CN117979988A - 用于治疗影响受试者眼睑肌肉的疾病的修饰的BoNT/A - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)，其用于治疗受试者眼睑痉挛的方法中，其中通过在受试者面部的多个部位进行肌内注射来施用修饰的BoNT/A，该方法包含：a)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；b)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；以及c)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌，其中单位剂量的修饰的BoNT/A为至少240pg(优选240pg至8000pg)修饰的BoNT/A，其中在治疗期间施用的总剂量为至多24000pg修饰的BoNT/A，并且其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域(HN)以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
Description
技术领域
本发明涉及治疗影响受试者眼睑肌肉的疾病。
背景技术
影响眼睑肌肉的疾病会对患有该疾病的患者的生活产生负面影响。在这些疾病中，眼睑痉挛和面部痉挛(例如，面肌痉挛(hemifacial spasm))尤其令人不适。
眼睑痉挛主要表征为眼轮匝肌异常收缩。更具体地，眼睑痉挛可表现为一只或两只眼睛不可控制的过度眨眼和痉挛，其进一步表征为不可控制的眼睑闭合持续时间长于典型眨眼反射。眼睑痉挛症状可反复出现，每次可持续几小时或几天，在一些情况下，症状(例如，抽搐)可以是慢性且持续的，对患有该病症的受试者造成终身困扰。其他症状可包括可辐射至鼻子、面部和颈部的抽搐、眼睛干涩以及对阳光和强光敏感。
眼睑痉挛的原因尚不清楚。有人认为眼睑痉挛可由某些药物诱发，例如治疗帕金森病的药物、雌激素替代疗法或苯二氮卓类药物急性停药。眼睑痉挛还可与脑部疾病(例如，包括神经退行性病症、大脑基底神经节功能异常和多发性硬化症)、脑损伤或头部损伤(例如，脑震荡)有关。
面肌痉挛是一种运动疾病，其表征为面部一侧的表情肌不由自主地强直阵挛性收缩。虽然有时会出现双侧病例，但极为罕见。受影响的肌肉是由面部神经(脑神经VII)支配的肌肉。最初，疾病症状通常位于眼轮匝肌(例如，典型面肌痉挛)，并且可蔓延到面部表情的其他肌肉。面肌痉挛(HFS)有两种形式：典型HFS和非典型HFS。在典型形式中，抽搐/痉挛通常始于眼轮匝肌的下眼睑中。随着时间的推移，抽搐/痉挛会扩散至整个眼睑，然后扩散至嘴唇周围的口轮匝肌和颧骨区域的颊肌。在非典型HFS中，抽搐/痉挛通常始于嘴唇周围的口轮匝肌和下面部中颧骨区域的颊肌，然后随着时间的推移扩散至眼睑中的眼轮匝肌。最常见的形式是典型形式，非典型形式仅见于约2-3％的面肌痉挛患者。
对影响受试者眼睑肌肉的疾病的药物治疗已被证明通常不可预测且短期。抗胆碱能药物、镇静药物和肉毒神经毒素(例如，或)是最常用的治疗选择。然而，这些治疗方案并非最佳，并且与严重副作用相关，包括毒性以及面部肌肉产生不必要的麻木。在一些情况下，对于对药物治疗或肉毒神经毒素注射反应不佳的患者，可以设想侵入性外科手术。因此，一直不断测试或寻求新的且有效的治疗眼睑痉挛的疗法。
更具体地，A型肉毒神经毒素(botulinum neurotoxin A)(BoNT/A)选择性抑制突触前神经末梢释放乙酰胆碱，从而阻断神经肌肉接头处的胆碱能传递，导致肌肉收缩和肌肉张力降低，使注射的肌肉松弛。然而，目前可用的BoNT/A产品的作用持续时间为约12至14周，此时新的神经末梢萌发，使神经功能恢复正常，原始症状重新出现。因此，为了保持效果，需要定期重复注射。因此，考虑到疾病的潜在慢性和所需治疗的长期性质，BoNT/A注射的频率是治疗影响受试者眼睑肌肉的疾病(例如，眼睑痉挛和/或面肌痉挛)的重要考虑因素。事实上，这影响着对患者和护理人员的直接和间接健康成本、医院/诊所内的注射物流以及患者生活质量(这是最重要的)。
被批准用于治疗眼睑痉挛和面肌痉挛，每次治疗期的最大总剂量为每只眼睛120个单位。要求临床医生对受试者的眼睑肌肉施用达到每次治疗期每只眼睛总计120个单位的上限(即，治疗两只眼睛时为240单位)。临床医生不得不在患者治疗期间做出艰难选择。换言之，在常规治疗方案中，临床医生必须在可施用的相对低总量的BoNT/A(由于BoNT/A的高毒性而必须如此)以及在多个不同肌肉和/或其部位处的有效量之间找到平衡。因此，可能忽略某些肌肉，而其他肌肉则接受次优量的BoNT/A，从而导致次优治疗。
此外，用于此类疾病的常规治疗方案很复杂，导致临床医生为了避免对患者产生毒性而给药剂量不足。因此，需要一种方便、安全且有效的单个剂量单位，以及在治疗期内可施用于眼睑肌肉的单位数量(例如，包括每个肌肉的注射部位的数量)的相应指南，而不会使患者产生毒性。
总之，需要一种改进的对影响受试者眼睑肌肉的疾病(例如，眼睑痉挛和/或面肌痉挛)的治疗，该治疗允许个体化的以患者为中心的方法根据目标临床模式定制治疗，根据疾病的分布、范围和严重程度允许待注射肌肉和/或其部位的不同组合，同时避免毒性并提供更持久的治疗(导致施用频率降低)。
本发明克服了一个或多个上述问题。
发明内容
本发明人出乎意料地发现，修饰的BoNT/A在治疗影响受试者眼睑肌肉的疾病(例如，眼睑痉挛和/或面肌痉挛)中特别有用。修饰的BoNT/A可包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)，这导致修饰的BoNT/A在施用部位滞留增加(减少远离扩散)和/或作用持续时间增加(例如，6至9个月)。可替代地，修饰的BoNT/A可包含一个或多个表面暴露的氨基酸残基的修饰，导致净正电荷增加。增加的电荷促进多肽与阴离子胞外成分之间的静电相互作用，从而促进多肽与细胞表面之间的结合。反过来，这也增加在施用部位滞留(减少远离扩散)和/或导致作用持续时间增加(例如，6至9个月)。
有利地，与未修饰的BoNT/A(例如，)相比，修饰的BoNT/A的安全性有所改进。可通过本文所述的修饰的BoNT/A的高安全性比率(Safety Ratio)来表示此类改进的安全性。
基于本文的临床前数据，已经表明可以向受试者施用更高总量的修饰的BoNT/A，同时在此类高剂量下获得与未修饰的BoNT/A(例如，)相似的安全性。因此，在达到最大总剂量之前，在治疗影响受试者眼睑肌肉的疾病(例如，眼睑痉挛和/或面肌痉挛，如典型面肌痉挛)时，可以注射更多修饰的BoNT/A和/或可以在更多数量的肌肉和/或其部位注射更多修饰的BoNT/A。该发现重要且有利，并且在为临床医生提供更大范围的治疗选择的同时，使得对此类疾病的治疗有所改进。治疗可以得到改进，因为与用未修饰的BoNT/A(例如，)治疗相比，其提供了更持久的治疗(导致施用频率降低)和/或能够为受试者定制和/或使受试者生活质量提高。因此，与常规治疗方案相比，本发明的治疗得到了改进。
此外，本发明提供了方便、安全且有效的单个单位剂量以及可以在单次治疗中安全施用的总(最大)剂量。本发明还提供了可对肌肉施用所述单位剂量的次数(例如，包括每个肌肉的注射部位的数量)的相应指导，而不会使患者产生毒性。因此，根据本发明对影响受试者眼睑肌肉的疾病(例如，眼睑痉挛和/或面肌痉挛)的治疗对临床医生而言简单得多，并且有助于避免给药剂量不足和/或给药剂量过多。此外，与常规治疗相比，根据本发明的治疗对患者而言更令人满意，因为其更适合患者的需求。
具体实施方式
一方面，本发明提供了一种修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)，其用于治疗影响受试者眼睑肌肉的疾病的方法中，该方法包含：
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；以及
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌，
其中单个单位剂量的修饰的BoNT/A为至少240pg修饰的BoNT/A，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多24000pg修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
在整篇公开内容中，注射部位附近的眼睛可被称为受疾病影响的眼睛。
在整篇公开内容中，术语“外侧上眼轮匝肌”可以指“上眼睑的外侧睑板前眼轮匝肌”。类似地，术语“内侧上眼轮匝肌”可以指“上眼睑的内侧睑板前眼轮匝肌”。此外，术语“外侧下眼轮匝肌”可以指“下眼睑的外侧睑板前眼轮匝肌”。
在一个相关方面，本发明提供了一种修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)，其用于治疗影响受试者眼睑肌肉的疾病的方法中，与通过未修饰的BoNT/A(例如，SEQ ID NO：2)治疗相比，其持续时间更长，该方法包含：
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；以及
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌，
其中单个单位剂量的修饰的BoNT/A为至少240pg修饰的BoNT/A，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多24000pg修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
术语“治疗影响受试者眼睑肌肉的疾病”可以指减轻受试者所述疾病的一种或多种症状。
术语“治疗影响受试者眼睑肌肉的疾病，与通过未修饰的BoNT/A治疗相比，其持续时间更长”可以指当与施用未修饰的BoNT/A相比时，在施用本发明的修饰的BoNT/A后，受试者的所述疾病的一种或多种症状减轻的持续时间更长。可以通过与用未修饰的BoNT/A治疗的表现出同等症状的同等对照受试者相比，来确定所述减少。在对照受试者的一种或多种症状的严重程度与未修饰的BoNT/A治疗前基本相同(例如，相同)的时间段，与用修饰的BoNT/A治疗前的一种或多种症状的严重程度相比，用根据本发明的修饰的BoNT/A治疗的受试者可表现出同等的一种或多种症状改进至少5％、10％、25％或50％。未修饰的BoNT/A优选为以双链形式存在的SEQ ID NO：2。
一方面，本发明提供了一种治疗影响受试者眼睑肌肉的疾病的方法，该方法包含：
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；以及
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌，
其中单个单位剂量的修饰的BoNT/A为至少240pg修饰的BoNT/A，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多24000pg修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
在一个相关方面，本发明提供了一种治疗影响受试者眼睑肌肉的疾病的方法，与通过未修饰的BoNT/A(例如，SEQ ID NO：2)治疗相比，其持续时间更长，该方法包含：
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；以及
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌，
其中单个单位剂量的修饰的BoNT/A为至少240pg修饰的BoNT/A，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多24000pg修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
一方面，本发明提供了修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)在制备用于治疗影响受试者眼睑肌肉的疾病的药物中的用途，包含：
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；以及
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌，
其中单个单位剂量的修饰的BoNT/A为至少240pg修饰的BoNT/A，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多24000pg修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
在一个相关方面，本发明提供了修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)在制备用于治疗受试者眼睑肌肉的疾病的药物中的用途，与通过未修饰的BoNT/A(例如，SEQ ID NO：2)治疗相比，其持续时间更长，包含：
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；以及
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌，
其中单个单位剂量的修饰的BoNT/A为至少240pg修饰的BoNT/A，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多24000pg修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
一方面提供了一种修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)，其用于治疗受试者眼睑痉挛的方法中，其中通过在受试者面部的多个部位进行肌内注射来施用修饰的BoNT/A，包含：
a)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
b)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；以及
c)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌，
其中单位剂量的修饰的BoNT/A为至少240pg(优选240pg至8000pg)修饰的BoNT/A，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多24000pg修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域(HN)以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
在一个相关方面，本发明提供了一种修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)，其用于治疗受试者眼睑痉挛的方法中，与通过未修饰的BoNT/A(例如，SEQ ID NO：2)治疗相比，其持续时间更长，其中通过在受试者面部的多个部位进行肌内注射来施用修饰的BoNT/A，该方法包含：
a)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
b)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；以及
c)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌，
其中单位剂量的修饰的BoNT/A为至少240pg(优选240pg至8000pg)修饰的BoNT/A，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多24000pg修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域(HN)以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
在一个相关方面，本发明提供了一种治疗受试者眼睑痉挛的方法，其中通过在受试者面部的多个部位进行肌内注射来施用修饰的BoNT/A，该方法包含：
a)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
b)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；以及
c)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌，
其中单位剂量的修饰的BoNT/A为至少240pg(优选240pg至8000pg)修饰的BoNT/A，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多24000pg修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域(HN)以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
在一个相关方面，本发明提供了一种治疗受试者眼睑痉挛的方法，与通过未修饰的BoNT/A(例如，SEQ ID NO：2)治疗相比，其持续时间更长，其中通过在受试者面部的多个部位进行肌内注射来施用修饰的BoNT/A，该方法包含：
a)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
b)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；以及
c)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌，
其中单位剂量的修饰的BoNT/A为至少240pg(优选240pg至8000pg)修饰的BoNT/A，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多24000pg修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域(HN)以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
一方面，本发明提供了修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)在制备用于治疗受试者眼睑痉挛的药物中的用途，包含：
a)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
b)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；以及
c)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌，
其中单位剂量的修饰的BoNT/A为至少240pg(优选240pg至8000pg)修饰的BoNT/A，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多24000pg修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域(HN)以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
一方面，本发明提供了修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)在制备用于治疗受试者眼睑痉挛的药物中的用途，与通过未修饰的BoNT/A(例如，SEQ ID NO：2)治疗相比，其持续时间更长，包含：
a)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
b)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；以及
c)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌，
其中单位剂量的修饰的BoNT/A为至少240pg(优选240pg至8000pg)修饰的BoNT/A，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多24000pg修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域(HN)以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
另一方面提供了一种修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)用于治疗典型面肌痉挛的方法中，其中通过在受试者面部的多个部位进行肌内注射来施用修饰的BoNT/A，该方法包含：
a)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
b)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；
c)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的外侧下眼轮匝肌；以及
d)根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于口轮匝肌上肌；
(ii)一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；
(iii)一个单位剂量施用于颧大肌；
(iv)一个单位剂量施用于颧小肌；
(v)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；
(vi)一个单位剂量施用于颏肌；
(vii)一个单位剂量施用于颈阔肌；
(viii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；
(ix)一个单位剂量施用于颊肌；
(x)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；
(xi)一个单位剂量施用于降眉间肌；
(xii)一个单位剂量施用于鼻肌；和/或
(xiii)一个单位剂量施用于上睑提肌；
其中单位剂量的修饰的BoNT/A为至少240pg(优选240pg至8000pg)修饰的BoNT/A，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多24000pg修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含A型肉毒神经毒素(BoNT/A)轻链和易位结构域(HN)以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
在一个相关方面，本发明提供了一种修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)，其用于治疗受试者典型面肌痉挛的方法中，与通过未修饰的BoNT/A(例如，SEQ ID NO：2)治疗相比，其持续时间更长，其中通过在受试者面部的多个部位进行肌内注射来施用修饰的BoNT/A，该方法包含：
a)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
b)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；
c)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的外侧下眼轮匝肌；以及
d)根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于口轮匝肌上肌；
(ii)一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；
(iii)一个单位剂量施用于颧大肌；
(iv)一个单位剂量施用于颧小肌；
(v)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；
(vi)一个单位剂量施用于颏肌；
(vii)一个单位剂量施用于颈阔肌；
(viii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；
(ix)一个单位剂量施用于颊肌；
(x)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；
(xi)一个单位剂量施用于降眉间肌；
(xii)一个单位剂量施用于鼻肌；和/或
(xiii)一个单位剂量施用于上睑提肌；
其中单位剂量的修饰的BoNT/A为至少240pg(优选240pg至8000pg)修饰的BoNT/A，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多24000pg修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含A型肉毒神经毒素(BoNT/A)轻链和易位结构域(HN)以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
在一个相关方面，本发明提供了一种治疗受试者典型面肌痉挛的方法，其中通过在受试者面部的多个部位进行肌内注射来施用修饰的BoNT/A，该方法包含：
a)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
b)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；
c)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的外侧下眼轮匝肌；以及
d)根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于口轮匝肌上肌；
(ii)一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；
(iii)一个单位剂量施用于颧大肌；
(iv)一个单位剂量施用于颧小肌；
(v)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；
(vi)一个单位剂量施用于颏肌；
(vii)一个单位剂量施用于颈阔肌；
(viii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；
(ix)一个单位剂量施用于颊肌；
(x)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；
(xi)一个单位剂量施用于降眉间肌；
(xii)一个单位剂量施用于鼻肌；和/或
(xiii)一个单位剂量施用于上睑提肌；
其中单位剂量的修饰的BoNT/A为至少240pg(优选240pg至8000pg)修饰的BoNT/A，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多24000pg修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含A型肉毒神经毒素(BoNT/A)轻链和易位结构域(HN)以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
在一个相关方面，本发明提供了一种治疗受试者典型面肌痉挛的方法，与通过未修饰的BoNT/A(例如，SEQ ID NO：2)治疗相比，其持续时间更长，其中通过在受试者面部的多个部位进行肌内注射来施用修饰的BoNT/A，该方法包含：
a)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
b)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；
c)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的外侧下眼轮匝肌；以及
d)根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于口轮匝肌上肌；
(ii)一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；
(iii)一个单位剂量施用于颧大肌；
(iv)一个单位剂量施用于颧小肌；
(v)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；
(vi)一个单位剂量施用于颏肌；
(vii)一个单位剂量施用于颈阔肌；
(viii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；
(ix)一个单位剂量施用于颊肌；
(x)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；
(xi)一个单位剂量施用于降眉间肌；
(xii)一个单位剂量施用于鼻肌；和/或
(xiii)一个单位剂量施用于上睑提肌；
其中单位剂量的修饰的BoNT/A为至少240pg(优选240pg至8000pg)修饰的BoNT/A，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多24000pg修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含A型肉毒神经毒素(BoNT/A)轻链和易位结构域(HN)以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
一方面，本发明提供了修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)在制备用于治疗受试者典型面肌痉挛的药物中的用途，其中通过在受试者面部的多个部位进行肌内注射来施用修饰的BoNT/A，包含：
a)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
b)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；
c)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的外侧下眼轮匝肌；以及
d)根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于口轮匝肌上肌；
(ii)一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；
(iii)一个单位剂量施用于颧大肌；
(iv)一个单位剂量施用于颧小肌；
(v)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；
(vi)一个单位剂量施用于颏肌；
(vii)一个单位剂量施用于颈阔肌；
(viii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；
(ix)一个单位剂量施用于颊肌；
(x)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；
(xi)一个单位剂量施用于降眉间肌；
(xii)一个单位剂量施用于鼻肌；和/或
(xiii)一个单位剂量施用于上睑提肌；
其中单位剂量的修饰的BoNT/A为至少240pg(优选240pg至8000pg)修饰的BoNT/A，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多24000pg修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含A型肉毒神经毒素(BoNT/A)轻链和易位结构域(HN)以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
一方面，本发明提供了修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)在制备用于治疗受试者典型面肌痉挛的药物中的用途，与通过未修饰的BoNT/A(例如，SEQ ID NO：2)治疗相比，其持续时间更长，其中通过在受试者面部的多个部位进行肌内注射来施用修饰的BoNT/A，包含：
a)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
b)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；
c)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的外侧下眼轮匝肌；以及
d)根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于口轮匝肌上肌；
(ii)一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；
(iii)一个单位剂量施用于颧大肌；
(iv)一个单位剂量施用于颧小肌；
(v)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；
(vi)一个单位剂量施用于颏肌；
(vii)一个单位剂量施用于颈阔肌；
(viii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；
(ix)一个单位剂量施用于颊肌；
(x)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；
(xi)一个单位剂量施用于降眉间肌；
(xii)一个单位剂量施用于鼻肌；和/或
(xiii)一个单位剂量施用于上睑提肌；
其中单位剂量的修饰的BoNT/A为至少240pg(优选240pg至8000pg)修饰的BoNT/A，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多24000pg修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含A型肉毒神经毒素(BoNT/A)轻链和易位结构域(HN)以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
另一方面提供了一种修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)，其用于治疗非典型面肌痉挛的方法中，其中通过在受试者面部的多个部位进行肌内注射来施用修饰的BoNT/A，该方法包含：
a)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的口轮匝肌(例如，将一个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的口轮匝肌上肌和/或将一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；优选将一个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受所述面肌痉挛影响的口轮匝肌上肌并将一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌)；以及
b)任选地，根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于颧大肌；
(ii)一个单位剂量施用于颧大肌；
(iii)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；
(iv)一个单位剂量施用于颏肌；
(v)一个单位剂量施用于颈阔肌；
(vi)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；
(vii)一个单位剂量施用于颊肌；
(viii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；
(ix)一个单位剂量施用于降眉间肌；
(x)一个单位剂量施用于鼻肌；
(xi)一个单位剂量施用于外侧上眼轮匝肌；
(xii)一个单位剂量施用于内侧上眼轮匝肌；
(xiii)一个单位剂量施用于外侧下眼轮匝肌；和/或
(xiv)一个单位剂量施用于上睑提肌；
其中单位剂量的修饰的BoNT/A为至少240pg(优选240pg至8000pg)修饰的BoNT/A，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多24000pg修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含A型肉毒神经毒素(BoNT/A)轻链和易位结构域(HN)以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
在一个相关方面，本发明提供了一种修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)，其用于治疗受试者非典型面肌痉挛的方法中，与通过未修饰的BoNT/A(例如，SEQ ID NO：2)治疗相比，其持续时间更长，其中通过在受试者面部的多个部位肌肉进行注射来施用修饰的BoNT/A，该方法包含：
a)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的口轮匝肌(例如，将一个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的口轮匝肌上肌和/或将一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；优选将一个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受所述面肌痉挛影响的口轮匝肌上肌并将一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌)；以及
b)任选地，根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于颧大肌；
(ii)一个单位剂量施用于颧大肌；
(iii)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；
(iv)一个单位剂量施用于颏肌；
(v)一个单位剂量施用于颈阔肌；
(vi)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；
(vii)一个单位剂量施用于颊肌；
(viii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；
(ix)一个单位剂量施用于降眉间肌；
(x)一个单位剂量施用于鼻肌；
(xi)一个单位剂量施用于外侧上眼轮匝肌；
(xii)一个单位剂量施用于内侧上眼轮匝肌；
(xiii)一个单位剂量施用于外侧下眼轮匝肌；和/或
(xiv)一个单位剂量施用于上睑提肌；
其中单位剂量的修饰的BoNT/A为至少240pg(优选240pg至8000pg)修饰的BoNT/A，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多24000pg修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含A型肉毒神经毒素(BoNT/A)轻链和易位结构域(HN)以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
在一个相关方面，本发明提供了一种治疗受试者非典型面肌痉挛的方法，其中通过在受试者面部的多个部位进行肌内注射来施用修饰的BoNT/A，该方法包含：
a)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的口轮匝肌(例如，将一个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的口轮匝肌上肌和/或将一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；优选将一个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受所述面肌痉挛影响的口轮匝肌上肌并将一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌)；以及
b)任选地，根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于颧大肌；
(ii)一个单位剂量施用于颧大肌；
(iii)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；
(iv)一个单位剂量施用于颏肌；
(v)一个单位剂量施用于颈阔肌；
(vi)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；
(vii)一个单位剂量施用于颊肌；
(viii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；
(ix)一个单位剂量施用于降眉间肌；
(x)一个单位剂量施用于鼻肌；
(xi)一个单位剂量施用于外侧上眼轮匝肌；
(xii)一个单位剂量施用于内侧上眼轮匝肌；
(xiii)一个单位剂量施用于外侧下眼轮匝肌；和/或
(xiv)一个单位剂量施用于上睑提肌；
其中单位剂量的修饰的BoNT/A为至少240pg(优选240pg至8000pg)修饰的BoNT/A，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多24000pg修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含A型肉毒神经毒素(BoNT/A)轻链和易位结构域(HN)以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
在一个相关方面，本发明提供了一种治疗受试者非典型面肌痉挛的方法，与通过未修饰的BoNT/A(例如，SEQ ID NO：2)治疗相比，其持续时间更长，其中通过在受试者面部的多个部位进行肌内注射来施用修饰的BoNT/A，该方法包含：
a)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的口轮匝肌(例如，将一个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的口轮匝肌上肌和/或将一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；优选将一个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受所述面肌痉挛影响的口轮匝肌上肌并将一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌)；以及
b)任选地，根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于颧大肌；
(ii)一个单位剂量施用于颧大肌；
(iii)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；
(iv)一个单位剂量施用于颏肌；
(v)一个单位剂量施用于颈阔肌；
(vi)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；
(vii)一个单位剂量施用于颊肌；
(viii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；
(ix)一个单位剂量施用于降眉间肌；
(x)一个单位剂量施用于鼻肌；
(xi)一个单位剂量施用于外侧上眼轮匝肌；
(xii)一个单位剂量施用于内侧上眼轮匝肌；
(xiii)一个单位剂量施用于外侧下眼轮匝肌；和/或
(xiv)一个单位剂量施用于上睑提肌；
其中单位剂量的修饰的BoNT/A为至少240pg(优选240pg至8000pg)修饰的BoNT/A，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多24000pg修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含A型肉毒神经毒素(BoNT/A)轻链和易位结构域(HN)以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
一方面，本发明提供了修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)在制备用于治疗受试者非典型面肌痉挛的药物中的用途，其中通过在受试者面部的多个部位进行肌内注射来施用修饰的BoNT/A，包含：
a)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的口轮匝肌(例如，将一个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的口轮匝肌上肌和/或将一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；优选将一个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受所述面肌痉挛影响的口轮匝肌上肌并将一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌)；以及
b)任选地，根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于颧大肌；
(ii)一个单位剂量施用于颧大肌；
(iii)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；
(iv)一个单位剂量施用于颏肌；
(v)一个单位剂量施用于颈阔肌；
(vi)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；
(vii)一个单位剂量施用于颊肌；
(viii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；
(ix)一个单位剂量施用于降眉间肌；
(x)一个单位剂量施用于鼻肌；
(xi)一个单位剂量施用于外侧上眼轮匝肌；
(xii)一个单位剂量施用于内侧上眼轮匝肌；
(xiii)一个单位剂量施用于外侧下眼轮匝肌；和/或
(xiv)一个单位剂量施用于上睑提肌；
其中单位剂量的修饰的BoNT/A为至少240pg(优选240pg至8000pg)修饰的BoNT/A，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多24000pg修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含A型肉毒神经毒素(BoNT/A)轻链和易位结构域(HN)以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
一方面，本发明提供了修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)在制备用于治疗受试者非典型面肌痉挛的药物中的用途，与通过未修饰的BoNT/A(例如，SEQ ID NO：2)治疗相比，其持续时间更长，其中通过在受试者面部的多个部位进行肌内注射来施用修饰的BoNT/A，包含：
a)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的口轮匝肌(例如，将一个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的口轮匝肌上肌和/或将一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；优选将一个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受所述面肌痉挛影响的口轮匝肌上肌并将一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌)；以及
b)任选地，根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于颧大肌；
(ii)一个单位剂量施用于颧大肌；
(iii)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；
(iv)一个单位剂量施用于颏肌；
(v)一个单位剂量施用于颈阔肌；
(vi)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；
(vii)一个单位剂量施用于颊肌；
(viii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；
(ix)一个单位剂量施用于降眉间肌；
(x)一个单位剂量施用于鼻肌；
(xi)一个单位剂量施用于外侧上眼轮匝肌；
(xii)一个单位剂量施用于内侧上眼轮匝肌；
(xiii)一个单位剂量施用于外侧下眼轮匝肌；和/或
(xiv)一个单位剂量施用于上睑提肌；
其中单位剂量的修饰的BoNT/A为至少240pg(优选240pg至8000pg)修饰的BoNT/A，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多24000pg修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含A型肉毒神经毒素(BoNT/A)轻链和易位结构域(HN)以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
在本发明全文中，术语“典型面肌痉挛”可以与术语“面肌痉挛”互换使用。
单位剂量可以是至少240.4pg、500pg、1000pg、2000pg、3000pg或4000pg，优选至少1000pg，其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
在一个实施方案中，可以基于治疗期间施用的总剂量以及施用修饰的BoNT/A的肌肉和/或其部位的数量，来确定本发明的单位剂量的上限。例如，如果治疗期间施用的总剂量为至多24000pg修饰的BoNT/A，并且仅施用于受试者第一只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌、第一只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌以及第一只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌，则单位剂量的上限可以是8000pg。如果另外施用于受试者第二只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌、第二只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌以及第二只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌，则上限可以是4000pg(例如，每只眼睛的上限为4000pg)。
单位剂量可以是240pg至10000pg修饰的BoNT/A，其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。单位剂量可以是240pg至9500pg修饰的BoNT/A，其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。单位剂量可以是240pg至9000pg修饰的BoNT/A，其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。优选地，单位剂量可以是240pg至8000pg修饰的BoNT/A，其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。单位剂量范围的上限可以是7500、7000、6500、6000、5500、5000、4800、4500、4000、3500、3000、2500、2400、2000、1500或1250pg修饰的BoNT/A。单位剂量范围的下限可以是300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500或5000pg修饰的BoNT/A，优选下限是1000pg。单位剂量可以是1000pg至4800pg、1000pg至4000pg、1000pg至2400pg、或1000pg至2000pg。单位剂量可以是240.4pg、500pg、1000pg、2000pg、3000pg、4000pg、5000pg、6000pg、7000pg或8000pg，其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。单位剂量可以是240.4pg、500pg、1000pg、2000pg、3000pg或4000pg，其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。优选地，单位剂量可以是1000pg、2000pg、3000pg或4000pg，其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
当实施本发明的治疗方案时，施用的总剂量可以是至多24000pg修饰的BoNT/A，其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。换言之，在给定治疗期施用的修饰的BoNT/A的总量可以是至多24000pg。总剂量可以是至多20000、15000、10000、7500或6000pg。总剂量可以是至少720、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、7500、10000、12500、15000或20000pg。优选地，总剂量可以是至少3000pg修饰的BoNT/A。总剂量可以是720pg至24000pg，优选3000pg至24000pg。
总剂量可以是720、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、7500、10000、12500、15000或20000pg，其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。例如，总剂量可以是6000pg、7500pg、10000pg、15000pg或20000pg，其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
在一个实施方案中，单位剂量可以是1000pg，总剂量可以是6000pg、7500pg、10000pg、15000pg或20000pg，其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。在一个实施方案中，单位剂量可以是2000pg，总剂量可以是6000pg、7500pg、10000pg、15000pg或20000pg，其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。在一个实施方案中，单位剂量可以是3000pg，总剂量可以是6000pg、7500pg、10000pg、15000pg或20000pg，其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。在一个实施方案中，单位剂量可以是4000pg，总剂量可以是6000pg、7500pg、10000pg、15000pg或20000pg，其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
一方面，本发明提供了一种修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)，其用于治疗影响受试者眼睑肌肉的疾病的方法中，该方法包含：
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；以及
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌，
