TWI700289B - 陽離子神經毒素 - Google Patents
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Abstract
本發明提供包含至少一個胺基酸修飾之工程化的梭菌毒素，其中該至少一個胺基酸修飾增加工程化的梭菌毒素之等電點(pI)至高於缺少該至少一個胺基酸修飾之其他方面相同的梭菌毒素之pI至少0.2個pI單位的值，且其中該至少一個胺基酸修飾並未位於梭菌毒素結合域(HC域)。亦提供該工程化的梭菌毒素之醫藥用途。
Description
本發明係關於包含至少一個胺基酸修飾之工程化的梭菌毒素，及此種工程化的梭菌毒素於醫藥及治療的用途。
梭狀芽孢桿菌(Clostridia)屬中的細菌產生極強且特異性的蛋白質毒素，其可毒害它們被遞送處的神經元及其他細胞。此種梭菌毒素之例包括由破傷風桿菌(C.tetani)及肉毒桿菌(C.botulinum)血清型A-G所產生的神經毒素TeNT及BoNT，以及由巴氏梭菌(C.baratii)及酪酸梭菌(C.butyricum)所產生者。
在該等梭菌毒素中有些為已知最強大的毒素。例如，肉毒桿菌神經毒素依其血清型而定，對於小鼠具有範圍從0.5至5ng/kg之半數致死劑量(LD50)值。破傷風及肉毒桿菌毒素兩者藉由抑制受影響的神經元而作用，尤其是神經傳導物之釋放。而肉毒桿菌毒素於神經肌肉接合處起作用並於周圍神經系統中抑制膽鹼能傳導，破傷風毒素則於中樞神經系統中起作用。
在自然界，梭菌毒素係以單鏈多肽被合成，該多肽係經蛋白酶切割事件(proteolytic cleavage event)
進行轉譯後修飾，而形成藉由雙硫鍵連結在一起的兩條多肽鏈。切割發生於特定切割位點，通常被稱為活化位，其位於提供鏈內雙硫鍵之半胱胺酸殘基之間。正是此二鏈型，其為毒素之活性型。此兩條鏈被稱為重鏈(H-鏈)(具有大約100kDa之分子量)及輕鏈(L-鏈)(具有大約50kDa之分子量)。H-鏈包含N-端轉位組件(HN域)及C-端目標組件(HC域)。切割位點位於L-鏈及轉位域組件之間。在HC域結合至其目標神經元以及所結合的毒素經由胞內體內化至細胞中，HN域使L-鏈轉位通過包內體膜並進入細胞質液內，並且L-鏈提供一種蛋白酶功能(亦已知為無細胞毒性蛋白酶)。
無細胞毒性蛋白酶藉由蛋白酶切割一種已知為SNARE蛋白質(例如，SNAP-25、VAMP、或突觸融合蛋白(Syntaxin))之細胞內運輸蛋白而起作用-參見Gerald K(2002)"Cell and Molecular Biology”(4th edition)John Wiley & Sons,Inc。首字母縮寫SNARE係衍生自可溶性NSF附著受體(Soluble NSF Attachment Receptor)一詞，其中NSF係指N-乙基馬來醯亞胺-敏感性因子(N-ethylmaleimide-Sensitive Factor)。SNARE蛋白質對於細胞內囊泡融合為不可或缺的，因此對於自細胞經由囊泡運輸之分子分泌為不可或缺。此蛋白酶功能為鋅依賴型肽鏈內肽酶(endopeptidase)活性且展現對SNARE蛋白質之高受質特異性。因此，一旦被遞送至所欲標的細胞，此無細胞毒性蛋白酶能夠抑制自標的細胞的細胞分泌。梭菌毒素之L-鏈蛋白酶是切斷SNARE蛋白質之無細胞毒性蛋白酶。
鑒於SNARE蛋白質之普遍存在的性質，梭菌毒素諸如肉毒桿菌毒素已被成功地運用在廣泛的療法中。
舉例而言，吾人參考William J.Lipham,Cosmetic and Clinical Applications of Botulinum Toxin(Slack,Inc.,2004)，其描述梭菌毒素諸如肉毒桿菌神經毒素(BoNTs)、BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F及BoNT/G、以及破傷風神經毒素(TeNT)之用途，用於在許多治療及化妝或美容之應用中抑制神經元傳導，例如目前市售肉毒桿菌毒素產品被核准作為治療之適應症包括局部痙攣狀態、上肢痙攣狀態、下肢痙攣狀態、頸肌張力不全(cervical dystonia)、眼瞼痙攣、半邊顏面痙攣、腋多汗症(hyperhidrosis of the axillae)、慢性偏頭痛、神經性逼尿肌過動(neurogenic detrusor overactivity)、皺眉紋(glabellar lines)、及嚴重魚尾紋(lateral canthal lines)。此外，梭菌毒素療法被描述用於治療神經肌肉失調(參見US 6,872,397)；用於治療子宮疾病(參見US 2004/0175399)；用於治療潰瘍及胃食道逆流疾病(參見US 2004/0086531)；用於治療肌張力不全(參見US 6,319,505)；用於治療眼疾(參見US 2004/0234532)；用於治療瞼痙攣(參見US 2004/0151740)；用於治療斜視(參見US 2004/0126396)；用於治療疼痛(參見US 6,869,610、US 6,641,820、US 6,464,986、及US 6,113,915)；用於治療肌纖維痛(參見US 6,623,742、US
2004/0062776)；用於治療下背痛(參見US 2004/0037852)；用於治療肌肉傷害(參見US 6,423,319)；用於治療鼻竇性頭痛(參見US 6,838,434)；用於治療緊張性頭痛(參見US 6,776,992)；用於治療頭痛(參見US 6,458,365)；用於減緩偏頭痛疼痛(參見US 5,714,469)；用於治療心血管疾病(參見US 6,767,544)；用於治療神經失調諸如帕金森氏病(Parkinson's disease)(參見US 6,620,415,US 6,306,403)；用於治療神經精神疾病(參見US 2004/0180061,US 2003/0211121)；用於治療內分泌失調(參見US 6,827,931)；用於治療甲狀腺失調(參見US 6,740,321)；用於治療膽鹼能影像的汗腺失調(參見US 6,683,049)；用於治療糖尿病(參見US 6,337,075、US 6,416,765)；用於治療胰臟疾病(參見US 6,261,572、US 6,143,306)；用於治療癌症諸如骨腫瘤(參見US 6,565,870、US 6,368,605、US 6,139,845、US 2005/0031648)；用於治療耳疾(參見US 6,358,926、US 6,265,379)；用於治療自主神經系統障礙諸如胃腸肌肉失調及其他平滑肌失能(參見US 5,437,291)；用於治療與皮膚細胞增生病有關的皮膚損傷(參見US 5,670,484)；用於處理神經性炎症失調(參見US 6,063,768)；用於減緩掉髮及刺激毛髮生長(參見US 6,299,893)；用於治療下垂嘴(downturned mouth)(參見US 6,358,917)；用於降低食慾(參見US 2004/40253274)；用於牙齒療法及處置(參見US 2004/0115139)；用於治療神經肌肉失調及症狀(參見US 2002/0010138)；用於治療各種失調及症狀以及相關的疼
痛(參見US 2004/0013692)；用於治療由黏膜過度分泌造成的症狀，諸如氣喘及COPD(參見WO 00/10598)；及用於治療非神經元性症狀諸如炎症、內分泌症狀、外分泌症狀、免疫症狀、心血管症狀、骨症狀(參見WO 01/21213)。在此藉由引用將所有上述出版物整體併入。
無細胞毒性蛋白酶諸如梭菌毒素(例如，BoNTs及TeNT)於人類及其他哺乳動物之治療及美容處理之用途被預期擴展至可受益於此等毒素之性質的疾病及失調之更廣範圍。
為了避免全身性神經性影響，許多梭菌毒素療法利用梭菌毒素之直接投予至所給目標位點(諸如目標組織)治療。於此方式中當投予基於梭菌毒素之治療時之一問題，即毒素自投予位點遠離並進入周圍組織或全身性循環的傳播。毒素遠離目標組織的擴散被認為係造成不欲副作用的原因，該等副作用於極端情形下可能會危及生命。當以高劑量、濃度及注射體積使用梭菌毒素療法(諸如BoNT療法)時，此可能為特別關注的問題。對於商業化的BoNT/A療法已有報告與此問題有關的副作用，包括衰弱、廣泛性肌無力(generalised muscle weakness)、複視、下垂、吞嚥困難、發音困難、發音不良、尿失禁、及呼吸困難。吞嚥及呼吸困難可能有生命威脅且關於毒素效應傳播的死亡已被報告。
因此於本項技術領域中存有對於下述梭菌毒素之需求，相較於已知的梭菌毒素，該梭菌毒素於投予位點中具有增進組織保留性質且因此展現出減少遠離投予位點的擴散。
本發明藉由提供如請求項中所詳列的工程化的梭菌毒素，而解決上述問題。
於一態樣，本發明提供一種工程化的梭菌毒素，其包含至少一個(例如，至少一、二或三個)胺基酸修飾，其中該至少一個胺基酸修飾增加工程化的梭菌毒素之等電點(pI)至高於缺少該至少一個胺基酸修飾之其他方面相同的梭菌毒素之pI至少0.2個(例如，至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個)pI單位的值，且其中該至少一個胺基酸修飾並未位於梭菌毒素結合域(HC域)。
於一具體實施例，「未位於梭菌毒素結合域(HC)域」意指該至少一個胺基酸修飾係位於梭菌毒素HN域或位於梭菌毒素輕鏈。
於一具體實施例，本發明提供一包含至少一個(例如，至少一、二或三個)胺基酸修飾之工程化的梭菌毒素，其中該至少一個胺基酸修飾增加工程化的梭菌毒素之等電點(pI)至高於缺少該至少一個胺基酸修飾之其他方面相同的梭菌毒素之pI至少0.2個(例如，至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個)pI單位，且其中該至少一個胺基酸修飾係位於梭菌毒素轉位域(HN域)。
於另一具體實施例中，本發明提供一包含至少一個(例如，至少一、二或三個)胺基酸修飾之工程化的梭菌毒素，其中該至少一個胺基酸修飾增加工程化的
梭菌毒素之等電點(pI)至高於缺少該至少一個胺基酸修飾之其他方面相同的梭菌毒素之pI至少0.2個(例如，至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個)pI單位，且其中該至少一個胺基酸修飾係位於梭菌毒素輕鏈。
於一具體實施例，其中該至少一個胺基酸修飾係位於梭菌毒素輕鏈，該至少一個胺基酸修飾並未導入梭菌毒素輕鏈E3連接酶辨識基序(E3 ligase recognition motif)。如此，於一具體實施例，本發明之工程化的梭菌毒素之輕鏈不包含E3連接酶辨識基序。
如上文所使用，「E3連接酶辨識基序」一詞係指於藉由已被施予神經毒素的患者中存在的內源性蛋白酶體降解路徑造成神經毒素多肽加速降解之輕鏈修飾。「E3連接酶辨識」基序為一結構基序，其使能夠藉由E3連接酶(亦已知為E3泛素(ubiquitin)連接酶；因此，「E3連接酶辨識基序」亦被稱為「E3泛素連接酶辨識基序」)辨識此基序並結合至此基序。E3連接酶辨識基序為本項所屬技術領域中具通常知識者所熟知。
E3連接酶辨識基序之例包括下列序列(其中「X」可代表自然存在的胺基酸之任一者)：
E3連接酶辨識基序之其他例包括：ETFSDLWKLLPE(SEQ ID NO：20)、TSFAEYWNLLSP(SEQ ID NO：21)、LTFEHYWAQLTS(SEQ ID NO：22)、LTFEHWWAQLTS(SEQ ID NO：23)、LTFEHSWAQLTS(SEQ ID NO：24)、ETFEHNWAQLTS(SEQ ID NO：25)、LTFEHNWAQLTS(SEQ ID NO：26)、LTFEHWWASLTS(SEQ ID NO：27)、LTFEHWWSSLTS(SEQ ID NO：28)、LTFTHWWAQLTS(SEQ ID NO：29)、ETFEHWWAQLTS(SEQ ID NO：30)、LTFEHWWSQLTS(SEQ ID NO：31)、LTFEHWWAQLLS(SEQ ID NO：32)、ETFEHWWSQLLS(SEQ ID NO：33)、RFMDYWEGL(SEQ
ID NO：34)、MPRFMDYWEGLN(SEQ ID NO：35)、SQETFSDLWKLLPEN(SEQ ID NO：36)、及LTFEHNWAQLEN(SEQ ID NO：37)。
於一具體實施例，其中該至少一個胺基酸修飾位於梭菌毒素輕鏈，該至少一個胺基酸修飾並未導入至梭菌毒素輕鏈一MDM2 E3連接酶辨識基序。如此，於一具體實施例，本發明之工程化的梭菌毒素之輕鏈不包含MDM2 E3連接酶辨識基序。
於一具體實施例，其中該至少一個胺基酸修飾位於梭菌毒素輕鏈，此工程化的梭菌毒素不包含N-端脯胺酸之胺基酸修飾。
於一具體實施例，其中此工程化的梭菌毒素為BoNT/E，其中該至少一個胺基酸修飾位於梭菌毒素輕鏈，該工程化的BoNT/E不包含於下列胺基酸位置之任一者以離胺酸之取代：Q53、N72、N378、N379、R394、T400。
於一具體實施例，其中工程化的梭菌毒素為BoNT/E，且其中該至少一個胺基酸修飾位於梭菌毒素輕鏈，該工程化的BoNT/E不包含於下列胺基酸位置之任一者以離胺酸之取代：Q53、N72、N378、N379、T400。
於一具體實施例，其中工程化的梭菌毒素為BoNT/E，且其中該至少一個胺基酸修飾位於梭菌毒素輕鏈，該工程化的BoNT/E不包含於下列胺基酸位置之任三者以離胺酸之取代：Q53、N72、N378、N379、R394、T400。
於一具體實施例，其中工程化的梭菌毒素為BoNT/E，且其中該至少一個胺基酸修飾位於梭菌毒素輕鏈，該工程化的BoNT/E不包含於下列胺基酸位置之任三者以離胺酸之取代：Q53、N72、N378、N379、T400。
於一具體實施例，可選擇地其中至少一個胺基酸修飾位於梭菌毒素輕鏈，此工程化的梭菌毒素並非BoNT/E。
本發明之工程化的梭菌毒素不包含位於梭菌毒素HC域之任何胺基酸修飾。如此，於本發明之工程化的梭菌毒素，該至少一個胺基酸修飾並未位於梭菌毒素HC域。
於一具體實施例，其中該至少一個胺基酸修飾位於梭菌毒素輕鏈，該至少一個胺基酸修飾不包含胺基酸以離胺酸殘基之取代。
於一具體實施例，其中工程化的梭菌毒素為如上述之工程化的梭菌毒素，該至少一個胺基酸修飾包含一酸性胺基酸殘基或不帶電胺基酸殘基以離胺酸或精胺酸殘基之取代。
於一具體實施例，其中工程化的梭菌毒素為如上述之工程化的梭菌毒素，該至少一個胺基酸修飾包含一酸性胺基酸殘基或不帶電胺基酸殘基以精胺酸殘基之取代。
於一具體實施例，其中工程化的梭菌毒素為如上述之工程化的梭菌毒素，該至少一個胺基酸修飾增加工程化的梭菌毒素之pI至高於缺少該至少一個胺基酸
修飾之其他方面相同的梭菌毒素之pI至少0.4個pI單位的值。於一具體實施例，該至少一個胺基酸修飾增加工程化的梭菌毒素之pI至高於缺少該至少一個胺基酸修飾之其他方面相同的梭菌毒素之pI至少0.5個pI單位的值。於一具體實施例，該至少一個胺基酸修飾增加工程化的梭菌毒素之pI至高於缺少該至少一個胺基酸修飾之其他方面相同的梭菌毒素之pI至少0.6個pI單位的值。於一具體實施例，該至少一個胺基酸修飾增加工程化的梭菌毒素之pI至高於缺少該至少一個胺基酸修飾之其他方面相同的梭菌毒素之pI至少0.8個pI單位的值。於一具體實施例，該至少一個胺基酸修飾增加工程化的梭菌毒素之pI至高於缺少該至少一個胺基酸修飾之其他方面相同的梭菌毒素之pI至少1個pI單位的值。
於某些具體實施例，此工程化的梭菌毒素包含至少2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85或90個胺基酸修飾。
於某些具體實施例，該至少一個胺基酸修飾增加工程化的梭菌毒素之pI至高於缺少該至少一個胺基酸修飾之其他方面相同的梭菌毒素之pI至少2、3、4或5個pI單位的值。
