CN118450899A - 修饰的BoNT/A用于颈肌张力障碍的治疗 - Google Patents

修饰的BoNT/A用于颈肌张力障碍的治疗 Download PDF

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CN118450899A CN202280076093.9A CN202280076093A CN118450899A CN 118450899 A CN118450899 A CN 118450899A CN 202280076093 A CN202280076093 A CN 202280076093A CN 118450899 A CN118450899 A CN 118450899A
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Abstract

本发明涉及使用修饰的BoNT/A治疗颈肌张力障碍，包括修饰的肉毒杆菌神经毒素A(BoNT/A)用于治疗颈肌张力障碍，其中修饰的BoNT/A通过肌内注射施用至受试者受影响的颈部肌肉，其中修饰的BoNT/A以单位剂量750pg至17,000pg的修饰的BoNT/A的方式进行施用，其中将至少单个单位剂量施用至受影响的颈部肌肉，其中在治疗期间施用的总剂量至多170,000pg修饰的BoNT/A，并且其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域，以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。还提供了相关的方法、用途、单位剂型和试剂盒。

Description

修饰的BoNT/A用于颈肌张力障碍的治疗
技术领域
本发明涉及颈肌张力障碍的治疗。
背景技术
颈肌张力障碍(也称为痉挛性斜颈)是一种慢性神经运动障碍，通常与极度疼痛相关。该疾患导致受影响受试者的颈部不自主地向左、向右、向上和/或向下转动。在肌张力障碍运动期间，主动肌和拮抗肌可能同时收缩。
这种疾患通常表现出相对轻微的症状，例如发病时持续几个月的非视觉可见的头部震颤。其他早期/进行性症状可包括突然运动的头部转动、拉动和/或倾斜。然而，进一步早期/进行性症状通常包括持续/长时间的不自主头部定位。在达到平台期之前，不自主的颈部肌肉痉挛的频率和强度倾向于随着时间的推移而增加。患有颈肌张力障碍的受试者还可能经历肌肉肥大、颈部疼痛、构音障碍和/或震颤。
颈肌张力障碍的症状可能涉及受试者的任何颈部肌肉，并且头部姿势可能会不同。通常，与颈肌张力障碍相关的最常见的异常姿势是下巴向肩膀方向扭转，导致头部向侧面旋转(斜颈)。与颈肌张力障碍相关的其他异常姿势可包括屈颈(anterocollis)(头部向前倾斜)、伸颈(retrocollis)(头部向后倾斜)或侧颈(laterocollis)(头部向一侧倾斜)。也可能发生头部在肩膀上的前矢状移位(向前移位)或后矢状移位(向后移位)。然而，最常见的是，颈肌张力障碍呈现出复杂的症状，其中受试者表现出多个角度的头部运动。
目前的治疗选择包括口服药物(例如多巴胺阻滞剂)、深部脑刺激、肉毒杆菌神经毒素和选择性去神经手术，去除触发肌肉收缩的神经。传统的口服药物与许多严重的副作用相关，而深部脑刺激和去神经手术是侵入性的，具有相关并发症的风险，和/或可能无效。
是治疗颈肌张力障碍的传统血清型A型肉毒杆菌神经毒素(BoNT/A)的一个示例，它是含有从A型肉毒杆菌(Clostridium botulinum)中分离和纯化的药物物质BoNT/A血凝素复合物(BTX-A-HAC)的医药产品。市场上还有其他几种由肉毒杆菌(Clostridium botulinum)天然产生的医药BoNT/A产品(例如和)。
通过麻痹肌张力障碍的拮抗肌，BoNT/A可以允许主动肌自由活动。更详细地说，BoNT/A选择性抑制突触前神经末梢释放乙酰胆碱，从而阻断神经肌肉接头处的胆碱能传递，从而诱导肌肉收缩和肌张力的降低，导致注射肌肉的放松。然而，目前可获得的BoNT/A产品的作用持续时间约为12至14周，此时新的神经末梢萌芽，使神经功能恢复正常，原有症状重新出现。因此，为了保持效果，需要定期重复注射。因此，考虑到病症的慢性特征和需要长期治疗的特性，BoNT/A注射的频率是治疗颈肌张力障碍的一个重要考虑因素。事实上，这会影响对患者和护理人员涉及的直接和间接健康成本、医院/诊所内注射的组织工作、以及最重要的是影响患者的生活质量。
被批准用于治疗颈肌张力障碍，每个治疗疗程的最大总剂量为1,000单位(见图1)。临床医生需要向受试者的颈部肌肉施用每个治疗疗程的总剂量上限为1,000单位。临床医生在治疗患者期间被迫做出艰难的选择。换句话说，在常规治疗方案中，临床医生必须在多种不同肌肉处找到可施用的相对较低的BoNT/A总量(1,000单位-BoNT/A的高毒性性质所必需)和有效量之间的平衡。因此，某些肌肉被忽视，而其他肌肉则接受次优量的BoNT/A，从而导致次优治疗。
此外，传统的颈肌张力障碍治疗方案很复杂，导致临床医生给药剂量不足，以尽量避免对患者的毒性。因此，需要一种方便、安全和有效的在治疗疗程中可以向受影响的颈部肌肉施用的单剂量单位以及对单位数量的相应指南(例如，包括每块肌肉的注射部位的数量)，而不会由此产生患者毒性。
总之，需要改进的颈肌张力障碍的治疗，允许采用以患者为中心的个体化方法，根据目标临床模式定制治疗，允许根据颈肌张力障碍的分布、范围和严重程度对受影响的颈部肌肉的不同组合进行注射，同时避免毒性并提供更持久的治疗(导致施用频率降低)。
本发明克服了一个或多个上述问题。
发明内容
