JP2017501715A - 慢性疼痛のためのマルチプロテアーゼ(multiprotease)治療薬 - Google Patents
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Abstract
Description
クロストリジウム・ボツリナムにより産生されるボツリヌス神経毒素(BoNT)血清型A〜Gは、シナプス小胞と細胞膜との融合を媒介し、そのためニューロンからの神経伝達物質、疼痛ペプチドおよびサイトカインのCa2+−刺激性エキソサイトーシスに必須である、SNARE(「可溶性NSF接着タンパク質受容体」)タンパク質をタンパク質分解により切断することにより末梢神経からのアセチルコリン放出を特異的に遮断することで知られる、最も強力な毒である。
a)神経筋障害、例えばKei Roger Aoki et al., Method for Treating Neuromuscular Disorders and Conditions with Botulinum Toxin Types A and B, 米国特許第6,872,397号(2005年3月29日); Rhett M. Schiffman, Methods for Treating Uterine Disorders, 米国特許出願公開第2004/0175399号(2004年9月9日); Richard L. Barron, Methods for Treating Ulcers and Gastroesophageal Reflux Disease, 米国特許出願公開第2004/0086531号(2004年5月7日);およびKei Roger Aoki, et al., Method for Treating Dystonia with Botulinum Toxin C to G, 米国特許第6,319,505号(2001年11月20日)参照;
b) 目の障害、例えばEric R. First, Methods and Compositions for Treating Eye Disorders,米国特許出願公開第2004/0234532号(2004年11月25日); Kei Roger Aoki et al., Botulinum Toxin Treatment for Blepharospasm,米国特許出願公開第2004/0151740号(2004年8月5日);およびKei Roger Aoki et al., Botulinum Toxin Treatment for Strabismus,米国特許出願公開第2004/0126396号(2004年7月1日)参照;
c)疼痛、例えばKei Roger Aoki et al., Pain Treatment by Peripheral Administration of a Neurotoxin,米国特許第6,869,610号(2005年3月22日); Stephen Donovan, Clostridial Toxin Derivatives and Methods to Treat Pain,米国特許第6,641,820号(2003年11月4日); Kei Roger Aoki, et al., Method for Treating Pain by Peripheral Administration of a Neurotoxin,米国特許第6,464,986号(2002年10月15日); Kei Roger Aoki and Minglei Cui, Methods for Treating Pain,米国特許第6,113,915号(2000年9月23日); Martin A. Voet, Methods for Treating Fibromyalgia,米国特許第6,623,742号(2003年9月23日); Martin A. Voet, Botulinum Toxin Therapy for Fibromyalgia,米国特許出願公開第2004/0062776号(2004年4月1日);およびKei Roger Aoki et al., Botulinum Toxin Therapy for Lower Back Pain,米国特許出願公開第2004/0037852号(2004年2月26日)参照;
d)筋肉損傷、例えばGregory F. Brooks, Methods for Treating Muscle Injuries,米国特許第6,423,319号(2002年7月23日)参照;
e)頭痛、例えばMartin Voet, Methods for Treating Sinus Headache,米国特許第6,838,434号(2005年1月4日); Kei Roger Aoki et al., Methods for Treating Tension Headache,米国特許第6,776,992号(2004年8月17日);およびKei Roger Aoki et al., Method for Treating Headache,米国特許第6,458,365号(2002年10月1日); William J. Binder, Method for Reduction of Migraine Headache Pain,米国特許第5,714,469号(1998年2月3日)参照;
