CN106432423B - 一种α-螺旋多肽及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种α‑螺旋多肽，其氨基酸序列结构为：或者本发明还公开了上述α‑螺旋多肽在制备抑制肿瘤干细胞生长活性药物中的用途。本发明采用了MDM2/MDMX双重抑制剂多肽PDI序列，以手性诱导α‑螺旋形成的方法，通过荧光偏振检测、免疫印迹分析、基因芯片分析、人源肿瘤异种移植模型等试验，证实PhR可以通过其穿膜性和良好的结合亲和力模拟p53‑MDM2/MDMX的相互作用，重新激活p53的凋亡通路并且消除恶性的CSC细胞。PhR是对MDM2和MDMX均有活性的一个高度有效的双重抑制剂，并可通过多肽侧链手性调控分子性质，抑制肿瘤生长。

Description

一种α-螺旋多肽及其用途
技术领域
本发明属于生物工程领域，涉及一种多肽，具体来说是一种α-螺旋多肽及其用途。
背景技术
癌症是世界上最难治愈的疾病之一。肿瘤干细胞(CSC)在肿瘤的发生发展中起着关键性作用，被认为与肿瘤的转移、抗药性的产生以及治疗后的复发有着密切关系。对于多数肿瘤，手术、化疗、放疗等手段仅可杀死一部分肿瘤细胞，但却无法杀灭肿瘤干细胞，从根本上治愈肿瘤。越来越多的研究正在投入抗CSC药物的开发，但由于CSC膜表面高表达耐药蛋白等性质,使得CSC形成自我保护和对现有的肿瘤药物高度耐受,是目前肿瘤治疗失败的主要原因之一。因此，其耐药性及药物递送是在发展的CSC治疗药物的主要障碍，并且缺乏合适的具有抗肿瘤干细胞活性和药理性质的化合物。
多肽结构稳定是一种用于约束短肽到固定的二级构象的技术，通常是α-螺旋结构。小分子药物由于其有限的相互作用的表面积，限制了靶向蛋白-蛋白相互作用(PPI)的可能性。多肽类药物相对于小分子的优势在于其分子作用面积更大更能形成复杂的构象，可以有效拓展靶向小分子的化学空间。所以自上世纪八十年代以来，化学家发展了一系列化学修饰的手段，将参与多种蛋白-蛋白相互作用的二级结构单元提取出来进行修饰，模拟原始蛋白-蛋白相互作用。
p53是一种非常重要的抑癌基因，它所产生的p53蛋白可通过诱导细胞周期停滞和细胞凋亡的功能，保护细胞在受到DNA损伤和细胞应激反应时免于恶性转化。MDM2或MDMX具有E3泛素连接酶的活性，是野生型p53的失活的主要因素。因此，破坏野生型p53和MDM2/MDMX之间的相互作用可能会释放并重新激活p53，为相应肿瘤的治疗提供了新思路。
小分子如nutlin-3a和RG7112由于其可靶向p53/MDM2相互作用的特性，被深入研究，然而它们针对MDMX几乎无效。Sawyer等人报道了小分子R-5963，可以有效地抑制p53结合到MDM2或MDMX。但是，其药理性质并不适合成药。近日，装订肽被应用于p53和MDM2/MDMX之间的相互作用，Verdine等人报道α-螺旋稳定的SAH-p53-8可在体外重新激活p53蛋白。
Sawyer等人报道了装订肽ATSP-7041，在体外和体内实验中发现对MDM2和MDMX均有活性的一个高度有效的双重抑制剂。尽管如此，针对肿瘤干细胞的研究刚刚起步，至今没有肽类药物对肿瘤干细胞的模型进行研究。
发明内容
针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种α-螺旋多肽及其用途，所述的这种α-螺旋多肽及其用要解决现有技术中的药物抗肿瘤的效果不佳的技术问题。
一种α-螺旋多肽，其氨基酸序列结构为
或者
其中，化合物结构式里面标出来的(R)指的是手性中心为R构型。