本发明人惊奇地发现修饰的BoNT/A在治疗颈肌张力障碍中特别有用。修饰的BoNT/A可以包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)，这导致修饰的BoNT/A表现出在施用部位的滞留增加(减少从施用部位的扩散)和/或作用持续时间增加(例如6-9个月)。或者，修饰的BoNT/A可包含表面暴露的氨基酸残基的一个或多个修饰，导致净正电荷增加。增加的电荷促进多肽与阴离子细胞外成分之间的静电相互作用，从而促进多肽与细胞表面之间的结合。反过来，这也增加了在施用部位的滞留(减少从施用部位的扩散)和/或导致作用持续时间增加(例如6-9个月)。
有利地，与未修饰的BoNT/A(例如)相比，修饰的BoNT/A具有改进的安全性。这种改进的安全性可以通过本文所述的修饰的BoNT/A的高安全性比来表达。
基于本文的临床前和临床数据(参见实施例)，已经显示可以向受试者施用更高总量的修饰的BoNT/A，同时实现与未修饰的BoNT/A(例如)类似的安全性，尽管在如此高的剂量下。因此，在治疗颈肌张力障碍中，在达到最大总剂量之前，可以注射更多修饰的BoNT/A和/或可以在更多数量的颈部肌肉/部位处注射。这是一个重要且有利的发现，提供了改进的颈肌张力障碍治疗，同时为临床医生提供了更广泛的治疗选择。治疗可以得到改进，是因为与用未修饰的BoNT/A(例如)治疗相比，它提供了更持久的治疗(导致施用频率减少)和/或能够针对受试者进行定制和/或导致受试者的生活质量改善。因此，与常规治疗方案相比，本发明的治疗得到改进。
此外，本发明提供了方便、安全且有效的可在单次治疗中安全施用的单个单位剂量以及总(最大)剂量。本发明还提供了对可以向颈部肌肉施用所述单位剂量的次数的相应指南(例如，包括每块肌肉的注射部位的数量)，而不导致患者毒性。因此，根据本发明的颈肌张力障碍的治疗对于临床医生而言简单得多并且有助于避免给药剂量不足和/或剂量过量。此外，与传统的颈肌张力障碍治疗相比，根据本发明的治疗对患者来说更加满意，因为它更好地根据患者的需要定制。
具体实施方式
一方面，本发明提供了用于治疗颈肌张力障碍的修饰的肉毒杆菌神经毒素A(BoNT/A)，其中修饰的BoNT/A通过肌内注射施用至受试者受影响的颈部肌肉，
其中修饰的BoNT/A通过单位剂量750pg至17,000pg的修饰BoNT/A的方式进行施用，
其中将至少单个单位剂量施用至受影响的颈部肌肉，
其中在治疗期间施用的总剂量高达170,000pg的修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域，以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
在相关方面，本发明提供了修饰的BoNT/A，其用于治疗受试者的颈肌张力障碍，其持续时间比用未修饰的BoNT/A(例如SEQ ID NO:2)治疗的持续时间更长，其中修饰的BoNT/A通过肌内注射施用至受试者受影响的颈部肌肉，
其中修饰的BoNT/A通过单位剂量750pg至17,000pg的修饰BoNT/A的方式进行施用，
其中将至少单个单位剂量施用至受影响的颈部肌肉，
其中在治疗期间施用的总剂量高达170,000pg的修饰的BoNT/A，
其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域，以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
术语“治疗受试者的颈肌张力障碍的持续时间比用未修饰的BoNT/A治疗的持续时间更长”可以指与施用未修饰的BoNT/A相比时，在施用本发明的修饰的BoNT/A后受试者的颈肌张力障碍的一种或多种症状减轻持续更长的时间。所述作用持续时间可以是至少1.25x、1.5x、1.75x、2.0x或2.25x。修饰的BoNT/A的作用持续时间可以在6至9个月之间。例如，作用持续时间可以至少是：4.5个月(从发生开始)、5.0个月、5.5个月、6个月、6.5个月、7.0个月、7.5个月、8.0个月、8.5个月或9.0个月。在具体实施方案中，作用持续时间可以大于9.0个月。所述减轻可以通过与已经用未修饰的BoNT/A治疗的表现出相同症状的同等对照受试者进行比较来确定。在对照受试者的一种或多种症状的严重程度与未修饰的BoNT/A治疗之前基本上相同(例如相同)的时间段，用根据本发明的修饰的BoNT/A治疗的受试者可以表现出与用修饰的BoNT/A治疗之前的一种或多种症状的严重程度相比，一种或多种同等症状改善至少5％、10％、25％或50％。未修饰的BoNT/A优选是以双链形式存在的SEQ IDNO：2。
一方面，本发明提供了用于治疗颈肌张力障碍的方法，所述方法包括通过肌内注射向受试者受影响的颈部肌肉施用修饰的BoNT/A，
其中修饰的BoNT/A通过单位剂量750pg至17,000pg的修饰BoNT/A的方式进行施用，
其中将至少单个单位剂量施用至受影响的颈部肌肉，
其中在治疗期间施用的总剂量高达170,000pg的修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域，以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
在相关方面，本发明提供了用于治疗受试者的颈肌张力障碍的方法，其持续时间比用未修饰的BoNT/A(例如SEQ ID NO:2)治疗的持续时间更长，所述方法包括通过肌内注射向受试者受影响的颈部肌肉施用修饰的BoNT/A，
其中修饰的BoNT/A通过单位剂量750pg至17,000pg的修饰BoNT/A的方式进行施用，
其中将至少单个单位剂量施用至受影响的颈部肌肉，
其中在治疗期间施用的总剂量高达170,000pg的修饰的BoNT/A，
其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域，以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
