CN109715820A - 用于产生双链梭菌神经毒素的方法 - Google Patents

用于产生双链梭菌神经毒素的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供避开活化步骤需要的适合用于重组产生双链梭菌神经毒素的方法、细胞和试剂盒，以及由此获得的适合用于治疗的双链梭菌神经毒素。

Description

用于产生双链梭菌神经毒素的方法
技术领域
本发明提供避开活化步骤需要的用于重组产生双链梭菌神经毒素的方法。
背景技术
梭菌属(Clostridia)细菌产生高度有效和特异的蛋白质毒素，这些蛋白质毒素可使它们所递送至的神经元和其他细胞中毒。这类梭菌毒素的实例包括由破伤风梭菌(C.tetani)(TeNT)及由肉毒梭菌(C.botulinum)(BoNT)血清型A-G产生的神经毒素，以及由巴氏梭菌(C.baratii)和丁酸梭菌(C.butyricum)产生的那些。
已知在梭菌毒素中有一些最有效的毒素。作为实例，肉毒梭菌神经毒素(botulinum neurotoxin)对小鼠的半数致死剂量取决于血清型在从0.5至5ng/kg的范围内。破伤风和肉毒毒素都通过抑制所影响的神经元功能，尤其是神经递质的释放来发挥作用。肉毒毒素在神经肌肉接头处发挥作用并抑制周围神经系统中的胆碱能传递，而破伤风毒素在中枢神经系统中发挥作用。
梭菌神经毒素通过蛋白酶解切割称为SNARE蛋白(例如SNAP-25、VAMP或突触融合蛋白)的胞内转运蛋白发挥作用——参见Gerald K(2002)"Cell and Molecular Biology”(第4版)John Wiley&Sons,Inc.。首字母缩略词SNARE源自术语可溶性NSF附着受体(Soluble NSF Attachment Receptor)，其中NSF意指N-乙基马来酰亚胺敏感因子(N-ethylmaleimide-Sensitive Factor)。SNARE蛋白是胞内小泡融合从而通过小泡运输从细胞分泌分子所不可或缺的。蛋白酶功能是锌依赖性内肽酶活性，且对SNARE显示高底物特异性。因此，一旦递送至所希望的靶细胞，非细胞毒性蛋白酶即能够抑制来自靶细胞的细胞分泌。
在自然界中，梭菌神经毒素作为单链多肽合成，该单链多肽翻译后通过蛋白酶解切割事件修饰形成通过二硫键连接在一起的两条多肽链。切割发生在通常称为活化位点的特异性切割位点，该位点位于提供链间二硫键的半胱氨酸残基之间。只有通过此活化事件，才能达到梭菌神经毒素的完全功效。两条链称为重链(H链)(其具有约100kDa的分子量)和轻链(L链)(其具有约50kDa的分子量)。H链包含N端易位成分(HN结构域)和C端靶向成分(HC结构域)。切割位点位于L链和易位结构域成分之间。在HC结构域结合其靶神经元且所结合的毒素通过内体内化进入细胞之后，HN结构域使L链跨内体膜易位，进入细胞质溶胶，L链提供蛋白酶功能(也称为非细胞毒性蛋白酶)。
肉毒梭菌神经毒素以其引起松弛性肌肉麻痹和抑制胆碱能分泌的能力为人们所熟知。这些特性导致肉毒梭菌神经毒素用于多种医疗和美容流程，包括眉间线或运动过度面线、头痛、半面痉挛、膀胱过度活动、多汗、鼻唇线、颈肌张力障碍、眼睑痉挛、痉挛和多汗的治疗。
目前所有批准的含有BoNT的药物/化妆品制剂包含从梭菌菌株纯化的天然存在的神经毒素(在或的情况下为BoNT/A，在的情况下为BoNT/B)。传统的BoNT产品生产是通过培养肉毒梭菌后分离和纯化肉毒梭菌神经毒素复合物或复合的游离神经毒素来进行。肉毒梭菌是产芽孢细菌，因此需要笨重的特殊培养设备和设施。因此在异源宿主如大肠杆菌(E.coli)中重组产生BoNT可以是有利的。但是，重组制备梭菌神经毒素的限制步骤是活化步骤。
实际上，目前用于重组梭菌神经毒素制备的实践是在适宜的异源宿主如大肠杆菌中将梭菌神经毒素表达为单条多肽链(上游工艺)。此起始步骤后通常是一系列纯化步骤(例如通过层析)和需要加入将单链无活性(或低活性)梭菌神经毒素转化为双链全活性形式的适宜蛋白酶的活化步骤(下游工艺)。活化步骤需要特异和受控地切割梭菌神经毒素活化环。通过使用适宜的蛋白酶来达到此切割，以产生所希望得到的包含通过二硫键连接轻链和重链的双链梭菌神经毒素。此活化步骤已证明是梭菌神经毒素生产的极具挑战的阶段。具体而言，切割事件可以发生在活化环外侧，导致产生截短的梭菌神经毒素，然后必须将其从全长双链梭菌神经毒素分开。此外，孵育期之后，必须将活化蛋白酶从活化的毒素去除，以避免污染最终药物产品。
活化阶段可遇到的问题包括：
-鉴定将切割活化环同时避免不想要的其他位点的切割(导致截短和功效降低/丧失)的蛋白酶的困难；
-从最终产品去除活化蛋白酶的困难；
-采购用于制备研发和商业化产品的GMP级活化蛋白酶的困难；
-确定最佳活化条件(温度、时间、活化酶/神经毒素比例…)的耗时方法。
可绕开对活化步骤需要的用于重组制备梭菌神经毒素的方法因此将大有裨益。
Maisey等1988(MAISEY,E.Anne等"Involvement of the constituent chains ofbotulinum neurotoxins A and B in the blockade of neurotransmitter release."European Journal of Biochemistry 177.3(1988):683-691.)尝试了用之前纯化的毒素形成双链BoNT/A和B，该纯化的毒素已解折叠并使所得到的结构域分别重折叠。在组合分开的结构域时，他们发现>70％的毒素确实形成了双链毒素，但功效大幅降低。在他们的讨论中，他们提出此功效降低可能归因于存在游离结构域、非共价结合或不正确的二硫键形成。
US2006/0024794A1研究了用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中共表达BoNT结构域来产生双链毒素的可能性。但是，尤其是US2006/0024794 A1的图10和11中提供的数据显示，虽然形成了小部分双链神经毒素，但绝大多数梭菌神经毒素仍为游离轻链和重链。
因此本领域存在对用于重组产生双链梭菌神经毒素的改进方法的需要。
发明概述
在第一方面，本发明提供用于产生双链梭菌神经毒素的方法，其包括在异源宿主细胞中分别表达编码梭菌神经毒素轻链的第一基因和编码梭菌神经毒素重链的第二基因，其中该第一和第二基因在该宿主细胞的氧化环境中表达。
在第二方面，本发明提供包含编码梭菌神经毒素轻链的第一基因和编码梭菌神经毒素重链的第二基因的细胞，其中该第一和第二基因在该细胞的氧化环境中表达。
在第三方面，本发明提供试剂盒，其包含：
a.包含氧化环境的细胞；
b.编码梭菌神经毒素轻链的第一基因；
c.编码梭菌神经毒素重链的第二基因；
其中该第一和第二基因适合用于在该细胞的该氧化环境中分别表达梭菌神经毒素轻链和重链。
在第四方面，本发明提供通过本发明的方法获得的双链梭菌神经毒素。
在第五方面，本发明提供包含本发明的双链梭菌神经毒素的药物组合物。
在第六方面，本发明提供具有氧化性细胞质的宿主细胞在产生双链梭菌神经毒素中的用途，其中该宿主细胞包含编码梭菌神经毒素轻链的第一基因和编码梭菌神经毒素重链的第二基因，其中该第一和第二基因在该宿主细胞的氧化性细胞质中表达。
发明详述
本发明基于发明人的发现，在异源宿主细胞的氧化环境中分开共表达梭菌神经毒素轻链和重链，允许两个结构域以显著提高的效率折叠在一起形成双链梭菌神经毒素。
在第一方面，本发明提供用于产生双链梭菌神经毒素的方法，其包括在异源宿主细胞中分别表达编码梭菌神经毒素轻链的第一基因和编码梭菌神经毒素重链的第二基因，其中该第一和第二基因在该宿主细胞的氧化环境中表达。
本文所用的术语“氧化环境”意指促进胱氨酸形成(半胱氨酸的氧化二聚体)的细胞环境。这通常通过如但不限于基于硫氧还蛋白的蛋白质(例如DsbA)和谷胱甘肽的不同氧化还原蛋白的平衡来达到。氧化环境的非限制性实例有革兰氏阴性菌的周质或真核表达系统如中国仓鼠卵巢(CHO)、昆虫或酵母细胞的内质网。