f)心血管疾患、例えばGregory F. Brooks and Stephen Donovan, Methods for Treating Cardiovascular Diseases with Botulinum Toxin,米国特許第6,767,544号(2004年7月27日)参照;
e)神経障害、例えばStephen Donovan, Parkinson’s Disease Treatment,米国特許第6,620,415号(2003年9月16日);およびStephen Donovan, Method for Treating Parkinson’s Disease with a Botulinum Toxin,米国特許第6,306,403号(2001年10月23日)参照;
g)精神神経障害、例えばStephen Donovan, Botulinum Toxin Therapy for Neuropsychiatric Disorders,米国特許出願公開第2004/0180061号(2004年9月16日);およびSteven Donovan, Therapeutic Treatments for Neuropsychiatric Disorders,米国特許出願公開第2003/0211121号(2003年11月13日)参照;
f)内分泌障害、例えばStephen Donovan, Method for Treating Endocrine Disorders,米国特許第6,827,931号(2004年12月7日); Stephen Donovan, Method for Treating Thyroid Disorders with a Botulinum Toxin,米国特許第6740321号(2004年5月25日); Kei Roger Aoki et al., Method for Treating a Cholinergic Influenced Sweat Gland,米国特許第6,683,049号(2004年1月27日); Stephen Donovan, Neurotoxin Therapy for Diabetes,米国特許第6,416,765号(2002年7月9日); Stephen Donovan, Methods for Treating Diabetes,米国特許第6,337,075号(2002年1月8日); Stephen Donovan, Method for Treating a Pancreatic Disorder with a Neurotoxin,米国特許第6,261,572号(2001年7月17日); Stephen Donovan, Methods for Treating Pancreatic Disorders,米国特許第6,143,306号(2000年11月7日)参照;
g)癌、例えばStephen Donovan, Methods for Treating Bone Tumors,米国特許第6,565,870号 (2003年5月20日); Stephen Donovan, Method for Treating Cancer with a Neurotoxin to Improve Patient Function,米国特許第6,368,605号(2002年4月9日); Stephen Donovan, Method for Treating Cancer with a Neurotoxin,米国特許第6,139,845号(2000年10月31日);およびMitchell F. Brin and Stephen Donovan, Methods for Treating Diverse Cancers,米国特許出願公開第2005/0031648号(2005年2月10日)参照;
h)耳の障害、例えばStephen Donovan, Neurotoxin Therapy for Inner Ear Disorders,米国特許第6358926号( 2002年19月3日);およびStephen Donovan, Method for Treating Otic Disorders,米国特許第6265379号(2001年7月24日)参照;
i)自律神経障害、例えばPankai J. Pasricha and Anthony N. Kalloo, Method for Treating Gastrointestinal Muscle Disorders and Other Smooth Muscle Dysfunction,米国特許第5,437,291号(1995年8月1日)参照;