其中单个单位剂量的修饰的BoNT/A为至少10单位(U)修饰的BoNT/A，其中1单位是对应于计算的小鼠半数致死量(LD50)的修饰的BoNT/A的量，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多998U修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
在一个相关方面，本发明提供了一种修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)，其用于治疗影响受试者眼睑肌肉的疾病的方法中，与通过未修饰的BoNT/A(例如，SEQ ID NO：2)治疗相比，其持续时间更长，该方法包含：
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；以及
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌，
其中单个单位剂量的修饰的BoNT/A为至少10单位(U)修饰的BoNT/A，其中1单位是对应于计算的小鼠半数致死量(LD50)的修饰的BoNT/A的量，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多998U修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
一方面，本发明提供了一种治疗影响受试者眼睑肌肉的疾病的方法，该方法包含：
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；以及
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌，
其中单个单位剂量的修饰的BoNT/A为至少10单位(U)修饰的BoNT/A，其中1单位是对应于计算的小鼠半数致死量(LD50)的修饰的BoNT/A的量，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多998U修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
在一个相关方面，本发明提供了一种治疗影响受试者眼睑肌肉的疾病的方法，与通过未修饰的BoNT/A(例如，SEQ ID NO：2)治疗相比，其持续时间更长，该方法包含：
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；以及
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌，
其中单个单位剂量的修饰的BoNT/A为至少10单位(U)修饰的BoNT/A，其中1单位是对应于计算的小鼠半数致死量(LD50)的修饰的BoNT/A的量，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多998U修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
一方面，本发明提供了修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)在制备用于治疗影响受试者眼睑肌肉的疾病的药物中的用途，包含：
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；以及
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌，
其中单个单位剂量的修饰的BoNT/A为至少10单位(U)修饰的BoNT/A，其中1单位是对应于计算的小鼠半数致死量(LD50)的修饰的BoNT/A的量，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多998U修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
在一个相关方面，本发明提供了修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)在制备用于治疗影响受试者眼睑肌肉的疾病的药物中的用途，与通过未修饰的BoNT/A(例如，SEQ ID NO：2)治疗相比，其持续时间更长，包含：
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；以及
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌，
其中单个单位剂量的修饰的BoNT/A为至少10单位(U)修饰的BoNT/A，其中1单位是对应于计算的小鼠半数致死量(LD50)的修饰的BoNT/A的量，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多998U修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
在一个相关方面，本发明提供了一种修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)，其用于治疗受试者眼睑痉挛的方法中，与通过未修饰的BoNT/A(例如，SEQ ID NO：2)治疗相比，其持续时间更长，其中通过在受试者面部的多个部位进行肌内注射来施用修饰的BoNT/A，该方法包含：
a)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
b)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；以及
c)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌，
其中单位剂量的修饰的BoNT/A为至少10单位(U)修饰的BoNT/A，其中1单位是对应于计算的小鼠半数致死量(LD50)的修饰的BoNT/A的量，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多998U修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
在一个相关方面，本发明提供了一种治疗受试者眼睑痉挛的方法，其中通过在受试者面部的多个部位进行肌内注射来施用修饰的BoNT/A，该方法包含：
a)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
b)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；以及
c)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌，
其中单位剂量的修饰的BoNT/A为至少10单位(U)修饰的BoNT/A，其中1单位是对应于计算的小鼠半数致死量(LD50)的修饰的BoNT/A的量，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多998U修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
在一个相关方面，本发明提供了一种治疗受试者眼睑痉挛的方法，与通过未修饰的BoNT/A(例如，SEQ ID NO：2)治疗相比，其持续时间更长，其中通过在受试者面部的多个部位进行肌内注射来施用修饰的BoNT/A，该方法包含：
a)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
b)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；以及
c)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌，
其中单位剂量的修饰的BoNT/A为至少10单位(U)修饰的BoNT/A，其中1单位是对应于计算的小鼠半数致死量(LD50)的修饰的BoNT/A的量，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多998U修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
一方面，本发明提供了修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)在制备用于治疗受试者眼睑痉挛的药物中的用途，包含：
a)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
b)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；以及
c)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌，
其中单位剂量的修饰的BoNT/A为至少10单位(U)修饰的BoNT/A，其中1单位是对应于计算的小鼠半数致死量(LD50)的修饰的BoNT/A的量，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多998U修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
一方面，本发明提供了修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)在制备用于治疗受试者眼睑痉挛的药物中的用途，与通过未修饰的BoNT/A(例如，SEQ ID NO：2)治疗相比，其持续时间更长，包含：
a)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
b)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；以及
c)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌，
其中单位剂量的修饰的BoNT/A为至少10单位(U)修饰的BoNT/A，其中1单位是对应于计算的小鼠半数致死量(LD50)的修饰的BoNT/A的量，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多998U修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
另一方面提供了一种修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)，其用于治疗典型面肌痉挛的方法中，其中通过在受试者面部的多个部位进行肌内注射来施用修饰的BoNT/A，该方法包含：
a)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
b)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；
c)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的外侧下眼轮匝肌；以及
d)根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于口轮匝肌上肌；
(ii)一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；
(iii)一个单位剂量施用于颧大肌；
(iv)一个单位剂量施用于颧小肌；
(v)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；
(vi)一个单位剂量施用于颏肌；
(vii)一个单位剂量施用于颈阔肌；
(viii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；
(ix)一个单位剂量施用于颊肌；
(x)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；
(xi)一个单位剂量施用于降眉间肌；
(xii)一个单位剂量施用于鼻肌；和/或
(xiii)一个单位剂量施用于上睑提肌；
其中单位剂量的修饰的BoNT/A为至少10单位(U)修饰的BoNT/A，其中1单位是对应于计算的小鼠半数致死量(LD50)的修饰的BoNT/A的量，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多998U修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
在一个相关方面，本发明提供了一种修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)，其用于治疗受试者典型面肌痉挛的方法中，与通过未修饰的BoNT/A(例如，SEQ ID NO：2)治疗相比，其持续时间更长，其中通过在受试者面部的多个部位进行肌内注射来施用修饰的BoNT/A，该方法包含：
a)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
b)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；
c)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的外侧下眼轮匝肌；以及
d)根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于口轮匝肌上肌；
(ii)一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；
(iii)一个单位剂量施用于颧大肌；
(iv)一个单位剂量施用于颧小肌；
(v)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；
(vi)一个单位剂量施用于颏肌；
(vii)一个单位剂量施用于颈阔肌；
(viii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；
(ix)一个单位剂量施用于颊肌；
(x)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；
(xi)一个单位剂量施用于降眉间肌；
(xii)一个单位剂量施用于鼻肌；和/或
(xiii)一个单位剂量施用于上睑提肌；
其中单位剂量的修饰的BoNT/A为至少10单位(U)修饰的BoNT/A，其中1单位是对应于计算的小鼠半数致死量(LD50)的修饰的BoNT/A的量，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多998U修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
在一个相关方面，本发明提供了一种治疗受试者典型面肌痉挛的方法，其中通过在受试者面部的多个部位进行肌内注射来施用修饰的BoNT/A，该方法包含：
a)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
b)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；
c)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的外侧下眼轮匝肌；以及
d)根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于口轮匝肌上肌；
(ii)一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；
(iii)一个单位剂量施用于颧大肌；
(iv)一个单位剂量施用于颧小肌；
(v)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；
(vi)一个单位剂量施用于颏肌；
(vii)一个单位剂量施用于颈阔肌；
(viii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；
(ix)一个单位剂量施用于颊肌；
(x)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；
(xi)一个单位剂量施用于降眉间肌；
(xii)一个单位剂量施用于鼻肌；和/或
(xiii)一个单位剂量施用于上睑提肌；
其中单位剂量的修饰的BoNT/A为至少10单位(U)修饰的BoNT/A，其中1单位是对应于计算的小鼠半数致死量(LD50)的修饰的BoNT/A的量，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多998U修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
在一个相关方面，本发明提供了一种用于治疗受试者典型面肌痉挛的方法，与通过未修饰的BoNT/A(例如，SEQ ID NO：2)治疗相比，其持续时间更长，其中通过在受试者面部的多个部位进行肌内注射来施用修饰的BoNT/A，该方法包含：
a)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
b)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；
c)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的外侧下眼轮匝肌；以及
d)根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于口轮匝肌上肌；
(ii)一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；
(iii)一个单位剂量施用于颧大肌；
(iv)一个单位剂量施用于颧小肌；
(v)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；
(vi)一个单位剂量施用于颏肌；
(vii)一个单位剂量施用于颈阔肌；
(viii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；
(ix)一个单位剂量施用于颊肌；
(x)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；
(xi)一个单位剂量施用于降眉间肌；
(xii)一个单位剂量施用于鼻肌；和/或
(xiii)一个单位剂量施用于上睑提肌；
其中单位剂量的修饰的BoNT/A为至少10单位(U)修饰的BoNT/A，其中1单位是对应于计算的小鼠半数致死量(LD50)的修饰的BoNT/A的量，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多998U修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
一方面，本发明提供了修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)在制备用于治疗受试者典型面肌痉挛的药物中的用途，其中通过在受试者面部的多个部位进行肌内注射来施用修饰的BoNT/A，包含：
a)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
b)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；
c)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的外侧下眼轮匝肌；以及
d)根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于口轮匝肌上肌；
(ii)一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；
(iii)一个单位剂量施用于颧大肌；
(iv)一个单位剂量施用于颧小肌；
(v)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；
(vi)一个单位剂量施用于颏肌；
(vii)一个单位剂量施用于颈阔肌；
(viii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；
(ix)一个单位剂量施用于颊肌；
(x)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；
(xi)一个单位剂量施用于降眉间肌；
(xii)一个单位剂量施用于鼻肌；和/或
(xiii)一个单位剂量施用于上睑提肌；
其中单位剂量的修饰的BoNT/A为至少10单位(U)修饰的BoNT/A，其中1单位是对应于计算的小鼠半数致死量(LD50)的修饰的BoNT/A的量，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多998U修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
一方面，本发明提供了修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)在制备用于治疗受试者典型面肌痉挛的药物中的用途，与通过未修饰的BoNT/A(例如，SEQ ID NO：2)治疗相比，其持续时间更长，其中通过在受试者面部的多个部位进行肌内注射来施用修饰的BoNT/A，包含：
a)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
b)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；
c)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的外侧下眼轮匝肌；以及
d)根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于口轮匝肌上肌；
(ii)一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；
(iii)一个单位剂量施用于颧大肌；
(iv)一个单位剂量施用于颧小肌；
(v)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；
(vi)一个单位剂量施用于颏肌；
(vii)一个单位剂量施用于颈阔肌；
(viii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；
(ix)一个单位剂量施用于颊肌；
(x)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；
(xi)一个单位剂量施用于降眉间肌；
(xii)一个单位剂量施用于鼻肌；和/或
(xiii)一个单位剂量施用于上睑提肌；
其中单位剂量的修饰的BoNT/A为至少10单位(U)修饰的BoNT/A，其中1单位是对应于计算的小鼠半数致死量(LD50)的修饰的BoNT/A的量，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多998U修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
另一方面提供了一种修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)，其用于治疗非典型面肌痉挛的方法中，其中通过在受试者面部的多个部位进行肌内注射来施用修饰的BoNT/A，该方法包含：
a)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的口轮匝肌(例如，将一个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的口轮匝肌上肌和/或将一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；优选将一个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受所述面肌痉挛影响的口轮匝肌上肌并将一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌)；以及
b)任选地，根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于颧大肌；
(ii)一个单位剂量施用于颧大肌；
(iii)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；
(iv)一个单位剂量施用于颏肌；
(v)一个单位剂量施用于颈阔肌；
(vi)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；
(vii)一个单位剂量施用于颊肌；
(viii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；
(ix)一个单位剂量施用于降眉间肌；
(x)一个单位剂量施用于鼻肌；
(xi)一个单位剂量施用于外侧上眼轮匝肌；
(xii)一个单位剂量施用于内侧上眼轮匝肌；
(xiii)一个单位剂量施用于外侧下眼轮匝肌；和/或
(xiv)一个单位剂量施用于上睑提肌；
其中单位剂量的修饰的BoNT/A为至少10单位(U)修饰的BoNT/A，其中1单位是对应于计算的小鼠半数致死量(LD50)的修饰的BoNT/A的量，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多998U修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
在一个相关方面，本发明提供了一种修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)，其用于治疗受试者非典型面肌痉挛的方法中，与通过未修饰的BoNT/A(例如，SEQ ID NO：2)治疗相比，其持续时间更长，其中通过在受试者面部的多个部位进行肌内注射来施用修饰的BoNT/A，该方法包含：
a)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的口轮匝肌(例如，将一个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的口轮匝肌上肌和/或将一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；优选将一个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受所述面肌痉挛影响的口轮匝肌上肌并将一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌)；以及
b)任选地，根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于颧大肌；
(ii)一个单位剂量施用于颧大肌；
(iii)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；
(iv)一个单位剂量施用于颏肌；
(v)一个单位剂量施用于颈阔肌；
(vi)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；
(vii)一个单位剂量施用于颊肌；
(viii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；
(ix)一个单位剂量施用于降眉间肌；
(x)一个单位剂量施用于鼻肌；
(xi)一个单位剂量施用于外侧上眼轮匝肌；
(xii)一个单位剂量施用于内侧上眼轮匝肌；
(xiii)一个单位剂量施用于外侧下眼轮匝肌；和/或
(xiv)一个单位剂量施用于上睑提肌；
其中单位剂量的修饰的BoNT/A为至少10单位(U)修饰的BoNT/A，其中1单位是对应于计算的小鼠半数致死量(LD50)的修饰的BoNT/A的量，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多998U修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
在一个相关方面，本发明提供了一种治疗受试者非典型面肌痉挛的方法，其中通过在受试者面部的多个部位进行肌内注射来施用修饰的BoNT/A，该方法包含：
a)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的口轮匝肌(例如，将一个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的口轮匝肌上肌和/或将一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；优选将一个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受所述面肌痉挛影响的口轮匝肌上肌并将一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌)；以及
b)任选地，根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于颧大肌；
(ii)一个单位剂量施用于颧大肌；
(iii)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；
(iv)一个单位剂量施用于颏肌；
(v)一个单位剂量施用于颈阔肌；
(vi)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；
(vii)一个单位剂量施用于颊肌；
(viii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；
(ix)一个单位剂量施用于降眉间肌；
(x)一个单位剂量施用于鼻肌；
(xi)一个单位剂量施用于外侧上眼轮匝肌；
(xii)一个单位剂量施用于内侧上眼轮匝肌；
(xiii)一个单位剂量施用于外侧下眼轮匝肌；和/或
(xiv)一个单位剂量施用于上睑提肌；
其中单位剂量的修饰的BoNT/A为至少10单位(U)修饰的BoNT/A，其中1单位是对应于计算的小鼠半数致死量(LD50)的修饰的BoNT/A的量，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多998U修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
在一个相关方面，本发明提供了一种治疗受试者非典型面肌痉挛的方法，与通过未修饰的BoNT/A(例如，SEQ ID NO：2)治疗相比，其持续时间更长，其中通过在受试者面部的多个部位进行肌内注射来施用修饰的BoNT/A，该方法包含：
a)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的口轮匝肌(例如，将一个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的口轮匝肌上肌和/或将一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；优选将一个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受所述面肌痉挛影响的口轮匝肌上肌并将一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌)；以及
b)任选地，根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于颧大肌；
(ii)一个单位剂量施用于颧大肌；
(iii)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；
(iv)一个单位剂量施用于颏肌；
(v)一个单位剂量施用于颈阔肌；
(vi)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；
(vii)一个单位剂量施用于颊肌；
(viii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；
(ix)一个单位剂量施用于降眉间肌；
(x)一个单位剂量施用于鼻肌；
(xi)一个单位剂量施用于外侧上眼轮匝肌；
(xii)一个单位剂量施用于内侧上眼轮匝肌；
(xiii)一个单位剂量施用于外侧下眼轮匝肌；和/或
(xiv)一个单位剂量施用于上睑提肌；
其中单位剂量的修饰的BoNT/A为至少10单位(U)修饰的BoNT/A，其中1单位是对应于计算的小鼠半数致死量(LD50)的修饰的BoNT/A的量，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多998U修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
一方面，本发明提供了修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)在制备用于治疗受试者非典型面肌痉挛的药物中的用途，其中通过在受试者面部的多个部位进行肌内注射来施用修饰的BoNT/A，包含：
a)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的口轮匝肌(例如，将一个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的口轮匝肌上肌和/或将一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；优选将一个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受所述面肌痉挛影响的口轮匝肌上肌并将一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌)；以及
b)任选地，根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于颧大肌；
(ii)一个单位剂量施用于颧大肌；
(iii)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；
(iv)一个单位剂量施用于颏肌；
(v)一个单位剂量施用于颈阔肌；
(vi)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；
(vii)一个单位剂量施用于颊肌；
(viii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；
(ix)一个单位剂量施用于降眉间肌；
(x)一个单位剂量施用于鼻肌；
(xi)一个单位剂量施用于外侧上眼轮匝肌；
(xii)一个单位剂量施用于内侧上眼轮匝肌；
(xiii)一个单位剂量施用于外侧下眼轮匝肌；和/或
(xiv)一个单位剂量施用于上睑提肌；
其中单位剂量的修饰的BoNT/A为至少10单位(U)修饰的BoNT/A，其中1单位是对应于计算的小鼠半数致死量(LD50)的修饰的BoNT/A的量，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多998U修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
一方面，本发明提供了修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)在制备用于治疗受试者非典型面肌痉挛的药物中的用途，与通过未修饰的BoNT/A(例如，SEQ ID NO：2)治疗相比，其持续时间更长，其中通过在受试者面部的多个部位进行肌内注射来施用修饰的BoNT/A，包含：
a)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的口轮匝肌(例如，将一个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的口轮匝肌上肌和/或将一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；优选将一个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受所述面肌痉挛影响的口轮匝肌上肌并将一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌)；以及
b)任选地，根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于颧大肌；
(ii)一个单位剂量施用于颧大肌；
(iii)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；
(iv)一个单位剂量施用于颏肌；
(v)一个单位剂量施用于颈阔肌；
(vi)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；
(vii)一个单位剂量施用于颊肌；
(viii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；
(ix)一个单位剂量施用于降眉间肌；
(x)一个单位剂量施用于鼻肌；
(xi)一个单位剂量施用于外侧上眼轮匝肌；
(xii)一个单位剂量施用于内侧上眼轮匝肌；
(xiii)一个单位剂量施用于外侧下眼轮匝肌；和/或
(xiv)一个单位剂量施用于上睑提肌；
其中单位剂量的修饰的BoNT/A为至少10单位(U)修饰的BoNT/A，其中1单位是对应于计算的小鼠半数致死量(LD50)的修饰的BoNT/A的量，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多998U修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
单位剂量可以是至少21U、42U、83U、125U或166U，优选至少42U，其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
单位剂量可以是10U至332.7U修饰的BoNT/A，其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。单位剂量范围的上限可以是312、291、270、250、229、208、199.6、187、166.3、146、125、104、99.8、89.17、62或52U修饰的BoNT/A。单位剂量范围的下限可以是12、17、21、25、29、33、37、42、62、83、104、125、146、166、187或208U修饰的BoNT/A，优选下限是42U。单位剂量可以是42U至199.6U、42U至166.3U、42U至99.8U、或42U至83.17U。
单位剂量可以是10单位、20.8单位、41.6单位、83.2单位、124.8单位、166.4单位、207.8单位、249.6单位、291.2单位或332.8单位，其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。单位剂量可以是10单位、20.8单位、41.6单位、83.2单位、124.8单位或166.4单位，其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。优选地，单位剂量可以是41.6单位、83.2单位、124.8单位或166.4单位，其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
当实施本发明的治疗方案时，施用的总剂量可以是至多998U修饰的BoNT/A，其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。换言之，在给定治疗期施用的修饰的BoNT/A的总量可以是至多998U。总剂量可以是至多832、624、416、312或250U。总剂量可以是至少30、33、37、42、83、125、166、208、312、416、520、624或832U。优选地，总剂量可以是至少125U修饰的BoNT/A。总剂量可以是30U至998U，优选125U至998U。
总剂量可以是29.9U、33.3U、37.4U、41.6U、83.2U、124.8U、166.4U、208U、312U、416U、520U、624U或831.9U，其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。例如，总剂量可以是249.6U、312U、416U、624U或831.9U，其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
在一个实施方案中，单位剂量可以是41.6U并且总剂量可以是249.6单位、312单位、416单位、624单位或831.9单位，其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
在一个实施方案中，单位剂量可以是83.2单位并且总剂量可以是249.6单位、312单位、416单位、624单位或831.9单位，其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
在一个实施方案中，单位剂量可以是124.8单位并且总剂量可以是249.6单位、312单位、416单位、624单位或831.9单位，其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
在一个实施方案中，单位剂量可以是166.4单位并且总剂量可以是249.6单位、312单位、416单位、624单位或831.9单位，其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
一方面，本发明提供了一种修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)，其用于治疗影响受试者眼睑肌肉的疾病的方法中，该方法包含：
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；以及
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌，
其中单个单位剂量的修饰的BoNT/A为至少84pg修饰的BoNT/A，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多2000pg修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，其中修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(ii)用不带电的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代不带电的表面暴露的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；以及
(v)缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。
在一个相关方面，本发明提供了一种修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)，其用于治疗影响受试者眼睑肌肉的疾病的方法中，与通过未修饰的BoNT/A(例如，SEQ ID NO：2)治疗相比，其持续时间更长，该方法包含：
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；以及
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌，
其中单个单位剂量的修饰的BoNT/A为至少84pg(优选84pg至666.7pg)修饰的BoNT/A，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多2000pg修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，其中修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(ii)用不带电的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代不带电的表面暴露的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；以及
(v)缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。
一方面，本发明提供了一种治疗影响受试者眼睑肌肉的疾病的方法，该方法包含：
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；以及
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌，
其中单个单位剂量的修饰的BoNT/A为至少84pg修饰的BoNT/A，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多2000pg修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，其中修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(ii)用不带电的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代不带电的表面暴露的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；以及
(v)缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。
在一个相关方面，本发明提供了一种治疗影响受试者眼睑肌肉的疾病的方法，与通过未修饰的BoNT/A(例如，SEQ ID NO：2)治疗相比，其持续时间更长，该方法包含：
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；以及
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌，
其中单个单位剂量的修饰的BoNT/A为至少84pg修饰的BoNT/A，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多2000pg修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，其中修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(ii)用不带电的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代不带电的表面暴露的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；以及
(v)缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。
一方面，本发明提供了修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)在制备用于治疗影响受试者眼睑肌肉的疾病的药物中的用途，包含：
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；以及
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌，
其中单个单位剂量的修饰的BoNT/A为至少84pg修饰的BoNT/A，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多2000pg修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，其中修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(ii)用不带电的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代不带电的表面暴露的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；以及
(v)缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。
在一个相关方面，本发明提供了修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)在制备用于治疗影响受试者眼睑肌肉的疾病的药物中的用途，与通过未修饰的BoNT/A(例如，SEQ ID NO：2)治疗相比，其持续时间更长，包含：
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；以及
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌，
其中单个单位剂量的修饰的BoNT/A为至少84pg修饰的BoNT/A，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多2000pg修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，其中修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(ii)用不带电的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代不带电的表面暴露的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；以及
(v)缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。
一方面提供了一种修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)，其用于治疗受试者眼睑痉挛的方法中，其中通过在受试者面部的多个部位进行肌内注射来施用修饰的BoNT/A，该方法包含：
a)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
b)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；以及
c)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌，
其中单位剂量的修饰的BoNT/A为至少84pg修饰的BoNT/A，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多2000pg修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，其中修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(ii)用不带电的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代不带电的表面暴露的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；以及
(v)缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。
在一个相关方面，本发明提供了一种修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)，其用于治疗受试者眼睑痉挛的方法中，与通过未修饰的BoNT/A(例如，SEQ ID NO：2)治疗相比，其持续时间更长，其中通过在受试者面部的多个部位进行肌内注射来施用修饰的BoNT/A，该方法包含：
a)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
b)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；以及
c)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌，
其中单位剂量的修饰的BoNT/A为至少84pg修饰的BoNT/A，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多2000pg修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，其中修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(ii)用不带电的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代不带电的表面暴露的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；以及
(v)缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。
在一个相关方面，本发明提供了一种治疗受试者眼睑痉挛的方法，其中通过在受试者面部的多个部位进行肌内注射来施用修饰的BoNT/A，该方法包含：
a)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
b)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；以及
c)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌，
其中单位剂量的修饰的BoNT/A为至少84pg修饰的BoNT/A，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多2000pg修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，其中修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(ii)用不带电的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代不带电的表面暴露的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；以及
(v)缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。
在一个相关方面，本发明提供了一种治疗受试者眼睑痉挛的方法，与通过未修饰的BoNT/A(例如，SEQ ID NO：2)治疗相比，其持续时间更长，其中通过在受试者面部的多个部位进行肌内注射来施用修饰的BoNT/A，该方法包含：
a)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
b)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；以及
c)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌，
其中单位剂量的修饰的BoNT/A为至少84pg修饰的BoNT/A，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多2000pg修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，其中修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(ii)用不带电的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代不带电的表面暴露的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；以及
(v)缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。
一方面，本发明提供了修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)在制备用于治疗受试者眼睑痉挛的药物中的用途，包含：
a)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
