TW202426039A - 肢體痙攣之治療 - Google Patents

肢體痙攣之治療 Download PDF

Info

Publication number
TW202426039A
TW202426039A TW112137672A TW112137672A TW202426039A TW 202426039 A TW202426039 A TW 202426039A TW 112137672 A TW112137672 A TW 112137672A TW 112137672 A TW112137672 A TW 112137672A TW 202426039 A TW202426039 A TW 202426039A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
asn
bont
amino acid
modified bont
administered
Prior art date
Application number
TW112137672A
Other languages
English (en)
Inventor
尼可拉 葛瑞勾瑞
凱帝 路菲
菲利浦 彼卡特
Original Assignee
英商艾普森生物製藥有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 英商艾普森生物製藥有限公司 filed Critical 英商艾普森生物製藥有限公司
Publication of TW202426039A publication Critical patent/TW202426039A/zh

Links

Abstract

本發明係關於一種於治療肢體痙攣中使用的經修飾的肉毒桿菌神經毒素A(BoNT/A)，其中藉由肌肉內注射至對象多數受影響的肌肉而投予該經修飾的BoNT/A 。亦提供對應的治療方法及用途，以及單位劑型、及套組。

Description

肢體痙攣之治療
本發明係關於使用經修飾的肉毒桿菌神經毒素A(BoNT/A)治療肢體痙攣。
痙攣為一種運動症狀，其特徵係以速度依賴性的伸張反射增加，伴隨有由伸張反射的過度興奮性導致之誇大的肌腱抽動，為運動神經元症候群之一個組成部分。痙攣與各種神經系統疾病有關，例如多發性硬化症、腦或脊髓損傷、外傷性腦損傷(TBI)、及腦血管疾病(中風)。其特徵為運動障礙(肌肉張力增加、肢體姿勢異常、拮抗肌過度收縮及反射亢進)功能障礙、疼痛及不適。
成人上肢(AUL)痙攣係中風後的常見併發症；它通常為痛苦的(與痙攣性肌肉收縮有關)，且可藉由干擾上肢運動並限制肢體用於主動功能性任務而導致顯著的失能。在嚴重的情況下，其亦可阻礙「被動功能」，如對患肢的清洗、穿衣及照護，因而增加照顧者的負擔。次要併發症可能包括自卑感和身體意象差、生活品質受損(社交和家庭互動減少)及壓迫性潰瘍。
由於患者外觀表現及其目標的多樣性而上肢中風後痙攣管理具有挑戰性。於此等患者中，肌張力過強通常表現為由受影響的肌肉所決定的幾種常見臨床模式，其又與中樞神經系統病變的大小、位置及年齡有關。在31個國家的臨床醫生的國際橫斷面調查中描述此等模式，且隨後將其用於對AUL痙攣的5種典型模式進行分類。此等係相對於肩膀、肘部、前臂及腕關節的位置而被定義。目前的臨床共識及現有指南建議，在選擇患者之治療方法時應考慮痙攣的確切模式，並應根據所選擇的注射用的適當肌肉相應調整肉毒桿菌神經毒素A(BoNT/A)療法。然而，並無兩個患者為相同的，因此需要客制/個人化的治療方案。
專家小組進一步研究此等模式，以便為每一種臨床模式的上肢痙攣(ULS)及目標肌肉的治療參數提供指引(參見圖1)。有代表性地，以BoNT治療為目標，專家小組定義三種總體姿勢組合。此等為： (1)內收的肩(Adducted shoulder)、屈曲的肘(Flexed elbow)、旋前的前臂(Pronated forearm)、屈曲的腕(Flexed wrist)、握拳(Clenched fist)； (2)屈曲的肘、旋前的前臂、屈曲的腕、握拳；及 (3)屈曲的腕、握拳。
已知於＞90%的對象中有圖1所示的四個上肢關節參與(參見圖1)。大多數痙攣性上肢模式(五分之四)係由於肩膀內旋及內收和肘關節屈曲所致，且於前臂及腕的姿勢具有姿勢差異。
整體的ULS治療係針對緩解痙攣的徵候及症狀-減少肌肉痙攣和疼痛、改善姿勢、促進可動性和靈巧性(達到抓握、移動和釋放的自發性運動功能)、使攣縮和變形最小化並增進患者的易於照護以及衛生/自我護理及/或生活品質。可用的藥物治療選擇，如口服(苯二氮卓類(benzodiazepines)、貝可芬(baclofen)、替扎尼定(tizanidine)及單挫林(dantrolene))及鞘內(貝可芬)藥物，大多會引起非選擇性肌肉無力，並有副作用，如全身無力及對中樞神經系統的不良影響，包括共濟失調、嗜睡、鎮靜甚至戒斷症狀。
治療痙攣的最有效途徑為物理治療及肌肉內(i.m.)注射BoNT/A的組合，其在最近幾年的數個指南中已被推薦。BoNT/A已成為一種治療的選擇，因為它具有最小的全身性副作用，且為可局部注射的治療，可藉由選擇性地靶向受影響的肌肉來適應個體的疾病表現。
Dysport ®係含有從A型肉毒桿菌菌株中分離並純化的BoNT/A血球凝集素複合物(BTX-A-HAC)的醫藥產品。肉毒桿菌天然產生的其它幾種BoNT/A醫藥產品亦已為市售(例如BOTOX ®及XEOMIN ®)。
BoNT/A選擇性抑制乙醯膽鹼從突觸前神經末梢的釋放，從而阻斷神經肌肉會合處的膽鹼性神經傳遞，而導致肌肉收縮及肌肉張力降低、引起注入的肌肉放鬆。此作用機制已經在治療上被用於治療數種臨床神經系統狀況，包括局部肌肉緊張不足(focal dystonias)、局部肌肉痙攣及審美狀況，已超過二十年。
然而，目前可用的BoNT/A產品的作用期間約為12至14週，此時新的神經末梢發芽，使神經功能恢復正常，且原始症狀會重新出現。因此，為了維持效果，需要定期重複注射。
因此，考慮到病情的慢性及所需治療的長期性質，BoNT/A注射的頻率為治療痙攣的重要考量。確實，它影響患者及照顧者所涉及的直接和間接的健康費用、醫院/診所內注射的後勤、以及最重要的是患者的生活品質。
Dysport ®被批准用於治療上肢和下肢痙攣，每次治療的最大總劑量為1,500單位(參見圖2–治療上肢痙攣的最大劑量為1,000單位)。需要臨床醫生投予Dysport ®至肢體上的多條肌肉，每次治療療程的總閾值上限為1,500個單位。在對患者進行治療期間，臨床醫生被迫做出艱難的選擇。換言之，在常規治療方案中，臨床醫生必須在可投予的BoNT/A相對較低總量(上肢痙攣的1,500單位或1,000單位-BoNT/A的高毒性性質所必需)及在多個不同肌肉上的有效量之間找到平衡。因此，某些肌肉會被忽略，而其它肌肉接受次優的BoNT/A量，而導致次優的治療。此外，目前的治療方案排除了對肩膀的治療，該肩膀的治療需要在其多個肌肉上使用多個單位劑量。
此外，常規的治療方案為複雜的，且導致臨床醫生為了避免對患者的毒性而投劑不足劑量。如此，需要一種方便、安全、有效的單一劑量單位，以及在治療過程中可對肢體投予的單位數量(包括每條肌肉注射部位的數量)而沒有導致患者毒性的相應指引。
總之，需要一種改善肢體痙攣的治療，其可允許以患者為中心的個人化方法以適應根據目標的臨床模式調整治療方案，從而根據痙攣的分佈、範圍及嚴重度注射不同的肢體肌肉組合避免痙攣，同時避免毒性並提供更持久的治療(導致較少頻率的投予)。亦需要一種改進的治療方案，該方案可治療被忽視的肌肉，如肩膀的肌肉。
本發明克服一或多個之上述問題。
發明摘述
本發明人等已驚訝地發現經修飾的BoNT/A於治療肢體痙攣中發現特殊效用。此經修飾的BoNT/A可包含造成增加的淨正電荷之表面暴露的胺基酸殘基之一或多個修飾。此增加的電荷促進多肽與陰離子細胞外組分之間的靜電相互作用，因而促進多肽及細胞表面之間的結合。反之，此增加了在投予部位的保留(減少自投予部位的擴散)，並導致作用期間增加(例如6-9個月)。或者，經修飾的BoNT/A可包含BoNT/A輕鏈及轉位域及BoNT/B受體結合域(H C域)，其相似地造成展現增加了在投予部位的保留(減少自投予部位的擴散)並導致作用期間增加(例如6-9個月)之經修飾的BoNT/A。有利地，與未經修飾的BoNT/A(例如Dysport ®)相比，經修飾的BoNT/A的安全性輪廓改善。此改善的安全性輪廓可藉由本文經修飾的BoNT/A所述的高安全比來表示。
基於本文的臨床前數據(參見實施例6)，已經顯示可以向對象投予較高總量之經修飾的BoNT/A，而於此種高劑量達成與未經修飾的BoNT/A(例如，Dysport®)相似的安全性輪廓。如此，在達到最大總劑量之前，可於肢體痙攣的治療中在更多的肌肉/部位注射經修飾的BoNT/A。此為一個重要且有利的發現，可以改善肢體痙攣的治療，同時為臨床醫生提供更大範圍的治療選擇。首次，它亦提供能夠治療其它大塊肌肉如彼等肩膀肌肉的選項，同時亦可在最大劑量範圍內良好地治療肘部、前臂及/或腕部。因為提供更持久的治療(導致較少的投予頻率)及/或能夠針對對象量身定制，及/或與使用未經修飾的BoNT/A(例如，Dysport ®)的治療相比，可改善對象的生活品質，而可改善治療。與常規治療方案相比，本發明之治療被改善。
此外，本發明提供一種方便、安全且有效的單一單位劑量以及總劑量(最大劑量)，其可於單次治療中安全地投予。本發明亦提供一種可將該單位劑量投予至肢體的次數的相應指引(例如，包括每條肌肉的注射部位的數目)，而不會導致患者毒性。如此，根據本發明之治療對於臨床醫生而言較不複雜，且有助於避免投劑劑量不足及/或劑量過多。 發明詳細說明
於一態樣，本發明提供一種於治療肢體痙攣中使用的經修飾的肉毒桿菌神經毒素A(BoNT/A)，其中藉由肌肉內注射至對象多數受影響的肌肉而投予該經修飾的BoNT/A， 其中藉由53單位至948單位之單位劑量之經修飾的BoNT/A(較佳藉由每注射部位53單位至948單位之單位劑量之經修飾的BoNT/A)於多數受影響的肌肉投予，且其中1單位為相當於小鼠中經計算的半數致死劑量(LD 50)之經修飾的BoNT/A的量， 其中多數受影響的肌肉選自： 第一群組，包含：屈指淺肌(flexor digitorum superficialis)、屈指深肌(flexor digitorum profundus)、橈側屈腕肌(flexor carpi radialis)、尺側屈腕肌(flexor carpi ulnaris)、肱橈肌(brachioradialis)、旋前圓肌(pronator teres)、肱二頭肌(biceps brachii)、腓腸肌內側頭(gastrocnemius medial head)、腓腸肌外側頭(gastrocnemius lateral head)、屈趾長肌(flexor digitorum longus)、屈足拇長肌(flexor hallucis longus)、腓腸肌(gastrocnemius)、三角肌(deltoid)、提肩胛肌(levator scapulae)、旋前方肌(pronator quadratus)、屈拇長肌(flexor policis longus)、內收拇肌(adductor policis)、屈拇短肌(flexor policis brevis)、掌長肌(palmaris longus)、蚓狀肌(lumbricales)、拇對指肌(opponens policis)、內收大肌(adductor magnus)、內收長肌(adductor longus)、內收短肌(adductor brevis)、股薄肌(gracilis)、內側膕旁肌(medial hamstrings)、外側膕旁肌(lateral hamstrings)、闊筋膜張肌(tensor fascia lata)、股直肌(rectus femoris)、股外側肌(vastus lateralis)、股內側肌(vastus medialis)、股間肌(vastus intermedius)、臀大肌(gluteus maximus)、脛骨前肌(tibialis anterior)、屈趾短肌(flexor digitorum brevis)、伸足拇長肌(extensor hallucis longus)、及屈足拇短肌(flexor hallucis brevis)；及 第二群組，包含：肱三頭肌(triceps brachii)(長頭)、肩胛下肌(subscapularis)、胸肌(pectoralis)(例如，胸大肌(pectoralis major))、闊背肌(latissimus dorsi)、肱二頭肌、肱肌(brachialis)、比目魚肌(soleus)、脛骨後肌(tibialis posterior)、肱橈肌、大圓肌(teres major)、髂腰肌(iliopsoas)、及腓腸肌；及 其中於受影響的第一群組肌肉投予單一單位劑量(較佳於一選擇的注射部位)及/或於受影響的第二群組肌肉投予多個單位劑量(較佳於選擇的不同注射部位)，且其中於治療期間投予的總劑量至多14,220單位，及 其中該經修飾的BoNT/A包含於選自下列一或多個胺基酸殘基的修飾：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS 1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274、及THR 1277，其中該修飾選自： i.以鹼性胺基酸殘基取代酸性表面暴露的胺基酸殘基； ii.以未帶電胺基酸殘基取代酸性表面暴露的胺基酸殘基； iii.以鹼性胺基酸殘基取代未帶電的表面暴露的胺基酸殘基； iv.鹼性胺基酸殘基之插入；及 v.酸性表面暴露的胺基酸殘基之刪除。
於一態樣，本發明提供一種於治療肢體痙攣中使用的經修飾的肉毒桿菌神經毒素A(BoNT/A)，其中藉由肌肉內注射至對象受影響的多數肌肉而投予該經修飾的BoNT/A， 其中藉由53單位至948單位之單位劑量之經修飾的BoNT/A(較佳藉由每注射部位53單位至948單位之單位劑量之經修飾的BoNT/A)於多數受影響的肌肉投予，且其中1單位為相當於小鼠中經計算的半數致死劑量(LD 50)之經修飾的BoNT/A的量， 其中多數受影響的肌肉選自： 第一群組，包含：屈指淺肌、屈指深肌、橈側屈腕肌、尺側屈腕肌、肱橈肌、旋前圓肌、肱二頭肌、腓腸肌內側頭、腓腸肌外側頭、屈趾長肌、屈足拇長肌、腓腸肌、三角肌、提肩胛肌、旋前方肌、屈拇長肌、內收拇肌、屈拇短肌、掌長肌、蚓狀肌、拇對指肌、內收大肌、內收長肌、內收短肌、股薄肌、內側膕旁肌、外側膕旁肌、闊筋膜張肌、股直肌、股外側肌、股內側肌、股間肌、臀大肌、脛骨前肌、屈趾短肌、伸足拇長肌、及屈足拇短肌；及 第二群組，包含：肱三頭肌(長頭)、肩胛下肌、胸肌(例如，胸大肌)、闊背肌、肱二頭肌、肱肌、比目魚肌、脛骨後肌、肱橈肌、大圓肌、髂腰肌、及腓腸肌；及 其中於受影響的第一群組肌肉投予單一單位劑量(較佳於一選擇的注射部位)及/或於受影響的第二群組肌肉投予多個單位劑量(較佳於選擇的不同注射部位)，且其中於治療期間投予的總劑量至多14,220單位，及 其中該經修飾的BoNT/A包含BoNT/A輕鏈及轉位域、及BoNT/B受體結合域(H C域)。
於一相關態樣，本發明提供一種治療肢體痙攣之方法，該方法包含藉由肌肉內注射至對象之多數受影響的肌肉而投予經修飾的肉毒桿菌神經毒素A(BoNT/A)， 其中藉由53單位至948單位之單位劑量之經修飾的BoNT/A(較佳藉由每注射部位53單位至948單位之單位劑量之經修飾的BoNT/A)於多數受影響的肌肉投予，且其中1單位為相當於小鼠中經計算的半數致死劑量(LD 50)之經修飾的BoNT/A的量， 其中多數受影響的肌肉選自： 第一群組，包含：屈指淺肌、屈指深肌、橈側屈腕肌、尺側屈腕肌、肱橈肌、旋前圓肌、肱二頭肌、腓腸肌內側頭、腓腸肌外側頭、屈趾長肌、屈足拇長肌、腓腸肌、三角肌、提肩胛肌、旋前方肌、屈拇長肌、內收拇肌、屈拇短肌、掌長肌、蚓狀肌、拇對指肌、內收大肌、內收長肌、內收短肌、股薄肌、內側膕旁肌、外側膕旁肌、闊筋膜張肌、股直肌、股外側肌、股內側肌、股間肌、臀大肌、脛骨前肌、屈趾短肌、伸足拇長肌、及屈足拇短肌；及 第二群組，包含：肱三頭肌(長頭)、肩胛下肌、胸肌(例如，胸大肌)、闊背肌、肱二頭肌、肱肌、比目魚肌、脛骨後肌、肱橈肌、大圓肌、髂腰肌、及腓腸肌；及 其中於受影響的第一群組肌肉投予單一單位劑量(較佳於一選擇的注射部位)及/或於受影響的第二群組肌肉投予多個單位劑量(較佳於選擇的不同注射部位)，且其中於治療期間投予的總劑量至多14,220單位，及 其中該經修飾的BoNT/A包含於選自下列一或多個胺基酸殘基的修飾：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS 1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274、及THR 1277，其中該修飾選自： i.以鹼性胺基酸殘基取代酸性表面暴露的胺基酸殘基； ii.以未帶電胺基酸殘基取代酸性表面暴露的胺基酸殘基； iii.以鹼性胺基酸殘基取代未帶電的表面暴露的胺基酸殘基； iv.鹼性胺基酸殘基之插入；及 v.酸性表面暴露的胺基酸殘基之刪除。
於一相關態樣，本發明提供一種治療肢體痙攣之方法，該方法包含藉由肌肉內注射至對象之多數受影響的肌肉而投予經修飾的肉毒桿菌神經毒素A(BoNT/A)， 其中藉由53單位至948單位之單位劑量之經修飾的BoNT/A(較佳藉由每注射部位53單位至948單位之單位劑量之經修飾的BoNT/A)於多數受影響的肌肉投予，且其中1單位為相當於小鼠中經計算的半數致死劑量(LD 50)之經修飾的BoNT/A的量， 其中多數受影響的肌肉選自： 第一群組，包含：屈指淺肌、屈指深肌、橈側屈腕肌、尺側屈腕肌、肱橈肌、旋前圓肌、肱二頭肌、腓腸肌內側頭、腓腸肌外側頭、屈趾長肌、屈足拇長肌、腓腸肌、三角肌、提肩胛肌、旋前方肌、屈拇長肌、內收拇肌、屈拇短肌、掌長肌、蚓狀肌、拇對指肌、內收大肌、內收長肌、內收短肌、股薄肌、內側膕旁肌、外側膕旁肌、闊筋膜張肌、股直肌、股外側肌、股內側肌、股間肌、臀大肌、脛骨前肌、屈趾短肌、伸足拇長肌、及屈足拇短肌；及 第二群組，包含：肱三頭肌(長頭)、肩胛下肌、胸肌(例如，胸大肌)、闊背肌、肱二頭肌、肱肌、比目魚肌、脛骨後肌、肱橈肌、大圓肌、髂腰肌、及腓腸肌；及 其中於受影響的第一群組肌肉投予單一單位劑量(較佳於一選擇的注射部位)及/或於受影響的第二群組肌肉投予多個單位劑量(較佳於選擇的不同注射部位)，且其中於治療期間投予的總劑量至多14,220單位，及 其中該經修飾的BoNT/A包含BoNT/A輕鏈及轉位域、及BoNT/B受體結合域(H C域)。
於另一相關態樣，本發明提供一種經修飾的肉毒桿菌神經毒素A(BoNT/A)之用途，其係用於製造治療肢體痙攣之醫藥，其中藉由肌肉內注射至對象多數受影響的肌肉而投予該經修飾的BoNT/A， 其中藉由53單位至948單位之單位劑量之經修飾的BoNT/A(較佳藉由每注射部位53單位至948單位之單位劑量之經修飾的BoNT/A)於多數受影響的肌肉投予，且其中1單位為相當於小鼠中經計算的半數致死劑量(LD 50)之經修飾的BoNT/A的量， 其中多數受影響的肌肉選自： 第一群組，包含：屈指淺肌、屈指深肌、橈側屈腕肌、尺側屈腕肌、肱橈肌、旋前圓肌、肱二頭肌、腓腸肌內側頭、腓腸肌外側頭、屈趾長肌、屈足拇長肌、腓腸肌、三角肌、提肩胛肌、旋前方肌、屈拇長肌、內收拇肌、屈拇短肌、掌長肌、蚓狀肌、拇對指肌、內收大肌、內收長肌、內收短肌、股薄肌、內側膕旁肌、外側膕旁肌、闊筋膜張肌、股直肌、股外側肌、股內側肌、股間肌、臀大肌、脛骨前肌、屈趾短肌、伸足拇長肌、及屈足拇短肌；及 第二群組，包含：肱三頭肌(長頭)、肩胛下肌、胸肌(例如，胸大肌)、闊背肌、肱二頭肌、肱肌、比目魚肌、脛骨後肌、肱橈肌、大圓肌、髂腰肌、及腓腸肌；及 其中於受影響的第一群組肌肉投予單一單位劑量(較佳於一選擇的注射部位)及/或於受影響的第二群組肌肉投予多個單位劑量(較佳於選擇的不同注射部位)，且其中於治療期間投予的總劑量至多14,220單位，及 其中該經修飾的BoNT/A包含於選自下列一或多個胺基酸殘基的修飾：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS 1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274、及THR 1277，其中該修飾選自： i.以鹼性胺基酸殘基取代酸性表面暴露的胺基酸殘基； ii.以未帶電胺基酸殘基取代酸性表面暴露的胺基酸殘基； iii.以鹼性胺基酸殘基取代未帶電的表面暴露的胺基酸殘基； iv.鹼性胺基酸殘基之插入；及 v.酸性表面暴露的胺基酸殘基之刪除。
於另一相關態樣，本發明提供一種經修飾的肉毒桿菌神經毒素A(BoNT/A)之用途，其係用於製造治療肢體痙攣之醫藥，其中藉由肌肉內注射至對象多數受影響的肌肉而投予該經修飾的BoNT/A， 其中藉由53單位至948單位之單位劑量之經修飾的BoNT/A(較佳藉由每注射部位53單位至948單位之單位劑量之經修飾的BoNT/A)於多數受影響的肌肉投予，且其中1單位為相當於小鼠中經計算的半數致死劑量(LD 50)之經修飾的BoNT/A的量， 其中多數受影響的肌肉選自： 第一群組，包含：屈指淺肌、屈指深肌、橈側屈腕肌、尺側屈腕肌、肱橈肌、旋前圓肌、肱二頭肌、腓腸肌內側頭、腓腸肌外側頭、屈趾長肌、屈足拇長肌、腓腸肌、三角肌、提肩胛肌、旋前方肌、屈拇長肌、內收拇肌、屈拇短肌、掌長肌、蚓狀肌、拇對指肌、內收大肌、內收長肌、內收短肌、股薄肌、內側膕旁肌、外側膕旁肌、闊筋膜張肌、股直肌、股外側肌、股內側肌、股間肌、臀大肌、脛骨前肌、屈趾短肌、伸足拇長肌、及屈足拇短肌；及 第二群組，包含：肱三頭肌(長頭)、肩胛下肌、胸肌(例如，胸大肌)、闊背肌、肱二頭肌、肱肌、比目魚肌、脛骨後肌、肱橈肌、大圓肌、髂腰肌、及腓腸肌；及 其中於受影響的第一群組肌肉投予單一單位劑量(較佳於一選擇的注射部位)及/或於受影響的第二群組肌肉投予多個單位劑量(較佳於選擇的不同注射部位)，且其中於治療期間投予的總劑量至多14,220單位，及 其中該經修飾的BoNT/A包含BoNT/A輕鏈及轉位域、及BoNT/B受體結合域(H C域)。
於一態樣，本發明提供一種於治療肢體痙攣中使用的經修飾的肉毒桿菌神經毒素A(BoNT/A)，其中藉由肌肉內注射至對象多數受影響的肌肉而投予該經修飾的BoNT/A， 其中藉由 31單位至707單位之單位劑量之經修飾的BoNT/A(較佳藉由每注射部位31單位至707單位之單位劑量之經修飾BoNT/A)於多數受影響的肌肉投予該經修飾的BoNT/A，且其中1單位為相當於小鼠中經計算的半數致死劑量(LD 50)之經修飾的BoNT/A的量， 其中多數受影響的肌肉選自： 第一群組，包含：屈指淺肌、屈指深肌、橈側屈腕肌、尺側屈腕肌、肱橈肌、旋前圓肌、肱二頭肌、腓腸肌內側頭、腓腸肌外側頭、屈趾長肌、屈足拇長肌、腓腸肌、三角肌、提肩胛肌、旋前方肌、屈拇長肌、內收拇肌、屈拇短肌、掌長肌、蚓狀肌、拇對指肌、內收大肌、內收長肌、內收短肌、股薄肌、內側膕旁肌、外側膕旁肌、闊筋膜張肌、股直肌、股外側肌、股內側肌、股間肌、臀大肌、脛骨前肌、屈趾短肌、伸足拇長肌、及屈足拇短肌；及 第二群組，包含：肱三頭肌(長頭)、肩胛下肌、胸肌(例如，胸大肌)、闊背肌、肱二頭肌、肱肌、比目魚肌、脛骨後肌、肱橈肌、大圓肌、髂腰肌、及腓腸肌；及 其中於受影響的第一群組肌肉投予單一單位劑量(較佳於一選擇的注射部位)及/或於受影響的第二群組肌肉投予多個單位劑量(較佳於選擇的不同注射部位)，且其中於治療期間投予的總劑量至多10,605單位，且 其中該經修飾的BoNT/A包含BoNT/A輕鏈及轉位域、及BoNT/B受體結合域(H C域)。
於一相關態樣，本發明提供一種治療肢體痙攣之方法，該方法包含藉由肌肉內注射至對象之多數受影響的肌肉而投予經修飾的肉毒桿菌神經毒素A(BoNT/A)， 其中藉由31單位至707單位之單位劑量之經修飾的BoNT/A(較佳藉由每注射部位31單位至707單位之單位劑量之經修飾BoNT/A)於多數受影響的肌肉投予該經修飾的BoNT/A，且其中1單位為相當於小鼠中經計算的半數致死劑量(LD 50)之經修飾的BoNT/A的量， 其中多數受影響的肌肉選自： 第一群組，包含：屈指淺肌、屈指深肌、橈側屈腕肌、尺側屈腕肌、肱橈肌、旋前圓肌、肱二頭肌、腓腸肌內側頭、腓腸肌外側頭、屈趾長肌、屈足拇長肌、腓腸肌、三角肌、提肩胛肌、旋前方肌、屈拇長肌、內收拇肌、屈拇短肌、掌長肌、蚓狀肌、拇對指肌、內收大肌、內收長肌、內收短肌、股薄肌、內側膕旁肌、外側膕旁肌、闊筋膜張肌、股直肌、股外側肌、股內側肌、股間肌、臀大肌、脛骨前肌、屈趾短肌、伸足拇長肌、及屈足拇短肌；及 第二群組，包含：肱三頭肌(長頭)、肩胛下肌、胸肌(例如，胸大肌)、闊背肌、肱二頭肌、肱肌、比目魚肌、脛骨後肌、肱橈肌、大圓肌、髂腰肌、及腓腸肌；及 其中於受影響的第一群組肌肉投予單一單位劑量(較佳於一選擇的注射部位)及/或於受影響的第二群組肌肉投予多個單位劑量(較佳於選擇的不同注射部位)，且其中於治療期間投予的總劑量至多10,605單位，且 其中該經修飾的BoNT/A包含BoNT/A輕鏈及轉位域、及BoNT/B受體結合域(H C域)。
於另一相關態樣，本發明提供一種經修飾的肉毒桿菌神經毒素A(BoNT/A)之用途，其係用於製造治療肢體痙攣之醫藥，其中藉由肌肉內注射至對象多數受影響的肌肉而投予該經修飾的BoNT/A， 其中藉由31單位至707單位之單位劑量之經修飾的BoNT/A(較佳藉由每注射部位31單位至707單位之單位劑量之經修飾BoNT/A)於多數受影響的肌肉投予該經修飾的BoNT/A，且其中1單位為相當於小鼠中經計算的半數致死劑量(LD 50)之經修飾的BoNT/A的量， 其中多數受影響的肌肉選自： 第一群組，包含：屈指淺肌、屈指深肌、橈側屈腕肌、尺側屈腕肌、肱橈肌、旋前圓肌、肱二頭肌、腓腸肌內側頭、腓腸肌外側頭、屈趾長肌、屈足拇長肌、腓腸肌、三角肌、提肩胛肌、旋前方肌、屈拇長肌、內收拇肌、屈拇短肌、掌長肌、蚓狀肌、拇對指肌、內收大肌、內收長肌、內收短肌、股薄肌、內側膕旁肌、外側膕旁肌、闊筋膜張肌、股直肌、股外側肌、股內側肌、股間肌、臀大肌、脛骨前肌、屈趾短肌、伸足拇長肌、及屈足拇短肌；及 第二群組，包含：肱三頭肌(長頭)、肩胛下肌、胸肌(例如，胸大肌)、闊背肌、肱二頭肌、肱肌、比目魚肌、脛骨後肌、肱橈肌、大圓肌、髂腰肌、及腓腸肌；及 其中於受影響的第一群組肌肉投予單一單位劑量(較佳於一選擇的注射部位)及/或於受影響的第二群組肌肉投予多個單位劑量(較佳於選擇的不同注射部位)，且其中於治療期間投予的總劑量至多10,605單位，且 其中該經修飾的BoNT/A包含BoNT/A輕鏈及轉位域、及BoNT/B受體結合域(H C域)。
於一態樣，本發明提供一種於治療兒科肢體痙攣中使用的經修飾的肉毒桿菌神經毒素A(BoNT/A)，其中藉由肌肉內注射至對象多數受影響的肌肉而投予該經修飾的BoNT/A， 其中藉由26.5單位至474單位之單位劑量之經修飾的BoNT/A(較佳藉由每注射部位26.5單位至474單位之單位劑量之經修飾BoNT/A)於多數受影響的肌肉投予該經修飾的BoNT/A，且其中1單位為相當於小鼠中經計算的半數致死劑量(LD 50)之經修飾的BoNT/A的量， 其中多數受影響的肌肉選自： 第一群組，包含：屈指淺肌、屈指深肌、橈側屈腕肌、尺側屈腕肌、肱橈肌、旋前圓肌、肱二頭肌、腓腸肌內側頭、腓腸肌外側頭、屈趾長肌、屈足拇長肌、腓腸肌、三角肌、提肩胛肌、旋前方肌、屈拇長肌、內收拇肌、屈拇短肌、掌長肌、蚓狀肌、拇對指肌、內收大肌、內收長肌、內收短肌、股薄肌、內側膕旁肌、外側膕旁肌、闊筋膜張肌、股直肌、股外側肌、股內側肌、股間肌、臀大肌、脛骨前肌、屈趾短肌、伸足拇長肌、及屈足拇短肌；及 第二群組，包含：肱三頭肌(長頭)、肩胛下肌、胸肌(例如，胸大肌)、闊背肌、肱二頭肌、肱肌、比目魚肌、脛骨後肌、肱橈肌、大圓肌、髂腰肌、及腓腸肌；及 其中於受影響的第一群組肌肉投予單一單位劑量(較佳於一選擇的注射部位)及/或於受影響的第二群組肌肉投予多個單位劑量(較佳於選擇的不同注射部位)，且其中於治療期間投予的總劑量至多7,110單位，且 其中該經修飾的BoNT/A包含於選自下列的一或多個胺基酸殘基的修飾：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS 1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274、及THR 1277，其中該修飾選自： i.以鹼性胺基酸殘基取代酸性表面暴露的胺基酸殘基； ii.以未帶電胺基酸殘基取代酸性表面暴露的胺基酸殘基； iii.以鹼性胺基酸殘基取代未帶電的表面暴露的胺基酸殘基； iv.鹼性胺基酸殘基之插入；及 v.酸性表面暴露的胺基酸殘基之刪除。
