CN115279337A

CN115279337A - 上部面纹的处理

Info

Publication number: CN115279337A
Application number: CN202180021505.4A
Authority: CN
Inventors: N·格里戈雷; K·拉弗勒; P·皮考特
Original assignee: Ipsen Biopharm Ltd
Current assignee: Ipsen Biopharm Ltd
Priority date: 2020-03-16
Filing date: 2021-03-16
Publication date: 2022-11-01
Also published as: US20230346674A1; BR112022018457A2; CA3166944A1; WO2021186167A1; EP4120997A1; TW202140522A; AU2021238928A1; KR20220154739A; GB202003813D0; JP2023517727A

Abstract

本发明涉及用于处理面纹的经修饰的BoNT/A，其中通过肌内注射在个体的多个面部部位处施用该经修饰的BoNT/A，其中以每个部位1个单位至41个单位经修饰的BoNT/A的单位剂量施用该经修饰的BoNT/A，其中1个单位是对应于小鼠中计算的半数致死剂量(LD₅₀)的经修饰的BoNT/A的量，其中该多个部位选自：用于处理眉间纹的皱眉肌的至多两个部位和降眉间肌的一个部位；用于处理额头纹的额肌的至多五个部位；和用于处理外眦纹的眼轮匝肌外侧部分的至多三个部位；其中在处理期间施用的经修饰的BoNT/A的总剂量至多为574个单位；其中该经修饰的BoNT/A在选自以下的一个或多个氨基酸残基处包含修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS 1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，其中该修饰选自：i.用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；ii.用不带电荷的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；iii.用碱性氨基酸残基取代不带电荷的表面暴露的氨基酸残基；iv.插入碱性氨基酸残基；和v.缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。本发明还提供对应的处理方法和用途，以及单位剂型和试剂盒。

Description

上部面纹的处理

技术领域

本发明涉及美容处理(例如，用于处理功能亢进性面纹(hyperfunctional faciallines))。更详细而言，本发明提供包括施用长效神经毒素的美容处理方法，更具体而言，涉及使用长效肉毒神经毒素处理美容上不规则的方法。

背景技术

功能亢进性面纹是常见的美容上不规则，包括但不限于：眉间纹、外眦纹、额头纹和皱纹、鱼尾纹、眉纹、鼻唇间线、唇纹和木偶纹。上部面纹可出现在额头、眉间和眼眶外侧区域。皱纹也可以由于皱眉表情而出现在眉间和额头区域，而皱纹可以由于微笑表情而出现在外眦区域。该区域过度突出的面纹经常被错误解释为疲劳，导致个体对其外观产生相当大的困扰。相反，过度突出的面纹由于底层肌肉的功能性牵拉而出现，其最终使皮肤起皱。在眉间复合体中，这些肌肉包括皱眉肌、降眉间肌和降眉肌，而眼轮匝肌负责外眦纹的产生。

在过去的几十年中，随着老龄化人口的持续增长，人们对美容手术的需求不断增加，以期逆转年龄增长的外观，特别是面部外观。这种对物理外观的日益关注导致了许多不同产品和方法的开发，如外科手术、多种类型的表面修复和填充剂的使用。由于这些方法都不是完全无风险的，因此有必要持续研究，以提供最安全和最有效的方法来处理面部衰老。

虽然在所谓衰老面部的产生中存在五个相互作用的因素，但主要有两个因素(皮肤和下面的肌肉)相互作用来产生更显著的纹路(lines)和褶皱(folds)，而不是皱纹(wrinkles)。许多处理方法已经开发出来，以处理皱纹以及纹路和褶皱的皮肤因素，其中包括多种类型的表面修复、皮肤科产品和软组织填充注射。

处理面纹外观的另一种美容方法是对面部皮肤下方肌肉施用神经毒素，特别是肉毒神经毒素。

是一种药物产品，含有从肉毒梭菌(Clostridium botulinum)A型菌株中分离和纯化的药物物质BoNT/A血凝素复合物(BTX-A-HAC)。由肉毒梭菌天然产生的其他几种药用BoNT/A产品也在市场上出售。

BoNT/A选择性地抑制突触前神经末梢乙酰胆碱的释放，从而阻断神经肌肉接头处的胆碱能传递，诱导肌肉收缩和肌张力的降低，导致注射的肌肉松弛。

被批准用于处理眉间纹，在皱眉肌和降眉间肌中施用的最大总剂量至多为50个单位(见图1)。Dysport的临床效果可以持续至多四个月。临床研究中重复给药展示了持续的功效，其中重复施用多达4次。然而，Dysport的施用频率不应超过每三个月进行一次。迄今为止，Dysport尚未获得FDA批准用于处理额头纹和外眦纹。

为了避免系统性神经效应，许多基于梭菌毒素的美容处理，采用直接对给定靶部位(例如靶组织)施用梭菌毒素处理剂的方式。以这种方式施用基于梭菌毒素的处理剂时的一个问题是，毒素从施用部位向周围组织或全身循环中的扩散。毒素从靶组织的扩散被认为是引起不良副作用的因素，在极端情况下可以危及生命。在以高剂量、高浓度和高注射体积使用梭菌毒素处理剂(如BoNT处理剂)时，这可能尤其是一个问题。对于市售BoNT/A处理剂，已经报道的与该问题相关的不良反应包括乏力、全身肌肉无力、复视、上睑下垂、吞咽困难、发音困难、构音障碍、尿失禁和呼吸困难。吞咽和呼吸困难可以危及生命，并且据报道，已存在与毒素效应扩散有关的死亡。

本发明克服了上述一个或多个问题。

发明概述

本发明人已经令人惊讶地发现，经修饰的BoNT/A在面纹(facial lines)的美容处理方面具有特别的效用。所述经修饰的BoNT/A可包含对表面暴露的氨基酸残基的一个或多个修饰，导致净正电荷增加。增加的电荷促进多肽和阴离子细胞外成分之间的静电相互作用，从而促进多肽和细胞表面之间的结合。反过来，这会增加在施用部位的滞留(减少自施用部位的扩散)，并导致作用持续时间增加(例如6-9个月)。备选地，经修饰的BoNT/A可以包括BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(H_C结构域)，这类似地导致经修饰的BoNT/A在施用部位的滞留增加(扩散减少)，作用持续时间增加(例如6-9个月)。有利的是，与未经修饰的BoNT/A(例如，

)相比，经修饰的BoNT/A具有改善的安全性特征。这种改善的安全性特征可以用本文所述的经修饰的BoNT/A的高安全性比(Safety Ratio)来表示。

基于本文的临床前数据(见实施例6)，已经显示，在高剂量下，可以对个体施用更高总量的经修饰的BoNT/A，同时达到与未经修饰的BoNT/A(例如

)相似的安全性特征。因此，在达到最大总剂量之前，可以在更多的肌肉/部位注射经修饰的BoNT/A以美容处理面纹(facial lines)。这是一个重要且有利的发现，可改善面纹的美容处理，同时为临床医生提供更大范围的处理选择。与未经修饰的BoNT/A(例如

)处理相比，该处理可以是改善的，它提供了更持久的处理效果(导致更低的施用频率)和/或能够针对个体量身定制，例如使得临床医生能够根据个体的美容要求在特定部位施用。与常规处理方案相比，本发明的处理是改善的。

此外，本发明提供了可在单次处理中安全施用的方便、安全和有效的单个单位剂量以及总(最大)剂量。本发明还提供了可以在不导致患者毒性的情况下将所述单位剂量施用于肌肉的次数(包括每块肌肉注射部位的数量)的相应指南。因此，本发明的处理对于临床医生来说要简单得多，并且有助于避免施用不足和/或施用过量。

发明详述

在一个方面，本发明提供经修饰的BoNT/A用于处理面纹，其中通过肌内注射，在个体的多个面部部位，施用该经修饰的BoNT/A，

其中，以每个部位1个单位至41个单位(2个单位至41个单位)经修饰的BoNT/A的单位剂量，施用该经修饰的BoNT/A，其中1个单位是对应于小鼠中计算的半数致死剂量(LD₅₀)的经修饰的BoNT/A的量，

其中该多个部位选自：

皱眉肌(corrugator muscle)的至多两个部位和降眉间肌(procerus muscle)的一个部位，用于处理眉间纹；

额肌(frontalis muscle)的至多五个部位，用于处理额头纹(forehead lines)；和

眼轮匝肌(orbicularis oculi muscle)外侧部分的至多三个部位，用于处理外眦纹(lateral canthal lines)，

其中在处理期间施用的经修饰的BoNT/A的总剂量至多为574个单位，和

其中该经修饰的BoNT/A在选自以下的一个或多个氨基酸残基处包含修饰：ASN886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP1058、HIS 1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，其中该修饰选自：

i.用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；

ii.用不带电荷的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；

iii.用碱性氨基酸残基取代不带电荷的表面暴露的氨基酸残基；

iv.插入碱性氨基酸残基；和

v.缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。

在另一个相关方面，本发明提供经修饰的BoNT/A用于处理面纹，其中通过肌内注射在个体的多个面部部位处施用该经修饰的BoNT/A，

其中，以每个部位8.4pg至344.4pg经修饰的BoNT/A的单位剂量，施用该经修饰的BoNT/A，

其中该多个部位选自：

皱眉肌的至多两个部位和降眉间肌的一个部位，用于处理眉间纹；

额肌的至多五个部位，用于处理额头纹；和

眼轮匝肌外侧部分的至多三个部位，用于处理外眦纹，

其中在处理期间施用的经修饰的BoNT/A的总剂量至多为4821.6pg，和

i.用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；

iv.插入碱性氨基酸残基；和

v.缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。

在一个方面，本发明提供经修饰的BoNT/A用于处理面纹，其中通过肌内注射在个体的多个面部部位处施用该经修饰的BoNT/A，

其中，以每个部位2个单位至41个单位经修饰的BoNT/A的单位剂量，施用该经修饰的BoNT/A，其中1个单位是对应于小鼠中计算的半数致死剂量(LD₅₀)的经修饰的BoNT/A的量，

其中该多个部位选自：

额肌的至多五个部位，用于处理额头纹；和

眼轮匝肌外侧部分的至多三个部位，用于处理外眦纹，

其中该经修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(H_C结构域)。

在一个相关方面，本发明提供用于处理面纹的方法，该方法包括通过肌内注射在个体的多个面部部位处施用经修饰的肉毒神经毒素A(BoNT/A)，

其中该多个部位选自：

额肌的至多五个部位，用于处理额头纹；和

眼轮匝肌外侧部分的至多三个部位，用于处理外眦纹，

i.用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；

iv.插入碱性氨基酸残基；和

v.缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。

其中该多个部位选自：

额肌的至多五个部位，用于处理额头纹；和

眼轮匝肌外侧部分的至多三个部位，用于处理外眦纹，

i.用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；

iv.插入碱性氨基酸残基；和

v.缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。

其中该多个部位选自：

额肌的至多五个部位，用于处理额头纹；和

眼轮匝肌外侧部分的至多三个部位，用于处理外眦纹，

在另一个相关方面，本发明提供经修饰的肉毒神经毒素A(BoNT/A)在制备用于处理面纹的药物中的用途，其中通过肌内注射在个体的多个面部部位处施用该经修饰的BoNT/A，

其中该多个部位选自：

额肌的至多五个部位，用于处理额头纹；和

眼轮匝肌外侧部分的至多三个部位，用于处理外眦纹，

i.用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；

iv.插入碱性氨基酸残基；和

v.缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。

其中该多个部位选自：

额肌的至多五个部位，用于处理额头纹；和

眼轮匝肌外侧部分的至多三个部位，用于处理外眦纹，

i.用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；

iv.插入碱性氨基酸残基；和

v.缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。

其中该多个部位选自：

额肌的至多五个部位，用于处理额头纹；和

眼轮匝肌外侧部分的至多三个部位，用于处理外眦纹，

其中，以每个部位0.5个单位至73个单位经修饰的BoNT/A的单位剂量，施用该经修饰的BoNT/A，其中1个单位是对应于小鼠中计算的半数致死剂量(LD₅₀)的经修饰的BoNT/A的量，

其中该多个部位选自：

额肌的至多五个部位，用于处理额头纹；和

眼轮匝肌外侧部分的至多三个部位，用于处理外眦纹，

其中在处理期间施用的经修饰的BoNT/A的总剂量至多为1019个单位，和

在另一个方面，本发明提供经修饰的BoNT/A用于处理面纹，其中通过肌内注射在个体的多个面部部位处施用该经修饰的BoNT/A，

其中，以每个部位12pg至1754pg经修饰的BoNT/A的单位剂量，施用该经修饰的BoNT/A，

其中该多个部位选自：

额肌的至多五个部位，用于处理额头纹；和

眼轮匝肌外侧部分的至多三个部位，用于处理外眦纹，

其中在处理期间施用的经修饰的BoNT/A的总剂量至多为24500pg，和

其中该多个部位选自：

额肌的至多五个部位，用于处理额头纹；和

眼轮匝肌外侧部分的至多三个部位，用于处理外眦纹，

其中该多个部位选自：

额肌的至多五个部位，用于处理额头纹；和

眼轮匝肌外侧部分的至多三个部位，用于处理外眦纹，

其中该多个部位选自：

额肌的至多五个部位，用于处理额头纹；和

眼轮匝肌外侧部分的至多三个部位，用于处理外眦纹，

其中该多个部位选自：

额肌的至多五个部位，用于处理额头纹；和

眼轮匝肌外侧部分的至多三个部位，用于处理外眦纹，

提到“肌肉”是指(例如，通过过度紧绷、紧张或张力)促成本发明所涉及的潜在美容状况的受影响的肌肉。

第一组肌肉定义为降眉间肌，第二组肌肉定义为皱眉肌，第三组肌肉定义为眼轮匝肌，第四组肌肉定义为额肌。

多个部位可以在同一肌肉组上(例如，右和左皱眉肌、右和左眼轮匝肌)。类似地，多个部位可以在同一肌肉上(例如，右皱眉肌或左皱眉肌；或右眼轮匝肌或左眼轮匝肌)。类似地，多个部位可以在所述肌肉和肌肉组的组合上。因此，可以提供个性化的处理方案。

用于本发明的经修饰的BoNT/A可以是在选自以下的一个或多个氨基酸残基处包含修饰的经修饰的BoNT/A：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS 1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR1277，其中该修饰选自：用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；用不带电荷的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；用碱性氨基酸残基取代不带电荷的表面暴露的氨基酸残基；插入碱性氨基酸残基；和缺失酸性表面暴露的氨基酸残基；或该经修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(H_C结构域)。

优选地，用于本发明的经修饰的BoNT/A可以是在选自以下的一个或多个氨基酸残基处包含修饰的经修饰的BoNT/A：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS 1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，其中该修饰选自：用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；用不带电荷的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；用碱性氨基酸残基取代不带电荷的表面暴露的氨基酸残基；插入碱性氨基酸残基；和缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。

根据本发明使用的经修饰的BoNT/A的效力优选根据标准技术通过小鼠LD₅₀测定来确定。在该测定中，1个单位定义为对应于小鼠中计算的半数致死剂量(LD₅₀)的经修饰的BoNT/A的量。优选地，计算的小鼠中半数致死腹腔内剂量。在该测定中对应于1个单位的经修饰的BoNT/A的量可以是至少1pg、2pg、3pg、4pg、5pg、6pg、7pg、8pg或9pg。在该测定中对应于1个单位的经修饰的BoNT/A的量可以是≤45pg、≤40pg、≤30pg、≤25pg、≤20pg、≤19pg、≤18pg、≤17pg、≤16pg、≤15pg、≤14pg、≤13pg、≤12pg、≤11pg、≤10pg、≤9pg、≤8pg、≤7pg或≤6pg。

在用于本发明的经修饰的BoNT/A是在选自以下的一个或多个氨基酸残基处包含修饰的经修饰的BoNT/A：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS 1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR1277，且其中该修饰选自：用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；用不带电荷的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；用碱性氨基酸残基取代不带电荷的表面暴露的氨基酸残基；插入碱性氨基酸残基；和缺失酸性表面暴露的氨基酸残基的情况下，在该测定中对应于1个单位的经修饰的BoNT/A的量可以是1-15pg，如5-10pg。优选地，在该测定中对应于1个单位的经修饰的BoNT/A的量可以是8-9pg，更优选8.4pg。

在用于本发明的经修饰的BoNT/A是包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(H_C结构域)的经修饰的BoNT/A的情况下，在该测定中对应于1个单位的经修饰的BoNT/A的量可以是15-35pg，如20-30pg。优选地，在该测定中对应于1个单位的经修饰的BoNT/A的量可以是23-25pg，更优选24.0pg。

术语“至多”在用于提到数值(例如至多574个单位)时是指，至多并包括所陈述的数值。因此，作为一个实例，提到施用“至多574个单位”经修饰的BoNT/A包括施用574个单位经修饰的BoNT/A以及施用少于574个单位经修饰的BoNT/A。

在多个部位处通过肌内注射施用一定剂量的经修饰的BoNT/A。每个部位施用单个单位剂量。术语“施用单个单位剂量”是指施用单个单位剂量的基本上全部。优选地，在复溶经修饰的BoNT/A的小瓶中最多仅可保留所述单位剂量的(例如，至多1％、0.1％或0.01％)残余量。然而，优选施用单个单位剂量的全部。取决于肌肉组，通常对选自第一组(本文所述)的肌肉施用单个单位剂量，通常对选自第二组(本文所述)的肌肉施用2x单位剂量，通常对选自第三组(本文所述)的肌肉施用3x单位剂量，通常对选自第四组(本文所述)的肌肉施用5x单位剂量。

单位剂量可以用经修饰的BoNT/A的单位数表示。

单位剂量可以是2个单位至41个单位经修饰的BoNT/A。单位剂量范围的上限可以是40、35、30、25、20、15或10个单位经修饰的BoNT/A，优选上限为35个单位。单位剂量范围的下限可以是5、10、15、20、25、30或35。优选地，经修饰的BoNT/A的单位剂量为12个单位至35个单位，12个单位至24个单位，更优选12个至18个单位。

备选地或此外，单位剂量可以用经修饰的BoNT/A的量表示。因此，在一个方面，本发明提供经修饰的肉毒神经毒素A(BoNT/A)用于处理面纹，其中通过肌内注射在个体的多个面部部位处施用该经修饰的BoNT/A，

其中，以每个部位18pg至350pg经修饰的BoNT/A的单位剂量，施用该经修饰的BoNT/A，

其中该多个部位选自：

额肌的至多五个部位，用于处理额头纹；和

眼轮匝肌外侧部分的至多三个部位，用于处理外眦纹，

其中在处理期间施用的经修饰的BoNT/A的总剂量至多为4850pg，和

i.用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；

iv.插入碱性氨基酸残基；和

v.缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。

其中以每个部位18pg至350pg经修饰的BoNT/A的单位剂量施用该经修饰的BoNT/A，

其中该多个部位选自：

额肌的至多五个部位，用于处理额头纹；和

眼轮匝肌外侧部分的至多三个部位，用于处理外眦纹，

本发明还提供(在制备药物中的)对应用途和处理方法。

单位剂量可以是18pg至350pg经修饰的BoNT/A。单位剂量范围的上限可以是325、300、275、250、225、200、175、150、125、100或50pg经修饰的BoNT/A，优选上限为300pg。单位剂量范围的下限可以是20、25、30、35、40、45、50、60、65、70、75、80、85、90、100、125、150、175、200、250或300pg经修饰的BoNT/A，优选下限为20pg。经修饰的BoNT/A的单位剂量选自：18pg至350pg，20pg至300pg，最优选100pg至150pg。优选地，经修饰的BoNT/A的单位剂量是20pg至300pg经修饰的BoNT/A，例如50pg至250pg。

最优选地，经修饰的BoNT/A的单位剂量是80至180pg，如100pg至150pg。

经修饰的BoNT/A的单位剂量可以是2个单位至41个单位。单位剂量范围的上限可以是35、30、25、20、15、10或5个单位经修饰的BoNT/A，优选上限为35个单位。单位剂量范围的下限可以是0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2个单位经修饰的BoNT/A，优选下限为2个单位。优选地，经修饰的BoNT/A的单位剂量是2个单位至35个单位经修饰的BoNT/A，例如15个单位至25个单位。

经修饰的BoNT/A的单位剂量选自：2个单位至35个单位、6个至35个单位，12个单位至35个单元、12个单位至24个单位，最优选12个单位至18个单位。

最优选地，经修饰的BoNT/A的单位剂量为5至25个单位，如12个单位至18个单位。

单位剂量可以是8.4pg至350pg经修饰的BoNT/A。单位剂量范围的上限可以是325、300、275、250、225、200、175、150、125、100或50pg经修饰的BoNT/A，优选上限为300pg。单位剂量范围的下限可以是5、10、20、25、30、35、40、45、50、60、65、70、75、80、85、90、100、125、150、175、200、250或300pg经修饰的BoNT/A，优选下限为10pg。优选地，经修饰的BoNT/A的单位剂量是10pg至300pg经修饰的BoNT/A，更优选10pg至200pg，例如50pg至250pg。

经修饰的BoNT/A的单位剂量选自：8.4pg至350pg，10pg至300pg，最优选60pg至120pg。

最优选地，经修饰的BoNT/A的单位剂量为80至180pg，如60pg至120pg。

经修饰的BoNT/A的单位剂量可以是1个单位至41个单位。单位剂量范围的上限可以是35、30、25、20、15、10或5个单位经修饰的BoNT/A，优选上限为35个单位。单位剂量范围的下限可以是0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1个单位经修饰的BoNT/A，优选下限为1个单位。优选地，经修饰的BoNT/A的单位剂量是1至35个单位经修饰的BoNT/A，例如10至20个单位。

经修饰的BoNT/A的单位剂量选自：1个单位至35个单位，3.5个至35个单位、7个单位至35个单位，7个单位至24个单位，最优选7个单位至14个单位。

最优选地，经修饰的BoNT/A的单位剂量为5个单位至20个单位，如7个单位至14个单位。

单位剂量可以是0.5个单位至73个单位经修饰的BoNT/A。单位剂量范围的上限可以是70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10或5个单位经修饰的BoNT/A，优选上限为62个单位。单位剂量范围的下限可以是0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5或9个单位经修饰的BoNT/A，优选下限为0.8个单位。优选地，经修饰的BoNT/A的单位剂量是0.8个单位至62个单位经修饰的BoNT/A，例如20至40个单位。

最优选地，经修饰的BoNT/A的单位剂量为5个单位至25个单位，如10个单位至21个单位。

单位剂量可以是12pg至1754pg经修饰的BoNT/A。单位剂量范围的上限可以是1700、1600、1500、1400、1300、1200、1100、1000、800、600、400、200、100或50pg经修饰的BoNT/A，优选上限为1000pg。单位剂量范围的下限可以是5、10、20、25、30、35、40、45、50、60、65、70、75、80、85、90、100、125、150、175、200、250或300pg经修饰的BoNT/A，优选下限为20pg。优选地，经修饰的BoNT/A的单位剂量是20pg至1500pg、更优选20pg至1000pg经修饰的BoNT/A，例如500pg至750pg。

最优选地，经修饰的BoNT/A的单位剂量为200至750pg，如250pg至500pg。

在经修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(H_C结构域)时，这些单位剂量可以特别相关。

经修饰的BoNT/A的单位剂量也可以同时以单位和量(pg)表示。

在处理面纹时，可对选自以下的多个部位施用经修饰的BoNT/A：用于处理眉间纹的皱眉肌的至多两个部位和降眉间肌的一个部位；用于处理额头纹的额肌的至多五个部位；和用于处理外眦纹的眼轮匝肌外侧部分的至多三个部位。

在实施本发明的处理方案时施用的总剂量可以是至多574个单位。换言之，在给定处理疗程中施用的经修饰的BoNT/A的总量可以是至多574个单位。总剂量可以是至多570、560、550、540、530、520、510、500、490、480、470、460、450或440个单位。优选地，总剂量可以是至多288个单位经修饰的BoNT/A。

在实施本发明的处理方案时施用的总剂量可以是至多4850、4500、4000、3550、3000、2750、2500pg，优选至多2400pg。

在实施用于眉间纹的处理方案时施用的总剂量可以是至多1500、1400、1300、1200、1100、1000、800、600、400、200、100或50，优选至多1000pg。

在实施用于额头纹的处理方案时施用的总剂量可以是至多1500、1400、1300、1200、1100、1000、800、600、400、200、100或50，优选至多1000pg。

在实施用于外眦纹的处理方案时施用的总剂量可以是至多1800、1700、1600、1500、1400、1300、1200、1100、1000、800、600、400、200、80、60、40或20，优选至多1200pg。

在实施本发明的处理方案时施用的总剂量可以是至多1019个单位。换言之，在一个给定的处理过程中施用的经修饰BoNT/A的总量可以是至多1019个单位。总剂量可以是至多1000、950、900、850、800、750、700、650、600、550、500、450、400或400个单位。优选地，总剂量可以是至多333个单位经修饰的BoNT/A。

在实施本发明的处理方案时施用的总剂量可以是至多24500、24000、23500、23000、22500、22000pg，优选至多8000pg。在经修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(H_C结构域)时，这些总剂量可以特别相关。

在实施用于眉间纹的处理方案时施用的总剂量可以是至多5000、4500、4000、3500、3000、2500、2000、1500、1000、500、400、300、200、100或50，优选至多5000pg。

在实施用于额头纹的处理方案时施用的总剂量可以是至多5000、4500、4000、3500、3000、2500、2000、1500、1000、500、400、300、200、100或50，优选至多5000pg。

在实施用于外眦纹的处理方案时施用的总剂量可以是至多6000、5500、4500、4000、3500、3000、2500、2000、1000、500、400、300、200、100或50，优选至多6000pg。

在经修饰的BoNT包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(H_C结构域)时，这些总剂量可以特别相关。

本领域技术人员将考虑个体最近已经(或随后)在何时用肉毒神经毒素(例如BoNT)进行额外处理，例如作为美容处理或不同适应症处理的一部分。使用本领域常规技术，本领域技术人员将相应地调整本处理方案。

按照本发明对多块肌肉的施用优选在同一处理疗程中进行。

在施用经修饰的BoNT/A后，可以在适当的时间段重复处理。考虑到作用持续时间约为未修饰的BoNT/A(如

)的两倍，因此与个体使用未修饰的BoNT/A处理(如

)相比，后续施用之间的时间间隔可以适当更长。个体可以在前一次施用后至少18、20、25或30周再次施用本发明的经修饰的BoNT/A。例如，个体可以在前一次施用后至少18-45周、优选20-35周再次施用本发明的经修饰的BoNT/A。

本文所用的“个体”可以是哺乳动物，如人或其他哺乳动物。优选地，“个体”指人个体。

本文所用的术语“处理”包括预防性处理(例如，预防病症的发作)以及矫正性处理(对已有状况的个体的处理)。优选地，本文所用的“处理”是指矫正性处理。本文所用的术语“处理”涉及状况和/或其征候。

在WO 2015/004461 A1和WO 2017/191315中描述适宜的经修饰的BoNT/A多肽(以及编码该多肽的核苷酸序列，如果存在的话)，二者在此以其整体引入作为参考。

BoNT/A是梭菌属(Clostridia)细菌产生的梭菌神经毒素的一个实例。此类梭菌神经毒素的其他实例包括由破伤风梭菌(C.tetani)(TeNT)和肉毒梭菌(C.botulinum)(BoNT)血清型B-G产生的那些，以及由巴氏梭菌(C.baratii)和丁酸梭菌(C.butyricum)产生的那些。所述神经毒素具有很强的效力和特异性，可以毒害神经元和它们所输送到的其他细胞。梭菌毒素中有一些是已知的最有效的毒素。例如，取决于血清型，肉毒神经毒素对小鼠的半数致死剂量(LD₅₀)值为0.5至5ng/kg。破伤风和肉毒毒素都通过抑制受影响神经元的功能，特别是神经递质的释放而起作用。肉毒毒素作用于神经肌肉接头并抑制外周神经系统中的胆碱能传递，而破伤风毒素作用于中枢神经系统。

在自然界中，梭菌神经毒素(包括BoNT/A)作为单链多肽合成，该单链多肽通过蛋白水解切割事件进行翻译后修饰，以形成通过二硫键连接在一起的两条多肽链。切割发生在特异性切割位点，通常称为激活位点，其位于提供链间二硫键的半胱氨酸残基之间。正是这种双链形式是毒素的活性形式。这两条链称为重链(H链)(分子量约为100kDa)和轻链(L链)(分子量约为50kDa)。H链包含N端易位成分(H_N结构域)和C端靶向成分(H_C结构域)。切割位点位于L链和易位结构域成分之间。在H_C结构域与其目标神经元结合并且结合的毒素通过内体被内化到细胞中之后，H_N结构域使L链易位穿过内体膜并转移到胞质溶胶中，L链提供蛋白酶功能(也称为非细胞毒性蛋白酶)。