b)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；以及
c)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌，
其中单位剂量的修饰的BoNT/A为至少84pg修饰的BoNT/A，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多2000pg修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，其中修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(ii)用不带电的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代不带电的表面暴露的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；以及
(v)缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。
一方面，本发明提供了修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)在制备用于治疗受试者眼睑痉挛的药物中的用途，与通过未修饰的BoNT/A(例如，SEQ ID NO：2)治疗相比，其持续时间更长，包含：
a)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
b)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；以及
c)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌，
其中单位剂量的修饰的BoNT/A为至少84pg修饰的BoNT/A，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多2000pg修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，其中修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(ii)用不带电的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代不带电的表面暴露的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；以及
(v)缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。
另一方面提供了一种修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)，其用于治疗典型面肌痉挛的方法中，其中通过在受试者面部的多个部位进行肌内注射来施用修饰的BoNT/A，该方法包含：
a)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
b)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；
c)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的外侧下眼轮匝肌；以及
d)根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于口轮匝肌上肌；
(ii)一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；
(iii)一个单位剂量施用于颧大肌；
(iv)一个单位剂量施用于颧小肌；
(v)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；
(vi)一个单位剂量施用于颏肌；
(vii)一个单位剂量施用于颈阔肌；
(viii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；
(ix)一个单位剂量施用于颊肌；
(x)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；
(xi)一个单位剂量施用于降眉间肌；
(xii)一个单位剂量施用于鼻肌；和/或
(xiii)一个单位剂量施用于上睑提肌；
其中单位剂量的修饰的BoNT/A为至少84pg修饰的BoNT/A，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多2000pg修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，其中修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(ii)用不带电的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代不带电的表面暴露的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；以及
(v)缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。
在一个相关方面，本发明提供了一种修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)，其用于治疗受试者典型面肌痉挛的方法中，与通过未修饰的BoNT/A(例如，SEQ ID NO：2)治疗相比，其持续时间更长，其中通过在受试者面部的多个部位进行肌内注射来施用修饰的BoNT/A，该方法包含：
a)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
b)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；
c)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的外侧下眼轮匝肌；以及
d)根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于口轮匝肌上肌；
(ii)一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；
(iii)一个单位剂量施用于颧大肌；
(iv)一个单位剂量施用于颧小肌；
(v)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；
(vi)一个单位剂量施用于颏肌；
(vii)一个单位剂量施用于颈阔肌；
(viii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；
(ix)一个单位剂量施用于颊肌；
(x)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；
(xi)一个单位剂量施用于降眉间肌；
(xii)一个单位剂量施用于鼻肌；和/或
(xiii)一个单位剂量施用于上睑提肌；
其中单位剂量的修饰的BoNT/A为至少84pg修饰的BoNT/A，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多2000pg修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，其中修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(ii)用不带电的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代不带电的表面暴露的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；以及
(v)缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。
在一个相关方面，本发明提供了一种治疗受试者典型面肌痉挛的方法，其中通过在受试者面部的多个部位进行肌内注射来施用修饰的BoNT/A，该方法包含：
a)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
b)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；
c)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的外侧下眼轮匝肌；以及
d)根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于口轮匝肌上肌；
(ii)一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；
(iii)一个单位剂量施用于颧大肌；
(iv)一个单位剂量施用于颧小肌；
(v)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；
(vi)一个单位剂量施用于颏肌；
(vii)一个单位剂量施用于颈阔肌；
(viii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；
(ix)一个单位剂量施用于颊肌；
(x)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；
(xi)一个单位剂量施用于降眉间肌；
(xii)一个单位剂量施用于鼻肌；和/或
(xiii)一个单位剂量施用于上睑提肌；
其中单位剂量的修饰的BoNT/A为至少84pg修饰的BoNT/A，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多2000pg修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，其中修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(ii)用不带电的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代不带电的表面暴露的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；以及
(v)缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。
在一个相关方面，本发明提供了一种治疗受试者典型面肌痉挛的方法，与通过未修饰的BoNT/A(例如，SEQ ID NO：2)治疗相比，其持续时间更长，其中通过在受试者面部的多个部位进行肌内注射施用修饰的BoNT/A，该方法包含：
a)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
b)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；
c)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的外侧下眼轮匝肌；以及
d)根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于口轮匝肌上肌；
(ii)一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；
(iii)一个单位剂量施用于颧大肌；
(iv)一个单位剂量施用于颧小肌；
(v)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；
(vi)一个单位剂量施用于颏肌；
(vii)一个单位剂量施用于颈阔肌；
(viii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；
(ix)一个单位剂量施用于颊肌；
(x)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；
(xi)一个单位剂量施用于降眉间肌；
(xii)一个单位剂量施用于鼻肌；和/或
(xiii)一个单位剂量施用于上睑提肌；
其中单位剂量的修饰的BoNT/A为至少84pg修饰的BoNT/A，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多2000pg修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，其中修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(ii)用不带电的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代不带电的表面暴露的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；以及
(v)缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。
一方面，本发明提供了修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)在制备用于治疗受试者典型面肌痉挛的药物中的用途，其中通过在受试者面部的多个部位进行肌内注射来施用修饰的BoNT/A，包含：
a)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
b)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；
c)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的外侧下眼轮匝肌；以及
d)根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于口轮匝肌上肌；
(ii)一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；
(iii)一个单位剂量施用于颧大肌；
(iv)一个单位剂量施用于颧小肌；
(v)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；
(vi)一个单位剂量施用于颏肌；
(vii)一个单位剂量施用于颈阔肌；
(viii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；
(ix)一个单位剂量施用于颊肌；
(x)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；
(xi)一个单位剂量施用于降眉间肌；
(xii)一个单位剂量施用于鼻肌；和/或
(xiii)一个单位剂量施用于上睑提肌；
其中单位剂量的修饰的BoNT/A为至少84pg修饰的BoNT/A，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多2000pg修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，其中修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(ii)用不带电的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代不带电的表面暴露的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；以及
(v)缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。
一方面，本发明提供了修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)在制备用于治疗受试者典型面肌痉挛的药物中的用途，与通过未修饰的BoNT/A(例如，SEQ ID NO：2)治疗相比，其持续时间更长，其中通过在受试者面部的多个部位进行肌内注射来施用修饰的BoNT/A，包含：
a)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
b)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；
c)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的外侧下眼轮匝肌；以及
d)根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于口轮匝肌上肌；
(ii)一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；
(iii)一个单位剂量施用于颧大肌；
(iv)一个单位剂量施用于颧小肌；
(v)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；
(vi)一个单位剂量施用于颏肌；
(vii)一个单位剂量施用于颈阔肌；
(viii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；
(ix)一个单位剂量施用于颊肌；
(x)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；
(xi)一个单位剂量施用于降眉间肌；
(xii)一个单位剂量施用于鼻肌；和/或
(xiii)一个单位剂量施用于上睑提肌；
其中单位剂量的修饰的BoNT/A为至少84pg修饰的BoNT/A，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多2000pg修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，其中修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(ii)用不带电的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代不带电的表面暴露的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；以及
(v)缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。
另一方面提供了一种修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)，其用于治疗非典型面肌痉挛的方法中，其中通过在受试者面部的多个部位进行肌内注射来施用修饰的BoNT/A，该方法包含：
a)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的口轮匝肌(例如，将一个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的口轮匝肌上肌和/或将一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；优选将一个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受所述面肌痉挛影响的口轮匝肌上肌并将一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌)；以及
b)任选地，根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于颧大肌；
(ii)一个单位剂量施用于颧大肌；
(iii)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；
(iv)一个单位剂量施用于颏肌；
(v)一个单位剂量施用于颈阔肌；
(vi)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；
(vii)一个单位剂量施用于颊肌；
(viii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；
(ix)一个单位剂量施用于降眉间肌；
(x)一个单位剂量施用于鼻肌；
(xi)一个单位剂量施用于外侧上眼轮匝肌；
(xii)一个单位剂量施用于内侧上眼轮匝肌；
(xiii)一个单位剂量施用于外侧下眼轮匝肌；和/或
(xiv)一个单位剂量施用于上睑提肌；
其中单位剂量的修饰的BoNT/A为至少84pg修饰的BoNT/A，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多2000pg修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，其中修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(ii)用不带电的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代不带电的表面暴露的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；以及
(v)缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。
在一个相关方面，本发明提供了一种修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)，其用于治疗受试者非典型面肌痉挛的方法中，与通过未修饰的BoNT/A(例如，SEQ ID NO：2)治疗相比，其持续时间更长，其中通过在受试者面部的多个部位进行肌内注射来施用修饰的BoNT/A，该方法包含：
a)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的口轮匝肌(例如，将一个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的口轮匝肌上肌和/或将一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；优选将一个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受所述面肌痉挛影响的口轮匝肌上肌并将一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌)；以及
b)任选地，根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于颧大肌；
(ii)一个单位剂量施用于颧大肌；
(iii)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；
(iv)一个单位剂量施用于颏肌；
(v)一个单位剂量施用于颈阔肌；
(vi)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；
(vii)一个单位剂量施用于颊肌；
(viii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；
(ix)一个单位剂量施用于降眉间肌；
(x)一个单位剂量施用于鼻肌；
(xi)一个单位剂量施用于外侧上眼轮匝肌；
(xii)一个单位剂量施用于内侧上眼轮匝肌；
(xiii)一个单位剂量施用于外侧下眼轮匝肌；和/或
(xiv)一个单位剂量施用于上睑提肌；
其中单位剂量的修饰的BoNT/A为至少84pg修饰的BoNT/A，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多2000pg修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，其中修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(ii)用不带电的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代不带电的表面暴露的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；以及
(v)缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。
在一个相关方面，本发明提供了一种治疗受试者非典型面肌痉挛的方法，其中通过在受试者面部的多个部位进行肌内注射来施用修饰的BoNT/A，该方法包含：
a)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的口轮匝肌(例如，将一个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的口轮匝肌上肌和/或将一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；优选将一个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受所述面肌痉挛影响的口轮匝肌上肌并将一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌)；以及
b)任选地，根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于颧大肌；
(ii)一个单位剂量施用于颧大肌；
(iii)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；
(iv)一个单位剂量施用于颏肌；
(v)一个单位剂量施用于颈阔肌；
(vi)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；
(vii)一个单位剂量施用于颊肌；
(viii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；
(ix)一个单位剂量施用于降眉间肌；
(x)一个单位剂量施用于鼻肌；
(xi)一个单位剂量施用于外侧上眼轮匝肌；
(xii)一个单位剂量施用于内侧上眼轮匝肌；
(xiii)一个单位剂量施用于外侧下眼轮匝肌；和/或
(xiv)一个单位剂量施用于上睑提肌；
其中单位剂量的修饰的BoNT/A为至少84pg修饰的BoNT/A，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多2000pg修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，其中修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(ii)用不带电的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代不带电的表面暴露的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；以及
(v)缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。
在一个相关方面，本发明提供了一种治疗受试者非典型面肌痉挛的方法，与通过未修饰的BoNT/A(例如，SEQ ID NO：2)治疗相比，其持续时间更长，其中通过在受试者面部的多个部位进行肌内注射来施用修饰的BoNT/A，该方法包含：
a)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的口轮匝肌(例如，将一个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的口轮匝肌上肌和/或将一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；优选将一个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受所述面肌痉挛影响的口轮匝肌上肌并将一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌)；以及
b)任选地，根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于颧大肌；
(ii)一个单位剂量施用于颧大肌；
(iii)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；
(iv)一个单位剂量施用于颏肌；
(v)一个单位剂量施用于颈阔肌；
(vi)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；
(vii)一个单位剂量施用于颊肌；
(viii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；
(ix)一个单位剂量施用于降眉间肌；
(x)一个单位剂量施用于鼻肌；
(xi)一个单位剂量施用于外侧上眼轮匝肌；
(xii)一个单位剂量施用于内侧上眼轮匝肌；
(xiii)一个单位剂量施用于外侧下眼轮匝肌；和/或
(xiv)一个单位剂量施用于上睑提肌；
其中单位剂量的修饰的BoNT/A为至少84pg修饰的BoNT/A，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多2000pg修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，其中修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(ii)用不带电的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代不带电的表面暴露的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；以及
(v)缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。
一方面，本发明提供了修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)在制备用于治疗受试者非典型面肌痉挛的药物中的用途，其中通过在受试者面部的多个部位进行肌内注射来施用修饰的BoNT/A，包含：
a)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的口轮匝肌(例如，将一个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的口轮匝肌上肌和/或将一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；优选将一个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受所述面肌痉挛影响的口轮匝肌上肌并将一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌)；以及
b)任选地，根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于颧大肌；
(ii)一个单位剂量施用于颧大肌；
(iii)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；
(iv)一个单位剂量施用于颏肌；
(v)一个单位剂量施用于颈阔肌；
(vi)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；
(vii)一个单位剂量施用于颊肌；
(viii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；
(ix)一个单位剂量施用于降眉间肌；
(x)一个单位剂量施用于鼻肌；
(xi)一个单位剂量施用于外侧上眼轮匝肌；
(xii)一个单位剂量施用于内侧上眼轮匝肌；
(xiii)一个单位剂量施用于外侧下眼轮匝肌；和/或
(xiv)一个单位剂量施用于上睑提肌；
其中单位剂量的修饰的BoNT/A为至少84pg修饰的BoNT/A，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多2000pg修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，其中修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(ii)用不带电的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代不带电的表面暴露的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；以及
(v)缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。
一方面，本发明提供了修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)在制备用于治疗受试者非典型面肌痉挛的药物中的用途，与通过未修饰的BoNT/A(例如，SEQ ID NO：2)治疗相比，其持续时间更长，其中通过在受试者面部的多个部位进行肌内注射来施用修饰的BoNT/A，包含：
a)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的口轮匝肌(例如，将一个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的口轮匝肌上肌和/或将一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；优选将一个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受所述面肌痉挛影响的口轮匝肌上肌并将一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌)；以及
b)任选地，根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于颧大肌；
(ii)一个单位剂量施用于颧大肌；
(iii)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；
(iv)一个单位剂量施用于颏肌；
(v)一个单位剂量施用于颈阔肌；
(vi)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；
(vii)一个单位剂量施用于颊肌；
(viii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；
(ix)一个单位剂量施用于降眉间肌；
(x)一个单位剂量施用于鼻肌；
(xi)一个单位剂量施用于外侧上眼轮匝肌；
(xii)一个单位剂量施用于内侧上眼轮匝肌；
(xiii)一个单位剂量施用于外侧下眼轮匝肌；和/或
(xiv)一个单位剂量施用于上睑提肌；
其中单位剂量的修饰的BoNT/A为至少84pg修饰的BoNT/A，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多2000pg修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，其中修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(ii)用不带电的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代不带电的表面暴露的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；以及
(v)缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。
单位剂量可以是至少84.4pg、100pg或250pg，其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN
1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，其中修饰选自：(i)用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；(ii)用不带电的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；(iii)用碱性氨基酸残基取代不带电的表面暴露的氨基酸残基；(iv)插入碱性氨基酸残基；以及(v)缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。
单位剂量可以是84pg至666.7pg修饰的BoNT/A，其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER1274和THR 1277，其中修饰选自：(i)用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；(ii)用不带电的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；(iii)用碱性氨基酸残基取代不带电的表面暴露的氨基酸残基；(iv)插入碱性氨基酸残基；以及(v)缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。单位剂量范围的上限可以是650、600、550、500、450、400、350、333.3、300、250、200、166.7、150或100pg修饰的BoNT/A。单位剂量范围的下限可以是100、125、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600或650pg修饰的BoNT/A。单位剂量可以是100pg至400pg、100pg至333.3pg、100pg至200pg、或100pg至166.7pg。
单位剂量可以是大于300pg或大于500pg修饰的BoNT/A，其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS 1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN1243、SER 1274和THR 1277，其中修饰选自：(i)用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；(ii)用不带电的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；(iii)用碱性氨基酸残基取代不带电的表面暴露的氨基酸残基；(iv)插入碱性氨基酸残基；以及(v)缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。例如，单位剂量可以是大于300pg且至多666.7pg修饰的BoNT/A，例如大于500pg且至多666.7pg修饰的BoNT/A。
当实施本发明的治疗方案时，施用的总剂量可以是至多2000pg修饰的BoNT/A，其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，其中修饰选自：(i)用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；(ii)用不带电的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；(iii)用碱性氨基酸残基取代不带电的表面暴露的氨基酸残基；(iv)插入碱性氨基酸残基；以及(v)缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。换言之，在给定治疗期内施用的修饰的BoNT/A的总量可以是至多2000pg。总剂量可以至多1750、1500、1000、750、500或300pg，优选至多1500pg。总剂量可以是至少252、300、350、400、500、600、700、800、900、1000或1250pg。总剂量可以是252pg至2000pg，优选300pg至1500pg。
总剂量可以是大于500pg、或大于750pg、或大于1000pg修饰的BoNT/A，其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，其中修饰选自：(i)用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；(ii)用不带电的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；(iii)用碱性氨基酸残基取代不带电的表面暴露的氨基酸残基；(iv)插入碱性氨基酸残基；以及(v)缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。
总剂量可以是大于500pg且至多2000pg修饰的BoNT/A，其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS 1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN1243、SER 1274和THR 1277，其中修饰选自：(i)用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；(ii)用不带电的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；(iii)用碱性氨基酸残基取代不带电的表面暴露的氨基酸残基；(iv)插入碱性氨基酸残基；以及(v)缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。例如，总剂量可以是大于750pg(优选大于1000pg)且至多2000pg修饰的BoNT/A。
一方面，本发明提供了一种修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)，其用于治疗影响受试者眼睑肌肉的疾病的方法中，该方法包含：
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；以及
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌，
其中单个单位剂量的修饰的BoNT/A为至少10U修饰的BoNT/A，其中1单位是对应于计算的小鼠半数致死量(LD50)的修饰的BoNT/A的量，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多237U修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，其中修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(ii)用不带电的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代不带电的表面暴露的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；以及
(v)缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。
在一个相关方面，本发明提供了一种修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)，其用于治疗影响受试者眼睑肌肉的疾病的方法中，与通过未修饰的BoNT/A(例如，SEQ ID NO：2)治疗相比，其持续时间更长，该方法包含：
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；以及
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌，
其中单个单位剂量的修饰的BoNT/A为至少10U修饰的BoNT/A，其中1单位是对应于计算的小鼠半数致死量(LD50)的修饰的BoNT/A的量，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多237U修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，其中修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(ii)用不带电的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代不带电的表面暴露的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；以及
(v)缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。
在一个相关方面，本发明提供了一种治疗影响受试者眼睑肌肉的疾病的方法，该方法包含：
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；以及
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌，
其中单个单位剂量的修饰的BoNT/A为至少10U修饰的BoNT/A，其中1单位是对应于计算的小鼠半数致死量(LD50)的修饰的BoNT/A的量，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多237U修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，其中修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(ii)用不带电的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代不带电的表面暴露的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；以及
(v)缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。
在一个相关方面，本发明提供了一种治疗影响受试者眼睑肌肉的疾病的方法，与通过未修饰的BoNT/A(例如，SEQ ID NO：2)治疗相比，其持续时间更长，该方法包含：
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；以及
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌，
其中单个单位剂量的修饰的BoNT/A为至少10U修饰的BoNT/A，其中1单位是对应于计算的小鼠半数致死量(LD50)的修饰的BoNT/A的量，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多237U修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，其中修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(ii)用不带电的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代不带电的表面暴露的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；以及
(v)缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。
在另一个相关方面，本发明提供了修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)在制备用于治疗影响受试者眼睑肌肉的疾病的药物中的用途，包含：
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；以及
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌，
其中单个单位剂量的修饰的BoNT/A为至少10U修饰的BoNT/A，其中1单位是对应于计算的小鼠半数致死量(LD50)的修饰的BoNT/A的量，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多237U修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，其中修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(ii)用不带电的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代不带电的表面暴露的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；以及
(v)缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。
在一个相关方面，本发明提供了修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)在制备用于治疗影响受试者眼睑肌肉的疾病的药物中的用途，与通过未修饰的BoNT/A(例如，SEQ ID NO：2)治疗相比，其持续时间更长，包含：
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；以及
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌，
其中单个单位剂量的修饰的BoNT/A为至少10U修饰的BoNT/A，其中1单位是对应于计算的小鼠半数致死量(LD50)的修饰的BoNT/A的量，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多237U修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，其中修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(ii)用不带电的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代不带电的表面暴露的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；以及
(v)缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。
一方面提供了一种修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)，其用于治疗受试者眼睑痉挛的方法中，其中通过在受试者面部的多个部位进行肌内注射来使用修饰的BoNT/A，该方法包含：
a)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
b)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；以及
c)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌，
其中单位剂量的修饰的BoNT/A为至少10U修饰的BoNT/A，其中1单位是对应于计算的小鼠半数致死量(LD50)的修饰的BoNT/A的量，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多237U修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，其中修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(ii)用不带电的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代不带电的表面暴露的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；以及
(v)缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。
在一个相关方面，本发明提供了一种修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)，其用于治疗受试者眼睑痉挛的方法中，与通过未修饰的BoNT/A(例如，SEQ ID NO：2)治疗相比，其持续时间更长，其中通过在受试者面部的多个部位进行肌内注射来施用修饰的BoNT/A，该方法包含：
a)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
b)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；以及
c)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌，
其中单位剂量的修饰的BoNT/A为至少10U修饰的BoNT/A，其中1单位是对应于计算的小鼠半数致死量(LD50)的修饰的BoNT/A的量，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多237U修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，其中修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(ii)用不带电的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代不带电的表面暴露的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；以及
(v)缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。
在一个相关方面，本发明提供了一种治疗受试者眼睑痉挛的方法，其中通过在受试者面部的多个部位进行肌内注射来施用修饰的BoNT/A，该方法包含：
a)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
b)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；以及
c)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌，
其中单位剂量的修饰的BoNT/A为至少10U修饰的BoNT/A，其中1单位是对应于计算的小鼠半数致死量(LD50)的修饰的BoNT/A的量，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多237U修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，其中修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(ii)用不带电的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代不带电的表面暴露的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；以及
(v)缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。
在一个相关方面，本发明提供了一种治疗受试者眼睑痉挛的方法，与通过未修饰的BoNT/A(例如，SEQ ID NO：2)治疗相比，其持续时间更长，其中通过在受试者面部的多个部位进行肌内注射来施用修饰的BoNT/A，该方法包含：
a)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
b)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；以及
c)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌，