j)ならびに他の障害、例えばWilliam J. Binder, Method for Treatment of Skin Lesions Associated with Cutaneous Cell−proliferative Disorders,米国特許第5,670,484号(1997年9月23日); Eric R. First, Application of Botulinum Toxin to the Management of Neurogenic Inflammatory Disorders,米国特許第6,063,768号(2000年5月16日); Marvin Schwartz and Brian J. Freund, Method to Reduce Hair Loss and Stimulate Hair Growth,米国特許第6,299,893号(2001年10月9日); Jean D. A. Carruthers and Alastair Carruthers, Cosmetic Use of Botulinum Toxin for Treatment of Downturned Mouth,米国特許第6,358,917号(2002年3月19日); Stephen Donovan, Use of a Clostridial Toxin to Reduce Appetite,米国特許出願公開第2004/40253274号(2004年12月16日);およびHoward I. Katz and Andrew M. Blumenfeld, Botulinum Toxin Dental Therapies and Procedures,米国特許出願公開第2004/0115139号(2004年6月17日); Kei Roger Aoki, et al., Treatment of Neuromuscular Disorders and Conditions with Different Botulinum,米国特許出願公開第2002/0010138号(2002年1月24日);およびKei Roger Aoki, et al., Use of Botulinum Toxins for Treating Various Disorders and Conditions and Associated Pain,米国特許出願公開第2004/0013692号(2004年1月22日)参照。
本発明は、ボツリヌス神経毒素由来の治療性ポリペプチド分子に関する方法および組成物を対象とする。詳細にはこの分子は、異なるBoNT血清型の軽鎖に由来する少なくとも2つの活性エンドペプチダーゼドメインを含む。非常に好ましくはこのエンドペプチダーゼドメインは、それらの基質における異なるアミノ酸配列を認識して切断する。特に好ましくは、このエンドペプチダーゼドメインは、2つ以上のBoNT血清型、または1つのBoNT血清型と1つのTeTx LCに由来する。
a)結合ドメインと、
b)転移ドメインと、
c)クロストリジウム神経毒素BoNT/Aサブタイプ由来の第一のエンドペプチダーゼドメインと、
d)クロストリジウム神経毒素BoNT/Eサブタイプ由来の第二のエンドペプチダーゼドメインと、
を含むポリペプチドを含む、組成物が提供される。
実施例1
E.coli内での発現増大のために最適化されたコドンとLys残基をコードする3つの余分のヌクレオチド(AAA)とを有する合成BoNT/Aの遺伝子を、原核生物発現ベクターpET29a(+)のNde IおよびSal I部位にクローニングして、pET−29a−BoNT/Aを生成した。
a)ヌクレオチド1〜3:C−末端His6(SEQ ID NO:15)を除去するための、任意のトリプシン切断部位を提供する追加的Lysをコードする、挿入されたAAAコドン;
b)1本の下線:Sal I制限エンドヌクレアーゼ部位;
c)二重下線:Hind III制限エンドヌクレアーゼ部位;
d)太字:トロンビン認識配列;
e)1本の下線:Pst I制限エンドヌクレアーゼ部位;
f)二重下線:Xho I制限エンドヌクレアーゼ部位;
g)ヌクレオチド49〜66:His6(SEQ ID NO:15)タグをコードするヌクレオチド領域。アライメントされたアミノ酸配列が、対応するヌクレオチドの上に示されている。矢印はトロンビン切断部位を示し、アスタリスクは翻訳「終止」コドンを表す。
LC/E−BoNT/Aの発現のため、配列が検証された構築物をE.coli BL21(DE3)株に形質転換し、標的タンパク質の発現を、スタディア(Studier’s)自動誘導培地を用いて誘導した(Studier, F.W., 41 Protein Expr. Purif. 207 (2005))。細菌溶解物中のHis6(SEQ ID NO:15)タグタンパク質の部分精製(約60%)を、Talon Superflow Resinを用いる固定金属(Co2+)アフィニティークロマトグラフ(IMAC)で実現した。分子量約200kDaの主要なタンパク質が、50mM以上のイミダゾールにより溶出され、これは、SDS−PAGEおよびそのゲルのクーマシーブルー染色を示す図2Aにおいて示される。ゲルのレーンは以下の通りである:レーン1:IMACカラムにアプライする前の洗浄された溶解物;レーン2:IMACカラムのフロースルー画分;レーン3:IMACカラムの洗浄画分;レーン4〜9:IMACカラムからイミダゾールを用いて溶出された画分。