进一步的，所述的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或者SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了编码权利要求2所述的α-螺旋多肽的分离的核苷酸序列。
本发明还提供了上述的α-螺旋多肽在制备抑制肿瘤干细胞生长活性药物中的用途。
本发明还提供了上述的一种药物在制备抑制肿瘤干细胞生长活性药物中的用途。
本发明还提供了一种药物，其活性成分为上述的α-螺旋多肽。
本发明通过荧光偏振检测、免疫印迹分析、基因芯片分析、人源肿瘤异种移植模型等试验，证实PhR可以通过其穿膜性和良好的结合亲和力模拟p53-MDM2/MDMX的相互作用，重新激活p53的凋亡通路并且消除恶性的CSC细胞。PhR是对MDM2和MDMX均有活性的一个高度有效的双重抑制剂，并可通过多肽侧链手性调控分子性质，抑制肿瘤生长。
本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明提供了一种抑制肿瘤干细胞增殖的多肽，是MDM2/MDMX的双重抑制剂，是以多肽PDI序列LTFEHYWAQLTS为模板的衍生物，以手性诱导α-螺旋形成的方法制备而成。本发明具有对p53-MDM2/MDMX的靶向调节作用以及对肿瘤生长的抑制作用。
附图说明
图1为MeR的质谱表征图。
图2为PhR的质谱表征图。
图3为MeR、PhR的CD结果图，显示有良好的α-螺旋特征。
图4为5μM FITC标记的MeR、PhR在 37℃，孵育2h的穿膜性实验图。
图5为MCF-7细胞中，PhR与MDM2蛋白在细胞核内共定位。
图6为不同浓度Me(S/R)、Ph(S/R)针对p53野生型细胞(MCF-7和PA-1)和p53突变型细胞(MDA-231和skov3)以及普通细胞(HEK-293和QSG7701)的细胞生存能力的影响，其中，A为p53野生型细胞MCF-7；B为p53野生型细胞PA-1；C为p53突变型细胞(MDA-231和skov3)；D为普通细胞(HEK-293和QSG7701)。
图7为不同浓度与时间变化PhR(图A)、MeR(图B)处理PA-1细胞的亮视场图像。
图8为不同细胞系中p53和不同目标蛋白的转录水平变化图。其中A为MCF-7细胞中p53和MDM2,MDMX,MIC等目标蛋白的转录水平；B、C为MCF-7细胞中干性相关基因sox2、foxA2的转录水平；D、E为PA-1细胞中p53和MDM2,MDMX,MIC等目标蛋白的转录水平；F、G为PA-1细胞中干性相关基因sox2、foxA2的转录水平。
图9为MCF-7、PA-1细胞中MeR、PhR及nutlin-3a诱导的细胞凋亡作用。
图10为PhR诱导PA-1细胞凋亡为剂量依赖性。
图11为MeR、PhR及nutlin-3a在不同细胞系中表现出对细胞周期的影响。
图12为PhR通过与MDM2蛋白结合从而抑制p53泛素化。
图13为PhR导致的p53上调和诱导细胞凋亡的浓度依赖性方式。
图14为PhR导致的p53上调和诱导细胞凋亡的时间依赖性方式。
图15为在HCT-116细胞中，PhR处理的细胞中p53蛋白比nutlin-3a处理的细胞更快速积累。
图16为PhR与空白对照处理的PA-1细胞中，进行RNA的微阵列差异表达分析的基因热图。
图17为基因芯片分析揭示了PA-1细胞共285下调和93上调的基因。
图18为用PBS，nutlin-3a，PhR分别处理肿瘤小鼠，所得的肿瘤组织的图像。其中，PhR治疗效果最好。
图19为PhR和nutlin-3a治疗肿瘤小鼠Kaplan-Meier的生存曲线。