其中单位剂量的修饰的BoNT/A为至少10U修饰的BoNT/A，其中1单位是对应于计算的小鼠半数致死量(LD50)的修饰的BoNT/A的量，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多237U修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，其中修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(ii)用不带电的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代不带电的表面暴露的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；以及
(v)缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。
一方面，本发明提供了修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)在制备用于治疗受试者眼睑痉挛的药物中的用途，包含：
a)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
b)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；以及
c)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌，
其中单位剂量的修饰的BoNT/A为至少10U修饰的BoNT/A，其中1单位是对应于计算的小鼠半数致死量(LD50)的修饰的BoNT/A的量，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多237U修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，其中修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(ii)用不带电的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代不带电的表面暴露的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；以及
(v)缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。
一方面，本发明提供了修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)在制备用于治疗受试者眼睑痉挛的药物中的用途，与通过未修饰的BoNT/A(例如，SEQ ID NO：2)治疗相比，其持续时间更长，包含：
a)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
b)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；以及
c)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌，
其中单位剂量的修饰的BoNT/A为至少10U修饰的BoNT/A，其中1单位是对应于计算的小鼠半数致死量(LD50)的修饰的BoNT/A的量，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多237U修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，其中修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(ii)用不带电的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代不带电的表面暴露的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；以及
(v)缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。
另一方面提供了一种修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)，其用于治疗典型面肌痉挛的方法中，其中通过在受试者面部的多个部位进行肌内注射来施用修饰的BoNT/A，该方法包含：
a)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
b)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；
c)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的外侧下眼轮匝肌；以及
d)根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于口轮匝肌上肌；
(ii)一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；
(iii)一个单位剂量施用于颧大肌；
(iv)一个单位剂量施用于颧小肌；
(v)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；
(vi)一个单位剂量施用于颏肌；
(vii)一个单位剂量施用于颈阔肌；
(viii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；
(ix)一个单位剂量施用于颊肌；
(x)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；
(xi)一个单位剂量施用于降眉间肌；
(xii)一个单位剂量施用于鼻肌；和/或
(xiii)一个单位剂量施用于上睑提肌；
其中单位剂量的修饰的BoNT/A为至少10U修饰的BoNT/A，其中1单位是对应于计算的小鼠半数致死量(LD50)的修饰的BoNT/A的量，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多237U修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，其中修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(ii)用不带电的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代不带电的表面暴露的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；以及
(v)缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。
在一个相关方面，本发明提供了一种修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)，其用于治疗受试者典型面肌痉挛的方法中，与通过未修饰的BoNT/A(例如，SEQ ID NO：2)治疗相比，其持续时间更长，其中通过在受试者面部的多个部位进行肌内注射来施用修饰的BoNT/A，该方法包含：
a)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
b)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；
c)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的外侧下眼轮匝肌；以及
d)根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于口轮匝肌上肌；
(ii)一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；
(iii)一个单位剂量施用于颧大肌；
(iv)一个单位剂量施用于颧小肌；
(v)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；
(vi)一个单位剂量施用于颏肌；
(vii)一个单位剂量施用于颈阔肌；
(viii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；
(ix)一个单位剂量施用于颊肌；
(x)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；
(xi)一个单位剂量施用于降眉间肌；
(xii)一个单位剂量施用于鼻肌；和/或
(xiii)一个单位剂量施用于上睑提肌；
其中单位剂量的修饰的BoNT/A为至少10U修饰的BoNT/A，其中1单位是对应于计算的小鼠半数致死量(LD50)的修饰的BoNT/A的量，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多237U修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，其中修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(ii)用不带电的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代不带电的表面暴露的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；以及
(v)缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。
在一个相关方面，本发明提供了一种治疗受试者典型面肌痉挛的方法，其中通过在受试者面部的多个部位进行肌内注射来施用修饰的BoNT/A，该方法包含：
a)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
b)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；
c)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的外侧下眼轮匝肌；以及
d)根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于口轮匝肌上肌；
(ii)一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；
(iii)一个单位剂量施用于颧大肌；
(iv)一个单位剂量施用于颧小肌；
(v)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；
(vi)一个单位剂量施用于颏肌；
(vii)一个单位剂量施用于颈阔肌；
(viii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；
(ix)一个单位剂量施用于颊肌；
(x)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；
(xi)一个单位剂量施用于降眉间肌；
(xii)一个单位剂量施用于鼻肌；和/或
(xiii)一个单位剂量施用于上睑提肌；
其中单位剂量的修饰的BoNT/A为至少10U修饰的BoNT/A，其中1单位是对应于计算的小鼠半数致死量(LD50)的修饰的BoNT/A的量，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多237U修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU992、GLN995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，其中修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(ii)用不带电的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代不带电的表面暴露的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；以及
(v)缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。
在一个相关方面，本发明提供了一种治疗受试者典型面肌痉挛的方法，与通过未修饰的BoNT/A(例如，SEQ ID NO：2)治疗相比，其持续时间更长，其中通过在受试者面部的多个部位进行肌内注射来施用修饰的BoNT/A，该方法包含：
a)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
b)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；
c)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的外侧下眼轮匝肌；以及
d)根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于口轮匝肌上肌；
(ii)一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；
(iii)一个单位剂量施用于颧大肌；
(iv)一个单位剂量施用于颧小肌；
(v)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；
(vi)一个单位剂量施用于颏肌；
(vii)一个单位剂量施用于颈阔肌；
(viii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；
(ix)一个单位剂量施用于颊肌；
(x)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；
(xi)一个单位剂量施用于降眉间肌；
(xii)一个单位剂量施用于鼻肌；和/或
(xiii)一个单位剂量施用于上睑提肌；
其中单位剂量的修饰的BoNT/A为至少10U修饰的BoNT/A，其中1单位是对应于计算的小鼠半数致死量(LD50)的修饰的BoNT/A的量，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多237U修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，其中修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(ii)用不带电的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代不带电的表面暴露的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；以及
(v)缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。
一方面，本发明提供了修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)在制备用于治疗受试者典型面肌痉挛的药物中的用途，其中通过在受试者面部的多个部位进行肌内注射来施用修饰的BoNT/A，包含：
a)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
b)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；
c)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的外侧下眼轮匝肌；以及
d)根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于口轮匝肌上肌；
(ii)一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；
(iii)一个单位剂量施用于颧大肌；
(iv)一个单位剂量施用于颧小肌；
(v)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；
(vi)一个单位剂量施用于颏肌；
(vii)一个单位剂量施用于颈阔肌；
(viii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；
(ix)一个单位剂量施用于颊肌；
(x)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；
(xi)一个单位剂量施用于降眉间肌；
(xii)一个单位剂量施用于鼻肌；和/或
(xiii)一个单位剂量施用于上睑提肌；
其中单位剂量的修饰的BoNT/A为至少10U修饰的BoNT/A，其中1单位是对应于计算的小鼠半数致死量(LD50)的修饰的BoNT/A的量，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多237U修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，其中修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(ii)用不带电的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代不带电的表面暴露的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；以及
(v)缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。
一方面，本发明提供了修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)在制备用于治疗受试者典型面肌痉挛的药物中的用途，与通过未修饰的BoNT/A(例如，SEQ ID NO：2)治疗相比，其持续时间更长，其中通过在受试者面部的多个部位进行肌内注射来施用修饰的BoNT/A，包含：
a)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
b)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；
c)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的外侧下眼轮匝肌；以及
d)根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于口轮匝肌上肌；
(ii)一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；
(iii)一个单位剂量施用于颧大肌；
(iv)一个单位剂量施用于颧小肌；
(v)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；
(vi)一个单位剂量施用于颏肌；
(vii)一个单位剂量施用于颈阔肌；
(viii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；
(ix)一个单位剂量施用于颊肌；
(x)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；
(xi)一个单位剂量施用于降眉间肌；
(xii)一个单位剂量施用于鼻肌；和/或
(xiii)一个单位剂量施用于上睑提肌；
其中单位剂量的修饰的BoNT/A为至少10U修饰的BoNT/A，其中1单位是对应于计算的小鼠半数致死量(LD50)的修饰的BoNT/A的量，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多237U修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，其中修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(ii)用不带电的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代不带电的表面暴露的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；以及
(v)缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。
另一方面提供了一种修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)，其用于治疗非典型面肌痉挛的方法中，其中通过在受试者面部的多个部位进行肌内注射来施用修饰的BoNT/A，该方法包含：
a)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的口轮匝肌(例如，将一个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的口轮匝肌上肌和/或将一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；优选将一个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受所述面肌痉挛影响的口轮匝肌上肌并将一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌)；以及
b)任选地，根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于颧大肌；
(ii)一个单位剂量施用于颧大肌；
(iii)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；
(iv)一个单位剂量施用于颏肌；
(v)一个单位剂量施用于颈阔肌；
(vi)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；
(vii)一个单位剂量施用于颊肌；
(viii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；
(ix)一个单位剂量施用于降眉间肌；
(x)一个单位剂量施用于鼻肌；
(xi)一个单位剂量施用于外侧上眼轮匝肌；
(xii)一个单位剂量施用于内侧上眼轮匝肌；
(xiii)一个单位剂量施用于外侧下眼轮匝肌；和/或
(xiv)一个单位剂量施用于上睑提肌；
其中单位剂量的修饰的BoNT/A为至少10U修饰的BoNT/A，其中1单位是对应于计算的小鼠半数致死量(LD50)的修饰的BoNT/A的量，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多237U修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，其中修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(ii)用不带电的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代不带电的表面暴露的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；以及
(v)缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。
在一个相关方面，本发明提供了一种修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)，其用于治疗受试者非典型面肌痉挛的方法中，与通过未修饰的BoNT/A(例如，SEQ ID NO：2)治疗相比，其持续时间更长，其中通过在受试者面部的多个部位进行肌内注射来施用修饰的BoNT/A，该方法包含：
a)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的口轮匝肌(例如，将一个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的口轮匝肌上肌和/或将一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；优选将一个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受所述面肌痉挛影响的口轮匝肌上肌并将一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌)；以及
b)任选地，根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于颧大肌；
(ii)一个单位剂量施用于颧大肌；
(iii)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；
(iv)一个单位剂量施用于颏肌；
(v)一个单位剂量施用于颈阔肌；
(vi)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；
(vii)一个单位剂量施用于颊肌；
(viii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；
(ix)一个单位剂量施用于降眉间肌；
(x)一个单位剂量施用于鼻肌；
(xi)一个单位剂量施用于外侧上眼轮匝肌；
(xii)一个单位剂量施用于内侧上眼轮匝肌；
(xiii)一个单位剂量施用于外侧下眼轮匝肌；和/或
(xiv)一个单位剂量施用于上睑提肌；
其中单位剂量的修饰的BoNT/A为至少10U修饰的BoNT/A，其中1单位是对应于计算的小鼠半数致死量(LD50)的修饰的BoNT/A的量，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多237U修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，其中修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(ii)用不带电的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代不带电的表面暴露的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；以及
(v)缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。
在一个相关方面，本发明提供了一种治疗受试者非典型面肌痉挛的方法，其中通过在受试者面部的多个部位进行肌内注射来施用修饰的BoNT/A，该方法包含：
a)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的口轮匝肌(例如，将一个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的口轮匝肌上肌和/或将一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；优选将一个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受所述面肌痉挛影响的口轮匝肌上肌并将一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌)；以及
b)任选地，根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于颧大肌；
(ii)一个单位剂量施用于颧大肌；
(iii)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；
(iv)一个单位剂量施用于颏肌；
(v)一个单位剂量施用于颈阔肌；
(vi)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；
(vii)一个单位剂量施用于颊肌；
(viii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；
(ix)一个单位剂量施用于降眉间肌；
(x)一个单位剂量施用于鼻肌；
(xi)一个单位剂量施用于外侧上眼轮匝肌；
(xii)一个单位剂量施用于内侧上眼轮匝肌；
(xiii)一个单位剂量施用于外侧下眼轮匝肌；和/或
(xiv)一个单位剂量施用于上睑提肌；
其中单位剂量的修饰的BoNT/A为至少10U修饰的BoNT/A，其中1单位是对应于计算的小鼠半数致死量(LD50)的修饰的BoNT/A的量，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多237U修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，其中修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(ii)用不带电的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代不带电的表面暴露的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；以及
(v)缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。
在一个相关方面，本发明提供了一种治疗受试者非典型面肌痉挛的方法，与通过未修饰的BoNT/A(例如，SEQ ID NO：2)治疗相比，其持续时间更长，其中通过在受试者面部的多个部位进行肌内注射来施用修饰的BoNT/A，该方法包含：
a)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的口轮匝肌(例如，将一个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的口轮匝肌上肌和/或将一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；优选将一个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受所述面肌痉挛影响的口轮匝肌上肌并将一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌)；以及
b)任选地，根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于颧大肌；
(ii)一个单位剂量施用于颧大肌；
(iii)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；
(iv)一个单位剂量施用于颏肌；
(v)一个单位剂量施用于颈阔肌；
(vi)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；
(vii)一个单位剂量施用于颊肌；
(viii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；
(ix)一个单位剂量施用于降眉间肌；
(x)一个单位剂量施用于鼻肌；
(xi)一个单位剂量施用于外侧上眼轮匝肌；
(xii)一个单位剂量施用于内侧上眼轮匝肌；
(xiii)一个单位剂量施用于外侧下眼轮匝肌；和/或
(xiv)一个单位剂量施用于上睑提肌；
其中单位剂量的修饰的BoNT/A为至少10U修饰的BoNT/A，其中1单位是对应于计算的小鼠半数致死量(LD50)的修饰的BoNT/A的量，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多237U修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，其中修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(ii)用不带电的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代不带电的表面暴露的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；以及
(v)缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。
一方面，本发明提供了修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)在制备用于治疗受试者非典型面肌痉挛的药物中的用途，其中通过在受试者面部的多个部位进行肌内注射来施用修饰的BoNT/A，包含：
a)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的口轮匝肌(例如，将一个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的口轮匝肌上肌和/或将一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；优选将一个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受所述面肌痉挛影响的口轮匝肌上肌并将一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌)；以及
b)任选地，根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于颧大肌；
(ii)一个单位剂量施用于颧大肌；
(iii)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；
(iv)一个单位剂量施用于颏肌；
(v)一个单位剂量施用于颈阔肌；
(vi)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；
(vii)一个单位剂量施用于颊肌；
(viii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；
(ix)一个单位剂量施用于降眉间肌；
(x)一个单位剂量施用于鼻肌；
(xi)一个单位剂量施用于外侧上眼轮匝肌；
(xii)一个单位剂量施用于内侧上眼轮匝肌；
(xiii)一个单位剂量施用于外侧下眼轮匝肌；和/或
(xiv)一个单位剂量施用于上睑提肌；
其中单位剂量的修饰的BoNT/A为至少10U修饰的BoNT/A，其中1单位是对应于计算的小鼠半数致死量(LD50)的修饰的BoNT/A的量，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多237U修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，其中修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(ii)用不带电的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代不带电的表面暴露的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；以及
(v)缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。
一方面，本发明提供了修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)在制备用于治疗受试者非典型面肌痉挛的药物中的用途，与通过未修饰的BoNT/A(例如，SEQ ID NO：2)治疗相比，其持续时间更长，其中通过在受试者面部的多个部位进行肌内注射来施用修饰的BoNT/A，包含：
a)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的口轮匝肌(例如，将一个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的口轮匝肌上肌和/或将一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；优选将一个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受所述面肌痉挛影响的口轮匝肌上肌并将一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌)；以及
b)任选地，根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于颧大肌；
(ii)一个单位剂量施用于颧大肌；
(iii)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；
(iv)一个单位剂量施用于颏肌；
(v)一个单位剂量施用于颈阔肌；
(vi)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；
(vii)一个单位剂量施用于颊肌；
(viii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；
(ix)一个单位剂量施用于降眉间肌；
(x)一个单位剂量施用于鼻肌；
(xi)一个单位剂量施用于外侧上眼轮匝肌；
(xii)一个单位剂量施用于内侧上眼轮匝肌；
(xiii)一个单位剂量施用于外侧下眼轮匝肌；和/或
(xiv)一个单位剂量施用于上睑提肌；
其中单位剂量的修饰的BoNT/A为至少10U修饰的BoNT/A，其中1单位是对应于计算的小鼠半数致死量(LD50)的修饰的BoNT/A的量，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多237U修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，其中修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(ii)用不带电的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代不带电的表面暴露的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；以及
(v)缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。
单位剂量可以是至少12U或30U，其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR1277，其中修饰选自：(i)用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；(ii)用不带电的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；(iii)用碱性氨基酸残基取代不带电的表面暴露的氨基酸残基；(iv)插入碱性氨基酸残基；以及(v)缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。
单位剂量可以是10U至79U修饰的BoNT/A，其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，其中修饰选自：(i)用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；(ii)用不带电的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；(iii)用碱性氨基酸残基取代不带电的表面暴露的氨基酸残基；(iv)插入碱性氨基酸残基；以及(v)缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。单位剂量范围的上限可以是77、71、65、59、53、47.4、41、39.5、36、30、23.7、19.75、18或12U修饰的BoNT/A。单位剂量范围的下限可以是12、15、18、24、30、36、41、47、53、59、65、71或77U修饰的BoNT/A。单位剂量可以是12U至47.4U、12U至39.5U、12U至23.7U、或12U至19.75U。
单位剂量可以是大于35.5单位或大于59.2单位修饰的BoNT/A，其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS 1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN1243、SER 1274和THR 1277，其中修饰选自：(i)用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；(ii)用不带电的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；(iii)用碱性氨基酸残基取代不带电的表面暴露的氨基酸残基；(iv)插入碱性氨基酸残基；以及(v)缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。例如，单位剂量可以是大于35.5单位且至多80单位修饰的BoNT/A，例如大于59.2单位且至多80单位修饰的BoNT/A。
当实施本发明的治疗方案时，施用的总剂量可以是至多237U修饰的BoNT/A，其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，其中修饰选自：(i)用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；(ii)用不带电的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；(iii)用碱性氨基酸残基取代不带电的表面暴露的氨基酸残基；(iv)插入碱性氨基酸残基；以及(v)缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。换言之，在给定治疗期施用的修饰的BoNT/A的总量可以是至多237U。总剂量可以是至多207、178、118、89、59或36U，优选至多178U。总剂量可以是至少30、36、41、47、59、71、83、95、107、118或148U。总剂量可以是30U至237U，优选36U至178U。
总剂量可以是大于59.2单位、或大于88.9单位、或大于118.5单位修饰的BoNT/A，其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，其中修饰选自：(i)用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；(ii)用不带电的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；(iii)用碱性氨基酸残基取代不带电的表面暴露的氨基酸残基；(iv)插入碱性氨基酸残基；以及(v)缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。
总剂量可以是大于59.2单位且至多236.9单位修饰的BoNT/A，其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS 1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN1243、SER 1274和THR 1277，其中修饰选自：(i)用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；(ii)用不带电的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；(iii)用碱性氨基酸残基取代不带电的表面暴露的氨基酸残基；(iv)插入碱性氨基酸残基；以及(v)缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。例如，总剂量可以是大于88.9单位(优选大于118.5单位)且至多236.9单位修饰的BoNT/A。
可以根据本发明治疗影响受试者眼睑肌肉(例如，影响两个或更多个眼睑肌肉)的任何疾病。合适的疾病包括眼睑痉挛和面部痉挛(例如，面肌痉挛)。优选地，影响受试者眼睑肌肉的疾病是眼睑痉挛。因此，本发明可以针对眼睑痉挛和/或面部痉挛(例如，面肌痉挛)的治疗，优选针对眼睑痉挛的治疗。
影响眼睑肌肉的疾病(例如，影响两个或更多个眼睑肌肉)可以是面肌痉挛。面肌痉挛可以是典型面肌痉挛或非典型面肌痉挛(优选典型面肌痉挛)。
影响受试者眼睑肌肉的疾病可以是眼睑肌肉疾病。该疾病的原因可能是神经相关疾病(例如，第七神经疾病)。
可以将修饰的BoNT/A施用于受疾病影响的任何肌肉(例如，受影响的眼睑肌肉)。受影响的肌肉可能导致(例如，引起)一种或多种疾病症状(例如，眼睑痉挛和/或面部痉挛，如面肌痉挛)。
在一个实施方案中，仅将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于至少以下各项：受试者第一只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌(例如，上眼睑的外侧睑板前眼轮匝肌)；受试者第一只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌(例如，上眼睑的内侧睑板前眼轮匝肌)；以及受试者第一只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌(例如，下眼睑的外侧睑板前眼轮匝肌)。优选地，每个注射部位施用单个单位，在该实施方案中，这相当于在三个注射部位施用。因此，可以根据上文施用三个单位剂量，然而可以根据本发明治疗其他肌肉和/或其部位，这意味着施用的单位剂量总数可以大于三个。
在一个实施方案中，当疾病影响受试者双眼附近的眼睑肌肉(例如，双侧眼睑痉挛)时，可以仅将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于至少以下各项：受试者第一只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；受试者第一只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；受试者第一只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌；受试者第二只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；受试者第二只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；以及受试者第二只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌。优选地，每个注射部位施用单个单位，在该实施方案中，这相当于在六个注射部位施用。因此，可以根据上文施用六个单位剂量，然而可以根据本发明治疗其他肌肉和/或其部位，这意味着施用的单位剂量总数可以大于六个。
在涉及治疗眼睑痉挛的方面和实施方案中，施用的单位剂量的总数优选为三个或更少(优选三个)，例如，当仅将修饰的BoNT/A施用于一只眼睛附近的肌肉时；例如，施用于至少以下各项：受试者第一只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；受试者第一只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；受试者第一只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌。也就是说，单位剂量的总数可以是六个或更少(优选六个)，例如，当将修饰的BoNT/A施用于双眼附近的肌肉时。例如，每只眼睛可以有总共三个或更少(优选三个)的单位剂量，因此施用于受试者的单位剂量为总共六个或更少(优选六个)——例如，其中可以将修饰的BoNT/A施用于至少以下各项：受试者第一只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；受试者第一只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；受试者第一只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌；受试者第二只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；受试者第二只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；以及受试者第二只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌。
也就是说，施用的单位剂量的总数也可以是15个或更少(例如，15个)。例如，除了上述肌肉之外，注射部位可以延伸至降眉间肌(例如，一个单位剂量施用于降眉间肌)、额肌(例如，至多四个单位剂量施用于额肌)和/或皱眉肌(例如，至多四个单位剂量施用于皱眉肌，优选每个皱眉肌施用两个单位剂量)。
术语“第一只眼睛”和“第二只眼睛”可以指左眼或右眼。这些术语只是用于区分两只眼睛。换言之，如果第一只眼睛是左眼，那么第二只眼睛将是右眼，反之亦然。提及“第一只眼睛”并不意味着“第二只眼睛”附近的肌肉和/或其部位总是需要治疗。例如，可以在单侧疾病(例如，单侧眼睑痉挛)的情况下提及“第一只眼睛”，其中第二只眼睛附近的肌肉和/或其部位未受影响，因此未对其进行治疗。
术语“附近”是指所称肌肉和/或其部位离所提及的眼睛最近。例如，如果第一只眼睛是受试者的左眼，那么所述第一只眼睛附近的肌肉和/或其部位是离受试者左眼相比右眼更近的肌肉和/或其部位。
可以将修饰的BoNT/A施用于一个或多个其他肌肉和/或其部位。当施用于其他肌肉和/或其部位时，优选设定单位剂量的上限以确保所施用的修饰的BoNT/A的总量不超过根据本发明所定义的治疗期间施用的总剂量。
被治疗的其他肌肉和/或其部位可以是选自以下的一个或多个(例如，至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个或十二个、或全部肌肉和/或部位)：内侧下眼轮匝肌、口轮匝肌(例如，口轮匝肌上肌和/或口轮匝肌下肌)；颧肌(例如，颧大肌)；鼻肌；颏肌；颈阔肌；额肌；皱眉肌；颊肌；咬肌；降眉间肌；以及外眦。被治疗的其他肌肉和/或其部位可以是选自以下的一个或多个(例如，至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个或十二个、或全部肌肉和/或部位)：内侧下眼轮匝肌、口轮匝肌上肌、口轮匝肌下肌、颧大肌、颧小肌、额肌、颏肌、颈阔肌、皱眉肌、颊肌、咬肌、降眉间肌、鼻肌和上睑提肌。其他被治疗的肌肉和/或其部位可以是选自以下的一个或多个(例如，至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个或十二个、或全部肌肉和/或部位)：口轮匝肌上肌、口轮匝肌下肌、颧大肌、颧小肌、额肌、颏肌、颈阔肌、皱眉肌、颊肌、咬肌、降眉间肌、鼻肌和上睑提肌。
可以根据需要治疗一只或两只眼睛附近的肌肉和/或其部位。可以将至少单个单位剂量施用于所述肌肉和/或其部位，例如可以施用两个或更多个(例如，三个或更多个、四个或更多个、或五个或更多个)单位剂量。
还可以将修饰的BoNT/A施用于内侧下眼轮匝肌(例如，下眼睑内侧睑板前眼轮匝肌)。在一个实施方案中，可以仅将单个单位剂量施用于内侧下眼轮匝肌。可以根据需要治疗一只或两只眼睛附近的内侧下眼轮匝肌。
还可以将修饰的BoNT/A施用于额肌。在一个实施方案中，可以仅将至少单个单位剂量施用于额肌，例如，可以施用两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、或五个或更多个单位剂量。可以根据需要治疗一只或两只眼睛附近的额肌。
还可以将修饰的BoNT/A施用于皱眉肌。在一个实施方案中，可以仅将至少一个单位剂量施用于皱眉肌，例如，可以施用两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、或五个或更多个单位剂量。可以根据需要治疗一只或两只眼睛附近的皱眉肌。
还可以将修饰的BoNT/A施用于降眉间肌。在一个实施方案中，可以仅将至少单个单位剂量施用于降眉间肌，例如，可以施用两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、或五个或更多个单位剂量。优选地，可以仅将单个单位剂量施用于降眉间肌。
还可以将修饰的BoNT/A施用于提肌。在一个实施方案中，可以仅将至少单个单位剂量施用于提肌，例如，可以施用两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、或五个或更多个单位剂量。优选地，可以仅将单个单位剂量施用于提肌。可以根据需要治疗一只或两只眼睛附近的提肌。
当治疗面部痉挛时，可以治疗一个或多个(例如，至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或十一个、或全部)其他肌肉和/或其部位，其中一个或多个肌肉和/或其部位选自：口轮匝肌(例如，口轮匝肌上肌和/或口轮匝肌下肌)；颧肌(例如，颧大肌)；鼻肌；颏肌；颈阔肌；额肌；皱眉肌；颊肌；咬肌；降眉间肌；以及外眦。当治疗面部痉挛时，可以治疗一个或多个(例如，至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或十一个、或全部)其他肌肉和/或其部位，其中一个或多个肌肉和/或其部位选自：口轮匝肌(例如，口轮匝肌上肌和/或口轮匝肌下肌)；颧肌(例如，颧大肌和/或颧小肌)；鼻肌；颏肌；颈阔肌；额肌；皱眉肌；颊肌；咬肌；降眉间肌；以及外眦。
优选地，一个或多个(例如，至少两个、三个或四个、或全部)其他肌肉和/或部位选自：皱眉肌、额肌、颧大肌、颊肌和咬肌。
如果面部痉挛是双侧的，可以将修饰的BoNT/A施用于受试者面部两侧的任何肌肉和/或其部位。当面部痉挛是面肌痉挛时，可以将修饰的BoNT/A施用于受试者面部受影响一侧的任何肌肉和/或其部位。可以将至少单个单位剂量施用于所述肌肉和/或其部位，例如，可以施用两个或更多个(例如，三个或更多个、四个或更多个、或五个或更多个)单位剂量。
额肌可以是额腹肌。
皱眉肌(corrugator muscle)可以是皱眉肌肉(corrugator superciliimuscle)。
根据本发明，可以通过任何合适的方式将修饰的BoNT/A施用于肌肉和/或其部位。
在一个实施方案中，可以皮下施用修饰的BoNT/A，例如，通过皮下注射。根据需要，所述皮下注射可以包括从内侧和/或外侧注射到上眼轮匝肌和/或下眼轮匝肌的眶隔前与眼眶部之间的连接处。
在一个实施方案中，可以肌内施用修饰的BoNT/A，例如，通过肌内注射。最优选地，肌内施用修饰的BoNT/A，例如，通过肌内注射。
根据本发明，可以采用肌电图控制/引导来辅助施用修饰的BoNT/A。
可以将单个单位剂量施用于一个或多个注射部位。当将单个单位剂量施用于一个以上注射部位时，该单位剂量可以在两个或更多个注射部位之间分配(相等或不相等)。然而，优选每个注射部位施用单个单位剂量。
在本文所述的本发明的任何方面或实施方案中，可以在受试者面部的多个部位施用(优选通过肌内注射)修饰的BoNT/A。
在涉及治疗眼睑痉挛的本发明的任何方面或实施方案中，所述方面或实施方案优选包含：
a)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
b)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；以及
c)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌，
其中修饰的BoNT/A的单位剂量和总剂量如所述方面或实施方案中所述。
在涉及治疗眼睑痉挛的本发明的任何方面或实施方案中，本发明可以进一步包含：根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个受所述眼睑痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于口轮匝肌上肌；
(ii)一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；
(iii)一个单位剂量施用于颧大肌；
(iv)一个单位剂量施用于颧小肌；
(v)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；
(vi)一个单位剂量施用于颏肌；
