TWI583792B - 展現減短的生物活性之神經毒素 - Google Patents
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Description
本發明有關藥學領域。明確而言，其涵蓋一種編碼在個體中展現減短的生物作用持續時間之神經毒性多肽之多核苷酸，其中該多肽在輕鏈中包含至少一種E3連接酶辨識模體，其中該E3連接酶辨識模體較佳地係針對E3連接酶MDM2之結合模體。本發明另外有關由本發明之多核苷酸編碼之多肽以及包含一或多個胺基酸取代之多肽。本發明另外涵蓋包含該多核苷酸、由其編碼之多肽之載體以及宿主細胞，以及專一性結合至該多肽之抗體。再者，本發明有關包含該多核苷酸以及多肽之藥劑，以及其之特定治療應用。此外，本發明涵蓋用於製造該多肽以及藥劑之方法。
肉毒桿菌以及破傷風桿菌會產生非常強的神經毒性，即，分別為肉毒桿菌毒素(BoNTs)以及破傷風毒素(TeNT)。此等梭菌屬神經毒性(CNTs)會專一性結合至神經細胞，且打斷神經傳導物質的釋出。各毒素合成時為非活性未處理約150kDa之單鏈蛋白。後轉譯過程涉及雙硫橋的形成，以及細胞蛋白酶進行之有限蛋白水解(刻痕)。活性神經毒性由二個鏈構成，約50kDa之N端輕鏈以及約100kDa之重鏈，其等由雙硫鍵連接。CNT由三個結構區構成，即催化輕鏈、包含轉位結構區(N端半段)之重鏈以及受體結合結構區(C端半段)，見Krieglstein 1990,Eur.J.Biochem.188,
39；Krieglstein 1991,Eur.J.Biochem.202,41；Krieglstein 1994,J.Protein Chem.13,49。肉毒桿菌神經毒素合成時為分子錯合物，包含150kDa神經毒素蛋白以及相關的非毒性錯合蛋白。該錯合物之尺寸大小隨著梭菌菌株以及不同的神經毒素血清型而不同，範圍從300kDa至900kDa。在此等錯合物中之錯合蛋白會安定神經毒素，且保護它對抗降解，見Chen 1998,Infect.Immun.66(6)：2420-2425。
肉毒桿菌分泌七種抗原性不同的血清型，命名為肉毒桿菌神經毒素(BoNT)A至G。所有的血清型以及由破傷風桿菌分泌之相關的破傷風神經毒素(TeNT)，均係Zn2+-內切蛋白酶，其等會藉由切割SNARE蛋白而阻斷突觸外胞飲作用，見Couesnon,2006,Microbiology,152,759。BoNT會引起在肉毒桿菌中毒中可見之弛缓性肌肉麻痹，見Fischer 2007,PNAS 104,10447。
儘管其毒性作用，肉毒桿菌素已用作為大量疾病或病症之治療劑。肉毒桿菌毒素血清型A在1989時，在美國已經核准供人類使用，用於治療斜視、眼瞼痙攣以及其它病症。市場上可購得的是具錯合蛋白之肉毒桿菌A神經毒素，例如，商品名BOTOX(Allergan Inc.)或商品名DYSPORT(Ipsen Ltd.)。可購得的改良無錯合神經毒素A多肽製品之商品係XEOMIN(Merz Pharmaceuticals LLC)。肉毒桿菌毒素之作用僅為暫時的，這就是為什麼需要重複投與肉毒桿菌，以維持治療效力之理由。
梭菌屬神經毒素會使隨意肌之強度變弱，對斜
視、局部肌張力不全症，包括斜頸症以及良性自發性眼瞼痙攣症，具有治療效率。其等進一步顯示出可緩解顏面不自主痙攣以及局部痙攣，此外，廣泛地對其它適應症有效，諸如胃腸病症、多汗症以及化妝品除皺，見Jost 2007,Drugs 67,669。
然而，諸如以下之醫學病況或疾病亦需要使肌肉強度變弱以及緊縮：傷口癒合、骨頭以及韌帶斷裂治療之固定、手術後固定，特別是和痔瘡切除手術有關、植入牙齒植入物或髖關節置換(內假體)、膝關節置換手術、眼科手術、痤瘡、激躁性結腸症、陰道痙攣、下背痛或良性前列腺增殖。神經毒素展現其生物作用之持續時間，通常比有效治療疾病或病狀實際所需之時間還長。然而，延長的肌肉痙攣在該醫療病況或疾病中係有害的或至少較不好的。然而，仍還未得到僅在所需時間內展現生物效力之神經毒素。
據此，可把本發明內在的技術問題，看成提供符合前述需求之手段以及方法。在申請專利範圍以及以下說明書中所描述之具體例，解決了該技術問題。
據此，本發明有關一種編碼在個體中展現減短的生物作用持續時間之神經毒性多肽之多核苷酸，其中該多肽在輕鏈中包含至少一種E3連接酶辨識模體，其中該E3連接酶辨識模體較佳地係針對E3連接酶MDM2之結合模體。因此修飾之多肽之減短的生物活性持續時間以
BoNT/E-MDM2作為例子。此外，該神經毒性多肽已進一步因為輕鏈中特定胺基酸殘基之定點突變而最適化。為此，用三維結構分析法，鑑定位置在空間上接近該引入的E3連接酶MDM2辨識模體之神經毒素輕鏈中之露出的胺基酸殘基。結果，該神經毒素輕鏈中所鑑定之露出的胺基酸殘基，已經過離胺酸殘基的取代。此最適化方法導致突變的BoNT/E-MDM2多肽之降解甚至比非突變的BoNT/E-MDM2多肽還快，此由下列範例證明。
據此，本發明之修飾的或突變的神經毒素多肽，特別可用於需要神經毒素之生物作用縮短或減短持續時間之疾病的治療。
在此所使用之術語“多核苷酸”意指單鏈或雙鏈DNA分子以及RNA分子。該術語包含基因組DNA、cDNA、hnRNA、mRNA以及此種分子之所有天然發生或人工合成修飾的衍生物。在一態樣中，該多核苷酸可為線性或環狀分子。此外，除了編碼前述神經毒素多肽之核酸序列之外，本發明之多核苷酸可包含適當的轉錄和/或轉譯需要之額外的序列，諸如5’或3’UTR序列。本發明之多核苷酸編碼一從肉毒桿菌神經毒素之抗原不同血清型中之一者，即BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G或破傷風神經毒素(TeNT)，衍生而來之修飾的神經毒素多肽。本發明之一態樣中，該多核苷酸包含(在本發明之修飾之前，即，輕鏈經由至少一種E3連接酶辨識模體修飾之前)下列所示之核酸序列：序列辨識編號1(BoNT/A)、
序列辨識編號3(BoNT/B)、序列辨識編號5(BoNT/C1)、序列辨識編號7(BoNT/D)、序列辨識編號9或81(BoNT/E)、序列辨識編號11(BoNT/F)、序列辨識編號13(BoNT/G)或序列辨識編號15(TeNT)。此外，在一態樣中，包含一種多核苷酸，其包含編碼(在本發明之修飾之前，即，輕鏈經由至少一種E3連接酶辨識模體修飾之前)如下列任一個所示之胺基酸序列之核酸序列：序列辨識編號2(BoNT/A)、序列辨識編號4(BoNT/B)、序列辨識編號6(BoNT/C1)、序列辨識編號8(BoNT/D)、序列辨識編號10或82(BoNT/E)、序列辨識編號12(BoNT/F)、序列辨識編號14(BoNT/G)或序列辨識編號16(TeNT)。在另一態樣中，該多核苷酸係前述多核苷酸之變異體，包含一或多個核苷酸取代、缺失和/或添加，其在又另一態樣中可產生一具有一或多個胺基酸取代、缺失和/或添加之編碼胺基酸。此外，在另一態樣中，本發明之變異多核苷酸包含與下列任一個所示之核酸序列具有至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%一致或100%一致之核酸序列變異體：序列辨識編號1、3、5、7、9、81、11、13或15，或編碼與下列任一個所示之胺基酸序列具有40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%一致或100%一致之核酸序列變異體：序列辨識編號2、4、6、8、10、82、12、14或16。於一態樣中，以上所提及之變異多