图20为瘤内注射PhR-Cy3后,在不同时间点的体内分布图像。
图21为瘤内注射PhR-Cy3 24小时后主要器官内的分布图像。
图22为治疗后的肿瘤组织切片在p53和p53相关蛋白水平的免疫组化分析。
图23为通过小鼠自发笼-轮运动测定小鼠的运动学习能力，来建模评估PhR毒性。
图24为经nutlin-3a，PhS、PhR 3周治疗后，肿瘤小鼠组织切片图。
图25为经PhR 3周治疗后，肿瘤小鼠不同器官切片图。
具体实施方式
下面通过实施例并结合附图对本发明内容做进一步阐述，但并不限制本发明的保护范围。本发明的各实施例中所用原料试剂若无特别说明均为市售。
实施例1：
MeR、PhR是MDM2和MDMX的双重抑制剂并表现出细胞核积聚
根据噬菌体展示技术发现MDM2/MDMX双重抑制剂多肽PDI序列LTFEHYWAQLTS，并且基于多肽穿膜性的考虑，将序列中4位的E突变为Q(PDI-1)，由此为模板设计模拟了一系列p53的稳定的α-螺旋肽序列。考虑到多肽侧链结构常常影响MDM2/MDMX结合的疏水口袋，保持作用位点的氨基酸不变，设计合成了一系列的i,i+4稳定构象的α-螺旋多肽(PDI 2-12)。如在不同位置的侧链构建，在手型位置替换不同侧链取代基的结构(Me或Ph)，以及在不同特定位点的氨基酸突变。
多肽的制备及分离纯化步骤：
(1)按照氨基酸序列(如SEQ ID NO.1或者2所示)固相合成多肽。
(2)将步骤(1)的产物经过thiol-ene反应获得2’碳手性侧链修饰的多肽化合物；该2’碳手性侧链偶联氨基酸的位置为i/i+4；
(3)通过固相关环反应，形成酰胺键，完成侧链关环，继续如步骤(1)固相合成多肽，而后将2’碳手性侧链修饰的多肽化合物从树脂上剪切下来，最终获得R型或者S型2’碳手性侧链修饰的多肽化合物；
合成路线如下所示：
化合物1是将多肽的羧基端连接非天然氨基酸。其中的天然氨基酸是由Fmoc(芴甲氧羰基)保护的固相接肽完成，所述非天然氨基酸(简称为S5[R1])的结构式如下：所述非天然氨基酸可通过固相接肽连接到树脂上，其中R1为甲基或苯基。
化合物2，是由化合物1与半胱氨酸(Fmoc-Cys-OH)及其衍生物进行反应而得。反应条件设定为：取化合物1 0.5mmol，加入光引发剂MAP:4-methoxyacetophenone,MMP:2-hydroxy-4’-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone各1.0mmol，Fmoc-Cys-OH衍生物5.0mmol，然后加入20ml DMF作溶剂，Ar保护于365nm紫外光下反应1小时，滤掉反应液洗涤，并重复该光反应三次，产率达到90％以上，即可得化合物2。
将上一步得到的化合物2加入到10ml DMF中，加入PyBOP,HATU,NMM,在N2鼓泡的条件下反应4h,滤掉反应液，用DMF和DCM交替洗涤3次，接下来用25％的吗啡啉脱除Fmoc-保护基，即得到关环的多肽树脂3。
多肽树脂3进一步通过脱除氮末端的Fmoc-保护基团，得到化合物4。化合物4再进行乙酰化，然后加入10ml三氟乙酸(TFA)/三异丙基硅烷(TIS)/水(H2O)(9.5：0.25：0.25体积/体积)的剪切液中反应3h，用氮气将剪切液吹干，10ml乙醚/正己烷(4:1)沉淀；HPLC纯化，冻干，得到干净的化合物5(S/R)，即2’碳手性侧链修饰的多肽化合物。值得指出的是，化合物5包含一对手型异构体，此文保护的化合物为化合物5中HPLC保留时间较长的一个化合物，即5R(PhR)。