於某些具體實施例，此工程化的梭菌毒素包含至少3個胺基酸修飾，且該至少3個胺基酸修飾增加工程化的梭菌毒素之pI至高於缺少該至少3個胺基酸修飾之其他方面相同的梭菌毒素之pI至少0.2個pI單位的值。
於某些具體實施例，此工程化的梭菌毒素包含至少5個胺基酸修飾，且該至少5個胺基酸修飾增加工程化的梭菌毒素之pI至高於缺少該至少5個胺基酸修飾之其他方面相同的梭菌毒素之pI至少0.5個pI單位的值。
本發明者們已發現藉由增加梭菌毒素之pI，例如，增加至少0.2個pI單位，或0.5個pI單位，或1個pI單位(透過導入梭菌毒素蛋白質至少一個胺基酸修飾)，所生成之工程化的梭菌毒素有利地證實增加組織保留及減少遠離投予位點的擴散的性質，而維持目標細胞結合、轉位、及目標SNARE蛋白質(類)的切斷之能力。如此，相較於缺少該至少一個胺基酸修飾之其他方面相同的梭菌毒素，梭菌毒素自投予位點的傳播被顯著地降低。
本發明之工程化的梭菌毒素適合用於上述任一療法中，且與使用已知之梭菌毒素療法相比，可有利地證實減少或不存有副作用。本發明之工程化的梭菌毒素之增加的組織保留性質亦提供增加的效力及/或作用期間，且與已知的梭菌毒素療法相比，能夠減少使用的劑量(或增加劑量而無任何額外的副作用)，因而提供進一步的優點。
如此，於一具體實施例，與對應之未修飾梭菌毒素相比，本發明之工程化的梭菌毒素具有增加的效力、增加的組織保留、及/或增加的作用期間。
於下列更詳細地討論，藉由至少一個胺基酸修飾所提供的pI增加意指，本發明之工程化的梭菌毒素於所指定之pH下具有淨電荷，該淨電荷較缺少該至少一個胺基酸修飾之其他方面相同的梭菌毒素上的淨電荷更為正值。不欲受限於任何理論，本發明者們咸信此增加的正電荷使得本發明之工程化的梭菌毒素於投予位點展現較長的組織保留時間，由於於投予位點處，在工程化的梭菌毒素與陰離子性細胞外組份(諸如細胞膜及肝素硫酸鹽蛋白多醣)之間有利的靜電交互作用。此等改善的靜電交互作用用來減少工程化的梭菌毒素遠離投予位點的擴散，因而改善組織保留。
例如，本發明之工程化的梭菌毒素之改善的組織保留性質能夠允許(i)較高劑量投入至個別的肌肉，諸如胸鎖乳突肌，不會傳播至附近的頸部肌肉而引起吞嚥困難，及(ii)於單次治療中較高的總劑量(至所有肌肉)，不會傳播至循環中及引起全身性的效果諸如呼吸困難。對病患的優點可包括大肌肉諸如胸鎖乳突肌之更有效的治療、增大的於各治療期間注射不同的肌肉之機會、及因為較高的劑量而可能較長的有效治療期間(再治療前較長時間為必要的)。
於一具體實施例，本發明之一工程化的梭菌毒素於使用中具有正的淨電荷(例如，當工程化的梭菌毒素在使用中被定位於組織中之所欲投予位點時)。
等電點(pI)為指定蛋白質之特性。如本項技術領域中所熟知，蛋白質係由特定的胺基酸(當於蛋白質
中時亦稱為胺基酸殘基)序列製成。二十種標準組之各胺基酸具有不同的側鏈(或R基團)，意指在蛋白質中各胺基酸殘基顯示不同的化學性質諸如電荷及疏水性。此等性質可受周遭化學環境的影響，諸如溫度及pH。蛋白質之整體化學特性將取決於此等各種因子的總和。
某些胺基酸殘基(如下詳述)具有可顯示取決於周圍pH的電荷之可離子化側鏈。在指定的pH下，此種側鏈是否帶電荷取決於相關的可離子化部分的pKa，其中pKa為自共軛鹼之特定質子的酸離解常數(Ka)之負對數。
例如，酸性殘基諸如天冬胺酸及麩胺酸具有pKa值大約為4.1(精確pKa值可取決於溫度、離子強度及可離子化基團的微環境)之側鏈羧酸基。如此，此等側鏈於pH 7.4(通常稱為「生理學的pH」)呈現負電荷。於低pH值，此等側鏈將成為質子化並喪失其電荷。
相反地，鹼性殘基諸如離胺酸及精胺酸具有pKa值大約為10-12之含氮側鏈基團。此等側鏈因此於pH 7.4呈現正電荷。於高pH值，此等側鏈將成為去質子化並喪失其電荷。
因此蛋白質分子之整體(淨)電荷取決於存於蛋白質中的酸性及鹼性殘基之數目(及其表面暴露程度)及周遭pH。改變周遭pH會改變蛋白質之整體電荷。因此，對於每一種蛋白質，存有一指定pH，其正及負電荷的數目相等且此蛋白質顯示無總淨電荷。此點已知為等電點(pI)。等電點為蛋白質生物化學中的一標準概念，其為本項技術領域中具有通常知識者所熟知。
因此等電點(pI)被定義為蛋白質顯示淨電荷為零之pH值。pI的增加意指蛋白質顯示淨電荷為零需要較高pH值。因此，pI的增加代表於所給pH下，蛋白質之淨正電荷增加。相反地，pI的減少意指蛋白質顯示淨電荷為零所需的pH值較低。因此，pI的減少代表於所給pH下，蛋白質之淨正電荷減少。
在本領域中測定蛋白質之pI的方法為已知，且對本項技術領域中具有通常知識者所熟悉。舉例而言，蛋白質之pI可由存於蛋白質中之各胺基酸之平均pKa值計算而得(「經計算的pI」)。此種計算可使用此項技術中已知的電腦程式進行；計算pI值之電腦程式的較佳例包括來自ExPASy之Scripps Research Institute and Compute pI/MW Tool的Protein Calculator。不同分子之間的pI值之比較應使用相同計算技術/程式進行。
在適當情況下，蛋白質之計算的pI可使用等電焦集法(「pI」)之技術確認。此技術使用電泳依據其pI來分離蛋白質。等電焦集法一般使用具有固相pH梯度的膠體來進行。當施加電場時，蛋白質透過pH梯度移動直到其到達其具零淨電荷的pH，此點為蛋白質的pI。等電焦集法提供的結果一般於性質上為相對低的解析，如此本發明者咸信藉由計算的pI(如上述)所提供的結果係更為適用。
除非另有陳述，本說明全文中「pI」意指「計算的pI」。
藉由改變於蛋白質表面上所顯示的鹼性及/或酸性基團的數目，蛋白質之pI可被增加或減少。此可藉由修飾此蛋白質之一或多個胺基酸而達成。例如，藉由減少酸性殘基的數目或藉由增加鹼性殘基的數目而可提供pI的增加。此種胺基酸修飾被更詳細討論於下文。
天然的(未經修飾的)梭菌毒素具有大約5-6之pI。因此，於pH7.4，天然的肉毒桿菌毒素具有負的淨電荷。舉例而言，BoNT/A之pI為6.4，且BoNT/A分子於pH7.4具有-8的淨電荷。此等pI值係如上文所述計算。
如上述，於一具體實施例，本發明之工程化的梭菌毒素包含至少一個胺基酸修飾，其中該至少一個胺基酸修飾增加工程化的梭菌毒素之等電點(pI)至高於缺少該至少一個胺基酸修飾之其他方面相同的梭菌毒素之pI至少0.2個pI單位的值。
因此，於本發明之內文，於工程化的BoNT/A梭菌毒素的情形中pI增加0.2個單位將會為pI由6.4增加至6.6。
如上文所述，於一具體實施例，本發明之一工程化的梭菌毒素包含至少一個胺基酸修飾，其中該至少一個胺基酸修飾增加工程化的梭菌毒素之等電點(pI)至高於缺少該至少一個胺基酸修飾之其他方面相同的梭菌毒素之pI的值至少一個pI單位。
因此，於本發明之內文，於工程化的BoNT/A梭菌毒素的情形中pI增加1單位將會為pI由6.4增加至7.4。
於一具體實施例，工程化的梭菌毒素具有至少5.5之pI。
於一具體實施例，工程化的梭菌毒素具有至少6之pI(例如，至少6、至少7、至少8、或至少9)。
於一具體實施例，工程化的梭菌毒素具有至少6.5之pI。
於一具體實施例，工程化的梭菌毒素具有至少7之pI。
於一具體實施例，工程化的梭菌毒素具有6.5至9.5之間的pI(例如6.5至7.5之間的pI)。
如上文所述，本發明之工程化的梭菌毒素具有增加的組織保留性質，其亦提供增加的效力及/或作用期間，且相較於已知梭菌毒素療法，可使使用的劑量減少(或增加的劑量而無額外的作用)。其中可定義此等有利性質(呈現治療指數的增加)之一方式為根據工程化的梭菌毒素之安全率(Safety Ratio)。關於此點，藉由於相關動物模型中測量體重減少的百分比(例如，小鼠，於投
予7日間偵測體重減少)，可以實驗評估梭菌毒素之不欲的效果(由毒素遠離投予位點的擴散所引起)。相反地，藉由趾的外展分數(Digital Abduction Score)(DAS)試驗，一種肌肉麻痺之測量，可實驗評估梭菌毒素於所欲目標的效果。DAS試驗係可藉由將20μl之調製於明膠磷酸緩衝液(Gelatin Phosphate Buffer)中之梭菌毒素注射至小鼠腓腸肌/比目魚肌複合體中，隨後使用Aoki之方法估計趾的外展分數(Aoki KR,Toxicon 39：1815-1820；2001)來進行。於此DAS試驗，小鼠以尾巴被短暫地懸掛以誘發特徵性的驚嚇反應，其中小鼠伸展其後肢並外展其後趾。隨著梭菌毒素注射，趾的外展變化程度以五點評分尺度(0=正常至4=趾的外展及腳的伸展減少最大)被計分。
然後梭菌毒素之安全率可被表示為體重降低10%所需的毒素量(於小鼠投劑後第1個7日間在峰效應下所測量的)及DAS分數為2所需的毒素量之間的比率。因此希望高安全率分數，且指示一種能夠有效地麻痺目標肌肉且具少許的不欲的超出目標物效果之毒素。本發明之工程化的毒素具有高於等價之未經修飾(天然)肉毒桿菌毒素之安全率。
因此，於一具體實施例，本發明之一工程化的梭菌毒素具有至少8(例如，至少8、9、10、15、20、25、30、35、40、45或50)之安全率，其中安全率被計算為：體重變化-10%所需的毒素劑量(pg/小鼠)除以DAS ED50(pg/小鼠)[ED50=產生DAS分數為2所需之劑量]。
於一具體實施例，本發明之一工程化的梭菌毒素具有至少10之安全率。於一具體實施例，本發明之一工程化的梭菌毒素具有至少15之安全率。
本發明之工程化的梭菌毒素包含至少一個胺基酸修飾。該至少一個胺基酸修飾增加梭菌毒素之pI，如上文所討論者。於本發明之內文，胺基酸修飾為梭菌毒素之胺基酸序列的修飾。此種修飾可藉由由序列中一個胺基酸以另一個胺基酸替換(即，取代)、經由插入新的胺基酸至序列中、或藉由刪除序列中的胺基酸而受影響。被併入蛋白質中的胺基酸序列之胺基酸亦被稱為胺基酸殘基。
蛋白質中發現的20種標準胺基酸如下：
下列胺基酸被視為帶電胺基酸：天冬胺酸(負的)、麩胺酸(負的)、精胺酸(正的)、及離胺酸(正的)。
於pH 7.4，天冬胺酸(pKa 3.1)及麩胺酸(pKa 4.1)之側鏈具有負電荷，而精胺酸(pKa 12.5)及離胺酸(pKa 10.8)之側鏈具有正電荷。天冬胺酸及麩胺酸被稱為酸性胺基酸殘基。精胺酸及離胺酸被稱為鹼性胺基酸殘基。
下列胺基酸被視為不帶電、極性(意指其可參與氫鍵結)胺基酸：天冬醯胺酸、麩醯胺酸、組胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、甲硫胺酸、色胺酸。
下列胺基酸被視為不帶電、疏水性胺基酸：丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、及甘胺酸。
梭菌毒素之pI中的增加可受於梭菌毒素中導入一或多個增加梭菌毒素中正電荷對負電荷的比率的胺基酸修飾而影響。
於一具體實施例，至少一個胺基酸修飾係選自：胺基酸取代、胺基酸插入、及胺基酸刪除。
於胺基酸取代，形成梭菌毒素胺基酸序列之部分的胺基酸殘基以不同胺基酸殘基替換。此替換胺基酸殘基可為如上述之20種標準胺基酸之一者。
或者，胺基酸取代中之替代胺基可為非標準胺基酸(非為上述20種胺基酸標準組之部分的胺基酸)。例如，替換胺基酸可為一鹼性非標準胺基酸，例如，L-
鳥胺酸、L-2-胺基-3-胍丙酸、或離胺酸、精胺酸及鳥胺酸之D-異構物)。導入非標準胺基酸至蛋白質之方法為此項技術領域已知，並且包括使用大腸桿菌營養缺陷型的表現宿主之重組蛋白質合成。
於胺基酸插入，額外的胺基酸殘基(並非通常存在者)被併入梭菌毒素胺基酸序列，如此，增加於該序列中的胺基酸殘基的總數。於胺基酸刪除，胺基酸殘基自梭菌毒素胺基酸序列被移除，如此減少該序列中的胺基酸殘基的總數。
藉由取代、插入或刪除胺基酸殘基來修飾蛋白質的方法為本項技術領域已知。例如，可藉由編碼梭菌毒素之DNA序列的修飾而導入胺基酸修飾。其能使用標準分子選殖技術而被達成，例如藉由定點突變(site-directed mutagenesis)，其中使用聚合酶酵素，使用編碼所欲胺基酸之DNA之短鏈(寡核苷酸)來替換原始編碼序列，或藉由使用各種酵素(例如，連接酶及限制核酸內切酶)插入/刪除部分之基因。或者，可化學合成經修飾的基因序列。
於一具體實施例，至少一個胺基酸修飾係選自：酸性胺基酸殘基以鹼性胺基酸殘基取代；酸性胺基酸殘基以不帶電胺基酸殘基取代；不帶電胺基酸殘基以鹼性胺基酸殘基取代；鹼性胺基酸殘基之插入；及酸性胺基酸殘基之刪除。
於一較佳具體實施例，至少一個胺基酸修飾為取代，其於梭菌毒素中有利地保持相同數目的胺基酸
殘基。於一具體實施例，此取代係選自：酸性胺基酸殘基以鹼性胺基酸殘基取代、酸性胺基酸殘基以不帶電胺基酸殘基取代、及不帶電胺基酸殘基以鹼性胺基酸殘基取代。於一具體實施例，鹼性胺基酸殘基為離胺酸殘基或精胺酸殘基。於一具體實施例，鹼性胺基酸殘基為離胺酸殘基。於一具體實施例，鹼性胺基酸殘基為精胺酸殘基。於一具體實施例，其中此取代係酸性胺基酸殘基以不帶電胺基酸殘基取代，此酸性胺基酸殘基以其對應的不帶電醯胺胺基酸殘基替換(即，天冬胺酸以天冬醯胺酸替換，及麩胺酸以麩醯胺酸替換)。
於另一較佳具體實施例，至少一個胺基酸修飾係酸性胺基酸殘基以鹼性胺基酸殘基取代、或不帶電胺基酸殘基以鹼性胺基酸殘基取代。於一具體實施例，鹼性胺基酸殘基為離胺酸殘基。於一具體實施例，鹼性胺基酸殘基為精胺酸殘基。
本發明之工程化的梭菌毒素可包含多於一個的胺基酸修飾。如此，於一具體實施例，工程化的梭菌毒素(如上述)包含1至90個胺基酸之修飾(例如，1至80、1至70、1至60、1至50、1至40、1至30、1至20、1至10、3至50、3至40、3至30、4至40、4至30、5至40、5至30、或10至25個胺基酸修飾)。於一具體實施例，工程化的梭菌毒素(如上述)包含1至20個胺基酸修飾。於一具體實施例，工程化的梭菌毒素(如上述)包含1至10個胺基酸修飾。於一具體實施例，工程化的梭菌毒素(如上述)包含2至20個胺基酸修飾。於一
具體實施例，工程化的梭菌毒素(如上述)包含2至15個胺基酸修飾。於一具體實施例，工程化的梭菌毒素(如上述)包含2至10個胺基酸修飾。於一具體實施例，工程化的梭菌毒素(如上述)包含3至20個胺基酸修飾。於一具體實施例，工程化的梭菌毒素(如上述)包含3至15個胺基酸修飾。於一具體實施例，工程化的梭菌毒素(如上述)包含3至10個胺基酸修飾。於一具體實施例，工程化的梭菌毒素(如上述)包含4至40個胺基酸修飾。於一具體實施例，此工程化的梭菌毒素包含至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、或至少10個胺基酸修飾。於一具體實施例，此工程化的梭菌毒素包含至少3個胺基酸修飾(例如，至少3個胺基酸取代)。於一具體實施例，此工程化的梭菌毒素包含至少4個胺基酸修飾(例如，至少4個胺基酸取代)。各該胺基酸修飾為如上述之胺基酸修飾。因此，各該胺基酸修飾有助於增加工程化的梭菌毒素之pI(與缺乏該胺基酸修飾而其他方面相同的梭菌毒素的pI相比)。
未位於梭菌毒素結合域(HC域)之任一梭菌毒素胺基酸(即，胺基酸殘基)可被如上文所述修飾，只要該修飾之結果為梭菌毒素pI增加(如上述)即可。然而，本發明者們已鑑定出特別適合用於修飾標的之梭菌毒素胺基酸的子集。
較佳標的胺基酸可具有某些性質。例如，較佳標的胺基酸可為：(i)表面暴露的胺基酸；(ii)位於梭菌毒素蛋白質二集結構外側者；(iii)位於梭菌毒素蛋白質
區域中，該區域對於蛋白質功能並非必需者；(iv)其同一性在梭菌毒素型、亞型或血清型之間未被保留之胺基酸；(iv)其修飾沒有產生預期的泛素化(ubiquitination)位點的胺基酸；或(v)前述之任何組合。
如上文所述，本發明之工程化的梭菌毒素的特徵為位於梭菌毒素HN轉位域或梭菌毒素輕鏈任一者之一或多個胺基酸修飾。
梭菌毒素輕鏈參考序列之例包括：肉毒桿菌A型神經毒素：胺基酸殘基1-448
肉毒桿菌B型神經毒素：胺基酸殘基1-440
肉毒桿菌C1型神經毒素：胺基酸殘基1-441