核苷酸中每一個均編碼保留一或多種生物特性之變異多肽，以及於另一態樣中，編碼該個別的神經毒素多肽，即BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G或破傷風神經毒素(TeNT)之生物特性。熟悉此技藝之人士應了解，僅在蛋白水解後可保持完整的生物活性，即使可以想像未經處理的前趨物可行使一些生物功能或部分活性。在此使用之術語“生物特性”意指(a)受體結合、(b)內化、(c)穿過內質膜進入細胞溶質之轉位和/或(d)內切蛋白酶水解打斷涉及突觸囊泡膜融合之蛋白。在另外的態樣中，該變異多核苷酸可編碼具有改善或改變生物特性之變異多肽，如，其等可包含改善酵素辨識或可改善受體結合或任何其它以上所述之特性之斷裂位置。於又另外態樣中，該變異多核苷酸應編碼包含至少二個不同血清型之神經毒素多肽之一部分之融合神經毒素多肽，如，包含BoNT/A之重鏈以及BoNT/E之輕鏈，或BoNT/E之結合結構區以及BoNT/A之轉位結構區以及輕鏈之融合神經毒素。
在此使用之術語“一致”，意指藉由決定二個核酸序列或胺基酸序列間一致的胺基酸之數目(其中比對該等序列，以便獲得最高級的匹配)特徵化的序列一致性。其可使用公開技術或電腦程式中編纂的方法計算得，例如BLASTP、BLASTN或FASTA(Altschul 1990,J.Mol.Biol.215,403)。在一態樣中，百分比一致性之值係在整個胺基酸序列上計算。熟悉此技藝之工作人員可利用一系列以各種演算法為基礎的程式比對不同的序列。在此情況下，
Needleman與Wunsch或Smith與Waterman之演算法提供了特別可靠的結果。為進行序列比對，可使用程式PileUp(Higgins 1989,CABIOS 5,151)或程式Gap以及BestFit(Needleman 1970,J.Mol.Biol.48；443；Smith 1981,Adv.Appl.Math.2,482)，其等係GCG軟體包之一部分(Genetics Computer Group 1991,575 Science Drive,Madison,Wisconsin,USA 53711)。在本發明之另一態樣中，以上所述序列一致性之百分比值(%)之測定，係使用程式GAP，以下列之設定值在整個序列區上進行比對：空位權重：50、長度權重：3、平均匹配：10.000以及平均錯配：0.000，除非有特別指示，否則應隨時使用標準設定進行序列比對。
在此使用之術語神經毒素之“活性”、“功能”、“生物活性”、“生物功能”或“生物作用”，代表每單元時間中，一細胞之細胞外胞飲作用被抑制的量，諸如從一標的細胞(諸如，神經元)外胞飲神經傳導物質(如，乙醯膽鹼)。更明確地，其意指成熟雙鏈神經毒素多肽展現下列之生物活性a)受體結合、b)內化、c)穿過內質膜進入細胞溶質之轉位，和/或d)內切蛋白酶水解打斷涉及突觸囊泡膜融合之蛋白。在此使用之術語“個體中(神經毒素之)生物作用之持續時間”，意指在已經施予神經毒素之個體中，神經毒素之生物活性的時間區間。用於評估生物活性之活體內分析，包括如Pearce et al.(Pearce 1994,Toxicol.Appl.Pharmacol.128：69-77)以及Dressler et al.(Dressler 2005,Mov.Disord.20：1617-1619,Keller 2006,Neuroscience 139：629-637)所述
之小鼠LD50分析法以及之活體內小鼠偏側膈分析法。亦可用Whitemarsh et al.(Whitemarsh et al.2012,Toxicol.Sci.126：426-435)所述之細胞為主的分析法評估生物活性。生物活性一般係以小鼠單位(MU)表示。在此使用之1MU，係神經毒素組份在經腹膜內注射後，殺死50%特定小鼠所需之數量，即小鼠i.p.LD50。在此使用之術語“個體”意指哺乳動物，較佳地人類。
此外，進一步包含可偵測的標記胜肽或標籤之融合多肽，涵蓋於本發明之另外的神經毒素多肽中，其因輕鏈中之至少一種E3連接酶辨識模體，而在個體中展現減短的生物作用持續時間。於一態樣中，適合的標籤係，如FLAG-標籤、Myc-標籤、His-標籤、HA-標籤或GST-標籤，其亦容許更有效的純化該標籤的多肽。於一態樣中，可偵測的標記胜肽包括螢光蛋白，諸如GFP、BFP、YFP等等。在一些態樣中，該融合多肽可包含額外的多肽結構區。例如，本發明之神經毒素多肽可包含介導細胞穿透之胜肽結構區，以便進入神經毒素輕鏈之作用位置，即，神經標的細胞之細胞質。為此目的，如，多精胺酸胜肽可用於融合至本發明之神經毒素多肽，其係業界熟悉的。
本發明之(由多核苷酸編碼之)神經毒素多肽，在其輕鏈中另外包含至少一種E3連接酶辨識模體。如在此其它地方之更詳細的說明以及下列範例之證明，在個體中神經毒素之生物作用持續時間，會因併入至少一種E3連接酶辨識模體於輕鏈中或添加至少一種E3連接酶辨識模體至輕
鏈之N-或C-端而受影響，即，改變。因此，於一態樣中，本發明之神經毒素多肽，在輕鏈中包含至少一種從中間或終端插入的E3連接酶辨識模體。與不含E3連接酶辨識模體之神經毒素相比，此一修飾使得本發明之神經毒素在個體中之生物作用的持續時間減短了。在本發明之一態樣中，由本發明之多核苷酸編碼之神經毒素多肽之輕鏈，係從包含前述特定核酸序列中任一個或以上所述其之變異體之多核苷酸編碼之輕鏈修飾而來。如上所述且為業界熟知的，神經毒素多肽之輕鏈係由蛋白水解打斷前趨多肽而產生的。輕鏈係前趨多肽之N端部分，其係因蛋白水解斷裂而得。在一態樣中，以上所指之神經毒素多肽之輕鏈之胺基酸序列，可從表1中指示之野生型神經毒素之斷裂位置推論而得。在重組神經毒素方面，斷裂位置(諸如凝血酶斷裂位置或腸激酶斷裂位置)被引入重與輕鏈之間，二個形成二硫橋之半胱胺酸間之序列中，較佳地進入在此其它地方定義之連結子中。
在此使用之術語“E3連接酶辨識模體”，用於修飾本發明之神經毒素多肽之輕鏈，導致該神經毒素多肽被存在已施予該神經毒素之個體中的內源性降解途徑加速降解。該E3連接酶辨識模體係結構模體，其容許E3連接酶辨識該模體以及連接至該模體。介導細胞蛋白降解之另外的胜肽降解信號為業界已知的，包含，例如，PEST模體、WW模體或WD40模體。降解途徑可為蛋白酶體的降解途徑或溶酶體的降解途徑。於另一態樣中，降解途徑可藉由如一或多種蛋白斷裂步驟，僅產生本發明之神經毒素多肽部分的降解。該E3連接酶辨識模體可被引入該輕鏈中，即被放置於該輕鏈之內部或將其連接至N-或C端。於後者之情況下，本發明之神經毒素多肽可，例如，攜帶插在神經毒素輕鏈
與重鏈之間之E3連接酶辨識模體。例如，此一結構在一態樣中從N端至C端具有下列排列：神經毒素輕鏈-E3連接酶辨識模體-神經毒素重鏈。選擇性地，從N端至C端結構體排列可為：神經毒素重鏈-E3連接酶辨識模體-神經毒素輕鏈。於另外的態樣中，額外的連結子，諸如多甘胺酸連結子，可用於使該神經毒素輕與重鏈互連。此一結構從N端至C端可排列成：神經毒素輕鏈-E3連接酶辨識模體-連結子-神經毒素重鏈。選擇性地，該結構體從N端至C端排列可為：神經毒素重鏈-連結子-E3連接酶辨識模體-神經毒素輕鏈。該連結子較佳地包含蛋白酶斷裂位置，例如，腸激酶斷裂位置或凝血酶斷裂位置。E3連接酶辨識模體之位置，較佳地在該輕鏈之形成第一雙硫橋半胱胺酸之C端以及之該蛋白酶斷裂位置之N端；見圖1。在被各別的蛋白酶打斷時，神經毒素輕鏈(包含E3連接酶辨識模體)從以上所述之結構體中釋出。於另一態樣中，本發明之神經毒素多肽在天然重組輕鏈中不僅包含或附著一種E3連接酶辨識模體，且包含二、三、四或甚至更多的E3連接酶辨識模體。在此使用之術語，在一個體中展現減短的生物作用持續時間之“修飾的”神經毒素多肽，意指本發明之神經毒素多肽在天然重組輕鏈中包含或附著至少一種E3連接酶辨識模體，較佳地在該神經毒素輕鏈中結合一或多種突變。甚至更佳的，該神經毒素輕鏈中之突變係在此其它地方定義之胺基酸取代。
熟悉此技藝之人士應具有適合的E3連接酶辨識
模體以及如何引入或連接其等至神經毒素多肽的輕鏈之知識。此外，熟悉此技藝之人士可利用重組分生技術或化學修飾，產生編碼此具有至少一種E3連接酶辨識模體之神經多肽之多核苷酸。例如，可使用定點突變來引入在此所提到之E3連接酶辨識模體。選擇性地，可設計有關包含神經毒素多肽之編碼序列以及設想的E3連接酶辨識模體之多核苷酸之核酸序列，然後可化學合成整個多核苷酸。