非细胞毒性蛋白酶通过蛋白水解切割称为SNARE蛋白的细胞内转运蛋白(例如SNAP-25、VAMP或Syntaxin)来发挥作用——见Gerald K(2002)"Cell and MolecularBiology”(第4版)John Wiley&Sons,Inc。首字母缩写SNARE来源于术语——可溶性NSF附着受体(Soluble NSF Attachment Receptor)，其中NSF表示N-乙基马来酰亚胺敏感因子(N-ethylmaleimide-Sensitive Factor)。SNARE蛋白是细胞内囊泡融合以及由此分子通过囊泡转运从细胞分泌所必需的。所述蛋白酶功能是锌依赖性内肽酶活性，并对SNARE蛋白表现出高底物特异性。因此，一旦递送至期望的靶细胞，该非细胞毒性蛋白酶能够抑制靶细胞的细胞分泌。梭菌毒素的L链蛋白酶是切割SNARE蛋白的非细胞毒性蛋白酶。

本文中所用的术语“H_C结构域”是指神经毒素重链的分子量约为50kDa的功能独特区域，其使神经毒素能够与位于靶细胞表面的受体结合。H_C结构域由两个结构不同的亚结构域组成，“H_CN亚结构域”(H_C结构域的N端部分)和“H_CC亚结构域(H_C结构域C端部分)”，每个亚结构域的分子量约为25kDa。

本文所用的术语“LH_N结构域”是指这样的神经毒素，其不含H_C结构域，由内肽酶结构域(“L”或“轻链”)和负责内肽酶向细胞质易位的结构域(重链的H_N结构域)组成。

如上所述，梭菌毒素由两条多肽链形成，分子量约100kDa的重链(H链)和分子量约50kDa的轻链(L链)。H链包含C端靶向成分(受体结合结构域或H_C结构域)和N端易位成分(H_N结构域)。

轻链参考序列的实例包括：

A型肉毒神经毒素：氨基酸残基1-448

B型肉毒神经毒素：氨基酸残基1-440

上述的参考序列应视为一个举例说明，因为根据亚血清型可以发生轻微变化。作为实例，US 2007/0166332(在此以其整体引入作为参考)引用了略微不同的梭菌序列：

A型肉毒神经毒素：氨基酸残基M1-K448

B型肉毒神经毒素：氨基酸残基M1-K441

优选的经修饰的BoNT/A在选自以下的一个或多个氨基酸残基处包含修饰：ASN886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP1058、HIS 1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277。与使用已知的BoNT/A相比，这种经修饰的BoNT/A展示了副作用减少或不存在。本发明经修饰的BoNT/A的增加组织留存性质还提供了提高的效力和/或作用持续时间，并且与已知的梭菌毒素处理相比，可以允许使用降低的剂量(或增加的剂量而没有任何附加的副作用)，从而提供进一步的优势。

该修饰可以是与SEQ ID NO:2所示的未修饰的BoNT/A相比的修饰，其中氨基酸残基编号通过与SEQ ID NO:2比对来确定。由于在SEQ ID NO:2(以及对应于本文所述的经修饰的BoNT/A多肽的SEQ ID NOs)的位置1处甲硫氨酸残基的存在是可选的，因此本领域技术人员在确定氨基酸残基编号时将考虑甲硫氨酸残基的存在/不存在。例如，在SEQ ID NO:2包含甲硫氨酸时，位置编号将如上所述(例如，ASN 886将是SEQ ID NO:2的ASN 886)。备选地，在SEQ ID NO:2不含甲硫氨酸时，氨基酸残基编号应通过-1来修改(例如，ASN 886将是SEQ ID NO:2的ASN 885)。类似的考虑也适用于本文所述的其他多肽序列的位置1处存在/不存在甲硫氨酸时，并且本领域技术人员可以使用本领域常规技术容易地确定正确的氨基酸残基编号。

所指出的用于修饰的氨基酸残基是表面暴露的氨基酸残基。

经修饰的BoNT/A可以在选自以下的一个或多个氨基酸残基处包含修饰：ASN 886、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1052、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277。经修饰的BoNT/A可以由与选自SEQ ID NO:3、5、7和9的核酸序列具有至少70％序列同一性的核酸序列编码。例如，与选自SEQ ID NO:3、5、7和9的核酸序列具有至少80％、90％、95％或99.9％序列同一性的核酸序列。优选地，用于本发明的经修饰的BoNT/A可以由包含SEQ ID NO:3、5、7或9(或由其组成)的核酸编码。经修饰的BoNT/A可以包含与选自SEQ ID NO:4、6、8和10的多肽序列具有至少70％序列同一性的多肽序列。例如，与选自SEQ ID NO:4、6、8和10的多肽序列具有至少80％、90％、95％或99.9％序列同一性的多肽序列。优选地，用于本发明的经修饰的BoNT/A可以包含选自SEQ ID NO:4、6、8和10的多肽序列(更优选由其组成)。

术语“一个或多个氨基酸残基”在经修饰的BoNT/A的上下文中使用时，优选指至少2、3、4、5、6或7个所指出的氨基酸残基。因此，经修饰的BoNT/A可以在所指的氨基酸残基处包含至少2、3、4、5、6或7(优选7)个修饰。经修饰的BoNT/A可以包含1-30、3-20或5-10个氨基酸修饰。更优选地，术语“一个或多个氨基酸残基”在经修饰的BoNT/A的上下文中使用时是指所指出的所有氨基酸残基。

优选地，与SEQ ID NO:2相比，除了所指的氨基酸残基处的一个或多个氨基酸修饰之外，经修饰的BoNT/A不包含任何其他氨基酸修饰。

最优选地，经修饰的BoNT/A在选自以下的一个或多个氨基酸残基处包含修饰(更优选由其组成)：ASN 886、ASN 930、SER 955、GLN 991、ASN 1026、ASN 1052和GLN 1229。经修饰的BoNT/A可以由与SEQ ID NO:3具有至少70％序列同一性的核酸序列编码。例如，与SEQ ID NO:3具有至少80％、90％、95％或99.9％序列同一性的核酸序列。优选地，用于本发明的经修饰的BoNT/A可以由包含SEQ ID NO:3(或由其组成)的核酸编码。经修饰的BoNT/A可以包含与SEQ ID NO:4具有至少70％序列同一性的多肽序列。例如，与SEQ ID NO:4具有至少80％、90％、95％或99.9％序列同一性的多肽序列。优选地，用于本发明的经修饰的BoNT/A可以包含SEQ ID NO:4(更优选由其组成)。

所述修饰可选自：

i.用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；

iv.插入碱性氨基酸残基；和

v.缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。

通过如上所述的修饰，可以产生与对应的未修饰BoNT/A相比具有增加的表面正电荷和增加的等电点的经修饰的BoNT/A。

等电点(pI)是给定蛋白质的特有性质。如本领域公知，蛋白质由特定顺序的氨基酸(在蛋白质中也称为氨基酸残基)组成。二十种标准氨基酸中的每一种氨基酸都具有不同的侧链(或R基团)，这意味着蛋白质中的每个氨基酸残基显示不同的化学性质，如电荷和疏水性。这些性质可以受周围化学环境的影响，如温度和pH。蛋白质的总体化学特征将取决于这些多种因素的总和。

某些氨基酸残基(下文详述)具有可电离侧链，该侧链可根据周围pH而显示电荷。这种侧链在给定pH值下是否带电荷取决于该相关可电离部分的pKa，其中pKa是具体质子自共轭碱的酸离解常数(Ka)的负对数。

例如，酸性残基如天冬氨酸和谷氨酸具有pKa值约为4.1的侧链羧酸基团(精确的pKa值可取决于温度、离子强度和可电离基团的微环境)。因此，这些侧链在pH为7.4(通常称为“生理pH”)时呈现负电荷。在低pH值下，这些侧链将质子化并失去其电荷。

相反，碱性残基如赖氨酸和精氨酸具有pKa值约为10-12的含氮侧链基团。因此，这些侧链在pH值为7.4时呈现正电荷。这些侧链将在高pH值下去质子化并失去电荷。

因此，蛋白质分子的总(净)电荷取决于蛋白质中存在的酸性和碱性残基的数量(以及它们的表面暴露程度)以及周围pH。改变周围pH可以改变蛋白质上的总电荷。因此，对于每种蛋白质，都存在一个给定的pH值，在该pH值下正负电荷的数量相等，并且蛋白质显示无总净电荷。该点称为等电点(pI)。等电点是本领域技术人员熟悉的蛋白质生物化学中的标准概念。

因此，等电点(pI)定义为蛋白质显示净电荷为零时的pH值。pI的增加意味着蛋白质需要更高的pH值以显示零净电荷。因此，pI的增加表示蛋白质在给定pH下的净正电荷的增加。相反，pI的降低意味着蛋白质需要较低的pH值以显示零净电荷。因此，pI的降低表示蛋白质在给定pH下的净正电荷的减少。

测定蛋白质pI的方法是本领域已知的，并且是本领域技术人员熟悉的。作为实例，蛋白质的pI可从蛋白质中存在的每个氨基酸的平均pKa值计算(“计算pI”)。这种计算可以使用本领域已知的计算机程序来进行，如来自ExPASy的Compute pI/MW Tool(https://web.expasy.org/compute_pi/)，这是根据本发明计算pI的优选方法。应使用相同的计算技术/程序进行不同分子之间的pI值的比较。

在适当情况下，可以使用等电聚焦技术通过实验确认蛋白质的计算pI(“实测pI”)。该技术使用电泳根据蛋白质的pI来分离蛋白质。等电聚焦通常使用具有固定化的pH梯度的凝胶进行。在施加电场时，蛋白质迁移通过pH梯度，直到达到其具有零净电荷时的pH，这一点是蛋白质的pI。由等电聚焦提供的结果在本质上通常是相对低分辨率的，因此本发明人认为由计算pI(如上所述)提供的结果更适合使用。

在本说明书中，除非另有说明，“pI”指“计算pI”。

蛋白质的pI可通过改变其表面显示的碱性和/或酸性基团的数量来增加或减少。这可以通过修饰蛋白质的一个或多个氨基酸来达到。例如，可以通过减少酸性残基的数量或通过增加碱性残基的数量来提供pI的增加。

本发明的经修饰的BoNT/A可以具有比未修饰的BoNT/A(例如，SEQ ID NO:2)高至少0.2、0.4、0.5或1个pI单位的pI值。优选地，经修饰的BoNT/A可以具有至少6.6的pI，例如至少6.8。

20种标准氨基酸的性质在下表显示：

认为以下氨基酸是带电荷氨基酸：天冬氨酸(负)、谷氨酸(负)、精氨酸(正)和赖氨酸(正)。

在pH为7.4时，天冬氨酸(pKa 3.1)和谷氨酸(pKa 4.1)的侧链带负电荷，而精氨酸(pKa 12.5)和赖氨酸(pKa 10.8)的侧链带正电荷。将天冬氨酸和谷氨酸称为酸性氨基酸残基。将精氨酸和赖氨酸称为碱性氨基酸残基。

认为以下氨基酸是不带电荷的极性氨基酸(意味着它们可以参与氢键键合)：天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸和色氨酸。

认为以下氨基酸是不带电荷的疏水性氨基酸：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸和甘氨酸。

在氨基酸插入中，将额外的氨基酸残基(通常不存在的氨基酸)掺入BoNT/A多肽序列中，从而增加该序列中的氨基酸残基总数。在氨基酸缺失中，从梭菌毒素氨基酸序列中去除氨基酸残基，从而减少该序列中的氨基酸残基总数。

优选地，所述修饰是取代，其有利地在经修饰的BoNT/A中保持相同的氨基酸残基数量。在氨基酸取代中，用不同的氨基酸残基替换形成BoNT/A多肽序列的一部分的氨基酸残基。替换氨基酸残基可以是如上所述20种标准氨基酸中的一种。备选地，氨基酸取代中的替换氨基酸可以是非标准氨基酸(不是上述20种标准氨基酸的氨基酸)。作为实例，替换氨基酸可以是碱性非标准氨基酸，例如L-鸟氨酸、L-2-氨基-3-胍基丙酸、或赖氨酸、精氨酸和鸟氨酸的D-异构体)。用于将非标准氨基酸引入蛋白质的方法是本领域已知的，包括使用大肠杆菌营养缺陷型表达宿主进行重组蛋白质合成。

在一个实施方案中，该取代选自：用碱性氨基酸残基取代酸性氨基酸残基、用不带电荷的氨基酸残基取代酸性氨基酸残基和用碱性氨基酸残基取代不带电荷的氨基酸残基。在其中该取代是用不带电荷的氨基酸残基取代酸性氨基酸残基的一个实施方案中，所述酸性氨基酸残基用其对应的不带电荷的酰胺氨基酸残基取代(即，用天冬酰胺替换天冬氨酸，用谷氨酰胺替换谷氨酸)。

优选地，所述碱性氨基酸残基是赖氨酸残基或精氨酸残基。换言之，该取代是用赖氨酸或精氨酸取代。最优选地，所述修饰是用赖氨酸取代。

根据本发明修饰后，经修饰的BoNT/A能够结合未修饰的BoNT/A(例如SEQ ID NO:2)所结合的靶细胞受体。

用于本发明的经修饰的BoNT/A可以包含BoNT/A轻链和易位结构域(BoNT/A LH_N结构域)以及BoNT/B H_C结构域。BoNT/A LH_N结构域与BoNT/B H_C结构域共价连接。所述经修饰的BoNT/A在本文中也称为“BoNT/AB”或“BoNT/AB嵌合体”。

该LH_N结构域的C端氨基酸残基可以对应于分隔BoNT/A的LH_N和H_C结构域的3₁₀螺旋的第一个氨基酸残基，而H_C结构域的N端氨基酸残基可以对应于分隔BoNT/B的LH_N与H_C结构域的3₁₀螺旋的第二个氨基酸残基。

BoNT/B多肽序列的一个实例作为SEQ ID NO:16(UniProt登录号B1INP5)提供。

此处提及的“分隔BoNT/A的LH_N和H_C结构域的3₁₀螺旋的第一个氨基酸残基”是指分隔所述LH_N和H_C结构域的3₁₀螺旋的N端残基。

此处提及的“分隔BoNT/B的LH_N和H_C结构域的3₁₀螺旋的第二个氨基酸残基”是指分隔所述LH_N和H_C结构域的3₁₀螺旋的N端残基之后的氨基酸残基。

“3₁₀螺旋”是与α-螺旋、β-片层和β-转角一起存在于蛋白质和多肽中的一类二级结构。3₁₀螺旋中的氨基酸排列成右手螺旋结构，其中每个整圈由三个残基和分隔开残基之间的分子内氢键的十个原子完成。每个氨基酸对应于螺旋中的120°转角(即，螺旋每圈具有三个残基)以及沿螺旋轴的

(＝0.2nm)平移，并且在通过氢键形成的环中有10个原子。最重要的是，氨基酸的N-H基团与三个残基前的氨基酸的C＝O基团形成氢键；此重复的i+3→i氢键键合定义3₁₀螺旋。3₁₀螺旋是本领域技术人员熟悉的结构生物学中的标准概念。

此3₁₀螺旋对应于形成实际螺旋的四个残基和两个帽(或过渡)残基(分别位于这四个残基的一端)。本文所用的术语“分隔LH_N和H_C结构域的3₁₀螺旋”由这6个残基组成。

通过进行结构分析和序列比对，鉴定了分隔LH_N和H_C结构域的3₁₀螺旋。该3₁₀螺旋被在其N端(即在LH_N结构域的C端部分)的α-螺旋和在其C端(即H_C结构域的N端部分)的β-链包围。3₁₀螺旋的第一个(N端)残基(帽或过渡残基)也对应于该α-螺旋的C端残基。

分隔LH_N和H_C结构域的3₁₀螺旋可以例如从公开可得的肉毒神经毒素的晶体结构确定，例如肉毒神经毒素A1和B1的晶体结构分别为3BTA(http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do？structureId＝3BTA)和1EPW(http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do？structureId＝1EPW)。

也可以用公开可得的计算机建模和比对工具来确定在其他神经毒素中分隔LH_N和H_C结构域的3₁₀螺旋的位置，例如同源建模服务器LOOPP(Learning,Observing andOutputting Protein Patterns,http://loopp.org)，PHYRE(Protein Homology/analogYRecognition Engine,http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/)和Rosetta(https://www.rosettacommons.org/)，蛋白质叠加服务器SuperPose(http://wishart.biology.ualberta.ca/superpose/)，比对程序Clustal Omega(http://www.clustal.org/omega/)，以及Internet Resources for Molecular and CellBiologists(http://molbiol-tools.ca/)所列出的许多其他工具/服务。特别是“H_N/H_CN”连接处周围的区域在结构上高度保守，这使得它成为叠加不同血清型的理想区域。

例如，可以用以下方法来确定其他神经毒素中该3₁₀螺旋的序列：

1.基于BoNT/A1晶体结构(3BTA.pdb)，用结构同源建模工具LOOP(http://loopp.org)来获得其他BoNT血清型的预测结构；

2.对如此获得的结构(pdb)文件进行编辑，以仅包括H_CN结构域的N末端和它之前的约80个残基(其是H_N结构域的一部分)，从而保留结构高度保守的“H_N/H_CN”区域；

3.用蛋白质叠加服务器SuperPose(http://wishart.biology.ualberta.ca/superpose/)，将每种血清型叠加到3BTA.pdb结构上；

4.检查叠加的pdb文件，以定位BoNT/A1的H_C结构域起始处的3₁₀螺旋，然后鉴定其他血清型中的对应残基；

5.用Clustal Omega比对其他BoNT血清型序列，以检查对应的残基是否正确。

通过该方法确定的LH_N、H_C和3₁₀螺旋结构域的实例如下所示：

使用结构分析和序列比对，发现分隔LH_N和H_C结构域的3₁₀螺旋后的β-链在所有肉毒和破伤风神经毒素中都是保守结构，并起始于自分隔LH_N与H_C结构域的3₁₀螺旋的第一个残基开始起的第8个残基(例如，对于BoNT/A1，在残基879处)。

BoNT/AB嵌合体可以包含与来自BoNT/B的H_C结构域共价连接的来自BoNT/A的LH_N结构域，

·其中LH_N结构域的C端氨基酸残基对应于位于BoNT/A的H_C结构域开始处(N端)的β-链的N端的第八个氨基酸残基，以及

·其中H_C结构域的N端氨基酸残基对应于位于BoNT/B的H_C结构域开始处(N端)的β-链的N端的第七个氨基酸残基。

·其中LH_N结构域的C端氨基酸残基对应于位于BoNT/A的LH_N结构域末端(C端)的α-螺旋的C端氨基酸残基，以及

·其中H_C结构域的N端氨基酸残基对应于位于BoNT/B的LH_N结构域末端(C端)的α-螺旋的C端氨基酸残基的紧C端的氨基酸残基。

BoNT/AB嵌合体设计过程的基本原理是：设法确保二级结构不受损，从而最小化对每个结构域的三级结构和功能的任何改变。不希望受限于理论，推测通过不破坏BoNT/AB嵌合体中3₁₀螺旋的四个中心氨基酸残基，可以确保嵌合神经毒素的最佳构象，从而允许嵌合神经毒素完全发挥其功能。

事实上，令人惊讶的是，仅保留BoNT/A的3₁₀螺旋的第一个氨基酸残基和BoNT/B的3₁₀螺旋向前的第二个氨基酸残基，不仅允许产生可溶性和功能性的BoNT/AB嵌合体，而且进一步导致与其他BoNT/AB嵌合体相比改善的特性，尤其是效力提高、安全性比增加和/或作用持续时间更长(以及与未修饰的BoNT/A相比，安全性比和/或作用持续时间增加)。

来自BoNT/A的LH_N结构域可以对应于SEQ ID NO:2的氨基酸残基1至872，或与之具有至少70％序列同一性的多肽序列。来自BoNT/A的LH_N结构域可以对应于SEQ ID NO:2的氨基酸残基1至872，或与之具有至少80％、90％或95％序列同一性的多肽序列。优选地，来自BoNT/A的LH_N结构域对应于SEQ ID NO:2的氨基酸残基1至872。

来自BoNT/B的H_C结构域可以对应于SEQ ID NO:16的氨基酸残基860至1291，或与之具有至少70％序列同一性的多肽序列。来自BoNT/B的H_C结构域可以对应于SEQ ID NO:16的氨基酸残基860至1291，或与之具有至少80％、90％或95％序列同一性的多肽序列。优选地，来自BoNT/B的H_C结构域对应于SEQ ID NO:16的氨基酸残基860至1291。

优选地，BoNT/AB嵌合体包含BoNT/A1LH_N结构域和BoNT/B1 H_C结构域。更优选地，LH_N结构域对应于BoNT/A1(SEQ ID NO:2)的氨基酸残基1至872，而H_C结构域对应于BoNT/B1(SEQ ID NO:16)的氨基酸残基860至1291。

优选地，BoNT/B H_C结构域进一步在H_CC亚结构域中包含至少一个氨基酸残基取代、添加或缺失，与天然BoNT/B序列相比，其具有增加BoNT/B神经毒素对人Syt II的结合亲和力的效果。在WO 2013/180799和WO 2016/154534(均在此引入作为参考)中公开了BoNT/BH_CC亚结构域中适宜的氨基酸残基取代、添加或缺失。

BoNT/B H_CC亚结构域中适宜的氨基酸残基取代、添加或缺失包括选自以下的取代突变：V1118M、Y1183M、E1191M、E1191I、E1191Q、E1191T、S1199Y、S1199F、S1199L、S1201V、E1191C、E1191V、E1191L、E1191Y、S1199W、S1199E、S1199H、W1178Y、W1178Q、W1178A、W1178S、Y1183C、Y1183P及其组合。

BoNT/B H_CC亚结构域中适宜的氨基酸残基取代、添加或缺失还包括选自以下的两种取代突变的组合：E1191M和S1199L、E1191M和S1199Y、E1191M和S1199F、E1191Q和S1199L、E1191Q和S1199Y、E1191Q和S1199F、E1191M和S1199W、E1191M和W1178Q、E1191C和S1199W、E1191C和S1199Y、E1191C和W1178Q、E1191Q和S1199W、E1191V和S1199W、E1191V和S1199Y、或E1191V和W1178Q。

BoNT/B H_CC亚结构域中适宜的氨基酸残基取代、添加或缺失还包括E1191M、S1199W和W1178Q这三种取代突变的组合。

优选地，BoNT/B H_CC亚结构域中适宜的氨基酸残基取代、添加或缺失包括E1191M和S1199Y这两种取代突变的组合。这类修饰存在于BoNT/AB嵌合体SEQ ID NO:13和SEQ IDNO:14中。

该修饰可以是与SEQ ID NO:16所示的未修饰的BoNT/B相比的修饰，其中氨基酸残基编号通过与SEQ ID NO:16比对来确定。由于在SEQ ID NO:16(以及对应于本文所述的经修饰的BoNT/A多肽的SEQ ID NOs)的位置1处甲硫氨酸残基的存在是可选的，本领域技术人员在确定氨基酸残基编号时将考虑该甲硫氨酸残基的存在/不存在。例如，在SEQ ID NO:16包含该甲硫氨酸时，位置编号将如上所述(例如，E1191将是SEQ ID NO:16的E1191)。备选地，在SEQ ID NO:16不含该甲硫氨酸时，氨基酸残基编号应通过-1来修改(例如，E1191将是SEQ ID NO:16的E1190)。类似的考虑也适用于本文所述的其他多肽序列的位置1处存在/不存在甲硫氨酸时，并且本领域技术人员将容易地使用本领域常规技术确定正确的氨基酸残基编号。

用于本发明的经修饰的BoNT/A可以包含与选自SEQ ID NO:11-15的多肽序列具有至少70％序列同一性的多肽序列。例如，与选自SEQID NO:11-15的多肽序列具有至少80％、90％、95％或99.9％序列同一性的多肽序列。优选地，用于本发明的经修饰的BoNT/A可以包含选自SEQ ID NO:11-15的多肽序列(更优选由其组成)。

在经修饰的BoNT/A是BoNT/AB嵌合体时，优选的是，经修饰的BoNT/A包含与SEQ IDNO:14具有至少70％序列同一性的多肽序列。例如，与SEQ ID NO:14具有80％、90％、95％或99.9％序列同一性的多肽序列。优选地，用于本发明的经修饰的BoNT/A可以包含SEQ IDNO:14(更优选由其组成)。

通过取代、插入或缺失氨基酸残基来修饰蛋白质的方法在本领域是已知的。例如，可以通过修饰编码BoNT/A(例如，编码未修饰的BoNT/A)的DNA序列来引入氨基酸修饰。这可以使用标准分子克隆技术达到，例如通过定点突变，其中使用聚合酶，用编码所需氨基酸(一个或多个)的短链DNA(寡核苷酸)来替换原始编码序列，或者通过用多种酶(例如连接酶和限制性内切酶)来插入/缺失基因的部分。备选地，可以化学合成经修饰的基因序列。

如上所述，本文所述的经修饰的BoNT/A具有增加的组织保留性质，这也提供了增加的效力和/或作用持续时间，并且可以允许提高剂量而没有任何附加的负面效应。定义这些有利特性(其表现为治疗指数增加)的一种方式是经修饰的BoNT/A的安全性比。在这方面，梭菌毒素的不期望影响(由毒素从施用部位扩散引起)可以通过在相关动物模型中测量体重下降百分比(例如小鼠，其中在施用七天内检测体重下降)来进行实验评估。相反，梭菌毒素的期望中靶效应可以通过趾外展评分(DAS)测定(肌肉麻痹的量度)进行实验评估。DAS测定可通过将20μl的梭菌毒素(配制在明胶磷酸盐缓冲液中)注射到小鼠腓肠肌/比目鱼肌复合体中进行，然后使用Aoki方法(Aoki KR,Toxicon 39:1815-1820；2001)评估趾外展评分。在DAS试验中，通过尾巴将小鼠短暂悬吊，以引起特征性震惊反应，在这种反应中，小鼠伸展其后肢并外展其后趾。注射梭菌毒素后，对不同程度的趾外展按5分制进行评分(0＝正常到4＝趾外展和腿部伸展的最大减少)。

然后，本发明的经修饰的BoNT/A(或用于比较的未修饰的BoNT/A)的安全性比可以表示为体重下降10％所需的毒素量(在小鼠给药后前七天内的峰值效应时测量)与DAS评分为2所需的毒素量之间的比值。因此，高安全性比分数是期望的，其指示毒素能够有效麻痹靶标肌肉而几乎没有不希望的脱靶效应。本发明的经修饰的BoNT/A的安全性比高于等同的未修饰(天然)BoNT/B的安全性比。

因此，在一个实施方案中，本发明的经修饰的BoNT/A具有大于7(例如，至少8、9、10、15、20、25、30、35、40、45或50)的安全性比，其中安全性比计算为：体重变化-10％所需的毒素剂量(pg/小鼠)除以DAS ED₅₀(pg/小鼠)[ED₅₀＝产生DAS得分2所需的剂量]。

在一个实施方案中，本发明的经修饰的BoNT/A具有至少10的安全性比。在一个具体实施方案中，本发明的经修饰的BoNT/A具有至少15的安全性比。

优选地，在经修饰的BoNT/A包含选自以下的一个或多个氨基酸残基时：如本文所述的ASN 886、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1052、ASN1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR1277，该经修饰的BoNT/A具有至少20、更优选至少22(例如23-25)的安全性比。

优选地，在经修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B H_C结构域时，经修饰的BoNT/A具有至少10、更优选至少12(例如14-15)的安全性比。

在使用中，本发明的经修饰的BoNT/A为双链形式。

经修饰的BoNT/A优选为非复合形式(即，不含天然BoNT/A中存在的复合蛋白)。这种复合蛋白的实例包括神经毒素结合蛋白(NAP)和非毒性非血凝素成分(NTNH)。优选的是，经修饰的BoNT/A是重组的经修饰的BoNT/A。

经修饰的BoNT/A可以通过产生具有轻链和重链的单链经修饰的BoNT/A的方法制备，该方法包括在适宜的宿主细胞中表达核酸(该核酸如上所述)，裂解宿主细胞以提供含有单链经修饰的BoNT/A的宿主细胞匀浆物，并分离单链经修饰的BoNT/A。经修饰的BoNT/A然后可通过如下方法活化，该方法包括提供可通过如上所述的产生单链经修饰的BoNT/A的方法获得的单链经修饰的BoNT/A蛋白，使经修饰的BoNT/A与在位于轻链和重链之间的识别位点(切割位点)切割多肽的蛋白酶接触，从而将多肽转化为双链经修饰的BoNT/A，其中轻链和重链通过二硫键连接在一起。

本发明的经修饰的BoNT/A可以以任何适宜的方式配制用于对个体施用，例如作为药物组合物的一部分。因此，在一个方面，本发明提供药物组合物，其包含本发明的经修饰的BoNT/A和可药用载体、赋形剂、助剂和/或盐。