溶出されたインタクト毒素を25mM HEPES/145mM NaCl(pH7.4)にバッファー交換した後、精製された一本鎖(「SC」)タンパク質を−80℃で貯蔵し、アリコットをSDS−PAGE分析のために採取した。図3は、精製されたポリペプチドの還元(+)および非還元(−)SDS−PAGEおよびウェスタンブロット分析の結果を示しており、見かけの分子量が約200kDaの単一バンド移動により明らかなように、この精製タンパク質が実際にSC形態で発現されたことが確認される。このバンドは、還元剤の非存下または存在下のいずれかで認められた。例えば、図3のクーマシーブリリアントブルー染色ゲル写真のレーンSC(−)およびSC(+)を参照されたい。
組換え生成されたLC/E−BoNT/AおよびBoNT/Aを、培養されたラット小脳顆粒ニューロン(CGN)と共に、10倍系列希釈された0.01pM〜1000pMの毒素濃度で一晩それぞれインキュベートした。これらの細胞を、7〜8日齢ラットの小脳から分離して、基本イーグル培地3部および40mM HEPES−NaOH(pH7.3)+78.4mM KCl+37.6mM D−グルコース+2.8mM CaCl2+1.6mM MgSO4+1.0mM NaH2PO4 1部、ならびに1×N2サプリメント、1mM L−グルタミン、60単位/mlペニシリン、60μg/mlストレプトマイシン、および2%(v/v)ウマ透析血清の中に、約1×106/mlで懸濁させる。この細胞懸濁液のアリコット(1ml)を、16mm径ポリ−D−リシンコーティングウェル(即ち、24ウェル形式)のそれぞれに添加し、5%(v/v)CO2中で20〜24時間培養した後、シトシン−β−D−アラビノフラノシド(40μM)を添加し;ニューロンを、10日おきに同一の新たに調製された培地と交換することにより保持する。特定されたら、ニューロンを培地中のBoNT/AまたはLC/E−BoNT/A(0.2−μmフィルターで滅菌済)のいずれかに24時間暴露する。BoNT/AまたはLC/E−BoNT/Aタンパク質と24時間インキュベートした後、細胞をその後回収し、インタクトSNAP−25を認識する抗SNAP−25抗体ならびに、LC/A切断SNAP−25およびLC/E切断SNAP−25を用いるSDS−PAGEおよびウェスタンブロットに供する。SNAREタンパク質シンタキシン1を、陽性内部負荷対照として用いた。
LC/E−BoNT/Aの特異的神経毒性は、参照により本明細書に組み入れられるMaisey, E. A., et al., 177 EUR. J. BIOCHEM. 683−691(1988)に記載される手法で、マウスに腹腔内注射することにより測定される。4日以内にマウスの50%を殺傷する最低毒素量は、1最小致死量(mLD50)と定義される。毒素の特異的活性は、mLD50単位/mg毒素の数として表現できる。
三叉神経節ニューロン(TGN)を用いて、LC/E−BoNT/Aタンパク質の抗侵害受容能を検査する。これらの細胞は、疼痛の伝播へのそれらの関与および、培養中のこれらの細胞が、異なる刺激により惹起される疼痛ペプチド(CGRP、SP)の放出を研究するための良好なモデルを提供するという事実から、この実験の良好なモデルである(例えば、Bacccaglini and Hogan, 80 PROC NATL ACAD SCI U.S.A. 594−598 (1983)参照)。トウガラシから単離されたカプサイシンは、感覚ニューロンのC線維で主に発現されるTRPV1を活性化する。したがって、アゴニストであるカプサイシンにより誘発されるCGRPの放出を遮断するこの複合毒素の能力は、その阻害活性の良好な指標になるはずである。
LC/E−BoNT/Aの抗侵害受容活性を、持続的な末梢神経因性疼痛のラットモデルにおいて、即ち神経部分損傷(SNI)アッセイで評価した。このモデルは、事実上全ての神経因性疼痛(切断による完全損傷に誘発される、幻肢痛の特別な例を除く)が部分的な神経損傷により生じる、という観察に基づく。これらの神経因性疼痛としては、糖尿病性神経障害、ヘルペス後神経痛、毒性神経障害、圧迫性神経障害および外傷が挙げられ、それらは突発的乱切痛、灼熱痛およびショック様の疼痛ならびに接触性アロディニア、針刺激性痛覚過敏およびヒペルパチーを含む疼痛過敏を特徴とする。
以下に示される複合的合成神経毒素オープンリーディングフレームLC/E−BoNT/Aの遺伝子配列およびそのコードされるアミノ酸(それぞれSEQ ID NO:5および6)は、それぞれ以下の領域を含む(ヌクレオチド残基に関して同定):残基1〜1233、LC/E;残基1240〜5130、BoNT/A。ヌクレオチド(1234〜1239)を含むDNA配列がリンカーとして導入され、適正なリーディングフレームを確実にする。一列に並べたアミノ酸配列が、対応するヌクレオチドの上に示されている。トロンビンプロテアーゼ認識配列が、LC/AとHN/Aの間のループに挿入され;同様に別のトロンビン部位が、切断配列を有するようにBoNT/A遺伝子のカルボキシ部位に導入され;これらによりC−末端His6(SEQ ID NO:15)の同時のニッキングおよび除去が可能になる。