现有技术中已知许多原核和真核表达系统。宿主细胞可以例如选自原核细胞，如大肠杆菌(Escherichia coli)和巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)，或选自真核细胞，如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。虽然也可以使用高等真核细胞，如昆虫细胞或哺乳动物细胞，但还是优选与肉毒梭菌一样不具有糖基化装置的宿主细胞。
在优选实施方案中，宿主细胞是原核细胞。在更优选的实施方案中，氧化环境是原核细胞的细胞质。
通过氧化两个半胱氨酸侧链之间的巯基产生共价键来形成二硫键。在自然界中，细胞在其细胞质(还原细胞质)中具有用于还原二硫键的酶，二硫键的形成发生在胞质外环境如革兰氏阴性菌的周质或真核生物的内质网(ER)中。因此，在如大肠杆菌的细胞的细胞质中产生需要二硫键的重组蛋白质富有挑战。
可以通过遗传改造来使细菌细胞的细胞质能够氧化，例如通过在细胞质中表达涉及二硫键形成的基因和/或抑制涉及二硫键还原的基因和/或修饰这类基因。例如，在硫氧还蛋白(trxB)和/或谷胱甘肽(gor或gshA)途径的基因中引入突变和/或在胞质中过量表达DsbC可使胞质环境能够氧化，允许形成二硫键(Bessette,Paul H.等"Efficient foldingof proteins with multiple disulfide bonds in the Escherichia coli cytoplasm."Proceedings of the National Academy of Sciences 96.24(1999):13703-13708；Lobstein,Julie,等"SHuffle,a novel Escherichia coli protein expression straincapable of correctly folding disulfide bonded proteins in its cytoplasm."Microbial cell factories 11.1(2012):1)。
具有氧化环境的市售大肠杆菌菌株的实例包括：
-可从Novagen获得的AD494和BL21trxB菌株，其中突变了trxB基因；
-可从Novagen获得的OrigamiTM菌株(Origami、Origami 2、Origami B)，其中突变了gor和trxB基因；
-可从Novagen获得的Rosetta-gamiTM菌株(Rosetta-gami、Rosetta-gami 2和Rosetta-gami B)，其中突变了gor和trxB基因；
-可从New England Biolabs获得的菌株(SHuffle T7、SHuffleT7express)，其中突变了gor和trxB基因，且在细胞质中表达缺乏其信号序列的DsbC基因。
在优选实施方案中，该细胞是原核细胞，其中与其他方面相同的野生型细胞相比在细胞质中过量表达至少一个涉及二硫键形成的基因，和/或与其他方面相同的野生型细胞相比抑制至少一个涉及二硫键还原的基因。在一个实施方案中，该原核细胞是来自选自AD494、BL21trxB、Origami、Rosetta-gami和SHuffle菌株的菌株的大肠杆菌细胞。在优选实施方案中，该原核细胞是来自Origami或SHuffle菌株的大肠杆菌细胞。
本文所用的术语“神经毒素”意指进入神经元并抑制神经递质释放的任何多肽。此过程涵盖神经毒素与低或高亲和力受体结合、神经毒素内化、神经毒素的内肽酶部分易位进入细胞质和神经毒素底物的酶促修饰。更具体而言，术语“神经毒素”涵盖由梭菌属(Clostridium)细菌产生的进入神经元并抑制神经递质释放的任何多肽(“梭菌神经毒素”)，及通过重组技术或化学技术产生的这类多肽。此双链形式正是该毒素的活性形式。两条链称为重链(H链)(其具有约100kDa的分子量)和轻链(L链)(其具有约50kDa的分子量)。L链包含内肽酶活性。H链包含各具有约50kDa的分子量的两个功能不同的结构域：使得神经毒素能够与定位在靶细胞表面的受体结合的“HC结构域”，及使得轻链(内肽酶)能够易位进入细胞质的“HN结构域”。HC结构域包含两个结构上不同的亚结构域：“HCN亚结构域”(HC结构域的N端部分)和“HCC亚结构域”(HC结构域的C端部分)，其各具有约25kDa的分子量。本文所用的术语“双链梭菌神经毒素”意指包含通过二硫键连接的梭菌神经毒素轻链和重链的活性神经毒素。应理解，本发明的双链梭菌神经毒素能够结合靶细胞，使轻链易位进入靶细胞的细胞质，切割SNARE蛋白，从而削弱靶细胞的分泌能力。
不同肉毒梭菌神经毒素(BoNT)血清型可以根据特异性中和抗血清的失活来区分，这种按血清型的分类与在氨基酸水平的百分比序列同一性相关。给定血清型的BoNT蛋白进一步根据氨基酸百分比序列同一性划分为不同亚型。BoNT/A氨基酸序列的实例作为SEQ IDNO:1(UniProt检索号A5HZZ9)提供。BoNT/B氨基酸序列的实例作为SEQ ID NO:2(UniProt检索号B1INP5)提供。BoNT/C氨基酸序列的实例作为SEQ ID NO:3(UniProt检索号P18640)提供。BoNT/D氨基酸序列的实例作为SEQ ID NO:4(UniProt检索号P19321)提供。BoNT/E氨基酸序列的实例作为SEQ ID NO:5(检索号WP_003372387)提供。BoNT/F氨基酸序列的实例作为SEQ ID NO:6(UniProt检索号Q57236)提供。BoNT/G氨基酸序列的实例作为SEQ ID NO:7(检索号WP_039635782)提供。破伤风神经毒素(TeNT)氨基酸序列的实例作为SEQ ID NO:8(UniProt检索号P04958)提供。
编码BoNT/A的核酸序列的实例作为SEQ ID NO:9提供。编码BoNT/B的核酸序列作为SEQ ID NO:10提供。编码BoNT/C的核酸序列作为SEQ ID NO:11提供。编码BoNT/D的核酸序列作为SEQ ID NO:12提供。编码BoNT/E的核酸序列作为SEQ ID NO:13提供。编码BoNT/F的核酸序列作为SEQ ID NO:14提供。编码BoNT/G序列的核酸序列作为SEQ ID NO:15提供。编码破伤风神经毒素(TeNT)序列的核酸序列作为SEQ ID NO:16提供。
表1中显示示例性L、HN、HCN和HCC氨基酸结构域。
表1-示例性氨基酸L、HN、HC、HCN和HCC结构域
表2中显示编码L、HN、HCN和HCC结构域的示例性核酸序列。
表2-编码L、HN、HC、HCN和HCC结构域的示例性核酸序列
上述参考序列应视为指导，因为根据亚血清型可存在轻微变异。作为实例，US2007/0166332(在此以其整体引入作为参考)引用了轻微不同的梭菌序列。
在一个实施方案中，梭菌神经毒素轻链来自BoNT A型、B型、C1型、D型、E型、F型或G型、或TeNT。
在一个实施方案中，梭菌神经毒素重链来自BoNT A型、B型、C1型、D型、E型、F型或G型、或TeNT。
在一个实施方案中，梭菌神经毒素轻链来自BoNT A型、B型、C1型、D型、E型、F型或G型、或TeNT，且梭菌神经毒素重链来自BoNT A型、B型、C1型、D型、E型、F型或G型、或TeNT。
在一个实施方案中，梭菌神经毒素轻链和重链来自同一血清型或亚型。
在一个实施方案中，梭菌神经毒素轻链和重链来自不同血清型或亚型。
在一个实施方案中，梭菌神经毒素轻链包含选自以下的序列：
-SEQ ID NO:1的氨基酸残基1至448，或与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的多肽序列；
-SEQ ID NO:2的氨基酸残基1至441，或与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的多肽序列；
-SEQ ID NO:3的氨基酸残基1至449，或与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的多肽序列；
-SEQ ID NO:4的氨基酸残基1至442，或与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的多肽序列；