一方面，本发明提供了修饰的肉毒杆菌神经毒素A(BoNT/A)在制备用于治疗颈肌张力障碍的药物中的用途，其中修饰的BoNT/A通过肌内注射施用至受试者受影响的颈部肌肉，
其中修饰的BoNT/A通过单位剂量750pg至17,000pg的修饰BoNT/A的方式进行施用，
其中将至少单个单位剂量施用至受影响的颈部肌肉，
其中在治疗期间施用的总剂量高达170,000pg的修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域，以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
在相关方面，本发明提供了修饰的BoNT/A在制备用于治疗受试者的颈肌张力障碍的药物中的用途，其持续时间比用未修饰的BoNT/A(例如SEQ ID NO:2)治疗的持续时间更长，其中修饰的BoNT/A通过肌内注射施用至受试者受影响的颈部肌肉，
其中修饰的BoNT/A通过单位剂量750pg至17,000pg的修饰BoNT/A的方式进行施用，
其中将至少单个单位剂量施用至受影响的颈部肌肉，
其中在治疗期间施用的总剂量高达170,000pg的修饰的BoNT/A，
其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域，以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
单位剂量可以是750pg至17,000pg的修饰的BoNT/A，其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域，以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。单位剂量范围的上限可以是16,500、15,500、14,500、13,500、12,500、11,500、10,500、9,500、8,500、7,500、6,500、5,500、4,500、3,500、2,500、2,250、2,000、1,500、1,250、1,000、750或500pg的修饰的BoNT/A，优选上限为16,000pg。单位剂量范围的下限可以是800、850、950、1,000、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、3,500、4,000、4,500或5,000pg的修饰的BoNT/A，优选下限是1,000pg。优选地，修饰的BoNT/A的单位剂量是1,000pg至16,000pg的修饰的BoNT/A，例如950pg至1,250pg、1,750pg至2,250pg、或8,000pg至12,000pg。优选地，修饰的BoNT/A的单位剂量可以是1,000、2,000、3,000、8,000或16,000pg。
当进行本发明的治疗方案时施用的总剂量可以是高达170,000pg的修饰的BoNT/A，其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域，以及BoNT/B受体结合域(HC结构域)。换句话说，在给定治疗疗程施用的修饰BoNT/A总量可以高达170,000pg。总剂量可以高达165,000、160,000、140,000、110,000、100,000、90,000、80,000、70,000、60,000、50,000、40,000、30,000、28,000、25,000、20,000、15,000、14,000、10,000、8,000、7,000或5,000pg。优选地，总剂量可以高达160,000pg修饰的BoNT/A，例如总剂量可以高达7,000、10,000、14,000、20,000、28,000、30,000、80,000或160,000pg。总剂量可以是至少900、1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、7,500、10,000、12,500、13,000、14,000、15,000、20,000、25,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、100,000、120,000或150,000pg。优选地，总剂量可以是至少1,500pg，更优选至少2,000pg修饰的BoNT/A，例如至少5,000pg。总剂量可以是5,250pg至170,000pg，优选7,000pg至160,000pg。例如，施用的总剂量可以是6,000-30,000pg，例如6,000-15,000pg或13,000-29,000pg。更优选地，施用的总剂量为10,000pg至160,000pg。优选地，施用的总剂量可以是7,000、10,000、14,000、20,000、28,000、30,000、80,000或160,000pg。
因此，单位剂量可以是750pg至17,000pg修饰的BoNT/A，其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域，以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)，当进行本发明的治疗方案时施用的总剂量可以高达170,000pg。单位剂量可以是1,000pg，总剂量可以高达7,000pg。单位剂量可以是1,000pg，总剂量可以高达10,000pg。单位剂量可以是1,000pg，总剂量可以高达14,000pg。单位剂量可以是2,000pg，总剂量可以高达14,000pg。单位剂量可以是2,000pg，总剂量可以高达20,000pg。单位剂量可以是2,000pg，总剂量可以高达28,000pg。单位剂量可以是3,000pg，总剂量可以高达30,000pg。单位剂量可以是8,000pg，总剂量可以高达80,000pg。单位剂量可以是16,000pg，总剂量可以高达160,000pg。