在一態樣中，該E3連接酶辨識模體係至少一種內部或終端引入的E3連接酶辨識和/或E3連接酶結合模體。較佳地，針對各別E3連接酶之辨識以及結合模體係一致的，即，該模體可用於辨識以及結合E3連接酶二者。在此態樣中，E3連接酶辨識模體會標靶本發明之神經毒素多肽的輕鏈，透過泛素介導的蛋白酶體降解途徑進行細胞降解。透過泛素蛋白酶體途徑之降解，涉及二個獨立以及連續的步驟：(i)共價附著數個泛素分子至本發明之神經毒素多肽的輕鏈，以形成聚泛素鏈以及(ii)經由26S蛋白酶體途徑降解本發明如此標籤的神經毒素多肽的輕鏈。在此技術中所描述之泛素係一種高度保守的76個胺基酸蛋白，其經由三個步驟之機制結合至標的蛋白。首先，由泛素激活酵素(E1)活化泛素之C端羧基基團。之後透過醯基轉移反應，將泛素附著至E1酵素所形成之硫酯轉移至泛素結合酵素(E2)。取決於所涉及的E3連接酶，泛素之後不是直接轉移至E3連接酶(HECT E3連接酶)就是E2-泛素錯合物結合至E3連接酶(RING E3連接酶)。最後，在二種情況下，E3連接
酶均專一性結合至基質以及催化在結合過程之最後步驟，其係共價連接泛素至該基質，目前的情況係連接至本發明之神經毒素多肽的輕鏈(Marmor and Yarden 2004,Oncogene 23：2057 2070)。連續的結合泛素至之前添加的泛素分子之中間的離胺酸會形成聚泛素鏈。該聚泛素化的標的蛋白之後會被26S蛋白酶體辨識以及排除(Schrader 2009,Nat.Chem.Biol.5：815 22)。較佳地，在此定義之E3連接酶辨識模體會介導不可逆的降解。此不可逆的降解已被描述為，例如，胜肽降解訊號結構區“ALAPYIP”(序列辨識編號25)。在特別的態樣中，E3連接酶辨識和/或結合模體係具有長度小於50個胺基酸殘基、長度小於40個殘基、長度小於30個殘基、長度小於20個殘基或長度小於15個殘基之胜肽或擬胜肽。特定E3連接酶辨識模體之例子示於表2中，或E3連接酶辨識模體包含胺基酸序列ETFSDLWKLLPE(序列辨識編號26)、TSFAEYWNLLSP(序列辨識編號27)、LTFEHYWAQLTS(序列辨識編號28)、LTFEHWWAQLTS(序列辨識編號29)、LTFEHSWAQLTS(序列辨識編號30)、ETFEHNWAQLTS(序列辨識編號31)、LTFEHNWAQLTS(序列辨識編號32)、LTFEHWWASLTS(序列辨識編號33)、LTFEHWWSSLTS(序列辨識編號34)、LTFTHWWAQLTS(序列辨識編號35)、ETFEHWWAQLTS(序列辨識編號36)、LTFEHWWSQLTS(序列辨識編號37)、LTFEHWWAQLLS(序列辨識編號38)、ETFEHWWSQLLS(序列辨識編號39)、RFMDYWEGL(序列辨識編號40)、MPRFMDYWEGLN(序
列辨識編號41)、SQETFSDLWKLLPEN(序列辨識編號42)和/或LTFEHNWAQLEN(序列辨識編號78)。較佳地，該E3連接酶辨識模體在細胞內會介導本發明之神經毒素多肽的輕鏈之至少10、20、30、40、50、60、70、80或90%，更佳地100%之降解。降解作用可用業界所述之分析法測定，如試管中之分析法，像定量細胞為主的分析法，或活體內分析法，諸如小鼠跑步分析法、趾伸展分析法(DAS)或大鼠抓力強度分析法。
在另一態樣中，該E3連接酶辨識模體係針對E3連接酶MDM2之結合模體。對應的人類核酸以及胺基酸序列分別示於登錄號NM_002392以及NP_002383中。較佳地，該針對E3連接酶MDM2之結合模體包含擇自於由下列所構成之群組之序列，或基本上由擇自於由下列所構成之
群組之序列構成：ETFSDLWKLLPE(序列辨識編號26)、TSFAEYWNLLSP(序列辨識編號27)、LTFEHYWAQLTS(序列辨識編號28)、LTFEHWWAQLTS(序列辨識編號29)、LTFEHSWAQLTS(序列辨識編號30)、ETFEHNWAQLTS(序列辨識編號31)、LTFEHNWAQLTS(序列辨識編號32)、LTFEHWWASLTS(序列辨識編號33)、LTFEHWWSSLTS(序列辨識編號34)、LTFTHWWAQLTS(序列辨識編號35)、ETFEHWWAQLTS(序列辨識編號36)、LTFEHWWSQLTS(序列辨識編號37)、LTFEHWWAQLLS(序列辨識編號38)、ETFEHWWSQLLS(序列辨識編號39)、RFMDYWEGL(序列辨識編號40)、MPRFMDYWEGLN(序列辨識編號41)、SQETFSDLWKLLPEN(序列辨識編號42)和/或LTFEHNWAQLEN(序列辨識編號78)。甚至更佳的，該針對E3連接酶MDM2之結合模體包含胺基酸序列LTFEHNWAQLTS(序列辨識編號32)或LTFEHNWAQLEN(序列辨識編號78)或由胺基酸序列LTFEHNWAQLTS(序列辨識編號32)或LTFEHNWAQLEN(序列辨識編號78)構成。亦較佳的是該針對E3連接酶MDM2之結合模體之長度介於9與15個胺基酸殘基之間，更佳地其長度為12個胺基酸殘基。圖1例示說明本發明之神經毒素多肽之例子，包含針對E3連接酶MDM2之結合模體(MDM2模體)。圖2顯示圖1中所述之神經毒素輕鏈與重鏈間針對E3連接酶MDM2之結合模體的中間位置，其使E3連接酶MDM2能夠辨識以及結合至因此修飾的神經毒素輕鏈，導致周圍表面露出的離胺酸殘
基泛素化，以及本發明之泛素化神經毒素輕鏈快速的被細胞蛋白酶體系統降解。涵蓋在本發明之範疇的是，針對E3連接酶MDM2之指示的結合模體之序列可進一步藉由，例如，一或多種核苷酸取代、缺失和/或添加進行修飾，其於又另一態樣中可產生具有一或多個胺基酸取代、缺失和/或添加之編碼的胺基酸。可進行該修飾，以便改變(如，改善)E3連接酶MDM2至指示的結合模體之結合，導致本發明之神經毒素多肽被泛素介導的蛋白體降解途徑降解得更快。
於另外的態樣中，本發明之多核苷酸包含擇自於由下列所構成之群組之核酸序列：a)具有序列辨識編號51或79中所示之核苷酸序列之核酸序列；b)編碼具有序列辨識編號52或80所示之胺基酸序列之多肽之核酸序列；以及c)至少40%，較佳地至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%與a)或b)之核酸序列一致之核酸序列。
如下列範例之說明，本發明之(由多核苷酸編碼之)神經毒素多肽在輕鏈中包含至少一種E3連接酶辨識模體，其在投與時，與未修飾的神經毒素多肽(在輕鏈中不包含一或多種E3連接酶辨識模體)相比，於個體中展現減短的生物作用持續時間。因此修飾之多肽之減短的生物活性持續時間已由BoNT/E-MDM2舉例說明。本發明之神經毒素多肽之減短的生物作用持續時間，係因個體之神經元中蛋白
酶體系統快速降解該神經毒素多肽的結果(即，催化神經毒素輕鏈)。
以上提及之BoNT/E-MDM2多肽已經過本發明人進一步利用定點突變輕鏈中露出的胺基酸殘基(其等在空間上位於MDM2辨識模體之附近)進行改善。在此使用之“露出的胺基酸殘基”意指，該胺基酸殘基位在神經毒素之輕鏈，如BoNT/E輕鏈，的表面，且該胺基酸殘基之側鏈沒有涉及分子內交互作用。先以三維結構分析鑑定輕鏈中露出的胺基酸殘基，然後以離胺酸殘基取代。與包含E3連接酶辨識模體之沒突變的BoNT/E-MDM2多肽相比，此最適化程序產生甚至更加速的降解突變的BoNT/E-MDM2多肽。令人意外地發現，Q53、N72、N378、N379、R394和/或T400之位置處用離胺酸取代，會導致BoNT/E-MDM2更快速的被蛋白酶體系統降解。各別的胺基酸殘基之指定位置係根據序列辨識編號52所示之胺基酸序列中之編號而定。特別是，其中輕鏈中之(i)Q53、N72、N378、N379、R394以及T400(序列辨識編號57)；(ii)Q53、N378以及N379(序列辨識編號58)；(iii)N72、N378以及N379(序列辨識編號61)；或(iv)N378、N379以及T400(序列辨識編號75)已經離胺酸殘基取代之BoNT/E-MDM2突變體，在培養的腦皮質神經元上顯示減短的生物作用。相對的，數個其它的突變沒有顯示出生物作用持續時間任何的減短，如圖3所示。據此，在另外的態樣中，本發明之多肽包含擇自於由下列所構成之群組之胺基酸序列或由擇自於由下列所構成之群組之胺基