-SEQ ID NO:5的氨基酸残基1至423，或与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的多肽序列；
-SEQ ID NO:6的氨基酸残基1至439，或与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的多肽序列；
-SEQ ID NO:7的氨基酸残基1至446，或与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的多肽序列；
-SEQ ID NO:8的氨基酸残基1至456，或与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的多肽序列；
-由SEQ ID NO:9的核苷酸1至1344编码的氨基酸序列，或由与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核酸序列编码的氨基酸序列；
-由SEQ ID NO:10的核苷酸1至1323编码的氨基酸序列，或由与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核酸序列编码的氨基酸序列；
-由SEQ ID NO:11的核苷酸1至1347编码的氨基酸序列，或由与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核酸序列编码的氨基酸序列；
-由SEQ ID NO:12的核苷酸1至1326编码的氨基酸序列，或由与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核酸序列编码的氨基酸序列；
-由SEQ ID NO:13的核苷酸1至1269编码的氨基酸序列，或由与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核酸序列编码的氨基酸序列；
-由SEQ ID NO:14的核苷酸1至1317编码的氨基酸序列，或由与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核酸序列编码的氨基酸序列；
-由SEQ ID NO:15的核苷酸1至1338编码的氨基酸序列，或由与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核酸序列编码的氨基酸序列；和
-由SEQ ID NO:16的核苷酸1至1368编码的氨基酸序列，或由与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核酸序列编码的氨基酸序列。
应理解，梭菌神经毒素轻链能够切割SNARE蛋白。
在一个实施方案中，梭菌神经毒素重链包含选自以下的序列：
-SEQ ID NO:1的氨基酸残基449至1296，或与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的多肽序列；
-SEQ ID NO:2的氨基酸残基442至1291，或与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的多肽序列；
-SEQ ID NO:3的氨基酸残基450至1291，或与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的多肽序列；
-SEQ ID NO:4的氨基酸残基443至1276，或与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的多肽序列；
-SEQ ID NO:5的氨基酸残基424至1253，或与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的多肽序列；
-SEQ ID NO:6的氨基酸残基440至1278，或与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的多肽序列；
-SEQ ID NO:7的氨基酸残基447至1297，或与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的多肽序列；
-SEQ ID NO:8的氨基酸残基457至1315，或与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的多肽序列；
-由SEQ ID NO:9的核苷酸1345至3888编码的氨基酸序列，或由与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核酸序列编码的氨基酸序列；
-由SEQ ID NO:10的核苷酸1324至3873编码的氨基酸序列，或由与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核酸序列编码的氨基酸序列；
-由SEQ ID NO:11的核苷酸1348至3873编码的氨基酸序列，或由与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核酸序列编码的氨基酸序列；
-由SEQ ID NO:12的核苷酸1327至3828编码的氨基酸序列，或由与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核酸序列编码的氨基酸序列；
-由SEQ ID NO:13的核苷酸1270至3756编码的氨基酸序列，或由与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核酸序列编码的氨基酸序列；
-由SEQ ID NO:14的核苷酸1318至3834编码的氨基酸序列，或由与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核酸序列编码的氨基酸序列；
-由SEQ ID NO:15的核苷酸1339至3891编码的氨基酸序列，或由与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核酸序列编码的氨基酸序列；和
-由SEQ ID NO:16的核苷酸1369至3945编码的氨基酸序列，或由与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核酸序列编码的氨基酸序列。
应理解，梭菌神经毒素重链能够结合靶细胞，并使轻链易位进入靶细胞的细胞质。
还应理解，本发明的梭菌神经毒素重链的HN、HCN和HCC结构域可以来自相同或不同的梭菌血清型或亚型。
在一个实施方案中，梭菌神经毒素重链包含HN、HCN和HCC结构域，其中：
HN结构域包含选自以下的序列：
-SEQ ID NO:1的氨基酸残基449至872，或与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的多肽序列；
-SEQ ID NO:2的氨基酸残基442至859，或与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的多肽序列；
-SEQ ID NO:3的氨基酸残基450至867，或与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的多肽序列；
-SEQ ID NO:4的氨基酸残基443至863，或与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的多肽序列；
-SEQ ID NO:5的氨基酸残基424至846，或与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的多肽序列；
-SEQ ID NO:6的氨基酸残基440至865，或与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的多肽序列；
-SEQ ID NO:7的氨基酸残基447至864，或与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的多肽序列；