对于每种肽，它具有两个非对映异构体(S/R)，所得到的环状非对映体通过HPLC分离。纯化的肽通过ESI/LC-MS检测,且保留时间长的化合物为R构型的异构体。合并纯馏分，然后冷冻干燥。对所有多肽化合物进行了表征，MeR、PhR的质谱表征图如图1、2，并通过CD测定发现MeR、PhR具有更好的一个螺旋性(图3)，证明这一手性硫醚侧链可以稳定多肽的alpha螺旋二级结构。
采用荧光偏振测定法用于测量的FITC标记的肽和GST标记的MDM2/MDMX蛋白之间的结合亲和力。将FITC标记的肽(10-20nM)在缓冲液(140mM的NaCl，50mM，Tris pH 8.0)与MDM2或MDMX蛋白在室温下孵育1h。荧光偏振实验在96孔板(Perkin Elmer Optiplate-96F)上进行,多肽的浓度根据FITC的494nm的吸收波长来确定。
表1中显示了所有合成多肽化合物的序列以及与MDM2/MDMX蛋白结合的Kd值。
同时，采用共聚焦显微镜和共定位分析，将PA-1细胞(或MCF-7细胞)用DMEM在含10％FBS(v/v)，37℃，5％CO2的条件下培养，达到80％饱和。首先将FITC标记的肽溶解于DMSO中，制成1mM储备，然后以5μM的最终浓度添加到细胞中。将细胞在37℃下孵育1h。PBS洗涤3次，用4％的甲醛(Alfa Aesar,MA)上在PBS摇匀10分钟。再用PBS洗涤3次，并用1μg/ml4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，Invitrogen公司，CA)染色5分钟，用共聚焦显微镜(PerkinElmer)观察多肽穿膜性和结合亲和力。
结果表明MeR、PhR均可穿膜(图4、5)，并且对MDM2/MDMX蛋白的结合亲和力最强。
实施例2：
MeR、PhR在癌细胞中激活p53信号
抑制p53蛋白和它的负调控蛋白MDM2和MDMX结合，是稳定和激活p53蛋白的途径。p53通路的激活仅发生在表达野生型p53蛋白的细胞中，而非p53突变体形式的细胞。为了评估上述实施例1中合成的MeR、PhR的活性，选择了过表达MDM2(PA-1卵巢畸胎瘤)或MDMX(MCF-7乳腺癌)的两种癌细胞系作为代表。同时，选择两种突变型p53的细胞系(SKOV3和MDA-231)排除MeR和PhR的非特异性毒性。以及两个正常细胞系(HEK293和QSG7701)，并采取相同的多肽处理方式以排除细胞毒作用。实验采用细胞生存实验检测IC50，nutlin-3a选择作为阳性对照。
细胞活力通过MTT测定法(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylt-etrazolium bromide,Sigma)。细胞在96孔板以5×103细胞密度接种，分别与p53肽和nutlin-3a在无血清培养基中孵育4小时，随后更换血清，再孵育44小时。将MTT(5mg/mL,20μL，PBS)加入培养基后，在37℃，5％CO2条件下温育4小时。然后加入DMSO(二甲基亚砜，150μL,Sigma)温和摇动5分钟以溶解沉淀物。采用酶标仪(Bio-Rad公司)在490nm波长测定吸光度。由实验组样品获得的吸光度比空白组的吸光度，并表示为百分比形式，其中未处理的细胞存活率为100％。
结果发现，如图6、7，只有MCF-7和PA-1细胞具有明显的细胞增殖抑制以及时间和浓度依赖性，且细胞毒作用可以忽略不计。这些结果证明了在野生型p53细胞系和正常细胞系的肽MeR和PhR的靶特异性。其中，非对映异构体MeS/PhS用作对照，发现细胞处理前后无明显变化。因此，多肽非对映体之间的功能差异清楚地表明了维持稳定二级结构的重要性。我们的手性诱导多肽螺旋(CIH)方法为研究肽的功能和结构之间的关系，提供了一个理想的平台。