在一个方面，本发明提供经修饰的肉毒神经毒素A(BoNT/A)的单位剂型，该单位剂型包含：

a.1个单位至41个单位(2个单位至41个单位)经修饰的BoNT/A，其中1个单位是对应于小鼠中计算的半数致死剂量(LD₅₀)的经修饰的BoNT/A的量；或

b.8.4pg至350pg(18pg至350pg)经修饰的BoNT/A；和

c.可选地，可药用载体、赋形剂、助剂和/或盐，

i.用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；

iv.插入碱性氨基酸残基；和

v.缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。

在一个实施方案中，本发明提供单位剂型，其包含：

a.1个单位至35个单位经修饰的BoNT/A；或

b.10pg至300pg经修饰的BoNT/A。

a.2个单位至41个单位经修饰的BoNT/A，其中1个单位是对应于小鼠中计算的半数致死剂量(LD₅₀)的经修饰的BoNT/A的量；或

b.18pg至350pg经修饰的BoNT/A；和

c.可选地，可药用载体、赋形剂、助剂和/或盐，

a.0.5个单位至73个单位经修饰的BoNT/A，其中1个单位是对应于小鼠中计算的半数致死剂量(LD₅₀)的经修饰的BoNT/A的量；或

b.12pg至1754pg经修饰的BoNT/A；和

c.可选地，可药用载体、赋形剂、助剂和/或盐，

本发明提供单位剂型，其包含：

a.0.8个单位至62个单位经修饰的BoNT/A；或

b.20pg至1500pg经修饰的BoNT/A。

单位剂型可以包含6个单位至35个单位、12个单位至35个单元、12个单位到24个单位、优选12个单位至18个单位经修饰的BoNT/A。

单位剂型可以包含50pg至300pg、100至300pg、100至200pg、优选100至150pg经修饰的BoNT/A。

本发明也提供试剂盒，其包含：

a.上文定义的单位剂型；和

b.用于处理面纹的说明书；和

c.可选地，稀释剂。

与本发明的多种处理用途相关的实施方案可适用于本发明的方法、组合物(例如单位剂型)和试剂盒，反之亦然。

序列同源性

可以使用多种序列比对方法中的任何一种来确定同一性百分比，包括但不限于全局方法、局部方法和混合方法，例如分段方法。确定同一性百分比的流程是本领域技术人员范围内的常规程序。全局方法从分子的开始到结束比对序列，并通过累加单个残基对的分数和施加缺口罚分来确定最佳比对。非限制性方法包括，例如，CLUSTAL W，参见例如JulieD.Thompson等,CLUSTAL W:Improving the Sensitivity of Progressive MultipleSequence Alignment Through Sequence Weighting,Position-Specific Gap Penaltiesand Weight Matrix Choice,22(22)Nucleic Acids Research 4673-4680(1994)；和迭代细化，参见例如Osamu Gotoh,Significant Improvement in Accuracy of MultipleProtein.Sequence Alignments by Iterative Refinement as Assessed by Referenceto Structural Alignments,264(4)J.MoI.Biol.823-838(1996)。局部方法通过识别所有输入序列共有的一个或多个保守基序来比对序列。非限制性方法包括，例如Match-box，参见例如，Eric Depiereux and Ernest Feytmans,Match-Box:AFundamentally NewAlgorithm for the Simultaneous Alignment of Several Protein Sequences,8(5)CABIOS 501-509(1992)；Gibbs抽样，参见例如C.E.Lawrence等,Detecting SubtleSequence Signals:A Gibbs Sampling Strategy for Multiple Alignment,262(5131)Science 208-214(1993)；Align-M，参见例如Ivo Van WaIIe等,Align-M-ANew Algorithmfor Multiple Alignment of Highly Divergent Sequences,20(9)Bioinformatics:1428-1435(2004)。

因此，通过常规方法确定百分比序列同一性。参见例如Altschul等,Bull.Math.Bio.48:603-16,1986以及Henikoff和Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915-19,1992。简言之，使用10的缺口开放罚分、1的缺口延伸罚分以及如下所示的Henikoff和Henikov(同上)的“blosum 62”评分矩阵(氨基酸用标准单字母代码表示)，比对两个氨基酸序列以优化比对得分。

两个或更多个核酸或氨基酸序列之间的“百分比序列同一性”是序列共有的相同位置数的函数。因此，％同一性可以计算为相同核苷酸/氨基酸的数量除以核苷酸/氨基酸的总数，再乘以100。％序列同一性的计算还可以考虑，为优化两个或多个序列的比对而需要引入的缺口的数量以及每个缺口的长度。两个或多个序列之间的序列比较和百分比同一性的确定可以使用特定的数学算法如BLAST来进行，这将是技术人员所熟悉的。

确定序列同一性的比对得分

A R N D C Q E G H I L K M F P S T W Y V

A 4

R -1 5

N -2 0 6

D -2 -2 1 6

C 0 -3 -3 -3 9

Q -1 1 0 0 -3 5

E -1 0 0 2 -4 2 5

G 0- 2 0 -1 -3 -2 -2 6

H -2 0 1 -1 -3 0 0 -2 8

I -1 -3 -3 -3 -1 -3 -3 -4 -3 4

L -1 -2 -3 -4 -1 -2 -3 -4 -3 2 4

K -1 2 0 -1 -3 1 1 -2 -1 -3 -2 5

M -1 -1 -2 -3 -1 0 -2 -3 -2 1 2 -1 5

F -2 -3 -3 -3 -2 -3 -3 -3 -1 0 0 -3 0 6

P -1 -2 -2 -1 -3 -1 -1 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -4 7

S 1 -1 1 0-1 0 0 0 -1 -2 -2 0 -1 -2 -1 4

T 0 -1 0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1 1 5

W -3 -3 -4 -4 -2 -2 -3 -2 -2 -3 -2 -3 -1 1 -4-3 -2 11

Y -2 -2 -2 -3 -2 -1 -2 -3 2 -1 -1 -2 -1 3 -3 -2 -2 2 7

V 0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3 3 1 -2 1 -1 -2 -2 0 -3 -1 4

然后计算百分比同一性为：

基本上同源的多肽的特征在于具有一个或多个氨基酸取代、缺失或添加。这些变化优选具有微小的性质，即保守氨基酸取代(见下文)和不显著影响多肽的折叠或活性的其他取代；小缺失，通常为1至约30个氨基酸；以及小的氨基或羧基端延伸，如氨基端甲硫氨酸残基、至多约20-25个残基的小接头肽、或亲和标签。

保守氨基酸取代

碱性氨基酸：精氨酸

赖氨酸

组氨酸

酸性氨基酸：谷氨酸

天冬氨酸

极性氨基酸：谷氨酰胺

天冬酰胺

疏水性氨基酸：亮氨酸

异亮氨酸

缬氨酸

芳香族氨基酸：苯丙氨酸

色氨酸

酪氨酸

小氨基酸：甘氨酸

丙氨酸

丝氨酸

苏氨酸

甲硫氨酸

除20种标准氨基酸外，非标准氨基酸(如4-羟脯氨酸、6-N-甲基赖氨酸、2-氨基异丁酸、异缬氨酸和α-甲基丝氨酸)可以取代本发明多肽的氨基酸残基。有限数量的非保守氨基酸、不由遗传密码编码的氨基酸和非天然氨基酸可以取代多肽氨基酸残基。本发明的多肽还可以包含非天然存在的氨基酸残基。

非天然存在的氨基酸包括但不限于反式-3-甲基脯氨酸、2,4-甲酰基脯氨酸、顺式-4-羟脯氨酸、反式-4-羟脯氨酸、N-甲基甘氨酸、别苏氨酸、甲基苏氨酸、羟乙基半胱氨酸、羟乙基高半胱氨酸、硝基谷氨酰胺、高谷氨酰胺、哌可酸、叔亮氨酸、正缬氨酸、2-氮杂苯丙氨酸、3-氮杂苯丙氨酸、4-氮杂苯丙氨酸和4-氟苯丙氨酸。本领域已知几种将非天然存在的氨基酸残基掺入到蛋白质中的方法。例如，可以使用体外系统，其中使用化学氨基酰化的抑制tRNA抑制无义突变。本领域已知合成氨基酸和氨基酰化tRNA的方法。含有无义突变的质粒的转录和翻译可以在无细胞系统中进行，该系统包含大肠杆菌S30提取物以及市售酶和其他试剂。通过层析纯化蛋白质。参见例如Robertson等,J.Am.Chem.Soc.113:2722,1991；Ellman等,Methods Enzymol.202:301,1991；Chung等,Science 259:806-9,1993；和Chung等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:10145-9,1993)。在第二种方法中，通过微量注射突变的mRNA和化学氨基酰化的抑制tRNA在爪蟾卵母细胞中进行翻译(Turcatti等,J.Biol.Chem.271:19991-8,1996)。在第三种方法中，在不存在待替换的天然氨基酸(例如苯丙氨酸)和存在所需的非天然氨基酸(如2-氮杂苯丙氨酸、3-氮杂苯丙氨酸、4-氮杂苯丙氨酸或4-氟苯丙氨酸)的情况下培养大肠杆菌细胞。将非天然存在的氨基酸掺入到多肽中以替换其天然对应物。参见Koide等,Biochem.33:7470-6,1994。天然存在的氨基酸残基可以通过体外化学修饰转化为非天然存在的种类。化学修饰可以与定点诱变相结合，以进一步扩大取代范围(Wynn和Richards,Protein Sci.2:395-403,1993)。

有限数量的非保守氨基酸、遗传密码不编码的氨基酸、非天然存在的氨基酸和非天然氨基酸可以取代本发明的多肽的氨基酸残基。

本发明的多肽中的必需氨基酸可根据本领域已知的方法进行鉴定，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham and Wells,Science 244:1081-5,1989)。生物相互作用位点也可以通过结构的物理分析来确定，如通过核磁共振、结晶学、电子衍射或光亲和标记等技术，结合假定接触位点氨基酸的突变来确定。参见例如de Vos等,Science 255:306-12,1992；Smith等,J.Mol.Biol.224:899-904,1992；Wlodaver等,FEBS Lett.309:59-64,1992。还可以通过分析与本发明多肽的相关成分(例如易位或蛋白酶成分)的同源性来推断必需氨基酸的身份。

可以使用已知的诱变和筛选方法，如Reidhaar-Olson和Sauer(Science 241:53-7,1988)或Bowie和Sauer(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:2152-6,1989)所公开的方法，制备和测试多种氨基酸取代。简言之，这些作者公开了用于同时随机化多肽中两个或多个位置、选择功能性多肽、然后对诱变的多肽进行测序以确定每个位置可允许的取代谱的方法。可使用的其他方法包括噬菌体展示(例如Lowman等,Biochem.30:10832-7,1991；Ladner等,美国专利号5,223,409；Huse,WIPO公开号WO 92/06204)和区域定向诱变(Derbyshire等,Gene46:145,1986；Ner等,DNA 7:127,1988)。

除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。Singleton等,DICTIONARY OF MICROBIOLOGY ANDMOLECULAR BIOLOGY,第20版,John Wiley and Sons,New York(1994)和Hale&Marham,THEHARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY,Harper Perennial,NY(1991)为本领域技术人员提供了本公开中使用的许多术语的通用词典。

本公开不受本文公开的示例性方法和材料的限制，并且与本文描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料都可以用于实施或测试本公开的实施方案。数字范围包括定义该范围的数字。除非另有说明，任何核酸序列都以5'至3'方向从左向右书写；氨基酸序列以氨基到羧基方向从左到右书写。

本文提供的标题不是对本公开的各方面或实施方案的限制。

本文中使用氨基酸名称、三字母缩写或单字母缩写来指代氨基酸。本文所用的术语“蛋白质”包括蛋白质、多肽和肽。本文所用的术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白”同义。在某些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“肽”同义。某些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“酶”同义。术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用。在本公开和权利要求书中，可以使用氨基酸残基的常规单字母和三字母代码。氨基酸的3个字母代码，符合IUPACIUB生物化学命名联合委员会(JCBN)的定义。还应理解，由于遗传密码的简并性，多肽可由一个以上核苷酸序列编码。

术语的其他定义可以出现在整个说明书中。在更详细地描述示例性实施方案之前，应当理解，本公开不限于所描述的具体实施方案，而是可以变化。还应理解，本文中使用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，而并非旨在进行限制，因为本公开的范围将仅由所附权利要求书限定。

在提供数值范围的情况下，应理解，除非上下文另有明确规定，否则也明确公开了该范围的上限和下限之间的每一个间隔下限单位十分之一的居间值。在所述范围内的任何所述值或居间值与该所述范围中的任何其他所述值或居间值之间的每个较小范围都包含在本公开之内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在所述范围内或排除在所述范围之外，并且上下限两者之一或无一或两者包含在该较小范围内的每个范围也包含在本公开之内，并接受在所述范围中明确排除任何限值。在所述范围包含一个或两个限值的情况下，排除其一或两者的范围也包含在本公开之内。

必须指出，除非上下文另有明确规定，本文和所附权利要求书中所用的单数形式“一”、“一种”和“该”包括复数指代物。因此，例如，提到“一种肉毒神经毒素A”包括多数个的此类候选活性剂，而提到“该肉毒神经毒素A”包括提到本领域技术人员已知的一种或多种梭菌神经毒素及其等同物，等等。

本文讨论的出版物仅针对其在本申请提交日期之前的公开内容提供。本文中的任何内容均不应解释为承认此类出版物构成本文所附权利要求的现有技术。

附图简述

现将参考以下附图和实施例描述本发明的实施方案，这些实施例仅作为举例说明。

图1显示FDA批准用于处理成人面纹的

剂量。

图2显示阳离子构建体的等电聚焦(IEF)凝胶。

图3显示Cat5v2(K1064H/N954K)(A)、Cat5v2(K1064H/N886K)(B)和Cat5v2(K1064H/N1025K)(C)在大鼠胚胎脊髓神经元(eSCN)中的SNAP-25切割百分比，以及相对于nBoNT/A1的pEC50总结。(A、B、C)将大鼠胚胎脊髓神经元培养三周并用Cat5v4处理24小时，然后用SNAP-25特异性抗体进行Western印迹。数据为一式三份的三个独立实验的平均值±SEM。(D)在大鼠eSCN SNAP-25切割效力测定中，Cat5v2(K1064H/N886K)、Cat5v2(K1064H/N954K)和Cat5v2(K1064H/N1025K)相对于nBoNT/A1(List Biological Laboratories)的效力。每个点对应于单个批次，是基于8点浓度响应曲线(CRC)的3次独立pEC50测定结果的平均值。CRC中的每个浓度进行一式三份评估。相对于List批次的平均值，进行效力比较，合并数据n＝24。数据为每个Cat5v4的n＝3批次的平均值±SEM。

图4显示，在小鼠膈神经单侧膈肌测定(mPNHD)中，nBoNT/A1和Cat5v4的效力(t₅₀)。如所示，将小鼠膈神经单侧膈肌组织与Cat5v4或天然BoNT/A1孵育。记录膈肌收缩力，直到不再检测到收缩或140分钟后。每个点对应于独立的测定。t₅₀值是抑制小鼠单侧膈肌收缩力50％所需的时间。

图5显示纯化的重组BoNT/AB嵌合体1、2和3A(分别为SEQ ID NO:11、12和13)的SDS-PAGE。泳道标记为“Marker”(分子量标记)、“-DTT”(氧化的BoNT/AB嵌合体样品)和“+DTT”(还原的BoNT/AB嵌合体样品)。

图6显示重组BoNT/AB嵌合体1、2和3A(分别为SEQ ID NO:11、12和13)对大鼠脊髓神经元中SNAP-25的切割。将培养的大鼠原代脊髓神经元(SCN)在37℃、含10％CO2的湿润气氛中暴露于多种浓度的重组BoNT/AB嵌合体1、2或3A持续24小时。然后用补充了DTT和Benzonase的1x NuPAGE缓冲液裂解细胞。将样品转移到微量离心管中，在加热块上90℃加热5分钟，并在-20℃储存，然后通过Western印迹分析SNAP-25切割。使用检测SNAP-25全长和切割形式的多克隆抗体(Sigma#S9684)检测SNAP-25。使用抗兔HRP(Sigma#A6154)作为二抗。

图7显示小鼠趾外展评分测定。在短时间全身麻醉下，在小鼠一个后肢的腓肠肌-比目鱼肌复合体肌肉中进行注射；使用趾外展评分(DAS)以0-4分制测量肌肉弱化。确定每个剂量的DAS最大值，并对剂量作图，将数据拟合到4参数logistic方程，确定导致DAS 4值的ED₅₀和剂量(DAS 4剂量)。

图8显示纯化的重组BoNT/AB嵌合体3B和3C(分别为SEQ ID NO:14和15)的SDS-PAGE。泳道标记为“Marker”(分子量标记)、“-DTT”(氧化的BoNT/AB嵌合体样品)和“+DTT”(还原的BoNT/AB嵌合体样品)。

图9显示，未修饰的BoNT/A以及BoNT/AB嵌合体3B和3C(分别为SEQ ID NO:2、14和15)在人诱导多能干细胞来源的外周神经元(PERI.4U–Axigenesis，德国)中对SNAP-25的切割。使PERI.4U细胞在37℃、含5％CO2的湿润CO₂气氛中暴露于多种浓度的重组BoNT/A或BoNT/AB嵌合体3B或3C共24小时。然后用补充了DTT和Benzonase的1xNuPAGE缓冲液裂解细胞。将样品转移到微量离心管中，在加热块上90℃加热5分钟，并在-20℃储存，然后通过Western印迹分析SNAP-25切割。使用检测SNAP-25全长和切割形式的多克隆抗体(Sigma#S9684)检测SNAP-25。使用抗兔HRP(Sigma#A6154)作为二抗。

图10显示，小鼠趾外展评分测定中肌肉随时间弱化的持续时间。在短时间全身麻醉下，在小鼠一个后肢的腓肠肌-比目鱼肌复合体肌肉中进行注射；使用趾外展评分(DAS)以0-4分制测量肌肉弱化。监测在最低剂量注射组中在注射的前四天内诱导了DAS 4的动物，直到肌无力完全恢复到DAS为0(未观察到肌无力)。

图11显示处理眉间纹时肌内注射经修饰的BoNT/A的注射部位。

图12显示处理眉间纹和额头纹时肌内注射经修饰的BoNT/A的注射部位。

图13显示仅处理外眦纹时肌内注射经修饰的BoNT/A的注射部位。

图14显示处理眉间纹、额头纹和外眦纹时肌内注射经修饰的BoNT/A的注射部位。

序列表

在以下任何SEQ ID NO中指示起始Met氨基酸残基或相应的起始密码子的情况下，该残基/密码子是可选的。

SEQ ID NO:1(未修饰的BoNT/A的核苷酸序列)

ATGCCATTCGTCAACAAGCAATTCAACTACAAAGACCCAGTCAACGGCGTCGACATCGCATACATCAAGATTCCGAACGCCGGTCAAATGCAGCCGGTTAAGGCTTTTAAGATCCACAACAAGATTTGGGTTATCCCGGAGCGTGACACCTTCACGAACCCGGAAGAAGGCGATCTGAACCCGCCACCGGAAGCGAAGCAAGTCCCTGTCAGCTACTACGATTCGACGTACCTGAGCACGGATAACGAAAAAGATAACTACCTGAAAGGTGTGACCAAGCTGTTCGAACGTATCTACAGCACGGATCTGGGTCGCATGCTGCTGACTAGCATTGTTCGCGGTATCCCGTTCTGGGGTGGTAGCACGATTGACACCGAACTGAAGGTTATCGACACTAACTGCATTAACGTTATTCAACCGGATGGTAGCTATCGTAGCGAAGAGCTGAATCTGGTCATCATTGGCCCGAGCGCAGACATTATCCAATTCGAGTGCAAGAGCTTTGGTCACGAGGTTCTGAATCTGACCCGCAATGGCTATGGTAGCACCCAGTACATTCGTTTTTCGCCGGATTTTACCTTCGGCTTTGAAGAGAGCCTGGAGGTTGATACCAATCCGTTGCTGGGTGCGGGCAAATTCGCTACCGATCCGGCTGTCACGCTGGCCCATGAACTGATCCACGCAGGCCACCGCCTGTACGGCATTGCCATCAACCCAAACCGTGTGTTCAAGGTTAATACGAATGCATACTACGAGATGAGCGGCCTGGAAGTCAGCTTCGAAGAACTGCGCACCTTCGGTGGCCATGACGCTAAATTCATTGACAGCTTGCAAGAGAATGAGTTCCGTCTGTACTACTATAACAAATTCAAAGACATTGCAAGCACGTTGAACAAGGCCAAAAGCATCGTTGGTACTACCGCGTCGTTGCAGTATATGAAGAATGTGTTTAAAGAGAAGTACCTGCTGTCCGAGGATACCTCCGGCAAGTTTAGCGTTGATAAGCTGAAGTTTGACAAACTGTACAAGATGCTGACCGAGATTTACACCGAGGACAACTTTGTGAAATTCTTCAAAGTGTTGAATCGTAAAACCTATCTGAATTTTGACAAAGCGGTTTTCAAGATTAACATCGTGCCGAAGGTGAACTACACCATCTATGACGGTTTTAACCTGCGTAACACCAACCTGGCGGCGAACTTTAACGGTCAGAATACGGAAATCAACAACATGAATTTCACGAAGTTGAAGAACTTCACGGGTCTGTTCGAGTTCTATAAGCTGCTGTGCGTGCGCGGTATCATCACCAGCAAAACCAAAAGCCTGGACAAAGGCTACAACAAGGCGCTGAATGACCTGTGCATTAAGGTAAACAATTGGGATCTGTTCTTTTCGCCATCCGAAGATAATTTTACCAACGACCTGAACAAGGGTGAAGAAATCACCAGCGATACGAATATTGAAGCAGCGGAAGAGAATATCAGCCTGGATCTGATCCAGCAGTACTATCTGACCTTTAACTTCGACAATGAACCGGAGAACATTAGCATTGAGAATCTGAGCAGCGACATTATCGGTCAGCTGGAACTGATGCCGAATATCGAACGTTTCCCGAACGGCAAAAAGTACGAGCTGGACAAGTACACTATGTTCCATTACCTGCGTGCACAGGAGTTTGAACACGGTAAAAGCCGTATCGCGCTGACCAACAGCGTTAACGAGGCCCTGCTGAACCCGAGCCGTGTCTATACCTTCTTCAGCAGCGACTATGTTAAGAAAGTGAACAAAGCCACTGAGGCCGCGATGTTCCTGGGCTGGGTGGAACAGCTGGTATATGACTTCACGGACGAGACGAGCGAAGTGAGCACTACCGACAAAATTGCTGATATTACCATCATTATCCCGTATATTGGTCCGGCACTGAACATTGGCAACATGCTGTACAAAGACGATTTTGTGGGTGCCCTGATCTTCTCCGGTGCCGTGATTCTGCTGGAGTTCATTCCGGAGATTGCGATCCCGGTGTTGGGTACCTTCGCGCTGGTGTCCTACATCGCGAATAAGGTTCTGACGGTTCAGACCATCGATAACGCGCTGTCGAAACGTAATGAAAAATGGGACGAGGTTTACAAATACATTGTTACGAATTGGCTGGCGAAAGTCAATACCCAGATCGACCTGATCCGTAAGAAAATGAAAGAGGCGCTGGAGAATCAGGCGGAGGCCACCAAAGCAATTATCAACTACCAATACAACCAGTACACGGAAGAAGAGAAGAATAACATTAACTTCAATATCGATGATTTGAGCAGCAAGCTGAATGAATCTATCAACAAAGCGATGATCAATATCAACAAGTTTTTGAATCAGTGTAGCGTTTCGTACCTGATGAATAGCATGATTCCGTATGGCGTCAAACGTCTGGAGGACTTCGACGCCAGCCTGAAAGATGCGTTGCTGAAATACATTTACGACAATCGTGGTACGCTGATTGGCCAAGTTGACCGCTTGAAAGACAAAGTTAACAATACCCTGAGCACCGACATCCCATTTCAACTGAGCAAGTATGTTGATAATCAACGTCTGTTGAGCACTTTCACCGAGTATATCAAAAACATCATCAATACTAGCATTCTGAACCTGCGTTACGAGAGCAATCATCTGATTGATCTGAGCCGTTATGCAAGCAAGATCAACATCGGTAGCAAGGTCAATTTTGACCCGATCGATAAGAACCAGATCCAGCTGTTTAATCTGGAATCGAGCAAAATTGAGGTTATCCTGAAAAACGCCATTGTCTACAACTCCATGTACGAGAATTTCTCCACCAGCTTCTGGATTCGCATCCCGAAATACTTCAACAGCATTAGCCTGAACAACGAGTATACTATCATCAACTGTATGGAGAACAACAGCGGTTGGAAGGTGTCTCTGAACTATGGTGAGATCATTTGGACCTTGCAGGACACCCAAGAGATCAAGCAGCGCGTCGTGTTCAAGTACTCTCAAATGATCAACATTTCCGATTACATTAATCGTTGGATCTTCGTGACCATTACGAATAACCGTCTGAATAACAGCAAGATTTACATCAATGGTCGCTTGATCGATCAGAAACCGATTAGCAACCTGGGTAATATCCACGCAAGCAACAACATTATGTTCAAATTGGACGGTTGCCGCGATACCCATCGTTATATCTGGATCAAGTATTTCAACCTGTTTGATAAAGAACTGAATGAGAAGGAGATCAAAGATTTGTATGACAACCAATCTAACAGCGGCATTTTGAAGGACTTCTGGGGCGATTATCTGCAATACGATAAGCCGTACTATATGCTGAACCTGTATGATCCGAACAAATATGTGGATGTCAATAATGTGGGTATTCGTGGTTACATGTATTTGAAGGGTCCGCGTGGCAGCGTTATGACGACCAACATTTACCTGAACTCTAGCCTGTACCGTGGTACGAAATTCATCATTAAGAAATATGCCAGCGGCAACAAAGATAACATTGTGCGTAATAACGATCGTGTCTACATCAACGTGGTCGTGAAGAATAAAGAGTACCGTCTGGCGACCAACGCTTCGCAGGCGGGTGTTGAGAAAATTCTGAGCGCGTTGGAGATCCCTGATGTCGGTAATCTGAGCCAAGTCGTGGTTATGAAGAGCAAGAACGACCAGGGTATCACTAACAAGTGCAAGATGAACCTGCAAGACAACAATGGTAACGACATCGGCTTTATTGGTTTCCACCAGTTCAACAATATTGCTAAACTGGTAGCGAGCAATTGGTACAATCGTCAGATTGAGCGCAGCAGCCGTACTTTGGGCTGTAGCTGGGAGTTTATCCCGGTCGATGATGGTTGGGGCGAACGTCCGCTG

SEQ ID NO:2(未修饰的BoNT/A的多肽序列)

MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQA

GVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPL

SEQ ID NO:3(经修饰的BoNT/A“Cat-A”的核苷酸序列)