-SEQ ID NO:8的氨基酸残基457至880，或与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的多肽序列；
-由SEQ ID NO:9的核苷酸1345至2616编码的氨基酸序列，或由与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核酸序列编码的氨基酸序列；
-由SEQ ID NO:10的核苷酸1324至2577编码的氨基酸序列，或由与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核酸序列编码的氨基酸序列；
-由SEQ ID NO:11的核苷酸1348至2601编码的氨基酸序列，或由与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核酸序列编码的氨基酸序列；
-由SEQ ID NO:12的核苷酸1327至2589编码的氨基酸序列，或由与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核酸序列编码的氨基酸序列；
-由SEQ ID NO:13的核苷酸1270至2538编码的氨基酸序列，或由与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核酸序列编码的氨基酸序列；
-由SEQ ID NO:14的核苷酸1318至2595编码的氨基酸序列，或由与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核酸序列编码的氨基酸序列；
-由SEQ ID NO:15的核苷酸1339至2592编码的氨基酸序列，或由与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核酸序列编码的氨基酸序列；和
-由SEQ ID NO:16的核苷酸1369至2640编码的氨基酸序列，或由与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核酸序列编码的氨基酸序列；
HCN结构域包含选自以下的序列：
-SEQ ID NO:1的氨基酸残基873至1094，或与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的多肽序列；
-SEQ ID NO:2的氨基酸残基860至1081，或与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的多肽序列；
-SEQ ID NO:3的氨基酸残基868至1095，或与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的多肽序列；
-SEQ ID NO:4的氨基酸残基864至1082，或与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的多肽序列；
-SEQ ID NO:5的氨基酸残基847至1069，或与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的多肽序列；
-SEQ ID NO:6的氨基酸残基866至1087，或与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的多肽序列；
-SEQ ID NO:7的氨基酸残基865至1089，或与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的多肽序列；
-SEQ ID NO:8的氨基酸残基881至1111，或与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的多肽序列；
-由SEQ ID NO:9的核苷酸2617至3282编码的氨基酸序列，或由与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核酸序列编码的氨基酸序列；
-由SEQ ID NO:10的核苷酸2578至3243编码的氨基酸序列，或由与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核酸序列编码的氨基酸序列；
-由SEQ ID NO:11的核苷酸2602至3285编码的氨基酸序列，或由与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核酸序列编码的氨基酸序列；
-由SEQ ID NO:12的核苷酸2590至3246编码的氨基酸序列，或由与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核酸序列编码的氨基酸序列；
-由SEQ ID NO:13的核苷酸2539至3207编码的氨基酸序列，或由与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核酸序列编码的氨基酸序列；
-由SEQ ID NO:14的核苷酸2596至3261编码的氨基酸序列，或由与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核酸序列编码的氨基酸序列；
-由SEQ ID NO:15的核苷酸2593至3267编码的氨基酸序列，或由与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核酸序列编码的氨基酸序列；和
-由SEQ ID NO:16的核苷酸2641至3333编码的氨基酸序列，或由与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核酸序列编码的氨基酸序列；
HCC结构域包含选自以下的序列：
-SEQ ID NO:1的氨基酸残基1095至1296，或与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的多肽序列；
-SEQ ID NO:2的氨基酸残基1082至1291，或与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的多肽序列；
-SEQ ID NO:3的氨基酸残基1096至1291，或与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的多肽序列；
-SEQ ID NO:4的氨基酸残基1083至1276，或与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的多肽序列；
-SEQ ID NO:5的氨基酸残基1070至1252，或与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的多肽序列；
-SEQ ID NO:6的氨基酸残基1088至1278，或与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的多肽序列；
-SEQ ID NO:7的氨基酸残基1090至1297，或与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的多肽序列；
-SEQ ID NO:8的氨基酸残基1112至1315，或与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的多肽序列；
-由SEQ ID NO:9的核苷酸3283至3888编码的氨基酸序列，或由与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核酸序列编码的氨基酸序列；
-由SEQ ID NO:10的核苷酸3244至3873编码的氨基酸序列，或由与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核酸序列编码的氨基酸序列；