因此，单位剂量可以是750pg至17,000pg修饰的BoNT/A，其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域，以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)，当进行本发明的治疗方案时施用的总剂量可以高达170,000pg。单位剂量可以是1,000pg，总剂量可以是7,000pg。单位剂量可以是1,000pg，总剂量可以是10,000pg。单位剂量可以是1,000pg，总剂量可以是14,000pg。单位剂量可以是2,000pg，总剂量可以是14,000pg。单位剂量可以是2,000pg，总剂量可以是20,000pg。单位剂量可以是2,000pg，总剂量可以是28,000pg。单位剂量可以是3,000pg，总剂量可以是30,000pg。单位剂量可以是8,000pg，总剂量可以是80,000pg。单位剂量可以是16,000pg，总剂量可以是160,000pg。
一方面，本发明提供了用于治疗颈肌张力障碍的修饰的肉毒杆菌神经毒素A(BoNT/A)，其中修饰的BoNT/A通过肌内注射施用至受试者受影响的颈部肌肉，
其中修饰的BoNT/A通过31单位(U)至707U的修饰的BoNT/A的单位剂量的方式进行施用，其中1单位是对应于小鼠中计算的半数致死剂量(LD50)的修饰的BoNT/A的量，
其中向受影响的颈部肌肉施用至少单个单位剂量，
其中在治疗期间施用的总剂量高达7,070U的修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域，以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
在相关方面，本发明提供了修饰的BoNT/A，其用于治疗受试者的颈肌张力障碍，其持续时间比用未修饰的BoNT/A(例如SEQ ID NO:2)治疗的持续时间更长，其中修饰的BoNT/A通过肌内注射施用至受试者受影响的颈部肌肉，
其中修饰的BoNT/A通过31单位(U)至707U的修饰的BoNT/A的单位剂量的方式进行施用，其中1单位是对应于小鼠中计算的半数致死剂量(LD50)的修饰的BoNT/A的量，
其中向受影响的颈部肌肉施用至少单个单位剂量，
其中在治疗期间施用的总剂量高达7,070U的修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域，以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
一方面，本发明提供了用于治疗颈肌张力障碍的方法，所述方法包括通过肌内注射向受试者受影响的颈部肌肉施用修饰的BoNT/A，
其中修饰的BoNT/A通过31U至707U的修饰的BoNT/A的单位剂量的方式进行施用，其中1单位是对应于小鼠中计算的半数致死剂量(LD50)的修饰的BoNT/A的量，
其中向受影响的颈部肌肉施用至少单个单位剂量，
其中在治疗期间施用的总剂量高达7,070U的修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域，以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
在相关方面，本发明提供了用于治疗受试者的颈肌张力障碍的方法，其持续时间比用未修饰的BoNT/A(例如SEQ ID NO:2)治疗的持续时间更长，所述方法包括通过肌内注射向受试者受影响的颈部肌肉施用修饰的BoNT/A，
其中修饰的BoNT/A通过31U至707U的修饰的BoNT/A的单位剂量的方式进行施用，其中1单位是对应于小鼠中计算的半数致死剂量(LD50)的修饰的BoNT/A的量，
其中向受影响的颈部肌肉施用至少单个单位剂量，
其中在治疗期间施用的总剂量高达7,070U的修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域，以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
一方面，本发明提供了修饰的肉毒杆菌神经毒素A(BoNT/A)在制备用于治疗颈肌张力障碍的药物中的用途，其中修饰的BoNT/A通过肌内注射施用至受试者受影响的颈部肌肉，
其中修饰的BoNT/A通过31U至707U的修饰的BoNT/A的单位剂量的方式进行施用，其中1单位是对应于小鼠中计算的半数致死剂量(LD50)的修饰的BoNT/A的量，
其中向受影响的颈部肌肉施用至少单个单位剂量，
其中在治疗期间施用的总剂量高达7,070U的修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域，以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
在相关方面，本发明提供了修饰的BoNT/A在制备用于治疗受试者的颈肌张力障碍的药物中的用途，其持续时间比用未修饰的BoNT/A(例如SEQ ID NO:2)治疗的持续时间更长，其中修饰的BoNT/A通过肌内注射施用至受试者受影响的颈部肌肉，
其中修饰的BoNT/A通过31U至707U的修饰的BoNT/A的单位剂量的方式进行施用，其中1单位是对应于小鼠中计算的半数致死剂量(LD50)的修饰的BoNT/A的量，
其中向受影响的颈部肌肉施用至少单个单位剂量，
其中在治疗期间施用的总剂量高达7,070U的修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域，以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
