제한 없이, 교대식 슬라이싱된 전사체에서 생산된 클로스트리듐 도메인 이소폼, 자발적 돌연변이에 의해 생산된 클로스트리듐 도메인 이소폼 및 클로스트리듐 도메인 아형을 포함하는, 천연 유래적 프로세스에 의해 생산된 임의의 클로스트리듐 도메인(엔도펩티다제, 전좌, 및/또는 결합 도메인)을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 천연 유래 클로스트리듐 도메인 변이체는 천연 유래 클로스트리듐 도메인 변이체가 기반으로 하는 기준 클로스트리듐 도메인과 실질적으로 동일한 방식으로 기능하고, 본 발명의 임의 측면의 기준 클로스트리듐 도메인에 대해 치환될 수 있다.
천연 유래 클로스트리듐 도메인 변이체는 천연 유래 클로스트리듐 도메인 변이체가 기반으로하는 기준 클로스트리듐 도메인의 1개 이상의 아미노산, 2개 이상의 아미노산, 3개 이상의 아미노산, 4개 이상의 아미노산, 5개 이상의 아미노산, 10 이상의 아미노산, 20 이상의 아미노산, 30개 이상의 아미노산, 40개 이상의 아미노산, 50개 이상의 아미노산 또는 100개 이상의 아미노산이 치환될 수 있다. 천연 유래 클로스트리듐 도메인 변이체는 또한 천연 유래 클로스트리듐 도메인의 생물학적 또는 생화학적 활성이 실질적으로 보존되는 한, 천연 유래 클로스트리듐 도메인 변이체가 기반으로 하는 기준 클로스트리듐 도메인과 적어도 50% 아미노산 동일성, 65% 아미노산 동일성, 75% 아미노산 동일성, 85% 아미노산 동일성 또는 95% 아미노산 동일성을 보유하는, 천연 유래 클로스트리듐 도메인 변이체를 기반으로 하는 기준 클로스트리듐 도메인에서 적어도 10개의 인접한 아미노산, 적어도 15개의 인접한 아미노산, 적어도 20개의 인접한 아미노산, 또는 적어도 25개의 인접한 아미노산을 치환할 수 있다. 도메인의 특징적인 기능 및 동일성이 실질적으로 변경되지 않는한 보존성 아미노산 삽입 및 결실이 또한 만들어질 수 있음을 이해할 것이다.
유전자 코드의 축퇴성으로 인해, 당업자라면 이들 아미노산 서열이 상이하지만, 확정된, 뉴클레오타이드 서열을 갖는 상이한 DNA 분자의 유한한 세트에 의해 코딩될 수 있음이 이해된다. 예를 들어, 소정 펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 축퇴성 뉴클레오타이드 서열은 특정 숙주 세포에서 발현을 선호하도록 조정되거나 또는 선택된 상이한 코돈을 가질 수 있다. 이러한 정보를 사용하여, 선택된 숙주 세포 내에서의 후속 발현 및 적합한 발현 벡터로 삽입된, 추가의 핵산 서열과 함께 또는 단독으로, 이들 아미노산 도메인-코딩 영역의 임의의 조합을 포함하는 핵산 분자의 어셈플리를 위해 발현가능한 오픈 핵산 리딩 프레임을 구축할 수 있다. 예를 들어, 국제 공개 특허 출원 WO01/14570은 이러한 방법을 사용하여 단일 사슬의, 절단가능한 재조합 개질 또는 미개질 클로스트리듐 신경독소 유도체 및 이의 키메라 및 하이브리드 형태를 제조하는 방법을 개시한다. 발현가능한 재조합 신경독소 및 이의 유도체를 제조하는 방법을 개시하는 추가의 공개물은 미국 특허 제5,989,545호; 제6,203,794호; 제6,395,513호; 미국 공개 특허 출원 제2003/0166238호; 제2002/169942호; 제2004/176299호; 제2004/126397호; 제2005/035730호; 제2005/068494호; 제2006/011966호; 국제 공개 특허 출원 W095/32738; WO 99/55359; W096/33273; W098/07864; W099/17806; WO98/07864; WO02/44199; WO02/40506, 및 2012년 10월 4일 출원된, 미국 특허 출원 제13/644,386호를 포함한다. 이들 및 모든 다른 특허, 특허 공고, 및 이 특허 출원에 인용된 비특허 간행물은 이와 같이 특이적으로 언급된 것과 무관하게, 개별적으로 본 명세서의 일부로서 참조하여 본원에 편입한다.
재조합 DNA 기술의 사용은 천연 유래 독소 아형 및 이의 일종과 상이하거나 또는 개질된 기능적 특성을 갖는 개질된 클로스트리듐 신경독소의 제작을 가능하게 한다.
예를 들어, 천연 신경독소 경쇄의 천연 유래 아미노산 서열의 변경 및/또는 상이한 치료적 모이어티의 부가는 뉴런 내에 치료제를 운반하도록 디자인된 수송 단백질의 제작을 가능하게 한다. 미국 특허 제6,203,794호(본 명세서에 참고로 편입됨)를 참조한다.
표적화(세포-결합) 도메인의 변경은 독소가 췌장 세포, 예컨대 선포 세포 내로 수송되게 하여서, 이러한 세포에 의한 활성화된 소화 효소의 분비를 방지하게 하거나, 예컨대 미국 특허 제6,843,998호(본 명세서에 참고로 편입됨)를 참조하거나, 또는 감각 구심성 뉴런 내로 수송되게 하여서, 신경전달물질, 사이토카인 및 통증 펩타이드 방출을 방지하여서 통증 경감을 제공하게 된다. 미국 특허 제6,395,513호(본 명세서에 참고로 편입시킴)를 참조한다.
또한, 미국 특허 제7,422,877호(본 명세서에 참고로 편입됨)는 예를 들어, 하나의 신경독소 아형, 예를 들어 BoNT/A의 결합 도메인 및 전좌 도메인(또는 이의 개질형), 및 다른 신경독소 아형, 예를 들어 BoNT/E의 경쇄 영역을 포함하는 키메라 신경독소 유도체의 생성을 개시한다. 신경독소 아형 간의 일반적인 구조적 상동성을 고려하면, 3종의 기본적인 클로스트리듐 신경독소 도메인의 임의의 조합을 단일 아미노산 사슬(또는 절단된 이중 사슬 분자)에 만들 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 예를 들어, 임의의 신경독소 아형 A, B, C1, D, E, F, G, 또는 TeTX 유래의 결합 도메인은 신경독소 아형 A, B, C1, D, E, F, G, 또는 TeTX 유래의 전좌 도메인과 독립적으로 조합될 수 있고, 임의의 신경독소 아형 A, B, C1, D, E, F, G 또는 TeTX 유래의 엔도펩티다제 도메인과 독립적으로 더욱 조합될 수 있다. 이는 예를 들어, 재조합 구축 및 이후 이중사슬 독소를 생성하게 절단되는 단일 키메라 사슬의 발현에 의해서, 또는 단일 H 및 L 사슬의 개별 발현과, 이후 예를 들어 사슬간 다이설파이드 결합의 생성에 의해 조합시킨 후 정제하는 것에 의해 수행된다. 또한, 이러한 기술을 사용하여, 다양한 도메인의 활성을 변경(예를 들어, 돌연변이를 LC 도메인에 도입시켜 LC의 프로테아제 활성을 파괴시킬 수 있음)시키거나, 또는 천연 유래 도메인을 예를 들어, BoNT/A의 HC 도메인(또는 이의 일부분)을 돌연변이 또는 결실시키고 표적화 리간드(TL)를 덧붙이는, 본원 어딘가에 기술된 바와 같이, 다른 모이어티로 치환시킬 수 있다.
각각의 클로스트리듐 신경독소 아형의 3가지 일반적인 신경독소 도메인(결합, 전좌 및 엔도펩티다제)을 설명시, 클로스트리듐 신경독소 연구는 잘 발전된 분야이고, 이들 도메인 각각을 포함하는 아미노산 서열과 그들 기능의 상관성이 잘 알려져 있음을 이해할 것이다. 이들 용어 각각("전좌 도메인", "결합 도메인", 및 "프로테아제", "엔도펩티다제", "LC" 또는 "경쇄" 도메인)에 대한 언급은 표 2에 언급된 서열번호 7 내지 14에 열거된 클로스트리듐 신경독소 아형의 임의의 아미노산 서열에 함유된 상응하는 도메인을 비롯하여 이들 서열 또는 이들 서열 내의 도메인의 보존적 개질 및 최적화 변이체를 포함하는 것으로 이해해야 한다.
부가적으로, 이들 일반적 도메인의 서브도메인으로의 세분화도 알려 있다. 예를 들어, 결합 도메인 HC의 서브도메인 HCN(BoNT/A의 대략 아미노산 871-1091에 상응하는, 도메인의 아미노산 말단부) 및 HCC(BoNT/A의 대략 아미노산 1092-1296에 상응하는, HC 도메인의 카복실 말단부)가 역시 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Lacy DB and Stevens RC, Sequence Homology and Structural Analysis of the Clostridial Neurotoxins, 1999, J. Mol. Biol. 291:1091-1104]을 참조한다. 서브도메인 HCN은 보툴리늄 독소 아형 중에서 고도로 보존되어 있지만, 그의 기능에 대해서는 거의 알려진 바가 없다. HCC 서브도메인은 덜 보존적이다.
부가적으로, 이들 도메인 및 서브도메인 각각의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열은 잘 알려져 있으며, 본 명세서에 개시하였고, 따라서, 본원과 유전자 코드의 지식을 조합하여 사용해서, 발현시키려는 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 만들 수 있다. 물론, 표시된 폴리펩타이드를 코딩하는 다른 뉴클레오타이드 서열을 즉시 상상하는 것은, 본 명세서의 관점에서 당업자에게는 일상적인 일이다. 또, 유전자 코드의 중복성 덕분에, 유한한 수의 뉴클레오타이드 서열이 각 폴리펩타이드에 대해 가능하다. 또한, 기준 서열과 10%, 8%, 또는 5%를 넘지 않는 염기쌍 차이를 함유하는 상동성 영역에서 이들 뉴클레오타이드 서열(또는 그들의 고유한 부분)의 보존적 개질 변이체를 함유하는 핵산을 합성할 수 있음은 명확하다.
또한, 표 2 및 본 명세서 또는 관련된 서열 목록에 기재된 아미노산 서열은 이들 아미노산 서열 및 이의 표시된 영역을 코딩하는 임의의 그리고 모든 뉴클레오타이드 서열의 완전한 개시를 제공함을 이해한다. 주어진 신경독소 아형의 엔도펩티다제 도메인, 전좌 도메인 또는 결합 도메인을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 표 2 또는 다른 곳에 열거된 임의의 이러한 기준 아미노산 서열 영역과 각각 60% 또는 그 이상, 65% 또는 그 이상, 또는 70% 또는 그 이상, 또는 75% 또는 그 이상, 또는 80% 또는 그 이상, 또는 85% 또는 그 이상, 또는 90% 또는 그 이상, 또는 95% 또는 그 이상, 또는 100% 동일성을 가질 수 있다.
보툴리늄 신경독소는 전구체 복합체라고도 알려진, 헤마글루티닌 복합체를 형성하도록 신경독소와 비공유적으로 회합되는 1 이상의 비독소 "신경독소 회합 단백질" 또는 NAP를 역시 생산하는 클로스트리듐 세포에 의해 발현된다. 이들 NAPS는 오염된 음식으로 섭취 시 신경독소가 장에서의 프로테아제 분해에 저항하도록 돕는다.
NAP 단백질은 3종의 헤마글루티닌(HA) 단백질(HA1, HA2 및 HA3), 및 비독소, 비헤마글루티딘 단백질(NTNH)을 포함한다. BoNT 유형 A2, E 및 F는 HA 유전자를 갖지 않으며, BoNT 및 NTNH를 포함하는 12S(약 300 kDa) 복합체만을 생산한다. "S"는 원심분리 침강률 단위인, 스베드버그 단위를 나타낸다. 유형 B, C 및 D는 12S 및 16S(약 500 kDa) 복합체를 생산하고; 16S 복합체는 BoNT, NTNH, HA1, HA2 및 HA3을 생산한다. 유형 A1은 12S 및 16S 복합체와 16S 복합체의 이량체를 나타내는, 약 900 kDa의 19S 복합체를 갖는다.
현재, BoNT/A1- 및 /B-헤마글루티닌 복합체는 이러한 임상적 용도에 대해 승인되었다. BoNT/A1 복합체의 치료적 유익은 뉴런에서의 보다 긴 수명을 갖는 그 프로테아제 덕분에 BoNT/B보다 더 지속적이다.
상기 언급한 바와 같이, BoNT는 단일 공유 다이설파이드 결합 및 부가적인 비공유 결합을 통해 중쇄(HC)에 연결된 경쇄-회합된 프로테아제 도메인(LC)으로 이루어진다. HC의 카복시 말단(C-말단) 모이어티(HC)는 운동, 자율신경 및 감각 뉴런을 포함하는, 다양한 신경 유형에서 발현되는 그의 특이적 억셉터에 결합한다. 표적 세포에 결합하면 BoNT 분자는 엔도사이토시스에 의해 소포체로 수송되고, HC의 아미노 말단(N-말단) 절반(HN)은 '엔도솜-유사' 막 소포체로부터 세포질로 LC가 전좌될 수 있게 하는 채널을 형성한다. 그 이후, LC는 특이적 SNARE 단백질 기질을 절단하여서, 소포체-막 융합을 매개하는 SNARE의 능력을 파괴하여, 세포로부터의 신경전달물질, 사이토카인 및 통증 펩타이드를 방출한다.
다양한 BoNT 혈청형의 LC는 유사하지만, 동일하지 않고, 2종의 상이한 LC는 상이한 SNARE 단백질을 절단하거나, 또는 동일한 SNARE 단백질을 다르게 절단한다. 예를 들어, LC/A, LC/C, 및 LC/E는 SNAP-25를 절단하고; LC/B, LC/D, LC/F, 및 LC/G는 시냅토브레빈-2(VAMP-2)를 절단하며; 부가적으로, LC/C는 세포 분할에 필요한 것으로 보고된, 다른 SNARE 단백질인, 신택신을 절단한다. TeTx의 LC는 VAMP-2를 절단한다. 각 혈청형의 LC는 분자의 고유한 위치에서 그들의 기질을 절단한다.