细胞的蛋白和mRNA表达水平可以用来评估CIH多肽的生物活性。将PA-1和MCF-7细胞在6孔板中接种，分别用MeR、PhR和nutlin-3a中处理48小时。然后提取总RNA(提取使用TRIzol试剂(Invitrogen公司))和并定量(Nano-Drop ND-2000)。上述总RNA(2μg)通过逆转录酶成cDNA(Promega)，靶基因mRNA水平实时荧光定量PCR使用SYBR green(Promega)定量，在ABI棱镜7500实时PCR系统(Applied Biosystems)进行。使用的引物在表1中列出。
Primer name Sequence(5’-3’)
Foward-P53 GGAGCACTAAGCGAGCACTG(SEQ ID NO.3)
Reverse-P53 TATGGCGGGAGGTAGACTGA(SEQ ID NO.4)
Foward-MDM2 GGGCTTTGATGTTCCTGATT(SEQ ID NO.5)
Reverse-MDM2 CTTTGTCTTGGGTTTCTTCC(SEQ ID NO.6)
Foward-MDMX CATTTCGGCTCCTGTCGTTA(SEQ ID NO.7)
Reverse-MDMX GTTCCCGTCTCGTGGTCTTT(SEQ ID NO.8)
Foward-MIC1 AGTTGCGGAAACGCTACGAG(SEQ ID NO.9)
Reverse-MIC1 GGAACAGAGCCCGGTGAAGG(SEQ ID NO.10)
Foward-Sox2 GTGAGCGCCCTGCAGTACAA(SEQ ID NO.11)
Reverse-Sox2 GCGAGTAGGACATGCTGTAGGTG(SEQ ID NO.12)
Foward-FoxA2 CCCCAACAAGATGCTGACGC(SEQ ID NO.13)
Reverse-FoxA2 GCGAGTGGCGGATGGAGTT(SEQ ID NO.14)
Foward-beta Actin TCCAGCCTTCCTTCTTGGGTATG(SEQ ID NO.15)
Reverse-beta Actin GAAGGTGGACAGTGAGGCCAGGAT(SEQ ID NO.16)
通过免疫印迹分析监测p53和MDM2和MDMX表达水平(如图8)值得注意的是，经过MeR、PhR处理后，p53的表达量上调。相反，其非对映异构体S对肿瘤细胞的mRNA表达水平则无明显影响。p53基因在PA-1和MCF-7细胞中的激活指标是通过诱导三个p53目标基因，MDM2，MDMX，和MIC-1的mRNA表达水平来实现。实际上，CSC抑制的直接证据也是来自部分干性基因SOX2下调和分化基因FOXA2的上调。实验发现，通过PhR处理细胞后，p53的活化作用导致分化基因FOXA2上调和干性基因SOX2的下调，这进一步表明，在CSC细胞的增殖中p53的失活起到了重要作用。因此，MeR、PhR可以在癌细胞中激活p53信号。
实施例3：
过表达MDM2/MDMX的肿瘤细胞中重新激活部分p53的细胞功能
1、CIH多肽对细胞凋亡作用的影响