(vii)一个单位剂量施用于颈阔肌；
(viii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；
(ix)一个单位剂量施用于颊肌；
(x)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；
(xi)一个单位剂量施用于降眉间肌；
(xii)一个单位剂量施用于鼻肌；和/或
(xiii)一个单位剂量施用于上睑提肌。
在涉及治疗眼睑痉挛的本发明的任何方面或实施方案中，本发明可以进一步包含：将一个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于口轮匝肌上肌；以及任选地根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个(例如，2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、或12个或更多个)受所述眼睑痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；(ii)一个单位剂量施用于颧大肌；(iii)一个单位剂量施用于颧小肌；(iv)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；(v)一个单位剂量施用于颏肌；(vi)一个单位剂量施用于颈阔肌；(vii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；(viii)一个单位剂量施用于颊肌；(ix)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；(x)一个单位剂量施用于降眉间肌；(x)一个单位剂量施用于鼻肌；和/或(xii)一个单位剂量施用于上睑提肌。
在涉及治疗眼睑痉挛的本发明的任何方面或实施方案中，本发明可以进一步包含：将一个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于口轮匝肌下肌；以及任选地根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个(例如，2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、或12个或更多个)受所述眼睑痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于口轮匝肌上肌；(ii)一个单位剂量施用于颧大肌；(iii)一个单位剂量施用于颧小肌；(iv)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；(v)一个单位剂量施用于颏肌；(vi)一个单位剂量施用于颈阔肌；(vii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；(viii)一个单位剂量施用于颊肌；(ix)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；(x)一个单位剂量施用于降眉间肌；(x)一个单位剂量施用于鼻肌；和/或(xii)一个单位剂量施用于上睑提肌。
在涉及治疗眼睑痉挛的本发明的任何方面或实施方案中，本发明可以进一步包含：将一个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于颧大肌；以及任选地根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个(例如，2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、或12个或更多个)受所述眼睑痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；(ii)一个单位剂量施用于口轮匝肌上肌；(iii)一个单位剂量施用于颧小肌；(iv)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；(v)一个单位剂量施用于颏肌；(vi)一个单位剂量施用于颈阔肌；(vii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；(viii)一个单位剂量施用于颊肌；(ix)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；(x)一个单位剂量施用于降眉间肌；(x)一个单位剂量施用于鼻肌；和/或(xii)一个单位剂量施用于上睑提肌。
在涉及治疗眼睑痉挛的本发明的任何方面或实施方案中，本发明可以进一步包含：将一个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于颧小肌；以及任选地根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个(例如，2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、或12个或更多个)受所述眼睑痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；(ii)一个单位剂量施用于颧大肌；(iii)一个单位剂量施用于口轮匝肌上肌；(iv)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；(v)一个单位剂量施用于颏肌；(vi)一个单位剂量施用于颈阔肌；(vii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；(viii)一个单位剂量施用于颊肌；(ix)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；(x)一个单位剂量施用于降眉间肌；(x)一个单位剂量施用于鼻肌；和/或(xii)一个单位剂量施用于上睑提肌。
在涉及治疗眼睑痉挛的本发明的任何方面或实施方案中，本发明可以进一步包含：将至多五个单位剂量(优选一个单位剂量；更优选两个单位剂量；最优选三个单位剂量)的修饰的BoNT/A施用于额肌；以及任选地根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个(例如，2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、或12个或更多个)受所述眼睑痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；(ii)一个单位剂量施用于颧大肌；(iii)一个单位剂量施用于颧小肌；(iv)一个单位剂量施用于口轮匝肌上肌；(v)一个单位剂量施用于颏肌；(vi)一个单位剂量施用于颈阔肌；(vii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；(viii)一个单位剂量施用于颊肌；(ix)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；(x)一个单位剂量施用于降眉间肌；(x)一个单位剂量施用于鼻肌；和/或(xii)一个单位剂量施用于上睑提肌。
在涉及治疗眼睑痉挛的本发明的任何方面或实施方案中，本发明可以进一步包含：将一个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于颏肌；以及任选地根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个(例如，2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、或12个或更多个)受所述眼睑痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；(ii)一个单位剂量施用于颧大肌；(iii)一个单位剂量施用于颧小肌；(iv)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；(v)一个单位剂量施用于口轮匝肌上肌；(vi)一个单位剂量施用于颈阔肌；(vii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；(viii)一个单位剂量施用于颊肌；(ix)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；(x)一个单位剂量施用于降眉间肌；(x)一个单位剂量施用于鼻肌；和/或(xii)一个单位剂量施用于上睑提肌。
在涉及治疗眼睑痉挛的本发明的任何方面或实施方案中，本发明可以进一步包含：将一个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于颈阔肌；以及任选地根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个(例如，2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、或12个或更多个)受所述眼睑痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；(ii)一个单位剂量施用于颧大肌；(iii)一个单位剂量施用于颧小肌；(iv)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；(v)一个单位剂量施用于颏肌；(vi)一个单位剂量施用于口轮匝肌上肌；(vii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；(viii)一个单位剂量施用于颊肌；(ix)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；(x)一个单位剂量施用于降眉间肌；(x)一个单位剂量施用于鼻肌；和/或(xii)一个单位剂量施用于上睑提肌。
在涉及治疗眼睑痉挛的本发明的任何方面或实施方案中，本发明可以进一步包含：将至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；以及任选地根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个(例如，2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、或12个或更多个)受所述眼睑痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；(ii)一个单位剂量施用于颧大肌；(iii)一个单位剂量施用于颧小肌；(iv)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；(v)一个单位剂量施用于颏肌；(vi)一个单位剂量施用于颈阔肌；(vii)一个单位剂量施用于口轮匝肌上肌；(viii)一个单位剂量施用于颊肌；(ix)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；(x)一个单位剂量施用于降眉间肌；(x)一个单位剂量施用于鼻肌；和/或(xii)一个单位剂量施用于上睑提肌。
在涉及治疗眼睑痉挛的本发明的任何方面或实施方案中，本发明可以进一步包含：将一个单位剂量施用于颊肌；以及任选地根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个(例如，2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、或12个或更多个)受所述眼睑痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；(ii)一个单位剂量施用于颧大肌；(iii)一个单位剂量施用于颧小肌；(iv)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；(v)一个单位剂量施用于颏肌；(vi)一个单位剂量施用于颈阔肌；(vii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；(viii)一个单位剂量施用于口轮匝肌上肌；(ix)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；(x)一个单位剂量施用于降眉间肌；(x)一个单位剂量施用于鼻肌；和/或(xii)一个单位剂量施用于上睑提肌。
在涉及治疗眼睑痉挛的本发明的任何方面或实施方案中，本发明可以进一步包含：将一个单位剂量至至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；以及任选地根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个(例如，2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、或12个或更多个)受所述眼睑痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；(ii)一个单位剂量施用于颧大肌；(iii)一个单位剂量施用于颧小肌；(iv)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；(v)一个单位剂量施用于颏肌；(vi)一个单位剂量施用于颈阔肌；(vii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；(viii)一个单位剂量施用于颊肌；(ix)一个单位剂量施用于口轮匝肌上肌；(x)一个单位剂量施用于降眉间肌；(x)一个单位剂量施用于鼻肌；和/或(xii)一个单位剂量施用于上睑提肌。
在涉及治疗眼睑痉挛的本发明的任何方面或实施方案中，本发明可以进一步包含：将一个单位剂量施用于降眉间肌；以及任选地根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个(例如，2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、或12个或更多个)受所述眼睑痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；(ii)一个单位剂量施用于颧大肌；(iii)一个单位剂量施用于颧小肌；(iv)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；(v)一个单位剂量施用于颏肌；(vi)一个单位剂量施用于颈阔肌；(vii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；(viii)一个单位剂量施用于颊肌；(ix)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；(x)一个单位剂量施用于口轮匝肌上肌；(x)一个单位剂量施用于鼻肌；和/或(xii)一个单位剂量施用于上睑提肌。
在涉及治疗眼睑痉挛的本发明的任何方面或实施方案中，本发明可以进一步包含：将一个单位剂量施用于鼻肌；以及任选地根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个(例如，2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、或12个或更多个)受所述眼睑痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；(ii)一个单位剂量施用于颧大肌；(iii)一个单位剂量施用于颧小肌；(iv)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；(v)一个单位剂量施用于颏肌；(vi)一个单位剂量施用于颈阔肌；(vii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；(viii)一个单位剂量施用于颊肌；(ix)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；(x)一个单位剂量施用于降眉间肌；(x)一个单位剂量施用于口轮匝肌上肌；和/或(xii)一个单位剂量施用于上睑提肌。
在涉及治疗眼睑痉挛的本发明的任何方面或实施方案中，本发明可以进一步包含：将一个单位剂量施用于上睑提肌；以及任选地根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个(例如，2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、或12个或更多个)受所述眼睑痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；(ii)一个单位剂量施用于颧大肌；(iii)一个单位剂量施用于颧小肌；(iv)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；(v)一个单位剂量施用于颏肌；(vi)一个单位剂量施用于颈阔肌；(vii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；(viii)一个单位剂量施用于颊肌；(ix)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；(x)一个单位剂量施用于降眉间肌；(x)一个单位剂量施用于鼻肌；和/或(xii)一个单位剂量施用于口轮匝肌上肌。
在涉及治疗眼睑痉挛的本发明的任何方面或实施方案中，本发明可以进一步包含：根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个受所述眼睑痉挛影响的其他肌肉：(i)一个单位剂量施用于上睑提肌。
在涉及治疗面肌痉挛(优选典型面肌痉挛)的本发明的任何方面或实施方案中，所述方面或实施方案优选包含：
a)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
b)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；
c)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的外侧下眼轮匝肌；以及
d)根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于口轮匝肌上肌；
(ii)一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；
(iii)一个单位剂量施用于颧大肌；
(iv)一个单位剂量施用于颧小肌；
(v)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；
(vi)一个单位剂量施用于颏肌；
(vii)一个单位剂量施用于颈阔肌；
(viii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；
(ix)一个单位剂量施用于颊肌；
(x)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；
(xi)一个单位剂量施用于降眉间肌；
(xii)一个单位剂量施用于鼻肌；和/或
(xiii)一个单位剂量施用于上睑提肌；
其中修饰的BoNT/A的单位剂量和总剂量如所述方面或实施方案中所述。
如上所述，在涉及治疗典型面肌痉挛的本发明的多个方面，本发明可以包含：根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：(i)一个单位剂量施用于口轮匝肌上肌；(ii)一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；(iii)一个单位剂量施用于颧大肌；(iv)一个单位剂量施用于颧小肌；(v)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；(vi)一个单位剂量施用于颏肌；(vii)一个单位剂量施用于颈阔肌；(viii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；(ix)一个单位剂量施用于颊肌；(x)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；(xi)一个单位剂量施用于降眉间肌；(xii)一个单位剂量施用于鼻肌；和/或(xiii)一个单位剂量施用于上睑提肌。
在涉及治疗典型面肌痉挛的本发明的任何方面或实施方案中，本发明可以进一步包含：(i)将一个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受所述面肌痉挛影响的口轮匝肌上肌；以及任选地根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个(例如2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、或12个或更多个)受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(ii)一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；(iii)一个单位剂量施用于颧大肌；(iv)一个单位剂量施用于颧小肌；(v)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；(vi)一个单位剂量施用于颏肌；(vii)一个单位剂量施用于颈阔肌；(viii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；(ix)一个单位剂量施用于颊肌；(x)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；(xi)一个单位剂量施用于降眉间肌；(xii)一个单位剂量施用于鼻肌；和/或(xiii)一个单位剂量施用于上睑提肌。
在涉及治疗典型面肌痉挛的本发明的任何方面或实施方案中，本发明可以进一步包含：将一个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受所述面肌痉挛影响的口轮匝肌下肌；以及任选地根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个(例如，2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、或12个或更多个)受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于口轮匝肌上肌；(ii)一个单位剂量施用于颧大肌；(iii)一个单位剂量施用于颧小肌；(iv)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；(v)一个单位剂量施用于颏肌；(vi)一个单位剂量施用于颈阔肌；(vii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；(iix)一个单位剂量施用于颊肌；(ix)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；(x)一个单位剂量施用于降眉间肌；(xi)一个单位剂量施用于鼻肌；和/或(xii)一个单位剂量施用于上睑提肌。
在涉及治疗典型面肌痉挛的本发明的任何方面或实施方案中，本发明可以进一步包含：将一个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受所述面肌痉挛影响的颧大肌；以及任选地根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个(例如，2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、或12个或更多个)受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于口轮匝肌上肌；(ii)一个单位剂量施用于颧小肌；(iii)口轮匝肌下肌；(iv)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；(v)一个单位剂量施用于颏肌；(vi)一个单位剂量施用于颈阔肌；(vii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；(iix)一个单位剂量施用于颊肌；(ix)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；(x)一个单位剂量施用于降眉间肌；(xi)一个单位剂量施用于鼻肌；和/或(xii)一个单位剂量施用于上睑提肌。
在涉及治疗典型面肌痉挛的本发明的任何方面或实施方案中，本发明可以进一步包含：将一个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受所述面肌痉挛影响的颧小肌；以及任选地根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个(例如，2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、或12个或更多个)受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于口轮匝肌上肌；(ii)一个单位剂量施用于颧大肌；(iii)一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；(iv)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；(v)一个单位剂量施用于颏肌；(vi)一个单位剂量施用于颈阔肌；(vii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；(iix)一个单位剂量施用于颊肌；(ix)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；(x)一个单位剂量施用于降眉间肌；(xi)一个单位剂量施用于鼻肌；和/或(xii)一个单位剂量施用于上睑提肌。
在涉及治疗典型面肌痉挛的本发明的任何方面或实施方案中，本发明可以进一步包含：将至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)修饰的BoNT/A施用于受所述面肌痉挛影响的额肌；以及任选地根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个(例如，2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、或12个或更多个)受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于口轮匝肌上肌；(ii)一个单位剂量施用于颧大肌；(iii)一个单位剂量施用于颧小肌；(iv)一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；(v)一个单位剂量施用于颏肌；(vi)一个单位剂量施用于颈阔肌；(vii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；(iix)一个单位剂量施用于颊肌；(ix)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；(x)一个单位剂量施用于降眉间肌；(xi)一个单位剂量施用于鼻肌；和/或(xii)一个单位剂量施用于上睑提肌。
在涉及治疗典型面肌痉挛的本发明的任何方面或实施方案中，本发明可以进一步包含：将一个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受所述面肌痉挛影响的颏肌；以及任选地根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个(例如，2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、或12个或更多个)受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于口轮匝肌上肌；(ii)一个单位剂量施用于颧大肌；(iii)一个单位剂量施用于颧小肌；(iv)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；(v)一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；(vi)一个单位剂量施用于颈阔肌；(vii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；(iix)一个单位剂量施用于颊肌；(ix)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；(x)一个单位剂量施用于降眉间肌；(xi)一个单位剂量施用于鼻肌；和/或(xii)一个单位剂量施用于上睑提肌。
在涉及治疗典型面肌痉挛的本发明的任何方面或实施方案中，本发明可以进一步包含：将一个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受所述面肌痉挛影响的颈阔肌；以及任选地根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个(例如，2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、或12个或更多个)受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于口轮匝肌上肌；(ii)一个单位剂量施用于颧大肌；(iii)一个单位剂量施用于颧小肌；(iv)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；(v)一个单位剂量施用于颏肌；(vi)一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；(vii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；(iix)一个单位剂量施用于颊肌；(ix)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；(x)一个单位剂量施用于降眉间肌；(xi)一个单位剂量施用于鼻肌；和/或(xii)一个单位剂量施用于上睑提肌。
在涉及治疗典型面肌痉挛的本发明的任何方面或实施方案中，本发明可以进一步包含：将至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于受所述面肌痉挛影响的皱眉肌；以及任选地根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个(例如2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、或12个或更多个)受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于口轮匝肌上肌；(ii)一个单位剂量施用于颧大肌；(iii)一个单位剂量施用于颧小肌；(iv)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；(v)一个单位剂量施用于颏肌；(vi)一个单位剂量施用于颈阔肌；(vii)一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；(iix)一个单位剂量施用于颊肌；(ix)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；(x)一个单位剂量施用于降眉间肌；(xi)一个单位剂量施用于鼻肌；和/或(xii)一个单位剂量施用于上睑提肌。
在涉及治疗典型面肌痉挛的本发明的任何方面或实施方案中，本发明可以进一步包含：将一个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受所述面肌痉挛影响的颊肌；以及任选地根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个(例如，2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、或12个或更多个)受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于口轮匝肌上肌；(ii)一个单位剂量施用于颧大肌；(iii)一个单位剂量施用于颧小肌；(iv)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；(v)一个单位剂量施用于颏肌；(vi)一个单位剂量施用于颈阔肌；(vii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；(iix)一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；(ix)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；(x)一个单位剂量施用于降眉间肌；(xi)一个单位剂量施用于鼻肌；和/或(xii)一个单位剂量施用于上睑提肌。
在涉及治疗典型面肌痉挛的本发明的任何方面或实施方案中，本发明可以进一步包含：将至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)修饰的BoNT/A施用于受所述面肌痉挛影响的咬肌；以及任选地根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个(例如，2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、或12个或更多个)受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于口轮匝肌上肌；(ii)一个单位剂量施用于颧大肌；(iii)一个单位剂量施用于颧小肌；(iv)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；(v)一个单位剂量施用于颏肌；(vi)一个单位剂量施用于颈阔肌；(vii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；(iix)一个单位剂量施用于颊肌；(ix)一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；(x)一个单位剂量施用于降眉间肌；(xi)一个单位剂量施用于鼻肌；和/或(xii)一个单位剂量施用于上睑提肌。
在涉及治疗典型面肌痉挛的本发明的任何方面或实施方案中，本发明可以进一步包含：将一个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受所述面肌痉挛影响的降眉间肌；以及任选地根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个(例如，2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、或12个或更多个)受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于口轮匝肌上肌；(ii)一个单位剂量施用于颧大肌；(iii)一个单位剂量施用于颧小肌；(iv)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；(v)一个单位剂量施用于颏肌；(vi)一个单位剂量施用于颈阔肌；(vii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；(iix)一个单位剂量施用于颊肌；(ix)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；(x)一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；(xi)一个单位剂量施用于鼻肌；和/或(xii)一个单位剂量施用于上睑提肌。
在涉及治疗典型面肌痉挛的本发明的任何方面或实施方案中，本发明可以进一步包含：将一个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受所述面肌痉挛影响的鼻肌；以及任选地根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个(例如，2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、或12个或更多个)受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于口轮匝肌上肌；(ii)一个单位剂量施用于颧大肌；(iii)一个单位剂量施用于颧小肌；(iv)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；(v)一个单位剂量施用于颏肌；(vi)一个单位剂量施用于颈阔肌；(vii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；(iix)一个单位剂量施用于颊肌；(ix)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；(x)一个单位剂量施用于降眉间肌；(xi)一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；和/或(xii)一个单位剂量施用于上睑提肌。
在涉及治疗典型面肌痉挛的本发明的任何方面或实施方案中，本发明可以进一步包含：将一个单位剂量施用于受所述面肌痉挛影响的上睑提肌；以及任选地根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个(例如2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、或12个或更多个)受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于口轮匝肌上肌；(ii)一个单位剂量施用于颧大肌；(iii)一个单位剂量施用于颧小肌；(iv)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；(v)一个单位剂量施用于颏肌；(vi)一个单位剂量施用于颈阔肌；(vii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；(iix)一个单位剂量施用于颊肌；(ix)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；(x)一个单位剂量施用于降眉间肌；(xi)一个单位剂量施用于鼻肌；和/或(xii)一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌。
当疾病是非典型面肌痉挛时，以下施用步骤可以只是任选的：
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；以及
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌，
在涉及治疗面肌痉挛(优选非典型面肌痉挛)的本发明的任何方面或实施方案中，所述方面或实施方案优选包含：
a)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的口轮匝肌(例如，将一个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受所述面肌痉挛影响的口轮匝肌上肌和/或将一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；优选将一个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受所述面肌痉挛影响的口轮匝肌上肌并将一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌)；以及
b)任选地，根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于颧大肌；
(ii)一个单位剂量施用于颧小肌；
(iii)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；
(iv)一个单位剂量施用于颏肌；
(v)一个单位剂量施用于颈阔肌；
(vi)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；
(vii)一个单位剂量施用于颊肌；
(viii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；
(ix)一个单位剂量施用于降眉间肌；
(x)一个单位剂量施用于鼻肌；
(xi)一个单位剂量施用于外侧上眼轮匝肌；
(xii)一个单位剂量施用于内侧上眼轮匝肌；
(xiii)一个单位剂量施用于外侧下眼轮匝肌；和/或
(xiv)一个单位剂量施用于上睑提肌；
其中修饰的BoNT/A的单位剂量和总剂量如所述方面或实施方案中所述。
本发明的一个方面提供了一种修饰的BoNT/A，其用于治疗非典型面肌痉挛的方法中，其中该方法包含：
a)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的口轮匝肌(例如，将一个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受所述面肌痉挛影响的口轮匝肌上肌和/或将一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；优选将一个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受所述面肌痉挛影响的口轮匝肌上肌并将一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌)；以及
b)任选地，根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于颧大肌；
(ii)一个单位剂量施用于颧小肌；
(iii)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；
(iv)一个单位剂量施用于颏肌；
(v)一个单位剂量施用于颈阔肌；
(vi)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；
(vii)一个单位剂量施用于颊肌；
(viii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；
(ix)一个单位剂量施用于降眉间肌；
(x)一个单位剂量施用于鼻肌；
(xi)一个单位剂量施用于外侧上眼轮匝肌；
(xii)一个单位剂量施用于内侧上眼轮匝肌；
(xiii)一个单位剂量施用于外侧下眼轮匝肌；和/或
(xiv)一个单位剂量施用于上睑提肌；
其中单位剂量的修饰的BoNT/A为至少240pg(优选240pg至8000pg)修饰的BoNT/A，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多24000pg修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
本发明的另一方面提供了一种修饰的BoNT/A，其用于治疗非典型面肌痉挛的方法中，其中该方法包含：
a)将单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的口轮匝肌(例如，将一个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受所述面肌痉挛影响的口轮匝肌上肌和/或将一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；优选将一个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受所述面肌痉挛影响的口轮匝肌上肌并将一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌)；以及
b)任选地，根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于颧大肌；
(ii)一个单位剂量施用于颧小肌；
(iii)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；
(iv)一个单位剂量施用于颏肌；
(v)一个单位剂量施用于颈阔肌；
(vi)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；
(vii)一个单位剂量施用于颊肌；
(viii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；
(ix)一个单位剂量施用于降眉间肌；
(x)一个单位剂量施用于鼻肌；
(xi)一个单位剂量施用于外侧上眼轮匝肌；
(xii)一个单位剂量施用于内侧上眼轮匝肌；
(xiii)一个单位剂量施用于外侧下眼轮匝肌；和/或
(xiv)一个单位剂量施用于上睑提肌；
其中单位剂量的修饰的BoNT/A为至少84pg(优选84pg至666.7pg)修饰的BoNT/A，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多2000pg修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，其中修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(ii)用不带电的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代不带电的表面暴露的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；以及
(v)缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。
术语“单位剂量”可以与术语“单个单位剂量”互换使用。
如上所述，在本发明涉及治疗非典型面肌痉挛的方面，本发明可以包含：根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于颧大肌；(ii)一个单位剂量施用于颧小肌；(iii)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；(iv)一个单位剂量施用于颏肌；(v)一个单位剂量施用于颈阔肌；(vi)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；(vii)一个单位剂量施用于颊肌；(viii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；(ix)一个单位剂量施用于降眉间肌；(x)一个单位剂量施用于鼻肌；(xi)一个单位剂量施用于外侧上眼轮匝肌；(xii)一个单位剂量施用于内侧上眼轮匝肌；(xiii)一个单位剂量施用于外侧下眼轮匝肌；和/或(xiv)一个单位剂量施用于上睑提肌。
在涉及治疗非典型面肌痉挛的本发明的任何方面或实施方案中，本发明可以进一步包含：(i)将一个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受所述面肌痉挛影响的颧大肌；以及任选地根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个(例如2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、或13个或更多个)受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(ii)一个单位剂量施用于颧小肌；(iii)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；(iv)一个单位剂量施用于颏肌；(v)一个单位剂量施用于颈阔肌；(vi)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；(vii)一个单位剂量施用于颊肌；(viii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；(ix)一个单位剂量施用于降眉间肌；(x)一个单位剂量施用于鼻肌；(xi)一个单位剂量施用于外侧上眼轮匝肌；(xii)一个单位剂量施用于内侧上眼轮匝肌；(xiii)一个单位剂量施用于外侧下眼轮匝肌；和/或(xiv)一个单位剂量施用于上睑提肌。
在涉及治疗非典型面肌痉挛的本发明的任何方面或实施方案中，本发明可以进一步包含：(i)将一个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受所述面肌痉挛影响的颧小肌；以及任选地根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个(例如2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、或13个或更多个)受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(ii)一个单位剂量施用于颧大肌；(iii)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；(iv)一个单位剂量施用于颏肌；(v)一个单位剂量施用于颈阔肌；(vi)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；(vii)一个单位剂量施用于颊肌；(viii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；(ix)一个单位剂量施用于降眉间肌；(x)一个单位剂量施用于鼻肌；(xi)一个单位剂量施用于外侧上眼轮匝肌；(xii)一个单位剂量施用于内侧上眼轮匝肌；(xiii)一个单位剂量施用于外侧下眼轮匝肌；和/或(xiv)一个单位剂量施用于上睑提肌。
在涉及治疗非典型面肌痉挛的本发明的任何方面或实施方案中，本发明可以进一步包含：(i)将至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)修饰的BoNT/A施用于额肌；以及任选地根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个(例如2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、或13个或更多个)受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(ii)一个单位剂量施用于颧小肌；(iii)一个单位剂量施用于颧大肌；(iv)一个单位剂量施用于颏肌；(v)一个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于颈阔肌；(vi)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；(vii)一个单位剂量施用于颊肌；(viii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；(ix)一个单位剂量施用于降眉间肌；(x)一个单位剂量施用于鼻肌；(xi)一个单位剂量施用于外侧上眼轮匝肌；(xii)一个单位剂量施用于内侧上眼轮匝肌；(xiii)一个单位剂量施用于外侧下眼轮匝肌；和/或(xiv)一个单位剂量施用于上睑提肌。
在涉及治疗非典型面肌痉挛的本发明的任何方面或实施方案中，本发明可以进一步包含：(i)将一个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受所述面肌痉挛影响的颏肌；以及任选地根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个(例如，2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、或13个或更多个)受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(ii)一个单位剂量施用于颧小肌；(iii)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；(iv)一个单位剂量施用于颧大肌；(v)一个单位剂量施用于颈阔肌；(vi)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；(vii)一个单位剂量施用于颊肌；(viii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；(ix)一个单位剂量施用于降眉间肌；(x)一个单位剂量施用于鼻肌；(xi)一个单位剂量施用于外侧上眼轮匝肌；(xii)一个单位剂量施用于内侧上眼轮匝肌；(xiii)一个单位剂量施用于外侧下眼轮匝肌；和/或(xiv)一个单位剂量施用于上睑提肌。
在涉及治疗非典型面肌痉挛的本发明的任何方面或实施方案中，本发明可以进一步包含：(i)将一个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受所述面肌痉挛影响的颈阔肌；以及任选地根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个(例如，2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、或13个或更多个)受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(ii)一个单位剂量施用于颧小肌；(iii)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；(iv)一个单位剂量施用于颏肌；(v)一个单位剂量施用于颧大肌；(vi)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；(vii)一个单位剂量施用于颊肌；(viii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；(ix)一个单位剂量施用于降眉间肌；(x)一个单位剂量施用于鼻肌；(xi)一个单位剂量施用于外侧上眼轮匝肌；(xii)一个单位剂量施用于内侧上眼轮匝肌；(xiii)一个单位剂量施用于外侧下眼轮匝肌；和/或(xiv)一个单位剂量施用于上睑提肌。
在涉及治疗非典型面肌痉挛的本发明的任何方面或实施方案中，本发明可以进一步包含：(i)将至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)的修饰的BoNT/A施用于受所述面肌痉挛影响的皱眉肌；以及任选地根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个(例如，2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、或13个或更多个)受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(ii)一个单位剂量施用于颧小肌；(iii)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；(iv)一个单位剂量施用于颏肌；(v)一个单位剂量施用于颈阔肌；(vi)一个单位剂量施用于颧大肌；(vii)一个单位剂量施用于颊肌；(viii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；(ix)一个单位剂量施用于降眉间肌；(x)一个单位剂量施用于鼻肌；(xi)一个单位剂量施用于外侧上眼轮匝肌；(xii)一个单位剂量施用于内侧上眼轮匝肌；(xiii)一个单位剂量施用于外侧下眼轮匝肌；和/或(xiv)一个单位剂量施用于上睑提肌。