肉毒桿菌D型神經毒素：胺基酸殘基1-445
肉毒桿菌E型神經毒素：胺基酸殘基1-422
肉毒桿菌F型神經毒素：胺基酸殘基1-439
肉毒桿菌G型神經毒素：胺基酸殘基1-441
破傷風神經毒素：胺基酸殘基1-457
梭菌毒素HN域參考序列之例包括：肉毒桿菌A型神經毒素：胺基酸殘基449-871
肉毒桿菌B型神經毒素：胺基酸殘基443-862
肉毒桿菌C1型神經毒素：胺基酸殘基450-866
肉毒桿菌D型神經毒素：胺基酸殘基449-871
肉毒桿菌E型神經毒素：胺基酸殘基455-845
肉毒桿菌F型神經毒素：胺基酸殘基450-864
肉毒桿菌G型神經毒素：胺基酸殘基449-871
破傷風神經毒素：胺基酸殘基456-879
梭菌毒素HC域參考序列之例包括：肉毒桿菌A型神經毒素：胺基酸殘基872-1278
肉毒桿菌B型神經毒素：胺基酸殘基863-1291
肉毒桿菌C1型神經毒素：胺基酸殘基867-1291
肉毒桿菌D型神經毒素：胺基酸殘基872-1276
肉毒桿菌E型神經毒素：胺基酸殘基846-1252
肉毒桿菌F型神經毒素：胺基酸殘基865-1278
肉毒桿菌G型神經毒素：胺基酸殘基872-1297
破傷風神經毒素：胺基酸殘基880-1315
上述鑑定的參考序列應被視為指引，依據次血清型(sub-serotype)可發生輕微變動。例如，US 2007/0166332(在此藉由引用將其全文併入)引述些微不同的梭菌序列：輕鏈：肉毒桿菌A型神經毒素：胺基酸殘基M1-K448
肉毒桿菌B型神經毒素：胺基酸殘基M1-K441
肉毒桿菌C1型神經毒素：胺基酸殘基M1-K449
肉毒桿菌D型神經毒素：胺基酸殘基M1-R445
肉毒桿菌E型神經毒素：胺基酸殘基M1-R422
肉毒桿菌F型神經毒素：胺基酸殘基M1-K439
肉毒桿菌G型神經毒素：胺基酸殘基M1-K446
破傷風神經毒素：胺基酸殘基M1-A457
HN域：肉毒桿菌A型神經毒素：胺基酸殘基A449-K871
肉毒桿菌B型神經毒素：胺基酸殘基A442-S858
肉毒桿菌C1型神經毒素：胺基酸殘基T450-N866
肉毒桿菌D型神經毒素：胺基酸殘基D446-N862
肉毒桿菌E型神經毒素：胺基酸殘基K423-K845
肉毒桿菌F型神經毒素：胺基酸殘基A440-K864
肉毒桿菌G型神經毒素：胺基酸殘基S447-S863
破傷風神經毒素：胺基酸殘基S458-V879
HC域：肉毒桿菌A型神經毒素：胺基酸殘基N872-L1296
肉毒桿菌B型神經毒素：胺基酸殘基E859-E1291
肉毒桿菌C1型神經毒素：胺基酸殘基N867-E1291
肉毒桿菌D型神經毒素：胺基酸殘基S863-E1276
肉毒桿菌E型神經毒素：胺基酸殘基R846-K1252
肉毒桿菌F型神經毒素：胺基酸殘基K865-E1274
肉毒桿菌G型神經毒素：胺基酸殘基N864-E1297
破傷風神經毒素：胺基酸殘基I880-D1315
於一具體實施例，其中該至少一個胺基酸修飾位於梭菌毒素轉位域(HN域)，該至少一個胺基酸修飾並未位於梭菌毒素帶區(belt region)。梭菌毒素帶區(藉由結構及模型之目視檢測所測定)被定義如下：肉毒桿菌A型神經毒素：胺基酸殘基492-545
肉毒桿菌B型神經毒素：胺基酸殘基472-532
肉毒桿菌C1型神經毒素：胺基酸殘基494-543
肉毒桿菌D型神經毒素：胺基酸殘基489-539
肉毒桿菌E型神經毒素：胺基酸殘基466-515
肉毒桿菌F型神經毒素：胺基酸殘基485-536
肉毒桿菌G型神經毒素：胺基酸殘基489-538
破傷風神經毒素：胺基酸殘基506-556
於一具體實施例，至少一個胺基酸修飾(如上述)為表面暴露的胺基酸殘基之修飾。表面暴露的胺基酸殘基為存於摺疊蛋白質之外部上的那些胺基酸，而如此易於接近周圍溶劑，與位於摺疊蛋白質之內部中的那些胺基酸殘基相反。胺基酸殘基之表面暴露程度及如此其對周圍溶劑的暴露取決於其摺疊的蛋白質間的位置，亦取決於蛋白質採取的立體構形。相較於具低表面暴露程度之胺基酸殘基的修飾，具高表面暴露程度之胺基酸殘基的修飾因此可能對蛋白質的等電點具有更大的影響。測定胺基酸殘基之表面暴露的程度的方法為本項技術領域所知。例如，可使用電腦程式AreaIMol(電腦程式CCP4套組之一部分)來計算所指定蛋白質中胺基酸殘基之表面暴露的程度。表面暴露的胺基酸殘基亦可藉由蛋白質晶體結構(諸如由X射線晶體學所提供)之目視檢測來鑑定。於一具體實施例，表面暴露的胺基酸殘基具有至少40之總計AreaIMol值。
於一具體實施例，至少一個胺基酸修飾包含選自下列胺基酸殘基之修飾：天冬胺酸殘基、麩胺酸殘基、組胺酸殘基、天冬醯胺酸殘基、麩醯胺酸殘基、絲胺酸殘基、蘇胺酸殘基、丙胺酸殘基、甘胺酸殘基、纈胺酸殘基、白胺酸殘基、及異白胺酸殘基。本發明者們已鑑定出來自此群組的胺基酸殘基呈現依據本發明用於修飾之特別適合的標的。
於一具體實施例，其中胺基酸修飾包含選自下列胺基酸殘基之修飾：天冬胺酸殘基、麩胺酸殘基、組胺酸殘基、天冬醯胺酸殘基、麩醯胺酸殘基、絲胺酸殘基、蘇胺酸殘基、丙胺酸殘基、甘胺酸殘基、纈胺酸殘基、白胺酸殘基、及異白胺酸殘基(如上述)，此胺基酸殘基係以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代。於一具體實施例，此胺基酸殘基係以精胺酸殘基取代。如此，於一具體實施例，帶負電的殘基、極性殘基、或不帶電殘基以帶正電殘基取代，如此增加正電荷對負電荷的比率並增加梭菌毒素之pI。
於一具體實施例，至少一個胺基酸修飾(如上述)包含天冬醯胺酸胺基酸殘基或麩醯胺酸胺基酸殘基(兩者不帶電、極性殘基)之修飾。於一具體實施例，天冬醯胺酸或麩醯胺酸胺基酸殘基以離胺酸殘基或精胺酸殘基(兩者帶正電殘基)取代。於一具體實施例，天冬醯胺酸或麩醯胺酸胺基酸殘基以離胺酸殘基取代。於一具體實施例，天冬醯胺酸或麩醯胺酸胺基酸殘基以精胺酸殘基取代。
於一具體實施例，工程化的梭菌毒素為BoNT/A。一參考BoNT/A序列具有UniProtKB登錄號P10845。於一具體實施例，其中工程化的梭菌毒素為BoNT/A，工程化的梭菌毒素為BoNT/A1。
本發明者們已鑑定出某些胺基酸，其呈現於BoNT/A梭菌毒素HN域中胺基酸修飾的較佳的標的。
於一具體實施例，其中工程化的梭菌毒素為BoNT/A，該工程化的BoNT/A包含至少一個(例如，至少1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50或所有55個)胺基酸之修飾，該胺基酸選自：D474、N476、D484、N486、I487、E488、A489、A490、E491、D546、E558、E560、H561、I566、L568、N570、S571、L577、N578、A597、E599、A601、E620、V621、T623、D625、T631、N645、L647、D650、D651、I668、E670、A672、V675、S683、I685、A686、N687、N752、Q753、T755、E756、E757、E758、N760、N761、I762、N763、D825、I831、G832、T847、D848、及D858；且該胺基酸修飾增加工程化的BoNT/A之等電點(pI)至一高於缺乏該胺基酸修飾之其他方面相同BoNT/A至少0.2個(例如，至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個)pI單位的值。於一具體實施例，該修飾包含胺基酸以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代。於一具體實施例，該修飾包含胺基酸以離胺酸殘基取代。於一具體實施例，該修飾包含胺基酸以精胺酸殘基取代。
於一具體實施例，其中工程化的梭菌毒素為BoNT/A，該工程化的BoNT/A包含至少一個(例如，至少1、2、3、4、5、10、15或所有17個)胺基酸之修飾，該胺基酸選自：N476、S564、N578、E599、L647、D650、D651、V675、I685、N687、T755、E757、N761、N763、I831、T847、及I849；且該胺基酸修飾增加工程化的BoNT/A之等電點(pI)至高於缺乏該胺基酸修飾之其他方
面相同BoNT/A至少0.2個(例如，至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個)pI單位的值。於一具體實施例，該修飾包含胺基酸以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代。於一具體實施例，該修飾包含胺基酸以離胺酸殘基取代。於一具體實施例，該修飾包含胺基酸以精胺酸殘基取代。
於一具體實施例，其中工程化的梭菌毒素為BoNT/A，該工程化的BoNT/A包含至少一個(例如，至少1、2、3、4、5或所有6個)胺基酸之修飾，該胺基酸選自：S564、L647、D650、D651、T847、及I849；且該胺基酸修飾增加工程化的BoNT/A之等電點(pI)至高於缺乏該胺基酸修飾之其他方面相同BoNT/A至少0.2個(例如，至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個)pI單位的值。於一具體實施例，該修飾包含胺基酸以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代。於一具體實施例，該修飾包含胺基酸以離胺酸殘基取代。於一具體實施例，該修飾包含胺基酸以精胺酸殘基取代。
於一具體實施例，其中工程化的梭菌毒素為BoNT/A，該工程化的BoNT/A包含至少一個(例如，至少1、2、3、4、5或所有6個)胺基酸之修飾，該胺基酸選自：N476、N763、N687、E599、I831、及N761；且該胺基酸修飾增加工程化的BoNT/A之等電點(pI)至高於缺乏該胺基酸修飾之其他方面相同BoNT/A至少0.2個(例如，至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個)pI單位的值。於一具體實施例，該修飾包含胺基酸
以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代。於一具體實施例，該修飾包含胺基酸以離胺酸殘基取代。於一具體實施例，該修飾包含胺基酸以精胺酸殘基取代。
於一具體實施例，其中工程化的梭菌毒素為BoNT/A，該工程化的BoNT/A包含至少一個(例如，至少1、2、3、4、或所有5個)胺基酸之修飾，該胺基酸選自：N578、V675、I685、T755、及E757；且該胺基酸修飾增加工程化的BoNT/A之等電點(pI)至高於缺乏該胺基酸修飾之其他方面相同BoNT/A至少0.2個(例如，至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個)pI單位的值。於一具體實施例，該修飾包含胺基酸以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代。於一具體實施例，該修飾包含胺基酸以離胺酸殘基取代。於一具體實施例，該修飾包含胺基酸以精胺酸殘基取代。
於一具體實施例，工程化的梭菌毒素為BoNT/B。一參考BoNT/B序列具有UniProtKB登錄號P10844。
本發明者們已鑑定出某些胺基酸，其代表於BoNT/B梭菌毒素HN域中胺基酸修飾的較佳的標的。
於一具體實施例，其中工程化的梭菌毒素為BoNT/B，該工程化的BoNT/B包含至少一個(例如，至少1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、或所有40個)胺基酸之修飾，該胺基酸選自：V443、G444、D453、S468、D533、E534、N535、T545、L548、D549、I550、D552、S557、L564、S566、N582、V584、N609、L619、
N632、E633、G637、A646、I655、E657、V662、E669、S670、I672、D673、N739、I740、N748、N750、I818、G819、T834、I842、N845、及S858；且該胺基酸修飾增加工程化的BoNT/B之等電點(pI)至高於缺乏該胺基酸修飾之其他方面相同BoNT/B至少0.2個(例如，至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個)pI單位的值。於一具體實施例，該修飾包含胺基酸以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代。於一具體實施例，該修飾包含胺基酸以離胺酸殘基取代。於一具體實施例，該修飾包含胺基酸以精胺酸殘基取代。
於一具體實施例，工程化的梭菌毒素為BoNT/C1。一參考序列BoNT/C1序列具有UniProtKB登錄號P18640。
本發明者們已鑑定出某些胺基酸，其代表於BoNT/C1梭菌毒素HN域中胺基酸修飾的較佳的標的。
於一具體實施例，其中工程化的梭菌毒素為BoNT/C1，該工程化的BoNT/C1包含至少一個(例如，至少1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45或所有50個)胺基酸之修飾，該胺基酸選自：L451、D452、C453、E455、V472、T474、D475、L478、N483、E484、E485、E487、I489、L555、S556、D557、N558、E560、D561、E569、N574、S575、T584、G592、Q594、G596、D617、N640、S641、V642、G645、N646、E661、E665、T667、A670、S678、V680、Q681、E682、S750、G751、S759、Q760、V826、G827、N842、T843、N847、
及N853；且該胺基酸修飾增加工程化的BoNT/C1之等電點(pI)至高於缺乏該胺基酸修飾之其他方面相同BoNT/C1至少0.2個(例如，至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個)pI單位的值。於一具體實施例，該修飾包含胺基酸以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代。於一具體實施例，該修飾包含胺基酸以離胺酸殘基取代。於一具體實施例，該修飾包含胺基酸以精胺酸殘基取代。
於一具體實施例，工程化的梭菌毒素為BoNT/D。一參考BoNT/D序列具有UniProtKB登錄號P19321。
本發明者們已鑑定出某些胺基酸，其代表於BoNT/D梭菌毒素HN域中胺基酸修飾的較佳的標的。
於一具體實施例，其中工程化的梭菌毒素為BoNT/D，該工程化的BoNT/D包含至少一個(例如，至少1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、或所有62個)胺基酸之修飾，該胺基酸選自：Q469、E470、E473、N474、D479、E480、N482、V483、Q484、N485、S487、D488、S552、N553、N554、V555、E556、N557、I558、L560、T562、S563、V564、G569、S571、N572、G588、Q590、T614、D616、S619、S622、N636、S637、L639、G641、N642、E657、E661、T663、A666、V669、S674、I676、Q677、E678、S746、G747、D749、E751、N752、I753、Q756、N818、V822、G823、E837、N838、T839、N843、N849、及N850；且該胺基酸修飾增加工程化的BoNT/D之等電點(pI)至高於缺乏