肿瘤抑制基因p53具有许多细胞功能，其中最重要的就是诱导细胞凋亡和细胞周期的停滞。用CIH多肽(40μM)或nutlin-3a(5μM)分别处理PA-1和MCF-7细胞48h，采用Annexin-V/PI测定法(BDPharmingenTM)用于量化MeR和PhR的细胞凋亡作用。将细胞收集，并用冷PBS洗涤两次，悬浮在缓冲液中。细胞凋亡过程中使FITC标记在Annexin-V与磷脂酰丝氨酸(PS)的结合上，细胞核用碘化丙啶(PI)染色。染色细胞通过流式细胞术分析来区分凋亡细胞。同时具有FITC和PI荧光信号强度的细胞代表凋亡细胞计数。而细胞凋亡的程度通过将细胞暴露于caspase-3特异性底物(癌基因)来测定caspase-3的活性。底物裂解后的荧光由Spectramax M5酶标仪(Molecular Devices公司)测定。
caspase-3活性测定结果表明，PhR诱导PA-1细胞凋亡为剂量依赖性(图10)。nutlin-3a只在低剂量时诱导最小的细胞凋亡，而剂量增加(>5μM)，并没有检测到caspase-3活性。这些结果表明nutlin-3a杀死癌细胞是部分通过非特异性的细胞毒性，而不是全部通过p53的活化途径导致的细胞凋亡。实验结果如图6，PhR比MeR和nutlin-3a具有更显著的细胞凋亡作用。
2、CIH多肽对细胞周期的影响
对于细胞周期阻滞实验，采用流式细胞术分析，将癌细胞与多肽及阳性对照nutlin-3a先经48小时处理。接着，将细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤两次，并通过胰蛋白酶消化收获。将细胞用冷70％乙醇固定4小时，然后以2000rpm的转速离心5分钟，以除去乙醇。然后将固定的细胞分散于加入1％的Triton-100的PBS溶液中，1mg/mL RNA酶和5mg/mL的PI，在37℃下染色30分钟。使用FACS Calibur的流式细胞仪(Becton Dickinson公司，Mississauga，CA)上分析样品。细胞处在生长的G1，S和G2的时期由FlowJo软件确定。
结果显示在MCF-7细胞中，nutlin-3a被报道易造成深刻G0/G1期的细胞周期阻滞，而PhR表现出对细胞不同时期的影响(图11)。表明PhR通过异构机制的p53途径激活细胞功能。值得一提的是，PhR不能诱导在正常细胞系QSG-7701下的细胞周期阻滞，进一步表明PhR比小分子抑制剂nutlin-3a的毒性小。
3、CIH多肽对p53蛋白泛素化和蛋白酶降解的调节功能的影响
MDM2通过多种负反馈调节机制，例如直接绑定p53蛋白，这掩盖了p53的激活域，损害p53蛋白的进核通道，影响了泛素化和蛋白酶降解的调节功能。通过抑制MDM2重新激活p53通路，还表现在抑制p53泛素化，阻止p53蛋白运输出核的泛素化降解过程。对于细胞质易位测定，HCT116细胞铺板在盖玻片上(Costar-six-well)，直到达到80-90％饱和。次日，使用HD转染试剂(Roche，USA)将GFP-p53(1μg)转染细胞。在转染后4小时，将细胞用PhR处理。细胞转染24小时后，将盖玻片上的细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤三次，然后在4％多聚甲醛/PBS溶液中室温下固定10分钟。经过3次冰PBS缓冲液洗涤，将细胞在含有0.2％Triton X-100的冰PBS溶液中透化10分钟。细胞在室温黑暗的环境下在含有1％牛血清白蛋白和DAPI(Sigma公司)的1μg/ml PBS溶液中染色30分钟。用PBS洗涤三次，并将染色的细胞分别装在载体介质，将盖玻片用指甲油密封。使用共聚焦显微镜记录荧光。
图像结果显示，当使用PhR处理细胞后，没有在显微镜视野中观察到绿色荧光，说明p53泛素化被抑制，如图12。同时发现S构型对此过程影响不大。因此，进一步证实了CIH多肽的穿核能力。