ATGCCATTCGTCAACAAGCAATTCAACTACAAAGACCCAGTCAACGGCGTCGACATCGCATACATCAAGATTCCGAACGCCGGTCAAATGCAGCCGGTTAAGGCTTTTAAGATCCACAACAAGATTTGGGTTATCCCGGAGCGTGACACCTTCACGAACCCGGAAGAAGGCGATCTGAACCCGCCACCGGAAGCGAAGCAAGTCCCTGTCAGCTACTACGATTCGACGTACCTGAGCACGGATAACGAAAAAGATAACTACCTGAAAGGTGTGACCAAGCTGTTCGAACGTATCTACAGCACGGATCTGGGTCGCATGCTGCTGACTAGCATTGTTCGCGGTATCCCGTTCTGGGGTGGTAGCACGATTGACACCGAACTGAAGGTTATCGACACTAACTGCATTAACGTTATTCAACCGGATGGTAGCTATCGTAGCGAAGAGCTGAATCTGGTCATCATTGGCCCGAGCGCAGACATTATCCAATTCGAGTGCAAGAGCTTTGGTCACGAGGTTCTGAATCTGACCCGCAATGGCTATGGTAGCACCCAGTACATTCGTTTTTCGCCGGATTTTACCTTCGGCTTTGAAGAGAGCCTGGAGGTTGATACCAATCCGTTGCTGGGTGCGGGCAAATTCGCTACCGATCCGGCTGTCACGCTGGCCCATGAACTGATCCACGCAGGCCACCGCCTGTACGGCATTGCCATCAACCCAAACCGTGTGTTCAAGGTTAATACGAATGCATACTACGAGATGAGCGGCCTGGAAGTCAGCTTCGAAGAACTGCGCACCTTCGGTGGCCATGACGCTAAATTCATTGACAGCTTGCAAGAGAATGAGTTCCGTCTGTACTACTATAACAAATTCAAAGACATTGCAAGCACGTTGAACAAGGCCAAAAGCATCGTTGGTACTACCGCGTCGTTGCAGTATATGAAGAATGTGTTTAAAGAGAAGTACCTGCTGTCCGAGGATACCTCCGGCAAGTTTAGCGTTGATAAGCTGAAGTTTGACAAACTGTACAAGATGCTGACCGAGATTTACACCGAGGACAACTTTGTGAAATTCTTCAAAGTGTTGAATCGTAAAACCTATCTGAATTTTGACAAAGCGGTTTTCAAGATTAACATCGTGCCGAAGGTGAACTACACCATCTATGACGGTTTTAACCTGCGTAACACCAACCTGGCGGCGAACTTTAACGGTCAGAATACGGAAATCAACAACATGAATTTCACGAAGTTGAAGAACTTCACGGGTCTGTTCGAGTTCTATAAGCTGCTGTGCGTGCGCGGTATCATCACCAGCAAAACCAAAAGCCTGGACAAAGGCTACAACAAGGCGCTGAATGACCTGTGCATTAAGGTAAACAATTGGGATCTGTTCTTTTCGCCATCCGAAGATAATTTTACCAACGACCTGAACAAGGGTGAAGAAATCACCAGCGATACGAATATTGAAGCAGCGGAAGAGAATATCAGCCTGGATCTGATCCAGCAGTACTATCTGACCTTTAACTTCGACAATGAACCGGAGAACATTAGCATTGAGAATCTGAGCAGCGACATTATCGGTCAGCTGGAACTGATGCCGAATATCGAACGTTTCCCGAACGGCAAAAAGTACGAGCTGGACAAGTACACTATGTTCCATTACCTGCGTGCACAGGAGTTTGAACACGGTAAAAGCCGTATCGCGCTGACCAACAGCGTTAACGAGGCCCTGCTGAACCCGAGCCGTGTCTATACCTTCTTCAGCAGCGACTATGTTAAGAAAGTGAACAAAGCCACTGAGGCCGCGATGTTCCTGGGCTGGGTGGAACAGCTGGTATATGACTTCACGGACGAGACGAGCGAAGTGAGCACTACCGACAAAATTGCTGATATTACCATCATTATCCCGTATATTGGTCCGGCACTGAACATTGGCAACATGCTGTACAAAGACGATTTTGTGGGTGCCCTGATCTTCTCCGGTGCCGTGATTCTGCTGGAGTTCATTCCGGAGATTGCGATCCCGGTGTTGGGTACCTTCGCGCTGGTGTCCTACATCGCGAATAAGGTTCTGACGGTTCAGACCATCGATAACGCGCTGTCGAAACGTAATGAAAAATGGGACGAGGTTTACAAATACATTGTTACGAATTGGCTGGCGAAAGTCAATACCCAGATCGACCTGATCCGTAAGAAAATGAAAGAGGCGCTGGAGAATCAGGCGGAGGCCACCAAAGCAATTATCAACTACCAATACAACCAGTACACGGAAGAAGAGAAGAATAACATTAACTTCAATATCGATGATTTGAGCAGCAAGCTGAATGAATCTATCAACAAAGCGATGATCAATATCAACAAGTTTTTGAATCAGTGTAGCGTTTCGTACCTGATGAATAGCATGATTCCGTATGGCGTCAAACGTCTGGAGGACTTCGACGCCAGCCTGAAAGATGCGTTGCTGAAATACATTTACGACAATCGTGGTACGCTGATTGGCCAAGTTGACCGCTTGAAAGACAAAGTTAACAATACCCTGAGCACCGACATCCCATTTCAACTGAGCAAGTATGTTGATAATCAACGTCTGTTGAGCACTTTCACCGAGTATATCAAAAACATCATCAATACTAGCATTCTGAACCTGCGTTACGAGAGCAAGCATCTGATTGATCTGAGCCGTTATGCTAGCAAGATCAACATCGGTAGCAAGGTCAATTTTGACCCGATCGATAAGAACCAGATCCAGCTGTTTAATCTGGAATCGAGCAAAATTGAGGTTATCCTGAAAAAGGCCATTGTCTACAACTCCATGTACGAGAATTTCTCCACCAGCTTCTGGATTCGCATCCCGAAATACTTCAACAAGATTAGCCTGAACAACGAGTATACTATCATCAACTGTATGGAGAACAACAGCGGTTGGAAGGTGTCTCTGAACTATGGTGAGATCATTTGGACCTTGCAGGACACCAAAGAGATCAAGCAGCGCGTCGTGTTCAAGTACTCTCAAATGATCAACATTTCCGATTACATTAATCGTTGGATCTTCGTGACCATTACGAATAACCGTCTGAATAAGAGCAAGATTTACATCAATGGTCGCTTGATCGATCAGAAACCGATTAGCAACCTGGGTAATATCCACGCAAGCAACAAGATTATGTTCAAATTGGACGGTTGCCGCGATACCCATCGTTATATCTGGATCAAGTATTTCAACCTGTTTGATAAAGAACTGAATGAGAAGGAGATCAAAGATTTGTATGACAACCAATCTAACAGCGGCATTTTGAAGGACTTCTGGGGCGATTATCTGCAATACGATAAGCCGTACTATATGCTGAACCTGTATGATCCGAACAAATATGTGGATGTCAATAATGTGGGTATTCGTGGTTACATGTATTTGAAGGGTCCGCGTGGCAGCGTTATGACGACCAACATTTACCTGAACTCTAGCCTGTACCGTGGTACGAAATTCATCATTAAGAAATATGCCAGCGGCAACAAAGATAACATTGTGCGTAATAACGATCGTGTCTACATCAACGTGGTCGTGAAGAATAAAGAGTACCGTCTGGCGACCAACGCTTCGCAGGCGGGTGTTGAGAAAATTCTGAGCGCGTTGGAGATCCCTGATGTCGGTAATCTGAGCCAAGTCGTGGTTATGAAGAGCAAGAACGACAAGGGTATCACTAACAAGTGCAAGATGAACCTGCAAGACAACAATGGTAACGACATCGGCTTTATTGGTTTCCACCAGTTCAACAATATTGCTAAACTGGTAGCGAGCAATTGGTACAATCGTCAGATTGAGCGCAGCAGCcGTACTTTGGGCTGTAGCTGGGAGTTTATCCCGGTCGATGATGGTTGGGGCGAACGTCCGCTG

SEQ ID NO:4(经修饰的BoNT/A“Cat-A”的多肽序列)

MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESKHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKKAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNKISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTKEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNKSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNKIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDKGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPL

SEQ ID NO:5(经修饰的BoNT/A“Cat-B”的核苷酸序列)

ATGCCATTCGTCAACAAGCAATTCAACTACAAAGACCCAGTCAACGGCGTCGACATCGCATACATCAAGATTCCGAACGCCGGTCAAATGCAGCCGGTTAAGGCTTTTAAGATCCACAACAAGATTTGGGTTATCCCGGAGCGTGACACCTTCACGAACCCGGAAGAAGGCGATCTGAACCCGCCACCGGAAGCGAAGCAAGTCCCTGTCAGCTACTACGATTCGACGTACCTGAGCACGGATAACGAAAAAGATAACTACCTGAAAGGTGTGACCAAGCTGTTCGAACGTATCTACAGCACGGATCTGGGTCGCATGCTGCTGACTAGCATTGTTCGCGGTATCCCGTTCTGGGGTGGTAGCACGATTGACACCGAACTGAAGGTTATCGACACTAACTGCATTAACGTTATTCAACCGGATGGTAGCTATCGTAGCGAAGAGCTGAATCTGGTCATCATTGGCCCGAGCGCAGACATTATCCAATTCGAGTGCAAGAGCTTTGGTCACGAGGTTCTGAATCTGACCCGCAATGGCTATGGTAGCACCCAGTACATTCGTTTTTCGCCGGATTTTACCTTCGGCTTTGAAGAGAGCCTGGAGGTTGATACCAATCCGTTGCTGGGTGCGGGCAAATTCGCTACCGATCCGGCTGTCACGCTGGCCCATGAACTGATCCACGCAGGCCACCGCCTGTACGGCATTGCCATCAACCCAAACCGTGTGTTCAAGGTTAATACGAATGCATACTACGAGATGAGCGGCCTGGAAGTCAGCTTCGAAGAACTGCGCACCTTCGGTGGCCATGACGCTAAATTCATTGACAGCTTGCAAGAGAATGAGTTCCGTCTGTACTACTATAACAAATTCAAAGACATTGCAAGCACGTTGAACAAGGCCAAAAGCATCGTTGGTACTACCGCGTCGTTGCAGTATATGAAGAATGTGTTTAAAGAGAAGTACCTGCTGTCCGAGGATACCTCCGGCAAGTTTAGCGTTGATAAGCTGAAGTTTGACAAACTGTACaAGATGCTGACCGAGATTTACACCGAGGACAACTTTGTGAAATTCTTCAAAGTGTTGAATCGTAAAACCTATCTGAATTTTGACAAAGCGGTTTTCAAGATTAACATCGTGCCGAAGGTGAACTACACCATCTATGACGGTTTTAACCTGCGTAACACCAACCTGGCGGCGAACTTTAACGGTCAGAATACGGAAATCAACAACATGAATTTCACGAAGTTGAAGAACTTCACGGGTCTGTTCGAGTTCTATAAGCTGCTGTGCGTGCGCGGTATCATCACCAGCAAAACCAAAAGCCTGGACAAAGGCTACAACAAGGCGCTGAATGACCTGTGCATTAAGGTAAACAATTGGGATCTGTTCTTTTCGCCATCCGAAGATAATTTTACCAACGACCTGAACAAGGGTGAAGAAATCACCAGCGATACGAATATTGAAGCAGCGGAAGAGAATATCAGCCTGGATCTGATCCAGCAGTACTATCTGACCTTTAACTTCGACAATGAACCGGAGAACATTAGCATTGAGAATCTGAGCAGCGACATTATCGGTCAGCTGGAACTGATGCCGAATATCGAACGTTTCCCGAACGGCAAAAAGTACGAGCTGGACAAGTACACTATGTTCCATTACCTGCGTGCACAGGAGTTTGAACACGGTAAAAGCCGTATCGCGCTGACCAACAGCGTTAACGAGGCCCTGCTGAACCCGAGCCGTGTCTATACCTTCTTCAGCAGCGACTATGTTAAGAAAGTGAACAAAGCCACTGAGGCCGCGATGTTCCTGGGCTGGGTGGAACAGCTGGTATATGACTTCACGGACGAGACGAGCGAAGTGAGCACTACCGACAAAATTGCTGATATTACCATCATTATCCCGTATATTGGTCCGGCACTGAACATTGGCAACATGCTGTACAAAGACGATTTTGTGGGTGCCCTGATCTTCTCCGGTGCCGTGATTCTGCTGGAGTTCATTCCGGAGATTGCGATCCCGGTGTTGGGTACCTTCGCGCTGGTGTCCTACATCGCGAATAAGGTTCTGACGGTTCAGACCATCGATAACGCGCTGTCGAAACGTAATGAAAAATGGGACGAGGTTTACAAATACATTGTTACGAATTGGCTGGCGAAAGTCAATACCCAGATCGACCTGATCCGTAAGAAAATGAAAGAGGCGCTGGAGAATCAGGCGGAGGCCACCAAAGCAATTATCAACTACCAATACAACCAGTACACGGAAGAAGAGAAGAATAACATTAACTTCAATATCGATGATTTGAGCAGCAAGCTGAATGAATCTATCAACAAAGCGATGATCAATATCAACAAGTTTTTGAATCAGTGTAGCGTTTCGTACCTGATGAATAGCATGATTCCGTATGGCGTCAAACGTCTGGAGGACTTCGACGCCAGCCTGAAAGATGCGTTGCTGAAATACATTTACGACAaTCGTGGTACGCTGATTGGCCAAGTTGACCGCTTGAAAGACAAAGTTAACAATACCCTGAGCACCGACATCCCATTTCAACTGAGCAAGTATGTTGATAATCAACGTCTGTTGAGCACTTTCACCGAGTATATCAAAAACATCATCAATACTAGCATTCTGAACCTGCGTTACGAGAGCAATCATCTGATTGATCTGAGCCGTTATGCTAGCAAGATCAACATCGGTAGCAAGGTCAATTTTGACCCGATCGATAAGAACCAGATCCAGCTGTTTAATCTGGAATCGAGCAAAATTGAGGTTATCCTGAAAAAGGCCATTGTCTACAACTCCATGTACGAGAATTTCTCCACCAGCTTCTGGATTCGCATCCCGAAATACTTCAAGAAGATTAGCCTGAACAACGAGTATACTATCATCAACTGTATGGAGAACAACAGCGGTTGGAAGGTGTCTCTGAACTATGGTGAGATCATTTGGACCTTGCAGGACACCAAAGAGATCAAGCAGCGCGTCGTGTTCAAGTACTCTCAAATGATCAACATTTCCGATTACATTAATCGTTGGATCTTCGTGACCATTACGAATAACCGTCTGAATAAGAGCAAGATTTACATCAATGGTCGCTTGATCGATCAGAAACCGATTAGCAACCTGGGTAATATCCACGCAAGCAACAAGATTATGTTCAAATTGGACGGTTGCCGCGATACCCATCGTTATATCTGGATCAAGTATTTCAACCTGTTTGATAAAGAACTGAATGAGAAGGAGATCAAAGATTTGTATGACAACCAATCTAACAGCGGCATTTTGAAGGACTTCTGGGGCGATTATCTGCAATACGATAAGCCGTACTATATGCTGAACCTGTATGATCCGAACAAATATGTGGATGTCAATAATGTGGGTATTCGTGGTTACATGTATTTGAAGGGTCCGCGTGGCAGCGTTATGACGACCAACATTTACCTGAACTCTAGCCTGTACCGTGGTACGAAATTCATCATTAAGAAATATGCCAGCGGCAACAAAGATAACATTGTGCGTAATAACGATCGTGTCTACATCAACGTGGTCGTGAAGAATAAAGAGTACCGTCTGGCGACCAACGCTTCGCAGGCGGGTGTTGAGAAAATTCTGAGCGCGTTGGAGATCCCTGATGTCGGTAATCTGAGCCAAGTCGTGGTTATGAAGAGCAAGAACGACAAGGGTATCACTAACAAGTGCAAGATGAACCTGCAAGACAACAATGGTAACGACATCGGCTTTATTGGTTTCCACCAGTTCAACAATATTGCTAAACTGGTAGCGAGCAATTGGTACAATCGTCAGATTGAGCGCAGCAGCCGTACTTTGGGCTGTAGCTGGGAGTTTATCCCGGTCGATGATGGTTGGGGCGAACGTCCGCTG

SEQ ID NO:6(经修饰的BoNT/A“Cat-B”的多肽序列)

MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKKAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFKKISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTKEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNKSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNKIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDKGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPL

SEQ ID NO:7(经修饰的BoNT/A“Cat-C”的核苷酸序列)

ATGCCATTCGTCAACAAGCAATTCAACTACAAAGACCCAGTCAACGGCGTCGACATCGCATACATCAAGATTCCGAACGCCGGTCAAATGCAGCCGGTTAAGGCTTTTAAGATCCACAACAAGATTTGGGTTATCCCGGAGCGTGACACCTTCACGAACCCGGAAGAAGGCGATCTGAACCCGCCACCGGAAGCGAAGCAAGTCCCTGTCAGCTACTACGATTCGACGTACCTGAGCACGGATAACGAAAAAGATAACTACCTGAAAGGTGTGACCAAGCTGTTCGAACGTATCTACAGCACGGATCTGGGTCGCATGCTGCTGACTAGCATTGTTCGCGGTATCCCGTTCTGGGGTGGTAGCACGATTGACACCGAACTGAAGGTTATCGACACTAACTGCATTAACGTTATTCAACCGGATGGTAGCTATCGTAGCGAAGAGCTGAATCTGGTCATCATTGGCCCGAGCGCAGACATTATCCAATTCGAGTGCAAGAGCTTTGGTCACGAGGTTCTGAATCTGACCCGCAATGGCTATGGTAGCACCCAGTACATTCGTTTTTCGCCGGATTTTACCTTCGGCTTTGAAGAGAGCCTGGAGGTTGATACCAATCCGTTGCTGGGTGCGGGCAAATTCGCTACCGATCCGGCTGTCACGCTGGCCCATGAACTGATCCACGCAGGCCACCGCCTGTACGGCATTGCCATCAACCCAAACCGTGTGTTCAAGGTTAATACGAATGCATACTACGAGATGAGCGGCCTGGAAGTCAGCTTCGAAGAACTGCGCACCTTCGGTGGCCATGACGCTAAATTCATTGACAGCTTGCAAGAGAATGAGTTCCGTCTGTACTACTATAACAAATTCAAAGACATTGCAAGCACGTTGAACAAGGCCAAAAGCATCGTTGGTACTACCGCGTCGTTGCAGTATATGAAGAATGTGTTTAAAGAGAAGTACCTGCTGTCCGAGGATACCTCCGGCAAGTTTAGCGTTGATAAGCTGAAGTTTGACAAACTGTACAAGATGCTGACCGAGATTTACACCGAGGACAACTTTGTGAAATTCTTCAAAGTGTTGAATCGTAAAACCTATCTGAATTTTGACAAAGCGGTTTTCAAGATTAACATCGTGCCGAAGGTGAACTACACCATCTATGACGGTTTTAACCTGCGTAACACCAACCTGGCGGCGAACTTTAACGGTCAGAATACGGAAATCAACAACATGAATTTCACGAAGTTGAAGAACTTCACGGGTCTGTTCGAGTTCTATAAGCTGCTGTGCGTGCGCGGTATCATCACCAGCAAAACCAAAAGCCTGGACAAAGGCTACAACAAGGCGCTGAATGACCTGTGCATTAAGGTAAACAATTGGGATCTGTTCTTTTCGCCATCCGAAGATAATTTTACCAACGACCTGAACAAGGGTGAAGAAATCACCAGCGATACGAATATTGAAGCAGCGGAAGAGAATATCAGCCTGGATCTGATCCAGCAGTACTATCTGACCTTTAACTTCGACAATGAACCGGAGAACATTAGCATTGAGAATCTGAGCAGCGACATTATCGGTCAGCTGGAACTGATGCCGAATATCGAACGTTTCCCGAACGGCAAAAAGTACGAGCTGGACAAGTACACTATGTTCCATTACCTGCGTGCACAGGAGTTTGAACACGGTAAAAGCCGTATCGCGCTGACCAACAGCGTTAACGAGGCCCTGCTGAACCCGAGCCGTGTCTATACCTTCTTCAGCAGCGACTATGTTAAGAAAGTGAACAAAGCCACTGAGGCCGCGATGTTCCTGGGCTGGGTGGAACAGCTGGTATATGACTTCACGGACGAGACGAGCGAAGTGAGCACTACCGACAAAATTGCTGATATTACCATCATTATCCCGTATATTGGTCCGGCACTGAACATTGGCAACATGCTGTACAAAGACGATTTTGTGGGTGCCCTGATCTTCTCCGGTGCCGTGATTCTGCTGGAGTTCATTCCGGAGATTGCGATCCCGGTGTTGGGTACCTTCGCGCTGGTGTCCTACATCGCGAATAAGGTTCTGACGGTTCAGACCATCGATAACGCGCTGTCGAAACGTAATGAAAAATGGGACGAGGTTTACAAATACATTGTTACGAATTGGCTGGCGAAAGTCAATACCCAGATCGACCTGATCCGTAAGAAAATGAAAGAGGCGCTGGAGAATCAGGCGGAGGCCACCAAAGCAATTATCAACTACCAATACAACCAGTACACGGAAGAAGAGAAGAATAACATTAACTTCAATATCGATGATTTGAGCAGCAAGCTGAATGAATCTATCAACAAAGCGATGATCAATATCAACAAGTTTTTGAATCAGTGTAGCGTTTCGTACCTGATGAATAGCATGATTCCGTATGGCGTCAAACGTCTGGAGGACTTCGACGCCAGCCTGAAAGATGCGTTGCTGAAATACATTTACGACAATCGTGGTACGCTGATTGGCCAAGTTGACCGCTTGAAAGACAAAGTTAACAATACCCTGAGCACCGACATCCCATTTCAACTGAGCAAGTATGTTGATAATCAACGTCTGTTGAGCACTTTCACCGAGTATATCAAAAACATCATCAATACTAGCATTCTGAACCTGCGTTACGAGAGCAATCATCTGATTGATCTGAGCCGTTATGCTAGCAAGATCAACATCGGTAGCAAGGTCAATTTTGACCCGATCGATAAGAACCAGATCCAGCTGTTTAATCTGGAATCGAGCAAAATTGAGGTTATCCTGAAAAAGGCCATTGTCTACAACTCCATGTACGAGAATTTCTCCACCAGCTTCTGGATTCGCATCCCGAAATACTTCAACAAGATTAGCCTGAACAACGAGTATACTATCATCAACTGTATGGAGAACAACAGCGGTTGGAAGGTGTCTCTGAACTATGGTGAGATCATTTGGACCTTGCAGGACACCAAAGAGATCAAGCAGCGCGTCGTGTTCAAGTACTCTCAAATGATCAACATTTCCGATTACATTAATCGTTGGATCTTCGTGACCATTACGAATAACCGTCTGAAGAAGAGCAAGATTTACATCAATGGTCGCTTGATCGATCAGAAACCGATTAGCAACCTGGGTAATATCCACGCAAGCAACAAGATTATGTTCAAATTGGACGGTTGCCGCGATACCCATCGTTATATCTGGATCAAGTATTTCAACCTGTTTGATAAAGAACTGAATGAGAAGGAGATCAAAGATTTGTATGACAACCAATCTAACAGCGGCATTTTGAAGGACTTCTGGGGCGATTATCTGCAATACGATAAGCCGTACTATATGCTGAACCTGTATGATCCGAACAAATATGTGGATGTCAATAATGTGGGTATTCGTGGTTACATGTATTTGAAGGGTCCGCGTGGCAGCGTTATGACGACCAACATTTACCTGAACTCTAGCCTGTACCGTGGTACGAAATTCATCATTAAGAAATATGCCAGCGGCAACAAAGATAACATTGTGCGTAATAACGATCGTGTCTACATCAACGTGGTCGTGAAGAATAAAGAGTACCGTCTGGCGACCAACGCTTCGCAGGCGGGTGTTGAGAAAATTCTGAGCGCGTTGGAGATCCCTGATGTCGGTAATCTGAGCCAAGTCGTGGTTATGAAGAGCAAGAACGACAAGGGTATCACTAACAAGTGCAAGATGAACCTGCAAGACAACAATGGTAACGACATCGGCTTTATTGGTTTCCACCAGTTCAACAATATTGCTAAACTGGTAGCGAGCAATTGGTACAATCGTCAGATTGAGCGCAGCAGCCGTACTTTGGGCTGTAGCTGGGAGTTTATCCCGGTCGATGATGGTTGGGGCGAACGTCCGCTG

SEQ ID NO:8(经修饰的BoNT/A“Cat-C”的多肽序列)

MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKKAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNKISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTKEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLKKSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNKIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDKGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPL

SEQ ID NO:9(经修饰的BoNT/A“Cat-D”的核苷酸序列)

ATGCCATTCGTCAACAAGCAATTCAACTACAAAGACCCAGTCAACGGCGTCGACATCGCATACATCAAGATTCCGAACGCCGGTCAAATGCAGCCGGTTAAGGCTTTTAAGATCCACAACAAGATTTGGGTTATCCCGGAGCGTGACACCTTCACGAACCCGGAAGAAGGCGATCTGAACCCGCCACCGGAAGCGAAGCAAGTCCCTGTCAGCTACTACGATTCGACGTACCTGAGCACGGATAACGAAAAAGATAACTACCTGAAAGGTGTGACCAAGCTGTTCGAACGTATCTACAGCACGGATCTGGGTCGCATGCTGCTGACTAGCATTGTTCGCGGTATCCCGTTCTGGGGTGGTAGCACGATTGACACCGAACTGAAGGTTATCGACACTAACTGCATTAACGTTATTCAACCGGATGGTAGCTATCGTAGCGAAGAGCTGAATCTGGTCATCATTGGCCCGAGCGCAGACATTATCCAATTCGAGTGCAAGAGCTTTGGTCACGAGGTTCTGAATCTGACCCGCAATGGCTATGGTAGCACCCAGTACATTCGTTTTTCGCCGGATTTTACCTTCGGCTTTGAAGAGAGCCTGGAGGTTGATACCAATCCGTTGCTGGGTGCGGGCAAATTCGCTACCGATCCGGCTGTCACGCTGGCCCATGAACTGATCCACGCAGGCCACCGCCTGTACGGCATTGCCATCAACCCAAACCGTGTGTTCAAGGTTAATACGAATGCATACTACGAGATGAGCGGCCTgGAAGTCAGCTTCGAAGAACTGCGCACCTTCGGTGGCCATGACGCTAAATTCATTGACAGCTTGCAAGAGAATGAGTTCCGTCTGTACTACTATAACAAATTCAAAGACATTGCAAGCACGTTGAACAAGGCCAAAAGCATCGTTGGTACTACCGCGTCGTTGCAGTATATGAAGAATGTGTTTAAAGAGAAGTACCTGCTGTCCGAGGATACCTCCGGCAAGTTTAGCGTTGATAAGCTGAAGTTTGACAAACTGTACAAGATGCTGACCGAGATTTACACCGAGGACAACTTTGTGAAATTCTTCAAaGTGTTGAATCGTAAAACCTATCTGAATTTTGACAAAGCGGTTTTCaAGATTAACATCGTGCCGAAGGTGAACTACACCATCTATGACGGTTTTAACCTGCGTAACACCAACCTGGCGGCGAACTTTAACGGTCAGAATACGGAAATCAACAACATGAATTTCACGAAGTTGAAGAACTTCACGGGTCTGTTCGAGTTCTATAAGCTGCTGTGCGTGCGCGGTATCATCACCAGCAAAACCAAAAGCCTGGACAAAGGCTACAACAAGGCGCTGAATGACCTGTGCATTAAGGTAAACAATTGGGATCTGTTCTTTTCGCCATCCGAAGATAATTTTACCAACGACCTGAACAAGGGTGAAGAAATCACCAGCGATACGAATATTGAAGCAGCGGAAGAGAATATCAGCCTGGATCTGATCCAGCAGTACTATCTGACCTTTAACTTCGACAATGAACCGGAGAACATTAGCATTGAGAATCTGAGCAGCGACATTATCGGTCAGCTGGAACTGATGCCGAATATCGAACGTTTCCCGAACGGCAAAAAGTACGAGCTGGACAAGTACACTATGTTCCATTACCTGCGTGCACAGGAGTTTGAACACGGTAAAAGCCGTATCGCGCTGACCAACAGCGTTAACGAGGCCCTGCTGAACCCGAGCCGTGTCTATACCTTCTTCAGCAGCGACTATGTTAAGAAAGTGAACAAAGCCACTGAGGCCGCGATGTTCCTGGGCTGGGTGGAACAGCTGGTATATGACTTCACGGACGAGACGAGCGAAGTGAGCACTACCGACAAAaTTGCTGATaTTACCATCATTATCCCGTATATTGGTCCGGCACTGAACATTGGCAACATGCTGTACAAAGACGATTTTGTGGGTGCCCTGATCTTCTCCGGTGCCGTGATTCTGCTGGAGTTCATTCCGGAGATTGCGATCCCGGTGTTGGGTACCTTCGCGCTGGTGTCCTACATCGCGAATAAGGTTCTGACGGTTCAGACCATCGATAACGCGCTGTCGAAACGTAATGAAAAATGGGACGAGGTTTACAAATACATTGTTACGAATTGGCTGGCGAAAGTCaATACCCAGATCGACCTGATCCGTAAGAAAATGAAAGAGGCGCTGGAGAATCAGGCGGAGGCCACCAAAGCAATTATCAACTACCAATACAACCAGTACACGGAAGAAGAGAAGAATAACATTAACTTCAATATCGATGATTTGAGCAGCAAGCTGAATGAATCTATCAACAAAGCGATGATCAATATCAACAAGTTTTTGAATCAGTGTAGCGTTTCGTACCTGATGAATAGCATGATTCCGTATGGCGTCAAACGTCTGGAGGACTTCGACGCCAGCCTGAAAGATGCGTTGCTGAAATACATTTACGACAATCGTGGTACGCTGATTGGCCAAGTTGACCGCTTGAAAGACAAAGTTAACAATACCCTGAGCACCGACATCCCATTTCAACTGAGCAAGTATGTTGATAATCAACGTCTGTTGAGCACTTTCACCGAGTATATCAAAAACATCATCAATACTAGCATTCTGAACCTGCGTTACGAGAGCAATCATCTGATtGATCTGAGCCGTTATGCAAGCAAGATCAACATCGGTAGCAAGGTCAATTTTGACCCGATCGATAAGAACCAGATCCAGCTGTTTAATCTGGAATCGAGCAAAATTGAGGTTATCCTGAAAAACGCCATTGTCTACAACTCCATGTACGAGAATTTCTCCACCAGCTTCTGGATTCGCATCCCGAAATACTTCAACAGCATTAGCCTGAACAACGAGTATACTATCATCAACTGTATGGAGAACAACAGCGGTTGGAAGGTGTCTCTGAACTATGGTGAGATCATTTGGACCTTGCAGGACACCCAAGAGATCAAGCAGCGCGTCGTGTTCAAGTACTCTCAAATGATCAACATTTCCGATTACATTAATCGTTGGATCTTCGTGACCATTACGAATAACCGTCTGAATAACAGCAAGATTTACATCAATGGTCGCTTGATCGATCAGAAACCGATTAGCAACCTGGGTAATATCCACGCAAGCAACAACATTATGTTCAAATTGGACGGTTGCCGCGATACCCATCGTTATATCTGGATCAAGTATTTCAACCTGTTTGATAAAGAACTGAATGAGAAGGAGATCAAAGATTTGTATGACAACCAATCTAACAGCGGCATTTTGAAGGACTTCTGGGGCGATTATCTGCAATACGATAAGCCGTACTATATGCTGAACCTGTATGATCCGAACAAATATGTGGATGTCAATAATGTGGGTATTCGTGGTTACATGTATTTGAAGGGTCCGCGTGGCAGCGTTATGACGACCAACATTTACCTGAACTCTAGCCTGTACCGTGGTACGAAATTCATCATTAAGAAATATGCCAGCGGCAACAAAGATAACATTGTGCGTAATAACGATCGTGTCTACATCAACGTGGTCGTGAAGCGTAAAGAGTACCGTCTGGCGACCAACGCTTCGCAGGCGGGTGTTGAGAAAATTCTGAGCGCGTTGGAGATCCCTCGTGTCCGTCGTCTGAGCCAAGTCGTGGTTATGAAGAGCAAGAACGACCAGGGTATCACTAACAAGTGCAAGATGAACCTGCAAGACCGTCGTGGTAACGACATCGGCTTTATTGGTTTCCACCAGTTCAACAATATTGCTAAACTGGTAGCGAGCAATTGGTACAATCGTCAGATTGAGCGCCGTAGCCGTCGTTTGGGCTGTAGCTGGGAGTTTATCCCGGTCGATGATGGTTGGGGCGAACGTCCGCTG