別の実施例において、上に記載された手法と実質的に類似の手法で、LC/E−BoNT/A核酸中のLC/E遺伝子を合成LC/E遺伝子と置き換えて、単一オープンリーディングフレームとしてLC/B−BoNT/Aをコードする最終プラスミドを作製することにより、マルチエンドペプチダーゼ構築物を作製した。
LC/E−BoNT/A(同じ基質の2つの異なる配列を認識する2つの活性プロテアーゼ)およびLC/B−BoNT/A(2つの異なる基質を切断する2つのプロテアーゼ)からの陽性の機能的結果に示されるように、およびこの特許出願の開示を考慮することにより、当業者は、本発明のさらなる実施例が、様々な神経タイプ(例えば、感覚ニューロンおよび交感神経細胞)からの疼痛ペプチド、サイトカイン、および神経伝達物質の放出を阻害するための、異なるクロストリジウム神経毒素またはクロストリジウム神経毒素サブタイプの組み合わせにより様々な他のマルチエンドペプチダーゼ治療薬を作製するための組成物および方法を含み得ることを、認識しているであろう。その上、マルチプロテアーゼ毒素の作用の活性は、サイトカイン放出細胞のそのようなメディエータによる活性を間接的に遮断するであろう。
60歳男性が、左臀部に重度の慢性関節痛を示し、歩行困難を有している。検査により、患者は、股関節(臀部関節)の関節リウマチと診断されている。
ヒトに使用するための十分量のクロストリジウム神経毒素誘導体LC/E/BoNT/Aの予想される最終的要件は、製造管理および品質管理に関する基準を満たす(GMP遵守)施設での生成法に適合するLC/E−BoNT/Aタンパク質の発現および精製のための、生成/精製基盤を必要とする。LC/E−BoNT/Aタンパク質の大規模生成および精製は、本質的にベンチスケール実験について上に記載されるように実施される。この工程は、SDS−PAGEで予測される見かけの分子量(約200kDa)を有する純粋な活性化生成物を生じる。鎖間ジスルフィド結合の還元に続いて、HC鎖とLC/E−LC/A鎖が、還元SDS−PAGEゲル上を共にに移動し、それぞれが約100kDaの見かけの分子量を有し;クーマシーブリリアントブルーでの染色から、図3に示されるものと実質的に同一の移動パターンが明らかである。GMP遵守生成法に適合した工程を利用して製造されるLC/E−BoNT/Aは、「PK」と呼称する。
この新規なGMP様抗侵害受容物質の高い効率は、一定割合の患者において顕著な有害反応および限定的な鎮痛作用を及ぼすことでも知られる、神経因性疼痛用の第一選択処置として臨床使用される鎮痛剤プレガバリンの10mg/kgでの連日全身(I.P.)投与に関連して、PK(75U/Kg)の単回注射のSNIモデルで評価することによりさらに実証される。
1)クロストリジウム神経毒素誘導体を含む組成物であって、前記クロストリジウム神経毒素誘導体が、結合ドメインと、転移ドメインと、第一のエンドペプチダーゼドメインと、第二のエンドペプチダーゼドメインとを含むポリペプチドを含み、前記第一のエンドペプチダーゼドメインおよび前記第二のエンドペプチダーゼドメインのそれぞれがSNAREタンパク質に対する選択的タンパク質分解活性を有し、かつSNAREタンパク質における異なる切断部位を認識する、組成物。
2)前記結合ドメイン、転移ドメイン、第一のエンドペプチダーゼドメイン、および第二のエンドペプチダーゼドメインが単一ポリペプチド鎖内に含まれる、請求項1に記載の組成物。
3)前記ポリペプチドが、前記結合ドメインおよび前記転移ドメインを含む第一の領域と、前記第一のエンドペプチダーゼドメインおよび第二のエンドペプチダーゼドメインを含む第二の領域との間に位置する選択的エンドペプチダーゼ切断部位をさらに含む、請求項2に記載の組成物。
4)前記結合ドメイン、転移ドメイン、第一のエンドペプチダーゼドメイン、および第二のエンドペプチダーゼドメインが1つよりも多いポリペプチド鎖内に含まれる、請求項1に記載の組成物。
5)少なくとも2つの前記ポリペプチド鎖がジスルフィド結合により連結される、請求項4に記載の組成物。
6)前記結合ドメインおよび前記転移ドメインを含む第一のポリペプチド鎖と、前記第一のエンドペプチダーゼドメインおよび第二のエンドペプチダーゼドメインを含む第二のポリペプチド鎖とを含む、請求項1に記載の組成物。
7)前記結合ドメインおよび前記転移ドメインを含む第一のポリペプチド鎖と、前記第一のエンドペプチダーゼドメインおよび第二のエンドペプチダーゼドメインを含む第二のポリペプチド鎖とを含む、請求項5に記載の組成物。