4、PhR导致的p53上调和诱导细胞凋亡的浓度、时间依赖性方式
实施例3-1表明PhR可激活p53途径和诱导细胞凋亡。以0μM-40μM的多肽浓度梯度和10％的血清处理PA-1细胞。2天后，观察可得p53由PhR的激活导致p53基因和三个p53的mRNA的靶基因P21，MDM2和MDMX的上调(图13)。为测定PhR导致的诱导细胞凋亡的时间依赖性方式，选定多肽浓度为40μM,时间点从0-48h不等。结果显示，无论在蛋白质及mRNA水平检测，都具有明显的p53和MDM2积累(图14)。Galit等报道，细胞死亡多依赖于p53的积累动力学。转染HCT-116细胞，发现在PhR处理的细胞中p53蛋白比nutlin-3a处理的细胞更快速积累。对于PhR，p53和p21在12小时达到积累的最高水平，而对于nutlin-3a是48小时(图15)。这种现象可能有助于解释PhR的作用机理。
5、PhR处理的细胞的转录组分析
为了获得P53通路的直接激活的基因概述，利用全基因组基因微阵列的方法检测PhR处理的PA-1细胞。
结果与未处理的细胞相比，共计检测到285个基因下调和93个基因上调(倍数变化>2)以及PA-1细胞表现出的群集化p53通路激活(图16)。尽管这个结果，基因本体分析显示实验中可变的mRNA表达水平的基因也会参与其他途径和调节癌细胞，并起了重要作用。如在信号通路中调控干细胞的多能性，p53的信号传导途径，Ras信号途径，PI3K-Akt信号通路和Rap信号通路等(图17)。总之，这些结果表明，PhR可作为p53-MDM2/X的通路强有力的调节剂并通过激活细胞凋亡起作用。
实施例4：
PhR通过激活p53途径抑制体内肿瘤生长
1、人源肿瘤异种移植模型研究PhR的抗肿瘤效力
实验使用无胸腺裸小鼠(BALB/cASlac-NU)(Vital River Laboratory AnimalTechnology Co.Ltd.)并通过了1周的适应期。无特定病原体(SPF)小鼠获得垫料，食物和水等独立的生物安全设施。无胸腺裸小鼠(雌性；6周龄)分别用1×107的PA-1细胞接种(PA-1细胞用胰蛋白酶处理，收获并再悬浮在DMEM，每100毫升体积)。随后10-15天，肿瘤体积超过100-150mm3的小鼠随机分为3组，每组5-6只小鼠。小鼠体内的PA-1肿瘤使用PhR(10mg/kg)或nutlin-3a(10mg/kg)注射,并使用PBS缓冲液作为阴性对照。小鼠两天注射一次，从第0天开始用卡尺测量肿瘤大小(0.02mm)，并使用下列公式计算肿瘤体积：V＝L×W2/2(W，宽；L，长)。每个肿瘤均是独立测量和计算。
结果如图15所示，当PhR剂量为10mg/kg，两天一次注射，连续3周给药，显示出显著抑制肿瘤生长(TGI)，PDI-3诱导的70％的肿瘤抑制。相比较而言，选择性MDM2小分子抑制剂nutl in-3a的(隔日给药剂量为10mg/kg)只诱导30％的肿瘤抑制。这些结果由肿瘤重量和肿瘤体积测量确认如图所示。同时，实验小鼠的重量没有显示出显著变化，这表明PhR对于小鼠的生长影响副作用少。另外，实验小鼠的存活期间的死亡率研究(图19)，表明PhR是能够显示延长小鼠的生命。
2、评估肿瘤内PhR药物动力学和持续药效时间
当肿瘤达到200-300mm3的适当量时，用100μL Cy3标记PhR通过瘤内注射小鼠，注射后，将小鼠用异氟醚麻醉(感应浓度为5％异氟烷/1L O2，持续浓度为2-3％异氟烷/1LO2)。采用体内光学成像系统(IVIS Lumina II)监控PhR-Cy3肽在肿瘤中的代谢情况，并在不同时间点拍摄(0h，5min，30min，2h，6h，24h)。