酸序列構成：a)序列辨識編號57、58、61或75中所示之胺基酸序列；以及b)至少40%，較佳地50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%與a)之胺基酸序列一致之胺基酸序列。
較佳地，b)之胺基酸序列在輕鏈中攜帶與序列辨識編號57(Q53、N72、N378、N379、R394以及T400)、58(Q53、N378以及N379)、61(N72、N378以及N379)或75(N378、N379以及T400)相同之突變組。於另一態樣中，本發明有關編碼以上a)或b)之胺基酸序列之多核苷酸。
在一態樣中，在個體中所觀察到之本發明之神經毒素多肽之生物作用，係引起肌肉痙攣，即，(可逆性)去除肌肉收縮之能力。於另外態樣中，在人類個體中，本發明之神經毒素多肽減短的生物作用持續時間短於5、4、3、2周或甚至短於1周。於另一態樣中，可用所謂的小鼠跑步分析法(Keller 2006,Neuroscience 139：629-637)、趾伸展分析法(Aoki 2001,Toxicon 12：1815 20)或大鼠抓力強度分析法(Torii 2011,Toxicon 57(1)：93 9)，於活體內測試該作用。生物作用可在熟悉此技藝人士不需費力之情況下測得。在一態樣中，減短的生物作用持續時間意指統計上有意義的減短持續時間。作用持續時間是否為統計上有意義的減少，可由熟悉此技藝之人士應用標準統計檢定法測定，如測定信賴區間、p-值測定、學生t測試、Mann-Whitney測試等等。
較佳的信賴區間係至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%。p值較佳地為0.1、0.05、0.01、0.005或0.0001。較佳地，本發明想像的機率容許指定的個體群之診斷正確率至少60%、至少70%、至少80%或至少90%。在一態樣中，該減短的持續時間短於正常持續時間，即未修飾的神經毒素多肽(輕鏈中不含或沒有連接一或多種E3連接酶辨識模體)中觀察到之持續時間之75%、短於70%、短於65%、短於60%、短於55%、短於50%、短於45%、短於40%、短於30%或短於20%。在一態樣中，BoNT/A情況之正常持續時間大約4個月，BoNT/B之情況2個月、BoNT/C之情況大約3至4個月或BoNT/E之情況大約4至6週(Foran,J.Biol.Chem.278(2)：1363-1371、Eleopra 1998,Neurosci.Lett.13,256(3)：135-138、Eleopra 1997,Neurosci.Lett.14,224(2)：91-94、Sloop 1997,Neurology 49(1)：189-194、Washbourne 1998,J.Physiol.Paris 92(2)：135-139)。應了解，作用之持續時間取決於個體內個別的影響，諸如基因背景、年齡、生活型態等等。因此，在此大約的持續時間，意指以上針對各別神經毒素多肽所指之持續時間，(如，針對BoNT/A為4個月或針對BoNT/E為4至6周)，具標準差25%或更小、20%或更小、15%或更小、10%或更小或5%或更小。
已發現，如本發明之神經毒素多肽具有可修飾成在投與時，於個體中展現減短生物作用之優點。此可藉由引入或連接E3連接酶辨識模體至該神經毒素多肽之輕鏈而
達到，因為發現該輕鏈的存留與生物作用之持續時間有關聯。由本發明之神經毒素多肽引起之減短的生物作持續時間，有利於各種在此其它地方所述需要減短該神經毒素之生物作用持續時間之醫療應用。此減短的持續時間，在使用神經毒素進行短期或急性治療之情況特別重要，例如，用於手術傷口的治療，以便在無疤痕形成之情況下促進快速以及無痛傷口癒合，或用在人工昏迷時麻痺病人的眼瞼肌肉，其眼睛可能遭受變乾之傷害。本發明之其它神經毒素多肽之應用列於在此其它地方。
本發明涵蓋一種載體，其包含本發明之多核苷酸。
術語“載體”較佳地包含噬菌體、質體、病毒或逆轉錄病毒以及人工染色體，諸如細菌或酵母菌人工染色體。此外，術語亦有關標靶結構體，其容許隨機或定點整合該標靶結構體進入基因組DNA。此標靶結構體較佳地包含足夠長度的DNA供同源或異源重組，在下文中詳細說明。於一態樣中，該包含本發明之多核苷酸之載體，進一步包含有關在宿主中增殖和/或選擇之可選擇的標記。該載體可經各種業界熟悉技術併入宿主細胞中。例如，質體載體可以諸如磷酸鈣沈澱物或氯化銣沈澱物之沈澱物，或與帶電脂質之錯合物，或碳為主的叢集，諸如富勒烯，之形式引入。選擇性地，可利用熱休克或電穿孔技術引入質體載體。該載體應為病毒，其在應用於宿主細胞之前，可在試管中使用適當的包裝細胞株包裝。逆轉錄病毒載體可為
可複製型或複製缺陷型。在後者之情況下，病毒增殖一般僅發生在互補宿主/細胞中發生。再者，在本發明之一態樣中，該多核苷酸係有效地連接至容許在原核或真核宿主細胞中表達之表達控制序列，或該載體中其之分離片段。多核苷酸之表達包含將該多核苷酸轉錄成轉移mRNA。確認宿主細胞中之表達的調節元素係業界熟悉的。在一態樣中，其等包含確認轉錄之起始之調節序列和/或確認轉錄終止以及使轉錄安定之多A訊號。額外的調節元素可包括轉錄以及轉譯增強子。容許在原核宿主細胞中表達之可能的調節元素包含如大腸桿菌中之lac-、trp-或tac-啟動子，而容許在真核宿主細胞中表達之調節元素之例子為酵母菌中之AOX1-或GAL1-啟動子，或哺乳動物以及其它動物細胞中之CMV-、SV40-、RSV-啟動子(勞氏(Rous)肉瘤病毒)、CMV-增強子、SV40-增強子或球蛋白內含子。此外，誘導型表達控制序列可用於本發明包含之表達載體。此誘導型載體可包含tet或lac操作子序列或可由熱休克或其它環境因子誘導之序列。適合的表達控制序列係業界熟知的。除了可因應轉錄之起始之元素外，此調節元素亦可包含轉錄終止訊號，諸如SV40-多-A位置或tk-多-A位置，在該多核苷酸之下游。在此方面，適合的表達載體係業界已知的，諸如Okayama-Berg cDNA表達載體pcDV1(Pharmacia)、pBluescript(Stratagene)、pCDM8、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3(Invitrogen)或pSPORT1(Invitrogen)。較佳地，該載體係表達載體以及基因轉移或標靶載體。從諸如逆轉錄
病毒、牛痘病毒、腺相關病毒、疱疹病毒或牛乳頭瘤病毒之病毒衍生而來之表達載體，可用於傳送本發明之多核苷酸或載體進入標靶細胞群。熟悉此技藝之人士熟悉之方法可用於建構重組病毒載體，見，例如，Sambrook,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory(2001)N.Y.以及Ausubel,Current Protocols in Molecular Biology,Green Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y.(1994)中所述之技術。
此外，本發明有關一種宿主細胞，其包含本發明之多核苷酸或載體。