SEQ ID NO:10(经修饰的BoNT/A“Cat-D”的多肽序列)

MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKRKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPRVRRLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDRRGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERRSRRLGCSWEFIPVDDGWGERPL

SEQ ID NO:11(经修饰的BoNT/A“嵌合体1”的多肽序列)

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SEQ ID NO:12(经修饰的BoNT/A“嵌合体2”的多肽序列)

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SEQ ID NO:13(经修饰的BoNT/A“嵌合体3A”的多肽序列)

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SEQ ID NO:14(经修饰的BoNT/A“嵌合体3B”的多肽序列)

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SEQ ID NO:15(经修饰的BoNT/A“嵌合体3C”的多肽序列)

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SEQ ID NO:16(BoNT/B的多肽序列)

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实施例

实施例1

克隆、表达和纯化

突变编码野生型BoNT/A(SEQ ID NO:2)的核苷酸序列SEQ ID NO:1来引入以下取代，以形成下表1中所示的四个构建体：

表1.构建体

*Cat-D的计算pI为7.45，分子量为149859。

合成编码上述经修饰的BoNT/A分子的DNA构建体，克隆到pJ401表达载体中，然后转化到BL21(DE3)大肠杆菌中。这允许重组Cat-A、Cat-B、Cat-C和Cat-D蛋白在BL21(DE3)大肠杆菌中可溶性过量表达。

使用经典层析技术从大肠杆菌裂解物中纯化重组的经修饰的BoNT。初始纯化步骤采用阳离子交换树脂，随后中间纯化步骤使用疏水相互作用树脂。重组的经修饰的BoNT单链然后通过蛋白水解切割，得到活化的双链经修饰的BoNT。然后采用最后的纯化步骤来去除剩余的污染物。在WO2015/166242、WO2017055274A1、EP2524963B1、EP2677029B1和US10087432B2中教导了适宜的技术。

实施例2

纯化的经修饰的BoNT/A的表征

如下实验表征以上实施例1中所述的经修饰的BoNT。

pI的测量显示，经修饰的BoNT的等电点大于未修饰(天然)的BoNT/A1–参见图2和下表2。

表2.经修饰的BoNT/A的pI值

使用大鼠胚胎脊髓神经元(eSCN)评估经修饰的BoNT进入神经元和切割SNAP-25(BoNT/A1的靶标)的能力。图3显示，经修饰的BoNT保留了与天然BoNT/A1相同的进入神经元和切割SNAP-25的能力。

使用小鼠膈神经单侧膈肌测定(mPNHD)进一步评估了经修饰的BoNT的效力。图4显示，经修饰的BoNT保留了与天然BoNT/A1相同的抑制小鼠单侧膈肌收缩能力的能力。

用体内小鼠趾外展评分(DAS)测定，评估了相对于天然BoNT/A1的效力和安全性。两种分子(Cat-A[SEQ ID NO:4]和Cat-B[SEQ ID NO:6])相对于天然BoNT/A1显示出更高的安全性比，且效力略强。这些数据见下表3：

表3.DAS测定和安全性比

-DAS ED₅₀：诱导DAS 2的计算剂量

-DAS 4剂量：诱导DAS 4的实验剂量

-BW：体重

-用于-10％ΔBW的剂量：与D0时的BW相比，诱导BW减少10％的计算剂量

-安全性比：用于-10％ΔBW的剂量/DAS ED₅₀

安全性比是衡量BoNT处理的负面影响(体重减轻)相对于效力(半数最大趾外展评分(DAS))的指标。其计算为-10％体重(BW)与DAS ED₅₀之间的比值，其中-10％BW指体重减少10％所需的BoNT的量(pg/动物)，ED₅₀指将产生DAS 2的BoNT的量(pg/动物)。

DAS测定通过将20μl配制在明胶磷酸盐缓冲液中的经修饰的BoNT/A注射到小鼠腓肠肌/比目鱼肌复合体中来进行，随后如Aoki之前报告的(Aoki KR,Toxicon 39:1815-1820；2001)，评估趾外展。

实施例3

BoNT/AB嵌合体的克隆、表达和纯化

使用标准分子生物学技术，从编码亲本血清型分子的DNA和适当的寡核苷酸，构建BoNT/AB嵌合构建体1、2、3A、3B和3C(分别为SEQ ID NO:11至15)。然后将其克隆到具有或不具有C端His₁₀标签的pJ401表达载体中，并转化到BLR(DE3)大肠杆菌细胞中进行过量表达。将这些细胞在含1L补充了适当抗生素的改良Terrific Broth(mTB)的2L带挡板锥形烧瓶中37℃和225RPM下摇动培养。A₆₀₀达到>0.5后，将培养箱温度降至16℃，然后1小时后用1mMIPTG诱导，在225RPM摇动20小时，以表达重组BoNT/AB构建体。

收获的细胞通过超声处理裂解，并通过在4℃下以4500RPM离心1小时进行澄清。然后在硫酸铵中提取重组BoNT/AB嵌合分子，并通过标准快速蛋白质液相色谱(FPLC)技术进行纯化。这涉及使用疏水相互作用树脂进行捕获，使用阴离子交换树脂进行中间纯化步骤。然后用内切蛋白酶Lys-C对部分纯化的分子进行蛋白水解切割，以产生活性双链。用第二疏水相互作用树脂进一步纯化，得到最终的BoNT/AB嵌合体。

对于具有十组氨酸标签(H₁₀)的BoNT/AB嵌合分子(嵌合体1、2、3A)，捕获步骤使用固定化镍树脂代替疏水相互作用树脂。

各嵌合体的序列如表4中所示。

表4-嵌合BoNT/AB构建体

实施例4

BoNT/AB嵌合体1、2和3A的比较

如实施例3(图5)中所述，纯化具有C端His₁₀标签和E1191M/S1199Y双突变的BoNT/AB嵌合体1、2和3A，并测试其功能活性。

大鼠脊髓神经元SNAP-25切割测定

制备大鼠脊髓神经元(SCN)的原代培养物，并在96孔组织培养板中培养3周(如Masuyer等,2011,J.Struct.Biol.Structure and activity of a functionalderivative of Clostridium botulinum neurotoxin B中，以及Chaddock等,2002,Protein Expr.Purif.Expression and purification of catalytically active,non-toxic endopeptidase derivatives of Clostridium botulinum toxin type A中所述)。在SCN补料培养基中制备BoNT/AB的系列稀释液。收集并过滤(0.2μm滤器)处理孔的生长培养基。将125μL经过滤的培养基添加回每个测试孔中。然后将125μL经稀释的毒素添加到平板(三个复孔)。将经处理的细胞在37℃、10％CO2下孵育24±1小时。

使用SNAP-25切割测定分析BoNT活性

处理后，去除BoNT，并在PBS(Gibco,UK)中洗涤细胞一次。细胞在补充了0.1M二硫苏糖醇(DTT)和250单位/mL benzonase(Sigma)的1x NuPAGE裂解缓冲液(LifeTechnologies)中裂解。通过SDS-PAGE分离裂解物蛋白并转移至硝酸纤维素膜。用对SNAP-25特异的一抗(Sigma#S9684)探测膜，该抗体识别未被切割的SNAP-25以及被BoNT/A内肽酶切割的SNAP-25。使用的第二抗体是HRP缀合的抗兔IgG(Sigma#A6154)。通过增强型化学发光，检测条带，并使用pXi6 Access(Synoptics,UK)成像。使用GeneTools软件(Syngene,Cambridge,UK)确定条带强度，并计算在每个浓度的BoNT下切割的SNAP-25的百分比。使用GraphPad Prism版本6(GraphPad)，将数据拟合4参数logistic方程并计算pEC₅₀。

下表5提供了在大鼠SCN SNAP-25切割测定中确定的嵌合体1、2和3A的pEC₅₀值。这些结果表明，三种BoNT/AB嵌合体保留了进入大鼠脊髓神经元并切割其靶标底物的能力。然而，在本测定中，嵌合体3A比嵌合体1和2更有效(也参见图6)。

表5.pEC₅₀值。

	pEC<sub>50</sub>±SEM
		嵌合体1	12.42±0.04
嵌合体2	12.57±0.01
		嵌合体3A	12.89±0.04

趾外展评分(DAS)测定

在DAS测定中测量BoNT/AB嵌合体1、2和3A活性的方法，基于小鼠在短暂尾悬吊时的震惊反应足趾伸展反射。这种反射作为趾外展评分(DAS)进行评分，并在将BoNT注入后爪的腓肠肌-比目鱼肌后被抑制。通过尾巴使小鼠短暂悬吊，以引起特征性震惊反应，在这种反应中，动物伸展其后肢并外展其后趾。(Aoki等1999,Eur.J.Neurol.；6(suppl.4)S3-S10)。

注射当天，在诱导室中用氧气中3％异氟烷麻醉小鼠。每只小鼠在右后爪的腓肠肌-比目鱼肌中肌内注射BoNT/AB嵌合体或溶媒(含有0.2％明胶的磷酸盐缓冲液)。

注射神经毒素后，对不同程度的趾外展进行评分，评分从0到4，其中0＝正常，4＝趾外展和腿部伸展的最大减少。使用每个剂量的最大效应平均值，通过非线性调整分析，确定ED₅₀。所使用的数学模型为4参数logistic模型。

在给药后的第一天，每2小时进行一次DAS；此后，每天进行3次，持续4天。

图7显示了嵌合体1、2和3A(分别为SEQ ID NO:11、12和13)的拟合曲线。嵌合体3A曲线向左移动，这意味着与嵌合体1和2相比，较低剂量的嵌合体3A达到了相似的DAS反应，因此表明在小鼠DAS测定中嵌合体3A比其他嵌合体更有效；也见下表(表6)，该表提供了每个嵌合体的计算ED₅₀值和导致DAS 4(最高评分)的剂量。

下表6提供了小鼠DAS测定中未修饰的重组BoNT/A1(rBoNT/A1–SEQ ID NO:2)以及嵌合体1、2和3A的ED₅₀和DAS 4剂量。这些结果表明，在三种嵌合体中，嵌合体3A在诱导肌肉弱化方面具有最高的体内效力。图7和表6中所示的研究是在获自Charles Riverlaboratories的小鼠中进行的。

表6.ED₅₀值

实施例5

BoNT/AB嵌合体3B、3C和未修饰的BoNT/A1的比较

如实施例3(图8)中所述，纯化分别存在和不存在E1191M/S1199Y双突变的不带标签的BoNT/AB嵌合体3B和3C(SEQ ID NO:14和15)，并使用未修饰的BoNT/A(SEQ ID NO:2)作为参考进行功能活性测试。

人多能干细胞SNAP-25切割测定

冷冻保存的PERI.4U细胞购自Axigenesis(Cologne,德国)。按照厂家的建议进行细胞的融化和铺板。简言之，将含有细胞的冻存管在37℃水浴中融化2分钟。温和重悬后，将细胞转移到50ml试管中。用1mL厂家提供的

融化培养基洗涤冻存管，并将培养基逐滴转移至50mL试管中的细胞悬浮液中，然后再逐滴向50mL试管中添加2mL

融化培养基。然后使用血球计数板对细胞进行计数。在此之后，再将6mL

融化培养基添加到细胞悬浮液中。通过在室温下以260xg(例如1100rpm)离心6分钟获得细胞沉淀。然后将细胞重悬在厂家提供的完全

培养基中。将细胞以50000至150000个细胞/cm²的密度，接种在包被有聚-L-鸟氨酸和层黏连蛋白的细胞培养板上。细胞在37℃的加湿CO2气氛中培养，培养期间每2-3天完全更换培养基。

为了进行毒素处理，在

培养基中制备了BoNT的系列稀释液。收集并过滤(0.2μm滤器)处理孔的培养基。将125μL过滤的培养基添加回每个测试孔中。然后将125μL稀释的毒素添加到平板(三个复孔)。将经处理的细胞在37℃、10％CO₂下培养48±1小时。

使用SNAP-25切割测定分析BoNT活性

处理后，去除BoNT，并在PBS(Gibco，英国)中洗涤细胞一次。将细胞在补充了0.1M二硫苏糖醇(DTT)和250单位/mL benzonase(Sigma)的1x NuPAGE裂解缓冲液(LifeTechnologies)中裂解。通过SDS-PAGE分离裂解物蛋白质并转移至硝酸纤维素膜。用对SNAP-25特异的一抗(Sigma#S9684)探测膜，该抗体识别未被切割的SNAP-5以及被BoNT/A内肽酶切割的SNAP-25。使用的第二抗体是HRP缀合的抗兔IgG(Sigma#A6154)。通过增强型化学发光，检测条带，并使用pXi6 Access(Synoptics,UK)成像。使用GeneTools软件(Syngene,Cambridge,UK)确定条带强度，并计算在每个浓度的BoNT下切割的SNAP-25的百分比。使用GraphPad Prism版本6(GraphPad)，将数据拟合到4参数logistic方程并计算pEC₅₀。

图9显示，嵌合体3B和3C在诱导人多能干细胞中切割SNAP-25方面显示出比rBoNT/A1更高的效力，但前者的效力显著更大。这可以通过双突变来解释，该双突变增加了嵌合体3B对这些细胞中存在的人突触结合蛋白II(Synaptotagmin)蛋白受体的亲和力(图9，表7)。

表7.pEC₅₀值

	pEC<sub>50</sub>±SEM
		rBoNT/A1	10.21±0.05
嵌合体3B	12.38±0.06
		嵌合体3C	10.72±0.08

趾外展评分(DAS)测定——安全性比

在DAS测定中测量BoNT活性的方法，基于小鼠在短暂尾悬吊时的震惊反应足趾伸展反射。这种反射作为趾外展评分(DAS)进行评分，并在将BoNT施用入后爪的腓肠肌-比目鱼肌后被抑制。通过尾巴使小鼠短暂悬吊，以引起特征性震惊反应，在这种反应中，动物伸展其后肢并外展其后趾。(Aoki等1999,Eur.J.Neurol.；6(suppl.4)S3-S10)。

注射当天，在诱导室中用氧气中3％异氟烷麻醉小鼠。每只小鼠在右后爪的腓肠肌-比目鱼肌中肌内注射BoNT或溶媒(含有0.2％明胶的磷酸盐缓冲液)。

在给药后的第一天，每2小时进行一次DAS；此后，对于所有剂量，每天进行3次，持续4天。随后监测注射溶媒和最低剂量组中在注射的前四天期间诱导了DAS 4的动物，直到肌无力完全恢复到DAS为0(未观察到肌无力)。

为了计算安全性比，所有动物在注射毒素前一天(D0)称重，此后在整个研究期间每天称重一次。每天计算每个剂量组的平均体重、标准偏差和标准误差平均值。为了获得BoNT的安全性比(-10％ΔBW/ED₅₀)，将研究期间任何时间剂量组的平均体重低于同一剂量组的D0平均重量的10％的剂量，除以所研究BoNT的ED₅₀。致死剂量定义为该剂量组中一只或多只动物死亡的剂量。

图10显示了未修饰的BoNT/A、嵌合体3B和嵌合体3C(SEQ ID NO:2、14和15)的小鼠趾外展评分测定中肌肉随时间弱化的持续时间，表明这些嵌合体具有更长的作用持续时间。

下表8提供了在小鼠DAS测定中测定的rBoNT/A1以及嵌合体3B和3C的ED₅₀和DAS4剂量。该表还提供了DAS 4剂量的总作用持续时间，直到肌无力完全恢复到DAS为0(未观察到肌无力)。此外，该表还显示了上文定义的小鼠致死剂量和安全性比(-10％ΔBW/ED₅₀)。与rBoNT/A1相比，嵌合体3B和3C具有更长的作用持续时间、更好的安全性比和更高的致死剂量。图10和表8中所示的研究是在获自Janvier laboratories的小鼠中进行的。

表8.BoNT/AB嵌合体的DAS和安全性比

实施例6

经修饰的BoNT/A(SEQ ID NO:4)的临床前测试

对经修饰的BoNT/A“Cat-A”(SEQ ID NO:4)进行了额外的临床前测试。

材料和方法

大鼠趾外展评分(DAS)测定

为了评估经修饰的BoNT/A(SEQ ID NO:4)对体内肌肉活动的影响，使用大鼠DAS测定进行了剂量-反应研究。大鼠DAS测定基于在动物被短暂抓住时的足趾伸展反射，这是一种特征性震惊反应。在左腓骨肌复合体中单次注射神经毒素后，肌无力导致趾外展减少。对不同程度的趾外展按5分制进行评分：0＝正常到4＝趾外展和腿部伸展的最大减少(BroideRS,Rubino J,Nicholson GS等The rat Digit Abduction Score(DAS)assay:Aphysiological model for assessing botulinum neurotoxin-induced skeletalmuscle paralysis.Toxicon 2013；71:18-24)。在毒素注射后的前五天连续测量DAS值，之后每隔两到三天测量一次，直到对于低剂量而言经修饰的BoNT/A(SEQ ID NO:4)对脚趾伸展反射的影响完全消失，以及直到对于产生DAS4的剂量而言恢复到DAS2。BoNT诱导的对体重增加的短暂剂量依赖性影响被认为是全身性毒素效应的证据(Torii Y,Goto Y,Nakahira S等Comparison of Systemic Toxicity between Botulinum Toxin SubtypesA1 and A2 in Mice and Rats.Basic Clin.Pharmacol.Toxicol.2015；116:524-528.)。因此，在每个评价时间点，对大鼠进行称重，并记录副作用。在注射前和研究结束前，掩藏BoNT的给药溶液(分配随机字母)。效力被确定为诱导50％效应所需的剂量(ED₅₀：导致DAS值为2的剂量)。为了确定ED₅₀和95％置信区间(CI)，测试了范围在2.5和750pg/kg之间的剂量。还施用了更高剂量1、1.5、2、2.4、3、4和5ng/kg，以评估可能的副作用。

为了评价经修饰的BoNT/A(SEQ ID NO:4)的作用持续时间，并将其与未修饰的BoNT/A(SEQ ID NO:2)的作用持续时间进行比较，在两项独立的直接头对头研究中，针对两种毒素的最高耐受剂量(与未经处理的大鼠相比对体重演变无影响)，评估了恢复到DAS2读数为2所需的中位时间。

大鼠单剂量研究

大鼠接受以0、0.1、1和3ng/kg的剂量单次肌内(i.m.)注射到右腓肠肌中的经修饰的BoNT/A(SEQ ID NO:4)。对照动物在右腓肠肌中接受SEQ ID NO:4稀释剂。在处理后7天(每组10只雄性和10只雌性)或在13周或26周的观察期(每个剂量5只雄性和5只雌性)后，对动物实施安乐死。在测试前(第-1天)、第8天以及第13周和第27周进行了用于评估中枢神经系统功能的Irwin测试观察。评估的其他临床(不良)体征包括跛行、注射毒素的肌肉尺寸小、和腹部软胀。

猴子研究

猴子接受施用到右腓肠肌中的0、0.1、0.25和0.75ng/kg经修饰的BoNT/A(SEQ IDNO:4)的单个肌内(i.m.)剂量。在处理后7天(每组三只雄性和三只雌性)或在13周或26周观察期(每剂量两只雄性和两只雌性)后，对动物实施安乐死。在测试前、第8天和第15天，通过外部遥测，进行了心血管检查，包括血流动力学、心电图和呼吸参数。

妊娠大鼠中的初步增强EFD

本研究的目的是提供初步信息，说明在整个器官发生期间，通过i.m.途径施用时，经修饰的BoNT/A(SEQ ID NO:4)对大鼠胚胎和胎儿发育的影响。从妊娠第6天(G6)到第17天(G17)，以0.02、0.05和0.1ng/kg/天的剂量水平，通过每日i.m.注射(腓肠肌)对9只交配的雌性Sprague-Dawley大鼠的组，施用经修饰的BoNT/A(SEQ ID NO:4)。在整个研究过程中监测临床状况、体重和食物消耗。在G21对雌性进行剖腹产检查，并记录幼崽参数。尸检时，对雌性进行目视检查，称重妊娠子宫，对出现小注射腓肠肌的雌性，称重此腓肠肌和对侧肌。所有胎儿均称重。然后检查胎儿的外部和内脏异常并进行性别鉴定。固定大约一半胎儿的头部用于通过连续切片进行内部检查。处理所有胎儿的去内脏尸体进行骨骼检查。

妊娠兔中的初步延长EFD

本研究的目的是提供初步信息，说明在整个器官发生期间通过i.m.途径施用时，经修饰的BoNT/A(SEQ ID NO:4)对兔胚胎和胎儿发育的影响。从妊娠第6天(G6)到第19天(G19)(含第19天)，以0.002、0.005和0.01ng/kg/天的剂量水平，通过每日i.m.注射(腓肠肌)，对9只交配的雌性新西兰白兔的组，施用经修饰的BoNT/A(SEQ ID NO:4)。在整个研究过程中监测临床状况、体重和食物消耗。在G29对雌性进行剖腹产检查，并记录幼崽参数。尸检时，对雌性进行目视检查，称重妊娠子宫，对出现小注射腓肠肌的雌性，称重此腓肠肌和对侧肌。所有胎儿均称重。然后检查胎儿的外部和内脏异常并进行性别鉴定。固定大约一半胎儿的头部用于通过连续切片进行内部检查。

结果

通过进行如上所述的研究，获得了施用经修饰的BoNT/A的多种不同物种的以下药理数据(如下表9所示)。

表9.临床前结果

此外，在大鼠DAS测定中测试了经修饰的BoNT/A(SEQ ID NO:4)，以确定与

相比的作用持续时间。结果见下表10：

表10.作用持续时间

这些数据表明，经修饰的BoNT/A的作用持续时间是

的两倍以上。

实施例7

用于处理面纹的经修饰的BoNT/A(SEQ ID NO:4)的单位剂量的计算

考虑到在上述实施例6中获得的临床前药理学数据，已经计算了在人体中施用经修饰的BoNT/A的适宜的单位剂量范围(UD)。研究表明，与未修饰的BoNT/A相比，经修饰的BoNT/A提供了更长的作用持续时间，同时表现出改善的安全性特征。这种改善的安全性特征可以通过本文所述的经修饰的BoNT/A的高安全性比来表示。

由于经修饰的BoNT/A与

具有相同的作用机制(但由于其经修饰的特性而具有增加的治疗指数(即，增加的安全性比))，相对于同一肌肉组中

的标签剂量，针对以下，已经定位用于处理个体面纹的经修饰BoNT/A的最低剂量：

·在趾外展评分大鼠模型中，使用预期用于临床应用的批次，得到的经修饰的BoNT/A的ED₅₀为13pg/kg，比同一动物物种中估计的未观察到不良反应水平(NOAEL)的1500pg/kg，低100倍以上。在应用相应的异速生长因子后，该ED₅₀可以转化为130pg的人体等效剂量(HED)。基于DAS大鼠发现，估计100pg经修饰的BoNT/AB将约为市售Azzalure/Dysport的4U剂量。如果使用由Azzalure/Dysport建立的DAS大鼠ED₅₀(即，0.5U/kg的ED₅₀)通过同样的方式计算起始剂量，这将等同于5U的总起始剂量，这是用于暂时改善中度至重度GL的50U总注册剂量的1/10。

·腹腔内小鼠LD₅₀建立在0.422ng/kg(8.44pg/动物)。在这些条件下，0.84ng经修饰的BoNT/A的剂量对应于100U

的剂量。

因此，计算的最低起始总剂量为100pg。为了提供一些背景，使用上述腹腔内小鼠LD₅₀数据，100pg经修饰的BoNT/A相当于约12U的

因此，在肌内施用处理面纹时，其将具有活性。

因此，单位剂量的上限计算为300pg(0.3ng)，对个体施用的总剂量为4800pg，因为这仍然低于换算为人体剂量的大鼠NOAEL。

因此，使用经修饰的BoNT/A处理面纹的适宜单位剂量，已经计算为20-300pg。基于所获得的这些临床前数据，基于使用小鼠腹腔致死剂量测定法确定的小鼠中的计算半数致死腹腔剂量(LD₅₀)，这是2-35个单位的经修饰的BoNT/A。

有利地，在达到最大剂量之前，在处理面纹时，可以将经修饰的BoNT/A注射到更多数量的肌肉中。这是一项重要且有利的发现，可改善上部面纹的处理，同时为临床医生提供更广泛的处理选择。

实施例8

用于处理眉间纹的剂量方案

经修饰的BoNT/A以冻干粉末的形式提供在2mL透明玻璃瓶中，每瓶含有15ng经修饰的BoNT/A。冻干粉末用无防腐剂的无菌氯化钠0.9％v/w溶液和稀释剂(仅含经修饰的BoNT/A的赋形剂的制剂缓冲液)的混合物复溶。复溶后，根据需要进一步稀释溶液。

按照图11中所示的注射方案，处理中度至重度眉间纹。

单位剂量为20-300pg(2-35个单位)。

按照单位剂量在至多五个部位处施用肌内注射。所施用的最大总剂量为1500pg(177个单位)。

实施例9

用于处理眉间纹和额头纹的剂量方案

按照图12中所示的注射方案，处理中度至重度眉间纹和额头纹。

单位剂量为20-300pg(2-35个单位)。

按照单位剂量在至多十个部位处施用肌内注射。所施用的最大总剂量为3000pg(355个单位)。

实施例10

用于处理外眦纹的剂量方案

按照图13中所示的注射方案，处理中度至重度外眦纹。

单位剂量为20-300pg(2-35个单位)。

按照单位剂量在至多六个部位处施用肌内注射。所施用的最大总剂量为1800pg(213个单位)。

实施例11

用于处理眉间纹、额头纹和外眦纹的剂量方案

按照图14中所示的注射方案，处理中度至重度眉间纹、额头纹和外眦纹。

单位剂量为20-300pg(2-35个单位)。

按照单位剂量在至多十六个部位处施用肌内注射。所施用的最大总剂量为4800pg(569个单位)。

实施例12

经修饰的BoNT/A(SEQ ID NO:14)的进一步表征

在小鼠LD₅₀测定中测试BoNT/AB嵌合体SEQ ID NO:14，结果为1.202ng/kg。因此，SEQ ID NO:14的1个单位在该测定中对应于24.04pg。

此外，在大鼠DAS测定中测试该BoNT/AB嵌合体，以确定与

相比的作用持续时间(按照实施例6)。结果见下表13：

表13.作用持续时间

总之，BoNT/AB的作用持续时间远高于

且与SEQ ID NO:4的作用持续时间相似。因此，预期SEQ ID NO:4的单位剂量和剂量方案可类似地适用于BoNT/AB，以改善面纹的处理。

实施例13

用于上部面纹的经修饰的BoNT/A(SEQ ID NO:14)的单位剂量的计算

鉴于临床前药理学数据，已计算出在人体中施用经修饰的BoNT/A的适宜单位剂量范围(UD)。

对于SEQ ID NO:14，计算出13pg/kg的DAS ED₅₀。ED₅₀被视为最小药理学活性剂量，其比同一动物物种中4ng/kg的未观察到不良反应水平(NOAEL)低约300倍。大鼠中13pg/kg的SEQ ID NO:14的ED₅₀对应于60kg体重的人的0.8ng剂量。

因此，选择了20pg的单位剂量下限。选择的单位剂量上限为1500pg，其低于由两种非临床安全性物种(大鼠和猴子)的4ng/kg NOAEL转换成的60kg体重人体剂量。

鉴于安全性特征的改善，处理上部面纹的最大总剂量设定为24000pg，这是从两种非临床安全性物种(大鼠和猴子)的4ng/kg NOAEL换算成60kg体重的人体剂量得出的。