单位剂量可以是31单位至707单位的修饰的BoNT/A，其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域，以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。单位剂量范围的上限可以是700、650、600、550、500、450、400、350、300、250、200、150、100、95、90、85、65、60、55、50或31单位的修饰BoNT/A，优选上限为666单位。单位剂量范围的下限可以是35、40、45、50、60、65、70、75、80、85、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650或700单位的修饰的BoNT/A，优选下限是42单位。优选地，修饰的BoNT/A的单位剂量是42单位至666单位的修饰的BoNT/A，例如40单位至50单位、70单位至95单位、或333单位至499单位。优选地，修饰的BoNT/A的单位剂量可以是41.6单位、83.2单位、124.8单位、332.8单位或665.6单位。
当进行本发明的治疗方案时施用的总剂量可以是高达7,070单位的修饰的BoNT/A，其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域，以及BoNT/B受体结合域(HC结构域)。换句话说，在给定治疗疗程施用的修饰BoNT/A总量可以高达7,070单位。总剂量可以高达7,000、6,000、5,000、4,000、3,500、3,350、3,000、2,000、1,500、1,250、1,175、1,000、900、800、700、650、625、600、575、550、500、450、425、400、350、330、300、290、250或200单位。优选地，总剂量可以高达6,660单位的修饰BoNT/A，例如总剂量可以高达290、425、575、600、800、1,000、1,175、1,250、3,000、3,350、3,500或7,000单位。总剂量可以是至少35、40、50、100、150、200、250、290、300、350、400、450、500、540、550、580、600、650、700、750、800、850、900、950、1,000、1,050、1,500、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000或7,000单位。优选地，总剂量可以是至少62单位、更优选至少83单位的修饰的BoNT/A，例如至少208单位。总剂量可以是217单位至7,070单位，优选294单位至6,660单位。例如，施用的总剂量可以是250-1,250单位，例如250-625单位，或540-1,200单位。更优选地，施用的总剂量为420单位至6,660单位。优选地，施用的总剂量可以是291单位、416单位、582单位、832单位、1,165单位、1,248单位、3,328单位或6,656单位。
因此，单位剂量可以是31单位至707单位修饰的BoNT/A，其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域，以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)，当进行本发明的治疗方案时施用的总剂量可以高达7,070单位。单位剂量可以是41.6单位并且总剂量可以高达291单位。单位剂量可以是41.6单位并且总剂量可以高达416单位。单位剂量可以是41.6单位并且总剂量可以高达582单位。单位剂量可以是83.2单位并且总剂量可以高达582单位。单位剂量可以是83.2单位并且总剂量可以高达832单位。单位剂量可以是83.2单位并且总剂量可以高达1,165单位。单位剂量可以是124.8单位并且总剂量可以高达1,248单位。单位剂量可以是332.8单位并且总剂量可以高达3,328单位。单位剂量可以是665.5单位并且总剂量可以高达6,656单位。
因此，单位剂量可以是31单位至707单位修饰的BoNT/A，其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域，以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)，当进行本发明的治疗方案时施用的总剂量可以高达7,070单位。单位剂量可以是41.6单位并且总剂量可以是291单位。单位剂量可以是41.6单位并且总剂量可以是416单位。单位剂量可以是41.6单位并且总剂量可以是582单位。单位剂量可以是83.2单位并且总剂量可以是582单位。单位剂量可以是83.2单位并且总剂量可以是832单位。单位剂量可以是83.2单位并且总剂量可以是1,165单位。单位剂量可以是124.8单位并且总剂量可以是1,248单位。单位剂量可以是332.8单位并且总剂量可以是3,328单位。单位剂量可以是665.5单位并且总剂量可以是6,656单位。
一方面，本发明提供了用于治疗颈肌张力障碍的修饰的肉毒杆菌神经毒素A(BoNT/A)，其中所述修饰的BoNT/A通过肌内注射施用至受试者受影响的颈部肌肉，
其中修饰的BoNT/A以单位剂量450pg至8,000pg的修饰的BoNT/A的方式施用，
其中至少单个单位剂量被施用至受影响的颈部肌肉，
其中在治疗期间施用的总剂量高达80,000pg的修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274、和THR 1277，其中所述修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；
(ii)用不带电荷的氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代表面暴露的不带电荷的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；和