结果发现PhR-Cy3肽的光信号强度24小时始终没有明显减少(图20)。此外，肿瘤和主要器官的离体荧光结果与上述多肽的生物分布与先前的报告一致，表明大多数PhR-Cy3肽在肿瘤和肝/肾区域累积(图21)。
3、在P53和p53相关蛋白水平的免疫组化分析
值得注意的是，用PhR处理的肿瘤组织中更高水平的表达p53和p21蛋白是通过免疫组织化学检测到的(图22)，与体外结果一致。通过caspase-3和增殖细胞核抗原(PCNA)检测免疫组织化学来测定凋亡的水平(图22)。
结果表明，虽然nutlin-3a在体外IC50值低于PhR肽，当在小鼠体内用较低的剂量治疗(10mg/kg)，所述肽诱导一个更高的水平的细胞凋亡，显著抑制肿瘤生长。
实施例5：
PhR在体内显示出了高的生物相容性和低毒性
1、从动物行为学研究PhR低毒性
根据实施例1-4，PhR在体内体外均有效地抑制癌症生长。然而，低毒性并从在合理的时间框架内从身体代谢是作为药效重要考虑因素。本实验采用小鼠自发转轮运动试验来建模评估毒性。采用BALB/c小鼠(Vital River Laboratory Animal TechnologyCo.Ltd.)，在22±2℃，12小时光照：黑暗循环(上午8点开灯，晚上8点灭灯)。接着，BALB/c小鼠随机分为2组(每组3-4只小鼠)分别用PBS或PhR(10mg/kg)皮下注射小鼠。在小鼠自发转轮运动测定中，由六个分隔室(成都TME科技有限公司，中国)组成。在训练过程中，小鼠被放置在分隔室内的电动棒上(直径为30mm)，电动棒旋转速度从0逐渐增加至100rpm。小鼠掉落电动棒时，记录小鼠的掉落速度。训练包括了7个试验，持续了大约7分钟。两组不同的基团在相同的五个连续的时间点都被训练(第0天，第2天，第4天，第8天，第12天，第16天和第20天)。
结果表明，经过注射后20天，自发运动周期稳步增长，无发现两组间显著差异(如图23)。这表明PhR与空白对照组一样，对小鼠的运动学习能力没有明显有害的影响。
2、从组织学分析PhR低毒性
在最后一天收集器官用于组织学实验，包括肿瘤，心脏，肝，脾，肺，肾和脑组织等。在室温下用4％缓冲的福尔马林盐水固定24小时。在此之后，将组织包埋在石蜡块和4毫米厚的石蜡切片，装在用苏木精和伊红(H&E)染色的载玻片上。染色后切片，用光镜(OlympusBX51)检查。
结果表明，相比于其它基团(图24)，PhR组具有更明显的肿瘤抑制效果。相比于PBS处理的小鼠，在用PhR治疗的小鼠中没有观察到脏器病变的迹象(图25)。因此，这些在生物体内毒性评估强烈表明PhR可以作为低毒性和生物相容的调制器，用于癌症治疗。

Claims (6)

1.一种α-螺旋多肽，其特征在于，其氨基酸序列结构为：
2.根据权利要求1所述的一种α-螺旋多肽，其特征在于，所述的氨基酸序列如SEQ IDNO.1或者SEQ ID NO.2所示。
3.编码权利要求2所述的α-螺旋多肽的分离的核苷酸序列。
4.权利要求1所述的α-螺旋多肽在制备抑制畸胎瘤PA-1肿瘤干细胞或人乳腺癌MCF-7肿瘤干细胞生长活性药物中的用途。
5.权利要求2所述的α-螺旋多肽在制备抑制畸胎瘤PA-1肿瘤干细胞或人乳腺癌MCF-7肿瘤干细胞生长活性药物中的用途。
6.一种药物，其特征在于，其活性成分为权利要求2所述的α-螺旋多肽。
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