於一態樣，本發明提供一種於治療兒科肢體痙攣中使用的經修飾的肉毒桿菌神經毒素A(BoNT/A)，其中藉由肌肉內注射至對象受影響的多數肌肉而投予該經修飾的BoNT/A， 其中藉由26.5單位至474單位之單位劑量之經修飾的BoNT/A(較佳藉由每注射部位26.5單位至474單位之單位劑量之經修飾BoNT/A)於受影響的多數肌肉投予該經修飾的BoNT/A，且其中1單位為相當於小鼠中經計算的半數致死劑量(LD 50)之經修飾的BoNT/A的量， 其中受影響的多數肌肉選自： 第一群組，包含：屈指淺肌、屈指深肌、橈側屈腕肌、尺側屈腕肌、肱橈肌、旋前圓肌、肱二頭肌、腓腸肌內側頭、腓腸肌外側頭、屈趾長肌、屈足拇長肌、腓腸肌、三角肌、提肩胛肌、旋前方肌、屈拇長肌、內收拇肌、屈拇短肌、掌長肌、蚓狀肌、拇對指肌、內收大肌、內收長肌、內收短肌、股薄肌、內側膕旁肌、外側膕旁肌、闊筋膜張肌、股直肌、股外側肌、股內側肌、股間肌、臀大肌、脛骨前肌、屈趾短肌、伸足拇長肌、及屈足拇短肌；及 第二群組，包含：肱三頭肌(長頭)、肩胛下肌、胸肌(例如，胸大肌)、闊背肌、肱二頭肌、肱肌、比目魚肌、脛骨後肌、肱橈肌、大圓肌、髂腰肌、及腓腸肌；及 其中於受影響的第一群組肌肉投予單一單位劑量(較佳於一選擇的注射部位)及/或於受影響的第二群組肌肉投予多個單位劑量(較佳於選擇的不同注射部位)，且其中於治療期間投予的總劑量至多7,110單位，且 其中經該修飾的BoNT/A包含BoNT/A輕鏈及轉位域、及BoNT/B受體結合域(H C域)。
於一相關態樣，本發明提供一種治療兒科肢體痙攣之方法，該方法包含藉由肌肉內注射至對象之多數受影響的肌肉而投予經修飾的肉毒桿菌神經毒素A(BoNT/A)， 其中藉由26.5單位至474單位之單位劑量之經修飾的BoNT/A(較佳藉由每注射部位26.5單位至474單位之單位劑量之經修飾BoNT/A)於多數受影響的肌肉投予該經修飾的BoNT/A，且其中1單位為相當於小鼠中經計算的半數致死劑量(LD 50)之經修飾的BoNT/A的量， 其中多數受影響的肌肉選自： 第一群組，包含：屈指淺肌、屈指深肌、橈側屈腕肌、尺側屈腕肌、肱橈肌、旋前圓肌、肱二頭肌、腓腸肌內側頭、腓腸肌外側頭、屈趾長肌、屈足拇長肌、腓腸肌、三角肌、提肩胛肌、旋前方肌、屈拇長肌、內收拇肌、屈拇短肌、掌長肌、蚓狀肌、拇對指肌、內收大肌、內收長肌、內收短肌、股薄肌、內側膕旁肌、外側膕旁肌、闊筋膜張肌、股直肌、股外側肌、股內側肌、股間肌、臀大肌、脛骨前肌、屈趾短肌、伸足拇長肌、及屈足拇短肌；及 第二群組，包含：肱三頭肌(長頭)、肩胛下肌、胸肌(例如，胸大肌)、闊背肌、肱二頭肌、肱肌、比目魚肌、脛骨後肌、肱橈肌、大圓肌、髂腰肌、及腓腸肌；及 其中於受影響的第一群組肌肉投予單一單位劑量(較佳於一選擇的注射部位)及/或於受影響的第二群組肌肉投予多個單位劑量(較佳於選擇的不同注射部位)，且其中於治療期間投予的總劑量至多7,110單位，且 其中該經修飾的BoNT/A包含於選自下列的一或多個胺基酸殘基的修飾：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS 1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274、及THR 1277，其中該修飾選自： i.以鹼性胺基酸殘基取代酸性表面暴露的胺基酸殘基； ii.以未帶電胺基酸殘基取代酸性表面暴露的胺基酸殘基； iii.以鹼性胺基酸殘基取代未帶電的表面暴露的胺基酸殘基； iv.鹼性胺基酸殘基之插入；及 v.酸性表面暴露的胺基酸殘基之刪除。
於一相關態樣，本發明提供一種治療兒科肢體痙攣之方法，該方法包含藉由肌肉內注射至對象之受影響的多數肌肉而投予經修飾的肉毒桿菌神經毒素A(BoNT/A)， 其中藉由26.5單位至474單位之單位劑量之經修飾的BoNT/A(較佳藉由每注射部位26.5單位至474單位之單位劑量之經修飾BoNT/A)於受影響的多數肌肉投予該經修飾的BoNT/A，且其中1單位為相當於小鼠中經計算的半數致死劑量(LD 50)之經修飾的BoNT/A的量， 其中受影響的多數肌肉選自： 第一群組，包含：屈指淺肌、屈指深肌、橈側屈腕肌、尺側屈腕肌、肱橈肌、旋前圓肌、肱二頭肌、腓腸肌內側頭、腓腸肌外側頭、屈趾長肌、屈足拇長肌、腓腸肌、三角肌、提肩胛肌、旋前方肌、屈拇長肌、內收拇肌、屈拇短肌、掌長肌、蚓狀肌、拇對指肌、內收大肌、內收長肌、內收短肌、股薄肌、內側膕旁肌、外側膕旁肌、闊筋膜張肌、股直肌、股外側肌、股內側肌、股間肌、臀大肌、脛骨前肌、屈趾短肌、伸足拇長肌、及屈足拇短肌；及 第二群組，包含：肱三頭肌(長頭)、肩胛下肌、胸肌(例如，胸大肌)、闊背肌、肱二頭肌、肱肌、比目魚肌、脛骨後肌、肱橈肌、大圓肌、髂腰肌、及腓腸肌；及 其中於受影響的第一群組肌肉投予單一單位劑量(較佳於一選擇的注射部位)及/或於受影響的第二群組肌肉投予多個單位劑量(較佳於選擇的不同注射部位)，且其中於治療期間投予的總劑量至多7,110單位，且 其中該經修飾的BoNT/A包含BoNT/A輕鏈及轉位域、及BoNT/B受體結合域(H C域)。
於另一相關態樣，本發明提供一種經修飾的肉毒桿菌神經毒素A(BoNT/A)之用途，其係用於製造治療兒科肢體痙攣之醫藥，其中藉由肌肉內注射至對象多數受影響的肌肉而投予該經修飾的BoNT/A， 其中藉由26.5單位至474單位之單位劑量之經修飾的BoNT/A(較佳藉由每注射部位26.5單位至474單位之單位劑量之經修飾BoNT/A)於多數受影響的肌肉投予該經修飾的BoNT/A，且其中1單位為相當於小鼠中經計算的半數致死劑量(LD 50)之經修飾的BoNT/A的量， 其中多數受影響的肌肉選自： 第一群組，包含：屈指淺肌、屈指深肌、橈側屈腕肌、尺側屈腕肌、肱橈肌、旋前圓肌、肱二頭肌、腓腸肌內側頭、腓腸肌外側頭、屈趾長肌、屈足拇長肌、腓腸肌、三角肌、提肩胛肌、旋前方肌、屈拇長肌、內收拇肌、屈拇短肌、掌長肌、蚓狀肌、拇對指肌、內收大肌、內收長肌、內收短肌、股薄肌、內側膕旁肌、外側膕旁肌、闊筋膜張肌、股直肌、股外側肌、股內側肌、股間肌、臀大肌、脛骨前肌、屈趾短肌、伸足拇長肌、及屈足拇短肌；及 第二群組，包含：肱三頭肌(長頭)、肩胛下肌、胸肌(例如，胸大肌)、闊背肌、肱二頭肌、肱肌、比目魚肌、脛骨後肌、肱橈肌、大圓肌、髂腰肌、及腓腸肌；及 其中於受影響的第一群組肌肉投予單一單位劑量(較佳於一選擇的注射部位)及/或於受影響的第二群組肌肉投予多個單位劑量(較佳於選擇的不同注射部位)，且其中於治療期間投予的總劑量至多7,110單位，且 其中該經修飾的BoNT/A包含於選自下列的一或多個胺基酸殘基的修飾：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS 1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274、及THR 1277，其中該修飾選自： i.以鹼性胺基酸殘基取代酸性表面暴露的胺基酸殘基； ii.以未帶電胺基酸殘基取代酸性表面暴露的胺基酸殘基； iii.以鹼性胺基酸殘基取代未帶電的表面暴露的胺基酸殘基； iv.鹼性胺基酸殘基之插入；及 v.酸性表面暴露的胺基酸殘基之刪除。
於另一相關態樣，本發明提供一種經修飾的肉毒桿菌神經毒素A(BoNT/A)之用途，其係用於製造治療兒科肢體痙攣之醫藥，其中藉由肌肉內注射至對象受影響的多數肌肉而投予該經修飾的BoNT/A， 其中藉由26.5單位至474單位之單位劑量之經修飾的BoNT/A(較佳藉由每注射部位26.5單位至474單位之單位劑量之經修飾BoNT/A)於受影響的多數肌肉投予該經修飾的BoNT/A，且其中1單位為相當於小鼠中經計算的半數致死劑量(LD 50)之經修飾的BoNT/A的量， 其中受影響的多數肌肉選自： 第一群組，包含：屈指淺肌、屈指深肌、橈側屈腕肌、尺側屈腕肌、肱橈肌、旋前圓肌、肱二頭肌、腓腸肌內側頭、腓腸肌外側頭、屈趾長肌、屈足拇長肌、腓腸肌、三角肌、提肩胛肌、旋前方肌、屈拇長肌、內收拇肌、屈拇短肌、掌長肌、蚓狀肌、拇對指肌、內收大肌、內收長肌、內收短肌、股薄肌、內側膕旁肌、外側膕旁肌、闊筋膜張肌、股直肌、股外側肌、股內側肌、股間肌、臀大肌、脛骨前肌、屈趾短肌、伸足拇長肌、及屈足拇短肌；及 第二群組，包含：肱三頭肌(長頭)、肩胛下肌、胸肌(例如，胸大肌)、闊背肌、肱二頭肌、肱肌、比目魚肌、脛骨後肌、肱橈肌、大圓肌、髂腰肌、及腓腸肌；及 其中於受影響的第一群組肌肉投予單一單位劑量(較佳於一選擇的注射部位)及/或於受影響的第二群組肌肉投予多個單位劑量(較佳於選擇的不同注射部位)，且其中於治療期間投予的總劑量至多7,110單位，且 其中該經修飾的BoNT/A包含BoNT/A輕鏈及轉位域、及BoNT/B受體結合域(H C域)。
於一態樣，本發明提供一種於治療兒科肢體痙攣中使用的經修飾的肉毒桿菌神經毒素A(BoNT/A)，其中藉由肌肉內注射至對象多數受影響的肌肉而投予該經修飾的BoNT/A， 其中藉由15.5單位至353.5單位之單位劑量之經修飾的BoNT/A(較佳藉由每注射部位15.5單位至353.5單位之單位劑量之經修飾BoNT/A)於多數受影響的肌肉投予該經修飾的BoNT/A，且其中1單位為相當於小鼠中經計算的半數致死劑量(LD 50)之經修飾的BoNT/A的量， 其中多數受影響的肌肉選自： 第一群組，包含：屈指淺肌、屈指深肌、橈側屈腕肌、尺側屈腕肌、肱橈肌、旋前圓肌、肱二頭肌、腓腸肌內側頭、腓腸肌外側頭、屈趾長肌、屈足拇長肌、腓腸肌、三角肌、提肩胛肌、旋前方肌、屈拇長肌、內收拇肌、屈拇短肌、掌長肌、蚓狀肌、拇對指肌、內收大肌、內收長肌、內收短肌、股薄肌、內側膕旁肌、外側膕旁肌、闊筋膜張肌、股直肌、股外側肌、股內側肌、股間肌、臀大肌、脛骨前肌、屈趾短肌、伸足拇長肌、及屈足拇短肌；及 第二群組，包含：肱三頭肌(長頭)、肩胛下肌、胸肌(例如，胸大肌)、闊背肌、肱二頭肌、肱肌、比目魚肌、脛骨後肌、肱橈肌、大圓肌、髂腰肌、及腓腸肌；及 其中於受影響的第一群組肌肉投予單一單位劑量(較佳於一選擇的注射部位)及/或於受影響的第二群組肌肉投予多個單位劑量(較佳於選擇的不同注射部位)，且其中於治療期間投予的總劑量至多5302.5單位，且 其中該經修飾的BoNT/A包含BoNT/A輕鏈及轉位域、及BoNT/B受體結合域(H C域)。
於一相關態樣，本發明提供一種治療兒科肢體痙攣之方法，該方法包含藉由肌肉內注射至對象之多數受影響的肌肉而投予經修飾的肉毒桿菌神經毒素A(BoNT/A)， 其中藉由15.5單位至353.5單位之單位劑量之經修飾的BoNT/A(較佳藉由每注射部位15.5單位至353.5單位之單位劑量之經修飾BoNT/A)於多數受影響的肌肉投予該經修飾的BoNT/A，且其中1單位為相當於小鼠中經計算的半數致死劑量(LD 50)之經修飾的BoNT/A的量， 其中多數受影響的肌肉選自： 第一群組，包含：屈指淺肌、屈指深肌、橈側屈腕肌、尺側屈腕肌、肱橈肌、旋前圓肌、肱二頭肌、腓腸肌內側頭、腓腸肌外側頭、屈趾長肌、屈足拇長肌、腓腸肌、三角肌、提肩胛肌、旋前方肌、屈拇長肌、內收拇肌、屈拇短肌、掌長肌、蚓狀肌、拇對指肌、內收大肌、內收長肌、內收短肌、股薄肌、內側膕旁肌、外側膕旁肌、闊筋膜張肌、股直肌、股外側肌、股內側肌、股間肌、臀大肌、脛骨前肌、屈趾短肌、伸足拇長肌、及屈足拇短肌；及 第二群組，包含：肱三頭肌(長頭)、肩胛下肌、胸肌(例如，胸大肌)、闊背肌、肱二頭肌、肱肌、比目魚肌、脛骨後肌、肱橈肌、大圓肌、髂腰肌、及腓腸肌；及 其中於受影響的第一群組肌肉投予單一單位劑量(較佳於一選擇的注射部位)及/或於受影響的第二群組肌肉投予多個單位劑量(較佳於選擇的不同注射部位)，且其中於治療期間投予的總劑量至多5302.5單位，且 其中該經修飾的BoNT/A包含BoNT/A輕鏈及轉位域、及BoNT/B受體結合域(H C域)。
於另一相關態樣，本發明提供一種經修飾的肉毒桿菌神經毒素A(BoNT/A)之用途，其係用於製造治療兒科肢體痙攣之醫藥，其中藉由肌肉內注射至對象多數受影響的肌肉而投予該經修飾的BoNT/A， 其中藉由15.5單位至353.5單位之單位劑量之經修飾的BoNT/A(較佳藉由每注射部位15.5單位至353.5單位之單位劑量之經修飾的BoNT/A)於多數受影響的肌肉投予該經修飾的BoNT/A，且其中1單位為相當於小鼠中經計算的半數致死劑量(LD 50)之經修飾的BoNT/A的量，其中多數受影響的肌肉為選自： 第一群組，包含：屈指淺肌、屈指深肌、橈側屈腕肌、尺側屈腕肌、肱橈肌、旋前圓肌、肱二頭肌、腓腸肌內側頭、腓腸肌外側頭、屈趾長肌、屈足拇長肌、腓腸肌、三角肌、提肩胛肌、旋前方肌、屈拇長肌、內收拇肌、屈拇短肌、掌長肌、蚓狀肌、拇對指肌、內收大肌、內收長肌、內收短肌、股薄肌、內側膕旁肌、外側膕旁肌、闊筋膜張肌、股直肌、股外側肌、股內側肌、股間肌、臀大肌、脛骨前肌、屈趾短肌、伸足拇長肌、及屈足拇短肌；及 第二群組，包含：肱三頭肌(長頭)、肩胛下肌、胸肌(例如，胸大肌)、闊背肌、肱二頭肌、肱肌、比目魚肌、脛骨後肌、肱橈肌、大圓肌、髂腰肌、及腓腸肌；及 其中於受影響的第一群組肌肉投予單一單位劑量(較佳於一選擇的注射部位)及/或於受影響的第二群組肌肉投予多個單位劑量(較佳於選擇的不同注射部位)，且其中於治療期間投予的總劑量至多5302.5單位，且 其中該經修飾的BoNT/A包含BoNT/A輕鏈及轉位域、及BoNT/B受體結合域(H C域)。
於一態樣，本發明提供一種於治療肢體痙攣中使用的經修飾的肉毒桿菌神經毒素A(BoNT/A)，其中藉由肌肉內注射至對象多數受影響的肌肉而投予該經修飾的BoNT/A， 其中藉由53單位至948單位之單位劑量之經修飾的BoNT/A(較佳藉由每注射部位53單位至948單位之單位劑量之經修飾的BoNT/A)於多數受影響的肌肉投予，且其中1單位為相當於小鼠中經計算的半數致死劑量(LD 50)之經修飾的BoNT/A的量， 其中多數受影響的肌肉選自： 第一群組，包含：屈指淺肌、屈指深肌、橈側屈腕肌、尺側屈腕肌、肱橈肌、旋前圓肌、肱二頭肌、腓腸肌內側頭、腓腸肌外側頭、屈趾長肌、屈足拇長肌；及 第二群組，包含：肱三頭肌(長頭)、肩胛下肌、胸大肌、闊背肌、肱二頭肌、肱肌、比目魚肌、及脛骨後肌；及 其中於受影響的第一群組肌肉投予單一單位劑量(較佳於一選擇的注射部位)及/或於受影響的第二群組肌肉投予多個單位劑量(較佳於選擇的不同注射部位)，且其中於治療期間投予的總劑量至多14,220單位，及 其中該經修飾的BoNT/A包含於選自下列一或多個胺基酸殘基的修飾：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS 1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274、及THR 1277，其中該修飾選自： i.以鹼性胺基酸殘基取代酸性表面暴露的胺基酸殘基； ii.以未帶電胺基酸殘基取代酸性表面暴露的胺基酸殘基； iii.以鹼性胺基酸殘基取代未帶電的表面暴露的胺基酸殘基； iv.鹼性胺基酸殘基之插入；及 v.酸性表面暴露的胺基酸殘基之刪除。
於一態樣，本發明提供一種於治療肢體痙攣中使用的經修飾的肉毒桿菌神經毒素A(BoNT/A)，其中藉由肌肉內注射至對象多數受影響的肌肉而投予該經修飾的BoNT/A， 其中藉由53單位至948單位之單位劑量之經修飾的BoNT/A(較佳藉由每注射部位53單位至948單位之單位劑量之經修飾的BoNT/A)於多數受影響的肌肉投予，且其中1單位為相當於小鼠中經計算的半數致死劑量(LD 50)之經修飾的BoNT/A的量， 其中多數受影響的肌肉選自： 第一群組，包含：屈指淺肌、屈指深肌、橈側屈腕肌、尺側屈腕肌、肱橈肌、旋前圓肌、肱二頭肌、腓腸肌內側頭、腓腸肌外側頭、屈趾長肌、屈足拇長肌；及 第二群組，包含：肱三頭肌(長頭)、肩胛下肌、胸大肌、闊背肌、肱二頭肌、肱肌、比目魚肌、及脛骨後肌；及 其中於受影響的第一群組肌肉投予單一單位劑量(較佳於一選擇的注射部位)及/或於受影響的第二群組肌肉投予多個單位劑量(較佳於選擇的不同注射部位)，且其中於治療期間投予的總劑量至多14,220單位，及 其中該經修飾的BoNT/A包含BoNT/A輕鏈及轉位域、及BoNT/B受體結合域(H C域)。
於一相關態樣，本發明提供一種治療肢體痙攣之方法，該方法包含藉由肌肉內注射至對象之多數受影響的肌肉而投予經修飾的肉毒桿菌神經毒素A(BoNT/A)， 其中藉由53單位至948單位之單位劑量之經修飾的BoNT/A(較佳藉由每注射部位53單位至948單位之單位劑量之經修飾的BoNT/A)於多數受影響的肌肉投予，且其中1單位為相當於小鼠中經計算的半數致死劑量(LD 50)之經修飾的BoNT/A的量， 其中多數受影響的肌肉選自： 第一群組，包含：屈指淺肌、屈指深肌、橈側屈腕肌、尺側屈腕肌、肱橈肌、旋前圓肌、肱二頭肌、腓腸肌內側頭、腓腸肌外側頭、屈趾長肌、屈足拇長肌；及 第二群組，包含：肱三頭肌(長頭)、肩胛下肌、胸大肌、闊背肌、肱二頭肌、肱肌、比目魚肌、及脛骨後肌；及 其中於受影響的第一群組肌肉投予單一單位劑量(較佳於一選擇的注射部位)及/或於受影響的第二群組肌肉投予多個單位劑量(較佳於選擇的不同注射部位)，且其中於治療期間投予的總劑量至多14,220單位，及 其中該經修飾的BoNT/A包含於選自下列一或多個胺基酸殘基的修飾：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS 1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274、及THR 1277，其中該修飾選自： i.以鹼性胺基酸殘基取代酸性表面暴露的胺基酸殘基； ii.以未帶電胺基酸殘基取代酸性表面暴露的胺基酸殘基； iii.以鹼性胺基酸殘基取代未帶電的表面暴露的胺基酸殘基； iv.鹼性胺基酸殘基之插入；及 v.酸性表面暴露的胺基酸殘基之刪除。
於一相關態樣，本發明提供一種治療肢體痙攣之方法，該方法包含藉由肌肉內注射至對象之多數受影響的肌肉而投予經修飾的肉毒桿菌神經毒素A(BoNT/A)， 其中藉由53單位至948單位之單位劑量之經修飾的BoNT/A(較佳藉由每注射部位53單位至948單位之單位劑量之經修飾的BoNT/A)於多數受影響的肌肉投予，且其中1單位為相當於小鼠中經計算的半數致死劑量(LD 50)之經修飾的BoNT/A的量， 其中多數受影響的肌肉選自： 第一群組，包含：屈指淺肌、屈指深肌、橈側屈腕肌、尺側屈腕肌、肱橈肌、旋前圓肌、肱二頭肌、腓腸肌內側頭、腓腸肌外側頭、屈趾長肌、屈足拇長肌；及 第二群組，包含：肱三頭肌(長頭)、肩胛下肌、胸大肌、闊背肌、肱二頭肌、肱肌、比目魚肌、及脛骨後肌；及 其中於受影響的第一群組肌肉投予單一單位劑量(較佳於一選擇的注射部位)及/或於受影響的第二群組肌肉投予多個單位劑量(較佳於選擇的不同注射部位)，且其中於治療期間投予的總劑量至多14,220單位，及 其中該經修飾的BoNT/A包含BoNT/A輕鏈及轉位域、及BoNT/B受體結合域(H C域)。
於另一相關態樣，本發明提供一種經修飾的肉毒桿菌神經毒素A(BoNT/A)之用途，其係用於製造治療肢體痙攣之醫藥，其中藉由肌肉內注射至對象多數受影響的肌肉而投予該經修飾的BoNT/A， 其中藉由53單位至948單位之單位劑量之經修飾的BoNT/A(較佳藉由每注射部位53單位至948單位之單位劑量之經修飾的BoNT/A)於多數受影響的肌肉投予，且其中1單位為相當於小鼠中經計算的半數致死劑量(LD 50)之經修飾的BoNT/A的量， 其中多數受影響的肌肉選自： 第一群組，包含：屈指淺肌、屈指深肌、橈側屈腕肌、尺側屈腕肌、肱橈肌、旋前圓肌、肱二頭肌、腓腸肌內側頭、腓腸肌外側頭、屈趾長肌、屈足拇長肌；及 第二群組，包含：肱三頭肌(長頭)、肩胛下肌、胸大肌、闊背肌、肱二頭肌、肱肌、比目魚肌、及脛骨後肌；及 其中於受影響的第一群組肌肉投予單一單位劑量(較佳於一選擇的注射部位)及/或於受影響的第二群組肌肉投予多個單位劑量(較佳於選擇的不同注射部位)，且其中於治療期間投予的總劑量至多14,220單位，及 其中該經修飾的BoNT/A包含於選自下列一或多個胺基酸殘基的修飾：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS 1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274、及THR 1277，其中該修飾選自： i.以鹼性胺基酸殘基取代酸性表面暴露的胺基酸殘基； ii.以未帶電胺基酸殘基取代酸性表面暴露的胺基酸殘基； iii.以鹼性胺基酸殘基取代未帶電的表面暴露的胺基酸殘基； iv.鹼性胺基酸殘基之插入；及 v.酸性表面暴露的胺基酸殘基之刪除。
於另一相關態樣，本發明提供一種經修飾的肉毒桿菌神經毒素A(BoNT/A)之用途，其係用於製造治療肢體痙攣之醫藥，其中藉由肌肉內注射至對象多數受影響的肌肉而投予該經修飾的BoNT/A， 其中藉由53單位至948單位之單位劑量之經修飾的BoNT/A(較佳藉由每注射部位53單位至948單位之單位劑量之經修飾的BoNT/A)於多數受影響的肌肉投予，且其中1單位為相當於小鼠中經計算的半數致死劑量(LD 50)之經修飾的BoNT/A的量， 其中多數受影響的肌肉選自： 第一群組，包含：屈指淺肌、屈指深肌、橈側屈腕肌、尺側屈腕肌、肱橈肌、旋前圓肌、肱二頭肌、腓腸肌內側頭、腓腸肌外側頭、屈趾長肌、屈足拇長肌；及 第二群組，包含：肱三頭肌(長頭)、肩胛下肌、胸大肌、闊背肌、肱二頭肌、肱肌、比目魚肌、及脛骨後肌；及 其中於受影響的第一群組肌肉投予單一單位劑量(較佳於一選擇的注射部位)及/或於受影響的第二群組肌肉投予多個單位劑量(較佳於選擇的不同注射部位)，且其中於治療期間投予的總劑量至多14,220單位，及 其中該經修飾的BoNT/A包含BoNT/A輕鏈及轉位域、及BoNT/B受體結合域(H C域)。
於一態樣，本發明提供一種於治療肢體痙攣中使用的經修飾的肉毒桿菌神經毒素A(BoNT/A)，其中藉由肌肉內注射至對象多數受影響的肌肉而投予該經修飾的BoNT/A， 其中藉由31單位至707單位之單位劑量之經修飾的BoNT/A(較佳藉由每注射部位31單位至707單位之單位劑量之經修飾BoNT/A)於多數受影響的肌肉投予該經修飾的BoNT/A，且其中1單位為相當於小鼠中經計算的半數致死劑量(LD 50)之經修飾的BoNT/A的量， 其中多數受影響的肌肉選自： 第一群組，包含：屈指淺肌、屈指深肌、橈側屈腕肌、尺側屈腕肌、肱橈肌、旋前圓肌、肱二頭肌、腓腸肌內側頭、腓腸肌外側頭、屈趾長肌、屈足拇長肌；及 第二群組，包含：肱三頭肌(長頭)、肩胛下肌、胸大肌、闊背肌、肱二頭肌、肱肌、比目魚肌、及脛骨後肌；及 其中於受影響的第一群組肌肉投予單一單位劑量(較佳於一選擇的注射部位)及/或於受影響的第二群組肌肉投予多個單位劑量(較佳於選擇的不同注射部位)，且其中於治療期間投予的總劑量至多10,605單位，及 其中該經修飾的BoNT/A包含BoNT/A輕鏈及轉位域、及BoNT/B受體結合域(H C域)。
於一相關態樣，本發明提供一種治療肢體痙攣之方法，該方法包含藉由肌肉內注射至對象之多數受影響的肌肉而投予經修飾的肉毒桿菌神經毒素A(BoNT/A)， 其中藉由31單位至707單位之單位劑量之經修飾的BoNT/A(較佳藉由每注射部位31單位至707單位之單位劑量之經修飾BoNT/A)於多數受影響的肌肉投予該經修飾的BoNT/A，且其中1單位為相當於小鼠中經計算的半數致死劑量(LD 50)之經修飾的BoNT/A的量， 其中多數受影響的肌肉選自： 第一群組，包含：屈指淺肌、屈指深肌、橈側屈腕肌、尺側屈腕肌、肱橈肌、旋前圓肌、肱二頭肌、腓腸肌內側頭、腓腸肌外側頭、屈趾長肌、屈足拇長肌；及 第二群組，包含：肱三頭肌(長頭)、肩胛下肌、胸大肌、闊背肌、肱二頭肌、肱肌、比目魚肌、及脛骨後肌；及 其中於受影響的第一群組肌肉投予單一單位劑量(較佳於一選擇的注射部位)及/或於受影響的第二群組肌肉投予多個單位劑量(較佳於選擇的不同注射部位)，且其中於治療期間投予的總劑量至多10,605單位，及 其中該經修飾的BoNT/A包含BoNT/A輕鏈及轉位域、及BoNT/B受體結合域(H C域)。
於另一相關態樣，本發明提供一種經修飾的肉毒桿菌神經毒素A(BoNT/A)之用途，其係用於製造治療肢體痙攣之醫藥，其中藉由肌肉內注射至對象多數受影響的肌肉而投予該經修飾的BoNT/A， 其中藉由31單位至707單位之單位劑量之經修飾的BoNT/A(較佳藉由每注射部位31單位至707單位之單位劑量之經修飾BoNT/A)於多數受影響的肌肉投予該經修飾的BoNT/A，且其中1單位為相當於小鼠中經計算的半數致死劑量(LD 50)之經修飾的BoNT/A的量， 其中多數受影響的肌肉選自： 第一群組，包含：屈指淺肌、屈指深肌、橈側屈腕肌、尺側屈腕肌、肱橈肌、旋前圓肌、肱二頭肌、腓腸肌內側頭、腓腸肌外側頭、屈趾長肌、屈足拇長肌；及 第二群組，包含：肱三頭肌(長頭)、肩胛下肌、胸大肌、闊背肌、肱二頭肌、肱肌、比目魚肌、及脛骨後肌；及 其中於受影響的第一群組肌肉投予單一單位劑量(較佳於一選擇的注射部位)及/或於受影響的第二群組肌肉投予多個單位劑量(較佳於選擇的不同注射部位)，且其中於治療期間投予的總劑量至多10,605單位，及 其中該經修飾的BoNT/A包含BoNT/A輕鏈及轉位域、及BoNT/B受體結合域(H C域)。
於一態樣，本發明提供一種於治療兒科肢體痙攣中使用的經修飾的肉毒桿菌神經毒素A(BoNT/A)，其中藉由肌肉內注射至對象多數受影響的肌肉而投予該經修飾的BoNT/A， 其中藉由26.5單位至474單位之單位劑量之經修飾的BoNT/A(較佳藉由每注射部位26.5單位至474單位之單位劑量之經修飾BoNT/A)於多數受影響的肌肉投予該經修飾的BoNT/A，且其中1單位為相當於小鼠中經計算的半數致死劑量(LD 50)之經修飾的BoNT/A的量， 其中多數受影響的肌肉選自： 第一群組，包含：屈指淺肌、屈指深肌、橈側屈腕肌、尺側屈腕肌、肱橈肌、旋前圓肌、肱二頭肌、腓腸肌內側頭、腓腸肌外側頭、屈趾長肌、屈足拇長肌；及 第二群組，包含：肱三頭肌(長頭)、肩胛下肌、胸大肌、闊背肌、肱二頭肌、肱肌、比目魚肌、及脛骨後肌；及 其中於受影響的第一群組肌肉投予單一單位劑量(較佳於一選擇的注射部位)及/或於受影響的第二群組肌肉投予多個單位劑量(較佳於選擇的不同注射部位)，且其中於治療期間投予的總劑量至多7,110單位，及 其中該經修飾的BoNT/A包含選自下列一或多個胺基酸殘基的修飾：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS 1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274、及THR 1277，其中該修飾選自： i.以鹼性胺基酸殘基取代酸性表面暴露的胺基酸殘基； ii.以未帶電胺基酸殘基取代酸性表面暴露的胺基酸殘基； iii.以鹼性胺基酸殘基取代未帶電的表面暴露的胺基酸殘基； iv.鹼性胺基酸殘基之插入；及 v.酸性表面暴露的胺基酸殘基之刪除。
於一態樣，本發明提供一種於治療兒科肢體痙攣中使用的經修飾的肉毒桿菌神經毒素A(BoNT/A)，其中藉由肌肉內注射至對象多數受影響的肌肉而投予該經修飾的BoNT/A， 其中藉由26.5單位至474單位之單位劑量之經修飾的BoNT/A(較佳藉由每注射部位26.5單位至474單位之單位劑量之經修飾BoNT/A)於多數受影響的肌肉投予該經修飾的BoNT/A，且其中1單位為相當於小鼠中經計算的半數致死劑量(LD 50)之經修飾的BoNT/A的量， 其中多數受影響的肌肉選自： 第一群組，包含：屈指淺肌、屈指深肌、橈側屈腕肌、尺側屈腕肌、肱橈肌、旋前圓肌、肱二頭肌、腓腸肌內側頭、腓腸肌外側頭、屈趾長肌、屈足拇長肌；及 第二群組，包含：肱三頭肌(長頭)、肩胛下肌、胸大肌、闊背肌、肱二頭肌、肱肌、比目魚肌、及脛骨後肌；及 其中於受影響的第一群組肌肉投予單一單位劑量(較佳於一選擇的注射部位)及/或於受影響的第二群組肌肉投予多個單位劑量(較佳於選擇的不同注射部位)，且其中於治療期間投予的總劑量至多7,110單位，及 其中該經修飾的BoNT/A包含BoNT/A輕鏈及轉位域、及BoNT/B受體結合域(H C域)。