該胺基酸修飾之其他方面相同BoNT/B至少0.2個(例如，至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個)pI單位的值。於一具體實施例，該修飾包含胺基酸以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代。於一具體實施例，該修飾包含胺基酸以離胺酸殘基取代。於一具體實施例，該修飾包含胺基酸以精胺酸殘基取代。
於一具體實施例，工程化的梭菌毒素為BoNT/E。一參考BoNT/E序列具有UniProtKB登錄號Q00496。於一具體實施例，其中工程化的梭菌毒素為BoNT/E，工程化的梭菌毒素為BoNT/E3。
本發明者們已鑑定出某些胺基酸，其代表於BoNT/E梭菌毒素HN域中胺基酸修飾的較佳的標的。
於一具體實施例，其中工程化的梭菌毒素為BoNT/E，該工程化的BoNT/E包含至少一個(例如，至少1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、或所有52個)胺基酸之修飾，該胺基酸選自：D474、N476、E479、E480、D484、N486、I487、E488、A489、A490、E491、E492、L496、D497、Q500、Q501、L504、N507、D509、N510、N514、S516、E518、Q527、L530、N533、I534、E535、N539、Y548、I566、L568、D589、A597、E599、A601、L604、Y612、E620、N645、L647、Y648、D651、E737、E741、Y803、Y824、D825、G828、I831、G832、及D835；且該胺基酸修飾增加工程化的BoNT/E之等電點(pI)至高於缺乏該胺基酸修飾之其他方面相同BoNT/E至少0.2個(例如，至少0.2、0.3、0.4、
0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個)pI單位的值。於一具體實施例，該修飾包含胺基酸以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代。於一具體實施例，該修飾包含胺基酸以離胺酸殘基取代。於一具體實施例，該修飾包含胺基酸以精胺酸殘基取代。
於一具體實施例，工程化的梭菌毒素為BoNT/F。一參考BoNT/F序列具有UniProtKB登錄號YP_001390123。
本發明者們已鑑定出某些胺基酸，其代表於BoNT/F梭菌毒素HN域中胺基酸修飾的較佳的標的。
於一具體實施例，其中工程化的梭菌毒素為BoNT/F，該工程化的BoNT/F包含至少一個(例如，至少1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、或所有86個)胺基酸之修飾，該胺基酸選自：N463、E464、N468、T469、D474、D475、T476、T477、N478、N482、N485、N495、I499、Q501、I502、Q505、T506、N508、T509、V511、D513、D521、S522、S526、E527、I528、E529、V534、D535、L536、E549、G550、T552、N553、S558、E566、E567、S568、V586、H587、Q608、D613、A616、D617、S619、N630、N633、N639、E654、V656、E658、L660、T663、L665、V666、S671、I673、G674、S675、S676、E677、N678、T746、N751、L753、E754、E756、N758、I759、N760、N761、S799、S821、I822、N840、S841、E845、L846、S847、S848、T850、N851、D852、I854、L855、
及I856；且該胺基酸修飾增加工程化的BoNT/F之等電點(pI)至高於缺乏該胺基酸修飾之其他方面相同BoNT/F至少0.2個(例如，至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個)pI單位的值。於一具體實施例，該修飾包含胺基酸以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代。於一具體實施例，該修飾包含胺基酸以離胺酸殘基取代。於一具體實施例，該修飾包含胺基酸以精胺酸殘基取代。
於一具體實施例，工程化的梭菌毒素為BoNT/G。一參考BoNT/G序列具有UniProtKB登錄號Q60393。
本發明者們已鑑定出某些胺基酸，其代表於BoNT/G梭菌毒素HN域中胺基酸修飾的較佳的標的。
於一具體實施例，其中工程化的梭菌毒素為BoNT/G，該工程化的BoNT/G包含至少一個(例如，至少1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、或所有36個)胺基酸之修飾，該胺基酸選自：N480、Q482、N483、N484、T485、E487、D540、N562、N570、N571、N572、T588、V589、T615、D621、N637、E638、E642、N643、I660、E662、I667、E674、S675、V677、G678、N679、S747、N755、D757、L823、D839、I841、D844、S846、及L847；且該胺基酸修飾增加工程化的BoNT/G之等電點(pI)至高於缺乏該胺基酸修飾之其他方面相同BoNT/G至少0.2個(例如，至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個)pI單位的值。於一具體實施例，該修飾包含胺基酸以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代。於一具體
實施例，該修飾包含胺基酸以離胺酸殘基取代。於一具體實施例，該修飾包含胺基酸以精胺酸殘基取代。
於一具體實施例，工程化的梭菌毒素為TeNT。一參考TeNT序列具有UniProtKB登錄號P04958。
本發明者們已鑑定出某些胺基酸，其代表於TeNT梭菌毒素HN域中胺基酸修飾的較佳的標的。
於一具體實施例，其中工程化的梭菌毒素為TeNT，該工程化的TeNT包含至少一個(例如，至少1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、或所有49個)胺基酸之修飾，該胺基酸選自：A457、S458、L459、D461、L462、E486、E487、Q490、D491、N497、N504、D557、T571、T572、L573、Q574、N580、S581、N588、S589、T590、S598、Q605、G606、Q608、T631、I633、S640、Q655、E658、G659、N660、E675、I677、E679、T681、V684、A691、E692、S694、T695、Q696、A772、D773、E774、S862、N866、L867及D868；且該胺基酸修飾增加工程化的TeNT之等電點(pI)至高於缺乏該胺基酸修飾之其他方面相同TeNT至少0.2個(例如，至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個)pI單位的值。於一具體實施例，該修飾包含胺基酸以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代。於一具體實施例，該修飾包含胺基酸以離胺酸殘基取代。於一具體實施例，該修飾包含胺基酸以精胺酸殘基取代。
本發明者們已鑑定出某些胺基酸，其代表於BoNT/A梭菌毒素輕鏈中胺基酸修飾的較佳的標的。
於一具體實施例，其中工程化的梭菌毒素為BoNT/A，該工程化的BoNT/A包含至少一個(例如，至少1、2、3、4、5、10、15、20、25或所有28個)胺基酸之修飾，該胺基酸選自：N5、Q7、N9、D12、N15、Q31、D58、N60、D74、N82、T122、D124、E126、Q139、D141、E281、L284、S295、Q311、D326、D334、N377、TYR387、N394、N396、N410、M411、及N418；且該胺基酸修飾增加工程化的BoNT/A之等電點(pI)至高於缺乏該胺基酸修飾之其他方面相同BoNT/A至少0.2個(例如，至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個)pI單位的值。於一具體實施例，該修飾包含胺基酸以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代。於一具體實施例，該修飾包含胺基酸以離胺酸殘基取代。於一具體實施例，該修飾包含胺基酸以精胺酸殘基取代。
本發明者們已鑑定出某些胺基酸，其代表於BoNT/B梭菌毒素輕鏈中胺基酸修飾的較佳的標的。
於一具體實施例，其中工程化的梭菌毒素為BoNT/B、該工程化的BoNT/B包含至少一個(例如，至少1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40或所有41個)胺基酸之修飾，該胺基酸選自：N6、N7、N9、N11、D12、N16、N17、N18、D41、E48、E57、N60、D75、D77、N80、E127、N130、N144、E147、E149、E185、N216、D245、E253、N316、D333、E335、D341、N385、D388、N389、E390、E395、E396、D402、D404、E406、E408、Q419、E423、及E427；且該胺基酸修飾增加工程
化的BoNT/B之等電點(pI)至高於缺乏該胺基酸修飾之其他方面相同BoNT/B至少0.2個(例如，至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個)pI單位的值。於一具體實施例，該修飾包含胺基酸以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代。於一具體實施例，該修飾包含胺基酸以離胺酸殘基取代。於一具體實施例，該修飾包含胺基酸以精胺酸殘基取代。
本發明者們已鑑定出某些胺基酸，其代表於BoNT/C1梭菌毒素輕鏈中胺基酸修飾的較佳的標的。
於一具體實施例，其中工程化的梭菌毒素為BoNT/C1，該工程化的BoNT/C1包含至少一個(例如，至少1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、或所有41個)胺基酸之修飾，該胺基酸選自：N6、N7、N9、D12、D15、N18、N31、E32、N55、N59、N75、N120、N121、N125、D128、Q142、N145、N177、N178、Q183、E184、D208、E211、Q247、N255、N311、E335、E339、N343、N368、N386、D389、D390、N391、Q396、N405、N407、N425、E427、D442、及N448；且該胺基酸修飾增加工程化的BoNT/C1之等電點(pI)至高於缺乏該胺基酸修飾之其他方面相同BoNT/C1至少0.2個(例如，至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個)pI單位的值。於一具體實施例，該修飾包含胺基酸以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代。於一具體實施例，該修飾包含胺基酸以離胺酸殘基取代。於一具體實施例，該修飾包含胺基酸以精胺酸殘基取代。
本發明者們已鑑定出某些胺基酸，其代表於BoNT/D梭菌毒素輕鏈中胺基酸修飾的較佳的標的。
於一具體實施例，其中工程化的梭菌毒素為BoNT/D，該工程化的BoNT/D包含至少一個(例如，至少1、2、3、4、5、10、15、20、30、或所有34個)胺基酸之修飾，該胺基酸選自：D7、N9、D12、N15、D16、N17、D53、D73、D119、E124、E139、E142、N143、Q177、Q178、N180、E184、E255、N308、D335、N336、N339、N343、N368、N386、D389、D390、N391、D397、N403、N407、E409、E416、及N443；且該胺基酸修飾增加工程化的BoNT/D之等電點(pI)至高於缺乏該胺基酸修飾之其他方面相同BoNT/D至少0.2個(例如，至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個)pI單位的值。於一具體實施例，該修飾包含胺基酸以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代。於一具體實施例，該修飾包含胺基酸以離胺酸殘基取代。於一具體實施例，該修飾包含胺基酸以精胺酸殘基取代。
本發明者們已鑑定出某些胺基酸，其代表於BoNT/E梭菌毒素輕鏈中胺基酸修飾的較佳的標的。
於一具體實施例，其中工程化的梭菌毒素為BoNT/E，該工程化的BoNT/E包含至少一個(例如，至少1、2、3、4、5、10、15、20、30、35、或所有37個)胺基酸之修飾，該胺基酸選自：N5、N8、N10、D11、N14、D15、Q27、E28、Q53、N72、Q75、D117、N118、D121、N122、Q123、N138、N169、N170、N195、Q237、
ILE244、Q290、N293、N297、D312、Q344、N362、N365、D366、N370、E373、N378、N379、N383、N390、及T397；且該胺基酸修飾增加工程化的BoNT/E之等電點(pI)至高於缺乏該胺基酸修飾之其他方面相同BoNT/E至少0.2個(例如，至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個)pI單位的值。於一具體實施例，該修飾包含胺基酸以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代。於一具體實施例，該修飾包含胺基酸以離胺酸殘基取代。於一具體實施例，該修飾包含胺基酸以精胺酸殘基取代。
於一具體實施例，其中工程化的梭菌毒素為BoNT/E，該工程化的BoNT/E包含至少一個(例如，至少1、2、3、4、5、10、15或20個)胺基酸之修飾，該胺基酸選自：N5、N8、N10、D11、N14、D15、Q27、E28、N72、Q75、N118、D121、N122、Q123、N138、Q237、Q290、N297、N362、N365、D366、N378、及N379；且該胺基酸修飾增加工程化的BoNT/E之等電點(pI)至高於缺乏該胺基酸修飾之其他方面相同BoNT/E至少0.2個(例如，至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個)pI單位的值。於一具體實施例，該修飾包含胺基酸以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代。於一具體實施例，該修飾包含胺基酸以離胺酸殘基取代。於一具體實施例，該修飾包含胺基酸以精胺酸殘基取代。
於一具體實施例，其中工程化的梭菌毒素為BoNT/E，該工程化的BoNT/E包含至少一個(例如，至少1、2、3、4、5、10、15或所有19個)胺基酸之修飾，該