在涉及治疗非典型面肌痉挛的本发明的任何方面或实施方案中，本发明可以进一步包含：(i)将一个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受所述面肌痉挛影响的颊肌；以及任选地根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个(例如，2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、或13个或更多个)受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(ii)一个单位剂量施用于颧小肌；(iii)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；(iv)一个单位剂量施用于颏肌；(v)一个单位剂量施用于颈阔肌；(vi)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；(vii)一个单位剂量施用于颧大肌；(viii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；(ix)一个单位剂量施用于降眉间肌；(x)一个单位剂量施用于鼻肌；(xi)一个单位剂量施用于外侧上眼轮匝肌；(xii)一个单位剂量施用于内侧上眼轮匝肌；(xiii)一个单位剂量施用于外侧下眼轮匝肌；和/或(xiv)一个单位剂量施用于上睑提肌。
在涉及治疗非典型面肌痉挛的本发明的任何方面或实施方案中，本发明可以进一步包含：(i)将至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)的修饰的BoNT/A施用于受所述面肌痉挛影响的咬肌；以及任选地根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个(例如，2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、或13个或更多个)受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(ii)一个单位剂量施用于颧小肌；(iii)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；(iv)一个单位剂量施用于颏肌；(v)一个单位剂量施用于颈阔肌；(vi)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；(vii)一个单位剂量施用于颊肌；(viii)一个单位剂量施用于颧大肌；(ix)一个单位剂量施用于降眉间肌；(x)一个单位剂量施用于鼻肌；(xi)一个单位剂量施用于外侧上眼轮匝肌；(xii)一个单位剂量施用于内侧上眼轮匝肌；(xiii)一个单位剂量施用于外侧下眼轮匝肌；和/或(xiv)一个单位剂量施用于上睑提肌。
在涉及治疗非典型面肌痉挛的本发明的任何方面或实施方案中，本发明可以进一步包含：(i)将一个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受所述面肌痉挛影响的降眉间肌；以及任选地根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个(例如，2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、或13个或更多个)受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(ii)一个单位剂量施用于颧小肌；(iii)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；(iv)一个单位剂量施用于颏肌；(v)一个单位剂量施用于颈阔肌；(vi)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；(vii)一个单位剂量施用于颊肌；(viii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；(ix)一个单位剂量施用于颧大肌；(x)一个单位剂量施用于鼻肌；(xi)一个单位剂量施用于外侧上眼轮匝肌；(xii)一个单位剂量施用于内侧上眼轮匝肌；(xiii)一个单位剂量施用于外侧下眼轮匝肌；和/或(xiv)一个单位剂量施用于上睑提肌。
在涉及治疗非典型面肌痉挛的本发明的任何方面或实施方案中，本发明可以进一步包含：(i)将一个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受所述面肌痉挛影响的鼻肌；以及任选地根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个(例如，2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、或13个或更多个)受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(ii)一个单位剂量施用于颧小肌；(iii)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；(iv)一个单位剂量施用于颏肌；(v)一个单位剂量施用于颈阔肌；(vi)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；(vii)一个单位剂量施用于颊肌；(viii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；(ix)一个单位剂量施用于降眉间肌；(x)一个单位剂量施用于颧大肌；(xi)一个单位剂量施用于外侧上眼轮匝肌；(xii)一个单位剂量施用于内侧上眼轮匝肌；(xiii)一个单位剂量施用于外侧下眼轮匝肌；和/或(xiv)一个单位剂量施用于上睑提肌。
在涉及治疗非典型面肌痉挛的本发明的任何方面或实施方案中，本发明可以进一步包含：(i)将一个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受所述面肌痉挛影响的外侧上眼轮匝肌；以及任选地根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个(例如，2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、或13个或更多个)受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(ii)一个单位剂量施用于颧小肌；(iii)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；(iv)一个单位剂量施用于颏肌；(v)一个单位剂量施用于颈阔肌；(vi)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；(vii)一个单位剂量施用于颊肌；(viii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；(ix)一个单位剂量施用于降眉间肌；(x)一个单位剂量施用于鼻肌；(xi)一个单位剂量施用于颧大肌；(xii)一个单位剂量施用于内侧上眼轮匝肌；(xiii)一个单位剂量施用于外侧下眼轮匝肌；和/或(xiv)一个单位剂量施用于上睑提肌。
在涉及治疗非典型面肌痉挛的本发明的任何方面或实施方案中，本发明可以进一步包含：(i)将一个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受所述面肌痉挛影响的内侧上眼轮匝肌；以及任选地根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个(例如，2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、或13个或更多个)受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(ii)一个单位剂量施用于颧小肌；(iii)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；(iv)一个单位剂量施用于颏肌；(v)一个单位剂量施用于颈阔肌；(vi)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；(vii)一个单位剂量施用于颊肌；(viii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；(ix)一个单位剂量施用于降眉间肌；(x)一个单位剂量施用于鼻肌；(xi)一个单位剂量施用于外侧上眼轮匝肌；(xii)一个单位剂量施用于颧大肌；(xiii)一个单位剂量施用于外侧下眼轮匝肌；和/或(xiv)一个单位剂量施用于上睑提肌。
在涉及治疗非典型面肌痉挛的本发明的任何方面或实施方案中，本发明可以进一步包含：(i)将一个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受所述面肌痉挛影响的外侧下眼轮匝肌；以及任选地根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个(例如，2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、或13个或更多个)受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(ii)一个单位剂量施用于颧小肌；(iii)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；(iv)一个单位剂量施用于颏肌；(v)一个单位剂量施用于颈阔肌；(vi)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；(vii)一个单位剂量施用于颊肌；(viii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；(ix)一个单位剂量施用于降眉间肌；(x)一个单位剂量施用于鼻肌；(xi)一个单位剂量施用于外侧上眼轮匝肌；(xii)一个单位剂量施用于内侧上眼轮匝肌；(xiii)一个单位剂量施用于颧大肌；和/或(xiv)一个单位剂量施用于上睑提肌。
在涉及治疗非典型面肌痉挛的本发明的任何方面或实施方案中，本发明可以进一步包含：(i)将一个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受所述面肌痉挛影响的上睑提肌；以及任选地根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于一个或多个(例如，2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、或13个或更多个)受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(ii)一个单位剂量施用于颧小肌；(iii)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；(iv)一个单位剂量施用于颏肌；(v)一个单位剂量施用于颈阔肌；(vi)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；(vii)一个单位剂量施用于颊肌；(viii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；(ix)一个单位剂量施用于降眉间肌；(x)一个单位剂量施用于鼻肌；(xi)一个单位剂量施用于外侧上眼轮匝肌；(xii)一个单位剂量施用于内侧上眼轮匝肌；(xiii)一个单位剂量施用于外侧下眼轮匝肌；和/或(xiv)一个单位剂量施用于颧大肌。
可以在一个或多个注射部位施用单个单位剂量。当在一个以上的注射部位施用单个单位剂量时，该单位剂量可以在两个或更多个注射部位之间分配(相等或不相等)。然而，优选每个注射部位施用单个单位剂量。
术语“施用单个单位剂量”是指施用基本上全部单个单位剂量。例如，单位剂量的残余量(例如，至多1％、0.1％或0.01％)可以保留在已重新配制的修饰的BoNT/A的小瓶中。然而，优选施用全部单个单位剂量(例如，在一个或多个注射部位，优选每个注射部位)。该定义类似地适用于施用两个单位剂量、三个单位剂量等。
根据本发明使用的修饰的BoNT/A的效力可以根据标准技术通过小鼠LD50测定来确定。在所述测定中，1单位被定义为对应于计算的小鼠半数致死量(LD50)的修饰的BoNT/A的量。优选地，计算的小鼠腹腔内半数致死量。
当用于本发明的修饰的BoNT/A是包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)的修饰的BoNT/A时，在所述测定中对应于1单位的修饰的BoNT/A的量优选为24.04pg。
其中用于本发明的修饰的BoNT/A是这样一种修饰的BoNT/A，其包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，其中修饰选自：用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；用不带电的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；用碱性氨基酸残基取代不带电的表面暴露的氨基酸残基；插入碱性氨基酸残基；以及缺失酸性表面暴露的氨基酸残基，在所述测定中对应于1单位的修饰的BoNT/A的量优选为8.44pg。
术语“至多”当用于指一个值(例如，至多24000pg)时表示至多且包括所述值。因此，例如，提及施用“至多24000pg”修饰的BoNT/A包括施用24000pg修饰的BoNT/A以及施用少于24000pg修饰的BoNT/A。
可以用修饰的BoNT/A的量、修饰的BoNT/A的单位或其组合来表示单位剂量。
施用的单位剂量的总数可以是至多20、15、10、5或3。施用的单位剂量的总数可以是至少3、5、10或15。施用的单位剂量的总数可以是3至20、或5至12。在一个实施方案中，施用5个单位剂量。在一个实施方案中，施用6个单位剂量。在一个实施方案中，施用10个单位剂量。在一个实施方案中，施用12个单位剂量。在一个实施方案中，施用15个单位剂量。
当受试者近期已接受(或随后将接受)梭菌神经毒素(例如，BoNT)的附加治疗时，例如，作为美容治疗或不同适应症治疗的一部分，技术人员将予以考虑。使用本领域常规技术，技术人员将相应地调整本治疗方案。优选地，本发明排除用另一种梭菌神经毒素(例如，BoNT)进行治疗。
与未修饰的BoNT/A(例如，)相比，本发明的修饰的BoNT/A优选具有更长的作用持续时间。所述作用持续时间可以至少长1.25倍、1.5倍、1.75倍、2.0倍或2.25倍。修饰的BoNT/A的作用持续时间可以在6至9个月之间。例如，作用持续时间可以是至少：4.5个月(从发病开始)、5.0个月、5.5个月、6个月、6.5个月、7.0个月、7.5个月、8.0个月、8.5个月或9.0个月。在特定实施方案中，作用持续时间可以大于9.0个月。
可以在施用修饰的BoNT/A之后的适当时间内重复治疗。鉴于作用持续时间大约为未修饰的BoNT/A(例如Dysport)的作用持续时间的两倍，因此与用未修饰的BoNT/A(例如，)治疗的受试者相比，后续施用之间的间隔时间适当更长。受试者可以在前次施用后至少18、20、25或30周再次施用根据本发明的修饰的BoNT/A。例如，受试者可以在前次施用后至少18至45周、优选20至35周再次施用本发明的修饰的BoNT/A。
如本文所用，“受试者”可以是哺乳动物，如人或其他哺乳动物。优选地，“受试者”是指人类受试者。“受试者”优选为成年受试者，即至少18岁的受试者。术语“受试者”和“患者”在本文中同义使用。
如本文所用，术语“治疗(treat或treating)”包括预防性治疗(例如，防止疾病发作)和矫正性治疗(对已患有疾病的受试者的治疗)。优选地，如本文所用，“治疗”是指矫正性性治疗。如本文所用，术语“治疗”是指疾病和/或其症状。
WO 2015/004461 A1和WO 2017/191315中描述了合适的修饰的BoNT/A多肽(以及编码该多肽的核苷酸序列(如果存在的话))，这两篇文献均通过引用整体并入本文。
BoNT/A是梭菌属(Clostridia)细菌产生的梭菌神经毒素的一个实例。此类梭菌神经毒素的其他实例包括由破伤风梭菌(C.tetani)(TeNT)和肉毒梭菌(C.botulinum)(BoNT)血清型B至G产生的毒素，以及由巴拉蒂梭菌(C.baratii)和丁酸梭菌(C.butyricum)产生的毒素。所述神经毒素具有极强效力和特异性，能够毒害神经元及其所递送到的其他细胞。梭菌毒素是已知的最强效毒素之一。例如，取决于血清型，肉毒神经毒素对小鼠的半数致死量(LD50)值为0.5至5ng/kg。破伤风和肉毒毒素都通过抑制受影响神经元的功能、特别是神经递质释放来发挥作用。肉毒毒素作用于神经肌肉接头并抑制外周神经系统中的胆碱能传递，而破伤风毒素则作用于中枢神经系统。
在自然界中，梭菌神经毒素(包括BoNT/A)合成为单链多肽，通过蛋白水解切割事件进行翻译后修饰，形成两条通过二硫键连接在一起的多肽链。切割发生在特定的切割位点，通常称为活化位点，位于提供链间二硫键的半胱氨酸残基之间。这种双链形式正是毒素的活性形式。这两条链被称为重链(H链)和轻链(L链)，重链的分子量为约100kDa，轻链的分子量为约50kDa。H链包含N末端易位组分(HN结构域)和C末端靶向组分(HC结构域)。切割位点位于L链和易位结构域组分之间。在HC结构域与其靶神经元结合并将结合的毒素经由内体内化到细胞中后，HN结构域将L链易位穿过内体膜并进入胞质溶胶，L链提供蛋白酶功能(也称为非细胞毒性蛋白酶)。
非细胞毒性蛋白酶通过蛋白水解切割细胞内转运蛋白(例如，SNAP-25、VAMP或突触融合蛋白(Syntaxin))发挥作用——参见Gerald K(2002)《细胞和分子生物学(Cell andMolecular Biology)》(第4版)John Wiley&Sons出版社。缩写“SNARE”源自术语“可溶性NSF附着受体”，其中NSF表示N-乙基马来酰亚胺敏感因子。SNARE蛋白是细胞内囊泡融合的组成部分，因此也是细胞通过囊泡转运分泌分子的组成部分。蛋白酶功能是一种锌依赖性内肽酶活性，对SNARE蛋白具有高度底物特异性。因此，一旦递送至期望的靶细胞，非细胞毒性蛋白酶能够抑制靶细胞的细胞分泌。梭菌毒素的L链蛋白酶是切割SNARE蛋白的非细胞毒性蛋白酶。
鉴于SNARE蛋白的普遍性质，梭菌神经毒素(如肉毒毒素)已成功用于广泛的治疗中。
关于肉毒梭菌和破伤风梭菌产生毒素的遗传基础的进一步细节，参见Henderson等人(1997)《梭菌：分子生物学和发病机理(The Clostridia:Molecular Biology andPathogenesis)》，Academic出版社。
如上所述，梭菌神经毒素由两条多肽链形成，重链(H链)的分子量为约100kDa，轻链(L链)的分子量为约50kDa。H链包含C末端靶向组分(受体结合结构域或HC结构域)和N末端易位组分(HN结构域)。
下文对梭菌神经毒素结构域进行更详细的描述。
L链参考序列的实例包括：
A型肉毒神经毒素：氨基酸残基1至448
B型肉毒神经毒素：氨基酸残基1至440
以上确定的参考序列应被视为指引，因为根据亚血清型，可能会发生轻微变化。例如，US2007/0166332(通过引用整体并入本文)引用了略微不同的梭菌序列：
A型肉毒神经毒素：氨基酸残基M1至K448
B型肉毒神经毒素：氨基酸残基M1至K441
易位结构域是梭菌神经毒素H链的片段，大约相当于H链氨基末端的一半、或对应于完整H链中该片段的结构域。
参考易位结构域的实例包括：
A型肉毒神经毒素——氨基酸残基(449至871)
B型肉毒神经毒素——氨基酸残基(441至858)
以上确定的参考序列应被视为指引，因为根据亚血清型，可能会发生轻微变化。例如，US2007/0166332(通过引用并入本文)引用了略微不同的梭菌序列：
A型肉毒神经毒素——氨基酸残基(A449至K871)
B型肉毒神经毒素——氨基酸残基(A442至S858)
在本发明的上下文中，包含易位结构域的多种BoNT/A HN区域可用于本发明的方面。BoNT/A重链的HN区长度为大约410至430个氨基酸，并且包含易位结构域。研究已表明，梭菌神经毒素重链HN区的全长对于易位结构域的易位活性而言并非必需。因此，该实施方案的方面可包括BoNT/A HN区，该BoNT/A HN区包含易位结构域，易位结构域的长度为例如至少350个氨基酸、至少375个氨基酸、至少400个氨基酸或至少425个氨基酸。该实施方案的其他方面可包括BoNT/A HN区，该BoNT/A HN区包含易位结构域，易位结构域的长度为例如至多350个氨基酸、至多375个氨基酸、至多400个氨基酸或至多425个氨基酸。
术语HN包括天然存在的BoNT/A HN部分和修饰的BoNT/A HN部分，它们具有天然不存在的氨基酸序列和/或合成氨基酸残基。优选地，所述修饰的BoNT/A HN部分仍然显示上述易位功能。
梭菌神经毒素受体结合结构域(HC)参考序列的实例包括：
BoNT/A——N872至L1296
BoNT/B——E859至E1291
梭菌神经毒素(如BoNT)的约50kDa HC结构域包含两个不同的结构特征，称为HCC和HCN结构域，每个结构域的分子量通常为约25kDa。据认为，参与受体结合的氨基酸残基主要位于HCC结构域。天然梭菌神经毒素的HC结构域可包含大约400至440个氨基酸残基。以下公开文献证实了这一事实，通过引用将其整体并入本文：Umland TC(1997)Nat.Struct.Biol.4:788-792；Herreros J(2000)Biochem.J.347:199-204；Halpern J(1993)J.Biol.Chem.268:15,第11188-11192页；Rummel A(2007)PNAS104:359-364；LaceyDB(1998)Nat.Struct.Biol.5:898-902；Knapp(1998)Am.Cryst.Assoc.Abstract Papers25:90；Swaminathan和Eswaramoorthy(2000)Nat.Struct.Biol.7:1751-1759；以及RummelA(2004)Mol.Microbiol.51(3),631-643。
(参考)HCN结构域的实例包括：
A型肉毒神经毒素——氨基酸残基(872至1110)
B型肉毒神经毒素——氨基酸残基(859至1097)
根据血清型/亚型，上述序列位置可能略有不同，(参考)HCN结构域的进一步实例包括：
A型肉毒神经毒素——氨基酸残基(874至1110)
B型肉毒神经毒素——氨基酸残基(861至1097)
(参考)HCC结构域的实例包括：
A型肉毒神经毒素——氨基酸残基(Y1111至L1296)
B型肉毒神经毒素——氨基酸残基(Y1098至E1291)
L链和HN结构域(任选地包括完整或部分激活环，例如，当修饰的BoNT/A为单链形式时为完整激活环，当为双链形式时为切割/部分激活环)可统称为LHN结构域。因此，LHN结构域不进一步包含HC结构域。
用于本发明的修饰的BoNT/A可以是这样一种修饰的BoNT/A，其包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277。与使用已知的BoNT/A相比，此类修饰的BoNT/A证明副作用减少或不存在。本发明的修饰的BoNT/A的组织保留特性增加，这也增加了效力和/或作用持续时间，并且与已知的梭菌毒素治疗剂相比，可以允许减少使用剂量(或增加剂量而不产生任何其他副作用)，从而提供了进一步的优点。
当与如SEQ ID NO：2所示的未修饰的BoNT/A相比时，修饰可以是如下修饰，其中通过与SEQ ID NO：2比对来确定氨基酸残基编号。由于SEQ ID NO：2(以及对应于本文所述修饰的BoNT/A多肽的SEQ ID NO)的位置1处存在甲硫氨酸残基是任选的，技术人员在确定氨基酸残基编号时会考虑是否存在甲硫氨酸残基。例如，当SEQ ID NO：2包括甲硫氨酸时，位置编号将如上定义(例如，ASN 886将是SEQ ID NO：2的ASN 886)。可替代地，当SEQ ID NO：2中缺少甲硫氨酸时，氨基酸残基编号应被修改-1(例如，ASN 886将是SEQ ID NO：2的ASN885)。当本文所述的其他多肽序列的位置1存在/不存在甲硫氨酸时，也适用类似的考虑，并且技术人员将容易使用本领域常规技术来确定正确的氨基酸残基编号。
可以使用本文所述的用于确定序列同源性和/或序列同一性百分比的任何方法来进行本文所述的用于确定氨基酸残基编号的比对。
指示进行修饰的氨基酸残基是表面暴露的氨基酸残基。
修饰的BoNT/A可以包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1052、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277。修饰的BoNT/A可以由与选自SEQ ID NO：3、5、7和9的核酸序列具有至少70％序列同一性的核酸序列编码。例如，与选自SEQ ID NO：3、5、7和9的核酸序列具有至少80％、90％、95％或99.9％序列同一性的核酸序列。优选地，用于本发明的修饰的BoNT/A可以由包含(或由其组成)SEQ ID NO：3、5、7或9的核酸编码。修饰的BoNT/A可以包含与选自SEQ ID NO：4、6、8和10的多肽序列具有至少70％序列同一性的多肽序列。例如，与选自SEQ ID NO：4、6、8和10的多肽序列具有至少80％、90％、95％或99.9％序列同一性的多肽序列。优选地，用于本发明的修饰的BoNT/A可以包含(更优选由其组成)选自SEQ ID NO：4、6、8和10的多肽序列。
当在修饰的BoNT/A的上下文中使用时，术语“一个或多个氨基酸残基”优选表示至少2、3、4、5、6或7个指定的氨基酸残基。因此，修饰的BoNT/A可以包含在指定的氨基酸残基处至少2、3、4、5、6或7个(优选7个)修饰。修饰的BoNT/A可以包含1至30个、3至20个或5至10个氨基酸修饰。更优选地，当在修饰的BoNT/A的上下文中使用时，术语“一个或多个氨基酸残基”表示全部指定的氨基酸残基。
优选地，与SEQ ID NO：2相比，除了指定的氨基酸残基处的一个或多个氨基酸修饰之外，修饰的BoNT/A不含有任何进一步的氨基酸修饰。
最优选地，修饰的BoNT/A包含(更优选地由其组成)在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 930、SER 955、GLN 991、ASN 1026、ASN 1052和GLN 1229。修饰的BoNT/A可以由与SEQ ID NO：3具有至少70％序列同一性的核酸序列编码。例如，与SEQID NO：3具有至少80％、90％、95％或99.9％序列同一性的核酸序列。优选地，用于本发明的修饰的BoNT/A可以由包含(或由其组成)SEQ ID NO：3的核酸编码。修饰的BoNT/A可以包含与SEQ ID NO：4具有至少70％序列同一性的多肽序列。例如，与SEQ ID NO：4具有至少80％、90％、95％或99.9％序列同一性的多肽序列。优选地，用于本发明的修饰的BoNT/A可以包含(更优选由其组成)SEQ ID NO：4。
修饰可以选自：
i.用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
ii.用不带电的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
iii.用碱性氨基酸残基取代不带电的表面暴露的氨基酸残基；
iv.插入碱性氨基酸残基；以及
v.缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。
与相应的未修饰的BoNT/A相比，上述修饰导致修饰的BoNT/A的正表面电荷增加且等电点增加。
等电点(pI)是给定蛋白质的特定性质。本领域中众所周知，蛋白质由特定的氨基酸(在蛋白质中也称为氨基酸残基)序列组成。20种标准氨基酸中的每种氨基酸都有不同的侧链(或R基团)，这意味着蛋白质中的每种氨基酸残基都显示出不同的化学性质，如电荷和疏水性。这些性质可能会受到周围化学环境的影响，如温度和pH值。蛋白质的整体化学特性将取决于这些不同因素的总和。
某些氨基酸残基(下文详述)具有可电离的侧链，侧链可根据周围的pH显示电荷。在给定pH下，此类侧链是否带电取决于相关可电离部分的pKa，其中pKa是特定质子离开共轭碱基的酸解离常数(Ka)的负对数。
例如，酸性残基(如天冬氨酸和谷氨酸)具有pKa值为大约4.1的侧链羧酸基团(精确的pKa值可取决于温度、离子强度和可电离基团的微环境)。因此，这些侧链在pH为7.4(通常称为“生理pH”)时显示出负电荷。在低pH值下，这些侧链将质子化并失去其电荷。
相反，碱性残基(如赖氨酸和精氨酸)具有pKa值为大约10至12的含氮侧链基团。因此，这些侧链在pH 7.4时显示出正电荷。在高pH值下，这些侧链将去质子化并失去其电荷。
因此，蛋白质分子的总(净)电荷取决于蛋白质中存在的酸性和碱性残基的数量(及其表面暴露程度)以及周围的pH值。改变周围的pH值会改变蛋白质的总电荷。因此，对于每种蛋白质来说，都有给定的pH值，在该pH值下，正电荷和负电荷的数量相等，蛋白质不显示总净电荷。这个点被称为等电点(pI)。等电点是蛋白质生物化学中的标准概念，技术人员对此非常熟悉。
因此，等电点(pI)被定义为蛋白质显示净电荷为零时的pH值。pI增加意味着蛋白质显示净电荷为零需要更高的pH值。因此，pI增加代表在给定pH下蛋白质的净正电荷增加。相反，pI减少意味着蛋白质显示净电荷为零需要更低的pH值。因此，pI减少代表给定pH下蛋白质的净正电荷减少。
测定蛋白质pI的方法是本领域已知的，并且是技术人员所熟知的。例如，可以由蛋白质中存在的每种氨基酸的平均pKa值来计算蛋白质的pI(“计算的pI”)。可以使用本领域已知的计算机程序来执行此类计算，如来自ExPASy的Compute pI/MW工具(https://web.expasy.org/compute_pi/)，这是根据本发明计算pI的优选方法。应当使用相同的计算技术/程序来比较不同分子之间的pI值。
在适当情况下，可以使用等电聚焦技术通过实验证实蛋白质的计算的pI(“观察的pI”)。这项技术使用电泳根据蛋白质的pI来分离蛋白质。通常使用具有固定pH梯度的凝胶进行等电聚焦。当施加电场时，蛋白质通过pH梯度迁移，直到其达到净电荷为零的pH，该点为蛋白质的pI。由等电聚焦提供的结果通常本质上分辨率相对较低，因此，本发明人认为由计算的pI(如上所述)提供的结果更适合使用。
在本说明书全文中，除非另有说明，“pI”是指“计算的pI”。
通过改变蛋白质表面显示的碱性和/或酸性基团的数量，可以减少或增加蛋白质的pI。这可以通过修饰蛋白质的一个或多个氨基酸来实现。例如，可以通过减少酸性残基的数量或增加碱性残基的数量来增加pI。
与未修饰的BoNT/A(例如，SEQ ID NO：2)的pI值相比，本发明的修饰的BoNT/A的pI值可以高至少0.2、0.4、0.5或1个pI单位。优选地，修饰的BoNT/A的pI可以是至少6.6，例如至少6.8。
20种标准氨基酸的性质如下表所示：
以下氨基酸被认为是带电氨基酸：天冬氨酸(阴性)、谷氨酸(阴性)、精氨酸(阳性)和赖氨酸(阳性)。
当pH为7.4时，天冬氨酸(pKa 3.1)和谷氨酸(pKa 4.1)的侧链带负电荷，而精氨酸(pKa 12.5)和赖氨酸(pKa 10.8)的侧链带正电荷。天冬氨酸和谷氨酸被称为酸性氨基酸残基。精氨酸和赖氨酸被称为碱性氨基酸残基。
以下氨基酸被认为是不带电的极性(意味着它们可以参与氢键合)氨基酸：天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸和色氨酸。
以下氨基酸被认为是不带电的疏水性氨基酸：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸和甘氨酸。
在氨基酸插入中，将另外的氨基酸残基(正常情况下不存在的残基)掺入BoNT/A多肽序列中，从而增加了所述序列中氨基酸残基的总数。在氨基酸缺失中，从梭菌毒素氨基酸序列中去除氨基酸残基，从而减少了所述序列中氨基酸残基的总数。
优选地，修饰是取代，其有利地维持修饰的BoNT/A中具有相同数量的氨基酸残基。在氨基酸取代中，形成BoNT/A多肽序列一部分的氨基酸残基被不同的氨基酸残基置换。如上所述，置换氨基酸残基可以是20种标准氨基酸之一。可替代地，氨基酸取代中的置换氨基酸可以是非标准氨基酸(不属于上述20种标准氨基酸)。例如，置换氨基酸可以是碱性非标准氨基酸，例如L-鸟氨酸、L-2-氨基-3-胍基丙酸、或赖氨酸、精氨酸和鸟氨酸的D-异构体。将非标准氨基酸引入蛋白质中的方法是本领域已知的，包括使用大肠杆菌(E.coli)营养缺陷型表达宿主进行重组蛋白质合成。
在一个实施方案中，取代选自：用碱性氨基酸残基取代酸性氨基酸残基、用不带电的氨基酸残基取代酸性氨基酸残基、以及用碱性氨基酸残基取代不带电的氨基酸残基。在一个实施方案中，其中取代是用不带电的氨基酸残基取代酸性氨基酸残基，酸性氨基酸残基被其相应的不带电的酰胺氨基酸残基置换(即，天冬氨酸被天冬酰胺置换，谷氨酸被谷氨酰胺置换)。
优选地，碱性氨基酸残基是赖氨酸残基或精氨酸残基。换言之，取代是用赖氨酸或精氨酸进行取代。最优选地，修饰是用赖氨酸进行取代。
根据本发明进行修饰后，修饰的BoNT/A能够与未修饰的BoNT/A(例如，SEQ ID NO：2)所结合的靶细胞受体结合。
用于本发明的修饰的BoNT/A可以包含位于梭菌毒素HCN结构域中的4至40个氨基酸修饰。所述修饰的BoNT/A优选还具有至少6.6的pI。所述修饰的BoNT/A优选包含选自以下的至少4个氨基酸的修饰：ASN 886、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、ASN 1025、ASN 1026和ASN 1052，其中所述修饰包含用赖氨酸残基或精氨酸残基取代氨基酸。例如，所述修饰的BoNT/A或其片段可以包含选自以下的至少5个氨基酸的修饰：ASN 886、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1052和GLN 1229，其中所述修饰包含用赖氨酸残基或精氨酸残基取代氨基酸。
最优选地，用于本发明的修饰的BoNT/A可以包含BoNT/A轻链和易位结构域(BoNT/A LHN结构域)和BoNT/B HC结构域。BoNT/A LHN结构域与BoNT/B HC结构域共价连接。所述修饰的BoNT/A在本文中也被称为“BoNT/AB”或“BoNT/AB嵌合体”。
LHN结构域的C末端氨基酸残基可对应于分隔BoNT/A的LHN和HC结构域的310螺旋的第一个氨基酸残基，HC结构域的N末端氨基酸残基可对应于BoNT/B的分隔LHN和HC结构域的310螺旋的第二个氨基酸残基。
一个BoNT/B多肽序列的实例提供为SEQ ID NO：16(UniProt登录号B1INP5)。
本文提到的“分隔BoNT/A的LHN和HC结构域的310螺旋的第一个氨基酸残基”是指分隔LHN和HC结构域的310螺旋的N末端残基。
本文提到的“分隔BoNT/B的LHN和HC结构域的310螺旋的第二个氨基酸残基”是指分隔LHN和HC结构域的310螺旋的N末端残基之后的氨基酸残基。
“310螺旋”是在蛋白质和多肽中发现的一种二级结构，与α螺旋、β折叠及反转一起存在。310螺旋中的氨基酸以右旋螺旋结构排列，其中每一整圈由三个残基和十个原子完成，这十个原子分隔了它们之间的分子内氢键。每个氨基酸对应于螺旋中的120°圈(即，螺旋每圈有三个残基)，沿螺旋轴平移(＝0.2nm)，并且在通过形成氢键而形成的环中有10个原子。最重要的是，氨基酸的N-H基团与氨基酸三个残基之前的C＝O基团形成氢键；该重复的i+3→i氢键定义了一个310螺旋。310螺旋是技术人员熟悉的结构生物学中的标准概念。
该310螺旋对应于形成实际螺旋的四个残基和两个帽(或过渡)残基，这四个残基的每一端各有一个。如本文所用，术语“分隔LHN和HC结构域的310螺旋”由这6个残基组成。
通过进行结构分析和序列比对，鉴定出分隔LHN和HC结构域的310螺旋。该310螺旋在其N末端(即，LHN结构域的C末端部分)被α螺旋包围，在其C末端(即，HC结构域的N末端部分)被β链包围。310螺旋的第一个(N末端)残基(帽或过渡残基)也对应于该α螺旋的C末端残基。
例如，可以由公开可得的肉毒神经毒素晶体结构中确定分隔LHN和HC结构域的310螺旋，例如3BTA(http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do？structureId＝3BTA)和1EPW(http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do？structureId＝1EPW)分别用于A1型和B1型肉毒神经毒素。
可公开获得的计算机模拟建模和比对工具也可用于确定其他神经毒素中分隔LHN和HC结构域的310螺旋的位置，例如同源建模服务器LOOPP(学习、观察和输出蛋白质模式，http://loopp.org)、PHYRE(蛋白质同源/相似识别引擎，http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/)和Rosetta(https://www.rosettacommons.org/)、蛋白质叠加服务器SuperPose(http://wishart.biology.ualberta.ca/superpose/)、比对程序Clustal Omega(http://www.clustal.org/omega/)以及分子和细胞生物学家互联网资源中列出的许多其他工具/服务(http://molbiol-tools.ca/)。特别地，“HN/HCN”结合点周围的区域可能在结构上高度保守，这使其成为叠加不同血清型的理想区域。
例如，以下方法可用于确定其他神经毒素中这种310螺旋的序列：
1.结构同源建模工具LOOP(http://loopp.org)可用于获得基于BoNT/A1晶体结构(3BTA.pdb)的其他BoNT血清型的预测结构；
2.如此获得的结构(pdb)文件可被编辑成仅包括HCN结构域的N末端及其之前的约80个残基(是HN结构域的一部分)，从而保留结构上高度保守的“HN/HCN”区；
3.蛋白质叠加服务器SuperPose(http://wishart.biology.ualberta.ca/superpose/)可用于将每个血清型叠加到3BTA.pdb结构上；
4.可以检查叠加的pdb文件以定位BoNT/A1的HC结构域起始处的310螺旋，然后可以鉴定其他血清型中的相应残基。
其他BoNT血清型序列可以用Clustal Omega进行比对，以检查相应的残基是否正确。
通过该方法确定的LHN、HC和310螺旋结构域的实例如下所示：
使用结构分析和序列比对，发现分离LHN和HC结构域的310螺旋之后的β链在所有肉毒梭菌和破伤风神经毒素中是保守结构，并且从分隔LHN和HC结构域的310螺旋的第一个残基起算第8个残基开始(例如，BoNT/A1的第879位残基)。
BoNT/AB嵌合体可以包含来自BoNT/A的LHN结构域，其与来自BoNT/B的HC结构域共价连接，其中LHN结构域的C末端氨基酸残基对应于位于BoNT/A的HC结构域起始端(N末端)的β链N末端的第8个氨基酸残基，并且其中HC结构域的N末端氨基酸残基对应于位于BoNT/A的HC结构域起始端(N末端)的β链N末端的第7个氨基酸残基。
BoNT/AB嵌合体可以包含来自BoNT/A的LHN结构域，其与来自BoNT/B的HC结构域共价连接，其中LHN结构域的C末端氨基酸残基对应于位于BoNT/A的LHN结构域末端(C末端)的α螺旋的C末端氨基酸残基，并且其中HC结构域的N末端氨基酸残基对应于位于BoNT/B的LHN结构域的末端(C末端)的α螺旋的C末端氨基酸残基的正好C末端的氨基酸残基。
BoNT/AB嵌合体设计过程的基本原理是试图确保二级结构不受损害，从而使三级结构和每个结构域功能的变化最小。不希望被理论所束缚，假设通过不破坏BoNT/AB嵌合体中310螺旋的四个中心氨基酸残基确保了嵌合神经毒素的最佳构象，从而允许嵌合神经毒素充分发挥其功能。事实上，令人意外的是，仅保留BoNT/A的310螺旋的第一个氨基酸残基和BoNT/B的310螺旋向前的第二个氨基酸残基，不仅使得产生可溶及功能性BoNT/AB嵌合体，而且还导致相对于其他BoNT/AB嵌合体性质有所改进，特别是效力增加、安全性比率增加和/或作用持续时间更长(以及与未修饰的BoNT/A相比，安全性比率和/或作用持续时间增加)。
BoNT/A轻链、BoNT/A易位结构域和/或BoNT/B HC结构域可以是修饰的BoNT/A轻链、BoNT/A易位结构域和/或BoNT/B HC结构域或其衍生物，包括但不限于下文所述的那些。与天然(未修饰的)形式的BoNT/A轻链、BoNT/A易位结构域和/或BoNT/B HC结构域相比，修饰的BoNT/A轻链、BoNT/A易位结构域和/或BoNT/B HC结构域可含有一个或多个修饰的氨基酸，或者可含有一个或多个不存在于天然(未修饰的)形式的BoNT/A轻链、BoNT/A易位结构域和/或BoNT/B HC结构域中的插入的氨基酸。例如，相对于天然(未修饰的)BoNT/A轻链、BoNT/A易位结构域和/或BoNT/B HC结构域序列，修饰的BoNT/A轻链、BoNT/A易位结构域和/或BoNT/B HC结构域可以在一个或多个结构域中具有修饰的氨基酸序列。此类修饰可以修饰其功能方面，例如生物活性或持久性。因此，在一个实施方案中，BoNT/A轻链、BoNT/A易位结构域和/或BoNT/B HC结构域是修饰的BoNT/A轻链、BoNT/A易位结构域和/或BoNT/B HC结构域，或修饰的BoNT/A轻链、BoNT/A易位结构域和/或BoNT/B HC结构域衍生物。
修饰的BoNT/B HC结构域可以具有一个或多个修饰，其修饰与靶神经细胞的结合，例如与天然(未修饰的)BoNT/B HC结构域相比，提供更高或更低的亲和力结合。BoNT/B HC结构域中的此类修饰可以包括修饰HC结构域的神经节苷脂结合位点或蛋白质(例如，突触结合蛋白)结合位点中的残基，这些残基改变了与神经节苷脂受体和/或靶神经细胞的蛋白质受体的结合。WO 2006/027207和WO 2006/114308中描述了此类修饰的神经毒素的实例，这两篇文献均通过引用整体并入本文。
修饰的轻链可以在其氨基酸序列中具有一个或多个修饰，例如底物结合或催化结构域中的修饰，其可以对修饰的轻链的SNARE蛋白特异性进行改变或修改，优选条件是所述修饰不会催化灭活所述轻链。WO 2010/120766和US2011/0318385中描述了此类修饰的神经毒素的实例，这两篇文献均通过引用整体并入本文。
来自BoNT/A的LHN结构域可对应于SEQ ID NO：2的氨基酸残基1至872，或与其具有至少70％序列同一性的多肽序列。来自BoNT/A的LHN结构域可对应于SEQ ID NO：2的氨基酸残基1至872，或与其具有至少80％、90％或95％序列同一性的多肽序列。优选地，来自BoNT/A的LHN结构域对应于SEQ ID NO：2的氨基酸残基1至872。
来自BoNT/B的HC结构域可对应于SEQ ID NO：16的氨基酸残基860至1291，或与其具有至少70％序列同一性的多肽序列。来自BoNT/B的HC结构域可对应于SEQ ID NO：16的氨基酸残基860至1291，或与其具有至少80％、90％或95％序列同一性的多肽序列。优选地，来自BoNT/B的HC结构域对应于SEQ ID NO：16的氨基酸残基860至1291。
优选地，BoNT/AB嵌合体包含BoNT/A1 LHN结构域和BoNT/B1 HC结构域。更优选地，LHN结构域对应于BoNT/A1(SEQ ID NO：2)的氨基酸残基1至872，HC结构域对应于BoNT/B1(SEQ ID NO：16)的氨基酸残基860至1291。
优选地，BoNT/B HC结构域在HCC亚结构域中进一步包含至少一个氨基酸残基取代、添加或缺失，与天然BoNT/B序列相比，其具有增加BoNT/B神经毒素对人Syt II的结合亲和力的作用。WO 2013/180799和WO 2016/154534(二者均通过引用并入本文)中已公开了BoNT/B HCC亚结构域中合适的氨基酸残基取代、添加或缺失。
BoNT/B HCC亚结构域中合适的氨基酸残基取代、添加或缺失可以包括选自以下的取代突变：V1118M、Y1183M、E1191M、E1191I、E1191Q、E1191T、S1199Y、S1199F、S1199L、S1201V、E1191C、E1191V、E1191L、E1191Y、S1199W、S1199E、S1199H、W1178Y、W1178Q、W1178A、W1178S、Y1183C、Y1183P及其组合。
BoNT/B HCC亚结构域中合适的氨基酸残基取代、添加或缺失可以进一步包括选自以下的两种取代突变的组合：E1191M和S1199L、E1191M和S1199Y、E1191M和S1199F、E1191Q和S1199L、E1191Q和S1199Y、E1191Q和S1199F、E1191M和S1199W、E1191M和W1178Q、E1191C和S1199W、E1191C和S1199Y、E1191C和W1178Q、E1191Q和S1199W、E1191V和S1199W、E1191V和S1199Y、或E1191V和W1178Q。
BoNT/B HCC亚结构域中合适的氨基酸残基取代、添加或缺失也可以包括E1191M、S1199W和W1178Q这三种取代突变的组合。
最优选地，BoNT/B HCC亚结构域中合适的氨基酸残基取代、添加或缺失包括E1191M和S1199Y这两种取代突变的组合。例如，此类修饰存在于BoNT/AB嵌合体SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14中。
与如SEQ ID NO：16所示的未修饰的BoNT/B相比，修饰可以是这样一种修饰，其中通过与SEQ ID NO：16进行比对来确定氨基酸残基编号。由于SEQ ID NO：16(以及对应于本文所述修饰的BoNT/A多肽的SEQ ID NO)的位置1处甲硫氨酸残基的存在是任选的，技术人员在确定氨基酸残基编号时会考虑存在/不存在甲硫氨酸残基。例如，当SEQ ID NO：16包括甲硫氨酸时，位置编号将如上定义(例如，E1191将是SEQ ID NO：16的E1191)。可替代地，当SEQ ID NO：16中不存在甲硫氨酸时，氨基酸残基编号应被修改-1(例如，E1191将是SEQ IDNO：16的E1190)。当本文所述的其他多肽序列的位置1存在/不存在甲硫氨酸时，类似的考虑也适用，并且技术人员将容易使用本领域常规技术来确定正确的氨基酸残基编号。
用于本发明的修饰的BoNT/A可以包含与选自SEQ ID NO：11-15的多肽序列具有至少70％序列同一性的多肽序列。例如，与选自SEQ ID NO：11-15的多肽序列具有至少80％、90％、95％或99.9％序列同一性的多肽序列。优选地，用于本发明的修饰的BoNT/A可以包含(更优选由其组成)选自SEQ ID NO：11-15的多肽序列。
当修饰的BoNT/A是BoNT/AB嵌合体时，优选修饰的BoNT/A包含与SEQ ID NO：14具有至少70％序列同一性的多肽序列。例如，与SEQ ID NO：14具有至少80％、90％、95％或99.9％序列同一性的多肽序列。最优选地，用于本发明的修饰的BoNT/A可以包含(更优选由其组成)SEQ ID NO：14。
通过氨基酸残基的取代、插入或缺失来修饰蛋白质的方法是本领域已知的。例如，可以通过修饰编码BoNT/A的DNA序列(例如，编码未修饰的BoNT/A)来引入氨基酸修饰。这可以通过使用标准的分子克隆技术来实现，例如通过定点诱变，其中使用聚合酶用编码所期望氨基酸的短链DNA(寡核苷酸)来置换原始编码序列，或者通过用各种酶(例如，连接酶和限制性内切核酸酶)插入/缺失部分基因。可替代地，可以化学合成修饰的基因序列。
当本文所述的修饰的BoNT/A的多肽序列包含标签(例如，用于纯化的标签，如His标签)时，所述标签是任选的。优选地，在使用根据本发明的修饰的BoNT/A之前，移除所述标签。
如上所述，本文所述的修饰的BoNT/A的组织保留性质增强，这也提供了增加的效力和/或作用持续时间，并且可以允许增加剂量而无任何其他副作用。可定义这些有利性质的一种方式是根据修饰的BoNT/A的安全性比率。在这方面，可以通过测量相关动物模型(例如，小鼠，其中在施用7天内检测到体重减轻)中体重减轻的百分比来实验性评估梭菌毒素的不良作用(由毒素从施用部位扩散开引起)。相反，梭菌毒素的预期目标效应可以通过数字外展评分(DAS)测定进行实验评估，这是一种肌肉瘫痪的测量方法。可以通过将20μl在明胶磷酸盐缓冲液中配制的梭菌毒素注射到小鼠腓肠肌/比目鱼肌复合体中，然后使用Aoki的方法(Aoki KR,Toxicon 39:1815-1820；2001)来进行DAS测定。在DAS测定中，小鼠被尾巴短暂悬吊，以引起特征性的惊吓反应，其中小鼠伸展其后肢并外展其后肢。注射梭菌毒素后，按五分制对不同程度的脚趾外展进行评分(0＝正常至4＝脚趾外展和腿部伸展最大程度减少)。
本发明的修饰的BoNT/A(或用于比较的未修饰的BoNT/A)的安全性比率可以表示为体重下降10％所需的毒素量(在小鼠给药后的前7天内以峰值效应测量)与DAS评分为2所需的毒素量之间的比率。因此，高安全性比率分数是期望的，并且表明毒素能够有效地麻痹靶肌肉而几乎没有不期望的脱靶效应。本发明的修饰的BoNT/A的安全性比率高于同等的未修饰的(天然)BoNT/A的安全性比率。
因此，在一个实施方案中，本发明的修饰的BoNT/A的安全性比率大于7(例如，至少8、9、10、15、20、25、30、35、40、45或50)，其中安全性比率计算如下：体重变化-10％所需的毒素剂量(pg/小鼠)除以DAS ED50(pg/小鼠)[ED50＝产生DAS评分为2所需的剂量]。
在一个实施方案中，本发明的修饰的BoNT/A的安全性比率为至少10。在一个实施方案中，本发明的修饰的BoNT/A的安全性比率为至少15。
优选地，其中修饰的BoNT/A包含一个或多个选自以下的氨基酸残基：ASN 886、ASN930、ASN 954、SER 955、GLN 991、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1052、ASN 1188、ASP 1213、GLY1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，如本文所述，所述修饰的BoNT/A的安全性比率为至少20，更优选为至少22(例如，23至25)。
优选地，当修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B HC结构域时，修饰的BoNT/A的安全性比率为至少10，更优选至少12(例如，14至15)。
修饰的BoNT/A优选为非复合形式(即，不含天然存在的BoNT/A中的复合蛋白)。此类复合蛋白的实例包括神经毒素相关蛋白(NAP)和无毒非血凝素成分(NTNH)。然而，优选修饰的BoNT/A是重组修饰的BoNT/A。可以使用重组核酸技术产生本发明的此类修饰的BoNT/A。
在一个实施方案中，提供了一种核酸(例如，DNA)，其包含编码修饰的BoNT/A的核酸序列。在一个实施方案中，核酸序列被制备为包含启动子和终止子的DNA载体的一部分。核酸序列可以选自本文所述的任何核酸序列。
在一个优选实施方案中，载体具有选自以下的启动子：
在另一个优选实施方案中，载体具有选自以下的启动子：
可以使用本领域已知的任何合适的方法制备核酸分子。因此，可以使用化学合成技术制备核酸分子。可替代地，可以使用分子生物学技术制备本发明的核酸分子。
本发明的DNA构建体优选在计算机中设计，然后通过常规DNA合成技术合成。
根据要使用的最终宿主细胞(例如，大肠杆菌)表达系统，任选地对上述核酸序列信息进行密码子偏好性修饰。
术语“核苷酸序列”和“核酸”在本文中同义使用。优选地，核苷酸序列是DNA序列。
本发明的修饰的BoNT/A可以作为单链或双链存在。然而，优选修饰的BoNT/A以双链存在，其中L链经由二硫键连接至H链(或其组分，例如HN结构域)。
可以使用一种方法来实现产生具有轻链和重链的单链修饰的BoNT/A，该方法包含在表达宿主中表达编码修饰的BoNT/A的核酸，裂解宿主细胞以提供含有单链修饰的BoNT/A的宿主细胞匀浆，以及分离单链修饰的BoNT/A。可以使用包含将单链修饰的BoNT/A与水解修饰的BoNT/A的激活环中肽键的蛋白酶接触的方法，对本文所述的单链修饰的BoNT/A进行蛋白水解处理，从而将单链修饰的BoNT/A转化为相应的双链修饰的BoNT/A(例如，其中轻链和重链通过二硫键连接在一起)。优选通过这种方法获得双链修饰的BoNT/A。
因此，本发明中使用的修饰的BoNT/A优选是由单链BoNT/A产生的双链修饰的BoNT/A，其中单链BoNT/A包含本文所述的多肽序列或由其组成。例如，优选本发明中使用的修饰的BoNT/A是双链修饰的BoNT/A，其由包含与SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或99.9％)序列同一性的多肽序列的多肽产生。例如，优选本发明中使用的修饰的BoNT/A是双链修饰的BoNT/A，其由包含与SEQ ID NO：14具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或99.9％)序列同一性的多肽序列的多肽产生。最优选地，本发明中使用的修饰的BoNT/A是双链修饰的BoNT/A，其由包含(甚至更优选由其组成)SEQ ID NO：14的多肽产生。
在一个实施方案中，本发明中使用的修饰的BoNT/A是双链修饰的BoNT/A，其由包含与SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或99.9％)序列同一性的多肽序列的多肽产生。例如，优选本发明中使用的修饰的BoNT/A是双链修饰的BoNT/A，其由包含与SEQ ID NO：4具有至少70％(例如，至少80％、90％、95％或99.9％)序列同一性的多肽序列的多肽产生。优选地，本发明中使用的修饰的BoNT/A是双链修饰的BoNT/A，其由包含(更优选由其组成)SEQ ID NO：4的多肽产生。
如本文所用，术语“可获得”也包括术语“获得”。在一个实施方案中，术语“可获得”意指获得。
用于切割激活环的蛋白酶优选为Lys-C。WO 2014/080206、WO2014/079495和EP2677029A2中教导了用于切割激活环以产生双链梭菌神经毒素的合适蛋白酶和方法，这些文献通过引用并入本文。Lys-C可以将激活环C末端切割至其中存在的一个或多个赖氨酸残基。当Lys-C不止一次切割激活环时，技术人员将理解，与本文所示的SEQ ID NO相比，双链修饰的BoNT/A的激活环的小肽可能不存在。
本发明的修饰的BoNT/A可以以任何合适的方式配制，例如作为药物组合物的一部分施用于受试者。因此，一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含本发明的修饰的BoNT/A和药学上可接受的载体、赋形剂、佐剂和/或盐。
通常使用修饰的BoNT/A和无热原的无菌溶媒来制备液体剂型。根据使用的溶媒和浓度，修饰的BoNT/A可以溶解或悬浮在溶媒中。在制备溶液时，可以将修饰的BoNT/A溶解在溶媒中，如果需要，通过加入氯化钠使溶液等渗，并在填充到合适的无菌小瓶或安瓿中并密封之前，使用无菌技术通过无菌过滤器过滤灭菌。可替代地，如果溶液稳定性足够，密封容器中的溶液可以高压灭菌。有利地，添加剂(如缓冲剂、增溶剂、稳定剂、防腐剂或杀菌剂、悬浮剂或乳化剂和/或局部麻醉剂)可以溶解在溶媒中。
干粉在使用前溶解或悬浮于合适的溶媒中，可以通过在无菌区使用无菌技术将预先灭菌的成分填充到无菌容器中来制备。可替代地，可以在无菌区使用无菌技术将这些成分溶解到合适的容器中。然后冷冻干燥产品，无菌密封容器。
适用于本文所述施用途径的肠胃外混悬液以基本相同的方式进行制备，不同之处在于无菌组分悬浮于无菌溶媒中，而不是溶解，并且不能通过过滤进行灭菌。可以在无菌状态下分离组分，或者可替代地，可以在分离后灭菌组分，例如通过γ辐射。
有利地，组合物中包括助悬剂，例如聚乙烯吡咯烷酮，以促进组分均匀分布。
与本发明的各种治疗用途相关的实施方案可以应用于本发明的方法，反之亦然。
序列同源性