於一相關態樣，本發明提供一種治療兒科肢體痙攣之方法，該方法包含藉由肌肉內注射至對象之多數受影響的肌肉而投予經修飾的肉毒桿菌神經毒素A(BoNT/A)， 其中藉由26.5單位至474單位之單位劑量之經修飾的BoNT/A(較佳藉由每注射部位26.5單位至474單位之單位劑量之經修飾BoNT/A)於多數受影響的肌肉投予該經修飾的BoNT/A，且其中1單位為相當於小鼠中經計算的半數致死劑量(LD 50)之經修飾的BoNT/A的量， 其中多數受影響的肌肉選自： 第一群組，包含：屈指淺肌、屈指深肌、橈側屈腕肌、尺側屈腕肌、肱橈肌、旋前圓肌、肱二頭肌、腓腸肌內側頭、腓腸肌外側頭、屈趾長肌、屈足拇長肌；及 第二群組，包含：肱三頭肌(長頭)、肩胛下肌、胸大肌、闊背肌、肱二頭肌、肱肌、比目魚肌、及脛骨後肌；及 其中於受影響的第一群組肌肉投予單一單位劑量(較佳於一選擇的注射部位)及/或於受影響的第二群組肌肉投予多個單位劑量(較佳於選擇的不同注射部位)，且其中於治療期間投予的總劑量至多7,110單位，及 其中該經修飾的BoNT/A包含選自下列一或多個胺基酸殘基的修飾：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS 1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274、及THR 1277，其中該修飾選自： i.以鹼性胺基酸殘基取代酸性表面暴露的胺基酸殘基； ii.以未帶電胺基酸殘基取代酸性表面暴露的胺基酸殘基； iii.以鹼性胺基酸殘基取代未帶電的表面暴露的胺基酸殘基； iv.鹼性胺基酸殘基之插入；及 v.酸性表面暴露的胺基酸殘基之刪除。
於一相關態樣，本發明提供一種治療兒科肢體痙攣之方法，該方法包含藉由肌肉內注射至對象之多數受影響的肌肉而投予經修飾的肉毒桿菌神經毒素A(BoNT/A)， 其中藉由26.5單位至474單位之單位劑量之經修飾的BoNT/A(較佳藉由每注射部位26.5單位至474單位之單位劑量之經修飾BoNT/A)於多數受影響的肌肉投予該經修飾的BoNT/A，且其中1單位為相當於小鼠中經計算的半數致死劑量(LD 50)之經修飾的BoNT/A的量， 其中多數受影響的肌肉選自： 第一群組，包含：屈指淺肌、屈指深肌、橈側屈腕肌、尺側屈腕肌、肱橈肌、旋前圓肌、肱二頭肌、腓腸肌內側頭、腓腸肌外側頭、屈趾長肌、屈足拇長肌；及 第二群組，包含：肱三頭肌(長頭)、肩胛下肌、胸大肌、闊背肌、肱二頭肌、肱肌、比目魚肌、及脛骨後肌；及 其中於受影響的第一群組肌肉投予單一單位劑量(較佳於一選擇的注射部位)及/或於受影響的第二群組肌肉投予多個單位劑量(較佳於選擇的不同注射部位)，且其中於治療期間投予的總劑量至多7,110單位，及 其中該經修飾的BoNT/A包含BoNT/A輕鏈及轉位域、及BoNT/B受體結合域(H C域)。
於另一相關態樣，本發明提供一種經修飾的肉毒桿菌神經毒素A(BoNT/A)之用途，其係用於製造治療兒科肢體痙攣之醫藥，其中藉由肌肉內注射至對象多數受影響的肌肉而投予該經修飾的BoNT/A， 其中藉由26.5單位至474單位之單位劑量之經修飾的BoNT/A(較佳藉由每注射部位26.5單位至474單位之單位劑量之經修飾BoNT/A)於多數受影響的肌肉投予該經修飾的BoNT/A，且其中1單位為相當於小鼠中經計算的半數致死劑量(LD 50)之經修飾的BoNT/A的量， 其中多數受影響的肌肉選自： 第一群組，包含：屈指淺肌、屈指深肌、橈側屈腕肌、尺側屈腕肌、肱橈肌、旋前圓肌、肱二頭肌、腓腸肌內側頭、腓腸肌外側頭、屈趾長肌、屈足拇長肌；及 第二群組，包含：肱三頭肌(長頭)、肩胛下肌、胸大肌、闊背肌、肱二頭肌、肱肌、比目魚肌、及脛骨後肌；及 其中於受影響的第一群組肌肉投予單一單位劑量(較佳於一選擇的注射部位)及/或於受影響的第二群組肌肉投予多個單位劑量(較佳於選擇的不同注射部位)，且其中於治療期間投予的總劑量至多7,110單位，及 其中該經修飾的BoNT/A包含選自下列一或多個胺基酸殘基的修飾：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS 1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274、及THR 1277，其中該修飾選自： i.以鹼性胺基酸殘基取代酸性表面暴露的胺基酸殘基； ii.以未帶電胺基酸殘基取代酸性表面暴露的胺基酸殘基； iii.以鹼性胺基酸殘基取代未帶電的表面暴露的胺基酸殘基； iv.鹼性胺基酸殘基之插入；及 v.酸性表面暴露的胺基酸殘基之刪除。
於另一相關態樣，本發明提供一種經修飾的肉毒桿菌神經毒素A(BoNT/A)之用途，其係用於製造治療兒科肢體痙攣之醫藥，其中藉由肌肉內注射至對象多數受影響的肌肉而投予該經修飾的BoNT/A， 其中藉由26.5單位至474單位之單位劑量之經修飾的BoNT/A(較佳藉由每注射部位26.5單位至474單位之單位劑量之經修飾BoNT/A)於多數受影響的肌肉投予該經修飾的BoNT/A，且其中1單位為相當於小鼠中經計算的半數致死劑量(LD 50)之經修飾的BoNT/A的量， 其中多數受影響的肌肉選自： 第一群組，包含：屈指淺肌、屈指深肌、橈側屈腕肌、尺側屈腕肌、肱橈肌、旋前圓肌、肱二頭肌、腓腸肌內側頭、腓腸肌外側頭、屈趾長肌、屈足拇長肌；及 第二群組，包含：肱三頭肌(長頭)、肩胛下肌、胸大肌、闊背肌、肱二頭肌、肱肌、比目魚肌、及脛骨後肌；及 其中於受影響的第一群組肌肉投予單一單位劑量(較佳於一選擇的注射部位)及/或於受影響的第二群組肌肉投予多個單位劑量(較佳於選擇的不同注射部位)，且其中於治療期間投予的總劑量至多7,110單位，及 其中該經修飾的BoNT/A包含BoNT/A輕鏈及轉位域、及BoNT/B受體結合域(H C域)。
於一態樣，本發明提供一種於治療兒科肢體痙攣中使用的經修飾的肉毒桿菌神經毒素A(BoNT/A)，其中藉由肌肉內注射至對象多數受影響的肌肉而投予該經修飾的BoNT/A， 其中藉由15.5單位至353.5單位之單位劑量之經修飾的BoNT/A(較佳藉由每注射部位15.5單位至353.5單位之單位劑量之經修飾BoNT/A)於多數受影響的肌肉投予該經修飾的BoNT/A，且其中1單位為相當於小鼠中經計算的半數致死劑量(LD 50)之經修飾的BoNT/A的量， 其中多數受影響的肌肉選自： 第一群組，包含：屈指淺肌、屈指深肌、橈側屈腕肌、尺側屈腕肌、肱橈肌、旋前圓肌、肱二頭肌、腓腸肌內側頭、腓腸肌外側頭、屈趾長肌、屈足拇長肌；及 第二群組，包含：肱三頭肌(長頭)、肩胛下肌、胸大肌、闊背肌、肱二頭肌、肱肌、比目魚肌、及脛骨後肌；及 其中於受影響的第一群組肌肉投予單一單位劑量(較佳於一選擇的注射部位)及/或於受影響的第二群組肌肉投予多個單位劑量(較佳於選擇的不同注射部位)，且其中於治療期間投予的總劑量至多5302.5單位，及 其中該經修飾的BoNT/A包含BoNT/A輕鏈及轉位域、及BoNT/B受體結合域(H C域)。
於一相關態樣，本發明提供一種治療兒科肢體痙攣之方法，該方法包含藉由肌肉內注射至對象之多數受影響的肌肉而投予經修飾的肉毒桿菌神經毒素A(BoNT/A)， 其中藉由15.5單位至353.5單位之單位劑量之經修飾的BoNT/A(較佳藉由每注射部位15.5單位至353.5單位之單位劑量之經修飾BoNT/A)於多數受影響的肌肉投予該經修飾的BoNT/A，且其中1單位為相當於小鼠中經計算的半數致死劑量(LD 50)之經修飾的BoNT/A的量， 其中多數受影響的肌肉選自： 第一群組，包含：屈指淺肌、屈指深肌、橈側屈腕肌、尺側屈腕肌、肱橈肌、旋前圓肌、肱二頭肌、腓腸肌內側頭、腓腸肌外側頭、屈趾長肌、屈足拇長肌；及 第二群組，包含：肱三頭肌(長頭)、肩胛下肌、胸大肌、闊背肌、肱二頭肌、肱肌、比目魚肌、及脛骨後肌；及 其中於受影響的第一群組肌肉投予單一單位劑量(較佳於一選擇的注射部位)及/或於受影響的第二群組肌肉投予多個單位劑量(較佳於選擇的不同注射部位)，且其中於治療期間投予的總劑量至多5302.5單位，及 其中該經修飾的BoNT/A包含BoNT/A輕鏈及轉位域、及BoNT/B受體結合域(H C域)。
於另一相關態樣，本發明提供一種經修飾的肉毒桿菌神經毒素A(BoNT/A)之用途，其係用於製造治療兒科肢體痙攣之醫藥，其中藉由肌肉內注射至對象多數受影響的肌肉而投予該經修飾的BoNT/A， 其中藉由15.5單位至353.5單位之單位劑量之經修飾的BoNT/A(較佳藉由每注射部位15.5單位至353.5單位之單位劑量之經修飾的BoNT/A)於多數受影響的肌肉投予該經修飾的BoNT/A，且其中1單位為相當於小鼠中經計算的半數致死劑量(LD 50)之經修飾的BoNT/A的量，其中多數受影響的肌肉為選自： 第一群組，包含：屈指淺肌、屈指深肌、橈側屈腕肌、尺側屈腕肌、肱橈肌、旋前圓肌、肱二頭肌、腓腸肌內側頭、腓腸肌外側頭、屈趾長肌、屈足拇長肌；及 第二群組，包含：肱三頭肌(長頭)、肩胛下肌、胸大肌、闊背肌、肱二頭肌、肱肌、比目魚肌、及脛骨後肌；及 其中於受影響的第一群組肌肉投予單一單位劑量(較佳於一選擇的注射部位)及/或於受影響的第二群組肌肉投予多個單位劑量(較佳於選擇的不同注射部位)，且其中於治療期間投予的總劑量至多5302.5單位，及 其中該經修飾的BoNT/A包含BoNT/A輕鏈及轉位域、及BoNT/B受體結合域(H C域)。
「受影響的肌肉」係表現出痙攣症狀或導致患肢痙攣的肌肉。例如，該肌肉可表現出增加的肌肉張力或僵硬。
多數受影響的肌肉選自本文所述之第一及第二群組。所選擇的多數受影響的肌肉可為第一群組之至少一種肌肉及/或第二群組之至少一種肌肉。或者，多數受影響的肌肉可為來自相同群組的二種或以上的肌肉(例如，二種以上第一群組的肌肉或二種或以上第二群組的肌肉)。較佳地，多數受影響的肌肉包括至少一種第一群組的肌肉及至少一種第二群組的肌肉。
多數肌肉可為相同肢之肌肉或不同肢之肌肉。然而其較佳為相同肢之肌肉。本發明包含同時治療一個或多個肢體的痙攣。例如，BoNT/A可於每一治療期中被投予至對象的一個或兩個上肢、一個或兩個下肢、或下肢及上肢的組合。無論是否治療兩個或以上的肢體，較佳為每個肢體至少治療2條肌肉，例如每個肢體至少3、4或5條肌肉。
於本發明中使用之經修飾的BoNT/A可為包含於選自下列一個或以上的胺基酸殘基的修飾任一者：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS 1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274、及THR 1277，其中該修飾係選自：以鹼性胺基酸殘基取代酸性表面暴露的胺基酸殘基；以未帶電胺基酸殘基取代酸性表面暴露的胺基酸殘基；以鹼性胺基酸殘基取代未帶電的表面暴露的胺基酸殘基；鹼性胺基酸殘基之插入；及酸性表面暴露的胺基酸殘基之刪除或一種經修飾的BoNT/A，包含BoNT/A輕鏈及轉位域、及BoNT/B受體結合域(H C域)。
較佳地，於本發明中使用之經修飾的BoNT/A為包含於選自下列一個或以上的胺基酸殘基的修飾之經修飾BoNT/A：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS 1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274、及THR 1277，其中該修飾係選自：以鹼性胺基酸殘基取代酸性表面暴露的胺基酸殘基；以未帶電胺基酸殘基取代酸性表面暴露的胺基酸殘基；以鹼性胺基酸殘基取代未帶電的表面暴露的胺基酸殘基；鹼性胺基酸殘基之插入；及酸性表面暴露的胺基酸殘基之刪除。
根據本發明使用的經修飾的BoNT/A的效力較佳地根據標準技術藉由小鼠LD 50測定而確定。於該測定，1單位被定義為相當於小鼠中經計算的半數致死劑量(LD 50)之經修飾的BoNT/A的量。較佳地，經計算的半數致死劑量。於該測定中相當於1單位的經修飾BoNT/A的量可為至少1 pg、2 pg、3 pg、4 pg、5 pg、6 pg、7 pg、8 pg或9 pg。於該測定中相當於1單位的經修飾BoNT/A的量可為≤45 pg、≤40 pg、≤30 pg、≤25 pg、≤20 pg、≤19 pg、≤18 pg、≤17 pg、≤16 pg、≤15 pg、≤14 pg、≤13 pg、≤12 pg、≤11 pg、≤10 pg、≤9 pg、≤8 pg、≤7 pg或≤6 pg。
於本發明中使用之經修飾的BoNT/A為包含於選自下列一個或以上的胺基酸殘基的修飾之經修飾的BoNT/A：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS 1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274、及THR 1277，其中該修飾係選自：以鹼性胺基酸殘基取代酸性表面暴露的胺基酸殘基；以未帶電胺基酸殘基取代酸性表面暴露的胺基酸殘基；以鹼性胺基酸殘基取代未帶電的表面暴露的胺基酸殘基；鹼性胺基酸殘基之插入；及酸性表面暴露的胺基酸殘基之刪除，於該測定中相當於1單位的經修飾BoNT/A的量可為1-15 pg，如5-10 pg。較佳地，於該測定中相當於1單位的經修飾BoNT/A 的量可為8-9 pg，更佳為8.4 pg。
於本發明中使用之經修飾的BoNT/A為包含BoNT/A輕鏈及轉位域及BoNT/B受體結合域(HC域)的經修飾的BoNT/A，於該測定中相當於1單位的經修飾BoNT/A的量可為15-35 pg，如20-30 pg。較佳地，於該測定中相當於1單位的經修飾BoNT/A 的量可為23-25 pg，更佳為24.0 pg。
術語「至多」當使用於指一個值(例如，至多14,220單位)時表示至多並包括該所引述的值。如此，例如，提及投予「至多14,220單位」的經修飾的BoNT/A包括投予14,220單位的經修飾的BoNT/A以及少於14,220單位的經修飾的BoNT/A。
較佳地，於受影響肌肉藉由肌肉內注射而投予一劑經修飾的BoNT/A。更佳地，於每注射部位投予單一單位劑量。術語「投予單一單位劑量」意指實質上所有之單一單位劑量皆被投予。例如， 剩餘量(例如，至多1%、0.1%或0.01%)的單位劑量可保留在已恢復組成的經修飾的BoNT/A的小瓶中。然而，較佳地投予所有之單一單位劑量(例如，於一或多個注射部位)。取決於肌肉的性質，投予單一單位劑量(即，投予至選自本文所述的第一群組的肌肉)或投予多個單位劑量(即，投予至選自本文中描述的第二群組的肌肉)。可於一或多個注射部位(例如，每條肌肉)投予該單一單位劑量或多個單位劑量。例如，於一些具體實施例，每注射部位可投予少於單一單位劑量。於一較佳具體實施例，僅於一部位注射一些肌肉(即，選自本文所述第一群組的肌肉)及於二或多個部位注射一些肌肉(即，選自本文所述第二群組的肌肉)。
於一具體實施例，於多數個受影響的第一群組的肌肉注射部位投予單一單位劑量及/或於多數個受影響的第二群組的肌肉注射部位投予多個單位劑量。
單位劑量可以經修飾的BoNT/A的單位表示。
單位劑量可為53單位至948單位之經修飾的BoNT/A。單位劑量範圍的上限可為925、900、850、800、750、700、650、600、550、500、450、400、350、300、250、200、150或100單位之經修飾的BoNT/A，較佳上限為889單位。單位劑量範圍的下限可為55、60、65、70、75、80、85、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850或900單位之經修飾的BoNT/A，較佳下限為59單位。較佳地，經修飾的BoNT/A之單位劑量為59單位至889單位之經修飾的BoNT/A，例如200單位至600單位。
最佳地，經修飾的BoNT/A之單位劑量為237至355單位，如284至308單位。
單位劑量可為31單位至707單位之經修飾的BoNT/A。單位劑量範圍的上限可為700、650、600、550、500、450、400、350、300、250、200、150或100單位之經修飾的BoNT/A，較佳地，上限為666單位。單位劑量範圍的下限可為40、45、50、60、65、70、75、80、85、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、或700單位之經修飾的BoNT/A，較佳地，下限為42單位。較佳地，經修飾的BoNT/A之單位劑量為42單位至666單位之經修飾的BoNT/A，例如200單位至400單位。此等單位劑量可為特別相關，當經修飾的BoNT/A包含BoNT/A輕鏈及轉位域、及BoNT/B受體結合域(H C域)。
或者或另外地，單位劑量可以經修飾的BoNT/A的量表示。如此，於一態樣，本發明提供一種於治療肢體痙攣中使用的經修飾的肉毒桿菌神經毒素A(BoNT/A)，其中藉由肌肉內注射至對象多數受影響的肌肉而投予該經修飾的BoNT/A， 其中該經修飾的BoNT/A藉由於多數個受影響的肌肉上投予450 pg至8,000 pg之經修飾的BoNT/A的單位劑量(較佳藉由每注射部位450 pg至8,000 pg之經修飾的BoNT/A之單位劑量)。 其中多數受影響的肌肉選自： 第一群組，包含：屈指淺肌、屈指深肌、橈側屈腕肌、尺側屈腕肌、肱橈肌、旋前圓肌、肱二頭肌、腓腸肌內側頭、腓腸肌外側頭、屈趾長肌、屈足拇長肌、腓腸肌、三角肌、提肩胛肌、旋前方肌、屈拇長肌、內收拇肌、屈拇短肌、掌長肌、蚓狀肌、拇對指肌、內收大肌、內收長肌、內收短肌、股薄肌、內側膕旁肌、外側膕旁肌、闊筋膜張肌、股直肌、股外側肌、股內側肌、股間肌、臀大肌、脛骨前肌、屈趾短肌、伸足拇長肌、及屈足拇短肌；及 第二群組，包含：肱三頭肌(長頭)、肩胛下肌、胸肌(例如，胸大肌)、闊背肌、肱二頭肌、肱肌、比目魚肌、脛骨後肌、肱橈肌、大圓肌、髂腰肌、及腓腸肌；及 其中於受影響的第一群組肌肉投予單一單位劑量(較佳於一選擇的注射部位)及/或於受影響的第二群組肌肉投予多個單位劑量(較佳於選擇的不同注射部位)，且其中於治療期間投予的總劑量至多120,000 pg，及 其中該經修飾的BoNT/A包含於選自下列一或多個胺基酸殘基的修飾：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS 1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274、及THR 1277，其中該修飾選自： i.以鹼性胺基酸殘基取代酸性表面暴露的胺基酸殘基； ii.以未帶電胺基酸殘基取代酸性表面暴露的胺基酸殘基； iii.以鹼性胺基酸殘基取代未帶電的表面暴露的胺基酸殘基； iv.鹼性胺基酸殘基之插入；及 v.酸性表面暴露的胺基酸殘基之刪除。
於另一態樣，本發明提供一種於治療肢體痙攣中使用的經修飾的肉毒桿菌神經毒素A(BoNT/A)，其中藉由肌肉內注射至對象多數受影響的肌肉而投予該經修飾的BoNT/A， 其中該經修飾的BoNT/A藉由於多數個受影響的肌肉上投予450 pg至8,000 pg之經修飾的BoNT/A的單位劑量(較佳藉由每注射部位450 pg至8,000 pg之經修飾的BoNT/A之單位劑量)。 其中多數受影響的肌肉選自： 第一群組，包含：屈指淺肌、屈指深肌、橈側屈腕肌、尺側屈腕肌、肱橈肌、旋前圓肌、肱二頭肌、腓腸肌內側頭、腓腸肌外側頭、屈趾長肌、屈足拇長肌、腓腸肌、三角肌、提肩胛肌、旋前方肌、屈拇長肌、內收拇肌、屈拇短肌、掌長肌、蚓狀肌、拇對指肌、內收大肌、內收長肌、內收短肌、股薄肌、內側膕旁肌、外側膕旁肌、闊筋膜張肌、股直肌、股外側肌、股內側肌、股間肌、臀大肌、脛骨前肌、屈趾短肌、伸足拇長肌、及屈足拇短肌；及 第二群組，包含：肱三頭肌(長頭)、肩胛下肌、胸肌(例如，胸大肌)、闊背肌、肱二頭肌、肱肌、比目魚肌、脛骨後肌、肱橈肌、大圓肌、髂腰肌、及腓腸肌；及 其中於受影響的第一群組肌肉投予單一單位劑量(較佳於一選擇的注射部位)及/或於受影響的第二群組肌肉投予多個單位劑量(較佳於選擇的不同注射部位)，且其中於治療期間投予的總劑量至多120,000 pg，及 其中該經修飾的BoNT/A包含BoNT/A輕鏈及轉位域、及BoNT/B受體結合域(H C域)。
於另一態樣，本發明提供一種於治療肢體痙攣中使用的經修飾的肉毒桿菌神經毒素A(BoNT/A)，其中藉由肌肉內注射至對象多數受影響的肌肉而投予該經修飾的BoNT/A， 其中藉由750 pg至17,000 pg單位劑量之經修飾的BoNT/A(較佳每注射位藉由750 pg至17,000 pg單位劑量之經修飾的BoNT/A)於多數受影響的肌肉投予該經修飾的BoNT/A， 其中多數受影響的肌肉選自： 第一群組，包含：屈指淺肌、屈指深肌、橈側屈腕肌、尺側屈腕肌、肱橈肌、旋前圓肌、肱二頭肌、腓腸肌內側頭、腓腸肌外側頭、屈趾長肌、屈足拇長肌、腓腸肌、三角肌、提肩胛肌、旋前方肌、屈拇長肌、內收拇肌、屈拇短肌、掌長肌、蚓狀肌、拇對指肌、內收大肌、內收長肌、內收短肌、股薄肌、內側膕旁肌、外側膕旁肌、闊筋膜張肌、股直肌、股外側肌、股內側肌、股間肌、臀大肌、脛骨前肌、屈趾短肌、伸足拇長肌、及屈足拇短肌；及 第二群組，包含：肱三頭肌(長頭)、肩胛下肌、胸肌(例如，胸大肌)、闊背肌、肱二頭肌、肱肌、比目魚肌、脛骨後肌、肱橈肌、大圓肌、髂腰肌、及腓腸肌；及 其中於受影響的第一群組肌肉投予單一單位劑量(較佳於一選擇的注射部位)及/或於受影響的第二群組肌肉投予多個單位劑量(較佳於選擇的不同注射部位)，且其中於治療期間投予的總劑量至多255,000 pg，且 其中該經修飾的BoNT/A包含BoNT/A輕鏈及轉位域、及BoNT/B受體結合域(H C域)。
亦提供對應的用途(於醫藥製造中)及治療方法。
於一態樣，本發明提供一種於治療肢體痙攣中使用的經修飾的肉毒桿菌神經毒素A(BoNT/A)，其中藉由肌肉內注射至對象多數受影響的肌肉而投予該經修飾的BoNT/A， 其中該經修飾的BoNT/A藉由於多數個受影響的肌肉上投予450 pg至8,000 pg之經修飾的BoNT/A的單位劑量(較佳藉由每注射部位450 pg至8,000 pg之經修飾的BoNT/A之單位劑量)。 其中多數受影響的肌肉選自： 第一群組，包含：屈指淺肌、屈指深肌、橈側屈腕肌、尺側屈腕肌、肱橈肌、旋前圓肌、肱二頭肌、腓腸肌內側頭、腓腸肌外側頭、屈趾長肌、屈足拇長肌；及 第二群組，包含：肱三頭肌(長頭)、肩胛下肌、胸大肌、闊背肌、肱二頭肌、肱肌、比目魚肌、及脛骨後肌；及 其中於受影響的第一群組肌肉投予單一單位劑量(較佳於一選擇的注射部位)及/或於受影響的第二群組肌肉投予多個單位劑量(較佳於選擇的不同注射部位)，且其中於治療期間投予的總劑量至多120,000 pg，及 其中該經修飾的BoNT/A包含於選自下列一或多個胺基酸殘基的修飾：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS 1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274、及THR 1277，其中該修飾選自： i.以鹼性胺基酸殘基取代酸性表面暴露的胺基酸殘基； ii.以未帶電胺基酸殘基取代酸性表面暴露的胺基酸殘基； iii.以鹼性胺基酸殘基取代未帶電的表面暴露的胺基酸殘基； iv.鹼性胺基酸殘基之插入；及 v.酸性表面暴露的胺基酸殘基之刪除。
於另一態樣，本發明提供一種於治療肢體痙攣中使用的經修飾的肉毒桿菌神經毒素A(BoNT/A)，其中藉由肌肉內注射至對象多數受影響的肌肉而投予該經修飾的BoNT/A， 其中該經修飾的BoNT/A藉由於多數個受影響的肌肉上投予450 pg至8,000 pg之經修飾的BoNT/A的單位劑量(較佳藉由每注射部位450 pg至8,000 pg之經修飾的BoNT/A之單位劑量)。 其中多數受影響的肌肉選自： 第一群組，包含：屈指淺肌、屈指深肌、橈側屈腕肌、尺側屈腕肌、肱橈肌、旋前圓肌、肱二頭肌、腓腸肌內側頭、腓腸肌外側頭、屈趾長肌、屈足拇長肌；及 第二群組，包含：肱三頭肌(長頭)、肩胛下肌、胸大肌、闊背肌、肱二頭肌、肱肌、比目魚肌、及脛骨後肌；及 其中於受影響的第一群組肌肉投予單一單位劑量(較佳於一選擇的注射部位)及/或於受影響的第二群組肌肉投予多個單位劑量(較佳於選擇的不同注射部位)，且其中於治療期間投予的總劑量至多120,000 pg，及 其中該經修飾的BoNT/A包含BoNT/A輕鏈及轉位域、及BoNT/B受體結合域(H C域)。
於另一態樣，本發明提供一種於治療肢體痙攣中使用的經修飾的肉毒桿菌神經毒素A(BoNT/A)，其中藉由肌肉內注射至對象多數受影響的肌肉而投予該經修飾的BoNT/A， 其中藉由750 pg至17,000 pg單位劑量之經修飾的BoNT/A(較佳每注射位藉由750 pg 至17,000 pg單位劑量之經修飾的BoNT/A)於多數受影響的肌肉投予該經修飾的BoNT/A， 其中多數受影響的肌肉選自： 第一群組，包含：屈指淺肌、屈指深肌、橈側屈腕肌、尺側屈腕肌、肱橈肌、旋前圓肌、肱二頭肌、腓腸肌內側頭、腓腸肌外側頭、屈趾長肌、屈足拇長肌；及 第二群組，包含：肱三頭肌(長頭)、肩胛下肌、胸大肌、闊背肌、肱二頭肌、肱肌、比目魚肌、及脛骨後肌；及 其中於受影響的第一群組肌肉投予單一單位劑量(較佳於一選擇的注射部位)及/或於受影響的第二群組肌肉投予多個單位劑量(較佳於選擇的不同注射部位)，且其中於治療期間投予的總劑量至多255,000 pg，及 其中該經修飾的BoNT/A包含BoNT/A輕鏈及轉位域、及BoNT/B受體結合域(H C域)。
亦提供對應的用途(於醫藥製造中)及治療方法。
單位劑量可為450 pg至8,000 pg之經修飾的BoNT/A。單位劑量範圍的上限可為7,750、7,500、7,000、6,000、5,000、4,000、3,000、2,000或1,000 pg之經修飾的BoNT/A，較佳地，上限為7,500 pg。單位劑量範圍的下限可為475、500、600、700、800、900、1,000、1,500、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000或7,000 pg之經修飾的BoNT/A，較佳地，下限為500 pg。較佳地，經修飾的BoNT/A之單位劑量為500 pg至7,500 pg之經修飾的BoNT/A，例如，4,000 pg至6,000 pg。
最佳地，經修飾的BoNT/A之單位劑量為2,000至3,000 pg，如2,400至2,600 pg。
單位劑量可為750 pg至17,000 pg之經修飾的BoNT/A。單位劑量範圍的上限可為16,500、15,500、14,500、13,500、12,500、11,500、10,500、9,500、8,500、7,500、6,500、5,500、4,500、3,500、2,500、1,500或500 pg之經修飾的BoNT/A，較佳地，上限為16,000 pg。單位劑量範圍的下限可為750、850、950、1000、1500、2000、2,500、3,000、3,500、4,000、4,500或5,000 pg之經修飾的BoNT/A，較佳地，下限為1000 pg。較佳地，經修飾的BoNT/A之單位劑量為1000 pg至16,000 pg之經修飾的BoNT/A，例如4,000 pg至6,000 pg。此等單位劑量可為特別相關，當經修飾的BoNT/A包含BoNT/A輕鏈及轉位域、及BoNT/B受體結合域(H C域)。
經修飾的BoNT/A之單位劑量亦可同時以單位及量(pg)兩者表示。
當選擇該第一群組肌肉進行治療時，向選自本文所述的第一群組的肌肉投予單一單位劑量之經修飾的BoNT/A。
多個單位劑量之經修飾的BoNT/A被投予至選自第二群組的肌肉。例如，可投予至少2x、3x或4x單位劑量。於一些具體實施例，可投予2-4x單位劑量。較佳地，2x單位劑量之經修飾的BoNT/A被投予至選自第二群組的肌肉。