(v)删除表面暴露的酸性氨基酸残基。
在相关方面，本发明提供了修饰的BoNT/A，其用于治疗受试者的颈肌张力障碍，其持续时间比用未修饰的BoNT/A(例如SEQ ID NO：2)治疗的持续时间更长，其中修饰的BoNT/A通过肌内注射施用至受试者受影响的颈部肌肉，
其中修饰的BoNT/A以单位剂量450pg至8,000pg的修饰的BoNT/A的方式施用，
其中至少单个单位剂量被施用至受影响的颈部肌肉，
其中在治疗期间施用的总剂量高达80,000pg的修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886，ASN 905，GLN 915，ASN 918，GLU 920，ASN 930，ASN 954，SER 955，GLN 991，GLU 992，GLN995，ASN 1006，ASN 1025，ASN 1026，ASN 1032，ASN 1043，ASN 1046，ASN 1052，ASP 1058，HIS 1064，ASN 1080，GLU 1081，GLU 1083，ASP 1086，ASN 1188，ASP 1213，GLY 1215，ASN1216，GLN 1229，ASN 1242，ASN 1243，SER 1274以及THR 1277，其中所述修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；
(ii)用不带电荷的氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代表面暴露的不带电荷的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；和
(v)删除表面暴露的酸性氨基酸残基。
一方面，本发明提供了治疗颈肌张力障碍的方法，所述方法包括通过肌内注射向受试者受影响的颈部肌肉施用修饰的BoNT/A，
其中修饰的BoNT/A以单位剂量450pg至8,000pg的修饰的BoNT/A的方式施用，
其中至少单个单位剂量被施用至受影响的颈部肌肉，
其中在治疗期间施用的总剂量高达80,000pg的修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886，ASN 905，GLN 915，ASN 918，GLU 920，ASN 930，ASN 954，SER 955，GLN 991，GLU 992，GLN995，ASN 1006，ASN 1025，ASN 1026，ASN 1032，ASN 1043，ASN 1046，ASN 1052，ASP 1058，HIS 1064，ASN 1080，GLU 1081，GLU 1083，ASP 1086，ASN 1188，ASP 1213，GLY 1215，ASN1216，GLN 1229，ASN 1242，ASN 1243，SER 1274以及THR 1277，其中所述修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；
(ii)用不带电荷的氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代表面暴露的不带电荷的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；和
(v)删除表面暴露的酸性氨基酸残基。
在相关方面，本发明提供了用于治疗受试者的颈肌张力障碍的方法，其持续时间比用未修饰的BoNT/A(例如SEQ ID NO：2)治疗的持续时间更长，所述方法包括通过肌内注射向受试者受影响的颈部肌肉施用修饰的BoNT/A，
其中修饰的BoNT/A以单位剂量450pg至8,000pg的修饰的BoNT/A的方式施用，
其中至少单个单位剂量被施用至受影响的颈部肌肉，
其中在治疗期间施用的总剂量高达80,000pg的修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886，ASN 905，GLN 915，ASN 918，GLU 920，ASN 930，ASN 954，SER 955，GLN 991，GLU 992，GLN995，ASN 1006，ASN 1025，ASN 1026，ASN 1032，ASN 1043，ASN 1046，ASN 1052，ASP 1058，HIS 1064，ASN 1080，GLU 1081，GLU 1083，ASP 1086，ASN 1188，ASP 1213，GLY 1215，ASN1216，GLN 1229，ASN 1242，ASN 1243，SER 1274和THR 1277，其中所述修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；
(ii)用不带电荷的氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代表面暴露的不带电荷的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；和
(v)删除表面暴露的酸性氨基酸残基。
一方面，本发明提供了修饰的肉毒杆菌神经毒素A(BoNT/A)在制备用于治疗颈肌张力障碍的药物中的用途，其中修饰的BoNT/A通过肌内注射施用至受试者受影响的颈部肌肉，
其中修饰的BoNT/A以单位剂量450pg至8,000pg的修饰的BoNT/A的方式施用，
其中至少单个单位剂量被施用至受影响的颈部肌肉，