胺基酸選自：N5、N8、N10、D11、N14、D15、N72、Q75、N118、N122、Q123、N138、Q237、Q290、Q297、N362、D366、N378、及N379；且該胺基酸修飾增加工程化的BoNT/E之等電點(pI)至高於缺乏該胺基酸修飾之其他方面相同BoNT/E至少0.2個(例如，至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個)pI單位的值。於一具體實施例，該修飾包含胺基酸以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代。於一具體實施例，該修飾包含胺基酸以離胺酸殘基取代。於一具體實施例，該修飾包含胺基酸以精胺酸殘基取代。
於一具體實施例，其中工程化的梭菌毒素為BoNT/E，該工程化的BoNT/E包含至少一個(例如，至少1、2、3、4、5、或所有6個)胺基酸之修飾，該胺基酸選自：N8、N10、Q75、Q123、N138、及Q237；且該胺基酸修飾增加工程化的BoNT/E之等電點(pI)至高於缺乏該胺基酸修飾之其他方面相同BoNT/E至少0.2個(例如，至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個)pI單位的值。於一具體實施例，該修飾包含胺基酸以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代。於一具體實施例，該修飾包含胺基酸以離胺酸殘基取代。於一具體實施例，該修飾包含胺基酸以精胺酸殘基取代。
於一具體實施例，其中工程化的梭菌毒素為BoNT/E，該工程化的BoNT/E包含至少一個(例如，至少1、2、或所有3個)胺基酸之修飾，該胺基酸選自Q123、N138、及Q237；且該胺基酸修飾增加工程化的BoNT/E
之等電點(pI)至高於缺乏該胺基酸修飾之其他方面相同BoNT/E至少0.2個(例如，至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個)pI單位的值。於一具體實施例，該修飾包含胺基酸以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代。於一具體實施例，該修飾包含胺基酸以離胺酸殘基取代。於一具體實施例，該修飾包含胺基酸以精胺酸殘基取代。
本發明者們已鑑定出某些胺基酸，其代表於BoNT/F梭菌毒素輕鏈中胺基酸修飾的較佳的標的。
於一具體實施例，其中工程化的梭菌毒素為BoNT/F，該工程化的BoNT/F包含至少一個(例如，至少1、2、3、4、5、10、15、20、30、或所有35個)胺基酸之修飾，該胺基酸選自：N6、N9、N11、D12、N15、D16、D17、E28、D55、D60、D74、N76、E105、E121、N126、E127、N144、D185、N211、Q252、N305、E310、D312、N314、N329、D331、N379、D382、D383、D384、E390、N396、N400、D414、及D418；且該胺基酸修飾增加工程化的BoNT/F之等電點(pI)值至高於缺乏該胺基酸修飾之其他方面相同BoNT/F至少0.2個(例如，至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個)pI單位的值。於一具體實施例，該修飾包含胺基酸以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代。於一具體實施例，該修飾包含胺基酸以離胺酸殘基取代。於一具體實施例，該修飾包含胺基酸以精胺酸殘基取代。
本發明者們已鑑定出某些胺基酸，其代表於BoNT/G梭菌毒素輕鏈中胺基酸修飾的較佳的標的。
於一具體實施例，其中工程化的梭菌毒素為BoNT/G，該工程化的BoNT/G包含至少一個(例如，至少1、2、3、4、5、10、15、20、30、35、或所有38個)胺基酸之修飾，該胺基酸選自：N4、N7、N9、N11、D12、N15、D17、E48、Q55、D57、N60、D75、D127、Q144、E148、D149、Q150、N178、E185、E208、D211、E255、D315、D332、N334、D340、E383、D387、N388、Q393、N394、E395、N403、E407、E418、E422、E426、及N443；且該胺基酸修飾增加工程化的BoNT/G之等電點(pI)至高於缺乏該胺基酸修飾之其他方面相同BoNT/G至少0.2個(例如，至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個)pI單位的值。於一具體實施例，該修飾包含胺基酸以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代。於一具體實施例，該修飾包含胺基酸以離胺酸殘基取代。於一具體實施例，該修飾包含胺基酸以精胺酸殘基取代。
本發明者們已鑑定出某些胺基酸，其代表於TeNT輕鏈中胺基酸修飾的較佳的標的。
於一具體實施例，其中工程化的梭菌毒素為TeNT，該工程化的TeNT包含至少一個(例如，至少1、2、3、4、5、10、15、20、30、35、或所有36個)胺基酸之修飾，該胺基酸選自：N6、N7、N15、N16、D17、D31、E51、E57、N60、N76、N101、D126、D143、N167、D179、N180、E251、Q257、N313、N316、D318、D335、N337、Q339、N368、N387、D390、D391、N395、D396、E403、D406、E410、N421、D427、及E450；且該胺基
酸修飾增加工程化的TeNT之等電點(pI)至高於缺乏該胺基酸修飾之其他方面相同TeNT至少0.2個(例如，至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個)pI單位的值。於一具體實施例，該修飾包含胺基酸以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代。於一具體實施例，該修飾包含胺基酸以離胺酸殘基取代。於一具體實施例，該修飾包含胺基酸以精胺酸殘基取代。
本發明係適合應用於梭菌毒素之許多不同變體。如此，於本發明之內文，「梭菌毒素」一詞涵括由肉毒桿菌(肉毒桿菌神經毒素血清型A、B、C1、D、E、F及G)、破傷風桿菌(破傷風神經毒素)、酪酸梭菌(肉毒桿菌神經毒素血清型E型)、巴氏梭菌(肉毒桿菌神經毒素血清型F型)所產生的毒素，以及衍生自前述任一者之經修飾的梭菌毒素或衍生物。「梭菌毒素」一詞亦涵括肉毒桿菌神經毒素血清型H。
肉毒桿菌神經毒素(BoNT)係由肉毒桿菌以大的蛋白質複合體形式生產，該複合體由與許多輔助的蛋白質複合的BoNT本身所構成。目前有8種不同類別之肉毒桿菌神經毒素，即：肉毒桿菌神經毒素血清型A、B、C1、D、E、F、G、及H，其所有共享相似的結構及作用模式。不同的BoNT血清型可基於藉由特異性中和抗血清的去活化來區別，以於胺基酸程級具血清型關聯百分比序列同一性之此種分類。基於胺基酸序列同一性百分比，指定的血清型之BoNT蛋白質被進一步分成不同血清型。
BoNTs於胃腸道被吸收，且進入全身循環後，結合至膽鹼能神經末梢的前突觸膜並防止其神經傳導物乙醯膽鹼之釋放。BoNT/B、BoNT/D、BoNT/F及BoNT/G切割小突觸泡蛋白(synaptobrevin)/與囊泡有關的膜蛋白質(VAMP)；BoNT/C1、BoNT/A及BoNT/E切割25kDa(SNAP-25)之與突觸小體有關的蛋白質；及BoNT/C1切割突觸融合蛋白。
破傷風毒素係由破傷風桿菌以單一血清型生產。酪酸梭菌生產BoNT/E，而巴氏梭菌生產BoNT/F。
「梭菌毒素」一詞亦意圖涵括經修飾的梭菌毒素及其衍生物，包括但未限於彼等下述者。經修飾的梭菌毒素或衍生物可含有相較於天然(未經修飾)型之梭菌毒素而言已被修飾的一或多個胺基酸，或可含有不存在於天然(未經修飾)型之梭菌毒素之一或多個經插入的胺基酸。例如，相對於天然(未經修飾)梭菌毒素序列，一經修飾的梭菌毒素於一或多個域可具有經修飾的胺基酸序列。此種修飾可修飾毒素之功能方面，例如生物活性或持續性。如此，於一具體實施例，本發明之工程化的梭菌毒素為經工程化之經修飾的梭菌毒素，或工程化之經修飾的梭菌毒素衍生物、或工程化的梭菌毒素衍生物。
經修飾的梭菌毒素可於重鏈之胺基酸序列(例如經修飾的HC域)具有一或多個修飾，其中該經修飾的重鏈以相較於天然(未經修飾)梭菌毒素為高或低的親和力結合至目標神經細胞。此種於HC域的修飾可包括修
飾於HC域之神經節苷脂結合位點中或修飾於蛋白質(SV2或突觸結合蛋白(synaptotagmin))結合位點中的殘基，其改變與目標神經細胞之神經節苷脂受體及/或蛋白質受體的結合。此種經修飾的梭菌毒素之例述於WO 2006/027207及WO 2006/114308，其兩者於本文完整以參考文獻被併入。
經修飾的梭菌毒素於輕鏈之胺基酸序列可具有一或多個修飾，例如於受質結合或催化域的修飾，其可改變或修飾經修飾LC之SNARE蛋白質特異性。此種經修飾梭菌毒素之例被述於WO 2010/120766及US 2011/0318385，其兩者完整以參考文獻併入本文。
經修飾的梭菌毒素可包含增加或減少經修飾梭菌毒素之生物活性及/或生物持續性之一或多個修飾。例如，經修飾梭菌毒素可包含白胺酸-或酪胺酸系基序，其中該基序增加或減少經修飾梭菌毒素之生物活性及/或生物持續性。適合的白胺酸系基序包括xDxxxLL、xExxxLL、xExxxIL、及xExxxLM(其中x為任一胺基酸)。適合的酪胺酸系基序包括Y-x-x-Hy(其中Hy為疏水性胺基酸)。包含白胺酸及酪胺酸系基序之經修飾的梭菌毒素之例述於WO 2002/08268，其完整以參考文獻併入本文。
「梭菌毒素」一詞被意圖涵括混合體及嵌合梭菌毒素。混合體梭菌毒素包含來自一梭菌毒素或其亞型之至少一部份之輕鏈及來自另一梭菌毒素或梭菌毒素亞型之至少一部份之重鏈。於一具體實施例，此混合體梭菌毒素可含有來自一梭菌毒素血清型之完整輕鏈及來
自另一梭菌毒素亞型之重鏈。於另一具體實施例中，嵌合梭菌毒素可含有一梭菌毒素亞型之重鏈之一部分(例如，結合域)，重鏈的另一部分來自另一梭菌毒素亞型。相似地或可替換地，治療成分可包含來自不同梭菌毒素之輕鏈部分。此種混合體或嵌合梭菌毒素為有用的，例如，作為遞送此種梭菌毒素之治療益處至病患的工具，此病患為對指定梭菌毒素亞型為免疫學上有抗性的、或此病患可能具有低於平均的對指定梭菌毒素重鏈結合域之受體濃度、或此病患可能具有膜或囊泡毒素受質(例如，SNAP-25、VAMP及突觸融合蛋白)之蛋白酶-抗性的變異體。混合體及嵌合梭菌毒素述於US 8,071,110，其刊物完整以參考文獻併入本文。如此，於一具體實施例，本發明之工程化的梭菌毒素為工程化的混合體梭菌毒素、或工程化的嵌合梭菌毒素。
「梭菌毒素」一詞意圖涵括再次標靶的梭菌毒素。於一再次標靶的梭菌毒素，梭菌毒素為經修飾以包括已知為靶向部分(Targeting Moiety(TM))之外源性配位體。此TM被選擇以提供對所欲目標細胞的結合特異性，及作為再次標靶過程的一部分，梭菌毒素之天然結合部分(例如，HC域、或HCC域)可被移除。再次標靶技術被述於例如：EP-B-0689459；WO 1994/021300；EP-B-0939818；US 6,461,617；US 7,192,596；WO 1998/007864；EP-B-0826051；US 5,989,545；US 6,395,513；US 6,962,703；WO 1996/033273；EP-B-0996468；US 7,052,702；WO 1999/017806；
EP-B-1107794；US 6,632,440；WO 2000/010598；WO 2001/21213；WO 2006/059093；WO 2000/62814；WO 2000/04926；WO 1993/15766；WO 2000/61192；及WO 1999/58571；其所有完整以參考文獻併入本文。如此，於一具體實施例，本發明之工程化的梭菌毒素為工程化的再次標靶的梭菌毒素。
本發明亦涵括具有非天然蛋白酶切割位點之梭菌毒素。於此種梭菌毒素，天然蛋白酶切割位點(亦已知為活性位點，如上述)被修飾或以對梭菌毒素為非天然的蛋白酶切割位點(即，外源性切割位點)替換。此種位置將需要外源性蛋白酶來切割，其能夠改善於切割事件之時程及位置的控制。可運用於梭菌毒素之非天然蛋白酶切割位點包括：腸激酶 (DDDDK↓)
Xa因子 (IEGR↓/IDGR↓)
TEV(煙草蝕紋病毒(Tobacco Etch virus))(ENLYFQ↓G)
凝血酶 (LVPR↓GS)
PreScission (LEVLFQ↓GP)
另外的蛋白酶切割位點包括經無細胞毒性蛋白酶(例如藉由梭菌神經毒素之輕鏈)切割的辨識序列。此等包括經無細胞毒性蛋白酶(如梭菌神經毒素之輕鏈)切割的SNARE(例如，SNAP-25、突觸融合蛋白、VAMP)蛋白質辨識序列。包含非天然蛋白酶切割位點之梭菌毒素被述於US 7,132,259、EP 1206554-B2及US 2007/0166332，其所有完整以參考文獻併入本文。亦被
蛋白酶切割位點一詞涵括者為內蛋白(intein)，其為一種自我切割序列。自剪接(self-splicing)反應為可控制的，例如藉由變化還原劑存在的濃度。
本發明亦涵括包含「破壞性切割位點」之梭菌毒素。於該梭菌毒素，非天然的蛋白酶切割位點被併入梭菌毒素，於所選擇的位置上，於該位切割將會降低梭菌毒素之活性、或不活化。於投予後梭菌毒素移行至非目標位置時之活動中，此破壞性蛋白酶切割位點可為對局部蛋白酶的切割為敏感的。適合的非天然蛋白酶切割位點包括彼等上述者。包含破壞性切割位點之梭菌毒素被述於WO 2010/094905及WO 2002/044199，其兩者完整以參考文獻併入本文。
本發明之工程化的梭菌毒素，尤其是其輕鏈組份，可為經聚乙二醇化(PEGylated)，此可有助於增加安定性，例如輕鏈組份之作用期間。當輕鏈包含BoNT/A、B或C1蛋白酶時，聚乙二醇化為特佳。聚乙二醇化較佳包括PEG加成至輕鏈組份之N-端。例如，輕鏈之N-端可以被一或多個胺基酸(例如，半胱胺酸)殘基延伸，其可為相同或不同。一或多個該胺基酸殘基可具有其自己的與其連接的(例如，共價連接)PEG分子。此技術之例被述於WO2007/104567，其完整以參考文獻併入本文。
本發明之工程化的梭菌毒素可沒有存在於自然界發生的梭菌毒素複合物之複合蛋白質。
本發明之工程化的梭菌毒素亦可包含有限數目之非標準胺基酸。因此，除了20種標準胺基酸之外，非標準胺基酸(諸如4-羥基脯胺酸、6-N-甲基離胺酸、2-胺基異丁酸、異纈胺酸及α-甲基絲胺酸)可被用來取代本發明之工程化的梭菌毒素之胺基酸殘基。有限數目之非保守性胺基酸、沒有經遺傳密碼編碼的胺基酸及非天然的胺基酸可被用來取代梭菌多肽胺基酸殘基。本發明之工程化的梭菌毒素亦可包含非天然發生的胺基酸殘基。
非天然發生的胺基酸包括但未限於反式-3-甲基脯胺酸、2,4-亞甲基-脯胺酸、順式-4-羥基脯胺酸、反式-4-羥基-脯胺酸、N-甲基甘胺酸、別式-蘇胺酸、甲基-蘇胺酸、羥基-乙基半胱胺酸、羥基乙基高半胱胺酸、硝基-麩醯胺酸、高麩醯胺酸、2-哌啶甲酸(pipecolic acid)、三級白胺酸、正纈胺酸、2-氮雜苯丙胺酸、3-氮雜苯基-丙胺酸、4-氮雜苯基-丙胺酸、及4-氟苯丙胺酸。本項技術領域中已知併入非天然發生的胺基酸殘基至蛋白質中的數個方法。例如，可運用活體外系統，其中使用化學性胺基醯基化的抑制因子tRNAs來抑制無意義突變。用以合成胺基酸及胺基醯基化tRNA之方法為本項技術領域已知。含無意義突變的質體之轉錄及轉譯係於無細胞系統(包含大腸桿菌S30萃取物及市售酵素及其他試劑)中進行。蛋白質係藉由層析純化。參見例如，Robertson等人，J.Am.Chem.Soc.113：2722,1991；Ellman等人，Methods Enzymol.202：301,1991；Chung等人，Science 259：806-9,1993；及Chung等人，Proc.