在此使用之術語“宿主細胞”涵蓋原核以及真核宿主細胞。較佳地，該宿主細胞係分離的原核或真核宿主細胞。在一態樣中，該宿主細胞係細菌細胞，於另一態樣中，厚壁菌門(Firmicutes)細菌細胞。於一態樣中，該細菌宿主細胞係大腸桿菌宿主細胞。於另一態樣中，其係梭菌屬宿主細胞。於另外的態樣中，該梭菌屬宿主細胞係肉毒桿菌宿主細胞，於甚至另外之態樣中，係前述肉毒桿菌之七種不同血清型中之一種之細胞。於又另一態樣中，該細菌宿主細胞係破傷風桿菌宿主細胞。於另外的態樣中，該宿主細胞係芽孢桿菌屬宿主細胞，而於特定態樣中，是巨大芽孢桿菌宿主細胞。於一態樣中，真核宿主細胞係適合產生毒性蛋白之動物細胞株之細胞，或諸如酵母菌宿主細胞之真菌宿主細胞。
本發明亦涵蓋一種由本發明之多核苷酸編碼之
多肽。於本發明之多肽之一態樣中，該多肽進一步包含至少一個在該神經毒素多肽之輕鏈上(但不是在以上定義之MDM2結合模體上)之胺基酸取代。較佳地，輕鏈中天然發生的胺基酸之取代係被離胺酸取代。更佳地，該多肽包含至少一個擇自於由下列所構成之群組之胺基酸取代：Q53K、N72K、N378K、N379K、R394K以及T400K。該多肽可包含不僅一個該胺基酸取代，且可包含二、三、四、五、六或甚至更多個胺基酸取代。特佳的是其中輕鏈上之(i)Q53、N72、N378、N379、R394以及T400(序列辨識編號57)、(ii)Q53、N378以及N379(序列辨識編號58)、(iii)N72、N378以及N379(序列辨識編號61)或(iv)N378、N379以及T400(序列辨識編號75)已經離胺酸殘基取代之BoNT/E-MDM2突變種。於本發明之多肽之其它態樣中，例如，為了改善E3連接酶MDM2與本發明之多肽之結合，除了以上提及之在輕鏈上的胺基酸序列之取代之外，該多肽可包含一或多個在MDM2結合模體上之胺基酸序列取代。
在此使用之術語“多肽”涵蓋分離或基本上純化的多肽，其基本上無其它包括肉毒桿菌之錯合蛋白(HA70、HA17、HA33或NTNH(NBP)之多肽或還包含其它蛋白之多肽製品。再者，該術語包括重組以及化學修飾的多肽。此修飾可為人工修飾或天然發生的修飾。如以上所指，本發明之多肽應具有以上所指之神經毒素多肽之生物特性。此外，其在投與時，於個體中應會展現減短的生物作用持續時間。另外，本發明之多肽可由肉毒桿菌毒素以及具有可
標靶其它細胞類型之新結合結構體構成。在一態樣中，本發明之多肽可用在此其它地方更詳細敘述之製造多肽之方法製造。在本發明之一態樣中，亦設想一種多肽製品，其包含神經毒素多肽與其錯合蛋白之錯合物。
再者，本發明有關一種抗體，其會專一性結合至本發明之多肽。於另外的態樣中，該抗體會專一性結合至序列辨識編號52、57、58、61或75中所示之胺基酸序列。
抗本發明之多肽之抗體可經由熟知之方法，使用根據本發明之純化的多肽或由其衍生而來之適合的片段作為抗原製得。適合作為抗原之片段可由業界熟知之抗原性測定演算法鑑定。此片段可從本發明之多肽經蛋白水解消化而得或可為合成胜肽。於一態樣中，本發明之抗體係單株抗體、多株抗體、單鏈抗體、人類或人源化抗體或靈長源抗體、嵌合抗體或其片段。亦包含作為本發明之抗體的是雙專一性或雙單鏈抗體、合成抗體、抗體片段，諸如Fab、Fv或scFv片段等等，或此等中任一個之化學修改的衍生物。本發明之抗體應可專一性結合至本發明之多肽(即，不會與其它多肽或胜肽交互反應)。明確而言，該抗體應亦不會與未修飾的神經毒素多肽(沒有攜帶MDM2結合模體)交互反應。另外，該抗體應不會與E3連接酶MDM2交互反應。專一性結合可用各種熟知之技術測試。抗體或其片段可用如Harlow and Lane "Antibodies,A Laboratory Manual",CSH Press,Cold Spring Harbor,1988中所述之方法獲得。單株抗體可用Köhler et al.(Köhler 1975,Nature 256：495)或Galfré
(Galfré 1981,Meth.Enzymol.73)最初所述之技術製得，其包含融合小鼠骨髓瘤細胞與已經過抗原(即，本發明之多肽或其免疫片段)免疫之哺乳動物取得之脾細胞。該抗體可用於，例如，本發明之多肽之免疫沈澱以及免疫定位，以及用於監控例如重組有機體中該多肽之存在，以及用於鑑定會與如本發明之蛋白反應之化合物。例如，在BIAcore系統中使用之表面等離子共振，可用於增加結合至本發明之蛋白的抗原決定部位之噬菌體抗體之效力(Schier 1996,Human Antibodies Hybridomas 7：97 105；Malmborg 1995,J.Immunol.Methods 183：7 13)。於另一態樣中，本發明之抗體會專一性結合至一或多個擇自於由下列所構成之群組之胺基酸取代：Q53K、N72K、N378K、N379K、R394K以及T400K，位置編號對應於序列辨識編號52。
本發明之多核苷酸或多肽一般可用作為藥劑。
在此使用之術語“藥劑”於一態樣中，意指一含有本發明之生物活性多肽或編碼其之多核苷酸作為藥學活性化合物之藥學組成物。該藥劑可以治療有效劑量，治療具有各種疾病或病症之人類或動物。該藥劑可根據所欲應用之目的，以各種技術配製。本發明之不同態樣的藥劑在下文中明確說明。
態樣中，該藥劑包含本發明之生物活性神經毒素多肽以及一或多種藥學上可接受之載劑之藥學組成物。該藥學上可接受之載劑，就與其它配方成份相容以及不會對其賦形劑有害之情況而言，必須係可接受的。所使用之藥
學載劑可包括固體、凝膠或液體。固體載劑之例子為乳糖、石膏粉、蔗糖、滑石、明膠、瓊脂、果膠、阿拉伯樹膠、硬脂酸鎂、硬脂酸等等。液體載劑之例子為甘油、磷酸鹽緩衝液、水、乳狀液、各種類型之潤濕劑等等。適合的載劑包含該等以上所提及者以及其它業界熟知者，見，如Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Easton,Pennsylvania。應了解，載劑亦可為適合基因療法之病毒或逆轉錄病毒，特別是假如該藥劑之活性成份係本發明之多核苷酸。
在一態樣中，該藥劑在投與之前可溶於稀釋液中。該稀釋液之選擇應為不會影響該組合之生物活性者。此稀釋液之例子係蒸餾水或生理食鹽水。此外，該藥學組成物或配方亦可包括其它載劑或無毒性、無治療性或無致免疫性之安定劑等等。因此，在一態樣中，本發明之神經毒性多肽可以液體或凍晶形式存在。在一態樣中，其可與甘油、蛋白安定劑(HSA)或非蛋白安定劑，諸如聚乙烯吡咯烷酮、玻璃酸或游離胺基酸一起存在。於一態樣中，適合的非蛋白質的安定劑揭示於WO 2005/007185或WO 2006/020208中。
於另一態樣中，該藥劑可以包含神經毒素多肽之溶液形式提供。此外，該溶液亦可包含以上所指之載劑或安定劑。於一態樣中，可提供如美國專利案第7,211,261號所揭示之適合的液體配方之神經毒素多肽。
於一態樣中，該藥學組成物可局部投與。取決於
所欲的醫療適應症，該藥劑慣常地經肌肉內或皮下(接近腺體)投與。然而，根據化合物之本質以及作用模式，該藥學組成物亦可經其它途徑投與。
治療有效劑量意指，本發明之神經毒素多肽或多核苷酸可預防、減輕或治療伴隨在此說明書中所指之病況或疾病之症狀所需之數量。該化合物之治療效率以及毒性，可在細胞培養液或實驗動物中，用標準藥學程序測定，如，ED50(對該群之50%具治療效率之劑量)以及LD50(對該群之50%具致死性之劑量)。治療以及毒性作用之劑量比係治療指數，其可以LD50/ED50之比率表示。在一態樣中，本發明之藥劑包含開藥者之劑量建議或使用者說明，以便根據個別接受者預先做劑量調整。
為了治療或減輕或預防在此說明書中所述之疾病或病況，在此所指之藥劑開發成至少投與一次。然而，該藥劑可投與超過一次。
在本發明之另外的態樣中，如本發明之藥劑除了生物活性神經毒素多肽外，可包含在其配製期間加至該藥學組成物之藥物。
，本發明有關本發明之多核苷酸或多肽於製備用於治療下列之藥劑之用途：傷口癒合、骨頭以及韌帶斷裂治療之固定、手術後固定，特別是和痔瘡切除手術有關、植入牙齒植入物、髖關節置換(內假體)、上髁炎、膝關節置換手術、眼科手術、痤瘡、激躁性結腸症、陰道痙攣、下背痛或良性前列腺增殖。