8)前記結合ドメインおよび転移ドメインが第一のクロストリジウム神経毒素またはクロストリジウム神経毒素サブタイプに由来し、かつ前記第一のエンドペプチダーゼドメインおよび前記第二のエンドペプチダーゼドメインの少なくとも一方が第二のクロストリジウム神経毒素またはクロストリジウム神経毒素サブタイプに由来する、請求項1に記載の組成物。
9)前記結合ドメイン、転移ドメインが、ならびに前記第一のエンドペプチダーゼドメインおよび前記第二のエンドペプチダーゼドメインの少なくとも一方が第一のクロストリジウム神経毒素またはクロストリジウム神経毒素サブタイプに由来する、請求項8に記載の組成物。
10)前記結合ドメイン、転移ドメイン、および前記第一のエンドペプチダーゼドメインが第一のクロストリジウム神経毒素またはクロストリジウム神経毒素サブタイプに由来し、かつ前記第二のエンドペプチダーゼドメインが第二のクロストリジウム神経毒素またはクロストリジウム神経毒素サブタイプに由来する、請求項9に記載の組成物。
11)前記第一のクロストリジウム神経毒素またはクロストリジウム神経毒素サブタイプがBoNT/Aであり、かつ前記第二のクロストリジウム神経毒素またはクロストリジウム神経毒素サブタイプがBoNT/Eである、請求項10に記載の組成物。
12)前記第一のクロストリジウム神経毒素またはクロストリジウム神経毒素サブタイプがBoNT/Aであり、かつ前記第二のクロストリジウム神経毒素またはクロストリジウム神経毒素サブタイプがBoNT/C1である、請求項11に記載の組成物。
13)前記結合ドメインおよび前記転移ドメインを含む第一のポリペプチド鎖と、前記第一のエンドペプチダーゼドメインおよび第二のエンドペプチダーゼドメインを含む第二のポリペプチド鎖とを含む、請求項11に記載の組成物。
14)前記第一のポリペプチド鎖および第二のポリペプチド鎖がジスルフィド結合により連結される、請求項13に記載の組成物。
15)前記結合ドメイン、転移ドメイン、第一のエンドペプチダーゼドメインおよび第二のエンドペプチダーゼドメインが全て単一のポリペプチド鎖内に含まれる、請求項11に記載の組成物。
16)前記転移ドメインと前記第一のエンドペプチダーゼドメインとの間に位置する第一のプロテアーゼ切断部位を含む第一のアミノ酸配列を含む、請求項11に記載の組成物。
17) a)前記結合ドメインのカルボキシ末端側、または前記第二のエンドペプチダーゼドメインのアミノ末端に位置するポリヒスチジン(polyhistadine)アミノ酸配列と、
b)前記転移ドメインと前記第一のエンドペプチダーゼドメインとの間に位置する第一のプロテアーゼ切断部位を含む第一のアミノ酸配列と、
c)前記第二のエンドペプチダーゼドメインと前記ポリヒスチジン(polyhistadine)アミノ酸配列との間、または前記結合ドメインと前記ポリヒスチジン(polyhistadine)アミノ酸配列との間に位置する第二のプロテアーゼ切断部位を含む第二のアミノ酸配列と、
をさらに含む、請求項11に記載の組成物。
18)クロストリジウム神経毒素誘導体を含むポリペプチドをコードする核酸であって、前記核酸が、カルボキシ末端からアミノ末端への順に:結合ドメイン、転移ドメイン、第一のエンドペプチダーゼドメイン、および第二のエンドペプチダーゼドメインをコードする単一のオープンリーディングフレームを含み、前記第一のエンドペプチダーゼドメインおよび前記第二のエンドペプチダーゼドメインのそれぞれがSNAREタンパク質に対する選択的タンパク質分解活性を有し、かつSNAREタンパク質における異なる切断部位を認識する、核酸。
19)前記結合ドメイン、前記転移ドメイン、前記第一のエンドペプチダーゼドメイン、および前記第二のエンドペプチダーゼドメインのそれぞれをコードするコドンが、細菌細胞、哺乳動物細胞、酵母細胞および昆虫細胞からなる群から選択される細胞型における発現のために最適化される、請求項18に記載の核酸。
20)前記コドンがE.Coli細菌細胞内での発現のために最適化される、請求項19に記載の核酸。
21)前記結合ドメイン、前記転移ドメイン、前記第一のエンドペプチダーゼドメイン、および前記第二のエンドペプチダーゼドメインからなる群から選択される少なくとも2つのドメインが、BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、およびTeTxからなる群から選択される異なるクロストリジウム神経毒素またはクロストリジウム神経毒素サブタイプに由来する核酸配列によりコードされる、請求項18に記載の核酸。
22)前記第一のエンドペプチダーゼドメインおよび前記第二のエンドペプチダーゼドメインが、BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、およびTeTxからなる群から選択される異なるクロストリジウム神経毒素またはクロストリジウム神経毒素サブタイプに由来する核酸配列によりコードされる、請求項21に記載の核酸。
23)前記第一のエンドペプチダーゼドメインがBoNT/Aに由来する核酸配列によりコードされ、かつ前記第二のエンドペプチダーゼドメインがBoNT/C1に由来する核酸配列によりコードされる、請求項22に記載の核酸。