예를 들어, BoNT/A의 경쇄(LC/A)는 SNAP-25의 C-말단으로부터 9 아미노산을 제거하는 반면, LC/E는 추가의 17 C-말단 잔기를 결실시키며, 따라서 안정한 SNARE 복합체를 탈안정화시켜 신경-엑소사이토시스의 보다 파괴적인 차단을 일으킨다(Meng et al., 2009; Wang et al., 2011). 예를 들어, LC/A에 의한 신경전달물질 방출 억제는 일반적으로 높은 Ca2+ 유입에 의해 반전될 수 있지만, LC/E의 경우는 그렇지 않은데, 아마도 SNAP-25 기질의 보다 큰 파괴에 기인하는 듯하다. 그러나, LC/E에 의한 활성의 보다 큰 "강인성"에도 불구하고, LC/E가 단지 단기의 일시적 신경근 마비를 유도하기 때문에, 그의 임상적 분야는 제한적이다.
신규한 특성을 갖는 치료제를 생성시키는 것이 매우 바람직하다. 예를 들면, 1 이상의 혈청형에서 유도된 2 이상의 경쇄 엔도펩티다제를 각 경쇄가 활성적이고 그의 기질 SNARE 단백질의 상이한 아미노산 서열을 인식하는 BoNT 또는 TeTx 유도체와 조합시킨 치료제를 만성 통증, 만성 염증성 병태(관절염 포함), 및 사이토카인 방출 포함 병태와 같은 병태를 표적화하도록 디자인할 수 있다.
일례에서, LC/A의 장기 지속 작용과 조합한 LC/#의 강력한 프로테아제를 조합시킨 치료제를 디자인한다. 이는 긴장성 두통/편두통, 만성 염증성 질환 예컨대 관절염을 포함한, 만성 통증을 치료하기 위한 BoNT/A의 효능을 개선시키는데 특히 중요한데 BoNT/A 복합체 그 자체는 전부가 아닌, 일부 이러한 환자에서 효과적인 것으로 확인되었기 때문이다. 예를 들어, 문헌[Naumann M. et al. (2008) Assessment: Botulinum Neurotoxin In The Treatment Of Autonomic Disorders And Pain(An Evidence-Based Review): Report Of The Therapeutics And Technology Assessment Subcommittee Of The American Academy Of Neurology, Neurology 70:1707-1714](본 명세서에 참고로 편입됨)을 참조한다. 통증-관련 인자 예컨대 통증 단백질 및 사이토카인의 엑소사이토시스의 차단은 만성 통증, 신경병증성 통증 및 염증성 병태를 치료하는데 유용한 것으로 입증되었다.
BoNT/A는 통증의 대부분의 형태의 신호전달에 관여하는 양이온 채널인 TRPV1(transient receptor potential vallinoid 1)을 활성화시켜 유발시 감각 뉴런으로부터 통증-자극성 펩타이드[예를 들어, 칼시토닌 유전자-관련 펩타이드(CGRP) 및 기질 P]의 엑소사이토시스 방출을 차단할 수 없다(Meng et al., 2007; Meng et al., 2009).
BoNT/E는 또한 그의 세포 표면 억셉터(당화된 시냅스 소포체 단백질 2A(SVP2A) 및 당화 SVP2B)가 감각 뉴런에 부재하거나 또는 드물기 때문에, 감각 뉴런으로부터 CGRP 및 기질 P의 캡사신-자극된, TRPV1-매개 방출을 억제하는데 실패하였다. 그러나, BoNT/E의 HC(수용기-결합 도메인)를 BoNT/A의 그의 대응부로 치환시킨 키메라 단백질이 이들 통증-매개 펩타이드의 방출을 차단할 수 있어, BoNT/A 세포 표면 수용기가 침해수용성 C-섬유로 LC/E의 엔도사이토시스 및 전달을 촉진시킴을 시사한다.
뉴런 내부에 있으면, LC/E 프로테아제는 26 SNAP-25 아미노산 잔기를 제거하여서, 신경-엑소사이토시스에 필요한 안정한 SNARE 복합체의 형성을 방해한다(Meng et al., 2009). LC/A도 SNAP-25를 절단하지만, 오직 9 아미노산 잔기를 제거하고, 엑소사이토시스 활성의 차단이 덜 완전하고 덜 안정적이다.
LC/E 프로테아제의 이러한 유리한 특징을 임상적으로 활용하도록 실현시키기 위해서, 그의 작용 지속기간을 상당히 연장시키는 것이 바람직하다.
도 1은 2종의 활성 프로테아제를 함유하는, 복합 신경독소 LC/E-BoNT/A를 생성하기 위해, 링커를 통해 BoNT/A의 N-말단 LC/a 모이어티에 연결된 활성화 LC/E를 코딩하는 유전자 구성체를 생성시켜 복합 신경독소를 생성시키는 것에 대한 개략도이다.
도 2A는 His6 태그(서열번호 15)에 대해 높은 선별도를 갖는 Co2+-충전된 아가로스 레진인, 탈론(Talon)(등록상표) 수퍼플로우 레진(Clonetech Laboratories, Inc.에 의해 제조)을 사용해, 고정된 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC)에 의한 His6-태그된(서열번호 15로 개시된 "His6") LC/E-BoNT/A 구성체의 정제를 보여주는 SDS-PAGE 전기영동 사진이다.
도 2B는 양이온-교환 크로마토그래피를 수행한 후 모아진 LC/E-BoNT/A-함유 IMAC 분획의 용리 프로파일에서 시간에 따른 흡광도 및 전도도를 도시한다.
도 3은 이중-사슬 독소를 생성하고 His6(서열번호 15) 태그를 제거하기 위해 바이오틴화된 트롬빈으로 정제된 LC/E-BoNT/A를 처리한 것을 보여주는 SDS-PAGE 전기영동의 사진이다. 심볼 + 및 -는 각각 LC/E-LC/A 및 HC/A 사슬을 연결하는 다이설파이드 결합을 환원시키기 위한 시약 디티오트레이톨(DTT)을 처리하거나 또는 처리하지 않음을 의미한다.
도 4는 BoNT/A(상부 겔) 및 LC/E-BoNT/A(하부 겔)의 일련의 희석물을 배양된 래트 소뇌 과립 뉴런(CGN)에서 SNARE 단백질 SNAP-25를 절단하는 그 능력에 대해 검정한 웨스턴 블롯 사진이다.
도 5는 최대 내성 용량(TDmax)을 시간 길이(일수)에 따라 플롯팅한, LC/E-BoNT/A, BoNT/E 또는 BoNT/A를 주사한 비장근의 근육 마비 지속기간을 보여준다.
도 6A는 LC/E-BoNT/A의 연속 희석물을 래트 TGN(trigeminal ganglion neurons)과 밤새 항온반응시킨 후, 용해물을 신택신이 아닌 SNAP-25(LC/E에 의해 생산된 주로 26 잔기 절단된 SNAP-25 절단 산물을 생성시킴)를 절단하는 LC/E-BoNT/A의 능력에 대해 항-SNAP-25 및 항-신택신 항체를 사용해 검정한 웨스턴 블롯의 사진이다.
도 6B는 a) SNAP-25의 절단 및 래트 TGN에서 b) 60 mM KCl 또는 c) 캡사이신에 의해 야기된 CGRP 방출의 억제, 및 BoNT/A와 항온반응한 TGN에서 캡사이신에 의해 야기된 CGRP 방출을 유의하게 감소시키는 BoNT/A의 실패를 보여주는 LC/E-BoNT/A에 의한 용량 반응 곡선이다.
도 7A는 염수, BoNT/A 또는 LC/E-BoNT/A로 처리한 후, 냉(4℃) 플레이트에 발을 위치시키고, 플레이트로부터 래트가 그 발을 후퇴시키는데 요구되는 시간을 측정하여, 수술 전 4일부터 수술 후 약 21일까지 수행된, 동물에 대한, 분지 신경 손상(SNI; Spared Nerve Injury) 시험으로, 래트 모델에서 항-침해수용 활성의 지속기간을 나타낸 그래프이다.
도 7B는 염수, BoNT/A 또는 LC/E-BoNT/A로 처리한 후, 뒷다리의 발바닥 면 상에 보정된 본 프레이 헤어의 적용에 대한 감수성에 의해 유도된 알로다니아를 측정하여, 수술전 4일부터 수술후 약 21일까지 수행된, 동물에 대한 분지 신경 손상(SNI) 시험으로, 래트 모델에서 항-침해수용 활성의 지속기간을 나타낸 그래프이다.
도 8A는 본 발명의 이중-프로테아제 폴리펩타이드의 개략도이다. 이 폴리펩타이드는 2종의 상이한 SNARE 단백질을 불활성화시킨다: LC/B에 의한 VAMP 및 LC/A에 의한 SNAP-25. 합성 LC/B 유전자를 링커 서열("DI" 잔기를 코딩)을 통해 BoNT/A의 5-말단과 융합시켜, 복합 신경독소 LC/B-BoNT/A를 생성시켰다. 후자는 또한 2 트롬빈 인식 서열을 함유한다.
도 8B는 탈론(등록상표) 수퍼플로우 레진(Clontech laboratories, Inc.에서 제조)을 사용하는, IMAC에 의한 His6-태그된 LC/B-BoNT/A의 정제를 보여주는 쿠마시 블루 염색된 SNS-PAGE 겔이다.
도 8C는 이중-사슬(DC) 독소를 생성시키기 위해 바이오틴화된 트롬빈을 처리한 후 IMAC-정제된 LC/B-BoNT/A의 SDS-PAGE이다. 심볼 + 및 -는 각각 환원제 디티오트레이톨(DTT) 처리 또는 무처리를 나타낸다.
도 8D는 LC/B-BoNT/A의 연속 희석물을 래트 CGN과 37℃에서 24시간 동안 항온반응시킨 SDS-PAGE 겔의 웨스턴 블롯을 도시한다. 이후 용해물은 2 SNARE 단백질 SNAP-25 및 VAMP 2의 독소 절단을 모니터링하기 위해 항-SNAP-25 및 항-VAMP 2 항체를 사용해 검정하였다. 그의 특이적 항체에 의해 입증되고 LC/B 또는 LC/A에 의해 인식되지 않은 신택신 1이 내부 로딩 대조군으로 작용하였다.
도 8E는 고농도의 LC/B-BoNT/A 구성체에서 SNAP-25(직사각형) 및 VAMP 2(역삼각형)의 절단을 보여주는 LC/B-BoNT/A에 대한 용량/반응 곡선을 도시한다.
도 9는 다중-SNARE 절단 치료 후보물이 SNARE 단백질의 모든 3가지 주요 유형을 불활성화시키는 능력을 갖는 본 발명의 다른 예이다: LC/C1에 의한 SNAP-25 및 신택신 1-3 및 LC/D에 의한 VAMP1-3. DI는 LC/D와 LC/C1 사이의 링커이다.
도 10A는 염수, PK(GMP-순응성 LC/E-BoNT/A), 또는 프리가발린을 처리한 후 본 프레이 필라멘트로 발바닥을 자극하고 래트가 그 발바닥을 후퇴시키는 물리적 한계치(mechanical threshold)를 측정하여, 수술전 4일부터 수술 후 약 21일까지 수행된, 동물에 대한 분지 신경 손상(SNI) 시험인, 래트 모델에서 항-침해수용 활성의 지속기간에 대한 그래프를 도시한다.
도 10B는 염수, PK(GMP 순응성 생산에 적합화된 프로세스를 사용해 제작된 LC/E-BoNT/A), 또는 프리가발린을 처리한 후, 발바닥을 냉(4℃) 플레이트에 위치시키고 래트가 그 발바닥을 플레이트에서 후퇴시키는데 요구되는 시간을 측정하여, 수술전 4일부터 수술 후 약 21일까지 수행된, 동물에 대한 분지 신경 손상(SNI) 시험인, 래트 모델에서 항-침해수용 활성의 지속기간에 대한 그래프를 도시한다.
도 11은 염수 또는 PK(GMP 순응성 생산에 적합화된 프로세스를 사용해 제작된 LC/E-BoNT/A)를 처리한 후 본 프레이 필라멘트로 발바닥을 자극하고 래트가 그 발바닥을 후퇴시키는 물리적 한계치를 측정하여, 수술전 4일부터 수술 후 약 36일까지 수행된, 동물에 대한 분지 신경 손상(SNI) 시험으로, 래트 모델에서 항-침해수용 활성의 지속기간에 대한 그래프이다. PK의 2차 주사는 수술 후 10일에 하나의 동물군에 대해 실시하였다.
본 발명은 보툴리늄 신경독소에서 유도된 치료적 폴리펩타이드에 대한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 구체적으로, 이러한 분자는 상이한 BoNT 혈청형의 경쇄에서 유래된 적어도 2 활성 엔도펩티다제 도메인을 포함한다. 매우 바람직하게 엔도펩티다제 도메인은 그들 기질의 상이한 아미노산 서열을 인식하여 절단한다. 특히 바람직하게, 엔도펩티다제 도메인은 2 이상의 BoNT 혈청형, 또는 하나의 BoNT 혈청형 및 TeTx LC에서 유래된다.
선택된 BoNT 유래 중쇄를 적어도 2종의 상이한 활성 클로스트리듐 경쇄 엔도펩티다제 도메인과 조합하는 능력은 강화되고 맞춤화된 특성을 갖는 조작된 치료적 분자를 제공한다. 이러한 치료제는 2종의 상이한 BoNt 혈청형의 복합체를 코딩하는 유전자 구성체의 디자인 및 생성, 및 치료적 용도의 복수 및 상승적 생물학적 활성을 나타내는 재조합 단백질의 원핵생물 발현/정제로 먼저 예시할 수 있다.
이러한 다중-엔도펩티다제 치료제에 의한 엑소사이토시스의 차단은 부가적인 활성 예컨대 감각 뉴런 표면으로 통증-감지 수용기의 수송 차단을 가질 수 있다. 따라서, 이러한 치료제가 가용성 시냅스 인자의 엑소사이토시스를 억제할 뿐만 아니라, 뉴런막에 통합되는 단백질의 수송도 억제할 수 있다.