與以上提及之醫療病況或疾病相關之症狀係熟悉此技藝之人士熟悉的，且敘述在醫學之標準教課書中，諸如Stedman或Pschyrembel。
再者，本發明亦有關本發明之多核苷酸或多肽在診斷藥劑之製備上之用途，其用於測定是否一個體適合神經毒素治療。
以上所指之診斷藥劑係如上所指之神經毒素多肽藥劑。然而，該藥劑施用之時間以及給藥方案，僅容許決定是否一個體對神經毒素多肽有反應或決定適合的劑量方案。因為以上之神經毒素多肽-雖然亦具有治療潛力-在此態樣中關鍵用於診斷目的，而不是用於治療或減輕，所以包含其之藥劑稱作“診斷藥劑”。因此，這樣一個利用本發明之修飾的神經毒素多肽之受時間限制的預篩選，可幫助選擇可使用未修飾的神經毒素治療之個體以及決定適合的劑量。由於本發明之修飾的神經毒素多肽所誘發之減短的生物作用持續時間，所以可減少正常情況下會持續一段長時間之未修飾神經毒素為基礎的治療法之可能的副作用。
本發明涵蓋用於製造由本發明之多核苷酸編碼之神經毒素多肽之方法，包含下列步驟：a)在容許由本發明之多核苷酸編碼之神經毒素多肽表達之條件下，培養本發明之宿主細胞，以及b)從a)之宿主細胞培養物中獲得由本發明之多核苷酸編碼之神經毒素多肽。
在一態樣中，該多肽可經由所有的習用純化技術從該培養物獲得，包括親和性色層分析法、離子交換色層分析法、尺寸排除色層分析法、高壓液態色層分析法(HPLC)以及包括抗體沈澱之沈澱技術。在另一態樣中，可獲得包含神經毒素多肽錯合蛋白外之錯合形式之神經多肽。此外，在一態樣中，在此使用之獲得，包括活化該神經毒素多肽。此可藉由下列達成：在細胞中經內源性或外源性(如，重組表達的)蛋白酶蛋白水解打斷(單鏈)神經毒素多肽前趨物，或在以上所述之純化之前、期間或之後，在容許斷裂之條件下，於細胞外用該蛋白酶接觸該神經毒素多肽。
再者，根據本發明可預期一種用於製造藥劑之方法，該方法包含本發明以上所述之方法之步驟以及另外配製由本發明之多核苷酸編碼之神經毒素多肽成為藥劑之步驟。
當然，為了確保品質、藥學安定性以及藥劑之效率，此用於製造藥劑之方法係根據藥物GMP標準。該藥劑之適合的配方在此說明書之其它地方說明。然而，熟悉此技藝之人士當知道如何製造此配方。
本發明亦包含用於製造化妝品組成物之方法，其包含本發明之方法之步驟以及另外配製該神經毒素多肽為化妝品組成物之步驟。
在此使用之“化妝品組成物”之配製以及用途如以上所述之藥學組成物。在化妝品組成物方面，相似的，在一態樣中預期使用實質上純的形式之本發明化合物。然
而，雜質之標準沒有藥劑嚴苛。在另外的態樣中，化妝品組成物係肌肉內施用。於本發明之甚至另外的態樣中，包含該神經毒素之化妝品組成物可配製成抗皺劑。
本發明亦有關此一化妝品組成物以及本發明之多核苷酸或多肽於製備用作抗皺劑之化妝品組成物之用途。
所有在此說明書中引述之參考文獻之全部內容以及在此說明書中特定提及之內容均在此併入本案以為參考。
圖1：攜帶MDM2結合模體之修飾的肉毒桿菌神經毒素。說明具有針對E3連接酶MDM2之結合模體插在肉毒桿菌神經毒素輕鏈以及重鏈之間之修飾的肉毒桿菌神經毒素，從N-至C-端包含肉毒桿菌神經毒素輕鏈、MDM2結合模體、包含蛋白酶斷裂位置之連結子以及肉毒桿菌神經毒素重鏈。該肉毒桿菌神經毒素輕鏈以及重鏈經雙硫橋互連。
圖2：MDM2結合模體之介紹。如圖1中所示，在肉毒桿菌神經毒素輕鏈以及重鏈之間插入針對E3連接酶MDM2之結合模體，使得E3連接酶MDM2能夠辨識以及結合至因此修飾的肉毒桿菌神經毒素，導致指出的周圍表面露出的離胺酸殘基泛素化，以及該泛素化肉毒桿菌神經毒素更快速的被細胞蛋白酶體系統降解。例示說明的是MDM2結合一致模體XXFXXXWXXIXX(序列辨識編號
43，“X”代表任何天然發生的胺基酸)。
圖3：BoNT/E-MDM2突變體之產生以及生物活性持續時間之分析。顯示BoNT/E-MDM2突變體在小鼠之額葉皮質細胞中之生物活性持續時間上，與非突變BoNT/E-MDM2(序列辨識編號52)相比較之結果。指出分別經離胺酸取代之對應的胺基酸殘基。結果，其中輕鏈中之(i)Q53、N72、N378、N379、R394以及T400(序列辨識編號57)、(ii)Q53、N378以及N379(序列辨識編號58)、(iii)N72、N378以及N379(序列辨識編號61)或(iv)N378、N379以及T400(序列辨識編號75)已經離胺酸殘基取代之BoNT/E-MDM2突變體，在皮質神經元上顯示出減短的生物作用。因此，在BoNT/E-MDM2神經毒素中指定位置處引入離胺酸殘基，導致皮質神經元中突變輕鏈更快降解。相反地，在輕鏈中許多其它測試胺基酸取代以及其等之組合，在神經毒素之生物活性上沒有顯示出作用。縮寫“n.d.”意指(尚)未測出。
圖4：利用蛋白酶斷裂活化純化的BoNT/E-MDM2(序列辨識編號52)。依照範例2，用凝血酶打斷純化的單鏈BoNT/E，移除該蛋白酶，然後用SDS-PAGE以及Commassie染色分析活化的BoNT/E。第1道：純化的單鏈BoNT/E-MDM2；第2道：活化的BoNT/E-MDM2；第3道：活化的BoNT/E-MDM2，凝血酶移除的。
圖5：BoNT/E-MDM2(序列辨識編號52)與重組野生型BoNT/E(rWT)(序列辨識編號82)在額葉皮質神經元上之
比較。用相等劑量的rWT(序列辨識編號82)以及BoNT/E-MDM2(序列辨識編號52)培育額葉皮質神經元。在規定的時間點，分析斷裂的對總SNAP-25之比例，此係神經細胞中輕鏈出現之程度。
圖6：BoNT/E-MDM2(序列辨識編號52)與重組野生型BoNT/E(序列辨識編號82)在趾伸展評分法(DAS)分析法中之比較。將相等劑量之rWT(序列辨識編號82)以及BoNT/E-MDM2(序列辨識編號52)注射進入小鼠之腓腸肌中，然後在DAS分析法中分析麻痺狀況。
圖7：利用蛋白酶斷裂活化純化的BoNT/E-MDM2(序列辨識編號80)。依照範例6，用凝血酶消化單鏈BoNT/E，移除該蛋白酶，然後用SDS-PAGE以及Coomassie染色分析活化的BoNT/E。第1道：純化的單鏈BoNT/E-MDM2；第2道：活化的BoNT/E-MDM2；第3道：活化的BoNT/E-MDM2，凝血酶移除的。
圖8：BoNT/E-MDM2(序列辨識編號80)與重組野生型BoNT/E(序列辨識編號82)在Foto趾伸展評分法(DAS)分析法中之比較。將相等劑量之rWT(序列辨識編號82)以及BoNT/E-MDM2(序列辨識編號80)注射進入小鼠之腓腸肌中，然後於Foto-DAS分析法中分析麻痺情況。與DAS分析法(見圖5)相反，在此分析法中之結果以1-注射掌之寬對長之比的差顯示。
現在將以下列範例說明本發明，然而，其等不應被解釋為本發明範疇之限制。
基因合成攜帶序列辨識編號32中所示之MDM2結合模體“LTFEHNWAQLTS”之肉毒桿菌神經毒素類型E(BoNT/E)之編碼序列，且次選殖進入添加C端純化標籤(如，組胺酸標籤)之大腸桿菌載體。在大腸桿菌BL21中，使用LB培養基在16℃下歷時24個小時，表達該蛋白(具序列辨識編號52中所示之胺基酸序列，BoNT/E-MDM2)。使用3步驟色層分析操作程式純化表達的神經毒素(如，使用C端親和性標籤(諸如組胺酸標籤)之親和性色層分析、離子交換色層分析和/或尺寸排除色層分析)。之後利用使用C端蛋白酶斷裂位置(如，凝血酶斷裂位置)之蛋白酶斷裂移除該標籤，以及用SDS-PAGE分析該蛋白之純度。
用生物素化凝血酶，在20℃ O/N下培育具序列辨識編號52所示，在輕與重鏈間之連接子中攜帶凝血酶斷裂位置之胺基酸序列之純化的肉毒桿菌神經毒素(見範例1)。利用親和性色層分析(如，用鏈親和素瓊脂糖培育)移除生物素化凝血酶，然後用SDS-PAGE，接著Coomassie染色(見圖4)以及免疫墨點法分析活化的毒素。藉由使用供抓取之兔子抗BoNT/E抗體以及供檢測之天竺鼠抗BoNT/E抗體之ELISA，測定活化的神經毒素之最後濃度。強度測試使