一些肌肉可為存於第一肌肉群組及第二肌肉群組。如此，臨床醫生可決定投予單一單位劑量或多個單位劑量至該肌肉。
肢體痙攣可為上肢痙攣或下肢痙攣。
當治療下肢痙攣，經修飾的BoNT/A可被投予至選自下列之多數條肌肉：第一群組，包含(較佳由其所組成)：腓腸肌內側頭、腓腸肌外側頭、腓腸肌、屈趾長肌、屈足拇長肌、內收大肌、內收長肌、內收短肌、股薄肌、內側膕旁肌、外側膕旁肌、闊筋膜張肌、股直肌、股外側肌、股內側肌、股間肌、臀大肌、脛骨前肌、屈趾短肌、伸足拇長肌、及屈足拇短肌；及第二群組，包含(較佳由其所組成)：比目魚肌、脛骨後肌、髂腰肌、及腓腸肌。
當投予至屈足拇長肌，於一些情形，可投予單一單位劑量，於而其它情形，可投予2x單位劑量。
下肢肌肉之適合的劑量示於下：
注射的肌肉 劑量
腓腸肌(內側頭) 1xUD
腓腸肌(外側頭) 1xUD
比目魚肌 2xUD或3xUD
脛骨後肌 2xUD
屈趾長肌(FDL) 1xUD
屈足拇長肌 1x或2xUD
經修飾的BoNT/A以上表所指劑量可被投予至一或多條肌肉。
經修飾的BoNT/A可被投予至一或多條下列肌肉，以如下列劑量：
注射的肌肉 劑量
內收大肌 1xUD
內收長肌 1xUD
內收短肌 1xUD
股薄肌 1xUD
內側膕旁肌 1xUD
外側膕旁肌 1xUD
闊筋膜張肌 1xUD
股直肌 1xUD
股外側肌 1xUD
股內側肌 1xUD
股間肌 1xUD
臀大肌 1xUD
脛骨前肌 1xUD
FDL 1xUD
屈趾短肌(FDB) 1xUD
屈足拇長肌 1xUD
伸足拇長肌 1xUD
屈足拇短肌 1xUD
髂腰肌 2xUD
腓腸肌 2xUD
脛骨後肌 2xUD
比目魚肌 2xUD
較佳地，肢體痙攣為上肢痙攣。
當治療上肢痙攣時，經修飾的BoNT/A可被投予至多數受影響的肌肉，該肌肉選自可被投予至多數受影響的肌肉，該肌肉選自：第一群組，包含(較佳由其所組成)：屈指淺肌、屈指深肌、橈側屈腕肌、尺側屈腕肌、肱橈肌、旋前圓肌、三角肌、提肩胛肌、旋前方肌、屈拇長肌、內收拇肌、屈拇短肌、掌長肌、蚓狀肌、及拇對指肌；及第二群組，包含(較佳由其所組成)：肱三頭肌(長頭)、肩胛下肌、胸肌(例如，胸大肌)、闊背肌、肱二頭肌、肱肌、肱橈肌、及大圓肌。
較佳地，當治療上肢痙攣時，經修飾的BoNT/A可被投予至多數受影響的肌肉，該肌肉選自可被投予至多數受影響的肌肉，該肌肉選自：第一群組，包含(較佳由其所組成)：屈指淺肌、屈指深肌、橈側屈腕肌、尺側屈腕肌、肱橈肌、旋前圓肌、及肱二頭肌；及第二群組，包含(較佳由其所組成)：肱三頭肌(長頭)、肩胛下肌、胸大肌、闊背肌、肱二頭肌、及肱肌。
更佳地，經修飾的BoNT/A可被投予至與肩膀痙攣有關的肌肉，如肩膀內縮。經修飾的BoNT/A可被投予至闊背肌、肩胛下肌、胸大肌、及肱三頭肌(長頭)之至少一者。例如，經修飾的BoNT/A可被投予至闊背肌、肩胛下肌、胸大肌或肱三頭肌(長頭)之至少二者或三者(較佳全部)。
當投予至肱二頭肌時，於一些情形，可投予單一單位劑量，於而其它情形，可投予2x單位劑量。如此，肱二頭肌落入肌肉之第一及第二群組兩者。較佳地，投予2x單位劑量至肱二頭肌且此肌肉被包括於肌肉之第二群組。
上肢肌肉之適合劑量呈示於下：
注射的肌肉 劑量
屈指淺肌(FDS) 1xUD
屈指深肌(FDP) 1xUD
橈側屈腕肌(FCR) 1xUD
尺側屈腕肌(FCU) 1xUD
肱橈肌 1xUD
肱肌 2xUD
旋前圓肌 1xUD
肱二頭肌 2xUD 1x或2xUD
肱三頭肌(長頭) 2xUD
胸大肌 2xUD
肩胛下肌 2xUD
闊背肌 2xUD
經修飾的BoNT/A以上表所指劑量可被投予至一或多條肌肉。
經修飾的BoNT/A可被投予至一或多條下列肌肉，以如下列劑量：
注射的肌肉 劑量
三角肌 1xUD
提肩胛肌 1xUD
旋前方肌 1xUD
旋前圓肌 1xUD
肱橈肌 1xUD
FCR 1xUD
FCU 1xUD
FDS 1xUD
FDP 1xUD
屈拇長肌 1xUD
內收拇肌 1xUD
屈拇短肌 1xUD
掌長肌 1xUD
蚓狀肌 1xUD
拇對指肌 1xUD
闊背肌 2xUD
胸肌 2xUD
肱橈肌 2xUD
大圓肌 2xUD
肩胛下肌 2xUD
肱肌 2xUD
肱二頭肌 2xUD
給定治療中投予的單位劑量的總數可能至多15x單位劑量。換言之，於一具體實施例，可於15x注射部位投予15x單一單位劑量。於另一具體實施例，可於超過15x注射部位投予15x單一單位劑量。單位劑量的總數將根據所治療的肌肉進行劃分，例如可以向闊背肌投予2x單位劑量，向肩胛下肌投予2x，向胸大肌投予2x，對尺側屈腕肌投予1x，產生的總單位劑量為7x。例如，投予的單位劑量的總數可至多14x、13x、12x、11x、10x、9x、8x或7x。投予的單位劑量的總數可為至少2x、3x、4x、5x、6x、7x之單位劑量，較佳至少2x。投予的單位劑量的總數可為2x至15x、7x至15x或10x至14x。較佳地，投予的單位劑量的總數為15x。
當實施本發明之治療方案時投予的總劑量可為至多14,220單位。換言之，在給定的治療方案中投予的經修飾的BoNT/A之總量可為至多14,220單位。總劑量可為至多14,000、13,000、12,000、11,000、10,000、9,000、8,000、7,000、6,000、5,000、4,000、3,000、2,000或1,000單位。較佳地，總劑量可為至多13,335單位之經修飾的BoNT/A。總劑量可為至少106、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1,000、1,500、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、11,000、12,000或13,000單位。較佳地，總劑量可為至少106單位，更佳為至少118單位之經修飾的BoNT/A，例如，至少795單位。總劑量可為118-13,335單位，較佳為795-13,335單位。更佳地，投予的總劑量為9,000-13,335單位。
當實施本發明之治療方案時投予的總劑量可為至多120,000 pg。換言之，在給定的治療方案中投予的經修飾的BoNT/A之總量可為至多120,000 pg。總劑量可為至多115,000、110,000、100,000、90,000、80,000、70,000、60,000、50,000、40,000、30,000、20,000、10,000或5,000 pg。較佳地，總劑量可為至多112,500 pg之經修飾的BoNT/A。總劑量可為至少900、1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、7,500、10,000、12,500、15,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000或100,000 pg。較佳地，總劑量可為至少900 pg，更佳為至少1,000 pg之經修飾的BoNT/A，例如，至少6,000 pg。總劑量可為1,000-112,500 pg，較佳為60,000-112,500 pg。更佳地，投予的總劑量為7,500-112,500 pg。
當實施本發明之治療方案時投予的總劑量可為至多10,605單位。換言之，在給定的治療方案中投予的經修飾的BoNT/A之總量可為至多10,605單位。總劑量可為至多10,000、9,000、8,000、7,000、6,000、5,000、4,000、3,000、2,000或1,000單位。較佳地，總劑量可為至多9,990單位之經修飾的BoNT/A。總劑量可為至少50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1,000、1,500、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、或9,000。較佳地，總劑量可為至少62單位，更佳為至少84單位之經修飾的BoNT/A，例如，至少465單位。總劑量可為84-9,990單位，較佳為465-9,990單位。更佳地，投予的總劑量為630-9,990單位。此等總劑量可為特別相關，於經修飾的BoNT/A包含BoNT/A輕鏈及轉位域、及BoNT/B受體結合域(H C域)。
當實施本發明之治療方案時投予的總劑量可為至多255,000 pg。換言之，在給定的治療方案中投予的經修飾的BoNT/A之總量可為至多255,000 pg。總劑量可為至多240,000、220,000、200,000、180,000、160,000、140,000,110,000、100,000、90,000、80,000、70,000、60,000、50,000、40,000、30,000、20,000、10,000或5,000 pg。較佳地，總劑量可為至多240,000 pg之經修飾的BoNT/A。總劑量可為至少900、1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、7,500、10,000、12,500、15,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、100,000、120,000、150,000、175,000、200,000或220,000 pg。較佳地，總劑量可為至少1500 pg，更佳為至少2000 pg之經修飾的BoNT/A，例如，至少12,000 pg。總劑量可為2000-240,000 pg，較佳為128,000-240,000 pg。更佳地，投予的總劑量為15,000-240,000 pg。此等總劑量可為特別相關，於經修飾的BoNT/A包含BoNT/A輕鏈及轉位域、及BoNT/B受體結合域(H C域)。
當對象最近已經(或隨後正在)使用梭狀芽孢感菌神經毒素(例如BoNT)進行另外的治療時，例如作為美容治療或針對不同適應症的治療的一部分，所屬技術領域中具通常知識者將予以考慮。使用本領域常規技術，所屬技術領域中具通常知識者將相應地調整本治療方案。
其較佳為依據本發明之肢體痙攣之治療為成人肢體痙攣。較佳地，上列提供的劑量細節為治療成人肢體痙攣。然而，亦包含兒科肢體痙攣之治療。當治療兒科肢體痙攣，合併的總劑量一般為當治療成人肢體痙攣所使用者之50%或以下。於一些具體實施例，合併的總劑量一般為當治療成人肢體痙攣所使用者之70%或以下(例如，67%或以下)。
治療兒科肢體痙攣之適合的單位劑量可為26.5單位至474單位之經修飾的BoNT/A且於此治療期間投予的總劑量為至多7,110單位。治療兒科肢體痙攣之單位劑量範圍的上限可為400、350、300、250、200、150、100或50單位之經修飾的BoNT/A，較佳上限為444.5單位。治療兒科肢體痙攣之單位劑量範圍的下限可為30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、100、150、200、250、300、350或400單位之經修飾的BoNT/A，較佳下限為29.5單位。較佳地，治療兒科肢體痙攣之經修飾的BoNT/A的單位劑量為29.5單位至474單位(更佳為29.5單位至444.5單位)之經修飾的BoNT/A，例如100單位至300單位。
治療兒科肢體痙攣之適合的單位劑量可為37.1單位至663.6單位之經修飾的BoNT/A且於此治療期間投予的總劑量為至多9,954單位。治療兒科肢體痙攣之單位劑量範圍的上限可為 600、550、500、450、400、350、300、250、200、150、100或50單位之經修飾的BoNT/A，較佳上限為622.3單位。治療兒科肢體痙攣之單位劑量範圍的下限可為40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400或450單位之經修飾的BoNT/A，較佳下限為41.3單位。較佳地，治療兒科肢體痙攣之經修飾的BoNT/A的單位劑量為41.3單位至622.3單位之經修飾的BoNT/A，例如100單位至700單位。
治療兒科肢體痙攣之適合的單位劑量可為35.1單位至635.16單位之經修飾的BoNT/A且於此治療期間投予的總劑量為至多9,527.4單位。治療兒科肢體痙攣之單位劑量範圍的上限可為 600、550、500、450、400、350、300、250、200、150、100或50單位之經修飾的BoNT/A，較佳上限為595.63單位。治療兒科肢體痙攣之單位劑量範圍的下限可為40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400或450單位之經修飾的BoNT/A，較佳下限為39.5單位。較佳地，治療兒科肢體痙攣之經修飾的BoNT/A的單位劑量為39.5單位至635.2單位之經修飾的BoNT/A，例如100單位至700單位。
治療兒科肢體痙攣之適合的單位劑量可為225 pg至4,000 pg之經修飾的BoNT/A且於此治療期間投予的總劑量為至多60,000 pg。治療兒科肢體痙攣的單位劑量範圍的上限可為3,500、3,000、2,000、1,000或500 pg之經修飾的BoNT/A，較佳上限為3,750 pg。治療兒科肢體痙攣的單位劑量範圍的下限可為250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、1,500、2,000、3,000或3,500 pg之經修飾的BoNT/A，較佳下限為250 pg。較佳地，治療兒科肢體痙攣的經修飾的BoNT/A的單位劑量為250 pg至3,750 pg之經修飾的BoNT/A，例如2,000 pg至3,000 pg。
治療兒科肢體痙攣之適合的單位劑量可為315 pg至5,600 pg之經修飾的BoNT/A且於此治療期間投予的總劑量為至多84,000 pg。治療兒科肢體痙攣的單位劑量範圍的上限可為5,000、4,000、3,000、2,000、1,000或500 pg之經修飾的BoNT/A，較佳上限為5,250 pg。治療兒科肢體痙攣的單位劑量範圍的下限可為350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、1,500、2,000、3,000或3,500 pg之經修飾的BoNT/A，較佳下限為350 pg。較佳地，治療兒科肢體痙攣的經修飾的BoNT/A的單位劑量為350 pg至5,250 pg之經修飾的BoNT/A，例如2,000 pg至3,000 pg。
治療兒科肢體痙攣之適合的單位劑量可為301.5 pg至5,360 pg之經修飾的BoNT/A且於此治療期間投予的總劑量為至多80,400 pg。治療兒科肢體痙攣的單位劑量範圍的上限可為5,000、4,000、3,000、2,000、1,000或500 pg之經修飾的BoNT/A，較佳上限為5,025 pg。治療兒科肢體痙攣的單位劑量範圍的下限可為300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、1,500、2,000、3,000或3,500 pg之經修飾的BoNT/A，較佳下限為335 pg。較佳地，治療兒科肢體痙攣的經修飾的BoNT/A的單位劑量為335 pg至5,025 pg之經修飾的BoNT/A，例如2,000 pg至3,000 pg。
當實施本發明之用於治療兒科肢體痙攣之治療方案時投予的總劑量可為至多7,110單位。換言之，在給定的治療方案中投予的用於治療兒科肢體痙攣的經修飾的BoNT/A之總量可為至多7,110 單位。用於治療兒科肢體痙攣之總劑量可為至多7,000、6,000、5,000、4,000、3,000、2,000、1,000或500單位。較佳地，用於治療兒科肢體痙攣之總劑量可為至多6,667.5單位之經修飾的BoNT/A。用於治療兒科肢體痙攣之總劑量可為至少53、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1,000、1,500、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000或7,000單位。較佳地，用於治療兒科肢體痙攣之總劑量可為至少53單位，更佳為至少59單位之經修飾的BoNT/A，例如，至少397.5單位。用於治療兒科肢體痙攣之總劑量可為59-6,667.5單位，較佳為397.5-6,667.5單位。更佳地，投予的總劑量為4,500-6,667.5單位。
當實施本發明之用於治療兒科肢體痙攣之治療方案時投予的總劑量可為至多60,000 pg。換言之，在給定的治療方案中投予的用於治療兒科肢體痙攣的經修飾的BoNT/A之總量可為至多60,000 pg。用於治療兒科肢體痙攣之總劑量可為至多55,000、50,000、40,000、30,000、20,000、10,000、5,000、3,000或2,500 pg。較佳地，用於治療兒科肢體痙攣之總劑量可為至多56,250 pg之經修飾的BoNT/A。用於治療兒科肢體痙攣之總劑量可為至少500、600、700、800、900、1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、7,500、10,000、12,500、15,000、20,000、30,000、40,000、50,000或55,000 pg。較佳地，用於治療兒科肢體痙攣之總劑量可為至少450 pg，更佳為至少500 pg之經修飾的BoNT/A，例如至少3,000 pg。用於治療兒科肢體痙攣之總劑量可為500-56,250 pg，較佳為30,000-56,250 pg。更佳地，用於治療兒科肢體痙攣之投予的總劑量為3,750-56,250 pg。
給定用於治療兒科肢體痙攣之投予的單位劑量的總數可為至多10x單位劑量。換言之，於一具體實施例，可於10個注射部位投予10x單一單位劑量。於另一具體實施例，可於超過10個注射部位投予10x單一單位劑量。單位劑量的總數將根據所治療的肌肉進行劃分，例如可以向闊背肌投予2x單位劑量，向肩胛下肌投予2x，向胸大肌投予2x，對尺側屈腕肌投予1x，產生的總單位劑量為7x。例如，投予的單位劑量的總數可至多9x、8x、7x、6x、5x、4x或3x。投予的單位劑量的總數可為至少2x、3x、4x、5x、6x、7x之單位劑量，較佳至少2x。投予的單位劑量的總數可為2x至10x、7x至10x或4x至8x。較佳地，投予的單位劑量的總數為10x。
當實施本發明之用於治療兒科肢體痙攣之治療方案時投予的總劑量可為至多4,740單位。換言之，在給定的治療方案中投予的用於治療兒科肢體痙攣的經修飾的BoNT/A之總量可為至多 4,740單位。用於治療兒科肢體痙攣之總劑量可為至多4,500、4,000、3,000、2,000、1,000、或500單位。較佳地，用於治療兒科肢體痙攣之總劑量可為至多4,445單位之經修飾的BoNT/A。用於治療兒科肢體痙攣之總劑量可為至少50、100、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1500、2000、3000、或4000單位。較佳地，用於治療兒科肢體痙攣之總劑量可為至少265單位，更佳為至少295單位之經修飾的BoNT/A。用於治療兒科肢體痙攣之總劑量可為265-4,740單位，較佳為295-4,445單位。
治療兒科肢體痙攣之適合的單位劑量可為15.5單位至353.5單位之經修飾的BoNT/A且於此治療期間投予的總劑量為至多5302.5單位。治療兒科肢體痙攣之單位劑量範圍的上限可為300、250、200、150、100、50或25單位之經修飾的BoNT/A，較佳上限為333單位。治療兒科肢體痙攣之單位劑量範圍的下限可為20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、100、150、200、250、300、或325單位之經修飾的BoNT/A，較佳下限為21單位。較佳地，治療兒科肢體痙攣之經修飾的BoNT/A的單位劑量為21單位至333單位之經修飾的BoNT/A，例如100單位至200單位。此等單位劑量及總劑量可為特別相關，於經修飾的BoNT/A包含BoNT/A輕鏈及轉位域、及BoNT/B受體結合域(H C域)。
治療兒科肢體痙攣之適合的單位劑量可為375 pg至8,500 pg之經修飾的BoNT/A且於此治療期間投予的總劑量為至多127,500 pg。用以治療兒科肢體痙攣之單位劑量範圍之上限可為8,000、7,000、6,000、5,000、4,0000、3,000、2,000或1,000 pg之經修飾的BoNT/A，較佳上限為8,000 pg。治療兒科肢體痙攣的單位劑量範圍的下限可為400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900或1000 pg之經修飾的BoNT/A，較佳下限為500 pg。較佳地，治療兒科肢體痙攣的經修飾的BoNT/A的單位劑量為500 pg至8,000 pg之經修飾的BoNT/A，例如4,000 pg至6,000 pg。此等單位劑量及總劑量可為特別相關，於經修飾的BoNT/A包含BoNT/A輕鏈及轉位域、及BoNT/B受體結合域(H C域)。
當實施本發明之用於治療兒科肢體痙攣之治療方案時投予的總劑量可為至多5,302.5單位。換言之，在給定的治療方案中投予的用於治療兒科肢體痙攣的經修飾的BoNT/A之總量可為至多 5,302.5單位。用於治療兒科肢體痙攣之總劑量可為至多5,000、4,000、3,000、2,000、1,000、或500單位。較佳地，用於治療兒科肢體痙攣之總劑量可為至多4,995單位之經修飾的BoNT/A。用於治療兒科肢體痙攣之總劑量可為至少20、40、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1,000、1,500、2,000、3,000、4,000、或5,000單位。較佳地，用於治療兒科肢體痙攣之總劑量可為至少31單位，更佳為至少42單位之經修飾的BoNT/A，例如，至少232.5單位。用於治療兒科肢體痙攣之總劑量可為42-4995單位，較佳為232.5-4995單位。更佳地，投予的總劑量為4725-4995單位。此等總劑量可為特別相關，於經修飾的BoNT/A包含BoNT/A輕鏈及轉位域、及BoNT/B受體結合域(H C域)。
當實施本發明之用於治療兒科肢體痙攣之治療方案時投予的總劑量可為至多127,500 pg。換言之，在給定的治療方案中投予的用於治療兒科肢體痙攣的經修飾的BoNT/A之總量可為至多127,500 pg。用於治療兒科肢體痙攣之總劑量可為至多127,000、125,000、120,000、110,000 100,000、80,000、60,000、40,000、30,000、20,000、或10,000 pg。較佳地，用於治療兒科肢體痙攣之總劑量可為至多120,000 pg之經修飾的BoNT/A。用於治療兒科肢體痙攣之總劑量可為至少500、600、700、800、900、1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、7,500、10,000、12,500、15,000、20,000、30,000、40,000、50,000或120,000 pg。較佳地，用於治療兒科肢體痙攣之總劑量可為至少750 pg，更佳為至少1000 pg之經修飾的BoNT/A，例如至少6000 pg。用於治療兒科肢體痙攣之總劑量可為1000-120,000 pg，較佳為64,000-120,000 pg。更佳地，用於治療兒科肢體痙攣之投予的總劑量為7500-120,000 pg。此等總劑量可為特別相關，於經修飾的BoNT/A包含BoNT/A輕鏈及轉位域、及BoNT/B受體結合域(H C域)。
當實施本發明之用於治療兒科肢體痙攣之治療方案時投予的總劑量可為至多3,535單位。換言之，在給定的治療方案中投予的用於治療兒科肢體痙攣的經修飾的BoNT/A之總量可為至多3,535單位。用於治療兒科肢體痙攣之總劑量可為至多3,000、2,000、1,000、或500單位。較佳地，用於治療兒科肢體痙攣之總劑量可為至多3,330單位之經修飾的BoNT/A。用於治療兒科肢體痙攣之總劑量可為至少25、50,100、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1500、2000、3000、或3000單位。較佳地，用於治療兒科肢體痙攣之總劑量可為至少150單位，更佳為至少210單位之經修飾的BoNT/A。用於治療兒科肢體痙攣之總劑量可為150-3,535單位，較佳為210-3330單位。此等單位劑量及總劑量可為特別相關，於經修飾的BoNT/A包含BoNT/A輕鏈及轉位域、及BoNT/B受體結合域(H C域)。
本發明之經修飾的BoNT/A較佳具有較長作用期間，當與未經修飾的BoNT/A(例如，Dysport ®)比較。該作用期間可為至少大1.25x、1.5x、1.75x、2.0x、或2.25x。經修飾的BoNT/A之作用期間可為6至9個月之間。例如，作用期間可為至少：4.5個月(由開始)、5.0個月、5.5個月、6 個月、6.5個月、7.0個月、7.5個月、8.0個月、8.5個月或9.0個月。
根據本發明，對多條肌肉的投予較佳於相同治療期間中進行。
投予經修飾的BoNT/A後，可於適當的時間期間重複治療。鑒於作用期間為約未經修飾的BoNT/A(例如，Dysport ®)之二倍，於後續給藥之間的間隔時間可能比用未修飾的BoNT/A(例如，Dysport ®)來治療對象的時間有適合更長期間。可於先前投予後至少18、20、25或30週對對象再次投予根據本發明的修飾的BoNT/A。例如，可於先前投予後至少18-45週，較佳20-35週，再次投予根據本發明的經修飾的BoNT/A。
本文所使用的「對象」可為哺乳類動物，諸如人類或其它哺乳類動物。較佳地，「對象」意指人類對象。
本文所使用的術語「治療」(treat/treating)涵蓋預防性治療(例如，防止疾病的發作)以及矯正性治療(corrective treatment)(對已經罹患疾病的對象的治療)。較佳地，本文所使用的「治療」(treat/treating)意指矯正性治療。本文所使用的術語「治療」(treat/treating)係指疾病及/或其症狀。
編碼其之適合的經修飾的BoNT/A多肽(及核苷酸序列，於存在時)被描述於WO 2015/004461 A1及WO 2017/191315，其兩者藉由引用完整併入本文。
BoNT/A為梭狀芽孢桿菌屬中的細菌所產生的梭狀芽孢桿菌神經毒素之一例。此種梭狀芽孢桿菌神經毒素之其它例包括彼等由破傷風桿菌( C. tetani)(TeNT)及肉毒桿菌( C. botulinum)(BoNT)血清型B-G所產生者，以及彼等由巴氏梭菌( C. baratii)及酪酸梭菌( C. butyricum)所產生者。該神經毒素為高度強效且特異性的，且可毒害彼等被遞送至之神經元及其它細胞。於梭狀芽孢桿菌毒素中有一些為已知最強效的毒素。舉例而言，肉毒桿菌神經毒素視其血清型而定，對於小鼠具有範圍從0.5至5 ng/kg之半數致死劑量(LD 50)值。破傷風及肉毒桿菌毒素兩者係藉由抑制受影響之神經元的功能而作用，特別是神經傳導物的釋放。而肉毒桿菌毒素作用於神經肌肉會合處並在周圍神經系統中抑制膽鹼性傳導(cholinergic transmission)，破傷風毒素則作用於中樞神經系統。
於自然界中，梭狀芽孢桿菌神經毒素(包括BoNT/A)係以單鏈多肽的方式被合成，其係藉由蛋白酶切割事件進行轉譯後修飾，而形成藉由雙硫鍵連接在一起的兩個多肽鏈。切割發生於特定切割位(cleavage site)，其通常稱為活化位(activation site)，其位於提供鏈間(inter-chain)雙硫鍵之半胱胺酸殘基間。此種雙鏈形式為毒素的活性形式。此兩鏈被稱為重鏈(H-鏈)，其具有約100 kDa之分子量；及輕鏈(L-鏈)，其具有約50kDa之分子量。此H-鏈包含N-端轉位組件(N-terminal translocation component)(H N域)及C-端標靶組件(C-terminal targeting component)(H C域)。此切割位係位於L-鏈及轉位域組分之間。於H C域結合至其目標神經元且所結合的毒素經由胞內體(endosome)內化至細胞中後，H N域將L-鏈轉位通過胞內體膜並進入細胞質液內，且L-鏈提供一種蛋白酶功能(亦已知為非細胞毒性(non-cytotoxic)蛋白酶)。