실시예 부문에서 예시하지 않은 일정 치료제에서, 천연 유래 결합 도메인은 그 치료제가 상이하거나 또는 부가적인 세포 유형을 재표적화하도록 변경될 수 있다. 예를 들면, Aoki 등의 미국 특허 제6,776,990호에서, BoNT의 결합 영역을 인간 콜레시스토키닌, 또는 이의 유사체로 치환시켜서, 췌장 선포세포로 독소(오직 단일 엔도펩티다제를 가짐)를 표적화한다. 유사하게, 2012년 10월 4일 출원된, 미국 특허 출원 제13/644,386호에서, 표적화 리간드를 일정 예에서 천연 유래 결합 도메인으로 치환시킨다. 이러한 일례에서, 인간 인터루킨-1 수용기 길항제(IL-1RA)를 코딩하는 유전자를 사용하여 천연 유래 HC 영역 또는 이의 일부를 치환시켜, 사이토카인-분비 세포를 표적화한다.
본 발명을 예시하는 현재 바람직한 분자는 분자 생물학적 방법을 사용하여 활성 재조합 BoNT/A의 LC/A 모이어티에 융합된 BoNT/E의 LC를 포함하는 단백질을 발현하는 핵산 구성체를 생성하기 위한 신규 개념을 기반으로 한다. 이러한 고유한 분자는 뉴런 BoNT/A 억셉터(예를 들어, 시냅스 소포체 단백질 2 및/또는 강글리오시드)에 결합하여, 억셉터-매개 엔도사이토시스를 겪고 세포질로 전좌하여서, 그곳에서 SNARE 단백질 SNAP-25를 효과적으로 절단해 신경절달물질, 사이토카인 및 통증 펩타이드 방출을 억제시키는 LC/E-BoNT/A(도 1에 도시함)를 포함한다. "효과적으로 절단"은 SNP-25 분자의 대부분이 예를 들어, 예컨대 LC/E에 의한 SNAP-25의 절단으로 야기되는, 높은 Ca2+ 유입에 의한 엑소사이토시스 차단의 역전을 방지하도록 충분한 수의 아미노산으로 절단됨을 의미한다.
상기 언급된 구성체는 바람직하게 트롬빈 프로테아제에 의해 선택적으로 인식되고 절단되는, /A의 LC 및 HC 사이에 위치된, 특이적 아미노산 잔기를 코딩하는 짧은 서열을 함유하도록 디자인되어서, 얻어진 단일 사슬(SC) 재조합 단백질이 트롬빈 노출에 의해 시험관내에서 이중-사슬(DC) 형태로 전환될 수 있다.
매우 바람직하게, 본 발명은 신규한 복합 독소를 산출하는, 2종의 아미노산 링커(예를 들어, 아스파르트산-아이소류신; DI)를 통해 BoNT/A의 LC/A 모이어티에 연결된 LC/E를 예시한다. 이러한 구성체에 감각 뉴런의 노출을 포함시킨 실험에서, 프로테아제는 배양된 뉴런 내로 전달되는 것으로 확인되었고, 부착된 LC/E는 안정되어, 이후 LC/A처럼 장기간 신경마비를 일으켰다.
중요한 것은, LC/A와 달리, 이러한 장기간 작용성 분자는 주로 LC/E의 단백질가수분해 산물 특징을 나타냈고 신경전달물질, 사이토카인 및 통증 펩타이드 방출을 매개하는 /E-절단된 SNAP-25의 불능으로 인해, 래트 배양된 감각 뉴런으로부터 캡사이신에 의해 유발되는 통증-매개인자의 방출을 차단하였다. 또한, 이러한 복합 단백질은 신경병증성 통증(분지 신경 손상-유도됨)의 래트 모델에서 통증 양태 약독화에 있어 LC/A 단독보다 더 효과적인 것으로 입증되었다.
따라서 예시적인 키메라 분자는 만성 통증 치료를 위한 치료법으로 주요한 장점들을 제공한다: (a) 부착된 LC/A에 존재하는 신경 말단 보유/안정화 모티프에 의해, 정상적으로 일시적으로 작용하는 /E 프로테아제의 고도로 바람직하고 상당히 연장된 수명; (b) /E 프로테아제에 의한 SNAP-25의 우세한 절단이 SNARE 복합체를 탈안정화시킴, 및 (c) 감각 뉴런으로부터 통증 펩타이드의 TRPV1-매개 엑소사이토시스의 억제. 이들 신규한 발견들은 상승적으로 혼합된 효과를 나타내는 이러한 독점적 조작된 단백질의 항-침해수용 잠재력에 집중한다. 천연 BoNT의 1세대에 비해 그의 장점이 결론적으로 증명되었고, 따라서 보다 개선된 치료법을 이끌어야 한다.
천연 BoNT는 오직 하나의 프로테아제 도메인을 갖기 때문에, 상이한 위치에서 동일 기질(또는 다른 기질)을 절단하는 여분의 LC를 전달하는 혁신적인 개념은 그의 억제 특성을 유의하게 상승시킬 뿐만 아니라 본래 LC/A의 추가적인 안정화 영향이 놀라운 상승 작용, 즉 BoNT/E와 비교하여 치료적 혜택의 상당히 연장된 지속기간을 제공한다.
다른 예에서, 상이한 다중-엔도펩티다제 치료는 LC/E-BoNT/A 핵산의 구축을 위해 적용된 기술을 사용해 LC/B-BoNT/A 핵산 구성체를 제작하는 것으로 예시된다. LC/E-BoNT/A 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩된 폴리펩타이드의 발현, 및 트롬빈 사이트의 닉킹시, 최종 단백질은 SNAP-25 및 VAMP-2 둘 모두를 절단한다. 시냅스 융합 3차원 복합체에 관여하는 2 SNARE 단백질의 절단은 보다 효과적일 수 있다.
본 발명의 일반적인 개념에 따라서, 클로스트리듐 신경독소 유도체를 포함하는 조성물을 제공하고, 상기 클로스트리듐 신경독수 유도체는 결합 도메인, 전좌 도메인, 제1 엔도펩티다제 도메인, 및 제2 엔도펩티다제 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하고, 여기서 상기 제1 엔도펩티다제 도메인 및 상기 제2 엔도펩티다제 도메인 각각은 SNARE 단백질에 대해 선택적인 단백질가수분해 활성(proteolytic activity)을 가지며, SNARE 단백질의 상이한 절단 부위를 인식한다.
이러한 일반적인 개념의 조성물을 사용하는 핵산 및 치료방법을 또한 고려한다. 또한, 만성 통증의 치료에 사용하기 위한 치료 조성물로서, 클로스트리듐 신경독소 유도체를 포함하고, 상기 클로스트리듐 신경독소 유도체는 결합 도메인, 전좌 도메인, 제1 엔도펩티다제 도메인, 및 제2 엔도펩티다제 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하고, 여기서 상기 제1 엔도펩티다제 도메인 및 상기 엔도펩티다제 도메인 각각은 SNARE 단백질에 대해 선택적인 단백질가수분해 활성을 가지며, SNARE 단백질의 상이한 절단 부위를 인식하는 것인 치료 조성물을 또한 고려한다. 부가적으로, 클로스트리듐 신경독소 유도체를 포함하는 치료 조성물로서, 상기 클로스트리듐 신경독소 유도체는 결합 도메인, 전좌 도메인, 제1 엔도펩티다제 도메인, 및 제2 엔도펩티다제 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하고, 여기서 상기 제1 엔도펩티다제 도메인 및 상기 제2 엔도펩티다제 도메인 각각은 SNARE 단백질에 대해 선택적인 단백질가수분해 활성을 가지며, SNARE 단백질의 상이한 절단 부위를 인식하는 것인 치료 조성물의 만성 통증 치료를 위한 약물 제조에서의 용도를 또한 고려한다.
본 발명의 바람직한 실시형태에 따라서, 클로스트리듐 신경독수 유도체를 포함하는 조성물을 제공하고, 상기 클로스트리듐 신경독소 유도체는
a) 결합 도메인,
b) 전좌 도메인, 및
c) 클로스트리듐 신경독소 BoNT/A 아형에서 유래된 제1 엔도펩티다제 도메인, 및
d) 클로스트리듐 신경독소 BoNT/E 아형에서 유래된 제2 엔도펩티다제 도메인
을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다.
본 발명의 다른 바람직한 실시형태에 따라서, 클로스트리듐 신경독소 유도체를 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 제공하고, 상기 핵산은 카복시 말단에서 아미노 말단의 배열로, 결합 도메인, 전좌 도메인, 클로스트리듐 신경독소 BoNT/A 아형 유래의 제1 엔도펩티다제 도메인, 및 클로스트리듐 신경독소 BoNT/E 아형 유래의 제2 엔도펩티다제 도메인을 코딩하는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시형태에 따라서, 클로스트리듐 신경독소 유도체를 포함하는 만성 통증의 치료에 사용하기 위한 치료 조성물을 제공하고, 상기 클로스트리듐 신경독소 유도체는 결합 도메인, 전좌 도메인, 클로스트리듐 신경독소 BoNT/A 아형 유래의 제1 엔도펩티다제 도메인, 및 클로스트리듐 신경독소 BoNT/E 아형 유래의 제2 엔도펩티다제 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다.
본 발명의 여전히 다른 바람직한 실시형태에 따라서, 클로스트리듐 신경독소 유도체를 포함하는 치료 조성물의 만성 통증의 치료를 위한 약물의 제조에서의 용도를 제공하고, 상기 클로스트리듐 신경독소 유도체는 결합 도메인, 전좌 도메인, 클로스트리듐 신경독소 BONT/A 아형 유래의 제1 엔도펩티다제 도메인, 및 클로스트리듐 신경독소 BoNT/E 아형 유래의 제2 엔도펩티다제 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다.
실시예
실시예 1
이.콜라이에서의 강화된 발현을 위해 그 코돈을 최적화시키고, Lys 잔기를 코딩하는 3개의 여분의 뉴클레오타이드(AAA)를 갖는 합성 BoNT/A 유전자를 원핵생물 발현 벡터 pET29a(+)의 Nde I 및 Sal I 부위에 클로닝하여 pET-29a-BoNT/A를 생성시켰다.
pET-29a-BoNT/A를 이후 pEG-29a 클로닝 벡터에 의해 코딩되는 헥사히스티딘(His6(서열번호 15)) 태그의 동시 제거 및 제어된 특이적 닉킹에 대한 능력을 제공하기 위해 더욱 개질시켰다. 트롬빈 절단 부위를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 독소의 HC/LC 루프를 코딩하는 핵산 영역에 조작시켜 넣었다. 이는 각각 서열번호 1 및 서열번호 2로서, 하기 핵산 및 아미노산 형태로 나타낸다.
개질된 BoNT/A 루프 뉴클레오타이드 서열(서열번호 1) 및 그의 코딩된 아미노산 서열(서열번호 2)
Figure 112016070643562-pct00001
부가적으로, 추가의 트롬빈 부위를 HC/A를 코딩하는 영역과 발현된 단백질의 His6(서열번호 15) 영역 사이에 삽입시켰다. 이는 각각 서열번호 3 및 서열번호 4로서, 하기 핵산 및 아미노산 형태로 나타낸다.
BoNT/A 유전자의 3' 말단에 융합된 뉴클레오타이드 서열(서열번호 3) 및 이의 코딩된 아미노산 서열(서열번호 4)
Figure 112016070643562-pct00002
상기에 제공된 뉴클레오타이드 서열은 각각 좌측에서 우측으로 다음의 영역들을 함유한다:
a) 뉴클레오타이드 1-3: C-말단 His6(서열번호 15)를 제거하기 위해, 선택적인 트립신 절단 부위를 제공하도록 부가적인 Lys를 코딩하는 AAA 코돈이 삽입됨;
b) 단일 밑줄: Sal I 제한 엔도뉴클레아제 부위;
c) 이중 밑줄: Hind III 제한 엔도뉴클레아제 부위;
d) 굵은체: 트롬빈 인식 서열;
e) 단일 밑줄: Pst I 제한 엔도뉴클레아제 부위;
f) 이중 밑줄: Xho I 제한 엔도뉴클레아제 부위;
g) 뉴클레오타이드 49-66: His6(서열번호 15) 태그를 코딩하는 뉴클레오타이드 영역. 상응하는 뉴클레오타이드를 상기 정렬된 아미노산 서열로 나타내었다. 화살표는 트롬빈 절단 부위를 나타내고, 별표는 번역 "중지" 코돈을 의미한다.
상기 기술된 BoNT/A 오픈 리딩 프레임을 포함하고, 서열번호 1 및 서열번호 3을 포함하는 이러한 핵산 구성체를 pET29a-BoNT/A-2T라고 하였다.
PCR 산물(앰플리콘)을 LC/E 프로테아제(잔기 1-411)를 코딩하는 합성 핵산으로부터 증폭시키고, 2종의 제한효소 부위(Nde I and Eco RV)를 각각 핵산 앰플리콘의 5' 및 3' 말단에 증폭 동안 도입시켰다. 이러한 PCR 앰플리콘을 이어 NdeI 및 EcoRV로 분해하고 역시 Nde I 및 EcoRV로 분해시킨, pET29a(+) 벡터에 클로닝하였다. 최종 중간 벡터 구성체를 pET29a-LC/E라고 명명하였다.
상기 언급된 BoNT/A-2T의 온전한 "단일 사슬" 오픈 리딩 프레임 BoNT 유전자 영역을 프라이머 쌍(BoNT/A 5' 코딩 서열의 상류에 EcoRV 제한효소 서열을 포함하는 박테리아 파지 T7 말단 리버스 프라이머 및 포워드 프라이머)을 사용하고 주형으로서 pET29a-BoNT/A-2T를 사용한 PCR을 통해 증폭시켰다. 최종 PCR 앰플리콘을 EcoRV 및 XhoI 효소로 분해하고, 정제하였으며, EcoRV- 및 Xho I-절단된 pET29a-LC/E 플라스미드에 삽입시켰다. 이 최종 구성체를 pET29a-LC/E-BoNT/A라고 하고, 오픈 핵산 리딩 프레임을 서열번호 5로 개시하며, 상응하는 아미노산 서열은 서열번호 6으로 본원에 개시한다.