用偏側膈分析法(HDA)進行。
從第15-16天小鼠胚胎中收集額葉皮質組織。令細胞懸浮於NeurobasalTM培養基中，密度0.5x106個細胞/mL，然後取2000μL種在6孔培養皿上。培養物在37℃下，4%CO2空氣中培育3.5周。用5-氟-2’去氧尿苷(25μM)以及尿苷(63μM)處理該培養物，以防止進一步的神經膠質增生。之後用10pM之野生型BoNT/E(序列辨識編號82)或含有MDM2辦識模體之BoNT/E(序列辨識編號52；範例2)處理該培養物，確實地歷時18個小時，然後用條件細胞培養液清洗。在此時間點，以及3天、7天、10天、14天以及21天後，收集細胞，然後使用小鼠單株抗體(Synaptic Systems #111111)，測定西方墨點法中斷裂的對總SNAP25之比率。發現，用含有MDM2辨識模體之BoNT/E(序列辨識編號52)處理之細胞培養物中之斷裂比率，到達50%比率之時間(t50)約比野生型BoNT/E(序列辨識編號82)短25%；見圖5。此顯示在神經元細胞中輕鏈之持久性減少25%，其證實了生物作用持續時間減少25%。
在趾伸展分析法(DAS)(Aoki,2001 Toxicon.(12)：1815-20)中分析範例2中所述之BoNT/E-MDM2(序列辨識編號52)。將相等劑量之野生型以及包含MDM2模體之突變BoNT/E，注射進入10隻小鼠之腓腸肌中。依照Aoki 2001 Toxicon(12)：1815-20中所述之比例尺評分該等小鼠。
用BoNT/E-MDM2(範例2，序列辨識編碼52)處理之小鼠的恢復時間，比野生型BoNT/E(序列辨識編號82)減短約20%；見圖6。
基因合成如序列辨識編號78所示之攜帶MDM2結合模體“LTFEHNWAQLEN”之肉毒桿菌神經毒素類型E(BoNT/E)之編碼序列，然後次選殖進入添加C端純化標籤(如，組胺酸標籤)之大腸桿菌表達載體中。在大腸桿菌BL21中，使用LB培養基，在16℃下歷時24個小時，表達該蛋白(具序列辨識編號80所示之胺基酸序列，BoNT/E-MDM2)。使用3步驟色層分析操作程式純化表達的神經毒素(如，使用C端親和性標籤(諸如，組胺酸標籤)之親和性色層分析、離子交換色層分析和/或尺寸排除色層分析)。之後利用使用C端蛋白酶斷裂位置(如，凝血酶斷裂位置)之蛋白酶斷裂移除該標籤，以及用SDS-PAGE分析該蛋白之純度。
用生物素化凝血酶，在20℃ O/N下培育具序列辨識編號80所示，在輕與重鏈間之連接子中攜帶凝血酶斷裂位置之胺基酸序列之純化的肉毒桿菌神經毒素。利用親和性色層分析(如，用鏈親和素瓊脂糖培育)移除生物素化凝血酶，然後用SDS-PAGE，接著Coomassie染色(見圖7)以及免疫墨點法分析活化的毒素。藉由使用供抓取之兔子抗BoNT/E抗體以及供檢測之天竺鼠抗BoNT/E抗體之
ELISA，測定活化的神經毒素之最後濃度。強度測試使用偏側膈分析法(HDA)進行。
從第15-16天小鼠胚胎中收集額葉皮質組織。令細胞懸浮於NeurobasalTM培養基中，密度0.5x106個細胞/mL，然後取2000μL種在6孔培養皿上。培養物在37℃下，4%CO2空氣中培育3.5周。用5-氟-2’去氧尿苷(25μM)以及尿苷(63μM)處理該培養物，以防止進一步的神經膠增生。之後用10pM之野生型BoNT/E(序列辨識編號82)或含有MDM2辦識模體之BoNT/E(序列辨識編號80；範例6)處理該培養物，確實地歷時18個小時，然後用條件細胞培養液清洗。在此時間點，以及3天、7天、10天、14天以及21天後，收集細胞，然後使用小鼠單株抗體(Synaptic Systems #111111)，測定西方墨點法中斷裂的對總SNAP25之比率。發現，用含有MDM2辨識模體之BoNT/E(序列辨識編號80)處理之細胞培養物中之斷裂比率，到達50%比率之時間(t50)約比野生型BoNT/E(序列辨識編號82)短25%。此顯示在神經元細胞中輕鏈之持久性減少25%，其證實了生物作用持續時間減少25%。
在DAS分析法之稍做修改的設定中(見[0071])，該評分以計算1-注射的掌之寬對長之比之間的差取代。用BoNT/E-MDM2(範例6，序列辨識編號80)處理之小鼠的恢復時間，與野生型BoNT/E(序列辨識編號82)相比減短約
25%；見圖8。
二個不同的BoNT/E-MDM2多肽(序列辨識編號52以及序列辨識編號80)之產生已述於範例1與5中。接著，利用BoNT/E輕鏈之三維結構之分析，鑑定空間上位在MDM2辨識模體附近之BoNT/E輕鏈中露出的胺基酸殘基。在此所使用之“露出的胺基酸殘基”，意指位在BoNT/E輕鏈之表面的胺基酸殘基，而該胺基酸殘基之側鏈不涉及分子內交互反應。該露出的胺基酸殘基已經過分子動態(MD)模擬以及溶劑可及表面積(SASA)之計算的鑑定。SASA值高於60%(大部分)選作為特定截留值。如圖3所示，鑑定的位置之露出的胺基酸殘基，已藉由使用QuikChangeTM突變套組以及為此目的設計之專一性引子對，進行以離胺酸殘基交換之定點突變。已完成該鑑定的露出胺基酸殘基中不涉及分子內交互反應之離胺酸殘基之取代，因為E3連接酶，包括MDM2，在離胺酸殘基處泛素化其等之基質。為此目的，該E3連接酶先結合至該基質中之E3連接酶結合模體，如在此所述之BoNT/E-MDM2蛋白中之MDM2結合模體，之後“檢測”在空間上接近該基質中之結合模體中之離胺酸(其可經泛素分子修飾)。據此，在包含MDM2 E3連接酶結合模體之本發明神經毒素多肽之輕鏈中引入額外的離胺酸殘基，會增加蛋白酶體降解之效率。所產生的DNA結構體已經轉形至大腸桿菌表達株(BL21)，且已表達出因此修飾之重組肉毒桿菌神經毒素。透過親和
性色層分析(如，組胺酸標籤)、離子交換色層分析和/或尺寸排除色層分析，從大腸桿菌細胞水解物中純化出突變的重組肉毒桿菌神經毒素。該突變的神經毒素已經過使用蛋白酶凝血酶之蛋白水解斷裂活化，之後移除該蛋白酶。接下來，因此純化以及活化之突變的神經毒素經如之後範例中所示之分析。
為此目的，依範例3之指示，建立小鼠額葉皮質細胞之細胞培養。用20 pM BoNT/E-MDM2(序列辨識編號52)以及各別的BoNT/E-MDM2突變體(見圖3)，處理6孔培養皿中之1 x 106個細胞，歷時18個小時。18個小時、3天、7天、10天、14天以及21天後，分離檢體，然後利用西方墨點法，使用會辨識SNAP-25以及被BoNT/E打斷之SNAP-25之抗體(Synaptic Systems # 111111)分析。斷裂的對未斷裂的SNAP-25之比率，取做為額葉皮質細胞中肉毒桿菌神經毒性之輕鏈中生物活性之濃度的。結果發現，與BoNT/E-MDM2相比，蛋白水解活性以及因此BoNT/E-MDM2突變體輕鏈之濃度減低顯著地更快；見圖3。特別是，其中輕鏈中之(i)Q53、N72、N378、N379、R394以及T400(序列辨識編號57)、(ii)Q53、N378以及N379(序列辨識編號58)、(iii)N72、N378以及N379(序列辨識編號61)或(iv)N378、N379以及T400(序列辨識編號75)已經離胺酸殘基取代之BoNT/E-MDM2突變，在皮質神經元上顯示減
短的生物作用。之後，BoNT/E-MDM2神經毒素中引入離胺酸殘基，會導致皮質神經元中突變輕鏈更快的降解。相反的，輕鏈中許多其它的測試胺基酸取代以及其等之組合，在神經毒素之生物活性的持續時間上沒有顯示出作用。
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<213> 人工合成序列
<220>
<223> 連接酶辨識模體
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<212> PRT
<213> 人工合成序列
<220>
<223> 連接酶辨識模體