其中在治疗期间施用的总剂量高达80,000pg的修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886，ASN 905，GLN 915，ASN 918，GLU 920，ASN 930，ASN 954，SER 955，GLN 991，GLU 992，GLN995，ASN 1006，ASN 1025，ASN 1026，ASN 1032，ASN 1043，ASN 1046，ASN 1052，ASP 1058，HIS 1064，ASN 1080，GLU 1081，GLU 1083，ASP 1086， ASN 1188，ASP 1213，GLY 1215，ASN1216，GLN 1229，ASN 1242，ASN 1243，SER 1274和THR 1277，其中所述修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；
(ii)用不带电荷的氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代表面暴露的不带电荷的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；和
(v)删除表面暴露的酸性氨基酸残基。
在相关方面，本发明提供了修饰的BoNT/A在制备用于治疗受试者的颈肌张力障碍的药物中的用途，其持续时间比用未修饰的BoNT/A(例如SEQ ID NO：2)治疗的持续时间更长，其中修饰的BoNT/A通过肌内注射施用至受试者受影响的颈部肌肉，
其中修饰的BoNT/A以单位剂量450pg至8,000pg的修饰的BoNT/A的方式施用，
其中至少单个单位剂量被施用至受影响的颈部肌肉，
其中在治疗期间施用的总剂量高达80,000pg的修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886，ASN 905，GLN 915，ASN 918，GLU 920，ASN 930，ASN 954，SER 955，GLN 991，GLU 992，GLN995，ASN 1006，ASN 1025，ASN 1026，ASN 1032，ASN 1043，ASN 1046，ASN 1052，ASP 1058，HIS 1064，ASN 1080，GLU 1081，GLU 1083，ASP 1086，ASN 1188，ASP 1213，GLY 1215，ASN1216，GLN 1229，ASN 1242，ASN 1243，SER 1274和THR 1277，其中所述修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；
(ii)用不带电荷的氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代表面暴露的不带电荷的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；和
(v)删除表面暴露的酸性氨基酸残基。
单位剂量可以是450pg至8,000pg的修饰的BoNT/A，其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905，GLN 915，ASN 918，GLU 920，ASN 930，ASN 954，SER 955，GLN 991，GLU 992，GLN 995，ASN 1006，ASN 1025，ASN 1026，ASN 1032，ASN 1043，ASN 1046，ASN 1052，ASP 1058，HIS1064，ASN 1080，GLU 1081，GLU1083，ASP 1086，ASN 1188，ASP 1213，GLY 1215，ASN 1216，GLN 1229，ASN 1242，ASN 1243，SER 1274，和THR 1277，其中所述修饰选自：(i)用碱性氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；(ii)用不带电荷的氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；(iii)用碱性氨基酸残基取代表面暴露的不带电荷的氨基酸残基；(iv)插入碱性氨基酸残基；(v)删除表面暴露的酸性氨基酸残基。单位剂量范围的上限可以是7,750、7,500、7,000、6,000、5,000、4,000、3,000、2,000或1,000pg的修饰的BoNT/A，优选上限是7,500pg。单位剂量范围的下限可以是475、500、600、700、800、900、1,000、1,500、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000或7,000pg的修饰的BoNT/A，优选下限是500pg。优选地，单位剂量的修饰的BoNT/A是500pg至7,500pg的修饰的BoNT/A，例如4,000pg至6,000pg。最优选地，单位剂量的修饰的BoNT/A是2,000pg至3,000pg，例如2,400pg至2,600pg。
单位剂量可以是大于1,000或大于5,000pg的修饰的BoNT/A，其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN1243、SER 1274、和THR 1277，其中所述修饰选自：(i)用碱性氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；(ii)用不带电荷的氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；(iii)用碱性氨基酸残基取代表面暴露的不带电荷的氨基酸残基；(iv)插入碱性氨基酸残基；(v)删除表面暴露的酸性氨基酸残基。单位剂量的修饰的BoNT/A可以大于1，000pg至高达7,500pg的修饰的BoNT/A，例如大于5,000pg至高达7,500pg的修饰的BoNT/A。