실시예 2
LC/E-BoNT/A의 발현을 위해, 서열-입증된 구성체로 이.콜라이 균주 BL21(DE3)를 형질전환시키고, 표적 단백질의 발현을 스튜디어의 자가유도 배지(Studier, F.W., 41 단백질 Expr. Purif. 207 (2005))를 사용해 유도시켰다. 박테리아 용해물 중 His6(서열번호 15) 태그된 단백질의 부분 정제물(대략 60%)을 탈론 수퍼플로우 수지를 사용해 고정된 금속(Co2 +) 친화성 크로마토그래피(IMAC)를 사용해 얻었다. Mr 대략 200 kDa의 주요 단백질을 50 mM과 같거나 또는 그 이상인 이미다졸로 용리시켰고, 이를 SDS-PAGE 및 이 겔의 쿠마시 블루 염색으로 도시한 도 2A에서 입증하였다. 겔 레인은 다음과 같다: 레인 1: IMAC 칼럼에 도포하기 전 투명 용해물; 레인 2: IMAC 칼럼 플로우쓰로우 분획; 레인 3: IMAC 칼럼 세척 분획; 레인 4-9: IMAC 칼럼으로부터 이미다졸을 사용해 용리된 분획들.
모아진 IMAC 용리 분획을 0.02 M 인산나트륨 완충액(pH 6.5)으로 완충액 교환시켰고, UNO-S1 양이온 교환 칼럼 상에 로딩하여 더욱 정제한 후, 최대 150 mM NaCl로 세척하고 NaCl 구배로 용리하였다. 독소는 220 mM과 같거나 또는 그 이상인 NaCl 농도로 용리되었다. 도 2B는 이중의 NaCl 구배의 전도도 증가에 따라, 시간 함유에 따른 LC/E-BoNT/A 단일 사슬 폴리펩타이드의 용리 프로파일(280 nm에서 흡광)을 보여준다. 화살표는 LC/E-BoNT/A-함유 흡광도 피크의 위치를 나타낸다.
실시예 3
25 mM HEPES/145 mM NaCl(pH 7.4)로 용리된 온전한 독소를 완충액-교환시킨 후, 정제된 단일 사슬("SC") 단백질을 -80℃에 보관하였고, 분취물을 SDS-PAGE 분석을 위해 취하였다. 도 3은 정제된 폴리펩타이드의 환원(+) 및 비환원(-) SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅 분석 결과를 도시한 것이며, 이 정제된 단백질이 약 200 kDa의 분명한 분자량으로 이동하는 단일 밴드로 밝혀진 바와 같이, SC 형태로 발현되었음을 확인시켜주었다. 이 밴드는 환원제 부재 또는 존재 시에 확인되었다. 예를 들어, 도 3의 쿠마시 브릴리언트 블루-염색된 겔 사진의 레인 SC(-) 및 SC(+)에서 확인할 수 있다.
이 SC 폴리펩타이드의 닉킹은 3시간 동안 22℃에서 바이오틴화된 트롬빈(1 유닛/단백질 mg)과 항온반응에 의해 시도되었고; 트롬빈 프로테아제를 이후 스트렙타비딘 아가로스를 샘플에 처리하여 제거하였다. 약 100 kDa의 분명한 분자량을 갖는 밴드가 샘플 중 단백질의 트롬빈 처리 후 환원 상태 하의 SDS-PAGE 수행으로 나타났고, 대략 200 KDa 밴드는 이 조건에서 보이지 않았지만, 비환원 조건 하의 겔에서는 존재한 반면, 대략 100 KDa 밴드는 이들 후자의 샘플에는 존재하지 않았다. 예를 들어 도 3의 쿠마시 브릴리언트 블루-염색된 겔 사진의 레인 DC(-) 및 DC(+)를 참조한다.
대략 100 KDa 밴드는 유사한 크기를 갖는 LC/E-LC/A 및 HC/A 사슬 둘 모두를 나타내는 것으로 여겨진다. 이 밴드의 폴리펩타이드의 정체는 상정된 단일 사슬 폴리펩타이드 LC/E 및 BoNT/A 각각에 특이적인 항체를 사용하여 닉킹 및 닉킹되지 않은 LC/E-BoNT/A 상에서 수행된 SDS-PAGE의 웨스턴 블롯팅으로 확인하였다.
도 3에 도시된 바와 같이, 닉킹된 샘플은 환원제 부재하에서 대략 200 kDa으로 계속 이동하여, 항-LC/E 또는 항-BoNT/A 항체를 사용해 표시(-)되고 현상된 웨스턴 블롯의 레인에 도시한 바와 같이 모든 샘플에서, LC/E-LC/와 HC/A 간에 사슬간 다이설파이드 결합이 형성되고, 지속됨을 보여준다. 따라서, 환원 및 비환원 조건 하의 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅은 복합 독소의 분해 없이 일어나는 루프 영역의 특이적 닉킹을 강조한다. 닉킹되지 않은 단백질과 닉킹된 단백질의 이동성의 약간의 차이는 트롬빈 처리된 샘플의 His-6(서열번호 15) 태그의 제거에 의한 것이며, 이는 이 태그에 특이적인 항체를 사용해 확인하였다. His6(서열번호 15) 태그가 관찰되지 않은, 도 3의 항-His6(서열번호 15) 항체를 사용한 웨스턴 블롯을 참조한다. 따라서 이 실험은 또한 트롬빈 프로테아제가 HC와 제1 LC 간 다이설파이드 결합의 연결 시스테인 사이의 독소를 동시에 닉킹할 수 있고, His6(서열번호 15)을 제거할 수 있음을 보여준다.
실시예 4
재조합적으로 생산된 LC/E-BoNT/A 및 BoNT/A를 각각 배양된 래트의 소뇌 과립 뉴런(CGN)과 0.01 pM 내지 1000 pM의 10배 연속 희석된 농도로 각각 밤새 항온반응시켰다. 이들 세포를 7-8일령 래트의 소뇌에서 해리시키고 3부의 기본 이글 배지 및 1부의 40 mM HEPES-NaOH, pH 7.3, 78.4 mM KCl, 37.6 mM D-포도당, 2.8 mM CaCl2, 1.6 mM MgSO4, 및 1.0 mM NaH2PO4를 비롯하여, 1x N2 보충제, 1 mM L-글루타민, 60 units/ml 페니실린, 60 ㎍/ml 스트렙토마이신, 및 2%(v/v) 홀스 투석 혈청 중에 약 1 × 106/ml을 현탁하였다. 이 세포 현탁물의 분취물(1 ml)을 각각 16-mm-직경의 폴리-D-리신 코팅웰(즉, 24-형태)에 부가하고 5% (v/v) CO2에서 20-24시간 동안 배양 후 시토신-β-D-아라비노푸라노시드(40 μM)을 부가하였고, 뉴런을 동일한 신선하게 제조된 배지로 10일마다 교체하여 유지시켰다. 특화된 경우, 뉴런을 24시간 동안 배양 배지 중의 BoNT/A 또는 LC/E-BoNT/A (0.2-㎛ 멸균된 필터)에 노출시켰다.
BoNT/A 또는 LC/E-BoNT/A 단백질과 24시간 항온반응 후, 세포를 회수하고 SDS-PAGE 및 온전한 SNAP-25를 비롯하여, LC/A-절단된 SNAP-25 및 LC/E-절단된 SNAP-25를 인식하는 항-SNAP-25 항체를 사용해 웨스턴 블롯팅을 수행하였다. SNARE 단백질 신택신 1을 양성 내부 로딩 대조군으로 사용하였다.
웨스턴 블롯팅을 항-SNAP-25 항체를 사용해 수행하였다. 도 4에 도시한 바와 같이, LC/E-BoNT/A는 각각의 경우에 1 pM이 넘는 독소 농도에서 유의한 절단이 발생하면서, 온전한 SNAP-25를 절단하는데 거의 BoNT/A만큼 활성이 있었다. 주목할 것은, 도시된 바와 같이, CGN을 LC/E-BoNT/A로 처리한 것이 또한 약 1 pM 이하의 독소를 사용시 LC/A 절단 생성물을 제공하였다. 이러한 절단 생성물("SNAP-25A")은 LC/E-BoNT/A 독소의 농도가 약 0.01 nM 이상으로 상승시 공동 전달된 LC/E 프로테아제에 의해 LC/E의 절단 생성물("SNAP-25E")로 실질적으로 더 절단되는 것으로 나타났다(도 4). 이들 결과는 BoNT/A 중쇄 전좌 도메인이 CGN의 세포질에 공유 연결된 LC/A 및 LC/E 프로테아제 둘 모두를 전달할 수 있고, 세포질에서 프로테아제는 SNAP-25를 절단하는 활성 상태로 유지되어서, SNARE 단백질을 전체적으로 또는 부분적으로 불활성화시킬 수 있다.
실시예 5
LC/E-BoNT/A의 특이적 신경독성은 본 명세서에 참고로 편입된 문헌[Maisey, E. A., et al., 177 Eur. J. Biochem. 683-691(1988)]에 기술된 방식으로 마우스에 복강내 주사하여 결정되었다. 4일 내에 마우스의 50%를 죽이는 독소의 최소량을 1 최소 치사량(mLD50)으로 정의하였다. 독소의 비활성은 mLD50 유닛의 수/독소 mg으로 나타낼 수 있다.
LC/E-BoNT/A 조제물의 mLD50은 0.7 x 108으로 관찰되었다. 이러한 비활성은 재조합 BoNT/E(0.4 x 108)에 대해 관찰된 것과 재조합 BoNT/A(2 x 108)에 대해 관찰된 것 사이였다. 생체내 신경마비 작용의 지속기간은, 예를 들어, 본 명세서에 참고로 편입된 문헌[Aoki, K.R., 39 Toxicon 1815-1820 (2001)]에 기재된 마우스 디지트 외전 점수(digit abduction score: DAS) 검정을 이용해서 평가하였다.
재조합 LC/E-BoNT/A를 전신 증상 없이 실험 동물에 투여할 수 있는 최대 내성 용량인 0.5 mLD50 유닛 용량으로 마우스 비복근에 주사하였다. LC/E-BONT/A의 이러한 용량은 약 27일 동안 마비를 야기하였고, 천연 BoNT/A의 6 유닛으로 유도된 효과와 유사하였다. 도 5를 참조한다. BoNT/E와 비교한 LC/E-BONT/A 단백질의 장기 지속 작용은 부착된 LC/E 모이어티를 안정화시키는 융합 단백질의 LC/A 모이어티의 능력에 기인하고, BoNT/E 단독은 다른 독소보다 훨씬 짧은 마비를 제공한다. 도 5에 LC/E-BoNT/A에 대한 BoNT/E의 비교 결과를 참조한다.
실시예 6
LC/E-BoNT/A 단백질의 항-침해수용 잠재력을 삼차 신경절 뉴런(TGN)을 사용하여 실험하였다. 이들 세포는 통증 전파에서 그들의 관여 및 배양중인 이들 세포가 상이한 자극에 의해 촉발되는 통증 펩타이드(CGRP, SP)의 방출을 조사하는데 우수한 모델을 제공한다는 점에서 이러한 실험에 양호한 모델이다. 예를 들어, 문헌[Bacccaglini and Hogan, 80 Proc Natl Acad Sci U.S.A. 594-598 (1983)]을 참조한다. 칠리 페퍼에서 단리한 캡사이신은 감각 신경의 C-섬유 상에서 주로 발현되는 TRPV1를 활성화시킨다. 따라서, 그 효현제인, 캡사이신에 의해 유발되는 CGRP의 방출을 차단하는 복합 독소의 능력은 그 억제 활성의 우수한 지표여야 한다.
BoNT/A는 오직 SNARE 단백질 SNAP-25("/A-절단된" SNAP-25 절단 생성물)의 C-말단으로부터 9 아미노산 잔기를 절단하고, TGN에서 캡사이신에 의해 유발되는 CGRP 엑소사이토시스에는 영향을 미치지 않았다. 대조적으로, LC/E 프로테아제에 의한 17개의 추가 잔기의 제거(그 결과로 "/E-절단된" SNAP-25 절단 생성물이 생성)cleavage product)는 이러한 CGRP의 캡사이신-자극 방출을 차단한다. 예를 들어, 문헌[Meng et al., 29 J Neurosci 4981-4992 (2009)]을 참조하며, 이 문헌은 본 명세서에 참고로 편입된다.
장기 작용 독소의 주요 SNAP-25 절단 생성물, LC/E-BoNT/A가 CGN에서 "/A-절단된" SNAP-25 절단 생성물보다는 "/E-절단된" SNAP-25 절단 생성물이므로(도 4를 참조함), LC/E-BoNT/A가 CGRP 통증 펩타이드의 방출을 차단할 것으로 예상된다.
간략하게, TGN를 도레살(50 mg/체중 kg)의 복강내 주사로 깊이 마취시킨 후 생후 5일 위스타 래트에서 절개하였다. 조직을 빙랭 L15 배지에 넣고, 1분간 170g에서 원심분리전에 빙랭 멸균 CMF-HBSS로 2회 세척하였다. 조직을 작은 조각으로 자르고 l15 배지로 사전 코팅된 10-mL 팔콘 파이펫을 통해 통과시킨 후, 조직을 2.4 U/ml 디스파제 II 및 1 mg/ml 콜라게나제를 함유하는 칼슘- 및 마그네슘-무함유 행크 균형 염 용액(CMF-HBSs)과 1:1 혼합물로 30분간 37℃에서 진탕하면서 항온반응시켰다. 현탁물을 이후 조심스럽게 불투명해질 때까지 L15 배지가 사전코팅된 10-ml 팔콘 파이펫을 통해 저작한 후, 15분간 1 mg/ml DNase I을 부가하였다.