24)前記第一のエンドペプチダーゼドメインがBoNT/Aに由来する核酸配列によりコードされ、かつ前記第二のエンドペプチダーゼドメインがBoNT/Eに由来する核酸配列によりコードされる、請求項22に記載の核酸。
25)前記オープンリーディングフレームが、エンドペプチダーゼ結合ドメインをコードするヌクレオチド配列と終止コドンとの間の少なくとも6つのヒスチジン(histadine)残基をコードする、請求項24に記載の核酸。
26)クロストリジウム神経毒素誘導体を含む治療性組成物を投与することを含む慢性疼痛の処置の方法であって、前記クロストリジウム神経毒素誘導体が、結合ドメインと、転移ドメインと、第一のエンドペプチダーゼドメインと、第二のエンドペプチダーゼドメインとを含むポリペプチドを含み、前記第一のエンドペプチダーゼドメインおよび前記第二のエンドペプチダーゼドメインのそれぞれがSNAREタンパク質に対する選択的タンパク質分解活性を有し、かつSNAREタンパク質における異なる切断部位を認識する、方法。
27)前記慢性疼痛が、炎症性侵害受容性疼痛および神経因性疼痛からなる群から選択される、請求項26に記載の方法。
28)前記慢性疼痛が神経因性疼痛である、請求項27に記載の方法。
29)前記神経因性疼痛が、癌性疼痛、術後疼痛、神経因性疼痛、アロディニア、ヘルペス後神経痛、過敏性腸症候群、および他の内臓性疼痛、骨痛、末梢神経障害、循環器系関連の疼痛、ならびに頭痛からなる群から選択される、請求項28に記載の方法。
30)前記慢性疼痛が炎症性侵害受容性疼痛である、請求項27に記載の方法。
31)前記慢性疼痛が関節炎の疼痛である、請求項27に記載の方法。
32)前記治療性組成物の前記結合ドメインおよび転移ドメインが第一のクロストリジウム神経毒素またはクロストリジウム神経毒素サブタイプに由来し、かつ前記第一のエンドペプチダーゼドメインおよび前記第二のエンドペプチダーゼドメインの少なくとも一方が第二のクロストリジウム神経毒素またはクロストリジウム神経毒素サブタイプに由来する、請求項26に記載の方法。
Claims (30)
- クロストリジウム神経毒素誘導体を含む組成物であって、前記クロストリジウム神経毒素誘導体が、
a)結合ドメインと、
b)転移ドメインと、
c)クロストリジウム神経毒素BoNT/Aサブタイプ由来の第一のエンドペプチダーゼドメインと、
d)クロストリジウム神経毒素BoNT/Eサブタイプ由来の第二のエンドペプチダーゼドメインと
を含むポリペプチドを含み、
前記第一のエンドペプチダーゼドメインおよび前記第二のエンドペプチダーゼドメインが、それぞれ、タンパク質分解性が活性である、
組成物。 - 前記結合ドメイン、転移ドメイン、第一のエンドペプチダーゼドメイン、および第二のエンドペプチダーゼドメインが単一ポリペプチド鎖内に含まれる、請求項1に記載の組成物。
- 前記ポリペプチドが、前記結合ドメインおよび前記転移ドメインを含む第一の領域と、前記第一のエンドペプチダーゼドメインおよび第二のエンドペプチダーゼドメインを含む第二の領域との間に位置する選択的エンドペプチダーゼ切断部位をさらに含む、請求項1または2に記載の組成物。
- 前記結合ドメイン、転移ドメイン、第一のエンドペプチダーゼドメイン、および第二のエンドペプチダーゼドメインが1つよりも多いポリペプチド鎖内に含まれる、請求項1に記載の組成物。
- 少なくとも2つの前記ポリペプチド鎖がジスルフィド結合により連結される、請求項4に記載の組成物。
- 前記結合ドメインおよび前記転移ドメインを含む第一のポリペプチド鎖と、前記第一のエンドペプチダーゼドメインおよび第二のエンドペプチダーゼドメインを含む第二のポリペプチド鎖とを含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記結合ドメインおよび前記転移ドメインを含む第一のポリペプチド鎖と、前記第一のエンドペプチダーゼドメインおよび第二のエンドペプチダーゼドメインを含む第二のポリペプチド鎖とを含む、請求項5に記載の組成物。
- 前記結合ドメインおよび転移ドメインがクロストリジウム神経毒素BoNT/Aに由来する、前記請求項のいずれかに記載の組成物。
- 前記転移ドメインと前記第一のエンドペプチダーゼドメインとの間に位置する第一のプロテアーゼ切断部位を含む第一のアミノ酸配列を含む、請求項8に記載の組成物。
- a)前記結合ドメインのカルボキシ末端側、または前記第二のエンドペプチダーゼドメインのアミノ末端に位置するポリヒスチジンアミノ酸配列と、
b)前記転移ドメインと前記第一のエンドペプチダーゼドメインとの間に位置する第一のプロテアーゼ切断部位を含む第一のアミノ酸配列と、
c)前記第二のエンドペプチダーゼドメインと前記ポリヒスチジン(polyhistadine)アミノ酸配列との間、または前記結合ドメインと前記ポリヒスチジン(polyhistadine)アミノ酸配列との間に位置する第二のプロテアーゼ切断部位を含む第二のアミノ酸配列と