Natl.Acad.Sci.USA 90：10145-9,1993)。於第二方法中，轉譯係於非洲爪蟾(Xenopus)卵母細胞中藉由微注射經突變的mRNA及化學上胺基醯基化的抑制基因tRNAs來進行(Turcatti等人，J.Biol.Chem.271：19991-8,1996)。於第三方法，於無天然胺基酸(欲被替換之胺基酸(例如，苯丙胺酸))下且於所欲非天然發生的胺基酸存在下(例如，2-氮雜苯丙胺酸、3-氮雜苯丙胺酸、4-氮雜苯丙胺酸、或4-氟苯丙胺酸)培養大腸桿菌細胞。非天然發生的胺基酸被併入多肽中替換其天然發生的相對物。參見，Koide等人，Biochem.33：7470-6,1994。
本發明之工程化的梭菌毒素可使用重組核酸技術生產。如此，於一具體實施例，工程化的梭菌毒素(如上述)為重組的工程化的梭菌毒素。
於另一態樣，本發明提供包含編碼如上述工程化的梭菌毒素之核酸序列的核酸(例如，DNA)。於一具體實施例，此核酸序列被製備為DNA載體之一部分，該載體包含啟動子及終止子。
於一較佳具體實施例，載體具有選自下列之啟動子：
於另一較佳具體實施例，載體具有選自下列之啟動子：
使用本項技術領域已知的任何適合的方法可製作本發明之核酸分子。如此，核酸分子可使用化學合成技術製作。或者，本發明之核酸分子可使用分子生物學技術製作。
本發明之DNA構築物為較佳利用電腦設計，然後藉由習用DNA合成技術來合成。
依據欲被採用的最終宿主細胞(例如，大腸桿菌)表現系統，可選擇性地對於密碼子偏移(codon-biasing)修飾上述核酸序列資訊。
於一具體實施例，此編碼如上述工程化的梭菌毒素之核酸序列為與選自SEQ ID NOs：2、4及6之核酸序列具有至少70%(例如，至少75、80、85、90、95、97、98或99%)序列同一性之核酸序列。於一具體實施例，此核酸序列與選自SEQ ID NOs：2、4及6之核酸序列具有至少90%序列同一性。
本發明亦提供經如上所述之核酸序列編碼的多肽。如此，於一態樣，本發明提供包含與選自SEQ ID NOs：1、3及5之胺基酸序列具有至少70%(例如，至少75、80、85、90、95、97、98或99%)序列同一性之胺基酸序列的多肽。
於一具體實施例，本發明之工程化的梭菌毒素如上文所述之工程化的BoNT/A，該工程化的BoNT/A包含與選自SEQ ID NOs：1、3及5之胺基酸序列具有至少70%(例如，至少75、80、85、90、95、97、98、99、99.5或99.9%)序列同一性之胺基酸序列(或由其組成)。
於一具體實施例，本發明之工程化的梭菌毒素為如上文所述之工程化的BoNT/A，該工程化的BoNT/A包含SEQ ID NO：1、3或5之胺基酸序列(或由其組成)。
於一態樣，本發明提供一種包含SEQ ID NO：1、3或5之胺基酸序列之多肽(或由其組成)。
於一態樣，本發明提供一種編碼如上述工程化的梭菌毒素之核酸，其中該核酸包含與選自SEQ ID NOs：2、4及6之核酸序列具有至少70%(例如，至少75、80、85、90、95、97、98、99、99.5或99.9%)序列同一性之核酸序列。於一具體實施例，此核酸包含SEQ ID NO：2、4或6之核酸(或由其組成)。
於一態樣，本發明提供一種包含SEQ ID NO：2、4或6之核酸序列之核酸(或由其組成)。
於一具體實施例，本發明之工程化的梭菌毒素為如上文所述之工程化的BoNT/E，該工程化的BoNT/E包含與SEQ ID NO：7具有至少70%(例如，至少75、80、85、90、95、97、98、99、99.5或99.9%)序列同一性之胺基酸序列。
於一態樣，本發明提供一種編碼如上述工程化的梭菌毒素之核酸，其中該核酸包含與SEQ ID NO：8具有至少70%(例如，至少75、80、85、90、95、97、98、99、99.5或99.9%)序列同一性之核酸序列。
於二或多個核酸或胺基酸序列間之「序列同一性百分比」係此序列共有的同一位置之數目的函數。因此，同一性%可被計算為同一核苷酸/胺基酸之數目除以核苷酸/胺基酸之總數，並乘以100。序列同一性%之計算亦可考量間隙的數目、及需要被導入以理想化二或多的序列之序列對比之各間隙的長度。二或多個序列間之序列比對及同一性百分比的決定可使用特定的數學演算法(諸如BLAST)進行，其為本項技術領域中具有通常知識者所熟悉。
於一態樣，本發明提供一種生產具有輕鏈及重鏈之單鏈工程化的梭菌毒素蛋白質之方法，此方法包含於適當宿主細胞中表現核酸(該核酸為如上述)、溶解此宿主細胞以提供含單鏈工程化的梭菌毒素蛋白質之宿主細胞均質物，及單離此單鏈工程化的梭菌毒素蛋白質。
於另一態樣，本發明提供一種活化工程化的梭菌毒素之方法，此方法包含提供藉由如上文所述之生產單鏈工程化的梭菌毒素蛋白質之方法可獲得之單鏈工程化的梭菌毒素蛋白質，使此多肽與在位於輕鏈及重鏈之間的辨識位點(切割位點)切割此多肽之蛋白酶接觸，因而轉化此多肽成二鏈多肽，其中輕鏈及重鏈藉由雙硫鍵連接在一起。
本發明之工程化的梭菌毒素可被用於預防或治療某些醫學或美容疾病及症狀。因此，於另一態樣，本發明提供如上文所述之工程化的梭菌毒素於醫學之使用。
於相關態樣，本發明提供一種如上文所述之工程化的梭菌毒素，其用於預防或治療選自下列之疾病或症狀：斜視(strabismus)、瞼痙攣、斜視(squint)、肌張力不全(例如，痙攣性肌張力不全、口下頷肌張力不全、局部肌張力不全、遲發性肌張力不全、喉肌張力不全、四肢肌張力不全、頸肌張力不全)、斜頸(例如，痙攣性斜頸)、美容治療(整容)應用(經由SNARE調降或去活化)、眼能動力之神經肌肉失調或症狀(例如，共同性斜視(concomitant strabismus)、垂直斜視、外直肌麻痺(lateral rectus palsy)、眼球震顫(nystagmus)、甲狀腺眼外肌病變(dysthyroid myopathy))、書寫痙攣(writer's cramp)、瞼痙攣、磨牙(bruxism)、威爾森氏症(Wilson's disease)、顫抖、抽描(tics)、節段性肌陣攣(segmental myoclonus)、痙攣、由於慢性多發性硬化症導致的痙攣、造成異常膀胱控制之痙攣狀態、敵意(animus)、背痙攣、四頭肌僵痛(charley horse)、緊張性頭痛、提肌骨盆症候群(levator pelvic syndrome)、脊柱裂(spina bifida)、遲發性運動不能(tardive dyskinesia)、帕金森氏病、口吃、半邊顏面痙攣、眼瞼失調、腦性麻痺、局部痙攣狀態、痙攣性結腸炎(spasmodic colitis)、神經性膀胱障礙(neurogenic bladder)、肛門痙攣(anismus)、四肢痙攣狀
態、抽播、震顫、磨牙、肛裂(anal fissure)、弛緩不能、吞咽困難、流淚、多汗症(hyperhydrosis)、過度流涎、過度胃腸分泌、肌肉疼痛(例如，來自肌肉痙攣的疼痛)、頭痛性疼痛(例如，緊張性頭痛)、蹙眉(brow furrows)、皮膚皺紋、癌症、子宮疾病、泌尿生殖器疾病、泌尿生殖器神經性失調、慢性神經性發炎、及平滑肌失調。
於使用時，本發明使用一種醫藥組成物，其包含工程化的梭菌毒素，同時包含至少一種組份，該組份選自醫藥上可容許的載劑、賦形劑、佐劑、推進劑及/或鹽。
本發明之工程化的梭菌毒素可被調製用於口服、腸胃外、連續輸注、吸入或局部塗敷。適合注射用之組成物可為溶液、懸浮液或乳液之型式，或為乾粉末，該乾粉末於使用前被溶解或懸浮於適當媒液。
於工程化的梭菌毒素欲被局部遞送的情形，工程化的梭菌毒素可被調製成霜劑(例如，用於局部塗敷)、或皮下注射。
局部遞送方式可包括氣溶膠、或其他噴霧(例如，噴霧器)。關於此點，工程化的梭菌毒素之氣溶膠調配物能夠遞送至肺臟及/或其他鼻道及/或支氣管或氣道的通道。
本發明之工程化的梭菌毒素於涉及受影響器官的神經分佈的脊椎骨節範圍內，藉由於脊柱中之脊髓內或硬膜外注射，可被投予病患。
投予之較佳路徑為經由腹腔鏡及/或局部，尤其是肌肉內注射。
投予本發明之工程化的梭菌毒素之劑量範圍為彼等產生所欲治療效果者。應明瞭所需劑量範圍取決於工程化的梭菌毒素或組成物的明確性質、投予路徑、調配物的本質、病患年齡、病患的症狀的性質、程度或嚴重性、若有其他投藥時之投藥禁忌、及主治醫師的判斷。能使用用於最佳化之標準經驗慣例來調整於此等劑量程度的變動。
適當的每日劑量(病患之每公斤體重)為0.0001-1ng/kg之範圍，較佳為0.0001-0.5ng/kg，更佳為0.002-0.5ng/kg，且特佳為0.004-0.5ng/kg。單位劑量可由少於1微微克(picogram)變化至30ng，但典型地將會在每劑0.01至1ng之範圍，其可每日投予或較佳地以更少的頻率投予，諸如每周或六個月。
特佳投劑規則(dosing regimen)係基於0.05ng之工程化的梭菌毒素作為1X劑。關於此點，較佳劑量為1X-100X之範圍(即，0.05-5ng)。
流體劑型典型是利用工程化的梭菌毒素及無熱原的無菌媒液製備。端視使用的媒液及濃度，工程化的梭菌毒素可被溶解或懸浮於媒液。於製備溶液中，工程化的梭菌毒素可被溶解於媒液，若需要，藉由添加氯化鈉將此溶液作成等張，並使用無菌技術於過濾至適當無菌小瓶或安瓶及密封前藉由通過無菌濾膜滅菌。或者，若溶液安定性為足夠的，溶液於密封的容器中可藉
由高壓釜滅菌。有利地，於媒液中可溶解添加劑諸如緩衝劑、助溶劑、安定劑、防腐劑或殺菌劑、懸浮劑或乳化劑、及/或局部麻醉劑。
使用前可被溶解或懸浮於適當媒液之乾粉末可藉由使用無菌技術於無菌區中填充預滅菌成分至無菌容器。或者，使用無菌技術於無菌區中可將成分溶解於適當容器。然後將產品冷凍乾燥並將容器無菌密封。
適合肌肉內、皮下或皮內注射用之腸胃外懸浮液以實質上相同方式被製備，除了無菌組份被懸浮於無菌媒液，而非被溶解，且滅菌無法藉由過濾而完成。組份可以無菌狀態被單離，或者其可單離後被滅菌，例如，藉由γ射線照射。
有利地，於此組成物中包括懸浮劑例如聚乙烯吡咯啶酮，以促進組份之均一分布。
依據本發明之投予可利用多種遞送技術，包括微粒子包膠(microparticle encapsulation)、病毒遞送系統或高壓氣溶膠衝擊。
第1圖CatHN_v1(第1A圖)、CatHN_v2(第1B圖)、及CatHN_v3(第1C圖)純化之SDS-PAGE純化。
第2圖於大鼠胚胎脊索神經元(eSCN)中CatHN_v1之SNAP-25切割百分比。於以SNAP-25特異性抗體作西方氏轉漬法之前，培養大鼠胚胎脊索神經元三星期並以CatHN_v1處理24h。資料為來自3個獨立實驗作3組之平均值±SEM。
第3圖於小鼠膈神經半橫膈膜試驗(mPNHD)中BoNT/A及CatHN_v1之效力(t50)。資料點為個別半橫膈膜製備物且為平均值±SEM。CatHN_v1為統計學上顯著慢於參考蛋白質BoNT/A(List Biological Laboratories)。1-way ANOVA及Dunnett's多重比較檢定。** p<0.01，*** p<0.001，****p<0.0001(1-way ANOVA及Dunnett's多重比較檢定)。
第4圖於大鼠胚胎脊索神經元(eSCN)中CatHN_v2之SNAP-25切割百分比。於以SNAP-25特異性抗體作西方氏轉漬法之前，培養大鼠胚胎脊索神經元三星期並以CatHN_v2處理24h。資料為來自3個獨立實驗作3組之平均值±SEM。
第5圖於小鼠膈神經半橫膈膜試驗(mPNHD)中BoNT/A及CatHN_v2之效力(t50)。資料點為個別半橫膈膜製備物且為平均值±SEM。CatHN_v2為統計學上相等於參考蛋白質BoNT/A(List Biological Laboratories).1-way ANOVA及Dunnett's多重比較檢定。** p<0.01，*** p<0.001，**** p<0.0001(1-way ANOVA及Dunnett's多重比較檢定)。
第6圖於大鼠胚胎脊索神經元(eSCN)中CatHN_v3之SNAP-25切割百分比。於以SNAP-25特異性抗體作西方氏轉漬法之前，培養大鼠胚胎脊索神經元三星期並以CatHN_v3處理24h。資料為來自3個獨立實驗作3組之平均值±SEM。
第7圖BoNT/A及CatHN_v3於小鼠膈神經半橫膈膜試驗(mPNHD)之效力(t50)。資料點為個別半橫膈膜製備物且為平均值±SEM。CatHN_v3為統計學上顯著慢於參考蛋白質BoNT/A(List Biological Laboratories)。1-way ANOVA及Dunnett's多重比較檢定，** p<0.01，*** p<0.001，**** p<0.0001(1-way ANOVA及Dunnett's多重比較檢定)。
第8圖等電集聚分析。與未經修飾的BoNT/A相比，所有3個CatHN構築物具有增加的觀察的pI。
第9圖CatLC構築物之SDS-PAGE純化。
第10圖CatLC與BoNT/E LC參考物相比之催化活性，以於BoTest A/E BoNT偵測套組(BioSentinal Cat#A1004)且依據製造商的說明獲得的pEC50值。資料顯示於一獨立實驗作3組之平均值±標準差。
SEQ ID NO：1.工程化的BoNT/A，「CatHN_v1」，胺基酸序列。
SEQ ID NO：2工程化的BoNT/A，「CatHN_v1」，核酸序列。
SEQ ID NO：3.工程化的BoNT/A，「CatHN_v2」，胺基酸序列。
SEQ ID NO：4.工程化的BoNT/A，「CatHN_v2」，核酸序列。
SEQ ID NO：5.工程化的BoNT/A，「CatHN_v3」，胺基酸序列。
SEQ ID NO：6.工程化的BoNT/A，「CatHN_v3」，核酸序列。
SEQ ID NO：7.工程化的BoNT/E輕鏈，「CatLC」，胺基酸序列。
SEQ ID NO：8.工程化的BoNT/E輕鏈，「CatLC」，核酸序列。
SEQ ID NO：1.工程化的BoNT/A，「CatHN_v1」，胺基酸序列。
SEQ ID NO：2.工程化的BoNT/A，「CatHN_v1」，核酸序列。