-由SEQ ID NO:11的核苷酸3286至3873编码的氨基酸序列，或由与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核酸序列编码的氨基酸序列；
-由SEQ ID NO:12的核苷酸3247至3828编码的氨基酸序列，或由与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核酸序列编码的氨基酸序列；
-由SEQ ID NO:13的核苷酸3208至3756编码的氨基酸序列，或由与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核酸序列编码的氨基酸序列；
-由SEQ ID NO:14的核苷酸3262至3834编码的氨基酸序列，或由与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核酸序列编码的氨基酸序列；
-由SEQ ID NO:15的核苷酸3268至3891编码的氨基酸序列，或由与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核酸序列编码的氨基酸序列；和
-由SEQ ID NO:16的核苷酸3334至3945编码的氨基酸序列，或由与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核酸序列编码的氨基酸序列。
两个或多个核酸或氨基酸序列之间的“百分比序列同一性”是所比对的序列在相同位置处所具有的相同核苷酸/氨基酸数的函数。因此，％同一性可以计算为：比对中各位置处相同核苷酸/氨基酸的数目除以所比对的序列中核苷酸/氨基酸的总数，乘以100。％序列同一性的计算还可考虑缺口的数目，及需要引入以优化两个或多个序列的比对的各缺口的长度。两个或多个序列间的序列比较和百分比同一性的确定可以用技术人员熟悉的具体数学算法(如BLAST)进行。
轻链和/或重链可以来自镶嵌神经毒素。此背景中所用的术语“镶嵌神经毒素”指包含来自另一种类型的梭菌神经毒素(例如不同血清型的梭菌神经毒素)的至少一个功能结构域的天然存在的梭菌神经毒素，该梭菌神经毒素通常不包含该至少一个功能结构域。镶嵌神经毒素的实例有天然存在的BoNT/DC和BoNT/CD。BoNT/DC包含血清型D的L链和HN结构域及血清型C的HC结构域，而BoNT/CD包含血清型C的L链和HN结构域及血清型D的HC结构域。
轻链和/或重链可以来自包括但不限于下文所述的那些的修饰神经毒素及其衍生物。修饰神经毒素或衍生物可以包含一个或多个与神经毒素的天然(未修饰)形式相比经过修饰的氨基酸，或者可以包含一个或多个不存在于毒素的天然(未修饰)形式中的插入氨基酸。作为实例，经修饰的梭菌神经毒素可以相对于天然(未修饰)梭菌神经毒素序列在一个或多个结构域中具有经修饰的氨基酸序列。这类修饰可以修饰神经毒素的功能方面，例如生物学活性或持久性。因此，在一个实施方案中，第一神经毒素和/或第二神经毒素是经修饰的神经毒素，或经修饰的神经毒素衍生物。
经修饰的神经毒素保留神经毒素的至少一种功能，该功能选自结合靶细胞上的低或高亲和力神经毒素受体、使神经毒素的内肽酶部分(轻链)易位进入细胞质和切割SNARE蛋白的能力。优选地，经修饰的神经毒素保留至少两种这些功能。更优选地，经修饰的神经毒素保留这三种功能。
经修饰的神经毒素可以在重链氨基酸序列中具有一个或多个修饰(例如经修饰的HC结构域)，其中该经修饰的重链以比天然(未修饰)神经毒素高或低的亲和力结合靶神经细胞。这类HC结构域中的修饰可以包括修饰HC结构域的神经节苷脂结合部位中或蛋白(SV2或突触结合蛋白)结合部位中的残基，其改变与靶神经细胞的神经节苷脂受体和/或蛋白质受体的结合。这类经修饰的神经毒素的实例描述于WO 2006/027207和WO 2006/114308中，二者在此以其整体引入作为参考。
经修饰的神经毒素可以在轻链氨基酸序列中具有一个或多个修饰，例如底物结合或催化结构域中的修饰，其可以改变或修饰该经修饰的LC的SNARE蛋白特异性。这类经修饰的神经毒素的实例描述于WO 2010/120766和US 2011/0318385中，二者在此以其整体引入作为参考。
经修饰的神经毒素可以包含一个或多个提高或降低该经修饰的神经毒素的生物学活性和/或生物学持久性的修饰。例如，经修饰的神经毒素可以包含基于亮氨酸或酪氨酸的基序，其中该基序提高或降低该经修饰的神经毒素的生物学活性和/或生物学持久性。适宜的基于亮氨酸的基序包括xDxxxLL、xExxxLL、xExxxIL和xExxxLM(其中x是任意氨基酸)。适宜的基于酪氨酸的基序包括Y-x-x-Hy(其中Hy是疏水性氨基酸)。包含基于亮氨酸和酪氨酸的基序的经修饰的神经毒素的实例描述于WO 2002/08268中，在此以其整体引入作为参考。
在一些实施方案中，该梭菌神经毒素是重靶向神经毒素。本文所用的术语“重靶向神经毒素”(也称为“靶向分泌抑制剂”、“TSI”、“TVEMP”或“TEM”)意指包含结合非梭菌受体的靶向部分(TM)的梭菌神经毒素。TM可以替换梭菌神经毒素重链HC或HCC结构域的一部分或全部。重靶向神经毒素的实例公开于WO96/33273、WO98/07864、WO00/10598、WO01/21213、WO01/53336、WO02/07759、WO2005/023309、WO2006/026780、WO2006/099590、WO2006/056093、WO2006/059105、WO2006/059113、WO2007/138339、WO2007/106115、WO2007/106799、WO2009/150469、WO2009/150470、WO2010/055358、WO2010/020811、WO2010/138379、WO2010/138395、WO2010/138382、WO2011/020052、WO2011/020056、WO2011/020114、WO2011/020117、WO2011/20119、WO2012/156743、WO2012/134900、WO2012/134897、WO2012/134904、WO2012/134902、WO2012/135343、WO2012/135448、WO2012/135304、WO2012/134902、WO2014/033441、WO2014/128497、WO2014/053651、WO2015/004464中，全都在此引入作为参考。
在一个实施方案中，编码梭菌神经毒素轻链的基因和编码梭菌神经毒素重链的基因存在于同一载体上。
在一个实施方案中，编码梭菌神经毒素轻链的基因和编码梭菌神经毒素重链的基因存在于不同载体上。
一般而言，任何表达载体都可以用来达到在大肠杆菌中共表达，例如pK7、pJ401、pBAD或pET载体。在用分开的载体来表达各结构域时，优选用不同抗生素抗性标记和复制起点来帮助质粒稳定性。对于单载体法，使基因处于分开的启动子和核糖体结合位点控制下通常是有益的，但这并不是必需的。最后，两种策略都可以通过相同类型的启动子控制两个基因或者可以各自利用不同的启动子，例如T7-lac、T5-lac、rhaBAD和araBAD启动子。
在一个实施方案中，可将编码梭菌神经毒素轻链的基因和编码梭菌神经毒素重链的基因制备为包含启动子和终止子的DNA或RNA载体，优选DNA载体的部分。适宜的启动子和终止子序列为本领域公知。
启动子的选择在这种情况下取决于用于表达的表达系统。一般而言，优选组成型启动子，但同样可以使用诱导型启动子。以这种方式产生的构建体包含至少一部分载体，尤其是调节元件，该载体例如选自A衍生物、腺病毒、杆状病毒、牛痘病毒、SV40病毒和反转录病毒。该载体优选能够在给定的宿主细胞中表达该基因。
在一个实施方案中，该载体具有选自以下的启动子：
本发明的基因可以用本领域已知的任何适宜的方法制备。因此，该基因可以用化学合成技术制备。备选地，本发明的基因可以用分子生物学技术制备。
本发明的基因优选用计算机设计，然后通过常规基因合成技术合成。
上述基因可选地针对待利用的最终宿主细胞(例如大肠杆菌)表达系统的密码子偏好修饰。