非細胞毒性蛋白酶係藉由將已知為SNARE蛋白質(例如，SNAP-25、VAMP、或突觸融合蛋白(Syntaxin))之細胞內運輸蛋白進行蛋白酶切割而作用–參見 Gerald K(2002)"Cell and Molecular Biology”(第4版) John Wiley & Sons, Inc。首字母縮略詞SNARE衍生自可溶性NSF附著受體( Soluble NSF Attachment Receptor)一詞，其中NSF意指N-乙基馬來醯亞胺-敏感性因子( N-ethylmaleimide- Sensitive Factor)。SNARE蛋白質對於細胞內囊泡融合為不可或缺的，因此對於自細胞經由囊泡運輸之分子分泌為不可或缺的。此蛋白酶功能為鋅依賴型內肽酶活性且展現對SNARE蛋白質之高受質特異性。因此，一旦被遞送至所欲標的細胞，此非細胞毒性蛋白酶能夠抑制自標的細胞的細胞分泌。梭狀芽孢桿菌神經毒素之L-鏈蛋白酶係切割SNARE蛋白質之非細胞毒性蛋白酶。
於本文中使用時，術語「H C域」係意指具有約50kDa分子量之神經毒素重鏈之功能上獨特的區域，其能夠使神經毒素結合至位於目標細胞表面的受體。H C域由兩個結構上獨特的次域「H CN次域」(H C域之N端部分)及「H CC次域」(H C域之C端部分)所組成，其各具有約25kDa之分子量。
本文使用之術語「LH N域」意指不含H C域之神經毒素且由內肽酶域(「L」或「輕鏈」)及負責將內肽酶轉移入細胞質的域(重鏈之H N域)所組成。
如上討論，梭狀芽孢桿菌毒素由兩條多肽鏈形成，重鏈(H-鏈)，其具有約100 kDa之分子量，及輕鏈(L-鏈)，其具有約50kDa之分子量。H鏈包含C-端目標組分(受體結合域或H C域)及N-端轉位組分(H N域)。
輕鏈參考序列之例包括： A型肉毒桿菌神經毒素：胺基酸殘基1-448 B型肉毒桿菌神經毒素：胺基酸殘基1-440
上述識別的參考序列應被視為指導，因為根據亞血清型可能會發生輕微的變化。舉例而言，US 2007/0166332(於此藉由引用完整併入)引用些為不同的梭狀芽孢桿菌序列： A型肉毒桿菌神經毒素：胺基酸殘基M1-K448 B型肉毒桿菌神經毒素：胺基酸殘基M1-K441
較佳的經修飾的BoNT/A為包含於選自下列一或多個胺基酸殘基的修飾之一者：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS 1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274、及THR 1277。與已知的BoNT/A的使用相比，此種經修飾的BoNT/A證實減少或無副作用。本發明之經修飾的BoNT/A之增加的組織保留性亦提供增加的效力及/或作用期間且與已知梭狀芽孢桿菌神經毒素療法相比可使劑量減少(或增加劑量而無任何副作用)，如此提供進一步的優點。
與SEQ ID NO：2所示的未經修飾的BoNT/A相比，該修飾可為一修飾，其中胺基酸殘基編號係藉由與SEQ ID NO：2比對而確定。由於SEQ ID NO：2(以及對應本文所述經修飾的BoNT/A多肽的SEQ ID NOs)之位於位置1的甲硫胺酸殘基係可選擇的，當確定胺基酸殘基編號時，所屬技術領域中具通常知識者將考量甲硫胺酸殘基的存在/不存在。例如，於SEQ ID NO：2包括甲硫胺酸時，位置編號將如上定義(例如，ASN 886將為SEQ ID NO：2之ASN 886)。或者，於SEQ ID NO：2不存有甲硫胺酸時，胺基酸殘基編號應-1修飾(例如，ASN 886將為SEQ ID NO：2之ASN 885)。當位於本文描述的其它多肽序列之位置1存有/不存有甲硫胺酸時，類似的考量適用，且所屬技術領域中具通常知識者使用本技術領域之常規技術將容易確定正確的胺基酸殘基編號。
修飾用所指的胺基酸殘基係表面暴露的胺基酸殘基。
經修飾的BoNT/A可包含位於選自下列的一或多個胺基酸殘基的修飾：ASN 886、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1052、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274及THR 1277。經修飾的BoNT/A可經與選自SEQ ID NOs：3、5、7、及9之核酸序列具有至少70%序列同一性的核酸序列編碼。例如，與選自SEQ ID NOs：3、5、7、及9之核酸序列具有至少80%、90%、95%或99.9%序列同一性的核酸序列。較佳地，本發明中使用的經修飾的BoNT/A可經包含(或由其組成)SEQ ID NO：3、5、7或9之核酸編碼。經修飾的BoNT/A可包含與選自SEQ ID NOs：4、6、8、及10之多肽序列具有至少70%序列同一性之多肽序列。例如，與選自SEQ ID NOs：4、6、8、及10之多肽序列具有至少80%、90%、95%或99.9%序列同一性的多肽序列。較佳地，本發明中使用的經修飾的BoNT/A可包含(更佳為由其組成)選自SEQ ID NOs：4、6、8、及10之多肽序列。
當使用於經修飾的BoNT/A的上下文時，術語「一或多個胺基酸殘基」較佳意指所指胺基酸殘基之至少2、3、4、5、6或7個。如此，經修飾的BoNT/A於所指胺基酸殘基可包含至少2、3、4、5、6或7(較佳為7)個修飾。經修飾的BoNT/A可包含1-30、3-20、或5-10個胺基酸修飾。更佳地，當使用於經修飾的BoNT/A的上下文時，術語「一或多個胺基酸殘基」意指所有之所指胺基酸殘基。
較佳地，除了所指胺基酸殘基處的一或多個胺基酸修飾之外，當與SEQ ID NO：2相比時，經修飾的BoNT/A不含有任何進一步的胺基酸修飾。
最佳地，經修飾的BoNT/A包含(更佳為由其組成)位於選自下列的一或多個胺基酸殘基的修飾：ASN 886、ASN 930、SER 955、GLN 991、ASN 1026、ASN 1052、及GLN 1229。經修飾的BoNT/A可經與SEQ ID NO：3具有至少70%序列同一性的核酸序列編碼。例如，與SEQ ID NO：3具有至少80%、90%、95%或99.9%序列同一性的核酸序列。較佳地，本發明中使用的經修飾的BoNT/A可經包含(或由其組成)SEQ ID NO：3之核酸編碼。經修飾的BoNT/A可包含與SEQ ID NO：4具有至少70%序列同一性的多肽序列。例如，與SEQ ID NO：4具有至少80%、90%、95%或99.9%序列同一性的多肽序列。較佳地，本發明中使用的經修飾的BoNT/A可包含(更佳為由其組成)SEQ ID NO：4。
該修飾可選自： i.以鹼性胺基酸殘基取代酸性表面暴露的胺基酸殘基； ii.以未帶電胺基酸殘基取代酸性表面暴露的胺基酸殘基； iii.以鹼性胺基酸殘基取代未帶電的表面暴露的胺基酸殘基； iv.鹼性胺基酸殘基之插入；及 v.酸性表面暴露的胺基酸殘基之刪除。
如上所指之修飾造成經修飾的BoNT/A具有增加的正表面電荷及增加的等電點，當與對應的未經修飾的BoNT/A比較時。
等電點(pI)為指定蛋白質之特性。如本項技術領域中所熟知，蛋白質係由特定的胺基酸(當於蛋白質中時亦稱為胺基酸殘基)序列製得。二十種標準組之各胺基酸具有不同的側鏈(或R基團)，意指在蛋白質中各胺基酸殘基顯示不同的化學性質諸如電荷及疏水性。此等性質可受周遭化學環境的影響，諸如溫度及pH。蛋白質之整體化學特性將取決於此等各種因子的總和。
某些胺基酸殘基(如下詳述)具有可顯示取決於周圍pH的電荷之可離子化側鏈。在指定的pH下，此種側鏈是否帶電荷取決於相關的可離子化部分的pKa，其中pKa為自共軛鹼之特定質子的酸離解常數(Ka)之負對數。
例如，酸性殘基諸如天冬胺酸及麩胺酸具有pKa值大約為4.1(精確pKa值可取決於溫度、離子強度及可離子化基團的微環境)之側鏈羧酸基。如此，此等側鏈於pH 7.4(通常稱為「生理學的pH」)呈現負電荷。於低pH值，此等側鏈將成為質子化並喪失其電荷。
相反地，鹼性殘基諸如離胺酸及精胺酸具有pKa值大約為10-12之含氮側鏈基團。因此，此等側鏈於pH 7.4呈現正電荷。於高pH值，此等側鏈將成為去質子化並喪失其電荷。
因此蛋白質分子之整體(淨)電荷取決於存於蛋白質中的酸性及鹼性殘基之數目(及其表面暴露程度)及周遭pH。改變周遭pH會改變蛋白質之整體電荷。因此，對於每一種蛋白質，存有一指定pH，其正及負電荷的數目相等且此蛋白質顯示無總淨電荷。此點已知為等電點(pI)。等電點為蛋白質生物化學中的一標準概念，其為本項技術領域中具有通常知識者所熟知。
因此等電點(pI)被定義為蛋白質顯示淨電荷為零之pH值。pI的增加意指蛋白質顯示淨電荷為零需要較高pH值。如此，pI的增加代表於所給pH下，蛋白質之淨正電荷增加。相反地，pI的減少意指蛋白質顯示淨電荷為零所需的pH值較低。如此，pI的減少代表於所給pH下，蛋白質之淨正電荷減少。
在本領域中測定蛋白質之pI的方法為已知，且為本項技術領域中具有通常知識者所熟悉。舉例而言，蛋白質之pI可由存於蛋白質中之各胺基酸之平均pKa值計算而得(「經計算的pI」)。此種計算可使用此項技術中已知的電腦程式進行，如來自ExPASy的Compute pI/MW Tool(https：//web.expasy.org/compute_pi/)，其為依據本發明計算pI的較佳方法。不同分子之間的pI值之比較應使用相同計算技術/程式進行。
在適當情況下，蛋白質之計算的pI可使用等電焦集法(「觀察到的pI」)之技術確認。此技術使用依據其pI的電泳來分離蛋白質。等電焦集法一般使用具有固定化pH梯度的膠體來進行。當施加電場時，蛋白質通過pH梯度移動直到其到達其具零淨電荷的pH，此點為蛋白質的pI。等電焦集法提供的結果一般於性質上為相對低的解析，如此本發明者咸信藉由計算的pI(如上述)所提供的結果係更為適用。
除非另有陳述，本說明全文中「pI」意指「計算的pI」。
藉由改變於蛋白質表面上所顯示的鹼性及/或酸性基團的數目，蛋白質之pI可被增加或減少。此可藉由修飾此蛋白質之一或多個胺基酸而達成。例如，藉由減少酸性殘基的數目或藉由增加鹼性殘基的數目而可提供pI的增加。
本發明之經修飾的BoNT/A可具有一pI值，其為高於未經修飾的BoNT/A(例如，SEQ ID NO：2)的PI值至少0.2、0.4、0.5或1 pI單位。較佳地，經修飾的BoNT/A可具有至少6.6，例如，至少6.8之pI。
下表列出20種標準胺基酸之性質：
胺基酸 側鏈
天冬胺酸 Asp D 帶電(酸性)
麩胺酸 Glu E 帶電(酸性)
精胺酸 Arg R 帶電(鹼性)
離胺酸 Lys K 帶電(鹼性)
組胺酸 His H 未帶電(極性)
天冬醯胺酸 Asn N 未帶電(極性)
麩醯胺酸 Gln Q 未帶電(極性)
絲胺酸 Ser S 未帶電(極性)
蘇胺酸 Thr T 未帶電(極性)
酪胺酸 Tyr Y 未帶電(極性)
甲硫胺酸 Met M 未帶電(極性)
色胺酸 Trp W 未帶電(極性)
半胱胺酸 Cys C 未帶電(極性)
丙胺酸 Ala A 未帶電(疏水性)
甘胺酸 Gly G 未帶電(疏水性)
纈胺酸 Val V 未帶電(疏水性)
白胺酸 Leu L 未帶電(疏水性)
異白胺酸 Ile I 未帶電(疏水性)
脯胺酸 Pro P 未帶電(疏水性)
苯丙胺酸 Phe F 未帶電(疏水性)
下列胺基酸被視為帶電胺基酸：天冬胺酸(負的)、麩胺酸(負的)、精胺酸(正的)、及離胺酸(正的)。
於pH 7.4，天冬胺酸(pKa 3.1)及麩胺酸(pKa 4.1)之側鏈具有負電荷，而精胺酸(pKa 12.5)及離胺酸(pKa 10.8)之側鏈具有正電荷。天冬胺酸及麩胺酸被稱為酸性胺基酸殘基。精胺酸及離胺酸被稱為鹼性胺基酸殘基。
下列胺基酸被視為不帶電、極性(意指其可參與氫鍵結)胺基酸：天冬醯胺酸、麩醯胺酸、組胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、甲硫胺酸、及色胺酸。
下列胺基酸被視為不帶電、疏水性胺基酸：丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、及甘胺酸。
於胺基酸插入，額外的胺基酸殘基(並非通常存在者)被併入BoNT/A多肽序列，如此，增加於該序列中的胺基酸殘基的總數。於胺基酸刪除，胺基酸殘基自梭狀芽孢桿菌毒素胺基酸序列刪除，如此，減少於該序列中的胺基酸殘基的總數。
較佳地，修飾為取代，其於經修飾的BoNT/A中有利地保持相同數目的胺基酸殘基。於胺基酸取代，形成BoNT/A多肽序列之部分的胺基酸殘基以不同胺基酸殘基置換。置換胺基酸殘基可為如上述20種標準胺基酸之一者。或者，於胺基酸取代中該置換胺基酸可為非標準胺基酸(非上述20種標準組之部分之胺基酸)。舉例而言，置換胺基酸可為鹼性非標準胺基酸，例如，L-鳥胺酸、L-2-胺基-3-胍丙酸、或離胺酸、精胺酸及鳥胺酸之D-異構物)。導入非標準胺基酸至蛋白質之方法為此項技術領域已知，並且包括使用大腸桿菌營養缺陷型的表現宿主之重組蛋白質合成。
於一具體實施例，取代係選自：酸性胺基酸殘基以鹼性胺基酸殘基之取代、酸性胺基酸殘基以未帶電胺基酸殘基之取代、及未帶電胺基酸殘基以鹼性胺基酸殘基之取代。於一具體實施例，其中取代為酸性胺基酸殘基以未帶電胺基酸殘基之取代，酸性胺基酸殘基以其對應的未帶電醯胺胺基酸殘基置換(即，天冬胺酸以天冬醯胺酸置換，及麩胺酸以麩醯胺酸置換)。
較佳地，鹼性胺基酸殘基為離胺酸殘基或精胺酸殘基。換言之，取代為以離胺酸或精胺酸之取代。最佳地，修飾為以離胺酸之取代。
根據本發明進行修飾後，經修飾的BoNT/A能夠結合至未經修飾的BoNT/A(例如，SEQ ID NO：2)所結合的目標細胞受體。
本發明中使用的經修飾的BoNT/A可包含 BoNT/A輕鏈及轉位域(BoNT/A LH N域)、及BoNT/B H C域。BoNT/A LH N域共價連結至BoNT/B H C域。於本文該經修飾的BoNT/A亦指「BoNT/AB」或「BoNT/AB嵌合體」。
LH N域之C端胺基酸殘基可對應於BoNT/A之分開LH N及H C域的3 10螺旋的第一胺基酸殘基，且H C域之N端胺基酸殘基可對應於BoNT/B之分開LH N及H C域的3 10螺旋的第二胺基酸殘基。
BoNT/B多肽序列之一例被提供為SEQ ID NO：16(UniProt登錄號B1INP5)。
本文中提及「BoNT/A之分開LH N及H C域的3 10螺旋的第一胺基酸殘基」意指分開LH N及H C域的3 10螺旋的N端殘基。
本文中提及「BoNT/B之分開LH N及H C域的3 10螺旋的第二胺基酸殘基」意指分開LH N及H C域的3 10螺旋的N端殘基後的胺基酸殘基。
「3 10螺旋」與α-螺旋、β-褶板及反轉，皆為於蛋白質及多肽中發現的一種二級結構的形式。3 10螺旋中胺基酸以右手螺旋結構的方式排列，其中每個完整轉折(turn)係由三個殘基且由分離其之間的分子內氫鍵的十個原子所完成。螺旋中各胺基酸對應120°轉折(即，螺旋於每一轉折具有三個殘基)，及伴隨螺旋軸之2.0Å(=0.2nm)的位移(translation)，且於藉由作成氫鍵所形成的環中具有10個原子。最重要地，胺基酸之N-H基團與三個在前的胺基酸之C=O基團形成氫鍵；此重複的i+3→i氫鍵定義了3 10螺旋。3 10螺旋係本技術領域中具有通常知識者所熟知的結構生物學中的標準概念。
此3 10螺旋係對應於形成真正螺旋的四個殘基、及兩個各自在此等四個殘基端上的帽(cap)(或過渡的)殘基。於本文中使用時，術語「分開LH N及H C域的3 10螺旋」係由彼等6個殘基所組成。
透過進行結構分析及序列比對，鑑定分開LH N及H C域的3 10螺旋。此3 10螺旋於其N端(即，於LH N域之C端部分)被α-螺旋環繞且於其C端(即，位於H C域之N端部分)被β-褶板環繞。3 10螺旋之第一(N端)殘基(帽或過渡殘基)亦對應於此α-螺旋之C端殘基。
分開LH N及H C域的3 10螺旋可被例如由公開可取得之肉毒桿菌神經毒素的結晶結構所確定，分別例如3BTA(http：//www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=3BTA)及肉毒桿菌神經毒素A1及B1之1EPW(http：//www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=1EPW)。
公開可使用的電腦模擬模型及比對工具亦可用於確定在其它神經毒素中分開LH N及H C域的3 10螺旋的位置，例如同源模型伺服器LOOPP(Learning, Observing and Outputting Protein Patterns, http：//loopp.org)、PHYRE(Protein Homology/analogY Recognition Engine, http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/)及Rosetta(https：//www.rosettacommons.org/)、蛋白質疊加伺服器SuperPose (http：//wishart. biology. ualberta.ca/ superpose/)、比對程式Clustal Omega(http：//www.clustal.org/omega/)、及列於Internet Resources for Molecular and Cell Biologists(http：//molbiol-tools.ca/)之許多其它工具/伺服器。尤其圍繞「H N/H CN」接合之區域係結構上高度保留，使其成為疊加不同血清型的理想區域。
例如，使用下列方法學以確定於其它神經毒素中之此3 10螺旋的序列： 1.使用結構同源性模型工具LOOP(http：//loopp.org)以獲得基於BoNT/A1結晶結構(3BTA.pdb)之其它BoNT血清型的預測結構； 2.編輯如此獲得的結構(pdb)檔案以包括僅H CN域之N端及其之前的約80個殘基(其為H N域之部分)，因而保有結構上高度保留的「H N/H CN」區域； 3.使用蛋白質疊加伺服器SuperPose(http：//wishart.biology.ualberta.ca/superpose/)以疊加各血清型於3BTA.pdb結構； 4.檢查疊加的pdb檔案以定位於BoNT/A1之HC域開始的310螺旋，然後鑑定於其它血清型中對應的殘基。 5.以Clustal Omega比對其它BoNT血清型序列以檢查對應的殘基是否正確。
以此方法確定的LH N、H C及3 10螺旋域之例呈示於下：
神經毒素 登錄號 ( 小數點後加上序列號 ) LH N H C 3 10 螺旋
BoNT/A1 (SEQ ID NO：2) A5HZZ9.1 1-872 873-1296 872NIINTS 877
BoNT/A2 X73423.3 1-872 873-1296 872NIVNTS 877
BoNT/A3 DQ185900.1(亦稱為Q3LRX9.1) 1-872 873-1292 872NIVNTS 877
BoNT/A4 EU341307.1(亦稱為Q3LRX8.1) 1-872 873-1296 872NITNAS 877
BoNT/A5 EU679004.1(亦稱為C1IPK2.1) 1-872 873-1296 872NIINTS 877
BoNT/A6 FJ981696.1 1-872 873-1296 872NIINTS 877
BoNT/A7 JQ954969.1(亦稱為K4LN57.1) 1-872 873-1296 872NIINTS 877
BoNT/A8 KM233166.1 1-872 873-1297 872NITNTS 877
BoNT/B1 (SEQ ID NO：16) B1INP5.1 1-859 860-1291 859EILNNI 864
BoNT/B2 AB084152.1(亦稱為Q8GR96.1) 1-859 860-1291 859EILNNI 864
BoNT/B3 EF028400.1(亦稱為A2I2S2.1) 1-859 860-1291 859EILNNI 864
BoNT/B4 EF051570.1(亦稱為A2I2W0.1) 1-859 860-1291 859EILNNI 864
BoNT/B5 EF033130.1(亦稱為A2I2U6.1) 1-859 860-1291 859DILNNI 864
BoNT/B6 AB302852.1(亦稱為A8R089.1) 1-859 860-1291 859EILNNI 864
BoNT/B7 JQ354985.1(亦稱為H9CNK9.1) 1-859 860-1291 859EILNNI 864
BoNT/B8 JQ964806.1(亦稱為I6Z8G9.1) 1-859 860-1292 859EILNNI 864
使用結構分析及序列比對，發現分開LH N及H C域的3 10螺旋後的β-褶板係於所有肉毒桿菌及破傷風神經毒素中被保留的結構，且起始於當自分開LH N及H C域的3 10螺旋的第一殘基算起之第8殘基(例如，於BoNT/A1之殘基879)。
BoNT/AB嵌合體可包含源自BoNT/A的LH N域共價連結至源自BoNT/B的H C域， ●     其中LH N域之C端胺基酸殘基對應於：對於位於BoNT/A之H C域的起始(N端)的β-褶板為N端上第八胺基酸殘基，且 ●     其中H C域之N端胺基酸殘基對應於：對於位於BoNT/B之H C域的起始(N端)的β-褶板為N端上第七胺基酸殘基。
BoNT/AB嵌合體可包含源自BoNT/A的LH N域共價連結至源自BoNT/B的H C域， ●     其中LH N域之C端胺基酸殘基對應於：位於BoNT/A之LH N域端(C端)之α-螺旋的C端胺基酸殘基，及 ●     其中H C域之N端胺基酸殘基對應於：緊靠對於位於BoNT/B之LH N域端(C端)之α-螺旋的C端胺基酸殘基的C端的胺基酸殘基。
BoNT/AB嵌合體之設計過程的原理係試圖確保不會危及二級結構，因而使對三級結構及對每個域的功能的任何改變最小化。不欲受理論束縛，假設藉由不破壞BoNT/AB嵌合體中3 10螺旋之四個中央胺基酸殘基確保嵌合神經毒素的最佳構象，從而允許嵌合神經毒素盡其所能發揮其功能。
事實上，令人驚訝地，僅保留BoNT/A的3 10螺旋的第一胺基酸殘基和BoNT/B以後的3 10螺旋的第二胺基酸殘基，不僅允許產生可溶性和功能性的BoNT/AB嵌合體，而且進一步導致優於其它BoNT/AB嵌合體的性能，特別是提高的效力、提高的安全比及/或更長的作用時間(以及當與未修飾的BoNT/A相比，增加的安全比及/或作用時間)。
源自BoNT/A的LH N域可對應SEQ ID NO：2之胺基酸殘基1至872，或與其具有至少70%序列同一性的多肽序列。源自BoNT/A的LH N域可對應SEQ ID NO：2之胺基酸殘基1至872，或與其具有至少80%、90%或95%序列同一性的多肽序列。較佳地，源自BoNT/A的LH N域對應SEQ ID NO：2之胺基酸殘基1至872。
源自BoNT/B的H C域可對應SEQ ID NO：16之胺基酸殘基860至1291，或與其具有至少70%序列同一性的多肽序列。源自BoNT/B的H C域可對應SEQ ID NO：16之胺基酸殘基860至1291，或與其具有至少80%、90%或95%序列同一性的多肽序列。較佳地，源自BoNT/B的H C域對應SEQ ID NO：16之胺基酸殘基860至1291。
較佳地，BoNT/AB嵌合體包含BoNT/A1 LH N域及BoNT/B1 H C域。更佳地，LH N域對應BoNT/A1(SEQ ID NO：2)之胺基酸殘基1至872且H C域對應BoNT/B1(SEQ ID NO：16)之胺基酸殘基860至1291。
較佳地，BoNT/B H C域進一步於H CC次域中包含至少一個胺基酸殘基取代、添加、或缺失，當與天然BoNT/B序列比較時，其具有增加BoNT/B神經毒素對人類Syt II結合親和性的效果。於BoNT/B H CC次域中適當的胺基酸殘基取代、添加或缺失已被揭示於WO2013/180799及WO 2016/154534(藉由引用將兩者皆併入本文)。
於BoNT/B H CC次域中適合的胺基酸殘基取代、添加或缺失包括選自下列所組成的群組之取代突變：V1118M、Y1183M、E1191M、E1191I、E1191Q、E1191T、S1199Y、S1199F、S1199L、S1201V、E1191C、E1191V、E1191L、E1191Y、S1199W、S1199E、S1199H、W1178Y、W1178Q、W1178A、W1178S、Y1183C、Y1183P及其組合。
於BoNT/B H CC次域中適合的胺基酸殘基取代、添加或缺失進一步包括兩個選自下列所組成的群組的取代突變的組合：E1191M及S1199L、E1191M及S1199Y、E1191M及S1199F、E1191Q及S1199L、E1191Q及S1199Y、E1191Q及S1199F、E1191M及S1199W、E1191M及W1178Q、E1191C及S1199W、E1191C及S1199Y、E1191C及W1178Q、E1191Q及S1199W、E1191V及S1199W、E1191V及S1199Y、或E1191V及W1178Q。
於BoNT/B H CC次域中適合的胺基酸殘基取代、添加或缺失亦包括三個取代突變之組合，該取代突變為E1191M、S1199W及W1178Q。
較佳地，於BoNT/B H CC次域中適合的胺基酸殘基取代、添加或缺失包括兩個取代突變之組合，該取代突變為E1191M及S1199Y。此種修飾存於BoNT/AB嵌合體SEQ ID NO：13及SEQ ID NO：14。
當與SEQ ID NO：16所示的未經修飾的BoNT/B比較時，該修飾可為一種修飾，其中胺基酸殘基編號係藉由與SEQ ID NO：16比對而確定。由於SEQ ID NO：16之位於位置1的甲硫胺酸殘基係可選擇的(以及對應本文所述經修飾的BoNT/A多肽之SEQ ID NOs)為非強制的，所屬技術領域中具通常知識者當決定胺基酸殘基編號時所屬技術領域中具通常知識者將考量甲硫胺酸殘基的存在/不存在。例如，於SEQ ID NO：16包括甲硫胺酸時，位置編號將如上定義(例如，E1191將為SEQ ID NO：16之E1191)。或者，於SEQ ID NO：16不存有甲硫胺酸時，胺基酸殘基編號應被-1修改(例如，E1191將為SEQ ID NO：16之E1190)。當位於本文描述的其它多肽序列之位置1存有/不存有甲硫胺酸時，類似的考量適用，且所屬技術領域中具通常知識者使用本技術領域之常規技術將容易確定正確的胺基酸殘基編號。
於本發明中使用之經修飾的BoNT/A可包含與選自SEQ ID NOs：11-15之多肽序列具有至少70%序列同一性之多肽序列。例如，與選自SEQ ID NOs：11-15之多肽序列具有至少80%、90%、95%或99.9%序列同一性的多肽序列。較佳地，本發明中使用的經修飾的BoNT/A可包含(更佳為由其組成)選自SEQ ID NOs：11-15之多肽序列。
當經修飾的BoNT/A為BoNT/AB嵌合體，其較佳為經修飾的BoNT/A包含與SEQ ID NO：14具有至少70%序列同一性的多肽序列。例如，與SEQ ID NO：14具有至少80%、90%、95%或99.9%序列同一性的多肽序列。較佳地，本發明中使用的經修飾的BoNT/A可包含(更佳為由其組成)SEQ ID NO：14。
藉由胺基酸殘基之取代、插入或刪除進行修飾蛋白質的方法為此項技術領域已知。舉例而言，藉由編碼BoNT/A之DNA序列(例如，編碼未經修飾的BoNT/A)之修飾可導入胺基酸修飾。此使用標準分子選殖技術可達成，例如藉由定點突變(site-directed mutagenesis)，其中使用聚合酶酵素，使用編碼所欲胺基酸之DNA之短股(寡核苷酸)來置換原始編碼序列，或藉由使用各種酵素(例如，連接酶及限制核酸內切酶)插入/刪除部分之基因。或者，可化學合成經修飾的基因序列。