5분간 170 g에서 원심분리 후, 세포 펠렛을 현탁시키고 3회 배양 배지[10%(v/v)의 가열 불활성화된 태아 소 혈청(FBS), 100 IU/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신 함유한 햄 F12 용액(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)]로 세척하였다. 세포를 신경 성장 인자(NGF)(50 ng/ml)가 보충된 F12 배지 중 폴리-L-리신(0.1 mg/ml) 및 라미닌(20 ㎍/ml)으로 사전 코팅된 24웰 플레이트에 접종하고 37℃의 CO2 항온반응기에 유지시켰다. 24시간(및 이후 매일) 후, 배양 상등액을 항-유사분열제 시토신-β-D-아라비노푸라노시드(10 μM)를 함유하는 신선한 배양 배지로 교체하였다.
37℃에서 LC/E-BoNT/A의 연속 희석물과 래트 TGN의 밤샘 항온반응 후, 절단 정도를 SDS-PAGE와 이후 A-절단 및 E-절단 생성물을 비롯하여 온전한 생성물에 결합할 수 있는 항-SNAP-25 항체를 사용한 웨스턴 블롯팅을 통해 모니터링하였다.
도 6A에 도시한 바와 같이, LC/E-BoNT/A는 SNAP-25의 용량 의존적 절단으로 주로 "/E-절단된" SNAP-25 절단 생성물을 제공하였다.
부가적으로, 예상한 바와 같이, 복합 독소는 용량 의존적 방식으로 60 mM KCl 또는 캡사이신에 의해 야기된 TGN에 의한 CGRP의 방출을 차단한다(도 6B). Ca2+-의존적 CGRP 방출은 HBS(NaCl로 등장성으로 평형화) 중 60 mM KCl을 처리해 자극시켰다. 캡사이신 자극을 위해서, 스톡(1 mM)을 각각 에탄올 또는 디메틸 설폭시드에 준비하였고, 필요한 농도로 BR-HBS에 희석하였다. 모든 경우에서, 비히클의 최종 농도는 0.1%로 유지시켰고, 이는 또한 기본 유입물 측정시 BR-HBS에 포함된다.
K+ 또는 캡사이신으로 세포를 자극하였고 CGRP의 방출을 30분간 모니터링하였다. 방출된 CGRP의 양을 결정하기 위해서, 0.1 ml의 샘플을 CGRP에 대한 단일클론 항체가 코팅된 96웰 플레이트에 부가하였고, 키트의 설명서에 따라 효소 면역검정을 수행하였다.
결과는 거대 밀도-코어 소포체로부터 통증 펩타이드의 방출을 억제하는 LC/E-BoNT/A 폴리펩타이드의 능력을 보여주는 한편, BoNT/A로 세포의 유사 처리는 TRPV1 양이온 채널의 활성화 시 CGRP의 방출을 억제하는데 실패하였다. 도 6B를 참조한다.
실시예 7
LC/E-BoNT/A의 항-침해수용 활성은 지속적인 말초 신경병증성 통증의 래트 모델, 즉 분지 신경 손상(SNI) 검정으로 평가하였다. 이 모델은 사실상 모든 신경병증성 통증(절단술에 의해 완전한 병변으로 야기된, 환상지통의 특정 경우를 제외)이 부분 신경 손상에 의한다는 관찰을 기초로 한다. 이들 신경병증성 통증은 당뇨병성 신경병증, 대상포진후 신경통, 독소 신경병증, 압박 신경병증 및 외상을 포함하고, 자발적 난자통, 작열통 및 쇼크-유사 통증을 비롯하여, 촉각 이질통, 핀프릭 통각과민 및 통각과민을 특징으로 한다.
SNI 수술을 마취된 성체 래트(에컨대 스프라그-다우리 래트)에 수행하였고, 좌골신경(경골 및 총비골신경)의 2개의 말단 원위 브랜치 중 2개의 결찰 및 횡단술을 포함하며, 세번째 브랜치(비복신경)는 온전하게 남겨두었다. 본 명세서에 참고로 편입된 문헌[Decosterd, I. & Woolf, C.J., 87 Pain 580-587 (2000)]을 참조한다. 이 모델은 기술적으로 수행이 용이하고, 생성된 손상 정도가 최소 가변성이라는 장점을 갖는다.
독소들을 원위 뒷다리의 발바닥(손바닥) 면에 주사하였다. LC/E-BoNT/A and BoNT/A의 최대 발바닥내 용량(운동 기능에 영향없음)은 각각 75 및 15 마우스 LD50 유닛/kg으로 확인되었다. SNI를 한 래트는 샴 대조군 래트(임의의 병변없이 좌골신경의 노출 수행)와 대조적으로 장기 지속적 신경병증성 통증-유사 행동을 보였다.
신경병증성 통증의 2 모델을 한랭 이질통 및 물리적 이질통 시험하였다. 한랭 과민증의 첫 번째 실험에서, 수술받은 발을 4℃의 냉플레이트와 접촉시키고, 발 후퇴 지속기간을 도 7A에 도시한 바와 같이 다양한 시점에서 기록하였다. 한랭 과민성 조절의 측정처럼, 처리후 값은 처리전 값의 비율로 나타내었다.
도 7A에 도시한 바와 같이, 한랭 과민증은 처리 후 2주동안, 특히 처음 10일간 LC/E-BoNT/A에 의해 유의하게 감소되었다(염수-처리와 비교하여 P<0.001). LC/E-BoNT/A의 항-침해수용 효과는 BoNT/A에 의해 유도된 것보다 유의하게 컸다(주사 후 5 및 7일에 P<0.05). 독소 또는 염수 제공과 무관하게, 샴 대조군에서는 한랭-유도 이질통이 보이지 않았다.
두 번째 시험에서, 물리적 이질통은 높은 와이어 격자 상에 동물을 위치시키고, 통증 탐지 전 얼마나 많은 감각 자극을 견질 수 있는지 결정(발의 빠른 후퇴로 표시)하기 위해 본 프레이 헤어 세트로 처리된 발의 발바닥 표면을 자극하여 측정하였다. 본 프레이 헤어(또는 모노필라멘트)는 실제 힘의 대략 로그 스케일, 및 인지된 강도의 선형 스케일을 제공하도록 보정하였다. 물리적 한계치는 발 후퇴를 일으키는데 필요한 힘의 평균 최소 그램의 50%로 나타낸다.
도 7B에 나타낸 바와 같이, 물리적 한계치는 신경 손상에 의해 극적으로 감소된다(오직 염수를 제공한 SNI 래트를 샴 대조군과 비교). 격려가 되는 것은, LC/E-BoNT/A가 주사 후 2일 이내에 이러한 물리적 과민증을 역전시키기 시작하였고, 최고 진통 효과가 처리 후 7일에 나타났다. 염수 처리한 래트보다 유의하게 높은 물리적 한계치가 주사 후 3 내지 10일에 기록되었다(P<0.001 대 염수). 또한, BoNT/A 처리가 손상 후 물리적 한계치의 보통정도의 증가를 유도하였지만, LC/E-BoNT/A가 유의하게 더 효과적인 것으로 확인되었다(P<0.05).
독소 또는 염수 어떠한 것도 샴 동물에 투여시 한랭 및 물리적 자극에 의해 촉발된 통증 거동에 영향을 미치지 않았다(도 7A 및 도 7B). LC/E-BoNT/A는 한랭 후퇴 기간 감소에서 BoNT/A보다 더 효과적(도 7A)인 것으로 입증되었고, 특히 물리적 후퇴 한계치를 증가시켰다(도 7B). 중요하게, SNI의 래트에 LC/E-BoNT/A의 주사는 모든 샴 대조군과 유사한 값으로 3일 및 7일의 한랭 및 물리적 자극에 대한 감응성을 정규화시켰다. 요약하면, LC/E-BoNT/A는 만성 신경병증성 통증의 래트 모델에서, 강력한 항-침해수용 효과를 유도시킨다.
실시예 8
이하에 제공된 복합 합성 신경독소 오픈 리딩 프레임 LC/E-BoNT/A 유전자 서열 및 이의 코딩된 아미노산(각각 서열번호 5 및 6)을 각각 다음의 영역을 함유한다(뉴클레오타이드 잔기에 대해 식별): 잔기 1-1233, LC/E; 잔기 1240-5130, BoNT/A. 뉴클레오타이드(1234-1239)를 포함하는 DNA 서열을 링커로서 도입시켰고 적합한 리딩 프레임을 보장하였다. 정렬된 아미노산 서열은 상기에 상응하는 뉴클레오타이드를 나타낸다. 트롬빈 프로테아제 인식 서열이 LC/A와 HN/A 사이의 루프에 삽입되었고, 유사하게, 다른 트롬빈 부위가 BoNT/A 유전자의 카복시 부위에 절단 서열을 갖도록 조작되었으며, 이들은 C-말단 His6(서열번호 15)의 동시 닉킹 및 제거를 가능케 한다.
복합 신경독소 유전자(LC/E-BoNT/A) 서열 및 이의 코딩된 아미노산(서열번호 5 및 6)
Figure 112016070643562-pct00003
Figure 112016070643562-pct00004
Figure 112016070643562-pct00005
Figure 112016070643562-pct00006
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본 발명의 이 실시예는 당 분야에 제시된 적어도 2가지 주요 문제를 해결한다. 첫 번째로, 항-침해수용 치료 잠재력을 확장시킨 장기-지속성 BoNT 키메라를 제공한다. 두 번째로, 만성 통증 요법에 대해 고유한 잠재력을 갖는 장기-지속성 BoNT-유도 치료법을 제공한다.
만성 통증의 관리는 환자가 성인 인구의 20%를 넘기 때문에 현대 헬쓰케어에서 주요한 도전이다. 인구의 실질적인 비율이 통용되는 진통제에 반응하지 않는다. 부가적으로, 다량의 처방 아편제와 연결된 약물 의존성 및 남용 증가, 및 통증에 대해 본래 처방된 대부분의 경우에서 많은 진통제의 짧은 반감기는 아편계 및 비스테로이드 항-염증성 약물의 사용을 매력적이지 않은 선택으로 만들었다.
BoNT/A 복합체의 치료적 용도는 통증 경로에 대해 가정된 간섭때문에, 모든 편두통 환자는 아니지만 일부에게 유익한 것으로 입증되었다. 인시츄에서 C-섬유의 통증 펩타이드 또는 TRPV1 활성화에 의해 유발되는 뉴런 발화를 약독화시키는데 BoNT/A의 실패 및 배양된 뉴런으로부터의 CGRP 방출을 차단하는 무능력은 장기-지속 및 보다 광범위한 효과적 형태를 개발하는데 필수적이라는 것을 강조한다.
BoNT/A 및 BoNT/E의 BoNT-유도성 키메라는 성공적으로 TGN으로 진입하고, /E-유사 SNAP-25 절단 생성물을 제공하여, 이후 통증 매개인자의 방출을 억제하지만, 그의 짧은 작용 지속기간은 임상적 용도를 제한한다.
본 발명은 신규 치료제를 생성하기 위해 함께 상이한 혈청형의 적어도 2 BoNT의 도메인을 조합한다. 이러한 혁신적인 전략을 사용하여 바람직한 특성을 갖는 치료제, 예를 들어 LC/E 대신 BoNT/A에 LC/C1을 부착하여, 제작할 수 있는, 예를 들어 다중-SNARE-절단 독소(상이한 SNARE 단백질을 절단)를 산출하기 위해 상이한 BoNT 헐?형 유래의 다중 LC를 포함하는 구성체를 포함하여, 다른 키메라 다중사슬 치료제를 생성시킬 수 있다.
실시예 9
다른 예에서, 다중-엔도펩티다제 구성체는 상기 기술한 것과 실질적으로 유사한 방식으로 단일 오픈 리딩 프레임으로서 LC/B-BoNT/A를 코딩하는 최종 플라스미드를 생성하기 위해 합성 LC/B 유전자로 LC/E-BoNT/A 핵산 중 LC/E 유전자를 치환시켜 생성시킬 수 있다.
LC/B-BoNT/A 발현을 위해서, 서열-입증된 핵산 구성체로 이.콜라이 균주BL21(DE3)를 형질전환시키고, 최종 단백질을 LC/E-BoNT/A에 대해 이전에 기술한 대로 발현시켰다. 투명한 박테리아 용해물로부터 His6-태그된 독소의 부분 정제를 탈론 수퍼플로우 레진을 사용하는, IMAC 친화성 분리 단계를 사용해 획득하였다. Mr 대략 200k의 주요 단백질을 150mM 이상의 이미다졸로 용리시켰고, 이는 환원 조건 하의 SDS-PAGE 및 이의 쿠마시 블루 염색을 보여주는 도 8B에서 확인하였다. 겔 레인은 다음과 같다: 레인 1: IMAC 칼럼에 도포 전 투명한 용해물; 2: IMAC 칼럼 플로우쓰로우 분획; 3: IMAC 칼럼 세척 분획; 4-8, 이미다졸을 사용해 용리된 분획들.
모아진 IMAC 용리물을 25 mM HEPES/145 mM NaCl(pH 7.4)로 완충액 교환하고 SDS-PAGE로 분취물을 분석하였다. 도 8C는 분취물을 환원(+) 및 비환원(-) 하에서 전기영동한 정제된 단백질의 SDS-PAGE를 보여준다. 전기영동은 단백질이 약 200 kDa의 분명한 분자량으로 이동한 주요 밴드로 밝혀진 바와 같이, 단일 사슬("SC") 형태로 발현됨을 보여준다. 이 밴드는 환원제 존재 또는 부재시에 확인되었다. 예를 들어, 도 8C의 쿠마시 브릴리언트 블루-염색된 겔의 레인 SC(-) 및 SC(+)를 참조한다.
이 단일 사슬 단백질(및 His6 태그 제거)의 닉킹은 3시간 동안 22℃에서 바이오틴화된 트롬빈(1 unit/독소 mg)과 단백질의 항온반응에 의해 얻었고, 트롬빈 프로테아제는 이후 아가로스 상에 고정된 스트렙타비딘으로 샘플을 처리하여 제거하였다. 약 100 K의 분명한 분자량을 갖는 2 밴드(2 단백질 사슬 이동성의 유사함으로 인해 SDS-PAGE에 의해 잘 분리되지 않음)가 환원 조건 하의 SDS-PAGE 겔 상에서 러닝된 샘플 중 단백질의 트롬빈 처리 후 나타났으며, 대략 200 K 밴드는 이러한 조건 하에서 보이지 않았지만, 비환원 조건 하에서 러닝한 겔에는 존재한 반면, 대략 100 KDa 밴드는 이들 후자의 샘플에서는 부재하였다. 예를 들어, 도 8C의 쿠마시 브릴리언트 블루-염색된 겔의 레인 DC(-) 및 DC(+)를 참조한다. 대략 100 K 밴드는 크기 차이가 작은, LC/B-LC/A 및 HC/A 사슬 둘 모두를 나타낸다고 여겨진다.