をさらに含む、請求項8に記載の組成物。 - クロストリジウム神経毒素誘導体を含むポリペプチドをコードする核酸であって、前記核酸が、カルボキシ末端からアミノ末端への順に:結合ドメイン、転移ドメイン、クロストリジウム神経毒素BoNT/Aサブタイプに由来する第一のエンドペプチダーゼドメイン、およびクロストリジウム神経毒素BoNT/Eサブタイプに由来する第二のエンドペプチダーゼドメインをコードする単一のオープンリーディングフレームを含み、前記第一のエンドペプチダーゼドメインおよび前記第二のエンドペプチダーゼドメインが、それぞれ、タンパク質分解性が活性である、核酸。
- 前記結合ドメイン、前記転移ドメイン、前記第一のエンドペプチダーゼドメイン、および前記第二のエンドペプチダーゼドメインのそれぞれをコードするコドンが、細菌細胞、哺乳動物細胞、酵母細胞および昆虫細胞からなる群から選択される細胞型における発現のために最適化される、請求項11に記載の核酸。
- 前記コドンが、E.Coli細菌細胞内での高い発現のために選択される、請求項12に記載の核酸。
- 前記結合ドメイン、前記転移ドメインがクロストリジウム神経毒素BoNT/Aサブタイプに由来する核酸配列によりコードされる、請求項11、12または13に記載の核酸。
- 前記オープンリーディングフレームが、結合ドメインをコードするヌクレオチド配列と終止コドンとの間の少なくとも6つのヒスチジン(histadine)残基をコードする、請求項14に記載の核酸。
- クロストリジウム神経毒素誘導体を含む治療性組成物を投与することを含む慢性疼痛の処置の方法であって、前記クロストリジウム神経毒素誘導体が、結合ドメインと、転移ドメインと、クロストリジウム神経毒素BoNT/Aサブタイプに由来する第一のエンドペプチダーゼドメインと、クロストリジウム神経毒素BoNT/Eサブタイプに由来する第二のエンドペプチダーゼドメインとを含むポリペプチドを含み、前記第一のエンドペプチダーゼドメインおよび前記第二のエンドペプチダーゼドメインが、それぞれ、タンパク質分解性が活性である、方法。
- 前記慢性疼痛が、炎症性侵害受容性疼痛および神経因性疼痛からなる群から選択される、請求項16に記載の方法。
- 前記慢性疼痛が神経因性疼痛である、請求項17に記載の方法。
- 前記神経因性疼痛が、癌性疼痛、術後疼痛、神経因性疼痛、アロディニア、ヘルペス後神経痛、過敏性腸症候群、および他の内臓性疼痛、骨痛、末梢神経障害、循環器系関連の疼痛、ならびに頭痛からなる群から選択される、請求項18に記載の方法。
- 前記慢性疼痛が炎症性侵害受容性疼痛である、請求項17に記載の方法。
- 前記慢性疼痛が関節炎の疼痛である、請求項17に記載の方法。
- 前記治療性組成物の前記結合ドメインおよび転移ドメインがクロストリジウム神経毒素BoNT/Aサブタイプに由来する、請求項16に記載の方法。
- 慢性疼痛の処置において使用するためのクロストリジウム神経毒素誘導体を含む治療性組成物であって、前記クロストリジウム神経毒素誘導体が、結合ドメインと、転移ドメインと、クロストリジウム神経毒素BoNT/Aサブタイプ由来の第一のエンドペプチダーゼドメインと、クロストリジウム神経毒素BoNT/Eサブタイプ由来の第二のエンドペプチダーゼドメインとを含むポリペプチドを含み、前記第一のエンドペプチダーゼドメインおよび前記第二のエンドペプチダーゼドメインが、それぞれ、タンパク質分解性が活性である、治療性組成物。
- 前記慢性疼痛が、炎症性侵害受容性疼痛および神経因性疼痛からなる群から選択される、請求項23に記載の使用のための治療性組成物。
- 前記慢性疼痛が神経因性疼痛である、請求項24に記載の使用のための治療性組成物。
- 前記神経因性疼痛が、癌性疼痛、術後疼痛、神経因性疼痛、アロディニア、ヘルペス後神経痛、過敏性腸症候群、および他の内臓性疼痛、骨痛、末梢神経障害、循環器系関連の疼痛、ならびに頭痛からなる群から選択される、請求項25記載の使用のための治療性組成物。
- 前記慢性疼痛が炎症性侵害受容性疼痛である、請求項24に記載の使用のための治療性組成物。
- 前記慢性疼痛が関節炎の疼痛である、請求項24に記載の使用のための治療性組成物。
- 前記治療性組成物の前記結合ドメインおよび転移ドメインがクロストリジウム神経毒素BoNT/Aサブタイプに由来する、請求項23に記載の処置のための使用。
- 慢性疼痛の処置のための薬剤を製造するためのクロストリジウム神経毒素誘導体を含む治療性組成物の使用であって、前記クロストリジウム神経毒素誘導体が、結合ドメインと、転移ドメインと、クロストリジウム神経毒素BoNT/Aサブタイプに由来する第一のエンドペプチダーゼドメインと、クロストリジウム神経毒素BoNT/Eサブタイプに由来する第二のエンドペプチダーゼドメインとを含むポリペプチドを含み、前記第一のエンドペプチダーゼドメインおよび前記第二のエンドペプチダーゼドメインが、それぞれ、タンパク質分解性が活性である、使用。
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