如上所討論，本文所述經修飾的BoNT/A已增加組織保留性，其亦提供增加的效力及/或作用持續時間，且可允許增加劑量而沒有任何其它負向作用。可定義此等有利性質的一種方式為根據經修飾的BoNT/A的安全比。關於此點，藉由於相關動物模型中測量體重減少的百分比(例如，小鼠，於投予7日間偵測體重減少)，可以實驗評估梭狀芽孢桿菌毒素之不欲的效果(由毒素遠離投予位點的擴散所引起)。相反地，藉由趾外展評分(Digital Abduction Score)(DAS)分析，一種肌肉癱瘓之測量，可實驗評估梭狀芽孢桿菌毒素於所欲目標的效果。DAS分析可藉由 將20μl之調製於明膠磷酸緩衝液(Gelatin Phosphate Buffer)中之梭狀芽孢桿菌毒素注射至小鼠腓腸肌/比目魚肌複合體中，隨後使用Aoki之方法估計趾外展評分(Aoki KR, Toxicon 39：1815-1820；2001)。於此DAS分析，小鼠以尾巴被短暫地懸掛以誘發特徵性的驚嚇反應，其中小鼠伸展其後肢並外展其後趾。梭狀芽孢桿菌毒素注射後，趾的外展變化程度以五點評分尺度(0=正常至4=趾外展及腿伸展減少最大)被計分。
然後本發明之經修飾的BoNT/A之安全率(或用於比較之未經修飾的BoNT/A)可被表示為體重降低10%所需的毒素量(於小鼠投劑後第1個7日間在峰效應下所測量的)及DAS分數為2所需的毒素量之間的比率。因此希望高安全率分數，且指出一種能夠有效地麻痺目標肌肉且具少許的不欲的偏離目標效果之毒素。本發明之經修飾的BoNT/A具有高於等價之未經修飾(天然)BoNT/A之安全率。
如此，於一具體實施例，本發明之經修飾的BoNT/A具有大於7(例如，至少8、9、10、15、20、25、30、35、40、45或50)之安全率，其中安全率被計算為：體重變化-10%所需的毒素劑量(pg/小鼠)除以DAS ED 50(pg/小鼠)[ED 50=產生DAS分數為2所需之劑量]。
於一具體實施例，本發明之經修飾的BoNT/A具有至少10之安全率。於一具體實施例，本發明之經修飾的BoNT/A具有至少15之安全率。
較佳地，於經修飾的BoNT/A為包含選自下列一或多個胺基酸殘基的一者：如本文所述ASN 886、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1052、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274及THR 1277，該經修飾的BoNT/A具有至少20之安全率，更佳為至少22(例如，23-25)。
較佳地，於經修飾的BoNT/A為包含BoNT/A 輕鏈及轉位域、及BoNT/B H C域者，該經修飾的BoNT/A具有至少10之安全率，更佳為至少12(例如，14-15)。
在使用中，本發明的經修飾的BoNT/A為雙鏈型式。
經修飾的BoNT/A較佳為非複合型式(non-complexed form)(即不含天然BoNT/A中存在的複合蛋白質)。此種複合蛋白質之例包括與神經毒素相關的蛋白質(NAP)及無毒非紅血球凝血素(nontoxic-nonhemagglutinin component(NTNH))。其較佳係經修飾的BoNT/A為重組經修飾的BoNT/A。
該經修飾的BoNT/A可藉由一種生產單鏈經修飾的BoNT/A之方法生產，該經修飾的BoNT/A具有輕鏈及重鏈，該方法包含於適合宿主細胞中表現核酸(該核酸為上述者)，溶解宿主細胞以提供含有該單股經修飾的BoNT/A之宿主細胞均質物，及單離該單鏈經修飾的BoNT/A。然後該經修飾的BoNT/A可藉由一方法而活化，該方法包含提供一單鏈經修飾的BoNT/A蛋白質，其可藉由如上述生產單鏈經修飾的BoNT/A之方法而獲得，將經修飾的BoNT/A與蛋白酶接觸，該蛋白酶於位於輕鏈與重鏈之間的辨識位(切割位)切割多肽，因而轉化該多肽成為雙鏈經修飾的BoNT/A，其中輕鏈及重鏈藉由雙硫鍵連結在一起。
可以任何適合的方式調配本發明之經修飾的BoNT/A以投予至對象，例如作為醫藥組成物之一部分。如此，於一態樣中，本發明提供一種醫藥組成物，其包含本發明之經修飾的BoNT/A及醫藥上可接受的載體、賦形劑、佐劑、及/或鹽。
於一態樣，本發明提供經修飾的肉毒桿菌神經毒素A(BoNT/A)之一單位劑型，該單位劑型包含： a.   53單位至948單位之經修飾的BoNT/A，其中1單位為相當於小鼠中經計算的半數致死劑量(LD50)之經修飾的BoNT/A的量；或 b.   450 pg至8,000 pg之經修飾的BoNT/A；及 c.   可選擇的醫藥上可接受的載劑、賦形劑、佐劑、及/或鹽， 其中該經修飾的BoNT/A包含於選自下列一或多個胺基酸殘基的修飾：886、905、915、918、920、930、954、955、991、992、995、1006、1025、1026、1032、1043、1046、1052、1058、1064、1080、1081、1083、1086、1188、1213、1215、1216、1229、1242、1243、1274、及1277，當與如SEQ ID NO：2所示之未經修飾的BoNT/A比較時，其中胺基酸殘基編號係藉由與SEQ ID NO：2比對而確定，且其中該修飾係選自： i.以鹼性胺基酸殘基取代酸性表面暴露的胺基酸殘基； ii.以未帶電胺基酸殘基取代酸性表面暴露的胺基酸殘基； iii.以鹼性胺基酸殘基取代未帶電的表面暴露的胺基酸殘基； iv.鹼性胺基酸殘基之插入；及 v.酸性表面暴露的胺基酸殘基之刪除。
於一態樣，本發明提供經修飾的肉毒桿菌神經毒素A(BoNT/A)之一單位劑型，該單位劑型包含： a.   53單位至948單位之經修飾的BoNT/A，其中1單位為相當於小鼠中經計算的半數致死劑量(LD50)之經修飾的BoNT/A的量；或 b.   450 pg至8,000 pg之經修飾的BoNT/A；及 c.   可選擇的醫藥上可接受的載劑、賦形劑、佐劑、及/或鹽， 其中該經修飾的BoNT/A包含BoNT/A輕鏈及轉位域、及BoNT/B受體結合域(H C域)。
單位劑型可包含53單位至948單位之經修飾的BoNT/A。該範圍之上限可為925、900、850、800、750、700、650、600、550、500、450、400、350、300、250、200、150或100單位之經修飾的BoNT/A，較佳上限為889單位。該範圍之下限可為55、60、65、70、75、80、85、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850或900單位之經修飾的BoNT/A，較佳下限為59單位。較佳地，單位劑型包含59單位至889單位之經修飾的BoNT/A，例如200單位至600單位。
單位劑型可包含450 pg至8,000 pg之經修飾的BoNT/A。該範圍之上限可為7,750、7,500、7,000、6,000、5,000、4,000、3,000、2,000或1,000 pg之經修飾的BoNT/A，較佳地，上限為7,500 pg。該範圍之下限可為475、500、600、700、800、900、1,000、1,500、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000或7,000 pg之經修飾的BoNT/A，較佳地，下限為500 pg。較佳地，單位劑型包含500 pg至7,500 pg之經修飾的BoNT/A，例如，4,000 pg至6,000 pg。
於另一態樣，本發明提供經修飾的肉毒桿菌神經毒素A(BoNT/A)之一單位劑型，該單位劑型包含： a.   31單位至707單位之經修飾的BoNT/A，其中1單位為相當於小鼠中經計算的半數致死劑量(LD 50)之經修飾的BoNT/A的量；或 b.   750 pg至17,000 pg之經修飾的BoNT/A；及 c.   可選擇的醫藥上可接受的載劑、賦形劑、佐劑、及/或鹽， 其中該經修飾的BoNT/A包含BoNT/A輕鏈及轉位域、及BoNT/B受體結合域(H C域)。
單位劑型可包含31單位至707單位之經修飾的BoNT/A。該範圍之上限可為700、650、600、550、500、450、400、350、300、250、200、150或100單位之經修飾的BoNT/A，較佳地，上限為666單位。該範圍之下限可為40、45、50、60、65、70、75、80、85、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、或700單位之經修飾的BoNT/A，較佳地，下限為42單位。較佳地，單位劑型包含42單位至666單位之經修飾的BoNT/A，例如200單位至400單位。
單位劑型可包含750 pg至17,000 pg之經修飾的BoNT/A。該範圍之上限可為16,500、15,500、14,500、13,500、12,500、11,500、10,500、9,500、8,500、7,500、6,500、5,500、4,500、3,500、2,500、1,500或500 pg之經修飾的BoNT/A，較佳地，上限為16,000 pg。該範圍之下限可為750、850、950、1000、1500、2000、2,500、3,000、3,500、3,000、4,000、5,000、4,500或5,000 pg之經修飾的BoNT/A，較佳地，下限為1000 pg。較佳地，單位劑型包含1000 pg至16,000 pg之經修飾的BoNT/A，例如，4,000 pg至6,000 pg。
如前所述，兒科應用的單位劑量可比上述所指低50%或更少。於一些具體實施例，單位劑量通常比治療成人肢體痙攣時所使用的單位劑量低70%或更少(例如，67%或以下)。
於一態樣，本發明提供經修飾的肉毒桿菌神經毒素A(BoNT/A)之一單位劑型，該單位劑型包含： a.   26.5單位至474單位之經修飾的BoNT/A，其中1單位為相當於小鼠中經計算的半數致死劑量(LD 50)之經修飾的BoNT/A的量；或 b.   225 pg至4,000 pg之經修飾的BoNT/A；及 c.   可選擇的醫藥上可接受的載劑、賦形劑、佐劑、及/或鹽， 其中該經修飾的BoNT/A包含於選自下列一或多個胺基酸殘基的修飾：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS 1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274、及THR 1277，其中該修飾選自： i.以鹼性胺基酸殘基取代酸性表面暴露的胺基酸殘基； ii.以未帶電胺基酸殘基取代酸性表面暴露的胺基酸殘基； iii.以鹼性胺基酸殘基取代未帶電的表面暴露的胺基酸殘基； iv.鹼性胺基酸殘基之插入；及 v.酸性表面暴露的胺基酸殘基之刪除。
於另一態樣，本發明提供經修飾的肉毒桿菌神經毒素A(BoNT/A)之一單位劑型，該單位劑型包含： a.   26.5單位至474單位之經修飾的BoNT/A，其中1單位為相當於小鼠中經計算的半數致死劑量(LD 50)之經修飾的BoNT/A的量；或 b.   225 pg至4,000 pg之經修飾的BoNT/A；及 c.   可選擇的醫藥上可接受的載劑、賦形劑、佐劑、及/或鹽， 其中該經修飾的BoNT/A包含BoNT/A輕鏈及轉位域、及BoNT/B受體結合域(H C域)。
單位劑型可包含26.5單位至474單位之經修飾的BoNT/A。該範圍之上限可為425、400、350、300、250、200、150、100或50單位之經修飾的BoNT/A，較佳地，上限為444.5單位。該範圍之下限可為30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550或600單位之經修飾的BoNT/A，較佳下限為29.5單位。較佳地，單位劑型包含29.5單位至444.5單位之經修飾的BoNT/A，例如100單位至300單位。
單位劑型可包含225 pg至4,000 pg之經修飾的BoNT/A。該範圍之上限可為3,750、3,500、3,000、2,000、1,000、4,000、或500 pg之經修飾的BoNT/A，較佳地，上限為3,750 pg。該範圍之下限可為225、250、300、400、500、600、800、1,000、1,500、2,000、2,500、3,000、或3500 pg之經修飾的BoNT/A，較佳地，下限為250 pg。較佳地，單位劑型包含250 pg至3,750 pg之經修飾的BoNT/A，例如，2,000 pg至3,000 pg。
於另一態樣，本發明提供經修飾的肉毒桿菌神經毒素A(BoNT/A)之一單位劑型，該單位劑型包含： a.   15.5單位至353.5單位之經修飾的BoNT/A，其中1單位為相當於小鼠中經計算的半數致死劑量(LD 50)之經修飾的BoNT/A的量；或 b.   375 pg至8,500 pg之經修飾的BoNT/A；及 c.   可選擇的醫藥上可接受的載劑、賦形劑、佐劑、及/或鹽， 其中該經修飾的BoNT/A包含BoNT/A輕鏈及轉位域、及BoNT/B受體結合域(H C域)。
單位劑型可包含15.5單位至353.5單位之經修飾的BoNT/A。該範圍之上限可為350、300、250、200、150、100或50單位之經修飾的BoNT/A，較佳地，上限為333單位。該範圍之下限可為20、25、30、35、40、45、50、65、70、75、80、85、90、95、或100單位之經修飾的BoNT/A，較佳地，下限為21單位。較佳地，單位劑型包含21單位至33單位之經修飾的BoNT/A，例如200單位至400單位。
單位劑型可包含375 pg至8,500 pg之經修飾的BoNT/A。該範圍之上限可為7,500、7,000、6,500、6,000、5,500、5,000、4,500、4,000、3,500、3,000、2,500、2,000、1,500、1,000、或500 pg之經修飾的BoNT/A，較佳地，上限為8,000 pg。該範圍之下限可為450、550、650、750、850、950、1,000、1,500、2,000、2,500或3,000 pg之經修飾的BoNT/A，較佳地，下限為500 pg。較佳地，單位劑型包含500 pg至8,000 pg之經修飾的BoNT/A，例如，2000 pg至4,000 pg。
於另一態樣，本發明提供一套組，包含： a.   依據本發明之單位劑型；及 b.   使用該藥物於治療肢體痙攣的說明；及 c.   可選擇的稀釋劑。
與本發明的各種治療用途有關的具體實施例可被應用於本發明之方法、組成物(例如，單位劑型)、及套組，反之亦然。
序列同源性
可使用多種序列比對方法中的任一種來確定百分比同一性，包括但不限於整體法(global methods)、局部法和混合法((hybrid methods)，諸如，例如區段逼近法(segment approach method)。確定百分比同一性的方案為本領域所屬技術領域中具有通常知識者範疇內的常規程序。整體法從分子的起始到末端比對序列，並藉由累加各個殘基對的分數並藉由施加間隙(gap)罰分(gap penalties)來確定最佳比對。非限制性方法包括例如CLUSTAL W，參見例如，Julie D. Thompson et al., CLUSTAL W：Improving the Sensitivity of Progressive Multiple Sequence Alignment Through Sequence Weighting, Position- Specific Gap Penalties and Weight MatrixChoice, 22(22) Nucleic Acids Research 4673-4680(1994)；及其疊代細化(iterative refinement)，參見例如，Osamu Gotoh, Significant Improvement in Accuracy of Multiple Protein.Sequence Alignments by Iterative Refinement as Assessed by Reference to Structural Alignments, 264(4) J. MoI.Biol.823-838(1996)。局部方法藉由鑑定所有輸入序列共有的一個或多個保守基序來比對序列。非限制性方法包括，例如，Match-box，參見例如，Eric Depiereux and Ernest Feytmans, Match-Box：A Fundamentally New Algorithm for the Simultaneous Alignment of Several Protein Sequences, 8(5) CABIOS 501 -509(1992)；吉布斯採樣(Gibbs sampling)，參見例如，C. E. Lawrence et al., Detecting Subtle Sequence Signals：A Gibbs Sampling Strategy for Multiple Alignment, 262(5131) Science 208-214(1993)；Align-M，參見例如，Ivo Van WaIIe et al., Align-M - A New Algorithm for Multiple Alignment of Highly Divergent Sequences, 20(9) Bioinformatics：1428-1435(2004)。
因此，藉由習知方法確定百分比序列同一性。參見例如，Altschul et al., Bull.Math.Bio.48：603-16, 1986 and Henikoff and Henikoff, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915-19, 1992。簡而言之，將兩個胺基酸序列進行比對，以優化比對得分，其使用間隙開放罰分10、間隙延伸罰分1以及Henikoff及Henikoff(同上)的「blosum 62」評分矩陣，如下所示(胺基酸藉由標準的單一字母代碼表示)。
在兩個以上核酸或胺基酸序列間的「百分比序列同一性」係在序列所共有的相同位置之數目的函數。如此，同一性%可以下述方式計算：相同核苷酸/胺基酸的數目除以核苷酸/胺基酸總數乘以100。序列同一性%的計算亦可考慮到為了最佳化兩個以上序列的比對所需要引入之間隙的數量、以及各間隙的長度。兩個以上序列之間的序列比較及百分比同一性的確定可使用例如BLAST的特定數學演算法進行，其為具有技術通常知識者熟悉。
用於確定序列同一性的比對分數
然後，百分比同一性計算為：
實質上同源的多肽特徵在於具有一或多個胺基酸取代、刪除或添加。這些改變較佳為較小性質，即保守胺基酸取代(詳見下文)且不會顯著影響多肽的折疊或活性的其它取代；小刪除，通常刪除1至約30個胺基酸；及小的胺基或羧基末端延伸，諸如胺基末端的甲硫胺酸殘基、最多達約20-25個殘基的小型連接肽或親和性標籤。
保守胺基酸取代
鹼性： 精胺酸
離胺酸
組胺酸
酸性： 麩胺酸
天冬胺酸
極性： 麩醯胺酸
天冬醯胺酸
疏水性： 白胺酸
異白胺酸
纈胺酸
芳香族： 苯丙胺酸
色胺酸
酪胺酸
小的： 甘胺酸
丙胺酸
絲胺酸
蘇胺酸
甲硫胺酸
除了20種標準胺基酸之外，非標準胺基酸(諸如4-羥基脯胺酸、6-N-甲基離胺酸、2-胺基異丁酸、異纈胺酸及α-甲基絲胺酸)亦可取代本發明的多肽的胺基酸殘基。有限數量的非保守胺基酸、非由遺傳密碼編碼的胺基酸及非天然胺基酸可取代多肽胺基酸殘基。本發明之多肽亦可包含非天然存在的胺基酸殘基。
非天然存在的胺基酸包括但不限於反式-3-甲基脯胺酸、2,4-甲橋-脯胺酸(2,4-methano-proline)、順式-4-羥基脯胺酸、反式-4-羥基-脯胺酸、N-甲基甘胺酸、別-蘇胺酸、甲基-蘇胺酸、羥基-乙基半胱胺酸、羥基乙基升半胱胺酸(hydroxyethylhomo-cysteine)、硝基-麩醯胺酸、升麩醯胺酸(homoglutamine)、2-哌啶甲酸、三級白胺酸、正纈胺酸、2-氮雜苯丙胺酸、3-氮雜苯基-丙胺酸、4-氮雜苯基-丙胺酸、及4-氟苯丙胺酸。此項技術領域已知將非天然存在的胺基酸殘基併入蛋白質中的數種方法。例如，可使用活體外系統，其中使用經化學胺基醯化的抑制型tRNA(suppressor tRNA)而抑制無意義突變(nonsense mutation)。用於合成胺基酸和胺基醯化tRNA的方法為此項技術領域所知。包含無意義突變的質體的轉錄和轉譯係於無細胞系統中進行，該無細胞系統包含大腸桿菌S30萃取物及可商業上購得的酶和其它試劑。蛋白質可藉由層析純化。參見例如，Robertson et al., J. Am. Chem.Soc.113：2722, 1991；Ellman et al., Methods Enzymol.202：301, 1991；Chung et al., Science 259：806-9, 1993；及Chung et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：10145-9, 1993)。於第二種方法中，藉由顯微注射突變的mRNA及經化學胺基醯化的抑制型tRNA，而在爪蟾卵母細胞(Xenopus oocyte)中進行轉譯(Turcatti et al., J. Biol.Chem.271：19991-8, 1996)。於第三種方法中，在欲置換的天然胺基酸(例如苯丙胺酸)不存在且所欲的非天然存在的胺基酸(例如2-氮雜苯丙胺酸、3-氮雜苯丙胺酸、4-氮雜苯丙胺酸或4-氟苯丙胺酸)存在下培養大腸桿菌細胞。非天然存在的胺基酸被併入多肽中代替其天然的對應物。參見，Koide et al., Biochem.33：7470-6, 1994。天然存在的胺基酸殘基可藉由活體外化學修飾而轉化為非天然存在的種類。化學修飾可與定點誘變結合以進一步擴大取代範圍(Wynn and Richards, Protein Sci.2：395-403, 1993)。
有限數量的非保守的胺基酸、非由遺傳密碼編碼的胺基酸、非天然存在的胺基酸及非天然的胺基酸可取代本發明之多肽的胺基酸殘基。
本發明之多肽中的必須胺基酸可根據所屬技術領域中已知的程序鑑定，諸如定點突變或丙胺酸-掃描誘變(scanning mutagenesis)(Cunningham and Wells, Science 244：1081-5, 1989)。生物相互作用的位置亦可藉由結構物理分析來確定，如藉由如核磁共振、結晶學、電子繞射或光親和性標幟(photoaffinity labeling)之技術，結合推定的接觸位胺基酸的突變。參見例如，de Vos et al., Science 255：306-12, 1992；Smith et al., J. Mol.Biol.224：899-904, 1992；Wlodaver et al., FEBS Lett.309：59-64, 1992。必須胺基酸的同一性亦可由與本發明之多肽的相關組分(例如轉位或蛋白酶組分)的同源性分析來推斷。
可使用已知的誘變與篩選方法而進行及測試多個胺基酸取代，如彼等Reidhaar-Olson and Sauer(Science 241：53-7, 1988)或Bowie and Sauer(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：2152-6, 1989)。簡而言之，此等作者揭示用於在多肽中同時隨機化二或多個位置，選擇功能性多肽，然後定序誘變的多肽以確定每個位置允許取代的幅度之方法。可使用的其它方法包括噬菌體展示(phage display)(例如，Lowman et al., Biochem.30：10832-7, 1991；Ladner et al., U.S.專利號No. 5,223,409；Huse, WIPO 公開案WO 92/06204)及區域定向誘變(region-directed mutagenesis)(Derbyshire et al., Gene 46：145, 1986；Ner et al., DNA 7：127, 1988)。
除非另有定義，否則本文中使用的所有技術和科學術語具有如被本揭示所屬技術領域中具有通常知識者通常所理解的相同含義。Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 20 ED., John Wiley and Sons, New York(1994)，及Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY(1991)為所屬技術領域中具通常知識者提供本揭示中使用的許多術語的一般詞典。
此揭示並不受限於本文所揭示的例示方法及材料，且與本文描述的彼等方法或材料相似或等同的任何方法和材料皆可用於本揭示之具體實施例的實施或試驗中。數字範圍包括定義範圍的數字。除非另有說明，否則分別為任何核酸序列均以5'至3'方向從左至右書寫；胺基酸序列以胺基至羧基的方向從左至右書寫。
本文所提供的標題並非此揭示之各種態樣或具體實施例的限制。
胺基酸在本文中使用胺基酸的名稱、三字母縮寫或單字母縮寫來指稱。本文所使用之術語「蛋白質」包括蛋白質、多肽及肽。本文所使用之術語「胺基酸序列」與術語「多肽」及/或術語「蛋白質」同義。在一些情況下，術語「胺基酸序列」與術語「肽」同義。在一些情況下，術語「胺基酸序列」與術語「酶」同義。術語「蛋白質」和「多肽」在本文可互換使用。在本揭示及申請專利範圍中，可使用用於胺基酸殘基的習知一字母及三字母代碼。胺基酸的三字母代碼，係與IUPACIUB 聯合生化命名委員會(Joint Commission on Biochemical Nomenclature，JCBN)一致地定義。亦應理解的是，由於遺傳密碼的簡併性，多肽可藉由多於一個的核苷酸序列所編碼。
術語之其它定義可能於整個說明書中出現。在更詳細地描述示例性具體實施例之前，應理解本揭示不限於所描述的特定具體實施例，並且因此可變化。亦應理解，本文所使用的術語僅用於描述特定具體實施例的目的，而無意於限制本發明，由於本揭示內容的範圍僅由所附申請專利範圍限定。
在提供一數值範圍時，應當理解，除非上下文另有明確指明，否則在該範圍的上限及下限之間的每個居中值(intervening value)至下限單位的十分之一亦被具體揭示。在本揭示內容中包含「在所述範圍內的任何所述值或中間值」與「所述範圍內的任何其它所述或中間值」之間的每個較小範圍。此等較小範圍的上限及下限可獨立地在該範圍內被包括或排除，且於較小範圍內包含此限值中的任一個、兩個皆不包含或兩個皆包含之每個範圍亦被包括於本揭示內容中，受到於所述範圍內任何明確排除的限制。當於所述範圍包括此限值的一或兩個時，排除彼等所包含的限值之一或兩個的範圍亦包括於本揭示內容。
必須注意於本文及所附申請專利範圍中使用時，單數形式「一」、「一種」、及「該」包括複數的指涉對象，除非上下文另有明確規定。如此，例如，提及「一種肉毒桿菌神經毒素A」包括多種的此種候選藥劑，且提及「該肉毒桿菌神經毒素A」包括提及所屬技術領域中具有通常知識者已知的一或多種梭狀芽孢桿菌神經毒素及其等效物等。
本文中討論的出版物僅提供用於彼等在本申請案之申請日之前的揭示。本文中的任何內容均不應解釋為承認此類出版物構成所附之申請專利範圍的先前技術。
現僅藉由例示的方式，參考下列圖式及實施例描述本發明之具體實施例。
序列表於下列SEQ ID NO之任一者中指示初始Met胺基酸殘基或對應的初始密碼子時，該殘基/密碼子為任選的。 實施例
實施例 1 選殖、表現及純化
核苷酸序列SEQ ID NO：1，其編碼野生型BoNT/A(SEQ ID NO：2)被突變以導入下列取代以形成下表1所示的四個構築體：
構築體 突變 核苷酸序列 多肽序列
Cat-A N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K、N886K 3 4
Cat-B N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K、N954K 5 6