在一个实施方案中，本发明的方法进一步包括从宿主细胞回收双链梭菌神经毒素的步骤。具体而言，该方法可以包括裂解宿主细胞以提供宿主细胞匀浆的步骤，及分离双链梭菌毒素蛋白的步骤。在一个实施方案中，本发明的方法可以进一步包括将编码梭菌神经毒素轻链的基因和编码梭菌神经毒素重链的基因引入宿主细胞的步骤。例如，本发明的基因可以以本文所述表达载体的形式引入细胞。
通常，在从宿主细胞回收后纯化和/或浓缩双链梭菌神经毒素。任何适宜的方法都可以用于回收、纯化和/或浓缩双链梭菌神经毒素。用于回收、纯化和/或浓缩的标准技术为本领域已知，例如层析方法和/或电泳。
双链梭菌神经毒素可以包含一个或多个定位在N端和/或C端的纯化标记来辅助纯化多肽。虽然可以利用任何纯化标记，但优选以下：His标记(例如6×组氨酸)，优选作为C端和/或N端标记；MBP标记(麦芽糖结合蛋白)，优选作为N端标记；GST标记(谷胱甘肽-S-转移酶)，优选作为N端标记；His-MBP标记，优选作为N端标记；GST-MBP标记，优选作为N端标记；硫氧还蛋白标记，优选作为N端标记；和/或CBD标记(几丁质结合结构域)，优选作为N端标记。
双链梭菌神经毒素中可以包含一个或多个肽间隔/接头分子。例如，可以在纯化标记和多肽分子的其余部分之间利用肽间隔分子。
在另一方面，本发明提供包含编码梭菌神经毒素轻链的第一基因和编码梭菌神经毒素重链的第二基因的细胞，其中该第一和第二基因在该细胞的氧化环境中表达。
在优选实施方案中，该细胞是原核细胞。在更优选的实施方案中，该氧化环境是该原核细胞的细胞质。
在优选实施方案中，该细胞是原核细胞，其中与其他方面相同的野生型细胞相比在细胞质中过量表达至少一个涉及二硫键形成的基因，和/或与其他方面相同的野生型细胞相比抑制至少一个涉及二硫键还原的基因。
在一个实施方案中，该原核细胞是来自选自AD494、BL21trxB、Origami、Rosetta-gami和SHuffle菌株的菌株的大肠杆菌细胞。在优选实施方案中，该原核细胞是选自Origami或Shuffle菌株的大肠杆菌细胞。
在一个实施方案中，编码梭菌神经毒素轻链的第一基因和编码梭菌神经毒素重链的第二基因存在于同一载体上。
在一个实施方案中，编码梭菌神经毒素轻链的第一基因和编码梭菌神经毒素重链的第二基因存在于不同载体上。
在另一方面，本发明提供试剂盒，其包含：
a.包含氧化环境的细胞；
b.编码梭菌神经毒素轻链的第一基因；和
c.编码梭菌神经毒素重链的第二基因；
其中该第一和第二基因适合用于在该细胞的该氧化环境中分别表达梭菌神经毒素轻链和重链。
在另一方面，本发明提供通过本发明的方法获得的双链梭菌神经毒素。
在另一方面，本发明提供包含本发明的双链梭菌神经毒素的药物组合物。优选地，该药物组合物包含本发明的双链梭菌神经毒素连同选自可药用载体、赋形剂、佐剂、抛射剂和/或盐的至少一种成分。
在另一方面，本发明提供本发明的双链梭菌神经毒素或本发明的药物组合物用于治疗。
在另一方面，本发明提供治疗方法，其包括对有需要的患者施用适宜剂量的本发明的双链梭菌神经毒素或本发明的药物组合物。
本发明的双链梭菌神经毒素适合用于治疗与不想要的神经元活动相关的病症，例如选自以下的病症：痉挛性发音困难、痉挛性斜颈、喉张力障碍、口下颌发音障碍、舌肌张力障碍、颈肌张力障碍、局灶性手部肌张力障碍、眼睑痉挛、斜视、半面痉挛、眼睑障碍、脑性瘫痪、局部痉挛和其他声音障碍、痉挛性结肠炎、神经性膀胱功能障碍、肛门痉挛、肢体痉挛、抽搐、震颤、夜间磨牙、肛裂、弛缓不能、吞咽困难和其他肌张力障碍和其他表征为肌群随意运动的障碍、流泪、多汗、过度流延、胃肠分泌过度、分泌性障碍、肌肉痉挛引起的疼痛、头痛、偏头痛和皮肤病症。
在另一方面，本发明提供本发明的双链梭菌神经毒素在处理美学或美容病症中的非治疗性用途。
本发明的双链梭菌神经毒素可以配制用于口服、胃肠外、连续输注、吸入或局部应用。适合用于注射的组合物可以是溶液、悬液或乳剂、或在使用前溶解或悬浮在适宜载体中的干粉的形式。
在待局部递送的本发明的双链梭菌神经毒素的情况下，该嵌合神经毒素可以配制为霜剂(例如用于局部应用)或用于皮下注射。
局部递送手段可以包括气溶胶或其他喷雾(例如喷雾剂)。在这方面，嵌合神经毒素的气溶胶制剂使得能够递送至肺和/或其他鼻和/或支气管或气道通道。
本发明的双链梭菌神经毒素可以通过在涉及所影响的器官的神经支配的脊髓节段水平在脊柱中进行鞘内或硬膜上注射来对患者施用。
优选的施用途径是通过腹腔镜和/或局部尤其是肌内注射。
施用本发明的双链梭菌神经毒素的剂量范围是产生所希望得到的治疗效果的那些。应理解，所需要的剂量范围取决于双链梭菌神经毒素或组合物的确切性质、施用途径、制剂的性质、患者年龄、患者病症的性质、程度或严重度、禁忌症(如有)和主治医生的判断。用标准经验惯例进行优化，可以调整这些剂量水平的变动。
通常用本发明的双链梭菌神经毒素和无热原无菌载体配制流体剂型。取决于所使用的载体和浓度，可将双链梭菌神经毒素溶解或悬浮在载体中。在配制溶液中，可将双链梭菌神经毒素溶解在载体中，根据需要通过加入氯化钠使溶液等渗，通过用无菌技术滤过无菌滤器来除菌，然后灌装入适宜的无菌瓶或安瓿并密封。备选地，如果溶液稳定性足够，可通过高压灭菌法对在其密封容器中的溶液除菌。有利地，可将添加剂如缓冲剂、增溶剂、稳定剂、防腐剂或杀菌剂、悬浮剂或乳化剂和/或局部麻醉剂溶解在载体中。
通过在无菌区域用无菌技术将预先除菌的成分灌装入无菌容器，可以制备在使用前溶解或悬浮在适宜载体中的干粉。备选地，可以在无菌区域用无菌技术将成分溶解入适宜的容器。然后冷冻干燥产品，并无菌密封容器。
除将无菌成分悬浮而不是溶解在无菌载体中和不能通过过滤达到除菌外，以基本相同的方式配制适合用于肌内、皮下或皮内注射的胃肠外悬剂。成分可以以无菌状态分离，或备选地可以在分离后例如通过γ辐射除菌。
本发明的施用可以利用多种递送技术，包括微粒包封、病毒递送系统或高压气溶胶冲击。
在另一方面，本发明提供具有氧化性细胞质的宿主细胞在生产双链梭菌神经毒素中的用途，其中该宿主细胞包含编码梭菌神经毒素轻链的第一基因和编码梭菌神经毒素重链的第二基因，其中该第一和第二基因在该宿主细胞的该细胞质中表达。
本公开不受限于本文中公开的示例性方法和材料，与本文中描述的那些相似或等同的任何方法和材料都可以用于实施或测试本公开的实施方案。数字范围包括定义该范围的数字。除非另有说明，任何核酸序列均从左至右按5’至3’方向书写；氨基酸序列从左至右按氨基至羧基方向书写。
在提供数值范围时，应理解，除非文中另有明确说明，也明确公开了该范围上限和下限之间至下限单位十分之一的每一居间值。所陈述的范围中的任何所陈述的值或居间值和所陈述的范围中的任何其他所陈述的值或居间值之间的每一较小范围也涵盖在本公开之内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包含在该范围之内或排除在该范围之外，上下限之一、没有一个或二者都包含在该较小范围内的每一个范围也涵盖在本公开之内，在所陈述的范围中受任何特别排除的限制。在所陈述的范围包含上下限之一或二者时，排除所包含的上下限之一或二者的范围也包含在本公开之内。
必须指出，除非文中另有明确说明，本文及所附权利要求书中所用的单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指代物。因此，例如，提到“梭菌神经毒素”包括多个这类候选活性剂，提到“该梭菌神经毒素”包括提到一个或多个梭菌神经毒素及其本领域技术人员已知的等同物，等等。
现将参考以下附图和实施例，仅以实例的方式描述本发明。
附图简述
图1-针对BoNT/A的LC(图1A)或全长BoNT/A1——优先针对HC(图1B)制备的自制多克隆抗体的Western印迹。MK：Magic Mark，样品1：对照，Shuffle T7裂解物-无IPTG，样品2：Origami 2裂解物±DTT，样品3：Shuffle T7裂解物±DTT，样品4：Shuffle T7Express裂解物±DTT，样品5：BL21(DE3)±DTT。
图2-纯化共表达的BoNT/A1(0)和单链表达的BoNT/A1(0)后的SDS-PAGE。MK：BenchMark，样品1：共表达的BoNT/A1(0)，2：单链表达的BoNT/A1(0)，样品3：共表达的BoNT/A1(0)还原，样品4：单链表达的BoNT/A1(0)还原。