多种序列比对方法中的任何一种都可用于确定同一性百分比，包括但不限于全局方法、局部方法和混合方法，例如片段方法。确定同一性百分比的方案是本领域技术人员能力范围内的常规程序。全局方法将序列从分子的开头到结尾进行比对，并通过累加单个残基对的分数和施加空位罚分来确定最佳比对。非限制性方法包括例如CLUSTAL W，例如参见Julie D.Thompson等人,CLUSTAL W:Improving the Sensitivity of ProgressiveMultiple Sequence Alignment Through Sequence Weighting,Position-Specific GapPenalties and Weight Matrix Choice,22(22)Nucleic Acids Research 4673-4680(1994)；以及迭代细化，例如参见Osamu Gotoh,Significant Improvement in Accuracyof Multiple Protein.Sequence Alignments by Iterative Refinement as Assessedby Reference to Structural Alignments,264(4)J.MoI.Biol.823-838(1996)。局部方法通过识别所有输入序列共有的一个或多个保守基序来比对序列。非限制性方法包括例如Match-box，例如参见Eric Depiereux和Ernest Feytmans,Match-Box:AFundamentallyNew Algorithm for the Simultaneous Alignment of Several Protein Sequences,8(5)CABIOS 501 -509(1992)；Gibbs采样，例如参见C.E.Lawrence等人,Detecting SubtleSequence Signals:A Gibbs Sampling Strategy for Multiple Alignment,262(5131)Science 208-214(1993)；Align-M，例如参见Ivo Van WaIIe等人,Align-M-A NewAlgorithm for Multiple Alignment of Highly Divergent Sequences,20(9)Bioinformatics:1428-1435(2004)。
因此，通过常规方法确定序列同一性百分比。例如，参见Altschul等人,Bull.Math.Bio.48:603-16,1986以及Henikoff和Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915-19,1992。简而言之，比对两个氨基酸序列以优化比对分数，使用空位开放罚分10，空位扩展罚分1，以及如下所示的Henikoff和Henikoff的“blosum 62”评分矩阵(同上)(氨基酸由标准单字母代码表示)；优选地，该方法用于将序列与本文的主题序列(例如，SEQ IDNO：2)进行比对，以定义本文所述的氨基酸位置编号。
两个或更多个核酸或氨基酸序列之间的“序列同一性百分比”是序列共有的相同位置数量的函数。因此，同一性百分比可以计算为相同核苷酸/氨基酸的数量除以核苷酸/氨基酸的总数，再乘以100。序列同一性百分比的计算还可以考虑空位的数量以及为优化两个或更多个序列的比对而需要引入的每个空位的长度。可以使用特定的数学算法进行序列比较并确定两个或更多个序列之间的同一性百分比，如BLAST，这是技术人员所熟悉的。
用于确定序列同一性的比对分数
A R N D C Q E G H I L K M F P S T W Y V
A 4
R -1 5
N -2 0 6
D -2 -2 1 6
C 0 -3 -3 -3 9
Q -1 1 0 0 -3 5
E-1 0 0 2 -4 2 5
G 0 -2 0 -1 -3 -2 -2 6
H -2 0 1 -1 -3 0 0 -2 8
I -1 -3 -3 -3 -1 -3 -3 -4 -3 4
L -1 -2 -3 -4 -1 -2 -3 -4 -3 2 4
K -1 2 0 -1 -3 1 1 -2 -1 -3 -2 5
M -1 -1 -2 -3 -1 0 -2 -3 -2 1 2 -1 5
F -2 -3 -3 -3 -2 -3 -3 -3 -1 0 0 -3 0 6
P -1 -2 -2 -1 -3 -1 -1 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -4 7
S 1 -1 1 0 -1 0 0 0 -1 -2 -2 0 -1 -2 -1 4
T 0 -1 0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1 1 5
W -3 -3 -4 -4 -2 -2 -3 -2 -2 -3 -2 -3-1 1 -4 -3 -2 1 1
Y -2 -2 -2 -3 -2 -1 -2 -3 2 -1 -1 -2 -1 3 -3 -2 -2 2 7
V 0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3 3 1 -2 1 -1 -2 -2 0 -3 -1 4
然后，同一性百分比计算如下：
相同匹配的总数
__________________________________________×100
[较长序列的长度加上
为比对两个序列而引入
较长序列的空位数]
基本同源的多肽被表征为具有一个或多个氨基酸取代、缺失或添加。这些变化优选是次要的，即保守氨基酸取代(见下文)以及不会显著影响多肽折叠或活性的其他取代；小的缺失，通常是1至约30个氨基酸的缺失；以及小的氨基或羧基末端延伸，如氨基末端甲硫氨酸残基、至多约20至25个残基的小连接肽或亲和标签。
保守氨基酸取代
碱性：精氨酸
赖氨酸
组氨酸
酸性：谷氨酸
天冬氨酸
极性：谷氨酰胺
天冬酰胺
疏水性：亮氨酸
异亮氨酸
缬氨酸
芳香：苯丙氨酸
色氨酸
酪氨酸
小：甘氨酸
丙氨酸
丝氨酸
苏氨酸
甲硫氨酸
除了20种标准氨基酸之外，非标准氨基酸(如4-羟基脯氨酸、6-N-甲基赖氨酸、2-氨基异丁酸、异缬氨酸和α-甲基丝氨酸)可以取代本发明多肽的氨基酸残基。有限数量的非保守氨基酸、非遗传密码编码的氨基酸和非天然氨基酸可以取代多肽氨基酸残基。本发明的多肽还可以包含非天然存在的氨基酸残基。
非天然存在的氨基酸包括但不限于反式-3-甲基脯氨酸、2,4-甲氧基脯氨酸、顺式-4-羟基脯氨酸、反式-4-羟基脯氨酸、N-甲基甘氨酸、别苏氨酸、甲基-苏氨酸、羟乙基半胱氨酸、羟乙基高半胱氨酸、硝基谷氨酰胺、高谷氨酰胺、哌啶酸、叔亮氨酸、正缬氨酸、2-氮杂苯丙氨酸、3-氮杂苯丙氨酸、4-氮杂苯丙氨酸和4-氟苯丙氨酸。本领域已知几种将非天然存在的氨基酸残基掺入蛋白质的方法。例如，可以使用体外系统，其中使用化学氨基酰化的抑制型tRNA抑制无义突变。合成氨基酸和氨基酰化tRNA的方法是本领域已知的。含有无义突变的质粒的转录和翻译在无细胞系统中进行，该系统包含大肠杆菌S30提取物和市售酶及其他试剂。用色谱法提纯蛋白质。例如，参见Robertson等人,J.Am.Chem.Soc.113:2722,1991；Ellman等人,Methods Enzymol.202:301,1991；Chung等人,Science 259:806-9,1993；以及Chung等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:10145-9,1993)。在第二种方法中，通过微注射突变的mRNA和化学氨基酰化的抑制性tRNA在非洲爪蟾卵母细胞中进行翻译(Turcatti等人,J.Biol.Chem.271:19991-8,1996)。在第三种方法中，在不存在待取代的天然氨基酸(例如，苯丙氨酸)和存在所需的非天然氨基酸(例如，2-氮杂苯丙氨酸、3-氮杂苯丙氨酸、4-氮杂苯丙氨酸或4-氟苯丙氨酸)的情况下培养大肠杆菌细胞。非天然存在的氨基酸取代其天然对应物掺入多肽中。参见Koide等人,Biochem.33:7470-6,1994。天然存在的氨基酸残基可以通过体外化学修饰转化为非天然存在的种类。化学修饰可以与定点诱变结合，以进一步扩大取代的范围(Wynn和Richards,Protein Sci.2:395-403,1993)。
有限数量的非保守氨基酸、非遗传密码编码的氨基酸、非天然存在的氨基酸和非天然氨基酸可以取代本发明多肽的氨基酸残基。
本发明的多肽中的必需氨基酸可以根据本领域已知的方法进行鉴定，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells,Science 244:1081-5,1989)。生物相互作用的位点也可以通过结构的物理分析来确定，如通过核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记等技术结合推定接触位点氨基酸的突变来确定。例如，参见de Vos等人,Science 255:306-12,1992；Smith等人,J.Mol.Biol.224:899-904,1992；Wlodaver等人,FEBS Lett.309:59-64,1992。也可以从与本发明多肽的相关组分(例如，易位或蛋白酶组分)的同源性分析中推断出必需氨基酸的身份。
使用已知的诱变和筛选方法，如Reidhaar-Olson和Sauer(Science 241:53-7,1988)或Bowie和Sauer(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:2152-6,1989)所公开的那些，可以形成并测试多种氨基酸取代。简而言之，这些作者公开了用于同时随机化多肽中的两个或更多个位置、选择功能性多肽、然后对经诱变的多肽进行测序以确定每个位置上可允许的取代谱的方法。可以使用的其他方法包括噬菌体展示(例如，Lowman等人,Biochem.30:10832-7,1991；
Ladner等人,美国专利号5,223,409；Huse,WIPO公开WO 92/06204)和区域定向诱变(Derbyshire等人,Gene 46:145,1986；Ner等人,DNA 7:127,1988)。
除非另有定义，否则本文使用的全部技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。Singleton等人,《微生物学和分子生物学词典(DICTIONARYOF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY)》,第20版,John Wiley and Sons,纽约(1994)以及Hale和Marham,《哈珀·柯林斯生物词典(THE HARPER COLLINS DICTIONARY OFBIOLOGY)》,Harper Perennial,纽约(1991)为本领域技术人员提供了本发明中使用的诸多术语的通用词典。
本发明不受本文公开的示例性方法和材料的限制，并且与本文描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料可用于本发明的实施方案的实践或测试中。数值范围包括限定该范围的数值。除非另有说明，分别地，任何核酸序列均以5’至3’方向从左至右书写；氨基酸序列以氨基到羧基的方向从左到右书写。
本文提供的标题并非对本发明的各个方面或实施方案的限制。
本文使用氨基酸名称、三字母缩写或单字母缩写来指代氨基酸。本文使用的术语“蛋白质”包括蛋白质、多肽和肽。如本文所用，术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白质”同义。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“肽”同义。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“酶”同义。术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用。在本发明和权利要求中，可以使用常规的氨基酸残基单字母和三字母编码。根据IUPACIUB生化命名联合委员会(JCBN)的定义，由3个字母组成的氨基酸代码。还应当理解，由于遗传密码的简并性，多肽可以由一个以上的核苷酸序列编码。
术语的其他定义可能出现在说明书全文中。在更详细地描述示例性实施方案之前，应当理解，本发明不限于所描述的特定实施方案，并且因此可以变化。还应当理解，本文使用的术语仅仅是为了描述特定实施方案，而非意图限制，因为本发明的范围将仅由所附权利要求进行限定。
在提供数值范围的情况下，应当理解，除非上下文另有明确规定，否则该范围的上限和下限之间的每个中间值也具体公开到下限单位的十分之一。在指定范围内的任何指定值或中间值与该指定范围内的任何其他指定值或中间值之间的每个较小范围都被包括在本发明中。这些较小范围的上限和下限可以独立地被包括在该范围内或被排除在外，并且其中在较小范围内包括任一个、零个或两个极限值的每个范围也被包括在本发明中，这取决于所述范围中任何具体排除的极限值。当所述范围包括一个或两个极限值时，排除这些所包括的极限值中的一个或两个的范围也被包括在本发明中。
应当注意，如本文和所附权利要求中所使用的，除非上下文另有明确规定，单数形式“一(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括复数指代物。因此，例如，提及“修饰的A型肉毒神经毒素”包括多种此类候选药剂，提及“该修饰的A型肉毒神经毒素”包括提及一种或多种修饰的肉毒神经毒素及其本领域技术人员已知的等同物，等等。
本文讨论的公开文献仅用于其在本申请申请日之前的公开内容。本文中的任何内容都不应被解释为承认此类公开文献构成所附权利要求的现有技术。
附图说明
现在将参考下面的附图和实例，仅通过实例的方式描述本发明的实施方案。
图1显示了阳离子结构的等电聚焦(IEF)凝胶。
图2显示了Cat5v2(K1064H/N954K)(A)、Cat5v2(K1064H/N886K)(B)和Cat5v2(K1064H/N1025K)(C)在大鼠胚胎脊髓神经元(eSCN)中的SNAP-25切割百分比，以及相对于nBoNT/A1的pEC50汇总。(A、B、C)培养大鼠胚胎脊髓神经元三周，用Cat5v4处理24小时，然后用SNAP-25特异性抗体进行蛋白质印迹。数据是三次独立实验的平均值±SEM。(D)在大鼠eSCN SNAP-25切割效力测定中，Cat5v2(K1064H/N886K)、Cat5v2(K1064H/N954K)和Cat5v2(K1064H/N1025K)对nBoNT/A1(List Biological Laboratories)的相对效力。每个点对应一个单独的批次，并且是基于8点浓度响应曲线(CRC)的3次独立pEC50测定的平均值。CRC中的每个浓度都进行了三次评估。效力比较进行至列表批次的平均值，合并数据n＝24。数据为每Cat5v4中n＝3批次的平均值±SEM。
图3显示了nBoNT/A1和Cat5v4在小鼠膈神经半膈肌测定(mPNHD)中的效力(t50)。按照指示用Cat5v4或天然BoNT/A1温育小鼠膈神经半膈肌组织。记录膈肌收缩力，直到再也无法检测到收缩或140分钟后。每个点对应于独立的测定。t50值是抑制小鼠半膈肌收缩力50％所需的时间。
图4显示了纯化的重组BoNT/AB嵌合体1、2和3A(分别为SEQ ID NO：11、12和13)的SDS-PAGE。泳道标记为“标志物(Marker)”(分子量标志物)、“-DTT”(氧化的BoNT/AB嵌合体样品)和“+DTT”(还原的BoNT/AB嵌合体样品)。
图5显示了重组BoNT/AB嵌合体1、2和3A(分别为SEQ ID NO：11、12和13)对大鼠脊髓神经元中SNAP-25的切割。将培养的大鼠原代脊髓神经元(SCN)暴露于不同浓度的重组BoNT/AB嵌合体1、2或3A中24小时，37℃，在含有10％CO2的湿润气氛中。然后用补充了DTT和全能核酸酶(Benzonase)的1x NuPAGE缓冲液裂解细胞。将样品转移到微量离心管中，于90℃在加热块上加热5分钟，并储存于-20℃，然后通过蛋白质印迹分析SNAP-25切割。使用多克隆抗体检测SNAP-25，该抗体检测SNAP-25的全长和切割形式(Sigma#S9684)。抗兔HRP(Sigma#A6154)用作第二抗体。
图6显示了小鼠脚趾外展评分测定。在短暂全身麻醉下，注射到小鼠一个后肢的腓肠肌-比目鱼肌复合肌中；使用脚趾外展评分(DAS)在0-4级上测量肌肉无力。确定每个剂量的DAS最大值，并对剂量作图，数据拟合为4参数逻辑方程，确定ED50和导致DAS 4(DAS 4剂量)值的剂量。
图7显示了纯化的重组BoNT/AB嵌合体3B和3C(分别为SEQ ID NO：14和15)的SDS-PAGE。泳道标记为“标志物”(分子量标志物)、“-DTT”(氧化的BoNT/AB嵌合体样品)和“+DTT”(还原的BoNT/AB嵌合体样品)。
图8显示了在人诱导性多能干细胞衍生的外周神经元(PERI.4U–Axiogenesis,Germany)中未修饰的3B和3C嵌合体(SEQ ID NO：2、14和15)对SNAP-25的切割。将PERI.4U细胞暴露于不同浓度的重组BoNT/A或BoNT/AB嵌合体3B或3C中24小时，37℃，在含有5％CO2的湿润CO2气氛中。然后用补充了DTT和全能核酸酶的1x NuPAGE缓冲液裂解细胞。将样品转移到微量离心管中，于90℃在加热块上加热5分钟，并储存于-20℃，然后通过蛋白质印迹分析SNAP-25切割。使用多克隆抗体检测SNAP-25，该抗体检测SNAP-25的全长和切割形式(Sigma#S9684)。抗兔HRP(Sigma#A6154)用作第二抗体。
图9显示了小鼠脚趾外展评分测定中肌肉无力随时间的持续。在短暂全身麻醉下，注射到小鼠一个后肢的腓肠肌-比目鱼肌复合肌中；使用脚趾外展评分(DAS)在0-4级上测量肌肉无力。监测在注射的前四天诱导DAS为4的最低剂量注射组的动物，直到肌肉无力完全恢复至DAS为0(未观察到肌肉无力)。
序列表
当起始Met氨基酸残基或相应的起始密码子出现在任何下列SEQ ID NO中时，所述残基/密码子是任选的。
SEQ ID NO：1(未修饰的BoNT/A的核苷酸序列)
SEQ ID NO：2(未修饰的BoNT/A的多肽序列)
SEQ ID NO：3(修饰的BoNT/A“Cat-A”的核苷酸序列)
SEQ ID NO：4(修饰的BoNT/A“Cat-A”的多肽序列)
SEQ ID NO：5(修饰的BoNT/A“Cat-B”的核苷酸序列)
SEQ ID NO：6(修饰的BoNT/A“Cat-B”的多肽序列)
SEQ ID NO：7(修饰的BoNT/A“Cat-C”的核苷酸序列)
SEQ ID NO：8(修饰的BoNT/A“Cat-C”的多肽序列)
SEQ ID NO：9(修饰的BoNT/A“Cat-D”的核苷酸序列)
SEQ ID NO：10(修饰的BoNT/A“Cat-D”的多肽序列)
SEQ ID NO：11(修饰的BoNT/A“嵌合体1”的多肽序列)
SEQ ID NO：12(修饰的BoNT/A“嵌合体2”的多肽序列)
SEQ ID NO：13(修饰的BoNT/A“嵌合体3A”的多肽序列)
SEQ ID NO：14(修饰的BoNT/A“嵌合体3B”的多肽序列)
SEQ ID NO：15(修饰的BoNT/A“嵌合体3C”的多肽序列)
SEQ ID NO：16(BoNT/B的多肽序列)
实施例
实施例1
克隆、表达和纯化
选择编码野生型BoNT/A(SEQ ID NO：2)的核苷酸序列SEQ ID NO：1进行突变，以引入以下取代而形成以下表1所示的四种构建体
表1.构建体。
*Cat-D的计算的pI为7.45，分子量为149859。
合成编码上述修饰的BoNT/A分子的DNA构建体，将其克隆到pJ401表达载体中，然后转化到BL21(DE3)大肠杆菌中。这允许重组Cat-A、Cat-B、Cat-C和Cat-D蛋白在BL21(DE3)大肠杆菌中可溶性过表达。
使用经典层析技术从大肠杆菌裂解物中纯化重组修饰的BoNT。采用了使用阳离子交换树脂的初始纯化步骤，随后使用疏水相互作用树脂的中间纯化步骤。然后通过蛋白水解切割重组修饰的BoNT单链，产生活化的双链修饰的BoNT。然后采用最后的纯化步骤来去除残留的污染物。WO2015/166242、WO2017055274A1、EP2524963B1、EP2677029B1和US10087432B2中教导了合适的技术。
实施例2
纯化的修饰的BoNT/A的表征
上述实施例1中描述的修饰的BoNT的通过实验表征如下。
pI测量结果显示，修饰的BoNT的等电点高于未修饰的(天然)BoNT/A1的等电点——参见以下图1和表2。
表2.修饰的BoNT/A pI值。
使用大鼠胚胎脊髓神经元(eSCN)评估修饰的BoNT进入神经元并切割SNAP-25(BoNT/A1的靶标)的能力。图2显示了修饰的BoNT保留了与天然BoNT/A1相同的进入神经元和切割SNAP-25的能力。
使用小鼠膈神经半膈肌测定法(mPNHD)进一步评估修饰的BoNT的效力。图3显示了饰的BoNT保留了与天然BoNT/A1相同的抑制小鼠半膈肌收缩能力的能力。
体内小鼠脚趾外展评分(DAS)测定用于评估相对于天然BoNT/A1的效力和安全性。两种分子(Cat-A[SEQ ID NO：4转换为双链形式]和Cat-B[SEQ ID NO：6转换为双链形式])相对于天然BoNT/A1显示出更高的安全性比率，效力略强。这些数据如以下表3所示：
表3.DAS测定和安全性比率。
-DAS ED50：计算的诱导DAS2的剂量
-剂量DAS 4：实验的诱导DAS 4的剂量
-BW：体重
--10％ΔBW的剂量：计算的诱导体重与D0时体重相比减少10％的剂量
-安全性比率：-10％ΔBW的剂量/DAS ED50
安全性比率是BoNT治疗(体重减轻)相对于效力(最大脚趾外展评分(DAS)的一半)的负面影响的量度。它计算为-10％体重(BW)与DAS ED50之间的比率，其中-10％BW是指体重减少10％所需的BoNT量(pg/动物)，ED50是指将产生DAS2的BoNT量(pg/动物)。
通过将20μl在明胶磷酸盐缓冲液中配制的修饰的BoNT/A注射到小鼠腓肠肌/比目鱼肌复合体中来进行DAS测定，随后如Aoki先前报道的那样(Aoki KR,Toxicon 39:1815-1820；2001)评估脚趾外展。
实施例3
修饰的BoNT/A嵌合体(BoNT/AB嵌合体)的克隆、表达和纯化
使用标准分子生物学技术由编码亲本血清型分子的DNA和合适的寡核苷酸构建BoNT/AB嵌合构建体1、2、3A、3B和3C(分别为SEQ ID NO：11至15)。然后将它们克隆至带有或不带有C末端His10标签的pJ401表达载体中，并转化至BLR(DE3)大肠杆菌细胞中进行过表达。这些细胞在37℃和225RPM摇动下在2L带挡板的锥形瓶中生长，该锥形瓶含有1L补充有适当抗生素的修饰的极品肉汤(Terrific Broth)(mTB)。一旦A600达到＞0.5，将培养箱温度降至16℃，然后在1小时后用1mM IPTG以225RPM摇动诱导20小时，以表达重组BoNT/AB构建体。
收获的细胞通过超声破碎进行裂解，并通过在4℃以4500RPM离心1小时进行澄清。然后在硫酸铵中提取重组BoNT/AB嵌合分子，并通过标准快速蛋白液相色谱(FPLC)技术进行纯化。这包括使用疏水相互作用树脂进行捕获，并使用阴离子交换树脂进行中间纯化步骤。然后用内切蛋白酶Lys-C对部分纯化的分子进行蛋白水解切割，产生活性双链。用第二种疏水相互作用树脂进一步纯化以获得最终的BoNT/AB嵌合体。
对于具有十组氨酸标签(H10)的BoNT/AB嵌合分子(嵌合体1、2、3A)，捕获步骤使用固定的镍树脂代替疏水相互作用树脂。
每种嵌合体的序列如表4中所示。
表4-嵌合BoNT/AB构建体
实施例4
BoNT/AB嵌合体1、2和3A的比较
具有C末端His10标签和E1191M/S1199Y双突变的BoNT/AB嵌合体1、2和3A如实施例3所述进行纯化(图4)，并测试功能活性。
大鼠脊髓神经元SNAP-25切割测定
制备大鼠脊髓神经元(SCN)的原代培养物，并在96孔组织培养板中培养3周(如以下中所述：Masuyer等人,2011,J.Struct.Biol.Structure and activity of afunctional derivative of Clostridium botulinum neurotoxin B；以及Chaddock等人,2002,Protein Expr.Purif.Expression and purification of catalytically active,non-toxic endopeptidase derivatives of Clostridium botulinum toxin type A)。在SCN饲养培养基中制备BoNT/AB的系列稀释液。收集待处理孔中的生长培养基并过滤(0.2μm过滤器)。将125μL过滤后的培养基加回每个测试孔中。然后将125μL稀释的毒素加入板中(一式三份孔)。将处理后的细胞在37℃、10％CO2下培养24±1h。
使用SNAP-25切割测定来分析BoNT活性
处理后，去除BoNT并在PBS(Gibco，英国)中洗涤细胞一次。在补充有0.1M二硫苏糖醇(DTT)和250单位/mL全能核酸酶(Sigma)的1x NuPAGE裂解缓冲液(Life Technologies)中裂解细胞。裂解物蛋白通过SDS-PAGE分离并转移至硝酸纤维素膜。用特异性针对SNAP-25的第一抗体(Sigma#S9684)探测膜，该第一抗体识别未切割的SNAP-25以及被BoNT/A内肽酶切割的SNAP-25。所用的第二抗体是HRP偶联的抗兔IgG(Sigma#A6154)。通过增强化学发光检测条带，并使用pXi6 Access(Synoptics公司，英国)成像。使用GeneTools软件(Syngene，英国剑桥)测定条带的强度，并计算每个BoNT浓度下切割的SNAP-25的百分比。数据拟合为4参数逻辑方程，并使用GraphPad Prism版本6(GraphPad)计算pEC50。
以下表5提供了在大鼠SCN SNAP-25切割测定中确定的嵌合体1、2和3A的pEC50值。这些结果表明，三种BoNT/AB嵌合体保留了进入大鼠脊髓神经元并切割其靶底物的能力。然而，在该测定中，嵌合体3A比嵌合体1和2更有效(还参见图5)。
| pEC50±SEM | |
| 嵌合体1 | 12.42±0.04 |
| 嵌合体2 | 12.57±0.01 |
| 嵌合体3A | 12.89±0.04 |
表5.pEC50值。
脚趾外展评分(DAS)测定
在DAS测定中测量BoNT/AB嵌合体1、2和3A活性的方法是基于小鼠在被尾巴短暂悬吊时的惊吓反应脚趾伸展反射。这种反射被记为脚趾外展评分(DAS)，并在将BoNT施用于后爪的腓肠肌-比目鱼肌后被抑制。小鼠被尾巴短暂悬吊起来，以引起典型的惊吓反应，即动物伸出后肢并外展其后趾(Aoki等人.1999,Eur.J.Neurol.；6(suppl.4)S3-S10)。
在注射当天，小鼠在容纳含3％异氟烷的氧气的诱导室中被麻醉。每只小鼠在右后爪的腓肠肌-比目鱼肌中接受BoNT/AB嵌合体或溶媒(含有0.2％明胶的磷酸盐缓冲液)的肌内注射。
注射神经毒素后，对不同程度的脚趾外展进行评分，范围从0到4，其中0＝正常，4＝脚趾外展和腿部伸展的减少最大。通过非线性调整分析确定ED50，使用每个剂量最大效应的平均值。使用的数学模型是4参数逻辑模型。
给药后第一天每2小时进行一次DAS，此后每天进行3次，持续4天。
图6显示了嵌合体1、2和3A(SEQ ID NO：11、12和13分别转换为双链形式)的拟合曲线。嵌合体3A曲线向左移动，这意味着与嵌合体1和2相比，较低剂量的嵌合体3A实现了类似的DAS反应，因此表明在小鼠DAS测定中嵌合体3A比其他嵌合体更有效；还参见下表(表6)，该表提供了每种嵌合体的计算的ED50值以及导致DAS 4(最高分)的剂量。
以下表6提供了在小鼠DAS测定中对未修饰的重组BoNT/A1(rBoNT/A1-SEQ ID NO：2转换为双链形式)和嵌合体1、2和3A确定的ED50和DAS 4剂量。这些结果表明，在三种嵌合体中，嵌合体3A在诱导肌肉无力方面具有最高的体内效力。图6和表6所示的研究是在从Charles River实验室获得的小鼠中进行的。
| ED50(pg/小鼠) | DAS 4剂量(pg/小鼠) | |
| rBoNT/A1 | 1 | 5 |
| 嵌合体1 | 23 | 200 |
| 嵌合体2 | 89 | >300 |
| 嵌合体3A | 18 | 133 |
表6.ED50值。
实施例5
BoNT/AB嵌合体3B、3C与未修饰的BoNT/A1的比较
如实施例3(图7)所述纯化分别存在和不存在E1191M/S1199Y双突变(SEQ ID NO：14和15)的未标记的BoNT/AB嵌合体3B和3C，并使用未修饰的BoNT/A(SEQ ID NO：2转换为双链形式)作为参照来测试功能活性。
人多能干细胞SNAP-25切割测定
冷冻保存的PERI.4U细胞购自Axiogenesis(德国科隆)。按照制造商的建议进行细胞的解冻和铺板。简而言之，将含有细胞的冷冻小瓶在37℃水浴中解冻2分钟。温和重悬后，将细胞转移至50mL试管中。用制造商提供的1mL解冻培养基洗涤冷冻小瓶，将培养基逐滴转移至50mL试管中的细胞悬浮液中，然后再向50mL试管中逐滴加入另外的2mL解冻培养基。然后使用血细胞计数器对细胞进行计数。此后，向细胞悬浮液中再加入另外的6mL解冻培养基。通过在室温以260×g(例如，1100RPM)离心6分钟获得细胞沉淀。然后将细胞重悬于制造商提供的完全培养基中。将细胞以每平方厘米50000至150000个细胞的密度铺在涂有聚-L-鸟氨酸和层粘连蛋白的细胞培养板上。细胞于37℃在潮湿CO2气氛中培养，培养期间每2至3天完全更换一次培养基。
对于毒素处理，在培养基中制备BoNT的系列稀释液。收集待处理孔中的培养基并过滤(0.2μm过滤器)。将125μL过滤后的培养基加回每个测试孔中。然后将125μL稀释的毒素加入板(一式三份孔)。将处理过的细胞在37℃、10％CO2下培养48±1小时。
使用SNAP-25切割测定来分析BoNT活性
处理后，去除BoNT并在PBS(Gibco，英国)中洗涤细胞一次。在补充有0.1M二硫苏糖醇(DTT)和250单位/mL全能核酸酶(Sigma)的1x NuPAGE裂解缓冲液(Life Technologies)中裂解细胞。裂解物蛋白通过SDS-PAGE分离并转移至硝酸纤维素膜。用特异性针对SNAP-25的第一抗体(Sigma#S9684)探测膜，该抗体识别未切割的SNAP-25以及被BoNT/A内肽酶切割的SNAP-25。所用的第二抗体是HRP偶联的抗兔IgG(Sigma#A6154)。通过增强化学发光检测条带，并使用pXi6 Access(Synoptics公司，英国)成像。使用GeneTools软件(Syngene，英国剑桥)测定条带的强度，并计算每个BoNT浓度下切割的SNAP-25的百分比。数据拟合为4参数逻辑方程，并使用GraphPad Prism版本6(GraphPad)计算pEC50。
图8显示了嵌合体3B和3C在诱导人多能干细胞中切割SNAP-25的效力比rBoNT/A1更强，但前者明显更强。这可以用双突变来解释，该双突变增加了嵌合体3B对这些细胞中存在的人突触结合蛋白II蛋白受体的亲和力(图8，表7)。
| pEC50±SEM | |
| rBoNT/A1 | 10.21±0.05 |
| 嵌合体3B | 12.38±0.06 |
| 嵌合体3C | 10.72±0.08 |
表7.pEC50值。
脚趾外展评分(DAS)测定——安全性比率
在DAS测定中测量BoNT活性的方法是基于小鼠被尾巴短暂悬吊时的惊吓反应脚趾伸展反射。这种反射被记为脚趾外展评分(DAS)，并在将BoNT施用于后爪的腓肠肌-比目鱼肌后被抑制。小鼠被尾巴短暂悬吊起来，以引起典型的惊吓反应，即动物伸出后肢并伸展其后趾(Aoki等人.1999,Eur.J.Neurol.；6(suppl.4)S3-S10)。
在注射当天，小鼠在容纳含3％异氟烷的氧气的诱导室中被麻醉。每只小鼠在右后爪的腓肠肌-比目鱼肌中接受BoNT或溶媒(含0.2％明胶的磷酸盐缓冲液)的肌内注射。
注射神经毒素后，对不同程度的脚趾外展进行评分，范围从0到4，其中0＝正常，4＝脚趾外展和腿部伸展的减少最大。通过非线性调整分析确定ED50，使用每个剂量最大效应的平均值。使用的数学模型是4参数逻辑模型。
给药后第一天每2小时进行一次DAS；此后，对于全部剂量，每天进行3次，持续4天。此后监测注射了溶媒以及在注射的前四天诱导DAS为4的最低剂量的各组动物，直到肌肉无力完全恢复至DAS为0(未观察到肌肉无力)。
为了计算安全性比率，在注射毒素前一天(D0)对全部动物进行称重，此后在整个研究持续期间每天称重一次。每天计算每个剂量组的平均体重、其标准偏差和标准误差平均值。为了获得BoNT的安全性比率(-10％ΔBW/ED50)，将研究期间任何时间的剂量组的平均体重低于同一剂量组在D0时平均体重10％的剂量除以所研究BoNT的ED50。致死剂量定义为该剂量组中一只或多只动物死亡的剂量。
图9显示了在未修饰的BoNT/A、嵌合体3B和嵌合体3C(SEQ ID NO：2、14和15转换为双链形式)的小鼠脚趾外展评分测定中肌肉无力的持续时间，表明嵌合体具有更长的作用持续时间。
以下表8提供了在小鼠DAS测定中确定的rBoNT/A1和嵌合体3B及3C的ED50和DAS 4剂量。该表还提供了DAS 4剂量的总作用持续时间，直至肌肉无力完全恢复至DAS 0(未观察到肌肉无力)。此外，该表显示了小鼠致死剂量和安全性比率(-10％ΔBW/ED50)，如上文所定义。与rBoNT/A1相比，嵌合体3B和3C具有更长的作用时间、更好的安全性比率和更高的致死剂量。图9和表8中所示的研究是在从Janvier实验室获得的小鼠中进行的。
表8.BoNT/AB嵌合体的DAS和安全性比率。
实施例6
修饰的BoNT/A(SEQ ID NO：4转换为双链形式)的临床前测试
对修饰的BoNT/A“Cat-A”(SEQ ID NO：4转换为双链形式)进行附加临床前测试。
材料和方法
大鼠脚趾外展评分(DAS)测定
为了评估修饰的BoNT/A(SEQ ID NO：4转换为双链形式)对体内肌肉活动的影响，使用大鼠DAS测定进行了剂量反应研究。大鼠DAS测定是基于短暂抓住动物时的脚趾伸展反射，这是一种典型的惊吓反应。在左侧腓骨肌复合体注射一次神经毒素后，肌肉无力导致脚趾外展减少。按5分制对脚趾外展的不同程度进行评分：0＝正常至4＝脚趾外展和腿部伸展的减少最大(Broide RS,Rubino J,Nicholson GS等人.The rat Digit Abduction Score(DAS)assay:A physiological model for assessing botulinum neurotoxin-inducedskeletal muscle paralysis.Toxicon 2013；71:18-24)。毒素注射后连续5天测量DAS值，此后每隔2至3天测量一次，直到较低剂量的修饰的BoNT/A(SEQ ID NO：4转换为双链形式)对脚趾外展反射的影响完全消失，并直到剂量恢复至DAS2导致DAS4。短暂的BoNT诱导的体重增加的剂量依赖性效应被认为是全身性毒素效应的证据(Torii Y,Goto Y,Nakahira S等人.Comparison of Systemic Toxicity between Botulinum Toxin Subtypes A1 andA2 in Mice and Rats.Basic Clin.Pharmacol.Toxicol.2015；116:524-528.)。随后在每个评估时间点对大鼠进行称重并记录副作用。注射前并且直到研究结束，掩蔽BoNT的给药溶液(分配随机字母)。效力确定为诱导50％效应所需的剂量(ED50：导致DAS值为2的剂量)。为了确定ED50和95％置信区间(CI)，测试了2.5至750pg/kg的剂量范围。还施用了1、1.5、2、2.4、3、4和5ng/kg的较高剂量，以评估可能的副作用。
为了评估修饰的BoNT/A(SEQ ID NO：4转换为双链形式)的作用持续时间，并将其与未修饰的BoNT/A(SEQ ID NO：2转换为双链形式)的作用持续时间进行比较，在两项独立、直接的头对头研究中，评估了恢复至两种毒素的最高耐受剂量(与未治疗的大鼠相比，对体重变化无影响)的DAS2读数为2所需的中值时间。
大鼠单剂量研究
大鼠接受单次肌内(i.m.)注射修饰的BoNT/A(SEQ ID NO：4转换为双链形式)，剂量为以0、0.1、1和3ng/kg施用于右侧腓肠肌中。对照动物的右侧腓肠肌接受SEQ ID NO：4稀释剂。在处理后7天(每组10只雄性和10只雌性)或在13或26周观察期后(每剂量5只雄性和5只雌性)对动物实施安乐死。在测试前(第-1天)、第8天以及第13周和第27周期间进行Irwin测试观察，以评估中枢神经系统功能。评估的其他临床(不良)体征为跛行、注射毒素的肌肉尺寸较小以及腹部柔软肿胀。
猴研究
猴接受单次肌内注射剂量的0、0.1、0.25和0.75ng/kg修饰的BoNT/A(SEQ ID NO：4转换为双链形式)，施用于右侧腓肠肌中。在处理后7天(每组三只雄性和三只雌性)或在13或26周观察期后(每剂量两只雄性和两只雌性)对动物实施安乐死。在第8天和第15天通过外部遥测预测试进行心血管检查，包括血液动力学、心电图和呼吸参数。
怀孕大鼠的初步增强的EFD
研究目的是提供关于在整个器官发生期间通过肌内注射途径施用时修饰的BoNT/A(SEQ ID NO：4转换为双链形式)对大鼠胚胎和胎儿发育的影响的初步信息。从妊娠第6天(G6)至第17天(G17)(包括在内)，以0.02、0.05和0.1ng/kg/天的剂量水平通过每日肌内注射(腓肠肌)将修饰的BoNT/A(SEQ ID NO：4转换为双链形式)施用于9只交配的雌性Sprague-Dawley大鼠。在整个研究过程中监测临床状况、体重和食物消耗。在G21对雌鼠进行剖腹产检查，并记录产仔参数。尸检时，对雌鼠进行肉眼检查，对妊娠子宫进行称重，对于存在小块注射腓肠肌的雌鼠，对该肌肉和对侧肌肉进行称重。对全部胎儿进行称重。然后检查胎儿的外部和内脏异常情况并进行性别鉴定。大约一半胎儿的头部被固定，通过连续切片进行内部检查。对全部胎儿的取出内脏的尸体进行骨骼检查。
怀孕兔的初步增强的EFD
研究目的是提供关于在整个器官发生期通过肌内注射途径施用时修饰的BoNT/A(SEQ ID NO：4转换为双链形式)对兔胚胎和胎儿发育的影响的初步信息。从妊娠第6天(G6)至第19天(G19)(包括在内)，以0.002、0.005和0.01ng/kg/天的剂量水平通过每日肌内注射(腓肠肌)将修饰的BoNT/A(SEQ ID NO：4转换为双链形式)施用于9只交配的雌性新西兰白兔。在整个研究过程中监测临床状况、体重和食物消耗。在G29对雌兔进行剖腹产检查，并记录产仔参数。尸检时，对雌兔进行肉眼检查，对妊娠子宫进行称重，对于存在小块注射腓肠肌的雌兔，对该肌肉和对侧肌肉进行称重。对全部胎儿进行称重。然后检查胎儿的外部和内脏异常情况并进行性别鉴定。大约一半胎儿的头部被固定，通过连续切片进行内部检查。
结果
通过进行上述研究，获得了施用修饰的BoNT/A的多个不同物种的下列药理学数据(如以下表9所示)。
表9.临床前结果。
此外，在大鼠DAS测定中测试了修饰的BoNT/A(SEQ ID NO：4转换为双链形式)，以确定与相比的作用持续时间。结果如以下表10所示：
表10.作用持续时间。
这些数据表明，修饰的BoNT/A的作用持续时间是的两倍以上。
实施例7
确定用于治疗影响受试者眼睑肌肉的疾病的修饰的BoNT/A(SEQ ID NO：4转换为
双链形式)的单位剂量
鉴于上述实施例6中获得的临床前药理学数据，已经确定了用于在人体中施用修饰的BoNT/A的合适单位剂量(UD)。研究表明，与未修饰的BoNT/A相比，修饰的BoNT/A提供了更长的作用持续时间，同时表现出安全性有所提高。可通过本文所述的修饰的BoNT/A的高安全性比率来表示该提高的安全性。
由于修饰的BoNT/A与具有相同的作用机制(尽管由于其修饰的特性而具有更高的安全性)，因此根据同一肌肉群中的标示剂量来确定用于治疗受试者的修饰的BoNT/A的最低剂量：
·在脚趾外展评分大鼠模型中，修饰的BoNT/A的ED50为13pg/kg，比同一动物物种的估计未观察到有害作用水平(NOAEL)1500pg/kg低100倍以上。在同一大鼠模型中，的ED50为0.5U/kg。基于这些动物数据，2.6ng修饰的BoNT/A的剂量估计为100U的剂量。
·腹腔内小鼠LD50为8.44pg。在这些条件下，0.84ng修饰的BoNT/A的剂量对应于100U Dysport的剂量。
因此，计算的最低剂量为84.4pg(四舍五入为84pg)。为了提供一些背景，使用以上腹腔内小鼠LD50数据，84pg修饰的BoNT/A等于大约10U在治疗影响受试者眼睑肌肉的疾病(例如，眼睑痉挛和单独的面肌痉挛)期间，每个部位施用10U是治疗有效的。例如，被批准用于治疗眼睑痉挛(以及单独的面肌痉挛)，其中向外侧上眼轮匝肌、内侧上眼轮匝肌和外侧下眼轮匝肌以及任选的内侧下眼轮匝肌各施用10U。因此，可以预期84pg修饰的BoNT/A(10U)是有效的最小单位剂量(例如，以类似的方式施用)。
大鼠中修饰的BoNT/A的估计NOAEL为1.5ng/kg，相当于体重为60kg的人的90ng剂量。在猴子中，在受试的两种非临床物种中敏感性更高，0.125ng/kg修饰的BoNT/A的估计NOAEL相当于体重为60kg的人的7.5ng剂量。
出于谨慎考虑，处理上限被选定为2000pg(约237U)，比猴的NOAEL低3倍以上。
因此，对影响受试者眼睑肌肉的疾病的合适治疗使用至少84pg(10U)修饰的BoNT/A，治疗期间总剂量至多2000pg(约237U)。可以根据施用修饰的BoNT/A的肌肉和/或部位的数量来确定单位剂量的上限。例如，当将修饰的BoNT/A施用于三个肌肉和/或部位(例如，单侧眼睑痉挛治疗中的外侧上眼轮匝肌、内侧上眼轮匝肌和外侧下眼轮匝肌)时，合适的单位剂量为84pg至666.7pg(10U至约79U)修饰的BoNT/A。如果施用于六个肌肉/部位(例如，双侧眼睑痉挛治疗中的2×外侧上眼轮匝肌、2×内侧上眼轮匝肌和2×外侧下眼轮匝肌)，合适的单位剂量为84pg至333.3pg(10U至约39.5U)修饰的BoNT/A。这确保不超过总剂量。
实施例8
用于治疗影响受试者眼睑肌肉的疾病的给药方案
修饰的BoNT/A(例如，SEQ ID NO：4转换为双链形式)以冻干粉末的形式装在2mL透明玻璃小瓶中，每小瓶含15ng修饰的BoNT/A。用无菌氯化钠0.9％v/w无防腐剂溶液和稀释剂(仅含修饰的BoNT/A的赋形剂的制剂缓冲液)的混合物复原干粉末。复原后，根据需要进一步稀释溶液。
单位剂量(UD)为84pg至666.7pg(10U至约79U)。
根据以下给药方案通过注射治疗疾病(表11)：
| 肌肉/部位 | 给药(单位剂量) |
| 外侧上眼轮匝肌 | 1×UD |
| 内侧上眼轮匝肌 | 1×UD |
| 外侧下眼轮匝肌 | 1×UD |
表11.给药方案。
施用的最大总剂量为2000pg(约237U)。
实施例9
修饰的BoNT/A(BoNT/AB嵌合体[SEQ ID NO：14转换为双链形式])的临床前测试
在小鼠LD50测定中对BoNT/AB嵌合体SEQ ID NO：14(转换为双链形式)进行测试，结果为1.202ng/kg。因此，在该测定中，1单位的SEQ ID NO：14(转换为双链形式)相当于24.04pg。
此外，在大鼠DAS测定中测试了所述BoNT/AB嵌合体，以确定与相比的作用持续时间(根据实施例6)。结果显示在以下表12中：
表12.作用持续时间。
总之，BoNT/AB的作用持续时间远高于与SEQ ID NO：4(转换为双链形式)的作用持续时间相似。因此，预计SEQ ID NO：4(转换为双链形式)的单位剂量和给药方案可以类似地应用于BoNT/AB，为影响受试者眼睑肌肉的疾病提供改进的治疗。
实施例10
确定用于治疗影响受试者眼睑肌肉的疾病的修饰的BoNT/A(SEQ ID NO：14转换为
双链形式)的单位剂量
鉴于临床前药理学数据，已经确定修饰的BoNT/A施用于人的的合适单位剂量(UD)。
根据计算，SEQ ID NO：14(转换为双链形式)的DAS ED50为13pg/kg，比同一动物物种的未观察到有害作用水平(NOAEL)4ng/kg低大约300倍。SEQ ID NO：14(转换为双链形式)在大鼠中的ED50为13pg/kg，相当于体重为60kg的人的0.8ng剂量。因此，1000pg的剂量被认为是优选的。然而，如上所述，考虑到治疗影响受试者眼睑肌肉的疾病(例如，眼睑痉挛或面肌痉挛)期间每个部位施用10U是治疗有效的，因此认为相应的10U剂量的修饰的BoNT/A(SEQ ID NO：14转换为双链形式)也将是有效的最小单位剂量(例如，以类似的方式施用)。使用上述腹腔内小鼠LD50数据，240.4pg(四舍五入为240pg)修饰的BoNT/A等于大约10U
两种非临床安全性物种(大鼠和猴)的NOAEL均为4ng/kg，换算成60kg为体重的人的剂量为240000pg。
出于谨慎考虑，治疗上限被选定为24000pg(约998U)，比NOAEL低10倍。
因此，对影响受试者眼睑肌肉的疾病的合适治疗使用至少240pg(10U)修饰的BoNT/A，治疗期间总剂量至多24000pg(约998U)。可以基于施用修饰的BoNT/A的肌肉和/或部位的数量来确定单位剂量的上限。例如，当将修饰的BoNT/A施用于三个肌肉和/或部位(例如，单侧眼睑痉挛治疗中的外侧上眼轮匝肌、内侧上眼轮匝肌和外侧下眼轮匝肌)时，合适的单位剂量为240pg至8000pg(10U至约332.7U)修饰的BoNT/A。如果施用于六个肌肉/部位(例如，双侧眼睑痉挛治疗中的2×外侧上眼轮匝肌、2×内侧上眼轮匝肌和2x外侧下眼轮匝肌)，合适的单位剂量为240pg至4000pg(10U至约166.3U)修饰的BoNT/A。这确保不超过总剂量。
鉴于与实施例9的临床前数据所确定的相比安全性有所提高，在治疗影响受试者眼睑肌肉的疾病中施用的总剂量(单位)预计比高4倍以上。治疗眼睑痉挛和单独的面肌痉挛的最大总剂量为240单位(每只眼睛120单位)。
有利地，在达到最大剂量之前，可以注射更多修饰的BoNT/A(SEQ ID NO：14转换为双链形式)和/或可以在更多的肌肉和/或部位注射以治疗影响受试者眼睑肌肉的疾病。该发现重要且有利，这使得对此类疾病的治疗有所改进，同时为临床医生提供范围更广的治疗选择。
实施例11
使用修饰的BoNT/A(SEQ ID NO：14转换为双链形式)治疗影响受试者眼睑肌肉的
疾病的给药方案
修饰的BoNT/A(例如，SEQ ID NO：14转换为双链形式)以冻干粉末的形式装在小瓶中，每小瓶含有36ng修饰的BoNT/A。复原冻干粉末。
单位剂量(UD)为240至8000pg(约10至332.7单位[通过小鼠LD50测量])。
根据以下给药方案通过注射治疗疾病(表13)：
| 肌肉/部位 | 给药(单位剂量) |
| 外侧上眼轮匝肌 | 1×UD |
| 内侧上眼轮匝肌 | 1×UD |
| 外侧下眼轮匝肌 | 1×UD |
表13.给药方案。
施用的最大总剂量为24000pg(约998单位)。这比治疗眼睑痉挛或面肌痉挛期间可施用的最大总剂量高4倍以上，且未接近毒性极限(传统治疗方案的问题)。因此，临床医生能够对受试者进行定制治疗，因为其知道可以施用24000pg(约998U)而没有任何毒性问题，从而允许对受试者的其他肌肉进行治疗和/或确保每个肌肉和/或其部位获得药学上有效剂量。
实施例12
治疗眼睑痉挛患者
Loretta，52岁，被其全科医生诊断患有双侧眼睑痉挛。将修饰的BoNT/A(SEQ IDNO：14转换为双链形式)施用于Loretta的各个以下肌肉/部位：
·1×单位剂量(UD)2000pg施用于左眼外侧上眼轮匝肌；
·1×UD 2000pg施用于左眼内侧上眼轮匝肌；
·1×UD 2000pg施用于左眼外侧下眼轮匝肌；
·1×UD 2000pg施用于右眼外侧上眼轮匝肌；
·1×UD 2000pg施用于右眼内侧上眼轮匝肌；以及
·1×UD 2000pg施用于右眼外侧下眼轮匝肌。
修饰的BoNT/A总量小于上限24000pg。眼睑痉挛得到缓解，并且由于修饰的BoNT/A的持续时间长，Loretta持续9个月不需要进一步治疗。因此，与施用未修饰的BoNT/A的同等受试者相比，Loretta接受注射的频率更低(例如，每年一次)。此外，由于修饰的BoNT/A的安全性提高，Loretta未出现任何副作用。
实施例13
治疗眼睑痉挛患者
Eleanor，63岁，被其全科医生诊断患有单侧眼睑痉挛，影响其左眼附近的眼睑肌肉。
将修饰的BoNT/A(SEQ ID NO：4转换为双链形式)施用于Eleanor的各个以下肌肉/部位：
·1×单位剂量(UD)250pg施用于左眼外侧上眼轮匝肌；
·1×UD 250pg施用于左眼内侧上眼轮匝肌；
·1×UD 250pg施用于左眼外侧下眼轮匝肌；以及
·2×UD 500pg施用于左眼额肌(在2×部位)。
修饰的BoNT/A总量小于上限2000pg。眼睑痉挛得到缓解，并且由于修饰的BoNT/A的持续时间长，Eleanor超过9个月不需要进一步治疗。因此，与施用未修饰的BoNT/A的同等受试者相比，Eleanor接受注射的频率更低(例如，每年一次)。此外，由于修饰的BoNT/A的安全性提高，Eleanor未出现任何副作用
实施例14
治疗面肌痉挛患者
Derek，49岁，被诊断患有影响其面部左侧的面肌痉挛(例如，典型面肌痉挛)。将修饰的BoNT/A(SEQ ID NO：14转换为双链形式)施用于Derek的各个以下肌肉/部位：
·1×单位剂量(UD)3000pg施用于左眼外侧上眼轮匝肌；
·1×UD 3000pg施用于左眼内侧上眼轮匝肌；
·1×UD 3000pg施用于左眼外侧下眼轮匝肌；
·1×UD 3000pg施用于面部左侧皱眉肌；
·1×UD 3000pg施用于面部左侧额肌；
·1×UD 3000pg施用于面部左侧颧大肌；
·1×UD 3000pg施用于面部左侧颊肌；以及
·1×UD 3000pg施用于面部左侧咬肌。
修饰的BoNT/A总量至多为上限24000pg。面肌痉挛得到缓解，由于修饰的BoNT/A的持续时间长，Derek超过9个月不需要进一步治疗。因此，与施用未修饰的BoNT/A的同等受试者相比，Derek接受注射的频率更低(例如，每年一次)。此外，由于修饰的BoNT/A的安全性提高，Derek未出现任何副作用
实施例15
治疗面肌痉挛患者
Kayleigh，41岁，被其全科医生诊断患有影响其右眼附近眼睑肌肉的面肌痉挛(例如，典型面肌痉挛)。将修饰的BoNT/A(SEQ ID NO：4转换为双链形式)施用于Kayleigh的各个以下肌肉/部位：
·1×单位剂量(UD)650pg施用于右眼外侧上眼轮匝肌；
·1×UD 650pg施用于右眼内侧上眼轮匝肌；以及
·1×UD 650pg施用于右眼外侧下眼轮匝肌。
修饰的BoNT/A总量小于上限2000pg。面肌痉挛得到缓解，由于修饰的BoNT/A的持续时间长，Kayleigh持续9个月不需要进一步治疗。因此，与施用未修饰的BoNT/A的同等受试者相比，Kayleigh接受注射的频率更低(例如，每年一次)。此外，由于修饰的BoNT/A的安全性提高，Kayleigh未出现任何副作用。
实施例16
治疗面肌痉挛患者
Stephen，43岁，被其全科医生诊断患有面肌痉挛，主要影响嘴唇，但也影响脸颊部位，表明非典型面肌痉挛。将修饰的BoNT/A(SEQ ID NO：4转换为双链形式)施用于Stephen的各个以下肌肉/部位：
·1×单位剂量(UD)650pg施用于口轮匝肌上肌；
·1×UD 650pg施用于口轮匝肌下肌；以及
·1×UD 650pg施用于受影响面颊附近的颊肌。
修饰的BoNT/A总量小于上限2000pg。面肌痉挛得到缓解，由于修饰的BoNT/A的持续时间长，Stephen持续9个月无需进一步治疗。因此，与施用未修饰的BoNT/A的同等受试者相比，Stephen接受注射的频率更低(例如，每年一次)。此外，由于修饰的BoNT/A的安全性提高，Stephen未出现任何副作用。
实施方案：
1.一种修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)，其用于治疗影响受试者眼睑肌肉的疾病的方法中，该方法包含：
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；以及
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌，
其中单个单位剂量的修饰的BoNT/A为至少240pg(优选240pg至8000pg)修饰的BoNT/A，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多24000pg修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
2.根据实施方案1的供使用的修饰的BoNT/A，其中单个单位剂量的修饰的BoNT/A为240pg至4800pg修饰的BoNT/A。
3.根据实施方案1或2的供使用的修饰的BoNT/A，其中单个单位剂量的修饰的BoNT/A为240pg至4000pg修饰的BoNT/A。
4.根据前述实施方案中任一项的供使用的修饰的BoNT/A，其中单个单位剂量的修饰的BoNT/A为240pg至2400pg修饰的BoNT/A。
5.根据前述实施方案中任一项的供使用的修饰的BoNT/A，其中单个单位剂量的修饰的BoNT/A为240pg至2000pg修饰的BoNT/A。
6.根据前述实施方案中任一项的供使用的修饰的BoNT/A，其中单个单位剂量(例如，单个单位剂量的下限)为至少500pg修饰的BoNT/A。
7.根据前述实施方案中任一项的供使用的修饰的BoNT/A，其中单个单位剂量(例如，单个单位剂量的下限)为至少1000pg修饰的BoNT/A。
8.一种修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)，其用于治疗影响受试者眼睑肌肉的疾病的方法中，该方法包含：
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；以及
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌，
其中单个单位剂量的修饰的BoNT/A为至少10单位(U)(优选10U至332.7U)修饰的BoNT/A，其中1单位是对应于计算的小鼠半数致死量(LD50)的修饰的BoNT/A的量，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多998U修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
9.根据实施方案8的供使用的修饰的BoNT/A，其中单个单位剂量的修饰的BoNT/A是10U至199.6U的修饰的BoNT/A。
10.根据实施方案8或9的供使用的修饰的BoNT/A，其中单个单位剂量的修饰的BoNT/A是10U至166.3U的修饰的BoNT/A。
11.根据实施方案8至10中任一项的供使用的修饰的BoNT/A，其中单个单位剂量的修饰的BoNT/A为10U至99.8U修饰的BoNT/A。
12.根据实施方案8至11中任一项的供使用的修饰的BoNT/A，其中单个单位剂量的修饰的BoNT/A为10U至83.17U修饰的BoNT/A。
13.根据实施方案8至12中任一项的供使用的修饰的BoNT/A，其中单个单位剂量(例如，单个单位剂量的下限)为至少21U修饰的BoNT/A。
14.根据实施方案8至13中任一项的供使用的修饰的BoNT/A，其中单个单位剂量(例如，单个单位剂量的下限)为至少42U修饰的BoNT/A。
15.根据前述实施方案中任一项的供使用的修饰的BoNT/A，其中修饰的BoNT/A包含与SEQ ID NO：14具有至少70％序列同一性的多肽序列。
16.一种修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)，其用于治疗影响受试者眼睑肌肉的疾病的方法中，该方法包含：
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；以及
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌，
其中单个单位剂量的修饰的BoNT/A为至少84pg(优选84pg至666.7pg)修饰的BoNT/A，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多2000pg修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，其中修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(ii)用不带电的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代不带电的表面暴露的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；以及
(v)缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。
17.根据实施方案16的供使用的修饰的BoNT/A，其中单个单位剂量的修饰的BoNT/A为84pg至400pg修饰的BoNT/A.