Cat-C N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K、N1025K 7 8
Cat-D* N1188R、D1213R、G1215R、N1216R、N1242R、N1243R、S1274R、T1277R 9 10
表1.構築體 *Cat-D的計算pI為7.45，分子量為149,859。
合成編碼上述經修飾的BoNT/A分子的DNA構築體，將其選殖到pJ401表現載體中，然後轉形至BL21(DE3)大腸桿菌中。此允許於BL21(DE3)大腸桿菌中重組Cat-A、Cat-B、Cat-C和Cat-D蛋白的可溶性過表現。
使用經典層析技術自大腸桿菌裂解物中純化重組經修飾的BoNT。採用使用陽離子交換樹脂的初始純化步驟，然後使用疏水相互作用樹脂的中間純化步驟。然後藉由蛋白水解切割重組的經修飾的BoNT單鏈，得到活化的雙鏈經修飾的BoNT。然後採用最後的純化步驟以去除殘留的污染物。適當的技術被教示於WO2015/166242、WO2017055274A1、EP2524963B1、EP2677029B1、及US10087432B2。
實施例 2 經純化之經修飾 BoNT/A 之示性
上列實施例1中所述的經修飾BoNTs實驗性地示性如下。
對pI的測量顯示經修飾的BoNT的等電點大於未經修飾的(天然)BoNT/A1的等電點-參見下圖3及表2。
BoNT/A1 分子 pI ( 計算的 ) pI ( 觀察的 )
經修飾的，“Cat-A” [Cat5v2(K1064H/N886K](SEQ ID NO：4) 6.9 ~8.0
經修飾的，“Cat-B” [Cat5v2(K1064/N954K)](SEQ ID NO：6) 6.9 ~8.0
經修飾的，“Cat-C” [Cat5v2(K1064H/N1025K)] (SEQ ID NO：8) 6.9 7.8-8.0
天然BoNT/A1 [rBoNT/A1](SEQ ID NO：2) 6.05 ~7.4
表2.經修飾的BoNT/A pI值。
使用大鼠胚胎脊髓神經元(eSCN)評估經修飾的BoNT進入神經元並切割SNAP-25(BoNT/A1的靶標)的能力。圖4顯示經修飾BoNTs保留與天然BoNT/A1相同的進入神經元並切割SNAP-25的能力。
經修飾的BoNTs的效力進一步藉由小鼠膈神經半橫膈測定法(mPNHD)進行評估。圖5顯示經修飾BoNTs保持與天然BoNT/A1相同的抑制小鼠半橫膈收縮的能力。
使用活體內小鼠趾外展評分(DAS)分析來評估相對於天然BoNT/A1的效力和安全性。與天然BoNT/A1相比，兩分子(Cat-A [SEQ ID NO：4]及Cat-B [SEQ ID NO：6])顯示出更高的安全比，且略更有效力。此等數據呈示於下表3中：
分子 DAS ED 50 (pg/ 小鼠 ) 劑量 DAS 4 (pg/ 小鼠 ) 對於 -10% ΔBW 之劑量 (pg/ 小鼠 ) 安全比
天然BoNT/A1(n=5) (SEQ ID NO：2) 2 10-20 9.9-14.5 7
經修飾的，“Cat-A” (SEQ ID NO：4) 1.16 10-20 27.4 24
經修飾的，“Cat-B” (SEQ ID NO：6) 1.79 25 47.6 27
表3.DAS分析及安全比。 -     DAS ED 50：計算的誘導DAS 2之劑量 -     劑量DAS 4：誘導DAS 4之實驗劑量 -     BW：體重 -     對於-10% ∆BW之劑量：計算的誘導BW與D0時的BW相比降低10%之劑量 -     安全比：對於-10% ∆BW之劑量/DAS ED 50
安全比係BoNT治療的不利效應(體重減輕)相對於效力(半數最大趾外展評分(DAS))的量度。其被計算成-10%體重(BW)與DAS ED 50之比率，其中-10%BW係指體重減少10%所需的BoNT量(pg/動物)，而ED 50係指將會產生DAS為2的BoNT量(pg/動物)。
DAS分析藉由將20μl之調製於明膠磷酸緩衝液中之經修飾的BoNT/A注射至小鼠腓腸肌/比目魚肌複合體中，隨後進行如先前Aoki報告的趾外展評分的評估(Aoki KR, Toxicon 39：1815-1820；2001)。
實施例 3 BoNT/AB 嵌合體的選殖、表現及純化
使用標準分子生物學技術，由編碼親本血清型分子的DNA及適合的寡核苷酸構築BoNT/AB嵌合體構築體1、2、3A、3B、及3C(分別為SEQ ID NO：11至15)。然後將其選殖至帶有或不帶有C端His 10-標籤的pJ401表現載體中，並轉形至BLR(DE3)大腸桿菌細胞中進行過度表現。此等細胞在2L帶擋板的錐形燒瓶中於37°C及225RPM震盪下生長，錐形燒瓶中裝有1L改良Terrific培養液(mTB)，並添加適當的抗生素。一旦A 600達到＞0.5，將培養箱溫度降至16°C，然後在以1mM IPTG誘導1小時後以225 RPM震盪20h，以表現重組BoNT/AB構築體。
藉由超音波裂解收穫的細胞，並於4°C下以4500 RPM離心1h進行澄清。然後在硫酸銨中提取重組的BoNT/AB嵌合分子，並通過標準快速蛋白質液相層析(FPLC)技術進行純化。此涉及使用疏水性相互作用樹脂進行捕獲，並使用陰離子交換樹脂進行中間純化步驟。然後以內蛋白酶Lys-C蛋白水解部分經純化的分子以產生活性二鏈。將其以第二種疏水相互作用樹脂進一步純化以獲得最終的BoNT/AB嵌合體。
對於具有十組胺酸標籤(H 10)(嵌合體1、2、3A)的BoNT/AB嵌合分子，捕獲步驟採用固定化鎳樹脂代替疏水性相互作用樹脂。
於表4呈示每種嵌合體的序列。
分子 SEQ ID NO 序列
嵌合體1 11 A1：1-871 + B1：858-1291(E1191M/S1199Y)+ His 10-標籤
嵌合體2 12 A1：1-874 + ELGGGGSEL + B1：858-1291(E1191M/S1199Y)+ His 10-標籤
嵌合體3A 13 A1：1-872 + B1：860-1291(E1191M/S1199Y)+ His 10-標籤
嵌合體3B 14 A1：1-872 + B1：860-1291(E1191M/S1199Y)
嵌合體3C 15 A1：1-872 + B1：860-1291
表4–嵌合BoNT/AB構築體
實施例 4 BoNT/AB 嵌合體 1 、 2 及 3A 之比較
具有C末端His 10標籤及E1191M/S1199Y雙重突變的BoNT/AB嵌合體1、2和3A如實施例3(圖6)中所述進行純化，並測試其功能活性。
[大鼠脊髓所神經元SNAP-25切割分析] 製備大鼠脊髓神經元(SCN)的初代培養物，並於96孔組織培養盤中培養3週(如下描述：Masuyer et al., 2011, J. Struct.Biol.Structure and activity of a functional derivative of Clostridium botulinum neurotoxin B；及描述於：Chaddock et al., 2002, Protein Expr.Purif.Expression and purification of catalytically active, non-toxic endopeptidase derivatives of Clostridium botulinum toxin type A)。在SCN營養培養基(feeding medium)中製備BoNT/AB的系列稀釋液。收集並過濾來自待處理孔的生長培養基(0.2 µm過濾器)。將125µL過濾後的培養基加回到每個測試孔中。然後將125μL稀釋的毒素添加到盤中(一式三份)。將經處理細胞於37°C培育，10% CO 2，24±1h)。
[使用SNAP-25切割分析法分析BoNT活性] 處理後，除去BoNT，並在PBS(Gibco，UK)中將細胞洗滌一次。將細胞在補充有0.1 M二硫蘇糖醇(DTT)和250單位/mLbenzonase(Sigma)的1xNuPAGE裂解緩衝液(Life Technologies)中裂解。藉由SDS-PAGE分開溶胞產物蛋白質並轉移至硝基纖維素膜。以對SNAP-25有特異性的一次抗體(Sigma＃S9684)探測膜，該抗體識別未切割的SNAP-25以及被BoNT/A內肽酶切割的SNAP-25。所使用的二次抗體係結合HRP的抗兔IgG(Sigma＃A6154)。藉由增強的化學發光檢測條帶，並使用pXi6 Access(Synoptics，UK)成影。使用GeneTools軟體(Syngene，Cambridge，UK)確定條帶的強度，並計算在每種計算的BoNT濃度下切割的SNAP-25的百分比。將數據擬合為4-參數對數方程式，並使用GraphPad Prism版本6(GraphPad)計算pEC 50。
下表5提供大鼠SCN SNAP-25切割測定中針對嵌合體1、2及3A確定的pEC 50值。此等結果顯示三個BoNT/AB嵌合體保留進入大鼠脊髓神經元並切割其標的基質的能力。然而，於此分析中，嵌合體3A比嵌合體1及2更強效(亦參見圖7)。
pEC 50±SEM
嵌合體1 12.42 ±0.04
嵌合體2 12.57 ±0.01
嵌合體3A 12.89 ±0.04
表5.pEC 50值。
[趾外展評分(DAS)分析] 在DAS分析中測量BoNT/AB嵌合體1、2和3A活性的方法係基於當小鼠短暫地以尾巴懸掛時小鼠腳趾擴散反射(toe spreading reflex)的驚嚇反應。此反射被記分為趾外展評分(DAS)，且在將BoNT投予至後爪的腓腸-比目魚肌中後被抑制。小鼠以尾巴被短暫地懸掛而誘發特徵性的驚嚇反應，其中動物伸展其後肢並外展其後趾。(Aoki et al.1999, Eur.J. Neurol.；6(suppl. 4) S3-S10)。
於注射日，將小鼠於接受3%異氟烷的氧氣的誘導室中麻醉。每隻小鼠在右後爪的腓腸-目魚肌中肌內注射BoNT/AB嵌合體或媒液(含0.2%明膠的磷酸鹽緩衝液)。
神經毒素注射後，趾外展變化程度以0至4的尺度計分，其中於趾外展及腿伸展中0=正常，且4=最大的減少。ED50係藉由使用每個劑量的最大作用平均值的非線性調整分析而確定。使用的數學模型為邏輯模型。
投劑後於第一日，每2小時進行一次DAS；此後每日進行3次，共4日。
圖8顯示嵌合體1、2及3A(分別為SEQ ID NO：11、12及13)之擬合曲線。嵌合體3A曲線向左位移，意味著與嵌合體1和2相比，較低劑量的嵌合體3A獲得了相似的DAS反應，因此顯示在小鼠DAS分析中，嵌合體3A比其它者更有效；亦參見下表(表6)，該表提供計算出的ED50值以及每種嵌合體導致DAS 4的劑量(最高分數)。
下表6提供小鼠DAS分析中對未經修飾的重組BoNT/A1(rBoNT/A1–SEQ ID NO：2)及嵌合體1、2和3A確定的ED 50及DAS 4劑量。此等結果顯示三種嵌合體中，嵌合體3A在誘導肌肉衰弱具有最高的活體內效力。圖8及表6中所示的研究係獲自Charles River實驗室的小鼠中進行。
ED 50(pg/小鼠) DAS 4劑量(pg/小鼠)
rBoNT/A1 1 5
嵌合體1 23 200
嵌合體2 89 ＞300
嵌合體3A 18 133
表6.ED 50值。
實施例 5 BoNT/AB 嵌合體 3B 、 3C 及未經修飾的 BoNT/A1 之比較分別具有及不具有E1191M/S1199Y雙重突變之未標籤的BoNT/AB嵌合體3B及3C(SEQ ID NO：14及15)如實施例3(圖9)中所述進行純化，並使用未經修飾的BoNT/A(SEQ ID NO：2)作為參考而進行功能活性測試。
[人類多潛能幹細胞SNAP-25切割分析] 冷凍保存的PERI.4 U細胞購自Axiogenesis(科隆，德國)。如製造商的建議進行解凍及平板培養。簡言之，將含有細胞的冷凍小管在37°C的水浴中解凍2分鐘。輕柔地再懸浮後，將細胞轉移至50 mL管中。用製造商提供的1 mLPeri.4U®解凍培養基洗滌冷凍管，然後將培養基逐滴轉移至細胞懸液中的50 mL管中，然後再添加2mL Peri.4U®解凍培養基逐滴滴入50 mL管中。然後使用血液細胞計數器計數細胞。之後在細胞懸液中加入另外的6mL Peri.4U®解凍培養基。在室溫下以260xg(例如1,100 RPM)離心6分鐘而獲得細胞沉澱物。然後將細胞再懸浮於製造商提供的complete Peri.4U®培養基中。將細胞以每平方厘米50,000至150,000個細胞的密度接種在塗有聚L-鳥胺酸及層連結蛋白(laminin)的細胞培養板上。將細胞在濕潤的CO 2環境中於37°C培養，且在培養過程中每2-3日徹底更換一次培養基。
對於毒素處理，在Peri.4U®培養基中製備BoNT的系列稀釋液。從待處理孔中收集培養基並過濾(0.2μm過濾器。將125 µL過濾後的培養基加回到每個測試孔中。然後將125μL稀釋的毒素添加到盤中(一式三份)。將經處理細胞於37°C培育，10% CO 2，48±1h)。
[使用SNAP-25切割分析法分析BoNT活性] 處理後，除去BoNT，並在PBS(Gibco，UK)中將細胞洗滌一次。將細胞在補充有0.1 M二硫蘇糖醇(DTT)和250單位/mLbenzonase(Sigma)的1x NuPAGE裂解緩衝液(Life Technologies)中裂解。藉由SDS-PAGE分開溶胞產物蛋白質並轉移至硝基纖維素膜。以對SNAP-25有特異性的一次抗體(Sigma#S9684)探測膜，該抗體識別未切割的SNAP-25以及被BoNT/A內肽酶切割的SNAP-25。所使用的二次抗體係結合HRP的抗兔IgG(Sigma＃A6154)。藉由增強的化學發光檢測條帶，並使用pXi6 Access(Synoptics，UK)成影。使用GeneTools軟體(Syngene，Cambridge，UK)確定條帶的強度，並計算在每種計算的BoNT濃度下切割的SNAP-25的百分比。將數據擬合為4-參數對數方程式，並使用GraphPad Prism版本6(GraphPad)計算pEC 50。
圖10顯示嵌合體3B和3C在誘導的人類多潛能幹細胞中裂解SNAP-25方面顯示出比rBoNT/A1更大的效力，而前者明顯更多。此可藉由雙重突變來解釋，該雙重突變增加嵌合體3B對此等細胞中存在的人類突觸結合蛋白II(synaptotagmin II)蛋白質受體的親和力(圖10、表7)。
pEC 50±SEM
rBoNT/A1 10.21 ±0.05
嵌合體3B 12.38 ±0.06
嵌合體3C 10.72 ±0.08
表7.pEC 50值。
[趾外展評分(DAS)分析–安全比] 在DAS分析中測量BoNTs活性的方法係基於當小鼠短暫地以尾巴懸掛時小鼠腳趾擴散反射的驚嚇反應。此反射被記分為趾外展評分(DAS)，且在將BoNT投予至後爪的腓腸-比目魚肌中後被抑制。小鼠以尾巴被短暫地懸掛而誘發特徵性的驚嚇反應，其中動物伸展其後肢並外展其後趾。(Aoki et al.1999, Eur.J. Neurol.; 6(suppl. 4) S3-S10)。
於注射日，將小鼠於接受3%異氟烷的氧氣的誘導室中麻醉。每隻小鼠在右後爪的腓腸-目魚肌中肌內注射BoNT或媒液(含0.2%明膠的磷酸鹽緩衝液)。
神經毒素注射後，趾外展變化程度以0至4的尺度計分，其中於趾外展及腿伸展中0=正常，且4=最大的減少。ED50係藉由使用每個劑量的最大作用平均值的非線性調整分析而確定。使用的數學模型為邏輯模型。
投劑後於第一日，每2小時進行一次DAS；此後對於所有劑量於4日每日進行3次。隨後監測注射媒劑及在注射的前四日內誘導的最低劑量的組的動物的DAS為4，直到肌肉無力完全恢復為DAS為0(未觀察到肌肉無力)。
為了計算安全比，在毒素注射(D0)前一日稱重所有動物，隨後在整個研究過程中每日稱重一次。每日計算每個劑量組的平均體重、其標準偏差及標準誤差平均值。為了獲得BoNT的安全比(-10%ΔBW/ED 50)，在研究期間任何時候，劑量組的平均重量低於相同劑量組D0時的平均重量的10%除以所研究的BoNT的ED 50。致死劑量定義為該劑量組中的一或多隻動物死亡的劑量。
圖11顯示針對未經修飾的BoNT/A、嵌合體3B和嵌合體3C(SEQ ID NO：2、14和15)的小鼠趾外展評分試驗中肌肉衰弱的持續時間，顯示嵌合體具有較長作用期間。
下表8提供小鼠DAS分析中針對rBoNT/A1和嵌合體3B和3C測定的ED 50和DAS 4劑量。該表亦提供了DAS 4劑量的總作用持續時間，直到肌肉無力完全恢復到DAS為0(未觀察到肌肉無力)為止。此外，該表顯示小鼠致死劑量和安全比(-10%ΔBW/ED 50)，如上文所述。與rBoNT/A1相比，嵌合體3B和3C具有更長的作用時間、更好的安全比、及更高的致死劑量。圖11及表8中所示的研究係於獲自Janvier實驗室的小鼠中進行。
ED 50(DAS 2)劑量 (pg/小鼠) DAS 4劑量 (pg/小鼠) 最低DAS 4劑量的總作用時間(日) 小鼠致死劑量(pg) 安全比 (-10%ΔBW/ED 50)
rBoNT/A1 0.9 2.3 29 18 4.5
嵌合體3B 8.0 89 42 200 14.1
嵌合體3C 5.0 26 42 8.9 7.4
表8.BoNT/AB嵌合體之DAS及安全比
實施例 6 經修飾的 BoNT/A(SEQ ID NO ： 4) 的臨床前測試將經修飾的BoNT/A“Cat-A”(SEQ ID NO：4)歷經另外的臨床前試驗。
材料 & 方法[大鼠趾外展評分(DAS)分析] 為了評估經修飾的BoNT/A(SEQ ID NO：4)對活體內肌肉活性的影響，使用大鼠DAS分析進行劑量反應研究。大鼠DAS分析是基於趾擴散反射，其為當短暫抓住動物時的特徵性驚嚇反應。向左腓骨肌肉複合物注射一次神經毒素後，肌肉無力導致趾外展減少。不同程度的趾外展評分基於5點分制評分：0=正常至4=趾外展及腿伸展中的最大減少(Broide RS, Rubino J, Nicholson GS, et al.The rat Digit Abduction Score(DAS) assay：A physiological model for assessing botulinum neurotoxin-induced skeletal muscle paralysis.Toxicon 2013；71：18-24)。在注射毒素後的前五日連續測量DAS值，此後每隔兩到三天測量一次，直到於較低劑量之經修飾的BoNT/A(SEQ ID NO：4)對趾擴散反射的作用完全消失，並直到於產生DAS4的劑量恢復到DAS2。暫時性BoNT誘導的體重增加之劑量依賴性效應被認為是普遍毒素效應的證據(Torii Y, Goto Y, Nakahira S, et al.Comparison of Systemic Toxicity between Botulinum Toxin Subtypes A1 and A2 in Mice and Rats.Basic Clin.Pharmacol.Toxicol.2015；116：524-528.)。在每個評估時間點特別稱重大鼠並記錄副作用。在注射之前和研究結束之前，將BoNT的劑量溶液掩蓋(指定為隨機字母)。將效力確定為誘導50%的效應所需的劑量(ED 50：導致DAS值為2的劑量)。為了確定ED 50和95%信賴區間(CIs)，測試2.5至750 pg/kg的劑量。亦投予1、1.5、2、2.4、3、4和5ng/kg之更高劑量，以評估可能的副作用。
為了評估修飾的BoNT/A(SEQ ID NO：4)的作用時間並將其與未經修飾的BoNT/A(SEQ ID NO：2)的作用時間進行比較，在兩項獨立的直接頭對頭(head-to-head)研究中，評估兩種毒素的最高耐受劑量(與未治療的大鼠相比，對體重演變沒有影響)評估了返回DAS2讀數2所需的中位時間。
[大鼠單劑研究] 大鼠以0、0.1、1和3 ng/kg的劑量單次肌內(i.m.)注射經修飾的BoNT/A(SEQ ID No：4)到右腓腸肌中。對照動物接受SEQ ID NO：4稀釋物於右腓腸肌中。在治療後7天(每組十隻雄性和十隻雌性)或在13或26週的觀察期後(每劑五隻雄性和五隻雌性)對動物實施安樂死。在第8日以及第13和27週進行預測試(第-1日)的Irwin測試觀察，以評估中樞神經系統的功能。評估的其它臨床(不良)體徵包括跛行、小毒素注入的肌肉大小和軟的腹脹。
[猴研究] 猴子在右側腓腸肌中分別接受了0、0.1、0.25和0.75 ng/kg經修飾的BoNT/A(SEQ ID NO：4)單次肌肉內劑量。在治療後7天(每組三隻雄性和三隻雌性)或在13或26週的觀察期後(每劑二隻雄性和二隻雌性)對動物實施安樂死。在第8及15日藉由外部遙測預測進行心血管檢查，包括血液動力學、心電圖及呼吸參數。
[妊娠大鼠中初步增強的EFD] 該研究的目的係提供在整個器官發生期間，經肌肉內途徑投予經修飾的BoNT/A(SEQ ID NO：4)對大鼠胚胎和胎兒發育的影響的初步資訊。9隻經交配的雌性Sprague-Dawley大鼠組，包括自第6(G6)至17(G17)日之妊娠，每日肌肉內注射(腓腸肌)而以0.02、0.05及0.1ng/kg/日之劑量水平投予經修飾的BoNT/A(SEQ ID NO：4)。於整個研究監測包括臨床情況、體重及食物消耗。對雌性進行G21剖腹產檢查並記錄產仔參數。屍檢時，對雌性動物進行肉眼檢查，稱量孕期子宮重量，對於彼等表現出少量注射腓腸肌的者，稱量該肌肉和對側肌肉。稱重所有胎兒。然後檢查胎兒的外部和內臟異常並進行性別檢查。將大約一半的胎兒的頭部固定以進行藉由連續切片的內部檢查。處理所有胎兒的去內臟屠體以進行骨骼檢查。
[妊娠兔的初步擴展的EFD] 該研究的目的係提供在整個器官發生期間，經肌肉內途徑投予經修飾的BoNT/A(SEQ ID NO：4)對兔胚胎和胎兒發育的影響的初步資訊。9隻經交配的雌性紐西蘭白兔組，包括自第6(G6)至19(G19)日之妊娠，每日肌肉內注射(腓腸肌)而以0.002、0.005及0.01ng/kg/日之劑量水平投予經修飾的BoNT/A(SEQ ID NO：4)。於整個研究監測包括臨床情況、體重及食物消耗。對雌性進行G29剖腹產檢查並記錄產仔參數。屍檢時，對雌性動物進行肉眼檢查，稱量孕期子宮重量，對於彼等表現出少量注射腓腸肌的者，稱量該肌肉和對側肌肉。稱重所有胎兒。然後檢查胎兒的外部和內臟異常並進行性別檢查。將大約一半的胎兒的頭部固定以進行藉由連續切片的內部檢查。
結果藉由進行如上所述的研究，對於投予經修飾的BoNT/A的許多不同物種，獲得下列藥理數據(如下表9所示)。
動物 研究類型 結果
小鼠 LD50 IP 0.422 ng/kg
大鼠 DAS ED50 0.013 ng/kg DAS4 0.125 pg/kg
CMAP單劑遠距離散布 0.002 ng/kg：無散布 0.3 ng/kg：-25% 0.8 ng/kg：-56%
單劑 估計的NOAEL 1.5 ng/kg 估計的致死的3 ng/kg
猴 單劑 估計的NOAEL 0.125 ng/kg 致死的0.375 ng/kg
大鼠(懷孕的雌性) pEFD 母體NOAEL和胎兒0.1 ng/kg/日
兔(懷孕的雌性) pEFD 母體NOAEL 0.005 ng/kg/日 胎兒NOEL 0.01 ng/kg/日
表9.臨床前結果
此外，在大鼠DAS分析中測試經修飾的BoNT/A(SEQ ID NO：4)，以確定與Dysport®相比作用的持續時間。結果列於下表10：
Dysport ®3 U/大鼠 15 U/kg 經修飾的BoNT/A 150 pg/大鼠 0.750 ng/kg
作用期間(中位日數) 21.9 46.4
表10.作用期間 此等數據顯示經修飾的BoNT/A的作用時間為Dysport®作用時間的兩倍以上。
實施例 7 用於治療肢體痙攣的經修飾 BoNT/A(SEQ ID NO ： 4) 之單位劑量的計算鑑於以上實施例6中獲得的臨床前藥理學數據，已經計算出用於在人類中投予經修飾的BoNT/A的合適的單位劑量範圍(UD)。此研究顯示與未經修飾的BoNT/A相比，經修飾的BoNT/A的作用時間更長，同時顯示出改進的安全性。此改善的安全性輪廓可藉由本文經修飾的BoNT/A所述的高安全比來表示。
由於經修飾的BoNT/A與Dysport®具有相同的作用機制(儘管由於其修飾的特性而提高了安全比)，所以相對於於相同肌肉群組中Dysport ®之經標籤的劑量，已定位治療痙攣性對象的最低劑量之經修飾的BoNT/A： ●     在趾外展評分大鼠模型中，經修飾的BoNT/A的ED 50為13 pg/kg，比相同的動物種類中估計的1500 pg/kg的未觀察到不良反應水平(NOAEL)低100倍以上。在同一大鼠模型中，Dysport®的ED 50為0.5 U/kg。基於此等動物數據，2.6ng之經修飾的BoNT/A劑量可估計為100 U Dysport®之劑量，此係於具上肢肢體痙攣之成人對象中治療痙攣性單指屈肌的標記範圍的最低限度。 ●     腹膜內小鼠LD 50建立在8.44pg。於此等條件下，0.84 ng之經修飾的BoNT/A的劑量，相當於100 U Dysport ®的劑量。
此計算出的最低劑量如此為500 pg(0.5 ng)。為了提供一些背景信息並使用上面的腹膜內小鼠LD 50數據，0.5 ng經修飾的BoNT/A大約等於60 U Dysport®，如此在肌肉內注射投予治療肢體痙攣時將為活性的。
在大鼠中1.5 ng/kg之經修飾的BoNT/A的估計NOAEL相當於60公斤體重的人的90ng劑量。在猴子中，測試的兩種非臨床物種中較為敏感的一種，估計的NOAEL為0.125 ng/kg之經修飾的BoNT/A，對應於體重60公斤的人為7.5ng劑量。
計算出的單位劑量上限如此為7,500 pg(7.5 ng)，由於其仍低於以人類劑量轉化的大鼠NOAEL。
如此，使用經修飾的BoNT/A治療肢體痙攣之適合的單位劑量於500-7500 pg已被計算。根據獲得的臨床前數據，此為59-889單位之經修飾的BoNT/A(亦對應59-889單位之Dysport ®)，根據確定的小鼠中經計算的中位數致死腹膜劑量(LD 50)，使用小鼠腹膜中位數致死劑量分析。
與實施例6的臨床前數據所確定的Dysport ®相比，考慮到改進的安全性輪廓，治療肢體痙攣的總劑量(單位)預計將比Dysport®幾乎高10x。Dysport®治療成人上肢和下肢痙攣的最大總劑量為1500單位(參見圖2)。
有利地，在達到最大劑量之前，可於肢體痙攣的治療中將經修飾的BoNT/A注射到更多的肌肉中。此為一個重要且有利的發現，其改善肢體痙攣的治療，同時為臨床醫生提供更大範圍的治療選擇。首次，它亦提供能夠治療其它大塊肌肉如彼等肩膀肌肉的選項，同時亦可在最大劑量範圍內良好地治療肘部、前臂及/或腕部。
實施例 8 治療成人上肢痙攣的劑量方案在2mL透明玻璃小瓶中以凍乾粉末形式提供經修飾的BoNT/A(例如SEQ ID NO：4)，每瓶中含15ng修飾的BoNT/A。將凍乾的粉末用無菌氯化鈉0.9%v/w不含防腐劑的溶液和賦形劑(僅包含上述經修飾的BoNT/A的配製緩衝液)的混合物復原。復原後，根據需要將溶液進一步稀釋。
單位劑量(UD)為500-7,500 pg(59-889單位)。 根據以下劑量方案，藉由肌肉注射治療成人上肢痙攣(表11)：
臨床模式 注射的肌肉 劑量 總計體積
握拳 屈指淺肌(FDS) 1xUD 1mL
屈指深肌(FDP) 1xUD 1mL
屈曲的腕 橈側屈腕肌(FCR) 1xUD 1mL
尺側屈腕肌(FCU) 1xUD 1mL
屈曲的肘 肱橈肌 1xUD 1mL
肱肌 2xUD 2mL
旋前圓肌 1xUD 1mL
肱二頭肌 2xUD 1x或2xUD 2mL 1-2mL
內收/旋轉肩 肱三頭肌(長頭) 2xUD 2mL
胸大肌 2xUD 2mL
肩胛下肌 2xUD 2mL
闊背肌 2xUD 2mL
表11.劑量方案。
投予的最大總劑量為15xUD。此相當於112,500 pg/13,335單位。此為成人上肢痙攣治療期間可投予的最大總劑量的Dysport®的10x以上，而沒有達到毒性極限(傳統治療方案需要考慮此毒性極限)。如此，臨床醫生能夠在不考慮毒性的情況下可投予15xUD的情況下為患者量身定制治療，而可治療對象的其它肌肉，包括肩膀，及/或確保每個肌肉皆接受醫藥上有效的劑量。