래트 배양된 소뇌 과립 뉴런(CGN)을 0.32 pM 내지 5000 pM의 5배 연속 희석 농도에서 트롬빈-처리된 LC/B-BoNT/A와 항온반응시켰다. LC/B-BoNT/A와 37℃에서 24시간 항온반응 후, 세포를 회수하고 SDS-PAGE, 및 온전한 SNAP-25 및 a) LC/A 처리의 거대 절단 생성물을 인식하는 항-SNAP-25 항체, 및 b) 온전한 형태를 인식하는 항-VAMP2 항체를 사용한 웨스턴 블롯팅을 수행하였다. 항-신택신 1 항체를 사용해 양성 내부 로딩 대조군으로 사용된, SNARE 단백질 신택신 1을 검출하였다. 대표적인 웨스턴 블롯(도 8D) 및 다중 블롯으로부터의 정량 데이터(도 8E)는 LC/B-BoNT/A가 SNAP-25와 VAMP2를 절단할 수 있음을 보여주지만, VAMP2는 고농도의 LC/B-BoNT/A를 효과적으로 절단할 수 있었다. 이론에 제한되지 않지만, 이러한 결과는 VAMP 절단을 낮추는 BoNT/A의 LC를 통한 막으로의 복합 독소의 격리에 의해 야기되는 것이다[Fernandez-Salas et al, Proc. Natt. Acad. Sci. USA. 2004, 101(9):3208-3213].
실시예 10
LC/E-BoNT/A(동일 기질의 상이한 2 서열을 인식하는 2 활성 프로테아제) 및 LC/B-BoNT/A(상이한 2 기질을 절단하는 2 프로테아제)에 의한 양성적 기능 결과로 예시한 바처럼, 그리고 본 출원의 개시 관점에서, 당분야의 숙련가는 본 발명의 추가 예가 다양한 신경 유형(예를 들어, 감각 및 교감 뉴런)으로부터 통증-펩타이드, 사이토카인, 및 신경전달물질의 방출을 억제하기 위한 상이한 클로스트리듐 신경독소 또는 클로스트리듐 신경독소 아형의 조합에 의해 다양한 다른 다중-엔도펩티다제를 생성하기 위한 조성물 및 방법을 포함함을 알 것이다. 또한, 다중-프로테아제 독소의 활성은 사이토카인-방출 세포의 이러한 매개인자에 의한 활성을 간접적으로 차단하게 된다.
예를 들어, 모든 3종의 SNARE 단백질을 불활성화시키는 단일 치료제는 링커를 통해 BoNT/C1의 N-말단에 BoNT/D(LC/D)의 경쇄의 재조합 융합에 의해 생성된다(도 9를 참조함). 간략하게, LC/D 엔도펩티다제를 코딩하는 핵산은 LC/E를 치환시키기 위해 LC/E-BoNT/A에 "인프레임"으로 삽입된다. LC/D를 코딩하는 합성 유전자는 이.콜라이에서의 최적 발현에 적합화된 코돈을 갖도록 디자인된다. 최종 플라스미드는 LC/D-BoNT/A를 포함하는 중간 단백질을 코딩한다.
이후, BoNT/C1을 코딩하는 합성 유전자(그 루프 영역에 트롬빈 절단 부위를 갖는, BoNT/A 구성체와 유사)를 사용해 LC/D-BoNT/A의 BoNT/A 유전자를 치환시켜 LC/D-BoNT/C1 오픈 리딩 프레임을 포함하는 최종 핵산 구성체를 산출한다. 발현되고, 정제하고 닉킹한 LC/D-BoNT/C1 치료제는 LC/D로 절단하여 VAMP 1-3을 불활성화시키는 능력을 가지며, LC/C1 프로테아제는 신택신 1-3 및 SNAP-25를 절단하게 된다. 이 구성체는 만성 염증성 및 신경병증성 통증의 치료에 적합하다.
실시예 11
60세 남성이 좌측 엉덩이에 심각한 만성 관절 통증을 보이고, 보행이 어려웠다. 조사 후, 이 환자는 골반대퇴부(엉덩이) 관절의 류마티스성 관절염으로 진단받았다.
환자는 대퇴부 신경절 및 좌골 신경절 둘 모두에 직접 주사에 의해 유효 용량의 클로스트리듐 신경독소 유도체 LC/E/BoNT/A를 투여받았다. 유전자 구성체는 상기 기술된 대로 만들었고 클로스트리듐 독소 유도체는 His6 태그(서열번호 15)를 사용하여 그의 발현 후 친화성 정제하고 이후 사용 전에 트롬빈 닉킹하고 이온 교환 크로마토그래피를 실시하였다.
48시간 내에, 통증 정도 및 격렬함에 주목할만한 호전이 있었고, 1주 내에 한자는 약간의 불편함으로 걸을 수 있었다.
실시예 12
인간 사용을 위한 클로스트리듐 신경독소 유도체 LC/E/BoNT/A의 충분한 양에 대해 예상되는 궁극적 요구는 양호한 제조 실행(GMP-순응성) 설비에서의 생산과 호환되는 LC/E-BoNT/A 단백질의 발현 및 정제를 위한 생산/정제 플랫폼이 요구된다. LC/E-BoNT/A 단백질의 규모 확대 생산 및 정제는 본질적으로 벤치-스케일 실험에 대해 상기 기술한 바와 같이 수행된다. 이러한 과정은 SDS-PAGE에서 예상되는 명백한 분자량(대략 200 kDa)을 갖는 순수한 활성 생성물을 산출한다. 사슬간 다이설파이드 결합의 환원 후 HC 사슬 및 LC/E-LC/A 사슬은 환원 SDS PAGE 겔 상에서 함께 이동하며, 각각이 약 100 kDa의 분명한 분자량을 가지고 있고, 쿠마시 브릴리언트 블루 염색은 도 3에 도시한 바와 실질적으로 동일한 이동 패턴을 보여준다. GMP 순응성 생산에 적합화된 과정을 사용해 제작된 LC/E-BoNT/A를 "PK"라고 한다.
SNAP-25를 절단하는 GMP PK 단백질의 활성, 및 마우스에서 그의 특이적 신경독성은 벤치 규모로 생산된 동일한 단백질의 그것과 일치한다. 유사하게, PK의 항-침해수용 잠재력은 PK 재료로 실시예 6의 실험을 반복하고, 도 6A 및 도 6B에 도시한 바와 실질적으로 동일한 결과를 얻음으로써 도시한 바와 같이, 감각 뉴런에 결합하여 그로 들어가서 주로 LC/E-절단된 SNAP-25를 생성시키고 탈분극- 또는 캡사이신-자극된 CGRP 방출을 억제하는 그 능력으로 검증되었다.
가장 중요한 것은, 이러한 유망한 PK 단백질은, 벤치 규모로 생성된 LC/E-BoNT/A 단백질처럼, 또한 생체내에서 균등하게 강건한 항-침해수용이 입증되었다. 만성 통증의 분지 신경 손상(SNI) 모델에서 래트의 한쪽 뒷발에 PK의 단일 주사(예를 들어, 실시예 7 및 도 7A 및 7B 참조)는 운동 활성(로타로드 상에서 정량화)에 영향을 미치지 않거나 또는 검출가능한 임의의 역효과를 유도하지 않았지만, 14일의 장기간 동안, 샴 그룹의 대조군 수준으로 물리적 과민성을 완화시켰다. 또한, SNI 모델에서 한랭 이질통의 높은 수준을 후퇴 기간의 두드러진 감소로 보여주는 바와 같이, 역시 유사하게 약화시킨다. 샴-수술 동물에 대한 염수 비히클의 주사는 예를 들어, 도 7A 및 도 7B에서 측정된 2 침해수용 변수에 대한 기본 수준을 변경시키지 않았다. PK 단백질은 확실의 높은 통증 수준을 경감시킨다.
이러한 발견들은 많은 광대한 동물 실험 세트에서 재현가능한 것으로 입증되었고 심각한 신경 손상으로 인한 극심한 통증을 역전시키는 PK의 생체내 치료 효능을 강조하였으며, 통증, 특히 만성 통증의 치료에서 BoNT/A 단독의 부적당성을 밝혔다.
실시예 13
이러한 신규 GMP-유사 항-침해수용의 높은 효율은 많은 환자에서 주목할만한 부정적인 반응 및 한정된 진통 효과를 발현하는 것으로도 알려진 신경병증성 통증에 대한 제1선 치료로서 임상적으로 사용되는 진통 약물인, 프레가발린 10 mg/Kg의 매일 전산(I.P.) 투여와 비교한 (75 U/Kg) PK의 단일 주사의 SNI 모델 평가를 통해 더욱 검증한다.
이전 단락에서와 동일한 용량의 활성제 및 래트의 만성 통증의 한랭 이질통 모델 및 분지 신경 손상(SNI)을 다시 사용하여, PK의 단일 발바닥내 주사는 PK와 대조적으로, 물리적 과민증의 반전을 유의하게 달성할 수 없었던 일일 프레가발린보다 매우 훨씬 긴 지속기간의 장점을 제공하고(도 10A) 한랭에 대해 고조된 반응성의 보다 적당한 약화를 유도한다(도 10B). PK의 2차 주사는 물리적 감수성(도 11) 및 한랭 이질통(도시하지 않음)에서 그 강력한 진통 효과를 지속하여서, 초기 치료 이후 25일이 넘게 지속되는 대조군 기본선보다 유의하게 높은 통증 경감을 일으킨다.
본 발명은 본원에 기술한 실시형태(들)에 한정되지 않고 본 발명의 범주를 벗어나지 않으면서 수정되거나 또는 변형될 수 있다.
본 발명을 이제 청구항 형식으로 이하에 제시된 실시형태 세트를 통해 설명한다.
1) 클로스트리듐 신경독소 유도체를 포함하는 조성물로서, 상기 클로스트리듐 신경독소 유도체는 결합 도메인, 전좌 도메인, 제1 엔도펩티다제 도메인, 및 제2 엔도펩티다제 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하고, 여기서 상기 제1 엔도펩티다제 도메인 및 상기 제2 엔도펩티다제 도메인 각각은 SNARE 단백질에 대해 선택적인 단백질가수분해 활성을 가지며, SNARE 단백질의 상이한 절단 부위를 인식하는, 조성물.
2) 제1항에 있어서, 상기 결합 도메인, 전좌 도메인, 제1 엔도펩티다제 도메인, 및 제2 엔도펩티다제 도메인은 단일 폴리펩타이드 사슬에 포함되는, 조성물.
3) 제2항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 상기 결합 도메인 및 상기 전좌 도메인을 포함하는 제1 영역, 및 상기 제1 엔도펩티다제 도메인 및 제2 엔도펩티다제 도메인을 포함하는 제2 영역 사이에 위치하는 선택적 엔도펩티다제 절단 부위를 더 포함하는, 조성물.
4) 제1항에 있어서, 상기 결합 도메인, 전좌 도메인, 제1 엔도펩티다제 도메인, 및 제2 엔도펩티다제 도메인은 1개 이상의 폴리펩타이드 사슬에 포함되는, 조성물.
5) 제4항에 있어서, 적어도 2개의 상기 폴리펩타이드 사슬은 다이설파이드 결합에 의해 연결되는, 조성물.
6) 제1항에 있어서, 상기 결합 도메인 및 상기 전좌 도메인을 포함하는 제1 폴리펩타이드 사슬, 및 상기 제1 엔도펩티다제 도메인 및 제2 엔도펩티다제 도메인을 포함하는 제2 폴리펩타이드 사슬을 포함하는, 조성물.
7) 제5항에 있어서, 상기 결합 도메인 및 상기 전좌 도메인을 포함하는 제1 폴리펩타이드 사슬, 및 상기 제1 엔도펩티다제 도메인 및 제2 엔도펩티다제 도메인을 포함하는 제2 폴리펩타이드 사슬을 포함하는, 조성물.
8) 제1항에 있어서, 결합 도메인 및 전좌 도메인은 제1 클로스트리듐 신경독소 또는 클로스트리듐 신경독소 아형에서 유래되고, 상기 제1 엔도펩티다제 도메인 및 상기 제2 엔도펩티다제 도메인 중 적어도 하나는 제2 클로스트리듐 신경독소 또는 클로스트리듐 신경독소 아형에서 유래되는, 조성물.
9) 제8항에 있어서, 결합 도메인, 전좌 도메인, 및 상기 제1 엔도펩티다제 도메인 및 상기 제2 엔도펩티다제 도메인 중 적어도 하나는 제1 클로스트리듐 신경독소 또는 클로스트리듐 신경독소 아형에서 유래되는, 조성물.
10) 제9항에 있어서, 결합 도메인, 전좌 도메인, 및 상기 제1 엔도펩티다제 도메인은 제1 클로스트리듐 신경독소 또는 클로스트리듐 신경독소 아형에서 유래되고, 상기 제2 엔도펩티다제 도메인은 제2 클로스트리듐 신경독소 또는 클로스트리듐 신경독소 아형에서 유래되는, 조성물.
11) 제10항에 있어서, 제1 클로스트리듐 신경독소 또는 클로스트리듐 신경독소 아형은 BoNT/A이고 제2 클로스트리듐 신경독소 또는 클로스트리듐 신경독소 아형은 BoNT/E인 조성물.
12) 제11항에 있어서, 제1 클로스트리듐 신경독소 또는 클로스트리듐 신경독소 아형은 BoNT/A이고 제2 클로스트리듐 신경독소 또는 클로스트리듐 신경독소 아형은 BoNT/C1인 조성물.