<400> 46
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工合成序列
<220>
<223> 連接酶辨識模體
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<212> PRT
<213> 人工合成序列
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<223> 連接酶辨識模體
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<222> (2)..(2)
<223> Xaa可為任何天然發生的胺基酸
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<212> PRT
<213> 人工合成序列
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<223> 連接酶辨識模體
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<222> (5)..(6)
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<212> PRT
<213> 人工合成序列
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<223> 連接酶辨識模體
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<222> (3)..(3)
<223> Xaa可為任何天然發生的胺基酸
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<212> PRT
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<213> 人工合成序列
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<223> 連接酶辨識模體
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<212> DNA
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<212> PRT
<213> 人工合成
<220>
<223> 具MDM2結合模體之重組蛋白BONT/E
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<212> DNA
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<212> PRT
<213> 肉毒桿菌
<400> 82
Claims (18)
- 一種編碼在個體中展現減短的生物作用持續時間之神經毒素多肽之多核苷酸，其中該多肽在輕鏈中包含至少一種E3連接酶辨識模體，其中該E3連接酶辨識模體係針對E3連接酶MDM2之結合模體，其中該神經毒素多肽之該輕鏈係從包含擇自於由下列所構成之群組之核酸序列之多核苷酸編碼之輕鏈修飾而得：a)具有序列辨識編號1、3、5、7、9、81、11、13或15中所示之核苷酸序列之核酸序列；b)編碼具有序列辨識編號2、4、6、8、10、82、12、14或16中所示之胺基酸序列之多肽之核酸序列；以及c)與a)或b)之核酸序列至少40%一致之核酸序列。
- 如申請專利範圍第1項之多核苷酸，其中該針對E3連接酶MDM2之結合模體係擇自於由下列所構成之群組：ETFSDLWKLLPE(序列辨識編號26)、TSFAEYWNLLSP(序列辨識編號27)、LTFEHYWAQLTS(序列辨識編號28)、LTFEHWWAQLTS(序列辨識編號29)、LTFEHSWAQLTS(序列辨識編號30)、ETFEHNWAQLTS(序列辨識編號31)、LTFEHNWAQLTS(序列辨識編號32)、LTFEHWWASLTS(序列辨識編號33)、LTFEHWWSSLTS(序列辨識編號34)、 LTFTHWWAQLTS(序列辨識編號35)、ETFEHWWAQLTS(序列辨識編號36)、LTFEHWWSQLTS(序列辨識編號37)、LTFEHWWAQLLS(序列辨識編號38)、ETFEHWWSQLLS(序列辨識編號39)、MPRFMDYWEGLN(序列辨識編號41)、SQETFSDLWKLLPEN(序列辨識編號42)和/或LTFEHNWAQLEN(序列辨識編號78)。
- 如申請專利範圍第1或2項之多核苷酸，其中該生物作用會引起該個體之肌肉麻痺。
- 如申請專利範圍第1或2項之多核苷酸，其中該減短的持續時間在該個體，較佳地人類，中短於5、4、3、2週或短於1週。
- 如申請專利範圍第1或2項之多核苷酸，其中該多核苷酸包含擇自於由下列所構成之群組之核酸序列：a)具有序列辨識編號51或79中所示之核苷酸序列之核酸序列；b)編碼具有序列辨識編號52或80中所示之胺基酸序列之多肽之核酸序列；以及c)與a)或b)之核酸序列至少40%一致之核酸序列。
- 一種載體，其包含如申請專利範圍第1至5項中任一項之多核苷酸。
- 一種宿主細胞，其包含如申請專利範圍第1至5項中任一項之多核苷酸或如申請專利範圍第6項之載體，其中該 宿主細胞係原核細胞、動物細胞株之細胞或真菌細胞。
- 如申請專利範圍第7項之宿主細胞，其中該原核細胞係大腸桿菌細胞或梭菌屬或芽孢桿菌屬細胞。
- 一種多肽，其由如申請專利範圍第1至5項中任一項之多核苷酸編碼。
- 如申請專利範圍第9項之多肽，其在該神經毒素多肽之輕鏈上進一步包含至少一個離胺酸之胺基酸取代。
- 如申請專利範圍第9或10項之多肽，其包含擇自於由下列所構成之群組之序列辨識編號52的胺基酸取代中之至少一者：Q53K、N72K、N378K、N379K、R394K以及T400K。
- 一種抗體，其會專一性結合至如申請專利範圍第9、10或11項之多肽，其中該抗體不會與下列交互反應：(i)沒有攜帶針對該E3連接酶MDM2之結合模體的未修飾之神經毒素多肽及(ii)該E3連接酶MDM2。
- 如申請專利範圍第1或2項之多核苷酸，其供用作為藥劑。
- 如申請專利範圍第9或10項之多肽，其供用作為藥劑。
- 如申請專利範圍第13項之多核苷酸，其中該藥劑係用於治療傷口癒合、骨頭以及韌帶(tendon)斷裂治療之固定、手術後固定，特別是和痔瘡切除手術(haemorrhoidectomy)有關、植入牙齒植入物、或髖關節置換(內假體)、上髁炎、膝關節置換手術(knee arthroplasty)、眼科手術、痤瘡、激躁性結腸症(irritable bowel disease)、陰道痙攣(vaginism)、下背痛或良性前列腺增殖。
- 如申請專利範圍第14項之多肽，其中該藥劑係用於治療傷口癒合、骨頭以及韌帶斷裂治療之固定、手術後固定，特別是和痔瘡切除手術有關、植入牙齒植入物、或髖關節置換(內假體)、上髁炎、膝關節置換手術、眼科手術、痤瘡、激躁性結腸症、陰道痙攣、下背痛或良性前列腺增殖。
- 一種用於製造由如申請專利範圍第1至5項中任一項之多核苷酸編碼之神經毒素多肽之方法，其包含下列步驟：a)在容許由如申請專利範圍第1至5項中任一項之多核苷酸編碼之神經毒素多肽之表達之條件下，培養如申請專利範圍第7或8項之宿主細胞，以及b)從a)之宿主細胞中獲得如申請專利範圍第1至5項中任一項之多核苷酸編碼之神經毒素多肽。
- 一種用於製造藥劑之方法，其包含如申請專利範圍第17項之方法之步驟以及另外之配製如申請專利範圍第1至5項中任一項之多核苷酸編碼之神經毒素多肽成為藥劑之步驟。
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