實施例 9 治療成人下肢痙攣的劑量方案在2mL透明玻璃小瓶中以凍乾粉末形式提供經修飾的BoNT/A(例如SEQ ID NO：4)，每瓶中含15ng修飾的BoNT/A。將凍乾的粉末用無菌氯化鈉0.9%v/w不含防腐劑的溶液和賦形劑(僅包含上述經修飾的BoNT/A的配製緩衝液)的混合物復原。復原後，根據需要將溶液進一步稀釋。
單位劑量(UD)為500-7,500 pg(59-889單位)。 根據以下劑量方案，藉由肌肉注射治療成人下肢痙攣(表12)：
注射的肌肉 劑量
腓腸肌(內側頭) 1xUD
腓腸肌(外側頭) 1xUD
比目魚肌 3xUD
脛骨後肌 2xUD
屈趾長肌 1xUD
屈足拇長肌 1x或2xUD
表12.劑量方案。
投予的最大總劑量為15xUD。此相當於112,500 pg/13,335單位。此幾乎大於成人上肢痙攣治療期間可投予的最大總劑量的Dysport®的10x，而沒有達到毒性極限(傳統治療方案需要考慮此毒性極限)。如此，臨床醫生能夠在不考慮毒性的情況下可投予15xUD的情況下為患者量身定制治療，而可治療對象的其它肌肉及/或確保每個肌肉皆接受醫藥上有效的劑量。
實施例 10 BoNT/AB 嵌合體的進一步表徵 (SEQ ID NO ： 14)在小鼠LD 50分析中測試BoNT/AB嵌合體SEQ ID NO：14，結果為1.202ng/kg。因此在該分析中1單位的SEQ ID NO：14對應於24.04pg。
另外，與Dysport ®相比，在大鼠DAS分析中測試該BoNT/AB嵌合體以確定作用的持續時間(如實施例6)。結果列於下表13：
Dysport ®3 U/大鼠 15 U/kg BoNT/AB 300 pg/大鼠 1.5 ng/kg
作用期間(中位日數) 21.9 47.7
表13.作用期間
總之，BoNT/AB的作用持續時間比Dysport®高得多，且類似於SEQ ID NO： 4。因此，預期SEQ ID NO：4的單位劑量及劑量方案可類似地應用於BoNT/AB，以提供對肢體痙攣的改善的治療。
實施例 11 用於治療肢體痙攣的經修飾 BoNT/A(SEQ ID NO ： 14) 之單位劑量的計算鑑於臨床前藥理學數據，已經計算出用於在人類中投予經修飾的BoNT/A的合適的單位劑量範圍(UD)。
計算出SEQ ID NO：14的DAS ED 50為13 pg/kg。ED 50被認為是最小的藥理活性劑量，其比相同動物物種中未觀察到不良反應水平(NOAEL)的4 ng/kg低約300倍。大鼠中SEQ ID NO：14的ED 50為13 pg/kg，相當於60公斤體重的人的0.8 ng劑量。
如此，選擇1000 pg之單位劑量的最低限值。選擇的單位劑量上限為16,000 pg，低於兩種非臨床安全性物種(大鼠和猴子)的NOAEL 4 ng/kg(轉換為60 kg體重的人劑量)。
鑑於改善的安全性輪廓，用於治療肢體痙攣的最大總劑量設定為240,000 pg，其係從轉換為60kg體重的人類劑量之兩種非臨床安全物種(大鼠和猴子)的4 ng/kg的NOAEL得出。
有利地，在達到最大劑量之前，於肢體痙攣的治療中經修飾的BoNT/A(SEQ ID NO：14)可被注入更多的肌肉中。此為一個重要且有利的發現，其改善肢體痙攣的治療，同時為臨床醫生提供更大範圍的治療選擇。首次，它亦提供能夠治療其它大塊肌肉如彼等肩膀肌肉的選項，同時亦可在最大劑量範圍內良好地治療肘部、前臂及/或腕部。
實施例 12 使用改良的 BoNT/A(SEQ ID NO ： 14) 治療成人上肢痙攣的劑量方案在小瓶中以凍乾粉末形式提供經修飾的BoNT/A，每瓶中含36 ng之修飾的BoNT/A。復原凍乾的粉末。
單位劑量(UD)為1000-16,000 pg(42-666單位[藉由小鼠LD 50測量])。
根據以下劑量方案，藉由肌肉注射治療成人上肢痙攣(表14)：
臨床模式 注射的肌肉 劑量 總計體積
握拳 屈指淺肌(FDS) 1xUD 1mL
屈指深肌(FDP) 1xUD 1mL
屈曲的腕 橈側屈腕肌(FCR) 1xUD 1mL
尺側屈腕肌(FCU) 1xUD 1mL
屈曲的肘 肱橈肌 1xUD 1mL
肱肌 2xUD 2mL
旋前圓肌 1xUD 1mL
肱二頭肌 2xUD 1x或2xUD 2mL 1-2mL
內收/旋轉肩 肱三頭肌(長頭) 2xUD 2mL
胸大肌 2xUD 2mL
肩胛下肌 2xUD 2mL
闊背肌 2xUD 2mL
表14.劑量方案。
投予的最大總劑量為15xUD。此相當於240,000 pg/9,990單位。如此，臨床醫生能夠在不考慮毒性的情況下可投予15xUD的情況下為患者量身定制治療，而可治療對象的其它肌肉，包括肩膀，及/或確保每個肌肉皆接受醫藥上有效的劑量。
實施例 13 使用改良的 BoNT/A 治療成人下肢痙攣的劑量方案 (SEQ ID NO ： 14)在小瓶中以凍乾粉末形式提供經修飾的BoNT/A，每瓶中含36 ng之修飾的BoNT/A。復原凍乾的粉末。
單位劑量(UD)為1000-16,000 pg(42-666單位)。
根據以下劑量方案，藉由肌肉注射治療成人下肢痙攣(表15)：
注射的肌肉 劑量
腓腸肌(內側頭) 1xUD
腓腸肌(外側頭) 1xUD
比目魚肌 3xUD
脛骨後肌 2xUD
屈趾長肌 1xUD
屈足拇長肌 1x或2xUD
表15.劑量方案。
投予的最大總劑量為15xUD。此相當於240,000 pg/9,990單位。如此，臨床醫生能夠在不考慮毒性的情況下可投予15xUD的情況下為患者量身定制治療，而可治療對象的其它肌肉及/或確保每個肌肉皆接受醫藥上有效的劑量。
於上述說明書中提及的所有出版物均藉由引用併入本文。在不脫離本發明的範疇及精神的情況下，本發明所描述方法及系統的各種修飾及變化對於所屬技術領域中具通常知識者將是顯而易見的。儘管已結合特定較佳具體實施例對本發明進行描述，但應當理解，所請發明不應過度限於此類特定具體實施例。實際上，對於生物化學和生物技術或相關技術領域中具有通常知識者而言顯而易見的是，所述用於實施本發明之模式的各種修飾皆在以下申請專利範圍的範疇內。
無
圖1顯示涉及上臂關節的五種最常見的上肢痙攣臨床模式。 圖2顯示FDA批准的用於治療成人痙攣的Dysport®的劑量。 圖3顯示陽離子構築體的等電聚焦(IEF)凝膠。 圖4顯示Cat5v2(K1064H/N954K)(A)、Cat5v2(K1064H/N886K)(B)及Cat5v2(K1064H/N1025K)(C)在大鼠胚胎脊髓神經元(eSCN)中的SNAP-25切割百分比，及相對於nBoNT/A1的pEC50的摘述。(A, B, C)將大鼠胚胎脊髓神經元培養三週，並以Cat5v4處理24小時，然後以SNAP-25特異性抗體進行西方印漬術(Western blotting)。數據係來自三個獨立實驗的平均值±SEM，一式三份。(D)於大鼠eSCN SNAP-25切割效力分析中Cat5v2(K1064H/N886K)、Cat5v2(K1064H/N954K)及Cat5v2(K1064H/N1025K)對nBoNT/A1(List Biological Laboratories)之相對效力。每個點對應一個單獨的批次，且係基於8點濃度響應曲線(CRC)進行的3次獨立pEC50測定的平均值。CRC中的每種濃度均一式三份進行評估。對列表批次的平均值進行效能比較，合併數據n = 24。數據為每Cat5v4 n = 3批的平均值±SEM。 圖5顯示nBoNT/A1和Cat5v4在小鼠膈神經半橫膈測定法(phrenic nerve hemi-diaphragm assay)(mPNHD)中的效力(t 50)。如文所示，將小鼠膈神經半橫膈膜組織與Cat5v4或天然BoNT/A1培育。記錄橫膈收縮力直到不再可檢測到收縮或直到140分鐘後。每個點對應於獨立的測定。t 50值係將小鼠半橫膈膜的收縮力抑制50%所需的時間。 圖6顯示經純化重組BoNT/AB嵌合體1、2及3A(分別為SEQ ID NO：11、12及13)之SDS-PAGE。泳道標誌為「標記」(分子量標記)、「-DTT」(氧化的BoNT/AB嵌合體樣品)及「+DTT」(還原的BoNT/AB嵌合體樣品)。 圖7顯示SNAP-25於大鼠脊髓神經元藉由重組BoNT/AB嵌合體1、2及3A(SEQ ID NO：11、12及13)之切割。將經培養的大鼠初代脊髓神經元(SCN)於含10% CO 2的37°C潮濕環境暴露於各種濃度的重組BoNT/AB嵌合體1、2或3A中24小時。然後以補充有DTT和Benzonase的1x NuPAGE緩衝液裂解細胞。將樣品轉移到微量離心管中，在加熱塊上於90°C加熱5分鐘，並在-20°C下保存，然後藉由西方墨點法分析SNAP-25切割。使用多株抗體檢測SNAP-25，該抗體檢測SNAP-25的全長及切割形式(Sigma #S9684)。使用抗兔HRP(Sigma #A6154)作為二次抗體。 圖8顯示小鼠趾外展評分分析。在短暫的全身麻醉下，小鼠被注射一後肢之腓腸肌-比目魚肌複合肌肉；使用趾外展評分(DAS)0-4分測量肌肉虛弱。確定每個劑量的DAS最大值並相對於劑量作圖，並將數據擬合到4參數對數方程中，確定ED50和導致DAS 4的劑量(DAS 4劑量)值。 圖9顯示經純化重組BoNT/AB嵌合體3B及3C(分別為SEQ ID NO：14及15)之SDS-PAGE。泳道標誌為「標記」(分子量標記)、「-DTT」(氧化的BoNT/AB嵌合體樣品)及「+DTT」(還原的BoNT/AB嵌合體樣品)。 圖10顯示於衍生自周圍神經元的人類經誘導的多潛能幹細胞(PERI.4U – Axiogenesis, Germany)中SNAP-25藉由未經修飾的BoNT/A及BoNT/AB嵌合體3B及3C(分別為SEQ ID NO：2、14及15)之切割。將PERI.4U細胞在37%的含有5%CO 2的潮濕CO 2環境中，於各種濃度的重組BoNT/A或BoNT/AB嵌合體3B或3C中暴露24小時。然後以補充有DTT和Benzonase的1x NuPAGE緩衝液裂解細胞。將樣品轉移到微量離心管中，在加熱塊上於90°C加熱5分鐘，並在-20°C下保存，然後藉由西方墨點法分析SNAP-25切割。使用多株抗體檢測SNAP-25，該抗體檢測SNAP-25的全長及切割形式(Sigma #S9684)。使用抗兔HRP(Sigma #A6154)作為二次抗體。 圖11顯示在小鼠趾外展評分分析中，隨著時間的推移，肌肉衰弱的持續時間。在短暫的全身麻醉下，小鼠被注射一後肢之腓腸肌-比目魚肌複合肌肉；使用趾外展評分(DAS)0-4分測量肌肉虛弱。監測在注射的首四日中誘導的最低劑量的該組動物的DAS為4，直到肌肉無力完全恢復到DAS為0(未觀察到肌肉無力)為止。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
Figure 12_A0101_SEQ_0009
Figure 12_A0101_SEQ_0010
Figure 12_A0101_SEQ_0011
Figure 12_A0101_SEQ_0012
Figure 12_A0101_SEQ_0013
Figure 12_A0101_SEQ_0014
Figure 12_A0101_SEQ_0015
Figure 12_A0101_SEQ_0016
Figure 12_A0101_SEQ_0017
Figure 12_A0101_SEQ_0018
Figure 12_A0101_SEQ_0019
Figure 12_A0101_SEQ_0020
Figure 12_A0101_SEQ_0021
Figure 12_A0101_SEQ_0022
Figure 12_A0101_SEQ_0023
Figure 12_A0101_SEQ_0024
Figure 12_A0101_SEQ_0025
Figure 12_A0101_SEQ_0026
Figure 12_A0101_SEQ_0027
Figure 12_A0101_SEQ_0028
Figure 12_A0101_SEQ_0029
Figure 12_A0101_SEQ_0030
Figure 12_A0101_SEQ_0031
Figure 12_A0101_SEQ_0032
Figure 12_A0101_SEQ_0033
Figure 12_A0101_SEQ_0034
Figure 12_A0101_SEQ_0035
Figure 12_A0101_SEQ_0036
Figure 12_A0101_SEQ_0037
Figure 12_A0101_SEQ_0038
Figure 12_A0101_SEQ_0039
Figure 12_A0101_SEQ_0040
Figure 12_A0101_SEQ_0041
Figure 12_A0101_SEQ_0042
Figure 12_A0101_SEQ_0043
Figure 12_A0101_SEQ_0044
Figure 12_A0101_SEQ_0045
Figure 12_A0101_SEQ_0046
Figure 12_A0101_SEQ_0047
Figure 12_A0101_SEQ_0048
Figure 12_A0101_SEQ_0049
Figure 12_A0101_SEQ_0050
Figure 12_A0101_SEQ_0051
Figure 12_A0101_SEQ_0052
Figure 12_A0101_SEQ_0053
Figure 12_A0101_SEQ_0054
Figure 12_A0101_SEQ_0055
Figure 12_A0101_SEQ_0056
Figure 12_A0101_SEQ_0057
Figure 12_A0101_SEQ_0058
Figure 12_A0101_SEQ_0059
Figure 12_A0101_SEQ_0060
Figure 12_A0101_SEQ_0061
Figure 12_A0101_SEQ_0062
Figure 12_A0101_SEQ_0063
Figure 12_A0101_SEQ_0064
Figure 12_A0101_SEQ_0065
Figure 12_A0101_SEQ_0066
Figure 12_A0101_SEQ_0067
Figure 12_A0101_SEQ_0068
Figure 12_A0101_SEQ_0069
Figure 12_A0101_SEQ_0070
Figure 12_A0101_SEQ_0071
Figure 12_A0101_SEQ_0072
Figure 12_A0101_SEQ_0073
Figure 12_A0101_SEQ_0074
Figure 12_A0101_SEQ_0075
Figure 12_A0101_SEQ_0076
Figure 12_A0101_SEQ_0077
Figure 12_A0101_SEQ_0078
Figure 12_A0101_SEQ_0079
無。

Claims (12)

  1. 一種經修飾的肉毒桿菌神經毒素A(BoNT/A)在製造用於治療肢體痙攣之藥劑的用途，其中藉由肌肉內注射至對象多數受影響的肌肉而投予該經修飾的BoNT/A， 其中藉由450 pg至8000 pg之單位劑量之經修飾的BoNT/A於多數受影響的肌肉投予該經修飾的BoNT/A， 其中多數受影響的肌肉選自： 二種以上的第一群組肌肉、 二種以上的第二群組肌肉、或 第一群組肌肉的至少一種肌肉及第一群組肌肉的至少一種肌肉； 其中該第一群組，包含：屈指淺肌(flexor digitorum superficialis)、屈指深肌(flexor digitorum profundus)、橈側屈腕肌(flexor carpi radialis)、尺側屈腕肌(flexor carpi ulnaris)、肱橈肌(brachioradialis)、旋前圓肌(pronator teres)、肱二頭肌(biceps brachii)、腓腸肌內側頭(gastrocnemius medial head)、腓腸肌外側頭(gastrocnemius lateral head)、屈趾長肌(flexor digitorum longus)、屈足拇長肌(flexor hallucis longus)、腓腸肌(gastrocnemius)、三角肌(deltoid)、提肩胛肌(levator scapulae)、旋前方肌(pronator quadratus)、屈拇長肌(flexor policis longus)、內收拇肌(adductor policis)、屈拇短肌(flexor policis brevis)、掌長肌(palmaris longus)、蚓狀肌(lumbricales)、拇對指肌(opponens policis)、內收大肌(adductor magnus)、內收長肌(adductor longus)、內收短肌(adductor brevis)、股薄肌(gracilis)、內側膕旁肌(medial hamstrings)、外側膕旁肌(lateral hamstrings)、闊筋膜張肌(tensor fascia lata)、股直肌(rectus femoris)、股外側肌(vastus lateralis)、股內側肌(vastus medialis)、股間肌(vastus intermedius)、臀大肌(gluteus maximus)、脛骨前肌(tibialis anterior)、屈趾短肌(flexor digitorum brevis)、伸足拇長肌(extensor hallucis longus)、及屈足拇短肌(flexor hallucis brevis)；及 其中該第二群組，包含：肱三頭肌(triceps brachii)、肩胛下肌(subscapularis)、胸肌(pectoralis)、闊背肌(latissimus dorsi)、肱二頭肌、肱肌(brachialis)、比目魚肌(soleus)、脛骨後肌(tibialis posterior)、肱橈肌、大圓肌(teres major)、髂腰肌(iliopsoas)、及腓腸肌；及 其中於受影響的第一群組肌肉投予單一單位劑量及/或於受影響的第二群組肌肉投予多個單位劑量，且其中於治療期間投予的總劑量至多120,000 pg，且 其中該經修飾的BoNT/A包含於選自下列的一或多個胺基酸殘基的修飾：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS 1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274、及THR 1277，其中該修飾選自： (i)   以鹼性胺基酸殘基取代酸性表面暴露的胺基酸殘基； (ii)  以未帶電胺基酸殘基取代酸性表面暴露的胺基酸殘基； (iii) 以鹼性胺基酸殘基取代未帶電的表面暴露的胺基酸殘基； (iv)  鹼性胺基酸殘基之插入；及 (v)   酸性表面暴露的胺基酸殘基之刪除。
  2. 如請求項1之用途， (a)   其中該單位劑量為450 pg至8,000 pg之經修飾的BoNT/A； (b)   其中該單位劑量為500 pg至7,500 pg之經修飾的BoNT/A； (c)   其中投予的總劑量為6,000 pg至120,000 pg； (d)   其中投予的總劑量為至多112,500 pg； (e)   其中投予的總劑量為7,500 pg至112,500 pg；及/或 (f)   其中投予的總劑量為40,000 pg至112,500 pg。
  3. 一種經修飾的肉毒桿菌神經毒素A(BoNT/A)在製造用於治療小兒肢體痙攣之藥劑的用途，其中藉由肌肉內注射至對象多數受影響的肌肉而投予該經修飾的BoNT/A， 其中藉由225 pg至4000 pg之單位劑量之經修飾的BoNT/A於多數受影響的肌肉投予該經修飾的BoNT/A， 其中多數受影響的肌肉選自： 二種以上的第一群組肌肉、 二種以上的第二群組肌肉、或 第一群組肌肉的至少一種肌肉及第一群組肌肉的至少一種肌肉； 其中該第一群組，包含：屈指淺肌、屈指深肌、橈側屈腕肌、尺側屈腕肌、肱橈肌、旋前圓肌、肱二頭肌、腓腸肌內側頭、腓腸肌外側頭、屈趾長肌、屈足拇長肌、腓腸肌、三角肌、提肩胛肌、旋前方肌、屈拇長肌、內收拇肌、屈拇短肌、掌長肌、蚓狀肌、拇對指肌、內收大肌、內收長肌、內收短肌、股薄肌、內側膕旁肌、外側膕旁肌、闊筋膜張肌、股直肌、股外側肌、股內側肌、股間肌、臀大肌、脛骨前肌、屈趾短肌、伸足拇長肌、及屈足拇短肌；及 其中該第二群組，包含：肱三頭肌、肩胛下肌、胸肌、闊背肌、肱二頭肌、肱肌、比目魚肌、脛骨後肌、肱橈肌、大圓肌、髂腰肌、及腓腸肌；及 其中於受影響的第一群組肌肉投予單一單位劑量及/或於受影響的第二群組肌肉投予多個單位劑量，且其中於治療期間投予的總劑量至多60,000 pg，且 其中該經修飾的BoNT/A包含於選自下列的一或多個胺基酸殘基的修飾：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS 1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274、及THR 1277，其中該修飾選自： (i)   以鹼性胺基酸殘基取代酸性表面暴露的胺基酸殘基； (ii)  以未帶電胺基酸殘基取代酸性表面暴露的胺基酸殘基； (iii) 以鹼性胺基酸殘基取代未帶電的表面暴露的胺基酸殘基； (iv)  鹼性胺基酸殘基之插入；及 (v)   酸性表面暴露的胺基酸殘基之刪除。
  4. 如請求項3之用途， (a)   其中該單位劑量為225 pg至4,000 pg之經修飾的BoNT/A； (b)   其中該單位劑量為250 pg至3,750 pg之經修飾的BoNT/A； (c)   其中投予的總劑量為3,000 pg至60,000 pg； (d)   其中投予的總劑量為至多56,250 pg； (e)   其中投予的總劑量為3,750 pg至56,250 pg； (f)   其中投予的總劑量為20,000 pg至56,250 pg； (g)   其中投予的單位劑量的總數為至多10x單位劑量； (h)   其中投予的總劑量為2,250 pg至40,000 pg；及/或 (i)   其中於治療期間投予的總劑量為40,000 pg。
  5. 如請求項1至4中任一項之用途， (a)   其中當與SEQ ID NO：2所示的未經修飾的BoNT/A相比，該修飾為一修飾，其中胺基酸殘基編號係藉由與SEQ ID NO：2比對而確定； (b)   其中該肱三頭肌為肱三頭肌的長頭及/或該胸肌為胸大肌； (c)   其中該經修飾的BoNT/A為雙鏈經修飾的BoNT/A，其中輕鏈及重鏈藉由雙硫鍵連結在一起，且其中該雙鏈經修飾的BoNT/A可藉由一方法而獲得，該方法包含： 提供單鏈經修飾的BoNT/A，該單鏈經修飾的BoNT/A包含與SEQ ID NOs：4、6、8、或10具有至少90%序列同一性的多肽序列、或由與SEQ ID NOs：3、5、7、或9具有至少90%序列同一性的核酸序列所編碼，且 將該單鏈經修飾的BoNT/A與蛋白酶接觸，該蛋白酶於位於輕鏈與重鏈之間的切割位切割多肽， 因而將該單鏈經修飾的BoNT/A轉化為該雙鏈經修飾的BoNT/A； (d)   其中該經修飾的BoNT/A具有大於7之安全比，其中該安全比被計算為：以pg/小鼠測量的-10%體重變化所需的毒素劑量除以以pg/小鼠測量的DAS ED 50，其中ED 50=產生DAS分數2所需的劑量；及/或 (e)   其中該肢體痙攣為上肢痙攣。
  6. 如請求項1至4中任一項之用途， (a)   其中該修飾為以離胺酸或精胺酸取代；及/或 (b)   其中藉由每注射部位之單位劑量投予該經修飾的BoNT/A至多數受影響的肌肉，其中於受影響的第一群組肌肉之選擇的注射部位投予單一單位劑量及/或於受影響的第二群組肌肉之選擇的不同注射部位投予多個單位劑量。
  7. 如請求項1至4中任一項之用途， (a)   其中該經修飾的BoNT/A藉由每個注射部位少於一單位劑量的方式投予；及/或 (b)   其中於受影響的第一群組肌肉之多數注射部位投予單一單位劑量及/或於受影響的第二群組肌肉之多數注射部位投予多個單位劑量。
  8. 一種經修飾的肉毒桿菌神經毒素A(BoNT/A)之單位劑型，該單位劑型包含： (a)   450 pg至8,000 pg或225 pg至4,000 pg之經修飾的BoNT/A； 其中該經修飾的BoNT/A包含於選自下列一或多個胺基酸殘基的修飾：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS 1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274、及THR 1277，其中該修飾選自： (i)   以鹼性胺基酸殘基取代酸性表面暴露的胺基酸殘基； (ii)  以未帶電胺基酸殘基取代酸性表面暴露的胺基酸殘基； (iii) 以鹼性胺基酸殘基取代未帶電的表面暴露的胺基酸殘基； (iv)  鹼性胺基酸殘基之插入；及 (v)   酸性表面暴露的胺基酸殘基之刪除。
  9. 如請求項8之單位劑型，該單位劑型進一步包含： (b)   醫藥上可接受的載劑、賦形劑、佐劑、及/或鹽。
  10. 一種套組，其包含： (a)   如請求項8之單位劑型；及 (b)   使用該單位劑型於治療肢體痙攣的說明書。
  11. 如請求項10之套組，其進一步包含： (c)   稀釋劑。
  12. 一種如請求項8之單位劑型在製造用於治療肢體痙攣之藥劑的用途。
TW112137672A 2020-03-16 2021-03-16 肢體痙攣之治療 TW202426039A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB2003803.0 2020-03-16
GBGB2003867.5 2020-03-17

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW202426039A true TW202426039A (zh) 2024-07-01

Family

ID=

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI825396B (zh) 肢體痙攣之治療
JP7360802B2 (ja) 陽イオン性神経毒
US20230346674A1 (en) Treatment of Upper Facial Lines
KR20240067100A (ko) 대상체의 안검 근육에 이환된 장애의 치료에 사용하기 위한 변형된 bont/a
KR20240067070A (ko) 경부 이상긴장증의 치료에 사용하기 위한 변형된 bont/a
TWI817872B (zh) 神經障礙之治療
TW202426039A (zh) 肢體痙攣之治療
JP2024534384A (ja) 頸部ジストニアを治療する用途の修飾ＢｏＮＴ／Ａ
JP2024534541A (ja) 被験体の眼瞼筋を冒す障害の治療における使用のための改変ＢｏＮＴ／Ａ
WO2023209385A1 (en) Treatment of limb spasticity
CN117979988A (zh) 用于治疗影响受试者眼睑肌肉的疾病的修饰的BoNT/A
CN118450899A (zh) 修饰的BoNT/A用于颈肌张力障碍的治疗
US20240082368A1 (en) Treatment of Brain Damage
WO2023209327A1 (en) Bont/a for use in treating a facial dystonia
WO2023209403A1 (en) Treatment of upper facial lines
WO2023209326A1 (en) Treatment of cervical dystonia
AU2022390672A1 (en) Treatment of visceral pain
WO2023089338A1 (en) Treatment of visceral pain
JP2022502446A (ja) ボツリヌス神経毒血清型ｅの治療的及び美容的使用