13) 제11항에 있어서, 상기 결합 도메인 및 상기 전좌 도메인을 포함하는 제1 폴리펩타이드 사슬, 및 상기 제1 엔도펩티다제 도메인 및 제2 엔도펩티다제 도메인을 포함하는 제2 폴리펩타이드 사슬을 포함하는, 조성물.
14) 제13항에 있어서, 상기 제1 폴리펩타이드 사슬 및 제2 폴리펩타이드 사슬은 다이설파이드 결합에 의해 연결되는, 조성물.
15) 제11항에 있어서, 상기 결합 도메인, 전좌 도메인, 제1 엔도펩티다제 도메인 및 제2 폴리펩타이드 사슬은 모두 단일 폴리펩타이드 사슬에 포함되는, 조성물.
16) 제11항에 있어서, 전좌 도메인 및 제1 엔도펩티다제 도메인에 위치된 제1 프로테아제 절단 부위를 포함하는 제1 아미노산 서열을 포함하는, 조성물.
17) 제11항에 있어서,
a) 결합 도메인의 카복실 말단면, 또는 상기 제2 엔도펩티다제 도메인의 아미노-말단에 위치된 폴리히스타딘 아미노산 서열;
b) 전좌 도메인 및 제1 엔도펩티다제 도메인 사이에 위치된 제1 프로테아제 절단 부위를 포함하는 제1 아미노산 서열; 및
c) 상기 제2 엔도펩티다제 도메인 및 상기 폴리히스타딘 아미노산 서열 사이, 또는 상기 결합 도메인 및 폴리히스타딘 아미노산 서열 사이에 위치된 제2 프로테아제 절단 부위를 포함하는 제2 아미노산 서열
을 더 포함하는, 조성물.
18) 클로스트리듐 신경독소 유도체를 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산으로서, 상기 핵산은 카복시 말단에서 아미노 말단의 배열로, 결합 도메인, 전좌 도메인, 제1 엔도펩티다제 도메인, 및 제2 엔도펩티다제 도메인을 코딩하는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함하고, 상기 제1 엔도펩티다제 도메인 및 상기 제2 엔도펩티다제 도메인 각각은 SNARE 단백질에 대해 선택적인 단백질가수분해 활성을 가지며, SNARE 단백질의 상이한 절단 부위를 인식하는, 핵산.
19) 제18항에 있어서, 결합 도메인, 전좌 도메인, 제1 엔도펩티다제 도메인, 및 제2 엔도펩티다제 도메인 각각을 코딩하는 코돈은 박테리아 세포, 포유동물 세포, 효모 세포, 및 곤충 세포로 이루어진 군에서 선택된 세포 유형에서의 발현에 최적화된, 핵산.
20) 제19항에 있어서, 코돈은 이.콜라이 박테리아 세포에서의 발현에 최적화된, 핵산.
21) 제18항에 있어서, 결합 도메인, 전좌 도메인, 제1 엔도펩티다제 도메인, 및 제2 엔도펩티다제 도메인으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 2 도메인은 BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, 및 TeTX로 이루어진 군에서 선택된 상이한 클로스트리듐 신경독소 또는 클로스트리듐 신경독소 아형에서 유래된 핵산 서열에 의해 코딩되는, 핵산.
22) 제21항에 있어서, 제1 엔도펩티다제 도메인 및 제2 엔도펩티다제 도메인은 BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, 및 TeTX로 이루어진 군에서 선택된 상이한 클로스트리듐 신경독소 또는 클로스트리듐 신경독소 아형에서 유래된 핵산 서열에 의해 코딩되는, 핵산.
23) 제22항에 있어서, 제1 엔도펩티다제 도메인은 BoNT/A에서 유래된 핵산 서열에 의해 코딩되고 상기 제2 엔도펩티다제 도메인은 BoNT/C1에서 유래된 핵산 서열에 의해 코딩되는, 핵산.
24) 제22항에 있어서, 제1 엔도펩티다제 도메인은 BoNT/A에서 유래된 핵산 서열에 의해 코딩되고 상기 제2 엔도펩티다제 도메인은 BoNT/E에서 유래된 핵산 서열에 의해 코딩되는, 핵산.
25) 제24항에 있어서, 상기 오픈 리딩 프레임은 엔도펩티다제 결합 도메인을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 중지 코돈 사이에 적어도 6 히스타딘 잔기를 코딩하는, 핵산.
26) 클로스트리듐 신경독소 유도체를 포함하는 치료 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 만성 통증의 치료 방법으로서, 상기 클로스트리듐 신경독소 유도체는 결합 도메인, 전좌 도메인, 제1 엔도펩티다제 도메인, 및 제2 엔도펩티다제 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하고, 상기 제1 엔도펩티다제 도메인 및 상기 제2 엔도펩티다제 도메인 각각은 SNARE 단백질에 대해 선택적인 단백질가수분해 활성을 가지며, SNARE 단백질의 상이한 절단 부위를 인식하는, 방법.
27) 제26항에 있어서, 상기 만성 통증은 염증성 침해수용성 통증 및 신경병증성 통증으로 이루어진 군에서 선택되는, 방법.
28) 제27항에 있어서, 상기 만성 통증은 신경병증성 통증인, 방법.
29) 제28항에 있어서, 상기 신경병증성 통증은 암 통증, 수술 후 통증, 신경병증성 통증, 이질통, 포진후 신경통, 과민성 대장 증후군, 및 다른 내장 통증, 골통증, 말초 신경병증, 순환계 연계 통증, 및 두통으로 이루어진 군에서 선택되는, 방법.
30) 제27항에 있어서, 상기 만성 통증은 염증성 침해수용성 통증인, 방법.
31) 제27항에 있어서, 상기 만성 통증은 관절염 통증인, 방법.
32) 제26항에 있어서, 상기 치료 조성물의 결합 도메인 및 전좌 도메인은 제1 클로스트리듐 신경독소 또는 클로스트리듐 신경독소 아형에서 유래되고, 상기 조성물의 상기 제1 엔도펩티다제 도메인 및 상기 제2 엔도펩티다제 도메인 중 적어도 하나는 제2 클로스트리듐 신경독소 또는 클로스트리듐 신경독소 아형에서 유래되는, 방법.
본 발명의 측면들을 개시된 실시형태를 참조하여 설명하였지만, 당업자라면 개시된 특정 예들은 오직 이들 측면의 예시이고 본 발명을 한정하는 방식이 아님을 쉽게 이해할 것이다. 다양한 변형이 본 발명의 정신을 벗어나지 않고 이루어질 수 있다. 본원에 기술된 각각 및 모든 특징들, 및 이러한 특징의 2 이상의 모든 그리고 각각의 조합은 그러한 조합에 포함된 특징들이 상호 불일치하지 않는 한 본 발명의 범주 내에 포함된다. 또한, 본 발명의 임의의 조성물 또는 장치는 청구항의 1 이상의 성분을 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 이루어지는 것으로 이해하며, 부가적으로, 청구항의 성분으로 특별히 포함되지 않은 각각 및 모든 성분은 그 청구항으로부터 부정적 한계로 특별히 배제하려는 것을 본 명세서에 근거하여 고려해야 한다.
본 명세서에 언급된 임의의 모든 특허, 공개물, 특허 출원, 및 수탁 번호로 인용된 뉴클레오타이드 및/또는 아미노산 서열은 그 전체로 본 명세서의 일부로 참조하여 본원에 편입시킨다.
SEQUENCE LISTING <110> Dublin City University <120> MULTIPROTEASE THERAPEUTICS FOR CHRONIC PAIN <130> WO2015/097087 <140> PCT/EP2014/078732 <141> 2014-12-19 <150> US 61/920,053 <151> 2013-12-23 <150> US 14/244,162 <151> 2014-04-03 <160> 15 <170> PatentIn version 2.0 <210> 1 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> CDS <222> (1)..(78) <400> 1 tgt gtc cgc ggt att atc acc agc aaa acc aaa tcc ttg gtg ccc cgc 48 Cys Val Arg Gly Ile Ile Thr Ser Lys Thr Lys Ser Leu Val Pro Arg 1 5 10 15 ggc tct aac aag gcg ctc aat gat tta tgc 78 Gly Ser Asn Lys Ala Leu Asn Asp Leu Cys 20 25 <210> 2 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 2 Cys Val Arg Gly Ile Ile Thr Ser Lys Thr Lys Ser Leu Val Pro Arg 1 5 10 15 Gly Ser Asn Lys Ala Leu Asn Asp Leu Cys 20 25 <210> 3 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of 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gat gaa act tct gaa gtc tcg acc acc 3114 Leu Val Tyr Asp Phe Thr Asp Glu Thr Ser Glu Val Ser Thr Thr 1025 1030 1035 gac aaa att gcc gat att acc att atc att ccc tat att ggc cct 3159 Asp Lys Ile Ala Asp Ile Thr Ile Ile Ile Pro Tyr Ile Gly Pro 1040 1045 1050 gca ctg aac att ggt aac atg ctg tat aaa gat gat ttt gtg ggc 3204 Ala Leu Asn Ile Gly Asn Met Leu Tyr Lys Asp Asp Phe Val Gly 1055 1060 1065 gcc ctg atc ttt tca ggc gct gtt atc ctg ctg gaa ttt atc ccg 3249 Ala Leu Ile Phe Ser Gly Ala Val Ile Leu Leu Glu Phe Ile Pro 1070 1075 1080 gaa atc gcc att cca gta ctc ggt acc ttt gcg ctg gtg tcc tat 3294 Glu Ile Ala Ile Pro Val Leu Gly Thr Phe Ala Leu Val Ser Tyr 1085 1090 1095 atc gca aac aaa gtt ttg act gtc cag acg atc gac aac gcg ctc 3339 Ile Ala Asn Lys Val Leu Thr Val Gln Thr Ile Asp Asn Ala Leu 1100 1105 1110 agt aaa cgt aac gaa aaa tgg gat gag gtg tat aag tat att gtt 3384 Ser Lys Arg Asn Glu Lys Trp Asp Glu Val Tyr Lys Tyr Ile Val 1115 1120 1125 acc aac tgg ctc gct aaa gta aac acc cag att gac ctg att cgc 3429 Thr Asn Trp Leu Ala Lys Val Asn Thr Gln Ile Asp Leu Ile Arg 1130 1135 1140 aag aag atg aaa gaa gcg ctg gaa aac caa gca gaa gcg acc aaa 3474 Lys Lys Met Lys Glu Ala Leu Glu Asn Gln Ala Glu Ala Thr Lys 1145 1150 1155 gct att atc aac tat caa tat aac cag tac aca gag gaa gaa aag 3519 Ala Ile Ile Asn Tyr Gln Tyr Asn Gln Tyr Thr Glu Glu Glu Lys 1160 1165 1170 aat aac atc aac ttc aac atc gac gac tta tct tca aag ctg aat 3564 Asn Asn Ile Asn Phe Asn Ile Asp Asp Leu Ser Ser Lys Leu Asn 1175 1180 1185 gaa tct att aac aaa gcg atg att aat att aac aag ttc ttg aac 3609 Glu Ser Ile Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile Asn Lys Phe Leu Asn 1190 1195 1200 caa tgt agt gtc agc tat ctg atg aac tcg atg atc cca tat ggt 3654 Gln Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met Asn Ser Met Ile Pro Tyr Gly 1205 1210 1215 gtg aaa cgt ctg gaa gac ttc gat gca agc ctt aaa gat gcc ctt 3699 Val Lys Arg Leu Glu Asp Phe Asp Ala Ser Leu Lys Asp Ala Leu 1220 1225 1230 ctg aag tat att tac gat aat cgc gga act ctt att ggc caa gtg 3744 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Asn Ala Ile Val Tyr Asn Ser Met Tyr Glu 1340 1345 1350 aat ttc tct acg agc ttt tgg att cgt att ccg aaa tat ttc aac 4104 Asn Phe Ser Thr Ser Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Phe Asn 1355 1360 1365 agt atc tct tta aac aac gag tat act atc atc aat tgt atg gag 4149 Ser Ile Ser Leu Asn Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Glu 1370 1375 1380 aat aac agc ggg tgg aaa gtg agc ctt aac tat ggt gaa atc atc 4194 Asn Asn Ser Gly Trp Lys Val Ser Leu Asn Tyr Gly Glu Ile Ile 1385 1390 1395 tgg act ctg cag gac act caa gaa att aaa caa cgc gtg gtg ttt 4239 Trp Thr Leu Gln Asp Thr Gln Glu Ile Lys Gln Arg Val Val Phe 1400 1405 1410 aaa tac tca cag atg att aac atc tcg gat tat att aat cgc tgg 4284 Lys Tyr Ser Gln Met Ile Asn Ile Ser Asp Tyr Ile Asn Arg Trp 1415 1420 1425 att ttt gtg aca att act aac aac cgg ctg aac aac agc aaa att 4329 Ile Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn Arg Leu Asn Asn Ser Lys Ile 1430 1435 1440 tac att aac ggt cgc ctg atc gat cag aaa cca atc agt aat ctc 4374 Tyr Ile Asn Gly Arg Leu Ile Asp Gln Lys 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aat aat atc gcg aaa ctg gtg gcc tca aat tgg tac aac cgt 5049 Phe Asn Asn Ile Ala Lys Leu Val Ala Ser Asn Trp Tyr Asn Arg 1670 1675 1680 cag att gag cgc agc tcc cgc act tta ggc tgt agc tgg gag ttc 5094 Gln Ile Glu Arg Ser Ser Arg Thr Leu Gly Cys Ser Trp Glu Phe 1685 1690 1695 att ccg gta gat gac ggt tgg gga gaa cgc cca ttg aaa gtc gac 5139 Ile