图3-Optim读出。在所有图中，泳道1是纯化的单链表达的BoNT/A1(0)，泳道2是纯化的共表达的BoNT/A1(0)。图3A)是荧光发射重心均值(BCM)的温度依赖性转换的测量。图3B)是266nm静态光散射(SLS)的温度依赖性转换的测量。图3C)是473nm SLS的温度依赖性转换的测量。显示来自每个分子的4个重复读数的平均值和标准差。
图4-280nm SEC读出，图4显示280nm全尺寸色谱图。标注了纯化的共表达的BoNT/A1(0)和纯化的单链表达的BoNT/A1(0)。
图5-谷氨酸释放测定。本图就它们抑制大鼠大脑皮质神经元中谷氨酸释放的能力将共表达的BoNT/A1(SXN104279-DK170710)与天然梭菌BoNT/A1(LIST BiologicalLaboratories)相比较。
实施例
实施例1-用单载体(双启动子)法共表达BoNT/A1(0)轻链和重链
设计引物来分别扩增endonegative BoNT/A1(0)的轻链(表3-引物1和2)和重链(表3-引物3和4)，保证可在轻链(LC)末端掺入终止密码子，在重链(HC)起始处掺入起始密码子。还包括限制位点NcoI(fwrd)和BamHI(rev)，以允许将LC连接入pETDuet载体(Millipore#71146)的MSC 1，而NdeI(fwrd)和XhoI(rev)用于能够将HC连接入MSC 2。使用表4中所示的BoNT/A1(0)模板DNA，用Q5热启动HF反应混合物(NEB#M0494S)扩增基因。然后用NcoI(NEB#R3193)和BamHI(NEB#R3136)消化所扩增的LC和pETDuet载体，并用NEB T4DNA连接酶(#M0202S)连接。
表3-用于将BoNT/A1(0)LC插入PetDuet的MSC 1和将HC插入MSC 2的引物
表4-用于BoNT/A1(0)的LC、活化环和HC序列
<u>BoNT/A1(0)LC的核酸序列</u> <u>SEQ ID NO:17</u>
<u>活化环</u> <u>SEQ ID NO:18</u>
<u>BoNT/A1(0)HC的核酸序列</u> <u>SEQ ID NO:19</u>
然后，用Xho1(NEB#R0146S)和Nde(NEB#R0111S)消化所得到的pETDuet/LC载体和所扩增的HC基因并连接在一起，产生所希望得到的最终构建体。
为了测试BoNT/A1(0)的共表达，按说明将载体转化入Shuffle T7((NEB#C3026H)、Shuffle T7Express细胞(NEB#C3029)、BL21(DE3)(C2527I)和Origami 2细胞(Merks#714083)，将所得到的菌落作为microbank bead保存于-80℃。注意所有克隆和转化步骤按照厂家说明书进行。
对于表达，为每一过夜培养物建立250ml三角摇瓶中的100ml含50μg/ml氨苄青霉素的改进TB(mTB)(Melford#T1703)。每个细胞系用一个microbank bead接种这些三角摇瓶，在225转/分钟震荡下30℃过夜培养20小时。第二天，用900ml mTB+50μg/ml氨苄青霉素在2.5L三角摇瓶中建立主培养物，用10ml过夜培养物接种。通过在225转/分钟震荡下30℃培养，使细胞密度达到OD600为1。一旦达到所希望的OD，即使温度降至16℃(1小时)，然后用1mM IPTG(Sigma#I6758)诱导。再在16℃孵育表达培养物20小时，然后6000转/分钟离心30分钟回收细胞。
用25mM Tris、150mM NaCl pH 8按6ml/g重悬来自表达的回收细胞，然后按20Kpsi通过constant systems匀浆机一次来提取可溶性蛋白质。通过12000转/分钟离心30分钟来去除细胞碎片，然后通过Western印迹评估澄清的裂解物(图1)。
简言之，对于还原样品用ThermoFishers LDS Sample Buffer(4X)#NP0007+0.1M DTT(Sigma)或对于非还原样品用Tris-Glycine SDS SampleBuffer(2x)#LC2676 1:10稀释澄清裂解物。95℃加热10分钟后，用4-12％Bis Tris丙烯酰胺凝胶对这些样品进行SDS PAGE电泳。将蛋白质转移至0.2μM硝酸纤维素膜，然后用针对BoNT/A1的LC或全长BoNT/A1——优先针对HC制备的自制多克隆抗体印记。用抗兔IgG-过氧化物酶抗体(Sigma#A0545-1ML)检测抗体结合，并用Super Signal West Dura长持续时间底物显示。
图1中提供的结果显示，等同于全长BoNT/A1(0)的150kDa的条带存在于样品2、3和5(还有程度较低的样品4)中，但在阴性对照中未观察到。150kDa蛋白质在DTT存在下不再可见的事实确认此为已还原的二硫键，现在LC在图1A中50kDa处可见，HC在图1B中100kDa处可见。
这些结果确认，共表达轻链和重链后胞内形成BoNT/A1(0)二硫键在所有菌株中都是可行的，与使用具有还原性细胞质的菌株(BL21(DE3))时相比，在使用包含氧化性细胞质的表达菌株时存在最小量的游离LC。
实施例2-在Shuffle T7细胞中共表达轻链和重链后纯化BoNT/A1(0)
按实施例1中详述再次在Shuffle T7细胞中共表达3升BoNT/A1(0)培养物并裂解。用以下三个层析步骤从澄清裂解物纯化所得到的全长BoNT/A1(0)：
步骤1：丁基HP
通过加入25mM Tris、2M(NH4)2SO4pH 8将澄清裂解物稀释一半，使(NH4)2SO4浓度为至多1M。然后按150cm/小时将样品上样至预先平衡的10ml丁基HP柱(2x5ml HiTrap ButylHP,GE Healthcare#28-4110-05)上。用25mM Tris、1M(NH4)2SO4pH 8洗涤10个柱体积(CV)后，在向下至25mM Tris、35mM NaCl pH 8的25CV线性梯度内洗脱任何结合蛋白质，收集5ml级分。然后通过SDS-PAGE分析馏分，合并包含靶毒素的那些级分。
步骤2：Q HP
将丁基HP合并收集液缓冲液更换入低盐缓冲液，使得它可以上样至Q HP柱上。这是通过用HiPrep26/10脱盐柱(GE healthcare,#17-5087-01)按照厂家说明书进行几轮缓冲液更换入25mM Tris、20mM NaCl pH 8来达到。
然后按75cm/小时将样品上样至预先平衡的4.7ml HiScreen Q HP柱(GEhealthcare,#28-9505-11)。用25mM Tris、20mM NaCl pH 8洗涤5CV后，在向上至25mMTris、300mM NaCl pH 8的25CV线性梯度内洗脱结合蛋白质，收集2.5ml级分。通过SDS PAGE分析后，合并包含靶蛋白的级分。
步骤3：苯基HP
通过用25mM Tris、2M(NH4)2SO4pH 8将样品稀释一半，使(NH4)2SO4为至多1M，针对苯基HP柱调节Q HP合并收集液。然后按150cm/小时将样品上样至预先平衡的1ml PhenylHP(GE Healthcare#17-1351-01)柱，然后用3CV的25mM Tris、1M(NH4)2SO4pH 8洗涤柱。用向下至25mM Tris、35mM NaCl pH 8的25CV线性梯度洗脱结合蛋白质，收集0.5ml级分。通过SDS PAGE分析后，合并包含靶蛋白的级分，得到如图2中所示的最终产物。
为了用作对照，还表达和纯化了单链重组BoNT/A1(0)。为此，将BoNT/A1(0)(表4-LC+活化环+HC)插入pJ401，使得它可以用BLR(DE3)大肠杆菌表达菌株(Novagen#69053)表达为单链产物。
对于表达，为过夜培养物建立250ml三角摇瓶中的100ml含30μg/ml卡那霉素的改进TB(mTB)(Melford#T1703)。用在225转/分钟震荡下37℃过夜培养20小时的一个microbank bead接种三角摇瓶。第二天，用15x 1L mTB+30μg/ml卡那霉素在2.5L三角摇瓶中建立主培养物，各用10ml过夜培养物接种。通过在225转/分钟震荡下37℃培养，使细胞密度达到OD600为0.5。一旦达到所希望的OD，即使温度降至16℃(1小时)，然后用1mM IPTG(Sigma#I6758)诱导。再在16℃孵育表达培养物20小时，然后5000转/分钟离心20分钟回收细胞。