实施例14

使用经修饰的BoNT/A(SEQ ID NO:14)处理眉间纹的剂量方案

经修饰的BoNT/A以冻干粉末的形式提供在小瓶中，每瓶含有36ng经修饰的BoNT/A。将冻干粉末复溶。

按照图11中所示的注射方案，处理中度至重度眉间纹。

单位剂量为20-1500pg(0.8-62个单位)。

按照单位剂量在至多五个部位处施用肌内注射。所施用的最大总剂量为7500pg(312个单位)。

实施例15

使用经修饰的BoNT/A(SEQ ID NO:14)处理眉间纹和额头纹的剂量方案

单位剂量为20-1500pg(0.8-62个单位)。

按照单位剂量在至多十个部位处施用肌内注射。所施用的最大总剂量为15000pg(624个单位)。

实施例16

使用经修饰的BoNT/A(SEQ ID NO:14)处理外眦纹的剂量方案

按照图13中所示的注射方案处理中度至重度外眦纹。

单位剂量为20-1500pg(0.8-62个单位)。

按照单位剂量在至多六个部位处施用肌内注射。所施用的最大总剂量为9000pg(374个单位)。

实施例17

使用经修饰的BoNT/A(SEQ ID NO:14)处理眉间纹、额头纹和外眦纹的剂量方案

按照图14中所示的注射方案处理中度至重度眉间纹、额头纹和外眦纹。

单位剂量为20-1500pg(0.8-62个单位)。

按照单位剂量在至多十六个部位处施用肌内注射。所施用的最大总剂量为24000pg(998个单位)。

上述说明书中提及的所有出版物在此引入作为参考。在不脱离本发明的范围和精神的情况下，所描述的本发明的方法和系统的多种修改和变化对于本领域技术人员将是显而易见的。虽然已经结合具体的优选实施方案描述了本发明，但是应当理解，所要求保护的本发明不应当不适当地限于这类具体实施方案。事实上，对于生物化学和生物技术或相关领域的技术人员而言显而易见的用于实施本发明的所述模式的多种修改，均旨在处于以下权利要求的范围内。

序列表

<110> 益普生生物制药有限公司(IPSEN BIOPHARM LIMITED)

<120> 上部面纹的处理(TREATMENT OF UPPER FACIAL LINES)

<130> P66420WO

<150> GB2003813.9

<151> 2020-03-16

<160> 16

<170> PatentIn 版本3.5

<210> 1

<211> 3888

<212> DNA

<213> 肉毒梭菌（Clostridium botulinum）

<400> 1

atgccattcg tcaacaagca attcaactac aaagacccag tcaacggcgt cgacatcgca 60

tacatcaaga ttccgaacgc cggtcaaatg cagccggtta aggcttttaa gatccacaac 120

aagatttggg ttatcccgga gcgtgacacc ttcacgaacc cggaagaagg cgatctgaac 180

ccgccaccgg aagcgaagca agtccctgtc agctactacg attcgacgta cctgagcacg 240

gataacgaaa aagataacta cctgaaaggt gtgaccaagc tgttcgaacg tatctacagc 300

acggatctgg gtcgcatgct gctgactagc attgttcgcg gtatcccgtt ctggggtggt 360

agcacgattg acaccgaact gaaggttatc gacactaact gcattaacgt tattcaaccg 420

gatggtagct atcgtagcga agagctgaat ctggtcatca ttggcccgag cgcagacatt 480

atccaattcg agtgcaagag ctttggtcac gaggttctga atctgacccg caatggctat 540

ggtagcaccc agtacattcg tttttcgccg gattttacct tcggctttga agagagcctg 600

gaggttgata ccaatccgtt gctgggtgcg ggcaaattcg ctaccgatcc ggctgtcacg 660

ctggcccatg aactgatcca cgcaggccac cgcctgtacg gcattgccat caacccaaac 720

cgtgtgttca aggttaatac gaatgcatac tacgagatga gcggcctgga agtcagcttc 780

gaagaactgc gcaccttcgg tggccatgac gctaaattca ttgacagctt gcaagagaat 840

gagttccgtc tgtactacta taacaaattc aaagacattg caagcacgtt gaacaaggcc 900

aaaagcatcg ttggtactac cgcgtcgttg cagtatatga agaatgtgtt taaagagaag 960

tacctgctgt ccgaggatac ctccggcaag tttagcgttg ataagctgaa gtttgacaaa 1020

ctgtacaaga tgctgaccga gatttacacc gaggacaact ttgtgaaatt cttcaaagtg 1080

ttgaatcgta aaacctatct gaattttgac aaagcggttt tcaagattaa catcgtgccg 1140

aaggtgaact acaccatcta tgacggtttt aacctgcgta acaccaacct ggcggcgaac 1200

tttaacggtc agaatacgga aatcaacaac atgaatttca cgaagttgaa gaacttcacg 1260

ggtctgttcg agttctataa gctgctgtgc gtgcgcggta tcatcaccag caaaaccaaa 1320

agcctggaca aaggctacaa caaggcgctg aatgacctgt gcattaaggt aaacaattgg 1380

gatctgttct tttcgccatc cgaagataat tttaccaacg acctgaacaa gggtgaagaa 1440

atcaccagcg atacgaatat tgaagcagcg gaagagaata tcagcctgga tctgatccag 1500

cagtactatc tgacctttaa cttcgacaat gaaccggaga acattagcat tgagaatctg 1560

agcagcgaca ttatcggtca gctggaactg atgccgaata tcgaacgttt cccgaacggc 1620

aaaaagtacg agctggacaa gtacactatg ttccattacc tgcgtgcaca ggagtttgaa 1680

cacggtaaaa gccgtatcgc gctgaccaac agcgttaacg aggccctgct gaacccgagc 1740

cgtgtctata ccttcttcag cagcgactat gttaagaaag tgaacaaagc cactgaggcc 1800

gcgatgttcc tgggctgggt ggaacagctg gtatatgact tcacggacga gacgagcgaa 1860

gtgagcacta ccgacaaaat tgctgatatt accatcatta tcccgtatat tggtccggca 1920

ctgaacattg gcaacatgct gtacaaagac gattttgtgg gtgccctgat cttctccggt 1980

gccgtgattc tgctggagtt cattccggag attgcgatcc cggtgttggg taccttcgcg 2040

ctggtgtcct acatcgcgaa taaggttctg acggttcaga ccatcgataa cgcgctgtcg 2100

aaacgtaatg aaaaatggga cgaggtttac aaatacattg ttacgaattg gctggcgaaa 2160

gtcaataccc agatcgacct gatccgtaag aaaatgaaag aggcgctgga gaatcaggcg 2220

gaggccacca aagcaattat caactaccaa tacaaccagt acacggaaga agagaagaat 2280

aacattaact tcaatatcga tgatttgagc agcaagctga atgaatctat caacaaagcg 2340

atgatcaata tcaacaagtt tttgaatcag tgtagcgttt cgtacctgat gaatagcatg 2400

attccgtatg gcgtcaaacg tctggaggac ttcgacgcca gcctgaaaga tgcgttgctg 2460

aaatacattt acgacaatcg tggtacgctg attggccaag ttgaccgctt gaaagacaaa 2520

gttaacaata ccctgagcac cgacatccca tttcaactga gcaagtatgt tgataatcaa 2580

cgtctgttga gcactttcac cgagtatatc aaaaacatca tcaatactag cattctgaac 2640

ctgcgttacg agagcaatca tctgattgat ctgagccgtt atgcaagcaa gatcaacatc 2700

ggtagcaagg tcaattttga cccgatcgat aagaaccaga tccagctgtt taatctggaa 2760

tcgagcaaaa ttgaggttat cctgaaaaac gccattgtct acaactccat gtacgagaat 2820

ttctccacca gcttctggat tcgcatcccg aaatacttca acagcattag cctgaacaac 2880

gagtatacta tcatcaactg tatggagaac aacagcggtt ggaaggtgtc tctgaactat 2940

ggtgagatca tttggacctt gcaggacacc caagagatca agcagcgcgt cgtgttcaag 3000

tactctcaaa tgatcaacat ttccgattac attaatcgtt ggatcttcgt gaccattacg 3060

aataaccgtc tgaataacag caagatttac atcaatggtc gcttgatcga tcagaaaccg 3120

attagcaacc tgggtaatat ccacgcaagc aacaacatta tgttcaaatt ggacggttgc 3180

cgcgataccc atcgttatat ctggatcaag tatttcaacc tgtttgataa agaactgaat 3240

gagaaggaga tcaaagattt gtatgacaac caatctaaca gcggcatttt gaaggacttc 3300

tggggcgatt atctgcaata cgataagccg tactatatgc tgaacctgta tgatccgaac 3360

aaatatgtgg atgtcaataa tgtgggtatt cgtggttaca tgtatttgaa gggtccgcgt 3420

ggcagcgtta tgacgaccaa catttacctg aactctagcc tgtaccgtgg tacgaaattc 3480

atcattaaga aatatgccag cggcaacaaa gataacattg tgcgtaataa cgatcgtgtc 3540

tacatcaacg tggtcgtgaa gaataaagag taccgtctgg cgaccaacgc ttcgcaggcg 3600

ggtgttgaga aaattctgag cgcgttggag atccctgatg tcggtaatct gagccaagtc 3660

gtggttatga agagcaagaa cgaccagggt atcactaaca agtgcaagat gaacctgcaa 3720

gacaacaatg gtaacgacat cggctttatt ggtttccacc agttcaacaa tattgctaaa 3780

ctggtagcga gcaattggta caatcgtcag attgagcgca gcagccgtac tttgggctgt 3840

agctgggagt ttatcccggt cgatgatggt tggggcgaac gtccgctg 3888

<210> 2

<211> 1296

<212> PRT

<213> 肉毒梭菌（Clostridium botulinum）

<400> 2

Met Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly

1 5 10 15

Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Ala Gly Gln Met Gln Pro

20 25 30

Val Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg

35 40 45

Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu

50 55 60

Ala Lys Gln Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr

65 70 75 80

Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu

85 90 95

Arg Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser Ile Val

100 105 110

Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys

115 120 125

Val Ile Asp Thr Asn Cys Ile Asn Val Ile Gln Pro Asp Gly Ser Tyr

130 135 140

Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val Ile Ile Gly Pro Ser Ala Asp Ile

145 150 155 160

Ile Gln Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn Leu Thr

165 170 175

Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Tyr Ile Arg Phe Ser Pro Asp Phe

180 185 190

Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro Leu Leu

195 200 205

Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala His Glu

210 215 220

Leu Ile His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn Pro Asn

225 230 235 240

Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly Leu

245 250 255

Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala Lys

260 265 270

Phe Ile Asp Ser Leu Gln Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr Asn

275 280 285

Lys Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser Ile Val

290 295 300

Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gln Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys Glu Lys

305 310 315 320

Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp Lys Leu

325 330 335

Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu Asp

340 345 350

Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr Leu Asn

355 360 365

Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys Ile Asn Ile Val Pro Lys Val Asn Tyr

370 375 380

Thr Ile Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala Ala Asn

385 390 395 400

Phe Asn Gly Gln Asn Thr Glu Ile Asn Asn Met Asn Phe Thr Lys Leu

405 410 415

Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys Val Arg

420 425 430

Gly Ile Ile Thr Ser Lys Thr Lys Ser Leu Asp Lys Gly Tyr Asn Lys

435 440 445

Ala Leu Asn Asp Leu Cys Ile Lys Val Asn Asn Trp Asp Leu Phe Phe

450 455 460

Ser Pro Ser Glu Asp Asn Phe Thr Asn Asp Leu Asn Lys Gly Glu Glu

465 470 475 480

Ile Thr Ser Asp Thr Asn Ile Glu Ala Ala Glu Glu Asn Ile Ser Leu

485 490 495

Asp Leu Ile Gln Gln Tyr Tyr Leu Thr Phe Asn Phe Asp Asn Glu Pro

500 505 510

Glu Asn Ile Ser Ile Glu Asn Leu Ser Ser Asp Ile Ile Gly Gln Leu

515 520 525

Glu Leu Met Pro Asn Ile Glu Arg Phe Pro Asn Gly Lys Lys Tyr Glu

530 535 540

Leu Asp Lys Tyr Thr Met Phe His Tyr Leu Arg Ala Gln Glu Phe Glu

545 550 555 560

His Gly Lys Ser Arg Ile Ala Leu Thr Asn Ser Val Asn Glu Ala Leu

565 570 575

Leu Asn Pro Ser Arg Val Tyr Thr Phe Phe Ser Ser Asp Tyr Val Lys

580 585 590

Lys Val Asn Lys Ala Thr Glu Ala Ala Met Phe Leu Gly Trp Val Glu

595 600 605

Gln Leu Val Tyr Asp Phe Thr Asp Glu Thr Ser Glu Val Ser Thr Thr

610 615 620

Asp Lys Ile Ala Asp Ile Thr Ile Ile Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala

625 630 635 640

Leu Asn Ile Gly Asn Met Leu Tyr Lys Asp Asp Phe Val Gly Ala Leu

645 650 655

Ile Phe Ser Gly Ala Val Ile Leu Leu Glu Phe Ile Pro Glu Ile Ala

660 665 670

Ile Pro Val Leu Gly Thr Phe Ala Leu Val Ser Tyr Ile Ala Asn Lys

675 680 685

Val Leu Thr Val Gln Thr Ile Asp Asn Ala Leu Ser Lys Arg Asn Glu

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Lys Trp Asp Glu Val Tyr Lys Tyr Ile Val Thr Asn Trp Leu Ala Lys

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Val Asn Thr Gln Ile Asp Leu Ile Arg Lys Lys Met Lys Glu Ala Leu

725 730 735

Glu Asn Gln Ala Glu Ala Thr Lys Ala Ile Ile Asn Tyr Gln Tyr Asn

740 745 750

Gln Tyr Thr Glu Glu Glu Lys Asn Asn Ile Asn Phe Asn Ile Asp Asp

755 760 765

Leu Ser Ser Lys Leu Asn Glu Ser Ile Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile

770 775 780

Asn Lys Phe Leu Asn Gln Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met Asn Ser Met

785 790 795 800

Ile Pro Tyr Gly Val Lys Arg Leu Glu Asp Phe Asp Ala Ser Leu Lys

805 810 815

Asp Ala Leu Leu Lys Tyr Ile Tyr Asp Asn Arg Gly Thr Leu Ile Gly

820 825 830

Gln Val Asp Arg Leu Lys Asp Lys Val Asn Asn Thr Leu Ser Thr Asp

835 840 845

Ile Pro Phe Gln Leu Ser Lys Tyr Val Asp Asn Gln Arg Leu Leu Ser

850 855 860

Thr Phe Thr Glu Tyr Ile Lys Asn Ile Ile Asn Thr Ser Ile Leu Asn

865 870 875 880

Leu Arg Tyr Glu Ser Asn His Leu Ile Asp Leu Ser Arg Tyr Ala Ser

885 890 895

Lys Ile Asn Ile Gly Ser Lys Val Asn Phe Asp Pro Ile Asp Lys Asn

900 905 910

Gln Ile Gln Leu Phe Asn Leu Glu Ser Ser Lys Ile Glu Val Ile Leu

915 920 925

Lys Asn Ala Ile Val Tyr Asn Ser Met Tyr Glu Asn Phe Ser Thr Ser

930 935 940

Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Phe Asn Ser Ile Ser Leu Asn Asn

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Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Glu Asn Asn Ser Gly Trp Lys Val

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980 985 990

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Asp Tyr Ile Asn Arg Trp Ile Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn Arg

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Leu Asn Asn Ser Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Arg Leu Ile Asp Gln

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Lys Pro Ile Ser Asn Leu Gly Asn Ile His Ala Ser Asn Asn Ile

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Met Phe Lys Leu Asp Gly Cys Arg Asp Thr His Arg Tyr Ile Trp

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Ile Lys Tyr Phe Asn Leu Phe Asp Lys Glu Leu Asn Glu Lys Glu

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Ile Lys Asp Leu Tyr Asp Asn Gln Ser Asn Ser Gly Ile Leu Lys

1085 1090 1095

Asp Phe Trp Gly Asp Tyr Leu Gln Tyr Asp Lys Pro Tyr Tyr Met

1100 1105 1110

Leu Asn Leu Tyr Asp Pro Asn Lys Tyr Val Asp Val Asn Asn Val

1115 1120 1125

Gly Ile Arg Gly Tyr Met Tyr Leu Lys Gly Pro Arg Gly Ser Val

1130 1135 1140

Met Thr Thr Asn Ile Tyr Leu Asn Ser Ser Leu Tyr Arg Gly Thr

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Lys Phe Ile Ile Lys Lys Tyr Ala Ser Gly Asn Lys Asp Asn Ile

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Val Arg Asn Asn Asp Arg Val Tyr Ile Asn Val Val Val Lys Asn

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Lys Glu Tyr Arg Leu Ala Thr Asn Ala Ser Gln Ala Gly Val Glu

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Lys Ile Leu Ser Ala Leu Glu Ile Pro Asp Val Gly Asn Leu Ser

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Gln Val Val Val Met Lys Ser Lys Asn Asp Gln Gly Ile Thr Asn

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Ser Asn Trp Tyr Asn Arg Gln Ile Glu Arg Ser Ser Arg Thr Leu

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1295

<210> 3

<211> 3888

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 修饰的BoNT/A "Cat-A"

<400> 3

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tacatcaaga ttccgaacgc cggtcaaatg cagccggtta aggcttttaa gatccacaac 120

aagatttggg ttatcccgga gcgtgacacc ttcacgaacc cggaagaagg cgatctgaac 180

ccgccaccgg aagcgaagca agtccctgtc agctactacg attcgacgta cctgagcacg 240

gataacgaaa aagataacta cctgaaaggt gtgaccaagc tgttcgaacg tatctacagc 300

acggatctgg gtcgcatgct gctgactagc attgttcgcg gtatcccgtt ctggggtggt 360

agcacgattg acaccgaact gaaggttatc gacactaact gcattaacgt tattcaaccg 420

gatggtagct atcgtagcga agagctgaat ctggtcatca ttggcccgag cgcagacatt 480

atccaattcg agtgcaagag ctttggtcac gaggttctga atctgacccg caatggctat 540

ggtagcaccc agtacattcg tttttcgccg gattttacct tcggctttga agagagcctg 600

gaggttgata ccaatccgtt gctgggtgcg ggcaaattcg ctaccgatcc ggctgtcacg 660

ctggcccatg aactgatcca cgcaggccac cgcctgtacg gcattgccat caacccaaac 720

cgtgtgttca aggttaatac gaatgcatac tacgagatga gcggcctgga agtcagcttc 780

gaagaactgc gcaccttcgg tggccatgac gctaaattca ttgacagctt gcaagagaat 840

gagttccgtc tgtactacta taacaaattc aaagacattg caagcacgtt gaacaaggcc 900

aaaagcatcg ttggtactac cgcgtcgttg cagtatatga agaatgtgtt taaagagaag 960

tacctgctgt ccgaggatac ctccggcaag tttagcgttg ataagctgaa gtttgacaaa 1020

ctgtacaaga tgctgaccga gatttacacc gaggacaact ttgtgaaatt cttcaaagtg 1080

ttgaatcgta aaacctatct gaattttgac aaagcggttt tcaagattaa catcgtgccg 1140

aaggtgaact acaccatcta tgacggtttt aacctgcgta acaccaacct ggcggcgaac 1200

tttaacggtc agaatacgga aatcaacaac atgaatttca cgaagttgaa gaacttcacg 1260

ggtctgttcg agttctataa gctgctgtgc gtgcgcggta tcatcaccag caaaaccaaa 1320

agcctggaca aaggctacaa caaggcgctg aatgacctgt gcattaaggt aaacaattgg 1380

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atcaccagcg atacgaatat tgaagcagcg gaagagaata tcagcctgga tctgatccag 1500

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aaaaagtacg agctggacaa gtacactatg ttccattacc tgcgtgcaca ggagtttgaa 1680

cacggtaaaa gccgtatcgc gctgaccaac agcgttaacg aggccctgct gaacccgagc 1740

cgtgtctata ccttcttcag cagcgactat gttaagaaag tgaacaaagc cactgaggcc 1800

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gtgagcacta ccgacaaaat tgctgatatt accatcatta tcccgtatat tggtccggca 1920

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gccgtgattc tgctggagtt cattccggag attgcgatcc cggtgttggg taccttcgcg 2040

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gaggccacca aagcaattat caactaccaa tacaaccagt acacggaaga agagaagaat 2280

aacattaact tcaatatcga tgatttgagc agcaagctga atgaatctat caacaaagcg 2340

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attccgtatg gcgtcaaacg tctggaggac ttcgacgcca gcctgaaaga tgcgttgctg 2460

aaatacattt acgacaatcg tggtacgctg attggccaag ttgaccgctt gaaagacaaa 2520

gttaacaata ccctgagcac cgacatccca tttcaactga gcaagtatgt tgataatcaa 2580

cgtctgttga gcactttcac cgagtatatc aaaaacatca tcaatactag cattctgaac 2640

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ggtagcaagg tcaattttga cccgatcgat aagaaccaga tccagctgtt taatctggaa 2760

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ttctccacca gcttctggat tcgcatcccg aaatacttca acaagattag cctgaacaac 2880

gagtatacta tcatcaactg tatggagaac aacagcggtt ggaaggtgtc tctgaactat 2940

ggtgagatca tttggacctt gcaggacacc aaagagatca agcagcgcgt cgtgttcaag 3000

tactctcaaa tgatcaacat ttccgattac attaatcgtt ggatcttcgt gaccattacg 3060

aataaccgtc tgaataagag caagatttac atcaatggtc gcttgatcga tcagaaaccg 3120

attagcaacc tgggtaatat ccacgcaagc aacaagatta tgttcaaatt ggacggttgc 3180

cgcgataccc atcgttatat ctggatcaag tatttcaacc tgtttgataa agaactgaat 3240

gagaaggaga tcaaagattt gtatgacaac caatctaaca gcggcatttt gaaggacttc 3300

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<210> 4

<211> 1296

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 修饰的BoNT/A "Cat-A"

<400> 4

Met Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly

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Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Ala Gly Gln Met Gln Pro

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Val Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg

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Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu

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Ala Lys Gln Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr

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Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu

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Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys

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Ile Gln Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn Leu Thr

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Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Tyr Ile Arg Phe Ser Pro Asp Phe

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Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala His Glu

210 215 220

Leu Ile His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn Pro Asn

225 230 235 240

Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly Leu

245 250 255

Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala Lys

260 265 270

Phe Ile Asp Ser Leu Gln Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr Asn

275 280 285

Lys Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser Ile Val

290 295 300

Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gln Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys Glu Lys

305 310 315 320

Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp Lys Leu

325 330 335

Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu Asp

340 345 350

Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr Leu Asn

355 360 365

Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys Ile Asn Ile Val Pro Lys Val Asn Tyr

370 375 380

Thr Ile Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala Ala Asn

385 390 395 400

Phe Asn Gly Gln Asn Thr Glu Ile Asn Asn Met Asn Phe Thr Lys Leu

405 410 415

Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys Val Arg

420 425 430

Gly Ile Ile Thr Ser Lys Thr Lys Ser Leu Asp Lys Gly Tyr Asn Lys

435 440 445

Ala Leu Asn Asp Leu Cys Ile Lys Val Asn Asn Trp Asp Leu Phe Phe

450 455 460

Ser Pro Ser Glu Asp Asn Phe Thr Asn Asp Leu Asn Lys Gly Glu Glu

465 470 475 480

Ile Thr Ser Asp Thr Asn Ile Glu Ala Ala Glu Glu Asn Ile Ser Leu

485 490 495

Asp Leu Ile Gln Gln Tyr Tyr Leu Thr Phe Asn Phe Asp Asn Glu Pro

500 505 510

Glu Asn Ile Ser Ile Glu Asn Leu Ser Ser Asp Ile Ile Gly Gln Leu

515 520 525

Glu Leu Met Pro Asn Ile Glu Arg Phe Pro Asn Gly Lys Lys Tyr Glu

530 535 540

Leu Asp Lys Tyr Thr Met Phe His Tyr Leu Arg Ala Gln Glu Phe Glu

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His Gly Lys Ser Arg Ile Ala Leu Thr Asn Ser Val Asn Glu Ala Leu

565 570 575

Leu Asn Pro Ser Arg Val Tyr Thr Phe Phe Ser Ser Asp Tyr Val Lys

580 585 590

Lys Val Asn Lys Ala Thr Glu Ala Ala Met Phe Leu Gly Trp Val Glu

595 600 605

Gln Leu Val Tyr Asp Phe Thr Asp Glu Thr Ser Glu Val Ser Thr Thr

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Asp Lys Ile Ala Asp Ile Thr Ile Ile Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala

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Leu Asn Ile Gly Asn Met Leu Tyr Lys Asp Asp Phe Val Gly Ala Leu

645 650 655

Ile Phe Ser Gly Ala Val Ile Leu Leu Glu Phe Ile Pro Glu Ile Ala

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Ile Pro Val Leu Gly Thr Phe Ala Leu Val Ser Tyr Ile Ala Asn Lys

675 680 685

Val Leu Thr Val Gln Thr Ile Asp Asn Ala Leu Ser Lys Arg Asn Glu

690 695 700

Lys Trp Asp Glu Val Tyr Lys Tyr Ile Val Thr Asn Trp Leu Ala Lys

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Val Asn Thr Gln Ile Asp Leu Ile Arg Lys Lys Met Lys Glu Ala Leu

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Glu Asn Gln Ala Glu Ala Thr Lys Ala Ile Ile Asn Tyr Gln Tyr Asn

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Gln Tyr Thr Glu Glu Glu Lys Asn Asn Ile Asn Phe Asn Ile Asp Asp

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Leu Ser Ser Lys Leu Asn Glu Ser Ile Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile

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Asp Ala Leu Leu Lys Tyr Ile Tyr Asp Asn Arg Gly Thr Leu Ile Gly

820 825 830

Gln Val Asp Arg Leu Lys Asp Lys Val Asn Asn Thr Leu Ser Thr Asp

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Ile Pro Phe Gln Leu Ser Lys Tyr Val Asp Asn Gln Arg Leu Leu Ser

850 855 860

Thr Phe Thr Glu Tyr Ile Lys Asn Ile Ile Asn Thr Ser Ile Leu Asn

865 870 875 880

Leu Arg Tyr Glu Ser Lys His Leu Ile Asp Leu Ser Arg Tyr Ala Ser

885 890 895

Lys Ile Asn Ile Gly Ser Lys Val Asn Phe Asp Pro Ile Asp Lys Asn

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Gln Ile Gln Leu Phe Asn Leu Glu Ser Ser Lys Ile Glu Val Ile Leu

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Lys Lys Ala Ile Val Tyr Asn Ser Met Tyr Glu Asn Phe Ser Thr Ser

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Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Phe Asn Lys Ile Ser Leu Asn Asn

945 950 955 960

Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Glu Asn Asn Ser Gly Trp Lys Val

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980 985 990

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Asp Tyr Ile Asn Arg Trp Ile Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn Arg

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1100 1105 1110

Leu Asn Leu Tyr Asp Pro Asn Lys Tyr Val Asp Val Asn Asn Val

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Met Thr Thr Asn Ile Tyr Leu Asn Ser Ser Leu Tyr Arg Gly Thr

1145 1150 1155

Lys Phe Ile Ile Lys Lys Tyr Ala Ser Gly Asn Lys Asp Asn Ile

1160 1165 1170

Val Arg Asn Asn Asp Arg Val Tyr Ile Asn Val Val Val Lys Asn

1175 1180 1185

Lys Glu Tyr Arg Leu Ala Thr Asn Ala Ser Gln Ala Gly Val Glu

1190 1195 1200

Lys Ile Leu Ser Ala Leu Glu Ile Pro Asp Val Gly Asn Leu Ser

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Gln Val Val Val Met Lys Ser Lys Asn Asp Lys Gly Ile Thr Asn

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1265 1270 1275

Gly Cys Ser Trp Glu Phe Ile Pro Val Asp Asp Gly Trp Gly Glu

1280 1285 1290

Arg Pro Leu

1295

<210> 5

<211> 3888

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 修饰的BoNT/A "Cat-B"

<400> 5

atgccattcg tcaacaagca attcaactac aaagacccag tcaacggcgt cgacatcgca 60

tacatcaaga ttccgaacgc cggtcaaatg cagccggtta aggcttttaa gatccacaac 120

aagatttggg ttatcccgga gcgtgacacc ttcacgaacc cggaagaagg cgatctgaac 180

ccgccaccgg aagcgaagca agtccctgtc agctactacg attcgacgta cctgagcacg 240

gataacgaaa aagataacta cctgaaaggt gtgaccaagc tgttcgaacg tatctacagc 300

acggatctgg gtcgcatgct gctgactagc attgttcgcg gtatcccgtt ctggggtggt 360

agcacgattg acaccgaact gaaggttatc gacactaact gcattaacgt tattcaaccg 420

gatggtagct atcgtagcga agagctgaat ctggtcatca ttggcccgag cgcagacatt 480

atccaattcg agtgcaagag ctttggtcac gaggttctga atctgacccg caatggctat 540

ggtagcaccc agtacattcg tttttcgccg gattttacct tcggctttga agagagcctg 600

gaggttgata ccaatccgtt gctgggtgcg ggcaaattcg ctaccgatcc ggctgtcacg 660

ctggcccatg aactgatcca cgcaggccac cgcctgtacg gcattgccat caacccaaac 720

cgtgtgttca aggttaatac gaatgcatac tacgagatga gcggcctgga agtcagcttc 780

gaagaactgc gcaccttcgg tggccatgac gctaaattca ttgacagctt gcaagagaat 840

gagttccgtc tgtactacta taacaaattc aaagacattg caagcacgtt gaacaaggcc 900

aaaagcatcg ttggtactac cgcgtcgttg cagtatatga agaatgtgtt taaagagaag 960

tacctgctgt ccgaggatac ctccggcaag tttagcgttg ataagctgaa gtttgacaaa 1020

ctgtacaaga tgctgaccga gatttacacc gaggacaact ttgtgaaatt cttcaaagtg 1080

ttgaatcgta aaacctatct gaattttgac aaagcggttt tcaagattaa catcgtgccg 1140

aaggtgaact acaccatcta tgacggtttt aacctgcgta acaccaacct ggcggcgaac 1200

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aaatacattt acgacaatcg tggtacgctg attggccaag ttgaccgctt gaaagacaaa 2520