SEQ ID NO：3.工程化的BoNT/A，「CatHN_v2」，胺基酸序列。
SEQ ID NO：4.工程化的BoNT/A，「CatHN_v2」，核酸序列。
SEQ ID NO：5.工程化的BoNT/A，「CatHN_v3」，胺基酸序列。
SEQ ID NO：6.工程化的BoNT/A，「CatHN_v3」，核酸序列。
SEQ ID NO：7.工程化的BoNT/E輕鏈，「CatLC」，胺基酸序列。
SEQ ID NO：8.工程化的BoNT/E輕鏈，「CatLC」，胺基酸序列。
下列實施例用以說明本發明之特定具體實施例，不以任何方式限制請求項所界定之範疇。
修飾用較佳梭菌毒素胺基酸之鑑定。
使用許多不同準則選擇適合修飾(突變位點)的候選物之鑑定的胺基酸。
1. 於BoNT分子間的殘基(於HN間，排除帶區)的位置；2. 與二級/三級結構有關的位置；3. 殘基的型式；4. 表面暴露的程度。
選擇時考量酸性、中性、極性及疏水性殘基。
使用來自CCP4套組的AreaIMol來決定暴露的殘基。各結構藉由AreaIMol分析，且暴露的殘基被鑑識為具有大於55之總和值。
使用二級結構分配程式(Stride Web Interface)鑑識各亞型及TeNT之HN間的二級結構。由選擇排除指派作為形成α-螺旋、β-股或310-螺旋的區域。
使用的序列
登錄號：BoNT/A：P10845
BoNT/B：P10844
BoNT/C1：P18640
BoNT/D：P19321
BoNT/E：Q00496
BoNT/F：YP_001390123
BoNT/G：Q60393
BoNT/A(3BTA.pdb)、BoNT/B(1EPW)及BoNT/E(3FFZ.pdb)之結晶結構獲自RCSB。
使用LOOPP及下列序列進行BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/F及BoNT/G之同一性模擬，分別為：P18640、P19321、YP_001390123及Q60393。
於梭菌毒素HN域之修飾用較佳梭菌毒素胺基酸殘基：BoNT/A：D474、N476、D484、N486、I487、E488、A489、A490、E491、D546、E558、E560、H561、I566、L568、N570、S571、L577、N578、A597、E599、A601、E620、V621、T623、D625、T631、N645、L647、D650、D651、I668、E670、A672、V675、S683、I685、A686、N687、N752、Q753、T755、E756、E757、E758、N760、N761、I762、N763、D825、I831、G832、T847、D848、及D858
BoNT/B：V443、G444、D453、S468、D533、E534、N535、T545、L548、D549、I550、D552、S557、L564、S566、N582、V584、N609、L619、N632、E633、G637、A646、I655、E657、V662、E669、S670、I672、D673、N739、I740、N748、N750、I818、G819、T834、I842、N845、及S858
BoNT/C1：
L451、D452、C453、E455、V472、T474、D475、L478、N483、E484、E485、E487、I489、L555、S556、D557、N558、E560、D561、E569、N574、S575、T584、G592、Q594、G596、D617、N640、S641、V642、G645、N646、E661、E665、T667、A670、S678、V680、Q681、E682、S750、G751、S759、Q760、V826、G827、N842、T843、N847、及N853
BoNT/D：Q469、E470、E473、N474、D479、E480、N482、V483、Q484、N485、S487、D488、S552、N553、N554、V555、E556、N557、I558、L560、T562、S563、V564、G569、S571、N572、G588、Q590、T614、D616、S619、S622、N636、S637、L639、G641、N642、E657、E661、T663、A666、V669、S674、I676、Q677、E678、S746、G747、D749、E751、N752、I753、Q756、N818、V822、G823、E837、N838、T839、N843、N849、及N850
BoNT/E：D474、N476、E479、E480、D484、N486、I487、E488、A489、A490、E491、E492、L496、D497、Q500、Q501、L504、N507、D509、N510、N514、S516、E518、Q527、L530、N533、I534、E535、N539、Y548、I566、L568、D589、A597、E599、A601、L604、Y612、E620、N645、L647、Y648、D651、E737、E741、Y803、Y824、D825、G828、I831、G832、及D835
BoNT/F：N463、E464、N468、T469、D474、D475、T476、T477、N478、N482、N485、N495、I499、Q501、I502、Q505、T506、N508、T509、V511、D513、D521、S522、S526、E527、I528、E529、V534、D535、L536、E549、G550、T552、N553、S558、E566、E567、S568、V586、H587、Q608、D613、A616、D617、S619、N630、N633、N639、E654、V656、E658、L660、T663、L665、V666、S671、I673、G674、S675、S676、E677、N678、T746、N751、L753、E754、E756、N758、I759、N760、N761、S799、S821、I822、N840、S841、E845、L846、S847、S848、T850、N851、D852、I854、L855、及I856
BoNT/G：N480、Q482、N483、N484、T485、E487、D540、N562、N570、N571、N572、T588、V589、T615、D621、N637、E638、E642、N643、I660、E662、I667、E674、S675、V677、G678、N679、S747、N755、D757、L823、D839、I841、D844、S846、及L847
TeNT：A457、S458、L459、D461、L462、E486、E487、Q490、D491、N497、N504、D557、T571、T572、L573、Q574、N580、S581、N588、S589、T590、S598、Q605、G606、Q608、T631、I633、S640、Q655、E658、G659、N660、E675、I677、E679、T681、V684、A691、E692、S694、T695、Q696、A772、D773、E774、S862、N866、L867及D868
於BoNT/E輕鏈中修飾用之較佳梭菌毒素胺基酸殘基：N5、N8、N10、D11、N14、D15、Q27、E28、N72、Q75、N118、D121、N122、Q123、N138、Q237、Q290、N297、N362、N365、D366、N378、及N379。
工程化的BoNT/A分子之設計
生產依據本發明之工程化的BoNT/A分子之三個不同實施例。
使用實施例1所述之方法，總共55個殘基被鑑定作為於BoNT/A HN域中突變的候選物。殘基之適合性進一步以BoNT/A結晶結構之目視觀察評估以提供11個較佳候選物列表(N476、N763、N687、E599、I831、N761、N578、V675、I685、T755、E757)。基於顯示這些殘基為可順從突變而無不利影響蛋白質功能的功能資料，可另選擇6個殘基。此等殘基之4者係於候選物列表(L647、D650、D651、T847)而2者並未於列表中(S564、I849)。由候選物列表之11個殘基加上來自功能資料的6個，總計17個殘基被選擇用來突變。
由選擇的17個殘基，製作3個構築物：CatHN_v1、CatHN_v2及CatHN_v3。CatHN構築物用之突變示於下表3：
CatHN_v1、CatHN_v2及CatHN_v3之純化分別示於第1A、1B及1C圖。
選殖、表現及純化
合成實施例2所述之編碼工程化的BoNT/A分子的DNA構築物，選殖至pJ401表現載體，然後轉形至BL21(DE3)大腸桿菌。此允許重組工程化的BoNT/A分子於大腸桿菌中可溶的過度表現。
使用傳統層析技術自大腸桿菌溶解物純化重組的工程化的BoNTs。採用使用陽離子交換樹脂的初始純化步驟，隨後藉由使用疏水性交互作用樹脂的中間純化步驟。然後藉由蛋白質水解切割重組的工程化的BoNT單鏈，生成活化的雙鏈工程化的BoNT。然後採用最終純化步驟以移除剩下的汙染物。
經純化的工程化的BoNTs之特性記述
上列實施例2所述的工程化的BoNTs被實驗性描述特徵。
使用大鼠胚胎脊索神經元(eSCN)評估工程化的BoNTs進入神經元並切割SNAP-25(BoNT/A的標的)的能力。使用小鼠膈神經半橫膈膜(mPNHD)試驗進一步評估工程化的BoNTs之效力。
CatH N _v1：添加的第一組突變為取代成精胺酸：S564R、L647R、D650R、D651R、T847R、I849R
於大鼠胚胎脊索神經元(eSCN)SNAP-25切割試驗中試驗CatHN_v1分子，發現與BoNT/A(BoNT/A)等效的效力(第2圖)。
陽性結果亦於小鼠膈神經半橫膈膜(mPNHD)試驗中證實(第3圖)。
CatH N _v2：第二組之突變為取代成離胺酸：N476K、N763K、N687K、E599K、I831K、N761K
於eSCN SNAP-25切割試驗中試驗CatHN_v2蛋白質，發現保持進入細胞及切割SNAP-25之能力。於mPNHD試驗，CatHN_v2與BoNT/A等效力(第4及5圖)。
CatH N _v3：第三組突變為取代成離胺酸：N578K、V675K、I685K、T755K、E757K
CatHN_v3分子於eSCN SNAP-25切割試驗中試驗，且發現保持進入細胞及切割SNAP-25的能力。相似地，陽性結果亦於mPNHD試驗證實(第6及7圖)。
相較於未修飾的BoNT/A，所有3個CatHN構築物具有增加的pI(第8圖)。
BoNT/E之輕鏈中的修飾
由於肉毒桿菌毒素之模組化，使用具N-端麥芽糖結合蛋白質(MBP)標籤及C-端6個組胺酸標籤(6HT)之BoNT/E輕鏈構築物作為替代物指標以當突變及特性描述時評估BoNT/E活性。
製備具有下表所示突變之BoNT/E輕鏈構築物(「CatLC」)。
此構築物於BL21 DE3細胞被表現及使用親和性層析純化。純化示於第9圖。
催化活性之構築物之評估顯示經修飾輕鏈保持未經修飾之輕鏈的催化活性(第10圖)。
<110> 艾普森生物創新有限公司(IPSEN BIOINNOVATION LIMITED)
<120> 陽離子神經毒素
<140> TW104144440
<141> 2015年12月30日
<150> PCT/GB2015/050043
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<170> PatentIn 3.5版
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<212> PRT
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<220>
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<213> 人工序列
<220>
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<223> Nedd4-2辨識序列
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<223> Xaa可為任何自然發生的胺基酸
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<211> 12
<212> PRT
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<220>
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<212> PRT
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<223> E3連接酶辨識基序
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<212> PRT
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<212> PRT
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> E3連接酶辨識基序
<400> 37
Claims (45)