Pro Val Asp Asp Gly Trp Gly Glu Arg Pro Leu Lys Val Asp 1700 1705 1710 aag ctt ctg gta ccg cgc ggc agc aaa ctg cag ctc gag cac cac 5184 Lys Leu Leu Val Pro Arg Gly Ser Lys Leu Gln Leu Glu His His 1715 1720 1725 cac cac cac cac tga 5199 His His His His 1730 <210> 6 <211> 1732 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 6 Met Pro Lys Ile Asn Ser Phe Asn Tyr Asn Asp Pro Val Asn Asp Arg 1 5 10 15 Thr Ile Leu Tyr Ile Lys Pro Gly Gly Cys Gln Glu Phe Tyr Lys Ser 20 25 30 Phe Asn Ile Met Lys Asn Ile Trp Ile Ile Pro Glu Arg Asn Val Ile 35 40 45 Gly Thr Thr Pro Gln Asp Phe His Pro Pro Thr 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Thr Ile Ser 675 680 685 Asn Ala Leu Lys Lys Arg Asp Gln Lys Trp Thr Asp Met Tyr Gly Leu 690 695 700 Ile Val Ser Gln Trp Leu Ser Thr Val Asn Thr Gln Phe Tyr Thr Ile 705 710 715 720 Lys Glu Arg Met Tyr Asn Ala Leu Asn Asn Gln Ser Gln Ala Ile Glu 725 730 735 Lys Ile Ile Glu Asp Gln Tyr Asn Arg Tyr Ser Glu Glu Asp Lys Met 740 745 750 Asn Ile Asn Ile Asp Phe Asn Asp Ile Asp Phe Lys Leu Asn Gln Ser 755 760 765 Ile Asn Leu Ala Ile Asn Asn Ile Asp Asp Phe Ile Asn Gln Cys Ser 770 775 780 Ile Ser Tyr Leu Met Asn Arg Met Ile Pro Leu Ala Val Lys Lys Leu 785 790 795 800 Lys Asp Phe Asp Asp Asn Leu Lys Arg Asp Leu Leu Glu Tyr Ile Asp 805 810 815 Thr Asn Glu Leu Tyr Leu Leu Asp Glu Val Asn Ile Leu Lys Ser Lys 820 825 830 Val Asn Arg His Leu Lys Asp Ser Ile Pro Phe Asp Leu Ser Leu Tyr 835 840 845 Thr Lys Asp Thr Ile Leu Ile Gln Val Phe Asn Asn Tyr Ile Ser Asn 850 855 860 Ile Ser Ser Asn Ala Ile Leu Ser Leu Ser Tyr Arg Gly Gly Arg Leu 865 870 875 880 Ile Asp Ser Ser Gly Tyr Gly Ala Thr Met Asn Val Gly Ser Asp Val 885 890 895 Ile Phe Asn Asp Ile Gly Asn Gly Gln Phe Lys Leu Asn Asn Ser Glu 900 905 910 Asn Ser Asn Ile Thr Ala His Gln Ser Lys Phe Val Val Tyr Asp Ser 915 920 925 Met Phe Asp Asn Phe Ser Ile Asn Phe Trp Val Arg Thr Pro Lys Tyr 930 935 940 Asn Asn Asn Asp Ile Gln Thr Tyr Leu Gln Asn Glu Tyr Thr Ile Ile 945 950 955 960 Ser Cys Ile Lys Asn Asp Ser Gly Trp Lys Val Ser Ile Lys Gly Asn 965 970 975 Arg Ile Ile Trp Thr Leu Ile Asp Val Asn Ala Lys Ser Lys Ser Ile 980 985 990 Phe Phe Glu Tyr Ser Ile Lys Asp Asn Ile Ser Asp Tyr Ile Asn Lys 995 1000 1005 Trp Phe Ser Ile Thr Ile Thr Asn Asp Arg Leu Gly Asn Ala Asn 1010 1015 1020 Ile Tyr Ile Asn Gly Ser Leu Lys Lys Ser Glu Lys Ile Leu Asn 1025 1030 1035 Leu Asp Arg Ile Asn Ser Ser Asn Asp Ile Asp Phe Lys Leu Ile 1040 1045 1050 Asn Cys Thr Asp Thr Thr Lys Phe Val Trp Ile Lys Asp Phe Asn 1055 1060 1065 Ile Phe Gly Arg Glu Leu Asn Ala Thr Glu Val Ser Ser Leu Tyr 1070 1075 1080 Trp Ile Gln Ser Ser Thr Asn Thr Leu Lys Asp Phe Trp Gly Asn 1085 1090 1095 Pro Leu Arg Tyr Asp Thr Gln Tyr Tyr Leu Phe Asn Gln Gly Met 1100 1105 1110 Gln Asn Ile Tyr Ile Lys Tyr Phe Ser Lys Ala Ser Met Gly Glu 1115 1120 1125 Thr Ala Pro Arg Thr Asn Phe Asn Asn Ala Ala Ile Asn Tyr Gln 1130 1135 1140 Asn Leu Tyr Leu Gly Leu Arg Phe Ile Ile Lys Lys Ala Ser Asn 1145 1150 1155 Ser Arg Asn Ile Asn Asn Asp Asn Ile Val Arg Glu Gly Asp Tyr 1160 1165 1170 Ile Tyr Leu Asn Ile Asp Asn Ile Ser Asp Glu Ser Tyr Arg Val 1175 1180 1185 Tyr Val Leu Val Asn Ser Lys Glu Ile Gln Thr Gln Leu Phe Leu 1190 1195 1200 Ala Pro Ile Asn Asp Asp Pro Thr Phe Tyr Asp Val Leu Gln Ile 1205 1210 1215 Lys Lys Tyr Tyr Glu Lys Thr Thr Tyr Asn Cys Gln Ile Leu Cys 1220 1225 1230 Glu Lys Asp Thr Lys Thr Phe Gly Leu Phe Gly Ile Gly Lys Phe 1235 1240 1245 Val Lys Asp Tyr Gly Tyr Val Trp Asp Thr Tyr Asp Asn Tyr Phe 1250 1255 1260 Cys Ile Ser Gln Trp Tyr Leu Arg Arg Ile Ser Glu Asn Ile Asn 1265 1270 1275 Lys Leu Arg Leu Gly Cys Asn Trp Gln Phe Ile Pro Val Asp Glu 1280 1285 1290 Gly Trp Thr Glu 1295 <210> 14 <211> 1315 <212> PRT <213> Clostridium tetani <400> 14 Met Pro Ile Thr Ile Asn Asn Phe Arg Tyr Ser Asp Pro Val Asn Asn 1 5 10 15 Asp Thr Ile Ile Met Met Glu Pro Pro Tyr Cys Lys Gly Leu Asp Ile 20 25 30 Tyr Tyr Lys Ala Phe Lys Ile Thr Asp Arg Ile Trp Ile Val Pro Glu 35 40 45 Arg Tyr Glu Phe Gly Thr Lys Pro Glu Asp Phe Asn Pro Pro Ser Ser 50 55 60 Leu Ile Glu Gly Ala Ser Glu Tyr Tyr Asp Pro Asn Tyr Leu Arg Thr 65 70 75 80 Asp Ser Asp Lys Asp Arg Phe Leu Gln Thr Met Val Lys Leu Phe Asn 85 90 95 Arg Ile Lys Asn Asn Val Ala Gly Glu Ala Leu Leu Asp Lys Ile Ile 100 105 110 Asn Ala Ile Pro Tyr Leu Gly Asn Ser Tyr Ser Leu Leu Asp Lys Phe 115 120 125 Asp Thr Asn Ser Asn Ser Val Ser Phe Asn Leu Leu Glu Gln Asp Pro 130 135 140 Ser Gly Ala Thr Thr Lys Ser Ala Met Leu Thr Asn Leu Ile Ile Phe 145 150 155 160 Gly Pro Gly Pro Val Leu Asn Lys Asn Glu Val Arg Gly Ile Val Leu 165 170 175 Arg Val Asp Asn Lys Asn Tyr Phe Pro Cys Arg Asp Gly Phe Gly Ser 180 185 190 Ile Met Gln Met Ala 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Claims (30)

  1. 클로스트리듐 신경독소 유도체로서, 상기 클로스트리듐 신경독소 유도체는,
    a) 결합 도메인,
    b) 전좌 도메인, 및
    c) 클로스트리듐 신경독소 BoNT/A 아형에서 유래된 제1 활성 엔도펩티다제 도메인, 및
    d) 클로스트리듐 신경독소 BoNT/E 아형에서 유래된 제2 활성 엔도펩티다제 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는, 클로스트리듐 신경독소 유도체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 결합 도메인, 전좌 도메인, 제1 엔도펩티다제 도메인, 및 제2 엔도펩티다제 도메인은 단일 폴리펩타이드 사슬에 포함되는, 클로스트리듐 신경독소 유도체.
  3. 제2항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 상기 결합 도메인 및 상기 전좌 도메인을 포함하는 제1 영역과, 상기 제1 엔도펩티다제 도메인 및 제2 엔도펩티다제 도메인을 포함하는 제2 영역 사이에 위치하는 선택적인 엔도펩티다제 절단 부위를 더 포함하는, 클로스트리듐 신경독소 유도체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 결합 도메인, 전좌 도메인, 제1 엔도펩티다제 도메인, 및 제2 엔도펩티다제 도메인은 1개 초과의 폴리펩타이드 사슬에 포함되는, 클로스트리듐 신경독소 유도체.
  5. 제4항에 있어서, 상기 1개 초과의 폴리펩타이드 사슬 중 적어도 2개는 다이설파이드 결합에 의해 연결되는, 클로스트리듐 신경독소 유도체.
  6. 제1항에 있어서, 상기 결합 도메인 및 상기 전좌 도메인을 포함하는 제1 폴리펩타이드 사슬, 및 상기 제1 활성 엔도펩티다제 도메인 및 제2 활성 엔도펩티다제 도메인을 포함하는 제2 폴리펩타이드 사슬을 포함하는, 클로스트리듐 신경독소 유도체.
  7. 제5항에 있어서, 상기 결합 도메인 및 상기 전좌 도메인을 포함하는 제1 폴리펩타이드 사슬, 및 상기 제1 엔도펩티다제 도메인 및 제2 엔도펩티다제 도메인을 포함하는 제2 폴리펩타이드 사슬을 포함하는, 클로스트리듐 신경독소 유도체.
  8. 제1항에 있어서, 상기 결합 도메인 및 전좌 도메인은 클로스트리듐 신경독소 BoNT/A에서 유래되는, 클로스트리듐 신경독소 유도체.
  9. 제8항에 있어서, 상기 전좌 도메인과 제1 엔도펩티다제 도메인 사이에 위치하는 제1 프로테아제 절단 부위를 포함하는 제1 아미노산 서열을 포함하는, 클로스트리듐 신경독소 유도체.
  10. 제8항에 있어서,
    a) 상기 결합 도메인의 카복실 말단면, 또는 상기 제2 활성 엔도펩티다제 도메인의 아미노 말단에 위치한 폴리히스티딘 아미노산 서열;
    b) 상기 전좌 도메인과 상기 제1 활성 엔도펩티다제 도메인 사이에 위치한 제1 프로테아제 절단 부위를 포함하는 제1 아미노산 서열; 및
    c) 상기 제2 활성 엔도펩티다제 도메인과 상기 폴리히스티딘 아미노산 서열 사이, 또는 상기 결합 도메인과 폴리히스티딘 아미노산 서열 사이에 위치한 제2 프로테아제 절단 부위를 포함하는 제2 아미노산 서열
    을 더 포함하는, 클로스트리듐 신경독소 유도체.
  11. 클로스트리듐 신경독소 유도체를 포함하는 만성 통증 치료용 조성물로서,
    상기 클로스트리듐 신경독소 유도체는 결합 도메인, 전좌 도메인, 클로스트리듐 신경독소 BoNT/A 아형에서 유래된 제1 활성 엔도펩티다제 도메인, 및 클로스트리듐 신경독소 BoNT/E 아형에서 유래된 제2 활성 엔도펩티다제 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는, 만성 통증 치료용 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 만성 통증은 염증성 침해수용성 통증 및 신경병증성 통증으로 이루어진 군에서 선택되는, 만성 통증 치료용 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 만성 통증은 신경병증성 통증인, 만성 통증 치료용 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 신경병증성 통증은 암 통증, 수술후 통증, 이질통, 포진후 신경통, 과민성 대장 증후군, 및 다른 내장통, 골 통증, 말초 신경병증, 순환계-연계 통증, 및 두통으로 이루어진 군에서 선택되는, 만성 통증 치료용 조성물.
  15. 제12항에 있어서, 상기 만성 통증은 염증성 침해수용성 통증인, 만성 통증 치료용 조성물.
  16. 제12항에 있어서, 상기 만성 통증은 관절염 통증인, 만성 통증 치료용 조성물.
  17. 제11항에 있어서, 상기 만성 통증 치료용 조성물의 상기 결합 도메인 및 전좌 도메인은 클로스트리듐 신경독소 BoNT/A 아형에서 유래되는, 만성 통증 치료용 조성물.
  18. 클로스트리듐 신경독소 유도체로서,
    a) 생리적 조건 하에서 SNARE 단백질을 절단하고 그리고 생리적 조건 하에 마우스 비장근 내에 주사될 경우 10일 이상의 효소 반감기를 갖는 제1 활성 클로스트리듐 독소-유래 엔도펩티다제 도메인;
    b) 제2 활성 클로스트리듐 독소-유래 엔도펩티다제 도메인;
    c) 생리적 조건 하에서 세포막을 가로질러서 세포질 내로 상기 제1 활성 엔도펩티다제 도메인의 이동을 용이하게 하는 클로스트리듐 독소-유래 전좌 도메인; 및
    d) 클로스트리듐 독소-유래 기능적 결합 도메인으로서, 상기 신경독소 유도체가 BoNT/A 단독에서보다 큰 정도로 배양된 래트 감각 뉴런으로부터 캡사이신에 의해 유발된 통증-매개인자의 방출을 차단하는, 상기 클로스트리듐 독소-유래 기능적 결합 도메인을 포함하는, 클로스트리듐 신경독소 유도체.
  19. 제18항에 있어서, 상기 제1 및 제2 클로스트리듐 독소-유래 엔도펩티다제 도메인은 둘 다 클로스트리듐 보툴리늄 신경독소로부터 유래되는, 클로스트리듐 신경독소 유도체.
  20. 제19항에 있어서, 상기 제1 및 제2 클로스트리듐 독소-유래 엔도펩티다제 도메인은 상이한 클로스트리듐 신경독소 아형으로부터 유래되는, 클로스트리듐 신경독소 유도체.
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