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gtggttatga agagcaagaa cgacaagggt atcactaaca agtgcaagat gaacctgcaa 3720

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<210> 8

<211> 1296

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 修饰的BoNT/A "Cat-C"

<400> 8

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Glu Asn Gln Ala Glu Ala Thr Lys Ala Ile Ile Asn Tyr Gln Tyr Asn

740 745 750

Gln Tyr Thr Glu Glu Glu Lys Asn Asn Ile Asn Phe Asn Ile Asp Asp

755 760 765

Leu Ser Ser Lys Leu Asn Glu Ser Ile Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile

770 775 780

Asn Lys Phe Leu Asn Gln Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met Asn Ser Met

785 790 795 800

Ile Pro Tyr Gly Val Lys Arg Leu Glu Asp Phe Asp Ala Ser Leu Lys

805 810 815

Asp Ala Leu Leu Lys Tyr Ile Tyr Asp Asn Arg Gly Thr Leu Ile Gly

820 825 830

Gln Val Asp Arg Leu Lys Asp Lys Val Asn Asn Thr Leu Ser Thr Asp

835 840 845

Ile Pro Phe Gln Leu Ser Lys Tyr Val Asp Asn Gln Arg Leu Leu Ser

850 855 860

Thr Phe Thr Glu Tyr Ile Lys Asn Ile Ile Asn Thr Ser Ile Leu Asn

865 870 875 880

Leu Arg Tyr Glu Ser Asn His Leu Ile Asp Leu Ser Arg Tyr Ala Ser

885 890 895

Lys Ile Asn Ile Gly Ser Lys Val Asn Phe Asp Pro Ile Asp Lys Asn

900 905 910

Gln Ile Gln Leu Phe Asn Leu Glu Ser Ser Lys Ile Glu Val Ile Leu

915 920 925

Lys Lys Ala Ile Val Tyr Asn Ser Met Tyr Glu Asn Phe Ser Thr Ser

930 935 940

Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Phe Asn Lys Ile Ser Leu Asn Asn

945 950 955 960

Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Glu Asn Asn Ser Gly Trp Lys Val

965 970 975

Ser Leu Asn Tyr Gly Glu Ile Ile Trp Thr Leu Gln Asp Thr Lys Glu

980 985 990

Ile Lys Gln Arg Val Val Phe Lys Tyr Ser Gln Met Ile Asn Ile Ser

995 1000 1005

Asp Tyr Ile Asn Arg Trp Ile Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn Arg

1010 1015 1020

Leu Lys Lys Ser Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Arg Leu Ile Asp Gln

1025 1030 1035

Lys Pro Ile Ser Asn Leu Gly Asn Ile His Ala Ser Asn Lys Ile

1040 1045 1050

Met Phe Lys Leu Asp Gly Cys Arg Asp Thr His Arg Tyr Ile Trp

1055 1060 1065

Ile Lys Tyr Phe Asn Leu Phe Asp Lys Glu Leu Asn Glu Lys Glu

1070 1075 1080

Ile Lys Asp Leu Tyr Asp Asn Gln Ser Asn Ser Gly Ile Leu Lys

1085 1090 1095

Asp Phe Trp Gly Asp Tyr Leu Gln Tyr Asp Lys Pro Tyr Tyr Met

1100 1105 1110

Leu Asn Leu Tyr Asp Pro Asn Lys Tyr Val Asp Val Asn Asn Val

1115 1120 1125

Gly Ile Arg Gly Tyr Met Tyr Leu Lys Gly Pro Arg Gly Ser Val

1130 1135 1140

Met Thr Thr Asn Ile Tyr Leu Asn Ser Ser Leu Tyr Arg Gly Thr

1145 1150 1155

Lys Phe Ile Ile Lys Lys Tyr Ala Ser Gly Asn Lys Asp Asn Ile

1160 1165 1170

Val Arg Asn Asn Asp Arg Val Tyr Ile Asn Val Val Val Lys Asn

1175 1180 1185

Lys Glu Tyr Arg Leu Ala Thr Asn Ala Ser Gln Ala Gly Val Glu

1190 1195 1200

Lys Ile Leu Ser Ala Leu Glu Ile Pro Asp Val Gly Asn Leu Ser

1205 1210 1215

Gln Val Val Val Met Lys Ser Lys Asn Asp Lys Gly Ile Thr Asn

1220 1225 1230

Lys Cys Lys Met Asn Leu Gln Asp Asn Asn Gly Asn Asp Ile Gly

1235 1240 1245

Phe Ile Gly Phe His Gln Phe Asn Asn Ile Ala Lys Leu Val Ala

1250 1255 1260

Ser Asn Trp Tyr Asn Arg Gln Ile Glu Arg Ser Ser Arg Thr Leu

1265 1270 1275

Gly Cys Ser Trp Glu Phe Ile Pro Val Asp Asp Gly Trp Gly Glu

1280 1285 1290

Arg Pro Leu

1295

<210> 9

<211> 3888

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 修饰的BoNT/A "Cat-D"

<400> 9

atgccattcg tcaacaagca attcaactac aaagacccag tcaacggcgt cgacatcgca 60

tacatcaaga ttccgaacgc cggtcaaatg cagccggtta aggcttttaa gatccacaac 120

aagatttggg ttatcccgga gcgtgacacc ttcacgaacc cggaagaagg cgatctgaac 180

ccgccaccgg aagcgaagca agtccctgtc agctactacg attcgacgta cctgagcacg 240

gataacgaaa aagataacta cctgaaaggt gtgaccaagc tgttcgaacg tatctacagc 300

acggatctgg gtcgcatgct gctgactagc attgttcgcg gtatcccgtt ctggggtggt 360

agcacgattg acaccgaact gaaggttatc gacactaact gcattaacgt tattcaaccg 420

gatggtagct atcgtagcga agagctgaat ctggtcatca ttggcccgag cgcagacatt 480

atccaattcg agtgcaagag ctttggtcac gaggttctga atctgacccg caatggctat 540

ggtagcaccc agtacattcg tttttcgccg gattttacct tcggctttga agagagcctg 600

gaggttgata ccaatccgtt gctgggtgcg ggcaaattcg ctaccgatcc ggctgtcacg 660

ctggcccatg aactgatcca cgcaggccac cgcctgtacg gcattgccat caacccaaac 720

cgtgtgttca aggttaatac gaatgcatac tacgagatga gcggcctgga agtcagcttc 780

gaagaactgc gcaccttcgg tggccatgac gctaaattca ttgacagctt gcaagagaat 840

gagttccgtc tgtactacta taacaaattc aaagacattg caagcacgtt gaacaaggcc 900

aaaagcatcg ttggtactac cgcgtcgttg cagtatatga agaatgtgtt taaagagaag 960

tacctgctgt ccgaggatac ctccggcaag tttagcgttg ataagctgaa gtttgacaaa 1020

ctgtacaaga tgctgaccga gatttacacc gaggacaact ttgtgaaatt cttcaaagtg 1080

ttgaatcgta aaacctatct gaattttgac aaagcggttt tcaagattaa catcgtgccg 1140

aaggtgaact acaccatcta tgacggtttt aacctgcgta acaccaacct ggcggcgaac 1200

tttaacggtc agaatacgga aatcaacaac atgaatttca cgaagttgaa gaacttcacg 1260

ggtctgttcg agttctataa gctgctgtgc gtgcgcggta tcatcaccag caaaaccaaa 1320

agcctggaca aaggctacaa caaggcgctg aatgacctgt gcattaaggt aaacaattgg 1380

gatctgttct tttcgccatc cgaagataat tttaccaacg acctgaacaa gggtgaagaa 1440

atcaccagcg atacgaatat tgaagcagcg gaagagaata tcagcctgga tctgatccag 1500

cagtactatc tgacctttaa cttcgacaat gaaccggaga acattagcat tgagaatctg 1560

agcagcgaca ttatcggtca gctggaactg atgccgaata tcgaacgttt cccgaacggc 1620

aaaaagtacg agctggacaa gtacactatg ttccattacc tgcgtgcaca ggagtttgaa 1680

cacggtaaaa gccgtatcgc gctgaccaac agcgttaacg aggccctgct gaacccgagc 1740

cgtgtctata ccttcttcag cagcgactat gttaagaaag tgaacaaagc cactgaggcc 1800

gcgatgttcc tgggctgggt ggaacagctg gtatatgact tcacggacga gacgagcgaa 1860

gtgagcacta ccgacaaaat tgctgatatt accatcatta tcccgtatat tggtccggca 1920

ctgaacattg gcaacatgct gtacaaagac gattttgtgg gtgccctgat cttctccggt 1980

gccgtgattc tgctggagtt cattccggag attgcgatcc cggtgttggg taccttcgcg 2040

ctggtgtcct acatcgcgaa taaggttctg acggttcaga ccatcgataa cgcgctgtcg 2100

aaacgtaatg aaaaatggga cgaggtttac aaatacattg ttacgaattg gctggcgaaa 2160

gtcaataccc agatcgacct gatccgtaag aaaatgaaag aggcgctgga gaatcaggcg 2220

gaggccacca aagcaattat caactaccaa tacaaccagt acacggaaga agagaagaat 2280

aacattaact tcaatatcga tgatttgagc agcaagctga atgaatctat caacaaagcg 2340

atgatcaata tcaacaagtt tttgaatcag tgtagcgttt cgtacctgat gaatagcatg 2400

attccgtatg gcgtcaaacg tctggaggac ttcgacgcca gcctgaaaga tgcgttgctg 2460

aaatacattt acgacaatcg tggtacgctg attggccaag ttgaccgctt gaaagacaaa 2520

gttaacaata ccctgagcac cgacatccca tttcaactga gcaagtatgt tgataatcaa 2580

cgtctgttga gcactttcac cgagtatatc aaaaacatca tcaatactag cattctgaac 2640

ctgcgttacg agagcaatca tctgattgat ctgagccgtt atgcaagcaa gatcaacatc 2700

ggtagcaagg tcaattttga cccgatcgat aagaaccaga tccagctgtt taatctggaa 2760

tcgagcaaaa ttgaggttat cctgaaaaac gccattgtct acaactccat gtacgagaat 2820

ttctccacca gcttctggat tcgcatcccg aaatacttca acagcattag cctgaacaac 2880

gagtatacta tcatcaactg tatggagaac aacagcggtt ggaaggtgtc tctgaactat 2940

ggtgagatca tttggacctt gcaggacacc caagagatca agcagcgcgt cgtgttcaag 3000

tactctcaaa tgatcaacat ttccgattac attaatcgtt ggatcttcgt gaccattacg 3060

aataaccgtc tgaataacag caagatttac atcaatggtc gcttgatcga tcagaaaccg 3120

attagcaacc tgggtaatat ccacgcaagc aacaacatta tgttcaaatt ggacggttgc 3180

cgcgataccc atcgttatat ctggatcaag tatttcaacc tgtttgataa agaactgaat 3240

gagaaggaga tcaaagattt gtatgacaac caatctaaca gcggcatttt gaaggacttc 3300

tggggcgatt atctgcaata cgataagccg tactatatgc tgaacctgta tgatccgaac 3360

aaatatgtgg atgtcaataa tgtgggtatt cgtggttaca tgtatttgaa gggtccgcgt 3420

ggcagcgtta tgacgaccaa catttacctg aactctagcc tgtaccgtgg tacgaaattc 3480

atcattaaga aatatgccag cggcaacaaa gataacattg tgcgtaataa cgatcgtgtc 3540

tacatcaacg tggtcgtgaa gcgtaaagag taccgtctgg cgaccaacgc ttcgcaggcg 3600

ggtgttgaga aaattctgag cgcgttggag atccctcgtg tccgtcgtct gagccaagtc 3660

gtggttatga agagcaagaa cgaccagggt atcactaaca agtgcaagat gaacctgcaa 3720

gaccgtcgtg gtaacgacat cggctttatt ggtttccacc agttcaacaa tattgctaaa 3780

ctggtagcga gcaattggta caatcgtcag attgagcgcc gtagccgtcg tttgggctgt 3840

agctgggagt ttatcccggt cgatgatggt tggggcgaac gtccgctg 3888

<210> 10

<211> 1296

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 修饰的BoNT/A "Cat-D"

<400> 10

Met Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly

1 5 10 15

Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Ala Gly Gln Met Gln Pro

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Val Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg

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Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu

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Ala Lys Gln Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr

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Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu

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Arg Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser Ile Val

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Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys

115 120 125

Val Ile Asp Thr Asn Cys Ile Asn Val Ile Gln Pro Asp Gly Ser Tyr

130 135 140

Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val Ile Ile Gly Pro Ser Ala Asp Ile

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Ile Gln Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn Leu Thr

165 170 175

Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Tyr Ile Arg Phe Ser Pro Asp Phe

180 185 190

Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro Leu Leu

195 200 205

Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala His Glu

210 215 220

Leu Ile His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn Pro Asn

225 230 235 240

Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly Leu

245 250 255

Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala Lys

260 265 270

Phe Ile Asp Ser Leu Gln Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr Asn

275 280 285

Lys Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser Ile Val

290 295 300

Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gln Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys Glu Lys

305 310 315 320

Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp Lys Leu

325 330 335

Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu Asp

340 345 350

Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr Leu Asn

355 360 365

Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys Ile Asn Ile Val Pro Lys Val Asn Tyr

370 375 380

Thr Ile Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala Ala Asn

385 390 395 400

Phe Asn Gly Gln Asn Thr Glu Ile Asn Asn Met Asn Phe Thr Lys Leu

405 410 415

Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys Val Arg

420 425 430

Gly Ile Ile Thr Ser Lys Thr Lys Ser Leu Asp Lys Gly Tyr Asn Lys

435 440 445

Ala Leu Asn Asp Leu Cys Ile Lys Val Asn Asn Trp Asp Leu Phe Phe

450 455 460

Ser Pro Ser Glu Asp Asn Phe Thr Asn Asp Leu Asn Lys Gly Glu Glu

465 470 475 480

Ile Thr Ser Asp Thr Asn Ile Glu Ala Ala Glu Glu Asn Ile Ser Leu

485 490 495

Asp Leu Ile Gln Gln Tyr Tyr Leu Thr Phe Asn Phe Asp Asn Glu Pro

500 505 510

Glu Asn Ile Ser Ile Glu Asn Leu Ser Ser Asp Ile Ile Gly Gln Leu

515 520 525

Glu Leu Met Pro Asn Ile Glu Arg Phe Pro Asn Gly Lys Lys Tyr Glu

530 535 540

Leu Asp Lys Tyr Thr Met Phe His Tyr Leu Arg Ala Gln Glu Phe Glu

545 550 555 560

His Gly Lys Ser Arg Ile Ala Leu Thr Asn Ser Val Asn Glu Ala Leu

565 570 575

Leu Asn Pro Ser Arg Val Tyr Thr Phe Phe Ser Ser Asp Tyr Val Lys

580 585 590

Lys Val Asn Lys Ala Thr Glu Ala Ala Met Phe Leu Gly Trp Val Glu

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Gln Leu Val Tyr Asp Phe Thr Asp Glu Thr Ser Glu Val Ser Thr Thr

610 615 620

Asp Lys Ile Ala Asp Ile Thr Ile Ile Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala

625 630 635 640

Leu Asn Ile Gly Asn Met Leu Tyr Lys Asp Asp Phe Val Gly Ala Leu

645 650 655

Ile Phe Ser Gly Ala Val Ile Leu Leu Glu Phe Ile Pro Glu Ile Ala

660 665 670

Ile Pro Val Leu Gly Thr Phe Ala Leu Val Ser Tyr Ile Ala Asn Lys

675 680 685

Val Leu Thr Val Gln Thr Ile Asp Asn Ala Leu Ser Lys Arg Asn Glu

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Lys Trp Asp Glu Val Tyr Lys Tyr Ile Val Thr Asn Trp Leu Ala Lys

705 710 715 720

Val Asn Thr Gln Ile Asp Leu Ile Arg Lys Lys Met Lys Glu Ala Leu

725 730 735

Glu Asn Gln Ala Glu Ala Thr Lys Ala Ile Ile Asn Tyr Gln Tyr Asn

740 745 750

Gln Tyr Thr Glu Glu Glu Lys Asn Asn Ile Asn Phe Asn Ile Asp Asp

755 760 765

Leu Ser Ser Lys Leu Asn Glu Ser Ile Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile

770 775 780

Asn Lys Phe Leu Asn Gln Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met Asn Ser Met

785 790 795 800

Ile Pro Tyr Gly Val Lys Arg Leu Glu Asp Phe Asp Ala Ser Leu Lys

805 810 815

Asp Ala Leu Leu Lys Tyr Ile Tyr Asp Asn Arg Gly Thr Leu Ile Gly

820 825 830

Gln Val Asp Arg Leu Lys Asp Lys Val Asn Asn Thr Leu Ser Thr Asp

835 840 845

Ile Pro Phe Gln Leu Ser Lys Tyr Val Asp Asn Gln Arg Leu Leu Ser

850 855 860

Thr Phe Thr Glu Tyr Ile Lys Asn Ile Ile Asn Thr Ser Ile Leu Asn

865 870 875 880

Leu Arg Tyr Glu Ser Asn His Leu Ile Asp Leu Ser Arg Tyr Ala Ser

885 890 895

Lys Ile Asn Ile Gly Ser Lys Val Asn Phe Asp Pro Ile Asp Lys Asn

900 905 910

Gln Ile Gln Leu Phe Asn Leu Glu Ser Ser Lys Ile Glu Val Ile Leu

915 920 925

Lys Asn Ala Ile Val Tyr Asn Ser Met Tyr Glu Asn Phe Ser Thr Ser

930 935 940

Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Phe Asn Ser Ile Ser Leu Asn Asn

945 950 955 960

Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Glu Asn Asn Ser Gly Trp Lys Val

965 970 975

Ser Leu Asn Tyr Gly Glu Ile Ile Trp Thr Leu Gln Asp Thr Gln Glu

980 985 990

Ile Lys Gln Arg Val Val Phe Lys Tyr Ser Gln Met Ile Asn Ile Ser

995 1000 1005

Asp Tyr Ile Asn Arg Trp Ile Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn Arg

1010 1015 1020

Leu Asn Asn Ser Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Arg Leu Ile Asp Gln

1025 1030 1035

Lys Pro Ile Ser Asn Leu Gly Asn Ile His Ala Ser Asn Asn Ile

1040 1045 1050

Met Phe Lys Leu Asp Gly Cys Arg Asp Thr His Arg Tyr Ile Trp

1055 1060 1065

Ile Lys Tyr Phe Asn Leu Phe Asp Lys Glu Leu Asn Glu Lys Glu

1070 1075 1080

Ile Lys Asp Leu Tyr Asp Asn Gln Ser Asn Ser Gly Ile Leu Lys

1085 1090 1095

Asp Phe Trp Gly Asp Tyr Leu Gln Tyr Asp Lys Pro Tyr Tyr Met

1100 1105 1110

Leu Asn Leu Tyr Asp Pro Asn Lys Tyr Val Asp Val Asn Asn Val

1115 1120 1125

Gly Ile Arg Gly Tyr Met Tyr Leu Lys Gly Pro Arg Gly Ser Val

1130 1135 1140

Met Thr Thr Asn Ile Tyr Leu Asn Ser Ser Leu Tyr Arg Gly Thr

1145 1150 1155

Lys Phe Ile Ile Lys Lys Tyr Ala Ser Gly Asn Lys Asp Asn Ile

1160 1165 1170

Val Arg Asn Asn Asp Arg Val Tyr Ile Asn Val Val Val Lys Arg

1175 1180 1185

Lys Glu Tyr Arg Leu Ala Thr Asn Ala Ser Gln Ala Gly Val Glu

1190 1195 1200

Lys Ile Leu Ser Ala Leu Glu Ile Pro Arg Val Arg Arg Leu Ser

1205 1210 1215

Gln Val Val Val Met Lys Ser Lys Asn Asp Gln Gly Ile Thr Asn

1220 1225 1230

Lys Cys Lys Met Asn Leu Gln Asp Arg Arg Gly Asn Asp Ile Gly

1235 1240 1245

Phe Ile Gly Phe His Gln Phe Asn Asn Ile Ala Lys Leu Val Ala

1250 1255 1260

Ser Asn Trp Tyr Asn Arg Gln Ile Glu Arg Arg Ser Arg Arg Leu

1265 1270 1275

Gly Cys Ser Trp Glu Phe Ile Pro Val Asp Asp Gly Trp Gly Glu

1280 1285 1290

Arg Pro Leu

1295

<210> 11

<211> 1315

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 修饰的BoNT/A "嵌合体 1"

<400> 11

Met Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly

1 5 10 15

Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Ala Gly Gln Met Gln Pro

20 25 30

Val Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg

35 40 45

Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu

50 55 60

Ala Lys Gln Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr

65 70 75 80

Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu

85 90 95

Arg Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser Ile Val

100 105 110

Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys

115 120 125

Val Ile Asp Thr Asn Cys Ile Asn Val Ile Gln Pro Asp Gly Ser Tyr

130 135 140

Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val Ile Ile Gly Pro Ser Ala Asp Ile

145 150 155 160

Ile Gln Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn Leu Thr

165 170 175

Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Tyr Ile Arg Phe Ser Pro Asp Phe

180 185 190

Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro Leu Leu

195 200 205

Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala His Glu

210 215 220

Leu Ile His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn Pro Asn

225 230 235 240

Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly Leu

245 250 255

Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala Lys

260 265 270

Phe Ile Asp Ser Leu Gln Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr Asn

275 280 285

Lys Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser Ile Val

290 295 300

Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gln Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys Glu Lys

305 310 315 320

Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp Lys Leu

325 330 335

Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu Asp

340 345 350

Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr Leu Asn

355 360 365

Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys Ile Asn Ile Val Pro Lys Val Asn Tyr

370 375 380

Thr Ile Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala Ala Asn

385 390 395 400

Phe Asn Gly Gln Asn Thr Glu Ile Asn Asn Met Asn Phe Thr Lys Leu

405 410 415

Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys Val Arg

420 425 430

Gly Ile Ile Thr Ser Lys Thr Lys Ser Leu Asp Lys Gly Tyr Asn Lys

435 440 445

Ala Leu Asn Asp Leu Cys Ile Lys Val Asn Asn Trp Asp Leu Phe Phe

450 455 460

Ser Pro Ser Glu Asp Asn Phe Thr Asn Asp Leu Asn Lys Gly Glu Glu

465 470 475 480

Ile Thr Ser Asp Thr Asn Ile Glu Ala Ala Glu Glu Asn Ile Ser Leu

485 490 495

Asp Leu Ile Gln Gln Tyr Tyr Leu Thr Phe Asn Phe Asp Asn Glu Pro

500 505 510

Glu Asn Ile Ser Ile Glu Asn Leu Ser Ser Asp Ile Ile Gly Gln Leu

515 520 525

Glu Leu Met Pro Asn Ile Glu Arg Phe Pro Asn Gly Lys Lys Tyr Glu

530 535 540

Leu Asp Lys Tyr Thr Met Phe His Tyr Leu Arg Ala Gln Glu Phe Glu

545 550 555 560

His Gly Lys Ser Arg Ile Ala Leu Thr Asn Ser Val Asn Glu Ala Leu

565 570 575

Leu Asn Pro Ser Arg Val Tyr Thr Phe Phe Ser Ser Asp Tyr Val Lys

580 585 590

Lys Val Asn Lys Ala Thr Glu Ala Ala Met Phe Leu Gly Trp Val Glu

595 600 605

Gln Leu Val Tyr Asp Phe Thr Asp Glu Thr Ser Glu Val Ser Thr Thr

610 615 620

Asp Lys Ile Ala Asp Ile Thr Ile Ile Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala

625 630 635 640

Leu Asn Ile Gly Asn Met Leu Tyr Lys Asp Asp Phe Val Gly Ala Leu

645 650 655

Ile Phe Ser Gly Ala Val Ile Leu Leu Glu Phe Ile Pro Glu Ile Ala

660 665 670

Ile Pro Val Leu Gly Thr Phe Ala Leu Val Ser Tyr Ile Ala Asn Lys

675 680 685

Val Leu Thr Val Gln Thr Ile Asp Asn Ala Leu Ser Lys Arg Asn Glu

690 695 700

Lys Trp Asp Glu Val Tyr Lys Tyr Ile Val Thr Asn Trp Leu Ala Lys

705 710 715 720

Val Asn Thr Gln Ile Asp Leu Ile Arg Lys Lys Met Lys Glu Ala Leu

725 730 735

Glu Asn Gln Ala Glu Ala Thr Lys Ala Ile Ile Asn Tyr Gln Tyr Asn

740 745 750

Gln Tyr Thr Glu Glu Glu Lys Asn Asn Ile Asn Phe Asn Ile Asp Asp

755 760 765

Leu Ser Ser Lys Leu Asn Glu Ser Ile Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile

770 775 780

Asn Lys Phe Leu Asn Gln Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met Asn Ser Met

785 790 795 800

Ile Pro Tyr Gly Val Lys Arg Leu Glu Asp Phe Asp Ala Ser Leu Lys

805 810 815

Asp Ala Leu Leu Lys Tyr Ile Tyr Asp Asn Arg Gly Thr Leu Ile Gly

820 825 830

Gln Val Asp Arg Leu Lys Asp Lys Val Asn Asn Thr Leu Ser Thr Asp

835 840 845

Ile Pro Phe Gln Leu Ser Lys Tyr Val Asp Asn Gln Arg Leu Leu Ser

850 855 860

Thr Phe Thr Glu Tyr Ile Lys Ser Glu Ile Leu Asn Asn Ile Ile Leu

865 870 875 880

Asn Leu Arg Tyr Lys Asp Asn Asn Leu Ile Asp Leu Ser Gly Tyr Gly

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725 730 735

Glu Asn Gln Ala Glu Ala Thr Lys Ala Ile Ile Asn Tyr Gln Tyr Asn

740 745 750

Gln Tyr Thr Glu Glu Glu Lys Asn Asn Ile Asn Phe Asn Ile Asp Asp

755 760 765

Leu Ser Ser Lys Leu Asn Glu Ser Ile Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile

770 775 780

Asn Lys Phe Leu Asn Gln Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met Asn Ser Met

785 790 795 800

Ile Pro Tyr Gly Val Lys Arg Leu Glu Asp Phe Asp Ala Ser Leu Lys

805 810 815

Asp Ala Leu Leu Lys Tyr Ile Tyr Asp Asn Arg Gly Thr Leu Ile Gly

820 825 830

Gln Val Asp Arg Leu Lys Asp Lys Val Asn Asn Thr Leu Ser Thr Asp

835 840 845

Ile Pro Phe Gln Leu Ser Lys Tyr Val Asp Asn Gln Arg Leu Leu Ser

850 855 860

Thr Phe Thr Glu Tyr Ile Lys Asn Ile Leu Asn Asn Ile Ile Leu Asn

865 870 875 880

Leu Arg Tyr Lys Asp Asn Asn Leu Ile Asp Leu Ser Gly Tyr Gly Ala

885 890 895

Lys Val Glu Val Tyr Asp Gly Val Glu Leu Asn Asp Lys Asn Gln Phe

900 905 910

Lys Leu Thr Ser Ser Ala Asn Ser Lys Ile Arg Val Thr Gln Asn Gln

915 920 925

Asn Ile Ile Phe Asn Ser Val Phe Leu Asp Phe Ser Val Ser Phe Trp

930 935 940

Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Lys Asn Asp Gly Ile Gln Asn Tyr Ile His

945 950 955 960

Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Lys Asn Asn Ser Gly Trp Lys

965 970 975

Ile Ser Ile Arg Gly Asn Arg Ile Ile Trp Thr Leu Ile Asp Ile Asn

980 985 990

Gly Lys Thr Lys Ser Val Phe Phe Glu Tyr Asn Ile Arg Glu Asp Ile

995 1000 1005

Ser Glu Tyr Ile Asn Arg Trp Phe Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn

1010 1015 1020

Leu Asn Asn Ala Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Lys Leu Glu Ser Asn