- 一種包含至少一個胺基酸修飾之工程化的梭菌毒素，其中該至少一個胺基酸修飾將工程化的梭菌毒素之等電點(pI)增加至高於缺少該至少一個胺基酸修飾之其他方面相同的梭菌毒素之pI至少0.2個pI單位的值，且其中該至少一個胺基酸修飾並未位於梭菌毒素結合域(HC域)；及其中該至少一個胺基酸修飾位於梭菌毒素轉位域(HN域)，或其中該至少一個胺基酸修飾位於梭菌毒素輕鏈，其但書為該至少一個胺基酸修飾並未導入E3連接酶辨識基序(E3 ligase recognition motif)至梭菌毒素輕鏈；及其中該至少一個胺基酸修飾係選自：酸性胺基酸殘基以鹼性胺基酸殘基取代；酸性胺基酸殘基以不帶電胺基酸殘基取代；不帶電胺基酸殘基以鹼性胺基酸殘基取代；鹼性胺基酸殘基之插入；及酸性胺基酸殘基之刪除；及其中該至少一個胺基酸修飾為表面暴露的胺基酸殘基之修飾；及其中該工程化的梭菌毒素為工程化的肉毒桿菌A型神經毒素(BoNT/A)，包含至少一個胺基酸之修飾，該胺基酸選自：N476、S564、N578、E599、L647、D650、D651、V675、I685、N687、T755、E757、N761、N763、 I831、T847、及I849；且其等電點(pI)至少為6.6，且其中該工程化的BoNT/A係由與選自SEQ ID NO：2、4及6之核酸序列具有至少95%序列同一性之核酸序列編碼，及/或包含與選自SEQ ID NO：1、3及5之胺基酸序列具有至少95%序列同一性之胺基酸序列，或其中該工程化的梭菌毒素為工程化的肉毒桿菌E型神經毒素(BoNT/E)，包含至少一個胺基酸之修飾，該胺基酸選自：Q123、N138、及Q237；且其等電點(pI)至少為6.2，且其中該工程化的BoNT/E包含由與SEQ ID NO：8之核酸序列具有至少95%序列同一性之核酸序列編碼的多肽，及/或包含與SEQ ID NO：7之胺基酸序列具有至少95%序列同一性之胺基酸序列。
- 如請求項1之工程化的梭菌毒素，其中該工程化的BoNT/A係由與選自SEQ ID NO：2、4及6之核酸序列具有至少98%序列同一性之核酸序列編碼，及/或包含與選自SEQ ID NO：1、3及5之胺基酸序列具有至少98%序列同一性之胺基酸序列；或其中該工程化的BoNT/E包含由與SEQ ID NO：8之核酸序列具有至少98%序列同一性之核酸序列編碼的多肽，及/或包含與SEQ ID NO：7之胺基酸序列具有至少98%序列同一性之胺基酸序列。
- 如請求項1之工程化的梭菌毒素，其中該工程化的BoNT/A係由與選自SEQ ID NO：2、4及6之核酸序列具有至少99%序列同一性之核酸序列編碼，及/或包含與選自SEQ ID NO：1、3及5之胺基酸序列具有至少 99%序列同一性之胺基酸序列；或其中該工程化的BoNT/E包含由與SEQ ID NO：8之核酸序列具有至少99%序列同一性之核酸序列編碼的多肽，及/或包含與SEQ ID NO：7之胺基酸序列具有至少99%序列同一性之胺基酸序列。
- 如請求項1之工程化的梭菌毒素，其中該工程化的BoNT/A係由包含選自SEQ ID NO：2、4及6之核酸序列之核酸序列編碼，及/或包含選自SEQ ID NO：1、3及5之胺基酸序列；或其中該工程化的BoNT/E包含由包含SEQ ID NO：8之核酸序列編碼的多肽序列，及/或包含SEQ ID NO：7所示之胺基酸序列。
- 如請求項1至4中任一項之工程化的梭菌毒素，其中該至少一個胺基酸修飾將工程化的梭菌毒素之等電點(pI)增加至高於缺少該至少一個胺基酸修飾之其他方面相同的梭菌毒素之pI至少0.5個pI單位的值。
- 如請求項1至4中任一項之工程化的梭菌毒素，其中該至少一個胺基酸修飾將工程化的梭菌毒素之等電點(pI)增加至高於缺少該至少一個胺基酸修飾之其他方面相同的梭菌毒素之pI至少1個pI單位的值。
- 如請求項1至4中任一項之工程化的梭菌毒素，其中該至少一個胺基酸修飾將工程化的梭菌毒素之等電點(pI)增加至高於缺少該至少一個胺基酸修飾之其他方面相同的梭菌毒素之pI至少2個pI單位的值。
- 如請求項1至4中任一項之工程化的梭菌毒素，其中 該至少一個胺基酸修飾將工程化的梭菌毒素之等電點(pI)增加至高於缺少該至少一個胺基酸修飾之其他方面相同的梭菌毒素之pI的2至5個pI單位的值。
- 如請求項1至4中任一項之工程化的梭菌毒素，其中該工程化的梭菌毒素具有至少6.5之pI。
- 如請求項1至4中任一項之工程化的梭菌毒素，其中該工程化的梭菌毒素具有6.5至9.5之間之pI。
- 如請求項1至4中任一項之工程化的梭菌毒素，其中該工程化的梭菌毒素具有6.5至7.5之間之pI。
- 如請求項1至4中任一項之工程化的梭菌毒素，其中該工程化的梭菌毒素包含1至90個胺基酸修飾。
- 如請求項中1至4任一項之工程化的梭菌毒素，其中該工程化的梭菌毒素包含至少3個胺基酸修飾。
- 如請求項1至4中任一項之工程化的梭菌毒素，其中該工程化的梭菌毒素包含4至40個胺基酸修飾。
- 如請求項1至4中任一項之工程化的梭菌毒素，其中該胺基酸殘基係以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代。
- 如請求項1至4中任一項之工程化的梭菌毒素，其用於醫藥。
- 如請求項1至4中任一項之工程化的梭菌毒素，其用於預防或治療選自下列之疾病或症狀：斜視(strabismus)、瞼痙攣、斜視(squint)、肌張力不全(dystonia)、斜頸、受益於細胞/肌肉無能的美容治療(整容)應用(經由SNARE調降或去活化)、眼能動力之神經肌肉失調或症狀、書寫痙攣(writer's cramp)、磨牙 (bruxism)、威爾森氏症(Wilson's disease)、震顫、抽搐(tics)、節段性肌陣攣(segmental myoclonus)、痙攣、由於慢性多發性硬化症導致的痙攣、造成異常膀胱控制之痙攣狀態、敵意(animus)、背痙攣、四頭肌僵痛(charley horse)、緊張性頭痛、提肌骨盆症候群(levator pelvic syndrome)、脊柱裂(spina bifida)、遲發性運動不能(tardive dyskinesia)、帕金森氏病、口吃、半邊顏面痙攣、眼瞼失調、腦性麻痺、局部痙攣狀態、痙攣性結腸炎(spasmodic colitis)、神經性膀胱障礙(neurogenic bladder)、肛門痙攣(anismus)、四肢痙攣狀態、肛裂(anal fissure)、弛緩不能、吞咽困難、流淚、多汗症(hyperhydrosis)、過度流涎、過度胃腸分泌、肌肉疼痛、頭痛性疼痛、蹙眉(brow furrows)、皮膚皺紋、癌症、子宮疾病、泌尿生殖器疾病、泌尿生殖器神經性失調、慢性神經性發炎、及平滑肌失調。
- 如請求項17之工程化的梭菌毒素，其中肌張力不全為痙攣性肌張力不全、口下頷肌張力不全、局部肌張力不全、遲發性肌張力不全、喉肌張力不全、四肢肌張力不全、或頸肌張力不全。
- 如請求項17之工程化的梭菌毒素，其中斜頸為痙攣性斜頸。
- 如請求項17之工程化的梭菌毒素，其中眼能動力之神經肌肉失調或症狀為共同性斜視、垂直斜視、外直肌麻痺、眼球震顫、或甲狀腺眼外肌病變。
- 如請求項17之工程化的梭菌毒素，其中肌肉疼痛為 來自肌肉痙攣的疼痛。
- 一種核酸，其包含編碼如請求項1至15中任一項之工程化的梭菌毒素之核酸序列。
- 一種生產具有輕鏈及重鏈之單鏈工程化的梭菌毒素蛋白質之方法，該方法包含於適當宿主細胞中表現如請求項22之核酸、溶解該宿主細胞以提供含有該單鏈工程化的梭菌毒素蛋白質之宿主細胞均質物、及單離該單鏈工程化的梭菌毒素蛋白質。
- 一種活化工程化的梭菌毒素之方法，該方法包含提供藉由如請求項23之方法可得到之單鏈工程化的梭菌毒素蛋白質多肽、使此多肽與在位於輕鏈及重鏈間之辨識位點(切割位點)切割此多肽的蛋白酶接觸、及轉化此多肽成為雙鏈多肽，其中該輕鏈及重鏈藉由雙硫鍵連接在一起。
- 一種如請求項24之方法可得到的工程化的梭菌毒素，其用於醫藥。
- 一種如請求項24之方法可得到的工程化的梭菌毒素，其用於預防或治療選自下列之疾病或症狀：斜視(strabismus)、瞼痙攣、斜視(squint)、肌張力不全(dystonia)、斜頸、受益於細胞/肌肉無能的美容治療(整容)應用(經由SNARE調降或去活化)、眼能動力之神經肌肉失調或症狀、書寫痙攣(writer's cramp)、磨牙(bruxism)、威爾森氏症(Wilson's disease)、震顫、抽搐(tics)、節段性肌陣攣(segmental myoclonus)、痙攣、由於慢性多發性硬化症導致的痙攣、造成異常膀胱控 制之痙攣狀態、敵意(animus)、背痙攣、四頭肌僵痛(charley horse)、緊張性頭痛、提肌骨盆症候群(levator pelvic syndrome)、脊柱裂(spina bifida)、遲發性運動不能(tardive dyskinesia)、帕金森氏病、口吃、半邊顏面痙攣、眼瞼失調、腦性麻痺、局部痙攣狀態、痙攣性結腸炎(spasmodic colitis)、神經性膀胱障礙(neurogenic bladder)、肛門痙攣(anismus)、四肢痙攣狀態、肛裂(anal fissure)、弛緩不能、吞咽困難、流淚、多汗症(hyperhydrosis)、過度流涎、過度胃腸分泌、肌肉疼痛、頭痛性疼痛、蹙眉(brow furrows)、皮膚皺紋、癌症、子宮疾病、泌尿生殖器疾病、泌尿生殖器神經性失調、慢性神經性發炎、及平滑肌失調。
- 如請求項26之工程化的梭菌毒素，其中肌張力不全為痙攣性肌張力不全、口下頷肌張力不全、局部肌張力不全、遲發性肌張力不全、喉肌張力不全、四肢肌張力不全、或頸肌張力不全。
- 如請求項26之工程化的梭菌毒素，其中斜頸為痙攣性斜頸。
- 如請求項26之工程化的梭菌毒素，其中眼能動力之神經肌肉失調或症狀為共同性斜視、垂直斜視、外直肌麻痺、眼球震顫、或甲狀腺眼外肌病變。
- 如請求項26之工程化的梭菌毒素，其中肌肉疼痛為來自肌肉痙攣的疼痛。
- 一種如請求項1至15中任一項之工程化的梭菌毒素或藉由如請求項24之方法可得到的工程化的梭菌毒素 之用途，其係用於製造美容處理用之醫藥。
- 如請求項31之用途，其中該美容處理係用於處理蹙眉及皮膚皺紋。
- 一種受益於細胞/肌肉無能之美容處理方法，該方法包括使用如請求項1至15中任一項之工程化的梭菌毒素或藉由如請求項24之方法可得到的工程化的梭菌毒素，其中該梭菌毒素係經由口服投予、局部塗覆、或吸入而使用。
- 一種如請求項1至15中任一項之工程化的梭菌毒素之用途，其係用於製造醫藥。
- 如請求項34之用途，其中該醫藥係用於預防或治療選自下列之疾病或症狀：斜視(strabismus)、瞼痙攣、斜視(squint)、肌張力不全(dystonia)、斜頸、受益於細胞/肌肉無能的美容治療(整容)應用(經由SNARE調降或去活化)、眼能動力之神經肌肉失調或症狀、書寫痙攣(writer's cramp)、磨牙(bruxism)、威爾森氏症(Wilson's disease)、震顫、抽搐(tics)、節段性肌陣攣(segmental myoclonus)、痙攣、由於慢性多發性硬化症導致的痙攣、造成異常膀胱控制之痙攣狀態、敵意(animus)、背痙攣、四頭肌僵痛(charley horse)、緊張性頭痛、提肌骨盆症候群(levator pelvic syndrome)、脊柱裂(spina bifida)、遲發性運動不能(tardive dyskinesia)、帕金森氏病、口吃、半邊顏面痙攣、眼瞼失調、腦性麻痺、局部痙攣狀態、痙攣性結腸炎(spasmodic colitis)、神經性膀胱障礙(neurogenic bladder)、肛門痙攣(anismus)、四肢痙攣狀態、肛裂(anal fissure)、弛緩不能、吞咽困難、流淚、多汗症(hyperhydrosis)、過度流涎、過度胃腸分泌、肌肉疼痛、頭痛性疼痛、蹙眉(brow furrows)、皮膚皺紋、癌症、子宮疾病、泌尿生殖器疾病、泌尿生殖器神經性失調、慢性神經性發炎、及平滑肌失調。
- 如請求項35之用途，其中肌張力不全為痙攣性肌張力不全、口下頷肌張力不全、局部肌張力不全、遲發性肌張力不全、喉肌張力不全、四肢肌張力不全、或頸肌張力不全。
- 如請求項35之用途，其中斜頸為痙攣性斜頸。
- 如請求項35之用途，其中眼能動力之神經肌肉失調或症狀為共同性斜視、垂直斜視、外直肌麻痺、眼球震顫、或甲狀腺眼外肌病變。
- 如請求項35之用途，其中肌肉疼痛為來自肌肉痙攣的疼痛。
- 一種藉由如請求項24之方法可得到的工程化的梭菌毒素之用途，其係用於製造醫藥。
- 如請求項40之用途，其中該醫藥係用於預防或治療選自下列之疾病或症狀：斜視(strabismus)、瞼痙攣、斜視(squint)、肌張力不全(dystonia)、斜頸、受益於細胞/肌肉無能的美容治療(整容)應用(經由SNARE調降或去活化)、眼能動力之神經肌肉失調或症狀、書寫痙攣(writer's cramp)、磨牙(bruxism)、威爾森氏症(Wilson's disease)、震顫、抽搐(tics)、節段性肌陣攣 (segmental myoclonus)、痙攣、由於慢性多發性硬化症導致的痙攣、造成異常膀胱控制之痙攣狀態、敵意(animus)、背痙攣、四頭肌僵痛(charley horse)、緊張性頭痛、提肌骨盆症候群(levator pelvic syndrome)、脊柱裂(spina bifida)、遲發性運動不能(tardive dyskinesia)、帕金森氏病、口吃、半邊顏面痙攣、眼瞼失調、腦性麻痺、局部痙攣狀態、痙攣性結腸炎(spasmodic colitis)、神經性膀胱障礙(neurogenic bladder)、肛門痙攣(anismus)、四肢痙攣狀態、肛裂(anal fissure)、弛緩不能、吞咽困難、流淚、多汗症(hyperhydrosis)、過度流涎、過度胃腸分泌、肌肉疼痛、頭痛性疼痛、蹙眉(brow furrows)、皮膚皺紋、癌症、子宮疾病、泌尿生殖器疾病、泌尿生殖器神經性失調、慢性神經性發炎、及平滑肌失調。
- 如請求項41之用途，其中肌張力不全為痙攣性肌張力不全、口下頷肌張力不全、局部肌張力不全、遲發性肌張力不全、喉肌張力不全、四肢肌張力不全、或頸肌張力不全。
- 如請求項41之用途，其中斜頸為痙攣性斜頸。
- 如請求項41之用途，其中眼能動力之神經肌肉失調或症狀為共同性斜視、垂直斜視、外直肌麻痺、眼球震顫、或甲狀腺眼外肌病變。
- 如請求項41之用途，其中肌肉疼痛為來自肌肉痙攣的疼痛。
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