18.根据实施方案16或17的供使用的修饰的BoNT/A，其中单个单位剂量的修饰的BoNT/A为84pg至333.3pg修饰的BoNT/A。
19.根据实施方案16至18中任一项的供使用的修饰的BoNT/A，其中单个单位剂量的修饰的BoNT/A为84pg至200pg修饰的BoNT/A。
20.根据实施方案16至19中任一项的供使用的修饰的BoNT/A，其中单个单位剂量的修饰的BoNT/A为84pg至166.7pg修饰的BoNT/A。
21.根据实施方案16至20中任一项的供使用的修饰的BoNT/A，其中单个单位剂量(例如，单个单位剂量的下限)为至少100pg修饰的BoNT/A。
22.一种修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)，其用于治疗影响受试者眼睑肌肉的疾病的方法中，该方法包含：
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；以及
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌，
其中单个单位剂量的修饰的BoNT/A为至少10U(优选10U至79U)修饰的BoNT/A，其中1单位是对应于计算的小鼠半数致死量(LD50)的修饰的BoNT/A的量，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多237U修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，其中修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(ii)用不带电的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代不带电的表面暴露的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；以及
(v)缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。
23.根据实施方案22的供使用的修饰的BoNT/A，其中所述单个单位剂量的修饰的BoNT/A为10U至47.4U修饰的BoNT/A。
24.根据实施方案22或23的供使用的修饰的BoNT/A，其中单个单位剂量的修饰的BoNT/A是10U至39.5U修饰的BoNT/A。
25.根据实施方案22至24中任一项的供使用的修饰的BoNT/A，其中单个单位剂量的修饰的BoNT/A为10U至23.7U修饰的BoNT/A。
26.根据实施方案22至25中任一项的供使用的修饰的BoNT/A，其中单个单位剂量的修饰的BoNT/A为10U至19.75U修饰的BoNT/A。
27.根据实施方案22至26中任一项的供使用的修饰的BoNT/A，其中单个单位剂量(例如，单个单位剂量的下限)为至少12U修饰的BoNT/A。
28.根据实施方案16至27中任一项的供使用的修饰的BoNT/A，其中所述修饰包含(优选由其组成)在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 930、ASN954、SER 955、GLN 991、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1052、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274或THR 1277，并且其中修饰的BoNT/A由与选自SEQ ID NO：3、5、7和9的核酸序列具有至少70％序列同一性的核酸序列编码，和/或包含与选自SEQ ID NO：4、6、8和10的多肽序列具有至少70％序列同一性的多肽序列，优选其中所述修饰包含(优选由其组成)在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 930、SER 955、GLN 991、ASN 1026、ASN 1052和GLN 1229，并且其中修饰的BoNT/A由与SEQ ID NO：3具有至少70％序列同一性的核酸序列编码，和/或包含与选自SEQ ID NO：4的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的多肽序列。
29.根据实施方案16至28中任一项的供使用的修饰的BoNT/A，其中修饰是取代，优选用赖氨酸或精氨酸取代。
30.根据前述实施方案中任一项的供使用的修饰的BoNT/A，其中修饰的BoNT/A具有大于7的安全性比率，其中安全性比率计算如下：以pg/小鼠测量的-10％体重变化所需的毒素剂量除以以pg/小鼠测量的DAS ED50，其中ED50＝产生DAS评分2所需的剂量。
31.根据实施方案1、3至8、10至16、18至22或24至30中任一项的供使用的修饰的BoNT/A，其中该方法还包含：
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第二只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第二只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；以及
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第二只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌。
32.根据前述实施方案中任一项的供使用的修饰的BoNT/A，其中影响受试者眼睑肌肉的疾病为眼睑痉挛。
33.根据前述实施方案中任一项的供使用的修饰的BoNT/A，其还包含将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者眼睛附近的内侧下眼轮匝肌，其中在治疗期间施用的修饰的BoNT/A的总剂量不超过所述的剂量(例如，在前述条款中)。
34.根据前述实施方案中任一项的供使用的修饰的BoNT/A，还包含将至少单个单位剂量(例如，两个单位剂量)修饰的BoNT/A施用于受试者眼睛附近的额肌，其中在治疗期间施用的修饰的BoNT/A的总剂量不超过所述的剂量(例如，在前述条款中)。
35.根据前述实施方案中任一项的供使用的修饰的BoNT/A，还包含将至少单个单位剂量(例如，两个单位剂量)修饰的BoNT/A施用于受试者眼睛附近的皱眉肌，其中在治疗期间施用的修饰的BoNT/A的总剂量不超过所述的剂量(例如，在前述条款中)。
36.根据前述实施方案中任一项的供使用的修饰的BoNT/A，其中影响受试者眼睑肌肉的疾病为面肌痉挛。
37.根据实施方案36的供使用的修饰的BoNT/A，还包含将修饰的BoNT/A施用于选自以下的一个或多个肌肉：口轮匝肌(例如，口轮匝肌上肌和/或口轮匝肌下肌)、颧肌(例如，颧大肌)、鼻肌、颏肌、颈阔肌、额肌、皱眉肌、颊肌、咬肌、降眉间肌和外眦；其中在治疗期间施用的修饰的BoNT/A的总剂量不超过所述的剂量(例如，在前述条款中)。
38.根据前述实施方案中任一项的供使用的修饰的BoNT/A，其中BoNT/A通过皮下施用，优选通过皮下注射施用。
39.根据实施方案1至38中任一项的供使用的修饰的BoNT/A，其中BoNT/A通过肌内施用，优选通过肌内注射施用。
40.根据前述实施方案中任一项所述的修饰的BoNT/A，其中修饰的BoNT/A通过每个注射部位单个单位剂量的方式施用。
条款
1.一种修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)，其用于治疗影响受试者眼睑肌肉的疾病的方法中，该方法包含：
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；以及
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌，
其中单个单位剂量的修饰的BoNT/A为至少240pg(优选240pg至8000pg)修饰的BoNT/A，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多24000pg修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
2.一种修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)，其用于治疗影响受试者眼睑肌肉的疾病的方法中，与通过未修饰的BoNT/A(例如，SEQ ID NO：2)治疗相比，其持续时间更长，该方法包含：
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；以及
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌，
其中单个单位剂量的修饰的BoNT/A为至少240pg(优选240pg至8000pg)修饰的BoNT/A，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多24000pg修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
3.一种治疗影响受试者眼睑肌肉的疾病的方法，该方法包含：
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；以及
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌，
其中单个单位剂量的修饰的BoNT/A为至少240pg(优选240pg至8000pg)修饰的BoNT/A，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多24000pg修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
4.一种治疗影响受试者眼睑肌肉的疾病的方法，与通过未修饰的BoNT/A(例如，SEQ ID NO：2)治疗相比，其持续时间更长，该方法包含：
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；以及
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌，
其中单个单位剂量的修饰的BoNT/A为至少240pg(优选240pg至8000pg)修饰的BoNT/A，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多24000pg修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
5.修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)在制备用于治疗影响受试者眼睑肌肉的疾病的药物中的用途，其中治疗该疾病包含：
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；以及
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌，
其中单个单位剂量的修饰的BoNT/A为至少240pg(优选240pg至8000pg)修饰的BoNT/A，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多24000pg修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
6.修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)在制备用于治疗影响受试者眼睑肌肉的疾病的药物中的用途，与通过未修饰的BoNT/A(例如，SEQ ID NO：2)治疗相比，其持续时间更长，其中治疗该疾病包含：
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；以及
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌，
其中单个单位剂量的修饰的BoNT/A为至少240pg(优选240pg至8000pg)修饰的BoNT/A，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多24000pg修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
7.根据前述条款中任一项所述的供使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，其中单个单位剂量的修饰的BoNT/A为240pg至4800pg修饰的BoNT/A。
8.根据前述条款中任一项所述的供使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，其中单个单位剂量的修饰的BoNT/A为240pg至4000pg修饰的BoNT/A。
9.根据前述条款中任一项所述的供使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，其中单个单位剂量的修饰的BoNT/A为240pg至2400pg修饰的BoNT/A
10.根据前述条款中任一项所述的供使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，其中单个单位剂量的修饰的BoNT/A为240pg至2000pg修饰的BoNT/A。
11.根据前述条款中任一项所述的供使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，其中单个单位剂量(例如，单个单位剂量的下限)为至少500pg修饰的BoNT/A。
12.根据前述条款中任一项所述的供使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，其中单个单位剂量(例如，单个单位剂量的下限)为至少1000pg修饰的BoNT/A。
13.一种修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)，其用于治疗影响受试者眼睑肌肉的疾病的方法中，该方法包含：
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；以及
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌，
其中单个单位剂量的修饰的BoNT/A为至少10单位(U)修饰的BoNT/A，其中1单位是对应于计算的小鼠半数致死量(LD50)的修饰的BoNT/A的量，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多998U修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
14.一种修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)，其用于治疗影响受试者眼睑肌肉的疾病的方法中，与通过未修饰的BoNT/A(例如，SEQ ID NO：2)治疗相比，其持续时间更长，该方法包含：
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；以及
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌，
其中单个单位剂量的修饰的BoNT/A为至少10单位(U)修饰的BoNT/A，其中1单位是对应于计算的小鼠半数致死量(LD50)的修饰的BoNT/A的量，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多998U修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
15.一种治疗影响受试者眼睑肌肉的疾病的方法，该方法包含：
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；以及
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌，
其中单个单位剂量的修饰的BoNT/A为至少10单位(U)修饰的BoNT/A，其中1单位是对应于计算的小鼠半数致死量(LD50)的修饰的BoNT/A的量，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多998U修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
16.一种治疗影响受试者眼睑肌肉的疾病的方法，与通过未修饰的BoNT/A(例如，SEQ ID NO：2)治疗相比，其持续时间更长，该方法包含：
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；以及
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌，
其中单个单位剂量的修饰的BoNT/A为至少10单位(U)修饰的BoNT/A，其中1单位是对应于计算的小鼠半数致死量(LD50)的修饰的BoNT/A的量，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多998U修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
17.修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)在制备用于治疗影响受试者眼睑肌肉的疾病的药物中的用途，其中治疗该疾病包含：
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；以及
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌，
其中单个单位剂量的修饰的BoNT/A为至少10单位(U)修饰的BoNT/A，其中1单位是对应于计算的小鼠半数致死量(LD50)的修饰的BoNT/A的量，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多998U修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
18.修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)在制备用于治疗影响受试者眼睑肌肉的疾病的药物中的用途，与通过未修饰的BoNT/A(例如，SEQ ID NO：2)治疗相比，其持续时间更长，其中治疗该疾病包含：
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；以及
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌，
其中单个单位剂量的修饰的BoNT/A为至少10单位(U)修饰的BoNT/A，其中1单位是对应于计算的小鼠半数致死量(LD50)的修饰的BoNT/A的量，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多998U修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
19.根据前述条款中任一项所述的供使用的修饰的BoNT/A、方法或修饰的BoNT/A的用途，其中修饰的BoNT/A包含E1191M和S1199Y两个取代突变的组合。
20.根据前述条款中任一项所述的供使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，其中修饰的BoNT/A包含与SEQ ID NO：14具有至少70％序列同一性的多肽序列。
21.根据前述条款中任一项所述的供使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，其中修饰的BoNT/A是双链修饰的BoNT/A，其中轻链(L链)经由二硫键连接至重链(H链)，其可通过包含以下的方法获得：将包含SEQ ID NO：14的单链修饰的BoNT/A与水解其激活环中肽键的蛋白酶接触，从而将单链修饰的BoNT/A转化为相应的双链修饰的BoNT/A。
22.根据前述条款中任一项所述的供使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，其中修饰的BoNT/A为双链修饰的BoNT/A，其中L链经由二硫键连接至H链，其可通过包含以下的方法获得：将由SEQ ID NO：14组成的单链修饰的BoNT/A与水解其激活环中肽键的蛋白酶接触，从而将单链修饰的BoNT/A转化为相应的双链修饰的BoNT/A。
23.一种修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)，其用于治疗影响受试者眼睑肌肉的疾病的方法中，该方法包含：
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；以及
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌，
其中单个单位剂量的修饰的BoNT/A为至少84pg(优选84pg至666.7pg)修饰的BoNT/A，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多2000pg修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，其中修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(ii)用不带电的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代不带电的表面暴露的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；以及
(v)缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。
24.一种修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)，其用于治疗影响受试者眼睑肌肉的疾病的方法中，与通过未修饰的BoNT/A(例如，SEQ ID NO：2)治疗相比，其持续时间更长，该方法包含：
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；以及
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌，
其中单个单位剂量的修饰的BoNT/A为至少84pg(优选84pg至666.7pg)修饰的BoNT/A，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多2000pg修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，其中修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(ii)用不带电的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代不带电的表面暴露的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；以及
(v)缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。
25.一种治疗影响受试者眼睑肌肉的疾病的方法，该方法包含：
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；以及
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌，
其中单个单位剂量的修饰的BoNT/A为至少84pg(优选84pg至666.7pg)修饰的BoNT/A，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多2000pg修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，其中修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(ii)用不带电的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代不带电的表面暴露的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；以及
(v)缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。
26.一种治疗影响受试者眼睑肌肉的疾病的方法，与通过未修饰的BoNT/A(例如，SEQ ID NO：2)治疗相比，其持续时间更长，该方法包含：
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；以及
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌，
其中单个单位剂量的修饰的BoNT/A为至少84pg(优选84pg至666.7pg)修饰的BoNT/A，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多2000pg修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，其中修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(ii)用不带电的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代不带电的表面暴露的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；以及
(v)缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。
27.修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)在制备用于治疗影响受试者眼睑肌肉的疾病的药物中的用途，其中治疗该疾病包含：
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；以及
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌，
其中单个单位剂量的修饰的BoNT/A为至少84pg(优选84pg至666.7pg)修饰的BoNT/A，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多2000pg修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，其中修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(ii)用不带电的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代不带电的表面暴露的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；以及
(v)缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。
28.修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)在制备用于治疗影响受试者眼睑肌肉的疾病的药物中的用途，与通过未修饰的BoNT/A(例如，SEQ ID NO：2)治疗相比，其持续时间更长，其中治疗该疾病包含：
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；以及
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第一只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌，
其中单个单位剂量的修饰的BoNT/A为至少84pg(优选84pg至666.7pg)修饰的BoNT/A，
其中在治疗期间施用的总剂量为至多2000pg修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，其中修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(ii)用不带电的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代不带电的表面暴露的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；以及
(v)缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。
29.根据条款23至28中任一项所述的供使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，其中单个单位剂量的修饰的BoNT/A为84pg至400pg修饰的BoNT/A。
30.根据条款23至29中任一项所述的供使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，其中单个单位剂量的修饰的BoNT/A为84pg至333.3pg修饰的BoNT/A。
31.根据条款23至30中任一项所述的供使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，其中单个单位剂量的修饰的BoNT/A为84pg至200pg修饰的BoNT/A。
32.根据条款23至31中任一项所述的供使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，其中单个单位剂量的修饰的BoNT/A为84pg至166.7pg修饰的BoNT/A。
33.根据条款23至32中任一项所述的供使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，其中单个单位剂量(例如，单个单位剂量的下限)为至少100pg修饰的BoNT/A。
34.根据条款23至33中任一项所述的供使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，其中修饰包含(优选由其组成)在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1052、ASN 1188、ASP 1213、GLY1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274或THR 1277，并且其中修饰的BoNT/A由与选自SEQ ID NO：3、5、7和9的核酸序列具有至少70％序列同一性的核酸序列编码，和/或包含与选自SEQ ID NO：4、6、8和10的多肽序列具有至少70％序列同一性的多肽序列，优选其中修饰包含(优选由其组成)在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN886、ASN 930、SER 955、GLN 991、ASN 1026、ASN 1052和GLN 1229，并且其中修饰的BoNT/A由与SEQ ID NO：3具有至少70％序列同一性的核酸序列编码，和/或包含与选自SEQ ID NO：4的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的多肽序列。
35.根据条款23至34中任一项所述的供使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，其中修饰是取代，优选用赖氨酸或精氨酸取代。
36.根据前述条款中任一项所述的供使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，其中修饰的BoNT/A具有大于7的安全性比率，其中安全性比率计算如下：以pg/小鼠测量的-10％体重变化所需的毒素剂量除以以pg/小鼠测量的DAS ED50，其中ED50＝产生DAS评分2所需的剂量。
37.根据前述条款中任一项所述的供使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，还包含：
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第二只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者第二只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；以及
单个单位剂量的修饰的BoNT/A将施用于受试者第二只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌。
38.根据前述条款中任一项所述的供使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，其中影响受试者眼睑肌肉的疾病为眼睑痉挛。
39.根据前述条款中任一项所述的修饰的BoNT/A的用途、方法或用途，还包含施用：
将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用于受试者眼睛附近的内侧下眼轮匝肌，其中在治疗期间施用的修饰的BoNT/A的总剂量不超过所述的剂量(例如，在前述条款中)；和/或
将至少单个单位剂量(例如，两个单位剂量)修饰的BoNT/A施用于受试者眼睛附近的额肌，其中在治疗期间施用的修饰的BoNT/A的总剂量不超过所述的剂量(例如，在前述条款中)；和/或
将至少单个单位剂量(例如，两个单位剂量)修饰的BoNT/A施用于受试者眼睛附近的皱眉肌，其中在治疗期间施用的修饰的BoNT/A的总剂量不超过所述的剂量(例如，在前述条款中)。
40.根据前述条款中任一项所述的供使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，其中影响受试者眼睑肌肉的疾病为面肌痉挛。
41.根据前述条款中任一项所述的供使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，还包含将修饰的BoNT/A施用于选自以下的一个或多个肌肉：提肌、口轮匝肌(例如，口轮匝肌上肌和/或口轮匝肌下肌)、颧肌(例如，颧大肌)、鼻肌、颏肌、颈阔肌、额肌、皱眉肌、颊肌、咬肌、降眉间肌和外眦，其中在治疗期间施用的修饰的BoNT/A的总剂量不超过所述的剂量(例如，在前述权利要求中)。
42.根据前述条款中任一项所述的供使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，还包含将修饰的BoNT/A施用于选自以下的一个或多个肌肉：口轮匝肌(例如，口轮匝肌下肌和/或口轮匝肌下肌)、颧肌(例如，颧大肌)、鼻肌、颏肌、颈阔肌、额肌、皱眉肌、颊肌、咬肌、降眉间肌和外眦，其中在治疗期间施用的修饰的BoNT/A的总剂量不超过所述的剂量(例如，在前述条款中)。
43.根据前述条款中任一项所述的供使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，还包含将修饰的BoNT/A施用于选自以下的一个或多个肌肉：提肌、额肌、皱眉肌、降眉间肌和外眦，其中在治疗期间施用的修饰的BoNT/A的总剂量不超过所述的剂量(例如，在前述条款中)。
44.根据前述条款中任一项所述的供使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，其中BoNT/A通过皮下施用，优选通过皮下注射施用。
45.根据条款1至43中任一项所述的供使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，其中BoNT/A通过肌内施用，优选通过肌内注射施用。
46.根据前述条款中任一项所述的供使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，其中通过每个注射部位单个单位剂量的方式施用修饰的BoNT/A。
47.根据前述条款中任一项所述的供使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，其中受试者为人类受试者。
上述说明书中提到的全部出版物均通过引用并入本文。在不脱离本发明的范围和精神的情况下，本发明的所述方法和系统的各种修改和变化对本领域技术人员而言均显而易见。尽管已结合特定的优选实施方案描述了本发明，但是应当理解，所要求保护的发明不应当不适当地受限于这些特定实施方案。实际上，对生物化学和生物技术或相关领域的技术人员而言显而易见的用于实施本发明的所述模式的各种修改均落入以下权利要求的范围内。
Claims (35)
1.一种修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)，其用于治疗受试者眼睑痉挛的方法中(例如，与通过未修饰的BoNT/A(例如，SEQ ID NO：2)治疗相比，持续时间更长)，其中通过在所述受试者面部的多个部位进行肌内注射来施用所述修饰的BoNT/A，所述方法包含：
a)将单位剂量的所述修饰的BoNT/A施用于所述受试者第一只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
b)将单位剂量的所述修饰的BoNT/A施用于所述受试者第一只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；以及
c)将单位剂量的所述修饰的BoNT/A施用于所述受试者第一只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌，
其中所述单位剂量的所述修饰的BoNT/A为至少240pg(优选240pg至8000pg)修饰的BoNT/A，
其中在所述治疗期间施用的总剂量为至多24000pg所述修饰的BoNT/A，并且
其中所述修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域(HN)以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
2.一种治疗受试者眼睑痉挛的方法(例如，与通过未修饰的BoNT/A(例如，SEQ ID NO：2)治疗相比，持续时间更长)，其中通过在所述受试者面部的多个部位进行肌内注射来施用修饰的BoNT/A，所述方法包含：
a)将单位剂量的所述修饰的BoNT/A施用于所述受试者第一只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
b)将单位剂量的所述修饰的BoNT/A施用于所述受试者第一只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；以及
c)将单位剂量的所述修饰的BoNT/A施用于所述受试者第一只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌，
其中所述单位剂量的所述修饰的BoNT/A为至少240pg(优选240pg至8000pg)修饰的BoNT/A，
其中在所述治疗期间施用的总剂量为至多24000pg所述修饰的BoNT/A，并且
其中所述修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域(HN)以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
3.一种修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)，其用于治疗典型面肌痉挛的方法中(例如，与通过未修饰的BoNT/A(例如，SEQ ID NO：2)治疗相比，持续时间更长)，其中通过在所述受试者面部的多个部位进行肌内注射来施用所述修饰的BoNT/A，所述方法包含：
a)将单位剂量的所述修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
b)将单位剂量的所述修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；
c)将单位剂量的所述修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的外侧下眼轮匝肌；以及
d)根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的所述修饰的BoNT/A施用于一个或多个受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于口轮匝肌上肌；
(ii)一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；
(iii)一个单位剂量施用于颧大肌；
(iv)一个单位剂量施用于颧小肌；
(v)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；
(vi)一个单位剂量施用于颏肌；
(vii)一个单位剂量施用于颈阔肌；
(viii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；
(ix)一个单位剂量施用于颊肌；
(x)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；
(xi)一个单位剂量施用于降眉间肌；
(xii)一个单位剂量施用于鼻肌；和/或
(xiii)一个单位剂量施用于上睑提肌；
其中所述单位剂量的所述修饰的BoNT/A为至少240pg(优选240pg至8000pg)修饰的BoNT/A，
其中在所述治疗期间施用的总剂量为至多24000pg所述修饰的BoNT/A，并且
其中所述修饰的BoNT/A包含A型肉毒神经毒素(BoNT/A)轻链和易位结构域(HN)以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
4.一种治疗受试者典型面肌痉挛的方法(例如，与通过未修饰的BoNT/A(例如，SEQ IDNO：2)治疗相比，持续时间更长)，其中通过在所述受试者面部的多个部位进行肌内注射来施用修饰的BoNT/A，所述方法包含：
a)将单位剂量的所述修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
b)将单位剂量的所述修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；
c)将单位剂量的所述修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的外侧下眼轮匝肌；以及
d)根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的所述修饰的BoNT/A施用于一个或多个受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(xiv)一个单位剂量施用于口轮匝肌上肌；
(xv)一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；
(xvi)一个单位剂量施用于颧大肌；
(xvii)一个单位剂量施用于颧小肌；
(xviii)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；
(xix)一个单位剂量施用于颏肌；
(xx)一个单位剂量施用于颈阔肌；
(xxi)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；
(xxii)一个单位剂量施用于颊肌；
(xxiii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；
(xxiv)一个单位剂量施用于降眉间肌；
(xxv)一个单位剂量施用于鼻肌；和/或
(xxvi)一个单位剂量施用于上睑提肌；
其中所述单位剂量的所述修饰的BoNT/A为至少240pg(优选240pg至8000pg)修饰的BoNT/A，
其中在所述治疗期间施用的总剂量为至多24000pg所述修饰的BoNT/A，并且
其中所述修饰的BoNT/A包含A型肉毒神经毒素(BoNT/A)轻链和易位结构域(HN)以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
5.一种修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)，其用于治疗受试者非典型面肌痉挛(例如，与通过未修饰的BoNT/A(例如，SEQ ID NO：2)治疗相比，持续时间更长)，其中通过在所述受试者面部的多个部位进行肌内注射来施用所述修饰的BoNT/A，所述方法包含：
a)将单位剂量的所述修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的口轮匝肌(例如，将一个单位剂量的所述修饰的BoNT/A施用于受所述面肌痉挛影响的口轮匝肌上肌和/或将一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；优选将一个单位剂量的所述修饰的BoNT/A施用于受所述面肌痉挛影响的口轮匝肌上肌并将一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌)；以及
b)任选地，根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的所述修饰的BoNT/A施用于一个或多个受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于颧大肌；
(ii)一个单位剂量施用于颧小肌；
(iii)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；
(iv)一个单位剂量施用于颏肌；
(v)一个单位剂量施用于颈阔肌；
(vi)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；
(vii)一个单位剂量施用于颊肌；
(viii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；
(ix)一个单位剂量施用于降眉间肌；
(x)一个单位剂量施用于鼻肌；
(xi)一个单位剂量施用于外侧上眼轮匝肌；
(xii)一个单位剂量施用于内侧上眼轮匝肌；
(xiii)一个单位剂量施用于外侧下眼轮匝肌；和/或
(xiv)一个单位剂量施用于上睑提肌；
其中所述单位剂量的所述修饰的BoNT/A为至少240pg(优选240pg至8000pg)修饰的BoNT/A，
其中在所述治疗期间施用的总剂量为至多24000pg所述修饰的BoNT/A，并且
其中所述修饰的BoNT/A包含A型肉毒神经毒素(BoNT/A)轻链和易位结构域(HN)以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
6.一种治疗受试者非典型面肌痉挛的方法(例如，与通过未修饰的BoNT/A(例如，SEQID NO：2)治疗相比，持续时间更长)，其中通过在所述受试者面部的多个部位进行肌内注射来施用修饰的BoNT/A，所述方法包含：
a)将单位剂量的所述修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的口轮匝肌(例如，将一个单位剂量的所述修饰的BoNT/A施用于受所述面肌痉挛影响的口轮匝肌上肌和/或将一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；优选将一个单位剂量的所述修饰的BoNT/A施用于受所述面肌痉挛影响的口轮匝肌上肌并将一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌)；以及
b)任选地，根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的所述修饰的BoNT/A施用于一个或多个受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于颧大肌；
(ii)一个单位剂量施用于颧小肌；
(iii)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；
(iv)一个单位剂量施用于颏肌；
(v)一个单位剂量施用于颈阔肌；
(vi)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；
(vii)一个单位剂量施用于颊肌；
(viii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；
(ix)一个单位剂量施用于降眉间肌；
(x)一个单位剂量施用于鼻肌；
(xi)一个单位剂量施用于外侧上眼轮匝肌；
(xii)一个单位剂量施用于内侧上眼轮匝肌；
(xiii)一个单位剂量施用于外侧下眼轮匝肌；和/或
(xiv)一个单位剂量施用于上睑提肌；
其中所述单位剂量的所述修饰的BoNT/A为至少240pg(优选240pg至8000pg)修饰的BoNT/A，
其中在所述治疗期间施用的总剂量为至多24000pg所述修饰的BoNT/A，并且
其中所述修饰的BoNT/A包含A型肉毒神经毒素(BoNT/A)轻链和易位结构域(HN)以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
7.根据权利要求1或权利要求2所述的供使用的修饰的BoNT/A或方法，还包含：根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的所述修饰的BoNT/A施用于一个或多个受所述眼睑痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于口轮匝肌上肌；
(ii)一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；
(iii)一个单位剂量施用于颧大肌；
(iv)一个单位剂量施用于颧小肌；
(v)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；
(vi)一个单位剂量施用于颏肌；
(vii)一个单位剂量施用于颈阔肌；
(viii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；
(ix)一个单位剂量施用于颊肌；
(x)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；
(xi)一个单位剂量施用于降眉间肌；
(xii)一个单位剂量施用于鼻肌；和/或
(xiii)一个单位剂量施用于上睑提肌。
8.根据权利要求1、2或7中任一项所述的供使用的修饰的BoNT/A或方法，还包含：根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的所述修饰的BoNT/A施用于一个或多个受所述眼睑痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于上睑提肌。
9.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的修饰的BoNT/A或方法，其中所述单位剂量的所述修饰的BoNT/A为240pg至4800pg修饰的BoNT/A。
10.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的修饰的BoNT/A或方法，其中所述单位剂量的所述修饰的BoNT/A为240pg至4000pg修饰的BoNT/A。
11.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的修饰的BoNT/A或方法，其中所述单位剂量的所述修饰的BoNT/A为240pg至2400pg修饰的BoNT/A。
12.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的修饰的BoNT/A或方法，其中所述单位剂量的所述修饰的BoNT/A为240pg至2000pg修饰的BoNT/A。
13.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的修饰的BoNT/A或方法，其中所述单位剂量(例如，所述单位剂量的下限)为至少500pg修饰的BoNT/A。
14.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的修饰的BoNT/A或方法，其中所述单位剂量(例如，所述单个单位剂量的下限)为至少1000pg修饰的BoNT/A。
15.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的修饰的BoNT/A或方法，其中所述修饰的BoNT/A包含与SEQ ID NO：14具有至少70％序列同一性的多肽序列。
16.根据前述权利要求中任一项所述的修饰的BoNT/A的用途或方法，其中所述修饰的BoNT/A包含E1191M和S1199Y两个取代突变的组合。
17.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的修饰的BoNT/A或方法，其中所述修饰的BoNT/A为双链修饰的BoNT/A，其中所述轻链(L链)经由二硫键连接至所述重链(H链)，其可通过包含以下的方法获得：将包含SEQ ID NO：14的单链修饰的BoNT/A与水解其激活环中肽键的蛋白酶接触，从而将所述单链修饰的BoNT/A转化为相应的双链修饰的BoNT/A。
18.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的修饰的BoNT/A或方法，其中所述修饰的BoNT/A为双链修饰的BoNT/A，其中所述L链经由二硫键连接至H链，其可通过包含以下的方法获得：将由SEQ ID NO：14组成的单链修饰的BoNT/A与水解其激活环中肽键的蛋白酶接触，从而将所述单链修饰的BoNT/A转化为相应的双链修饰的BoNT/A。
19.一种修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)，其用于治疗受试者眼睑痉挛的方法中(例如，与通过未修饰的BoNT/A(例如，SEQ ID NO：2)治疗相比，持续时间更长)，其中通过在所述受试者面部的多个部位进行肌内注射来施用所述修饰的BoNT/A，所述方法包含：
a)将单位剂量的所述修饰的BoNT/A施用于所述受试者第一只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
b)将单位剂量的所述修饰的BoNT/A施用于所述受试者第一只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；以及
c)将单位剂量的所述修饰的BoNT/A施用于所述受试者第一只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌，
其中所述单位剂量的所述修饰的BoNT/A为至少84pg(优选84pg至666.7pg)修饰的BoNT/A，
其中在所述治疗期间施用的总剂量为至多2000pg所述修饰的BoNT/A，并且
其中所述修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，其中所述修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(ii)用不带电的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代不带电的表面暴露的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；以及
(v)缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。
20.一种治疗受试者眼睑痉挛的方法(例如，与通过未修饰的BoNT/A(例如，SEQ ID NO：2)治疗相比，持续时间更长)，其中通过在所述受试者面部的多个部位进行肌内注射来施用修饰的BoNT/A，所述方法包含：
a)将单位剂量的所述修饰的BoNT/A施用于所述受试者第一只眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
b)将单位剂量的所述修饰的BoNT/A施用于所述受试者第一只眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；以及
c)将单位剂量的所述修饰的BoNT/A施用于所述受试者第一只眼睛附近的外侧下眼轮匝肌，
其中所述单位剂量的所述修饰的BoNT/A为至少84pg(优选84pg至666.7pg)修饰的BoNT/A，
其中在所述治疗期间施用的总剂量为至多2000pg所述修饰的BoNT/A，并且
其中所述修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，其中所述修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(ii)用不带电的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代不带电的表面暴露的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；以及
(v)缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。
21.一种修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)，其用于治疗典型面肌痉挛的方法中(例如，与通过未修饰的BoNT/A(例如，SEQ ID NO：2)治疗相比，持续时间更长)，其中通过在所述受试者面部的多个部位进行肌内注射来施用所述修饰的BoNT/A，所述方法包含：
a)将单位剂量的所述修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
b)将单位剂量的所述修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；
c)将单位剂量的所述修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的外侧下眼轮匝肌；以及
d)根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的所述修饰的BoNT/A施用于一个或多个受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于口轮匝肌上肌；
(ii)一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；
(iii)一个单位剂量施用于颧大肌；
(iv)一个单位剂量施用于颧小肌；
(v)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；
(vi)一个单位剂量施用于颏肌；
(vii)一个单位剂量施用于颈阔肌；
(viii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；
(ix)一个单位剂量施用于颊肌；
(x)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；
(xi)一个单位剂量施用于降眉间肌；
(xii)一个单位剂量施用于鼻肌；和/或
(xiii)一个单位剂量施用于上睑提肌；
其中所述单位剂量的所述修饰的BoNT/A为至少84pg(优选84pg至666.7pg)修饰的BoNT/A，
其中在所述治疗期间施用的总剂量为至多2000pg所述修饰的BoNT/A，并且
其中所述修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，其中所述修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(ii)用不带电的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代不带电的表面暴露的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；以及
(v)缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。
22.一种治疗受试者典型面肌痉挛的方法(例如，与通过未修饰的BoNT/A(例如，SEQ IDNO：2)治疗相比，持续时间更长)，其中通过在所述受试者面部的多个部位进行肌内注射来施用修饰的BoNT/A，所述方法包含：
a)将单位剂量的所述修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的外侧上眼轮匝肌；
b)将单位剂量的所述修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的内侧上眼轮匝肌；
c)将单位剂量的所述修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的眼睛附近的外侧下眼轮匝肌；以及
d)根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的所述修饰的BoNT/A施用于一个或多个受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于口轮匝肌上肌；
(ii)一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；
(iii)一个单位剂量施用于颧大肌；
(iv)一个单位剂量施用于颧小肌；
(v)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；
(vi)一个单位剂量施用于颏肌；
(vii)一个单位剂量施用于颈阔肌；
(viii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；
(ix)一个单位剂量施用于颊肌；
(x)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；
(xi)一个单位剂量施用于降眉间肌；
(xii)一个单位剂量施用于鼻肌；和/或
(xiii)一个单位剂量施用于上睑提肌；
其中所述单位剂量的所述修饰的BoNT/A为至少84pg(优选84pg至666.7pg)修饰的BoNT/A，
其中在所述治疗期间施用的总剂量为至多2000pg所述修饰的BoNT/A，并且
其中所述修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，其中所述修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(ii)用不带电的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代不带电的表面暴露的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；以及
(v)缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。
23.一种修饰的A型肉毒神经毒素(BoNT/A)，其用于治疗非典型面肌痉挛(例如，与通过未修饰的BoNT/A(例如，SEQ ID NO：2)治疗相比，持续时间更长)，其中通过在受试者面部的多个部位进行肌内注射来施用所述修饰的BoNT/A，所述方法包含：
a)将单位剂量的所述修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的口轮匝肌(例如，将一个单位剂量的所述修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的口轮匝肌上肌和/或将一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；优选将一个单位剂量的所述修饰的BoNT/A施用于受所述面肌痉挛影响的口轮匝肌上肌并将一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌)；以及
b)任选地，根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的所述修饰的BoNT/A施用于一个或多个受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于颧大肌；
(ii)一个单位剂量施用于颧小肌；
(iii)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；
(iv)一个单位剂量施用于颏肌；
(v)一个单位剂量施用于颈阔肌；
(vi)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；
(vii)一个单位剂量施用于颊肌；
(viii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；
(ix)一个单位剂量施用于降眉间肌；
(x)一个单位剂量施用于鼻肌；
(xi)一个单位剂量施用于外侧上眼轮匝肌；
(xii)一个单位剂量施用于内侧上眼轮匝肌；
(xiii)一个单位剂量施用于外侧下眼轮匝肌；和/或
一个单位剂量施用于上睑提肌；其中所述单位剂量的所述修饰的BoNT/A为至少84pg(优选84pg至666.7pg)修饰的BoNT/A，
其中在所述治疗期间施用的总剂量为至多2000pg所述修饰的BoNT/A，并且
其中所述修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，其中所述修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(ii)用不带电的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代不带电的表面暴露的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；以及
(v)缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。
24.一种治疗受试者非典型面肌痉挛的方法(例如，与通过未修饰的BoNT/A(例如，SEQID NO：2)治疗相比，持续时间更长)，其中通过在所述受试者面部的多个部位进行肌内注射来施用修饰的BoNT/A，所述方法包含：
a)将单位剂量的所述修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的口轮匝肌(例如，将一个单位剂量的所述修饰的BoNT/A施用于受面肌痉挛影响的口轮匝肌上肌和/或将一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；优选将一个单位剂量的所述修饰的BoNT/A施用于受所述面肌痉挛影响的口轮匝肌上肌并将一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌)；以及
b)任选地，根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的所述修饰的BoNT/A施用于一个或多个受所述面肌痉挛影响的其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于颧大肌；
(ii)一个单位剂量施用于颧小肌；
(iii)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；
(iv)一个单位剂量施用于颏肌；
(v)一个单位剂量施用于颈阔肌；
(vi)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；
(vii)一个单位剂量施用于颊肌；
(viii)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；
(ix)一个单位剂量施用于降眉间肌；
(x)一个单位剂量施用于鼻肌；
(xi)一个单位剂量施用于外侧上眼轮匝肌；
(xii)一个单位剂量施用于内侧上眼轮匝肌；
(xiii)一个单位剂量施用于外侧下眼轮匝肌；和/或
一个单位剂量施用于上睑提肌；其中所述单位剂量的所述修饰的BoNT/A为至少84pg(优选84pg至666.7pg)修饰的BoNT/A，
其中在所述治疗期间施用的总剂量为至多2000pg所述修饰的BoNT/A，并且
其中所述修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，其中所述修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(ii)用不带电的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代不带电的表面暴露的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；以及
(v)缺失酸性表面暴露的氨基酸残基。
25.根据权利要求19或权利要求20所述的供使用的修饰的BoNT/A或方法，还包含：根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的所述修饰的BoNT/A施用于一个或多个受所述眼睑痉挛影响的其他肌肉：
(a)一个单位剂量施用于口轮匝肌上肌；
(b)一个单位剂量施用于口轮匝肌下肌；
(c)一个单位剂量施用于颧大肌；
(d)一个单位剂量施用于颧小肌；
(e)至多五个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于额肌；
(f)一个单位剂量施用于颏肌；
(g)一个单位剂量施用于颈阔肌；
(h)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于皱眉肌；
(i)一个单位剂量施用于颊肌；
(j)至多两个单位剂量(优选一个单位剂量)施用于咬肌；
(k)一个单位剂量施用于降眉间肌；
(l)一个单位剂量施用于鼻肌；和/或
(m)一个单位剂量施用于上睑提肌。
26.根据权利要求19、20或25中任一项所述的供使用的修饰的BoNT/A或方法，还包含：根据以下给药方案，将一个或多个单位剂量的所述修饰的BoNT/A施用于受所述眼睑痉挛影响的一个或多个其他肌肉：
(i)一个单位剂量施用于上睑提肌。
27.根据权利要求19至26中任一项所述的供使用的修饰的BoNT/A或方法，其中所述单位剂量的所述修饰的BoNT/A为84pg至400pg修饰的BoNT/A；和/或
其中所述单位剂量的所述修饰的BoNT/A为84pg至333.3pg修饰的BoNT/A；和/或
其中所述单位剂量的所述修饰的BoNT/A为84pg至200pg修饰的BoNT/A。
28.根据权利要求19至27中任一项所述的供使用的修饰的BoNT/A或方法，其中所述单位剂量的所述修饰的BoNT/A为84pg至166.7pg修饰的BoNT/A；和/或
其中所述单位剂量(例如，单个单位剂量的下限)为至少100pg修饰的BoNT/A。
29.根据权利要求19至28中任一项所述的供使用的修饰的BoNT/A或方法，其中所述修饰包含(优选由其组成)在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1052、ASN 1188、ASP 1213、GLY1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274或THR 1277，并且其中所述修饰的BoNT/A由与选自SEQ ID NO：3、5、7和9的核酸序列具有至少70％序列同一性的核酸序列编码，和/或包含与选自SEQ ID NO：4、6、8和10的多肽序列具有至少70％序列同一性的多肽序列，优选其中所述修饰包含(优选由其组成)在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 930、SER 955、GLN 991、ASN 1026、ASN 1052和GLN 1229，并且其中所述修饰的BoNT/A由与SEQ ID NO：3具有至少70％序列同一性的核酸序列编码，和/或包含与选自SEQ ID NO：4的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的多肽序列。
30.根据权利要求19至29中任一项所述的供使用的修饰的BoNT/A或方法，其中所述修饰是取代，优选用赖氨酸或精氨酸取代。
31.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的修饰的BoNT/A或方法，其中所述修饰的BoNT/A具有大于7的安全性比率，其中安全性比率计算如下：以pg/小鼠测量的-10％体重变化所需的毒素剂量除以以pg/小鼠测量的DAS ED50，其中ED50＝产生DAS评分2所需的剂量。
32.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的修饰的BoNT/A或方法，其中所述方法(优选用于治疗眼睑痉挛)还包含：
将单位剂量的所述修饰的BoNT/A施用于所述受试者第二只眼睛附近的所述外侧上眼轮匝肌；
将单位剂量的所述修饰的BoNT/A施用于所述受试者第二只眼睛附近的所述内侧上眼轮匝肌；以及
将单位剂量的所述修饰的BoNT/A施用于所述受试者第二只眼睛附近的所述外侧下眼轮匝肌。
33.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的修饰的BoNT/A或方法，还包含：
将单位剂量的所述修饰的BoNT/A施用于所述受试者眼睛附近的内侧下眼轮匝肌，其中在所述治疗期间施用的所述修饰的BoNT/A的所述总剂量不超过所述的剂量(例如，在前述权利要求中)；和/或
将至少一个单位剂量(例如，两个单位剂量)的所述修饰的BoNT/A施用于所述受试者眼睛附近的额肌，其中所述治疗期间施用的所述修饰的BoNT/A的所述总剂量不超过所述的剂量(例如，前述权利要求中的剂量)；和/或
将至少一个单位剂量(例如，两个单位剂量)的所述修饰的BoNT/A施用于所述受试者眼睛附近的皱眉肌，其中所述治疗期间施用的所述修饰的BoNT/A的所述总剂量不超过所述的剂量(例如，前述权利要求中的剂量)。
34.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的修饰的BoNT/A或方法，其中通过每个注射部位单个单位剂量的方式施用所述修饰的BoNT/A。
35.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的修饰的BoNT/A或方法，其中所述受试者为人类受试者。
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