1025 1030 1035

Thr Asp Ile Lys Asp Ile Arg Glu Val Ile Ala Asn Gly Glu Ile

1040 1045 1050

Ile Phe Lys Leu Asp Gly Asp Ile Asp Arg Thr Gln Phe Ile Trp

1055 1060 1065

Met Lys Tyr Phe Ser Ile Phe Asn Thr Glu Leu Ser Gln Ser Asn

1070 1075 1080

Ile Glu Glu Arg Tyr Lys Ile Gln Ser Tyr Ser Glu Tyr Leu Lys

1085 1090 1095

Asp Phe Trp Gly Asn Pro Leu Met Tyr Asn Lys Glu Tyr Tyr Met

1100 1105 1110

Phe Asn Ala Gly Asn Lys Asn Ser Tyr Ile Lys Leu Lys Lys Asp

1115 1120 1125

Ser Pro Val Gly Glu Ile Leu Thr Arg Ser Lys Tyr Asn Gln Asn

1130 1135 1140

Ser Lys Tyr Ile Asn Tyr Arg Asp Leu Tyr Ile Gly Glu Lys Phe

1145 1150 1155

Ile Ile Arg Arg Lys Ser Asn Ser Gln Ser Ile Asn Asp Asp Ile

1160 1165 1170

Val Arg Lys Glu Asp Tyr Ile Tyr Leu Asp Phe Phe Asn Leu Asn

1175 1180 1185

Gln Glu Trp Arg Val Tyr Thr Tyr Lys Tyr Phe Lys Lys Glu Glu

1190 1195 1200

Met Lys Leu Phe Leu Ala Pro Ile Tyr Asp Ser Asp Glu Phe Tyr

1205 1210 1215

Asn Thr Ile Gln Ile Lys Glu Tyr Asp Glu Gln Pro Thr Tyr Ser

1220 1225 1230

Cys Gln Leu Leu Phe Lys Lys Asp Glu Glu Ser Thr Asp Glu Ile

1235 1240 1245

Gly Leu Ile Gly Ile His Arg Phe Tyr Glu Ser Gly Ile Val Phe

1250 1255 1260

Glu Glu Tyr Lys Asp Tyr Phe Cys Ile Ser Lys Trp Tyr Leu Lys

1265 1270 1275

Glu Val Lys Arg Lys Pro Tyr Asn Leu Lys Leu Gly Cys Asn Trp

1280 1285 1290

Gln Phe Ile Pro Lys Asp Glu Gly Trp Thr Glu

1295 1300

<210> 15

<211> 1304

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 修饰的BoNT/A "嵌合体 3C"

<400> 15

Met Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly

1 5 10 15

Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Ala Gly Gln Met Gln Pro

20 25 30

Val Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg

35 40 45

Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu

50 55 60

Ala Lys Gln Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr

65 70 75 80

Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu

85 90 95

Arg Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser Ile Val

100 105 110

Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys

115 120 125

Val Ile Asp Thr Asn Cys Ile Asn Val Ile Gln Pro Asp Gly Ser Tyr

130 135 140

Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val Ile Ile Gly Pro Ser Ala Asp Ile

145 150 155 160

Ile Gln Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn Leu Thr

165 170 175

Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Tyr Ile Arg Phe Ser Pro Asp Phe

180 185 190

Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro Leu Leu

195 200 205

Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala His Glu

210 215 220

Leu Ile His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn Pro Asn

225 230 235 240

Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly Leu

245 250 255

Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala Lys

260 265 270

Phe Ile Asp Ser Leu Gln Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr Asn

275 280 285

Lys Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser Ile Val

290 295 300

Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gln Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys Glu Lys

305 310 315 320

Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp Lys Leu

325 330 335

Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu Asp

340 345 350

Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr Leu Asn

355 360 365

Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys Ile Asn Ile Val Pro Lys Val Asn Tyr

370 375 380

Thr Ile Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala Ala Asn

385 390 395 400

Phe Asn Gly Gln Asn Thr Glu Ile Asn Asn Met Asn Phe Thr Lys Leu

405 410 415

Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys Val Arg

420 425 430

Gly Ile Ile Thr Ser Lys Thr Lys Ser Leu Asp Lys Gly Tyr Asn Lys

435 440 445

Ala Leu Asn Asp Leu Cys Ile Lys Val Asn Asn Trp Asp Leu Phe Phe

450 455 460

Ser Pro Ser Glu Asp Asn Phe Thr Asn Asp Leu Asn Lys Gly Glu Glu

465 470 475 480

Ile Thr Ser Asp Thr Asn Ile Glu Ala Ala Glu Glu Asn Ile Ser Leu

485 490 495

Asp Leu Ile Gln Gln Tyr Tyr Leu Thr Phe Asn Phe Asp Asn Glu Pro

500 505 510

Glu Asn Ile Ser Ile Glu Asn Leu Ser Ser Asp Ile Ile Gly Gln Leu

515 520 525

Glu Leu Met Pro Asn Ile Glu Arg Phe Pro Asn Gly Lys Lys Tyr Glu

530 535 540

Leu Asp Lys Tyr Thr Met Phe His Tyr Leu Arg Ala Gln Glu Phe Glu

545 550 555 560

His Gly Lys Ser Arg Ile Ala Leu Thr Asn Ser Val Asn Glu Ala Leu

565 570 575

Leu Asn Pro Ser Arg Val Tyr Thr Phe Phe Ser Ser Asp Tyr Val Lys

580 585 590

Lys Val Asn Lys Ala Thr Glu Ala Ala Met Phe Leu Gly Trp Val Glu

595 600 605

Gln Leu Val Tyr Asp Phe Thr Asp Glu Thr Ser Glu Val Ser Thr Thr

610 615 620

Asp Lys Ile Ala Asp Ile Thr Ile Ile Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala

625 630 635 640

Leu Asn Ile Gly Asn Met Leu Tyr Lys Asp Asp Phe Val Gly Ala Leu

645 650 655

Ile Phe Ser Gly Ala Val Ile Leu Leu Glu Phe Ile Pro Glu Ile Ala

660 665 670

Ile Pro Val Leu Gly Thr Phe Ala Leu Val Ser Tyr Ile Ala Asn Lys

675 680 685

Val Leu Thr Val Gln Thr Ile Asp Asn Ala Leu Ser Lys Arg Asn Glu

690 695 700

Lys Trp Asp Glu Val Tyr Lys Tyr Ile Val Thr Asn Trp Leu Ala Lys

705 710 715 720

Val Asn Thr Gln Ile Asp Leu Ile Arg Lys Lys Met Lys Glu Ala Leu

725 730 735

Glu Asn Gln Ala Glu Ala Thr Lys Ala Ile Ile Asn Tyr Gln Tyr Asn

740 745 750

Gln Tyr Thr Glu Glu Glu Lys Asn Asn Ile Asn Phe Asn Ile Asp Asp

755 760 765

Leu Ser Ser Lys Leu Asn Glu Ser Ile Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile

770 775 780

Asn Lys Phe Leu Asn Gln Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met Asn Ser Met

785 790 795 800

Ile Pro Tyr Gly Val Lys Arg Leu Glu Asp Phe Asp Ala Ser Leu Lys

805 810 815

Asp Ala Leu Leu Lys Tyr Ile Tyr Asp Asn Arg Gly Thr Leu Ile Gly

820 825 830

Gln Val Asp Arg Leu Lys Asp Lys Val Asn Asn Thr Leu Ser Thr Asp

835 840 845

Ile Pro Phe Gln Leu Ser Lys Tyr Val Asp Asn Gln Arg Leu Leu Ser

850 855 860

Thr Phe Thr Glu Tyr Ile Lys Asn Ile Leu Asn Asn Ile Ile Leu Asn

865 870 875 880

Leu Arg Tyr Lys Asp Asn Asn Leu Ile Asp Leu Ser Gly Tyr Gly Ala

885 890 895

Lys Val Glu Val Tyr Asp Gly Val Glu Leu Asn Asp Lys Asn Gln Phe

900 905 910

Lys Leu Thr Ser Ser Ala Asn Ser Lys Ile Arg Val Thr Gln Asn Gln

915 920 925

Asn Ile Ile Phe Asn Ser Val Phe Leu Asp Phe Ser Val Ser Phe Trp

930 935 940

Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Lys Asn Asp Gly Ile Gln Asn Tyr Ile His

945 950 955 960

Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Lys Asn Asn Ser Gly Trp Lys

965 970 975

Ile Ser Ile Arg Gly Asn Arg Ile Ile Trp Thr Leu Ile Asp Ile Asn

980 985 990

Gly Lys Thr Lys Ser Val Phe Phe Glu Tyr Asn Ile Arg Glu Asp Ile

995 1000 1005

Ser Glu Tyr Ile Asn Arg Trp Phe Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn

1010 1015 1020

Leu Asn Asn Ala Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Lys Leu Glu Ser Asn

1025 1030 1035

Thr Asp Ile Lys Asp Ile Arg Glu Val Ile Ala Asn Gly Glu Ile

1040 1045 1050

Ile Phe Lys Leu Asp Gly Asp Ile Asp Arg Thr Gln Phe Ile Trp

1055 1060 1065

Met Lys Tyr Phe Ser Ile Phe Asn Thr Glu Leu Ser Gln Ser Asn

1070 1075 1080

Ile Glu Glu Arg Tyr Lys Ile Gln Ser Tyr Ser Glu Tyr Leu Lys

1085 1090 1095

Asp Phe Trp Gly Asn Pro Leu Met Tyr Asn Lys Glu Tyr Tyr Met

1100 1105 1110

Phe Asn Ala Gly Asn Lys Asn Ser Tyr Ile Lys Leu Lys Lys Asp

1115 1120 1125

Ser Pro Val Gly Glu Ile Leu Thr Arg Ser Lys Tyr Asn Gln Asn

1130 1135 1140

Ser Lys Tyr Ile Asn Tyr Arg Asp Leu Tyr Ile Gly Glu Lys Phe

1145 1150 1155

Ile Ile Arg Arg Lys Ser Asn Ser Gln Ser Ile Asn Asp Asp Ile

1160 1165 1170

Val Arg Lys Glu Asp Tyr Ile Tyr Leu Asp Phe Phe Asn Leu Asn

1175 1180 1185

Gln Glu Trp Arg Val Tyr Thr Tyr Lys Tyr Phe Lys Lys Glu Glu

1190 1195 1200

Glu Lys Leu Phe Leu Ala Pro Ile Ser Asp Ser Asp Glu Phe Tyr

1205 1210 1215

Asn Thr Ile Gln Ile Lys Glu Tyr Asp Glu Gln Pro Thr Tyr Ser

1220 1225 1230

Cys Gln Leu Leu Phe Lys Lys Asp Glu Glu Ser Thr Asp Glu Ile

1235 1240 1245

Gly Leu Ile Gly Ile His Arg Phe Tyr Glu Ser Gly Ile Val Phe

1250 1255 1260

Glu Glu Tyr Lys Asp Tyr Phe Cys Ile Ser Lys Trp Tyr Leu Lys

1265 1270 1275

Glu Val Lys Arg Lys Pro Tyr Asn Leu Lys Leu Gly Cys Asn Trp

1280 1285 1290

Gln Phe Ile Pro Lys Asp Glu Gly Trp Thr Glu

1295 1300

<210> 16

<211> 1291

<212> PRT

<213> 肉毒梭菌（Clostridium botulinum）

<400> 16

Met Pro Val Thr Ile Asn Asn Phe Asn Tyr Asn Asp Pro Ile Asp Asn

1 5 10 15

Asn Asn Ile Ile Met Met Glu Pro Pro Phe Ala Arg Gly Thr Gly Arg

20 25 30

Tyr Tyr Lys Ala Phe Lys Ile Thr Asp Arg Ile Trp Ile Ile Pro Glu

35 40 45

Arg Tyr Thr Phe Gly Tyr Lys Pro Glu Asp Phe Asn Lys Ser Ser Gly

50 55 60

Ile Phe Asn Arg Asp Val Cys Glu Tyr Tyr Asp Pro Asp Tyr Leu Asn

65 70 75 80

Thr Asn Asp Lys Lys Asn Ile Phe Leu Gln Thr Met Ile Lys Leu Phe

85 90 95

Asn Arg Ile Lys Ser Lys Pro Leu Gly Glu Lys Leu Leu Glu Met Ile

100 105 110

Ile Asn Gly Ile Pro Tyr Leu Gly Asp Arg Arg Val Pro Leu Glu Glu

115 120 125

Phe Asn Thr Asn Ile Ala Ser Val Thr Val Asn Lys Leu Ile Ser Asn

130 135 140

Pro Gly Glu Val Glu Arg Lys Lys Gly Ile Phe Ala Asn Leu Ile Ile

145 150 155 160

Phe Gly Pro Gly Pro Val Leu Asn Glu Asn Glu Thr Ile Asp Ile Gly

165 170 175

Ile Gln Asn His Phe Ala Ser Arg Glu Gly Phe Gly Gly Ile Met Gln

180 185 190

Met Lys Phe Cys Pro Glu Tyr Val Ser Val Phe Asn Asn Val Gln Glu

195 200 205

Asn Lys Gly Ala Ser Ile Phe Asn Arg Arg Gly Tyr Phe Ser Asp Pro

210 215 220

Ala Leu Ile Leu Met His Glu Leu Ile His Val Leu His Gly Leu Tyr

225 230 235 240

Gly Ile Lys Val Asp Asp Leu Pro Ile Val Pro Asn Glu Lys Lys Phe

245 250 255

Phe Met Gln Ser Thr Asp Ala Ile Gln Ala Glu Glu Leu Tyr Thr Phe

260 265 270

Gly Gly Gln Asp Pro Ser Ile Ile Thr Pro Ser Thr Asp Lys Ser Ile

275 280 285

Tyr Asp Lys Val Leu Gln Asn Phe Arg Gly Ile Val Asp Arg Leu Asn

290 295 300

Lys Val Leu Val Cys Ile Ser Asp Pro Asn Ile Asn Ile Asn Ile Tyr

305 310 315 320

Lys Asn Lys Phe Lys Asp Lys Tyr Lys Phe Val Glu Asp Ser Glu Gly

325 330 335

Lys Tyr Ser Ile Asp Val Glu Ser Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Ser Leu

340 345 350

Met Phe Gly Phe Thr Glu Thr Asn Ile Ala Glu Asn Tyr Lys Ile Lys

355 360 365

Thr Arg Ala Ser Tyr Phe Ser Asp Ser Leu Pro Pro Val Lys Ile Lys

370 375 380

Asn Leu Leu Asp Asn Glu Ile Tyr Thr Ile Glu Glu Gly Phe Asn Ile

385 390 395 400

Ser Asp Lys Asp Met Glu Lys Glu Tyr Arg Gly Gln Asn Lys Ala Ile

405 410 415

Asn Lys Gln Ala Tyr Glu Glu Ile Ser Lys Glu His Leu Ala Val Tyr

420 425 430

Lys Ile Gln Met Cys Lys Ser Val Lys Ala Pro Gly Ile Cys Ile Asp

435 440 445

Val Asp Asn Glu Asp Leu Phe Phe Ile Ala Asp Lys Asn Ser Phe Ser

450 455 460

Asp Asp Leu Ser Lys Asn Glu Arg Ile Glu Tyr Asn Thr Gln Ser Asn

465 470 475 480

Tyr Ile Glu Asn Asp Phe Pro Ile Asn Glu Leu Ile Leu Asp Thr Asp

485 490 495

Leu Ile Ser Lys Ile Glu Leu Pro Ser Glu Asn Thr Glu Ser Leu Thr

500 505 510

Asp Phe Asn Val Asp Val Pro Val Tyr Glu Lys Gln Pro Ala Ile Lys

515 520 525

Lys Ile Phe Thr Asp Glu Asn Thr Ile Phe Gln Tyr Leu Tyr Ser Gln

530 535 540

Thr Phe Pro Leu Asp Ile Arg Asp Ile Ser Leu Thr Ser Ser Phe Asp

545 550 555 560

Asp Ala Leu Leu Phe Ser Asn Lys Val Tyr Ser Phe Phe Ser Met Asp

565 570 575

Tyr Ile Lys Thr Ala Asn Lys Val Val Glu Ala Gly Leu Phe Ala Gly

580 585 590

Trp Val Lys Gln Ile Val Asn Asp Phe Val Ile Glu Ala Asn Lys Ser

595 600 605

Asn Thr Met Asp Lys Ile Ala Asp Ile Ser Leu Ile Val Pro Tyr Ile

610 615 620

Gly Leu Ala Leu Asn Val Gly Asn Glu Thr Ala Lys Gly Asn Phe Glu

625 630 635 640

Asn Ala Phe Glu Ile Ala Gly Ala Ser Ile Leu Leu Glu Phe Ile Pro

645 650 655

Glu Leu Leu Ile Pro Val Val Gly Ala Phe Leu Leu Glu Ser Tyr Ile

660 665 670

Asp Asn Lys Asn Lys Ile Ile Lys Thr Ile Asp Asn Ala Leu Thr Lys

675 680 685

Arg Asn Glu Lys Trp Ser Asp Met Tyr Gly Leu Ile Val Ala Gln Trp

690 695 700

Leu Ser Thr Val Asn Thr Gln Phe Tyr Thr Ile Lys Glu Gly Met Tyr

705 710 715 720

Lys Ala Leu Asn Tyr Gln Ala Gln Ala Leu Glu Glu Ile Ile Lys Tyr

725 730 735

Arg Tyr Asn Ile Tyr Ser Glu Lys Glu Lys Ser Asn Ile Asn Ile Asp

740 745 750

Phe Asn Asp Ile Asn Ser Lys Leu Asn Glu Gly Ile Asn Gln Ala Ile

755 760 765

Asp Asn Ile Asn Asn Phe Ile Asn Gly Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met

770 775 780

Lys Lys Met Ile Pro Leu Ala Val Glu Lys Leu Leu Asp Phe Asp Asn

785 790 795 800

Thr Leu Lys Lys Asn Leu Leu Asn Tyr Ile Asp Glu Asn Lys Leu Tyr

805 810 815

Leu Ile Gly Ser Ala Glu Tyr Glu Lys Ser Lys Val Asn Lys Tyr Leu

820 825 830

Lys Thr Ile Met Pro Phe Asp Leu Ser Ile Tyr Thr Asn Asp Thr Ile

835 840 845

Leu Ile Glu Met Phe Asn Lys Tyr Asn Ser Glu Ile Leu Asn Asn Ile

850 855 860

Ile Leu Asn Leu Arg Tyr Lys Asp Asn Asn Leu Ile Asp Leu Ser Gly

865 870 875 880

Tyr Gly Ala Lys Val Glu Val Tyr Asp Gly Val Glu Leu Asn Asp Lys

885 890 895

Asn Gln Phe Lys Leu Thr Ser Ser Ala Asn Ser Lys Ile Arg Val Thr

900 905 910

Gln Asn Gln Asn Ile Ile Phe Asn Ser Val Phe Leu Asp Phe Ser Val

915 920 925

Ser Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Lys Asn Asp Gly Ile Gln Asn

930 935 940

Tyr Ile His Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Lys Asn Asn Ser

945 950 955 960

Gly Trp Lys Ile Ser Ile Arg Gly Asn Arg Ile Ile Trp Thr Leu Ile

965 970 975

Asp Ile Asn Gly Lys Thr Lys Ser Val Phe Phe Glu Tyr Asn Ile Arg

980 985 990

Glu Asp Ile Ser Glu Tyr Ile Asn Arg Trp Phe Phe Val Thr Ile Thr

995 1000 1005

Asn Asn Leu Asn Asn Ala Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Lys Leu Glu

1010 1015 1020

Ser Asn Thr Asp Ile Lys Asp Ile Arg Glu Val Ile Ala Asn Gly

1025 1030 1035

Glu Ile Ile Phe Lys Leu Asp Gly Asp Ile Asp Arg Thr Gln Phe

1040 1045 1050

Ile Trp Met Lys Tyr Phe Ser Ile Phe Asn Thr Glu Leu Ser Gln

1055 1060 1065

Ser Asn Ile Glu Glu Arg Tyr Lys Ile Gln Ser Tyr Ser Glu Tyr

1070 1075 1080

Leu Lys Asp Phe Trp Gly Asn Pro Leu Met Tyr Asn Lys Glu Tyr

1085 1090 1095

Tyr Met Phe Asn Ala Gly Asn Lys Asn Ser Tyr Ile Lys Leu Lys

1100 1105 1110

Lys Asp Ser Pro Val Gly Glu Ile Leu Thr Arg Ser Lys Tyr Asn

1115 1120 1125

Gln Asn Ser Lys Tyr Ile Asn Tyr Arg Asp Leu Tyr Ile Gly Glu

1130 1135 1140

Lys Phe Ile Ile Arg Arg Lys Ser Asn Ser Gln Ser Ile Asn Asp

1145 1150 1155

Asp Ile Val Arg Lys Glu Asp Tyr Ile Tyr Leu Asp Phe Phe Asn

1160 1165 1170

Leu Asn Gln Glu Trp Arg Val Tyr Thr Tyr Lys Tyr Phe Lys Lys

1175 1180 1185

Glu Glu Glu Lys Leu Phe Leu Ala Pro Ile Ser Asp Ser Asp Glu

1190 1195 1200

Phe Tyr Asn Thr Ile Gln Ile Lys Glu Tyr Asp Glu Gln Pro Thr

1205 1210 1215

Tyr Ser Cys Gln Leu Leu Phe Lys Lys Asp Glu Glu Ser Thr Asp

1220 1225 1230

Glu Ile Gly Leu Ile Gly Ile His Arg Phe Tyr Glu Ser Gly Ile

1235 1240 1245

Val Phe Glu Glu Tyr Lys Asp Tyr Phe Cys Ile Ser Lys Trp Tyr

1250 1255 1260

Leu Lys Glu Val Lys Arg Lys Pro Tyr Asn Leu Lys Leu Gly Cys

1265 1270 1275

Asn Trp Gln Phe Ile Pro Lys Asp Glu Gly Trp Thr Glu

1280 1285 1290

Claims

1.用于处理面纹的经修饰的BoNT/A，其中通过肌内注射在个体的多个面部部位处施用该经修饰的BoNT/A，

其中，以每个部位1个单位至41个单位经修饰的BoNT/A的单位剂量，施用该经修饰的BoNT/A，其中1个单位是对应于小鼠中计算的半数致死剂量(LD₅₀)的经修饰的BoNT/A的量，

其中该多个部位选自：

用于处理眉间纹的皱眉肌的至多两个部位和降眉间肌的一个部位；

用于处理额头纹的额肌的至多五个部位；和

用于处理外眦纹的眼轮匝肌外侧部分的至多三个部位，

其中该经修饰的BoNT/A在选自以下的一个或多个氨基酸残基处包含修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS 1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，其中该修饰选自：

i.用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；

iv.插入碱性氨基酸残基；和

v.缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。

2.用于处理面纹的经修饰的BoNT/A，其中通过肌内注射在个体的多个面部部位处施用该经修饰的BoNT/A，

其中该多个部位选自：

用于处理额头纹的额肌的至多五个部位；和

用于处理外眦纹的眼轮匝肌外侧部分的至多三个部位，

i.用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；

iv.插入碱性氨基酸残基；和

v.缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。

3.权利要求1的用于应用的经修饰的BoNT/A，其中5-10pg(优选8.4pg)经修饰的BoNT/A对应于小鼠中计算的半数致死剂量(LD₅₀)。

4.前述权利要求中任一项的用于应用的经修饰的BoNT/A，其中经修饰的BoNT/A的单位剂量选自：2个单位至35个单位、6个至35个单位，12个单位至35个单位、12个单位至24个单位，最优选12个单位至18个单位。

5.权利要求4的用于应用的经修饰的BoNT/A，其中在处理期间施用的经修饰的BoNT/A的总剂量选自：574个单位、560个单位、384个单位，最优选288个单位；

优选地，其中该总剂量基于在16个注射部位施用16个单位剂量。

6.前述权利要求中任一项的用于应用的经修饰的BoNT/A，其中经修饰的BoNT/A的单位剂量选自：18pg至350pg，20pg至300pg，最优选100pg至150pg。

7.前述权利要求中任一项的用于应用的经修饰的BoNT/A，其中在处理期间施用的经修饰的BoNT/A的总剂量选自至多4850pg、4800pg，最优选2400pg。

8.用于处理面纹的经修饰的BoNT/A，其中通过肌内注射在个体的多个面部部位处施用该经修饰的BoNT/A，

其中该多个部位选自：

用于处理额头纹的额肌的至多五个部位；和

用于处理外眦纹的眼轮匝肌外侧部分的至多三个部位，

9.用于处理面纹的经修饰的BoNT/A，其中通过肌内注射在个体的多个面部部位处施用该经修饰的BoNT/A，

其中以每个部位12pg至1754pg经修饰的BoNT/A的单位剂量，施用该经修饰的BoNT/A，

其中该多个部位选自：

用于处理额头纹的额肌的至多五个部位；和

用于处理外眦纹的眼轮匝肌外侧部分的至多三个部位，

10.权利要求8的用于应用的经修饰的BoNT/A，其中该经修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B H_C结构域，并且其中20-30pg(优选24.04pg)经修饰的BoNT/A对应于小鼠中计算的半数致死剂量(LD₅₀)。

11.权利要求8-10中任一项的用于应用的经修饰的BoNT/A，其中经修饰的BoNT/A的单位剂量选自：0.5个单位至62个单位，3个单位至62个单位，10至62个单位，10个单位至42个单位，最优选10个单位至21个单位。

12.权利要求11的用于应用的经修饰的BoNT/A，其中在处理期间施用的经修饰的BoNT/A的总剂量选自：1019个单位、998个单位、666个单位，最优选333个单位；

13.权利要求8-12中任一项的用于应用的经修饰的BoNT/A，其中经修饰的BoNT/A的单位剂量选自：12pg至1750pg，20pg至1500pg，最优选250pg至500pg。

14.权利要求8-13中任一项的用于应用的经修饰的BoNT/A，其中在处理期间施用的经修饰的BoNT/A的总剂量选自至多24500pg、24000pg、最优选8000pg。

15.前述权利要求中任一项的用于应用的经修饰的BoNT/A，其中经修饰的BoNT/A具有大于7的安全性比，其中安全比计算为：以pg/小鼠测量的-10％体重变化所需的毒素剂量除以以pg/小鼠测量的DAS ED₅₀，其中ED₅₀＝产生DAS得分2所需的剂量。

16.前述权利要求中任一项的用于应用的经修饰的BoNT/A，其中经修饰的BoNT/A用于处理眉间纹，优选其中该经修饰的BoNT/A在皱眉肌的两个部位和降眉间肌的一个部位处施用，更优选其中该经修饰的BoNT/A在总共五个部位处施用。

17.权利要求1-15的用于应用的经修饰的BoNT/A，其中经修饰的BoNT/A用于处理额头纹，优选其中该经修饰的BoNT/A在额肌的五个部位处施用。

18.权利要求1-15的用于应用的经修饰的BoNT/A，其中经修饰的BoNT/A用于处理外眦纹，优选其中该经修饰的BoNT/A在眼轮匝肌外侧部分的三个部位处施用以用于处理外眦纹，更优选其中该经修饰的BoNT/A在总共六个部位处施用。

19.权利要求16-18的用于应用的经修饰的BoNT/A，其中该经修饰的BoNT/A对8、10、12、14或16个部位施用。

20.权利要求16-18的用于应用的经修饰的BoNT/A，其中该经修饰的BoNT/A对7、9、11、13或15个部位施用。

21.权利要求1-7或15-20的用于应用的经修饰的BoNT/A，其中该修饰包括在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰(优选由其组成)：ASN 886、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1052、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274或THR 1277，并且其中经修饰的BoNT/A由与选自SEQID NO:3、5、7和9的核酸序列具有至少70％序列同一性的核酸序列编码，和/或包含与选自SEQ ID NO:4、6、8和10的多肽序列具有至少70％序列同一性的多肽序列。

22.权利要求1-7或15-21的用于应用的经修饰的BoNT/A，其中该修饰包括在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰(优选由其组成)：ASN 886、ASN 930、SER 955、GLN 991、ASN 1026、ASN1052和GLN 1229，并且其中经修饰的BoNT/A由与SEQ ID NO:3具有至少70％序列同一性的核酸序列编码，和/或包含与选自SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的多肽序列。

23.权利要求1-7或15-22的用于应用的经修饰的BoNT/A，其中该修饰是取代，优选用赖氨酸或精氨酸取代。

24.权利要求8-20中任一项的用于应用的经修饰的BoNT/A，其中经修饰的BoNT/A包含与SEQ ID NO:14具有至少70％序列同一性的多肽序列。

25.经修饰的肉毒神经毒素A(BoNT/A)的单位剂型，该单位剂型包含：

a.1个单位至41个单位经修饰的BoNT/A，其中1个单位是对应于小鼠中计算的半数致死剂量(LD₅₀)的经修饰的BoNT/A的量；或

b.8.4pg至350pg经修饰的BoNT/A；和

c.可选地，可药用载体、赋形剂、助剂和/或盐，

d.其中该经修饰的BoNT/A在选自以下的一个或多个氨基酸残基处包含修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS 1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，其中该修饰选自：

i.用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；

iv.插入碱性氨基酸残基；和

v.缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。

26.权利要求25的单位剂型，其包含：

a.1个单位至35个单位经修饰的BoNT/A；或

b.10pg至300pg经修饰的BoNT/A。

27.经修饰的肉毒神经毒素A(BoNT/A)的单位剂型，该单位剂型包含：

a.0.5个单位至73个单位经修饰的BoNT/A，其中1个单位是对应于小鼠中计算的半数致死剂量(LD50)的经修饰的BoNT/A的量；或

b.12pg至1754pg经修饰的BoNT/A；和

c.可选地，可药用载体、赋形剂、助剂和/或盐，

d.其中该经修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(H_C结构域)。

28.权利要求27的单位剂型，其包含：

a.0.8个单位至62个单位经修饰的BoNT/A；或

b.20pg至1500pg经修饰的BoNT/A。

29.试剂盒，其包含：

a.权利要求25-28中任一项的单位剂型；和

b.用于处理面纹的说明书；和

c.可选地，稀释剂。