与共表达的BoNT/A1(0)一样，裂解所回收的细胞并纯化毒素。仅有的2个差异是在更大规模下进行纯化以及在第2和第3柱子之间需要活化步骤：
200ml丁基HP->53ml Q HP->活化(见下文)->10ml丁基HP
活化阶段-用92μg(0.8μg Lys-C/ml样品)Lys-C(Sigma#P2289)在4℃孵育Q HP合并收集液(A280测定为0.46mg/ml)20小时。活化后，立即用25mM Tris pH 8、2M(NH4)2SO4将样品稀释一半，使得它可以上样至苯基HP，然后与实施例1一样继续纯化。
通过SDS-PAGE评估从苯基HP柱得到的两个最终产物(图2)。简言之，对于还原样品用ThermoFishers LDS Sample Buffer(4X)#NP0007+0.1M DTT(Sigma)或对于非还原样品用Tris-Glycine SDS Sample Buffer(2x)#LC2676将包含共表达和单链表达BoNT/A1(0)的苯基HP合并收集液稀释至0.1mg/ml。将用包括附加活化步骤的相同方法纯化的单链表达的BoNT/A1(0)用作对照。将所制备的SDS样品95℃加热10分钟，用4-12％Bis Tris丙烯酰胺凝胶对这些样品进行SDS PAGE电泳。用SimplyBlue SafeStain(Thermo fisher#LC6065)染色1小时，然后过夜脱色。
图2中所示的结果确认纯化成功，共表达的BoNT/A1(0)与单链表达的BoNT/A1(0)行为方式相同表明正确的折叠。
还在测量提供关于折叠和稳定性的指示的内在荧光和光散射的设备optim(图3)及针对大小和聚集特征的大小排阻层析(SEC)(图4)上比较了所纯化的样品。
Optim结果显示，共表达的BoNT A1(0)和单链表达的BoNT A1(0)在BCM、266和473nm SLS中具有非常相似的转换点，BCM、266和473nm SLS分别是熔解温度及小和大颗粒聚集的读出。
SEC结果显示，共表达的BoNT A1(0)和单链表达的BoNT A1(0)具有相同的单体峰，二者都具有最少的聚集。
实施例3-BoNT/A1的共表达及确认活性的谷氨酸释放测定
设计引物来突变BoNT/A1(0)pETDUET共表达载体的LC结构域(SEQ ID NO 17)内的两个残基(Q224E/Y227H)，以恢复此结构域的蛋白酶解活性所必需的锌结合。所得到的pETDUET载体将共表达活性BoNT/A1 LC和HC，因此允许在基于细胞的系统中确认功效。按照厂家说明书用quick change闪电诱变(#210514–Agilent technologies)引入突变。
将所得到的载体转化入Shuffle T7细胞，表达/纯化按实施例1-BoNT/A1(0)的共表达和实施例2-共表达的BoNT/A1(0)的纯化中所述进行。注意，此分子仅需要前两个层析柱丁基HP和Q HP，因为它不需要活化步骤。
然后在大鼠Ctx谷氨酸释放测定上测试共表达的全长BoNT/A1，该测定将通过BoNT活性引起的谷氨酸释放的抑制来确认易位和SNARE切割。用市售天然BoNT/A1(LISTbiological laboratories)作为共表达的BoNT/A1的对照。
谷氨酸释放测定显示，共表达的BoNT/A1以与天然BoNT/A1相当的功效抑制谷氨酸释放。这因此证明共表达是用于产生能够进行中毒(intoxication)所需的所有步骤(在神经元终板处结合和内化，使轻链从内体易位进入细胞质及蛋白水解切割靶SNARE蛋白)的全活性双链梭菌神经毒素的可行方法。
序列
SEQ ID NO:1.BoNT/A1，检索号A5HZZ9，氨基酸序列。
SEQ ID NO:2.BoNT/B1，检索号B1INP5，氨基酸序列。
SEQ ID NO:3.BoNT/C1，检索号P18640，氨基酸序列。
SEQ ID NO:4.BoNT/D，检索号P19321，氨基酸序列。
SEQ ID NO:5.BoNT/E1，检索号WP_003372387，氨基酸序列。
SEQ ID NO:6.BoNT/F1，检索号Q57236，氨基酸序列。
SEQ ID NO:7.BoNT/G，检索号WP_039635782，氨基酸序列。
SEQ ID NO:8.TeNT，检索号P04958，氨基酸序列。
SEQ ID NO:9.BoNT/A1，DNA。
SEQ ID NO:10.BoNT/B1，DNA。
SEQ ID NO:11.BoNT/C1，DNA。
·SEQ ID NO：12.BoNT/D，DNA.
·SEQ ID NO：13.BoNT/E1，DNA.
·SEQ ID NO：14.BoNT/F1，DNA.
·SEQ ID NO：15.BoNT/G，DNA.
·SEQ ID NO；16.TeNT，DNA.
·SEQ ID NO：17，DNA，BoNT/A1(0)LC
·SEQ ID NO：18，DNA，BoNT/A1(0)Activation loop
·SEQ ID NO：19，DNA，BoNT/A1(0)HC
SEQ ID NO：20，DNA，引物
SEQ ID NO：21，DNA，引物
SEQ ID NO：22，DNA，引物
SEQ ID NO：23，DNA，引物

Claims (16)

1.用于产生双链梭菌神经毒素的方法，其包括在异源宿主细胞中分别表达编码梭菌神经毒素轻链的第一基因和编码梭菌神经毒素重链的第二基因，其中所述第一和第二基因在所述宿主细胞的氧化环境中表达。
2.权利要求1的方法，其中所述宿主细胞是原核细胞。
3.权利要求2的方法，其中所述氧化环境是所述宿主原核细胞的细胞质。
4.权利要求2或3的方法，其中所述原核细胞是这样的原核细胞，其中与其他方面相同的野生型细胞相比在细胞质中过量表达至少一个涉及二硫键形成的基因，和/或与其他方面相同的野生型细胞相比抑制至少一个涉及二硫键还原的基因。
5.权利要求4的方法，其中所述原核细胞是来自选自AD494、BL21trxB、Origami、Rosetta-gami和Shuffle菌株的菌株的大肠杆菌细胞。
6.权利要求1至5中任一项的方法，其中所述梭菌神经毒素轻链选自BoNT A型、B型、C型、D型、E型、F型或G型或TeNT轻链，且其中所述梭菌神经毒素重链选自BoNT A型、B型、C型、D型、E型、F型或G型或TeNT重链。
7.权利要求1至6中任一项的方法，其中所述梭菌神经毒素轻链和所述梭菌神经毒素重链来自同一BoNT血清型或亚型。
8.权利要求1至6中任一项的方法，其中所述梭菌神经毒素轻链和所述梭菌神经毒素重链来自不同BoNT血清型或亚型。
9.权利要求1至8中任一项的方法，其中所述编码梭菌神经毒素轻链的第一基因和所述编码梭菌神经毒素重链的第二基因存在于同一载体上。
10.权利要求1至8中任一项的方法，其中所述编码梭菌神经毒素轻链的第一基因和所述编码梭菌神经毒素重链的第二基因存在于不同载体上。
11.权利要求1至10中任一项的方法，其进一步包括从所述宿主细胞回收所述双链梭菌神经毒素的步骤。
12.细胞，其包含编码梭菌神经毒素轻链的第一基因和编码梭菌神经毒素重链的第二基因，其中所述第一和第二基因在所述细胞的氧化环境中表达。
13.试剂盒，其包含：
a.包含氧化环境的细胞；
b.编码梭菌神经毒素轻链的第一基因；和
c.编码梭菌神经毒素重链的第二基因；
其中所述第一和第二基因适合用于在所述细胞的所述氧化环境中分别表达梭菌神经毒素轻链和重链。
14.双链梭菌神经毒素，其通过权利要求1至11中任一项的方法获得。
15.药物组合物，其包含权利要求14的双链梭菌神经毒素。
16.具有氧化性细胞质的宿主细胞的用途，用于产生双链梭菌神经毒素，其中所述宿主细胞包含编码梭菌神经毒素轻链的第一基因和编码梭菌神经毒素重链的第二基因，其中所述第一和第二基因在所述宿主细胞的氧化性细胞质中表达。
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