进行本发明的治疗方案时施用的总剂量可以是高达80,000pg的修饰的BoNT/A，其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886，ASN 905，GLN 915，ASN 918，GLU 920，ASN 930，ASN 954，SER 955，GLN 991，GLU 992，GLN 995，ASN1006，ASN 1025，ASN 1026，ASN 1032，ASN 1043，ASN 1046，ASN 1052，ASP 1058，HIS 1064，ASN 1080，GLU 1081，GLU 1083，ASP 1086，ASN 1188，ASP 1213，GLY 1215，ASN 1216，GLN1229，ASN 1242，ASN 1243，SER 1274，和THR 1277，其中所述修饰选自：(i)用碱性氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；(ii)用不带电荷的氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；(iii)用碱性氨基酸残基取代表面暴露的不带电荷的氨基酸残基；(iv)插入碱性氨基酸残基；(v)删除表面暴露的酸性氨基酸残基。换句话说，在给定治疗疗程施用的修饰BoNT/A总量可以高达80,000pg。总剂量可以高达75,000、70,000、60,000、50,000、40,000、30,000、20,000、10,000或5,000pg。优选地，总剂量可以高达75,000pg的修饰的BoNT/A。总剂量可以是至少700、800、900、1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、7,500、10,000、12,500、15,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60、000或70,000pg。优选地，总剂量可以是至少900pg，更优选至少1,000pg修饰的BoNT/A，例如至少3,000pg。总剂量可以是3,150pg至80,000pg，优选3,500pg至75,000pg。更优选地，施用的总剂量为7,500-75,000pg。
施用的总剂量可以是大于1,000或大于5,000pg的修饰的BoNT/A，其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886，ASN 905，GLN 915，ASN 918，GLU 920，ASN 930，ASN 954，SER 955，GLN 991，GLU 992，GLN 995，ASN 1006，ASN1025，ASN 1026，ASN 1032ASN 1043，ASN 1046，ASN 1052，ASP 1058，HIS1064，ASN 1080，GLU 1081，GLU 1083，ASP 1086，ASN 1188，ASP 1213，GLY 1215，ASN 1216，GLN 1229，ASN1242，ASN 1243，SER 1274、和THR 1277，其中所述修饰选自：(i)用碱性氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；(ii)用不带电荷的氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；(iii)用碱性氨基酸残基取代表面暴露的不带电荷的氨基酸残基；(iv)插入碱性氨基酸残基；(v)删除表面暴露的酸性氨基酸残基。优选地，总剂量可以大于1,000pg的修饰的BoNT/A，例如大于5,000pg的修饰的BoNT/A。
一方面，本发明提供了用于治疗颈肌张力障碍的修饰的肉毒杆菌神经毒素A(BoNT/A)，其中所述修饰的BoNT/A通过肌内注射施用至受试者受影响的颈部肌肉，
其中修饰的BoNT/A以53U至948U的修饰的BoNT/A的单位剂量的方式施用，其中1单位是对应于在小鼠中计算的半数致死剂量(LDs0)的修饰的BoNT/A的量，
其中至少单个单位剂量被施用至受影响的颈部肌肉，
其中在治疗期间施用的总剂量高达9,480U的修饰的BoNT/A，并且其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886，ASN 905，GLN 915，ASN 918，GLU 920，ASN 930，ASN 954，SER 955，GLN 991，GLU 992，GLN 995，ASN 1006，ASN1025，ASN 1026，ASN 1032，ASN 1043，ASN 1046，ASN 1052，ASP 1058，HIS 1064，ASN 1080，GLU 1081，GLU 1083，ASP 1086，ASN 1188，ASP 1213，GLY 1215，ASN 1216，GLN 1229，ASN1242，ASN 1243，SER 1274、和THR 1277，其中所述修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；
(ii)用不带电荷的氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代表面暴露的不带电荷的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；和
(v)删除表面暴露的酸性氨基酸残基。
在相关方面，本发明提供了修饰的BoNT/A，其用于治疗受试者的颈肌张力障碍，其持续时间比用未修饰的BoNT/A(例如SEQ ID NO：2)治疗的持续时间更长，其中修饰的BoNT/A通过肌内注射施用至受试者受影响的颈部肌肉，
其中修饰的BoNT/A以53U至948U的修饰的BoNT/A的单位剂量的方式施用，其中1单位是对应于在小鼠中计算的半数致死剂量(LD50)的修饰的BoNT/A的量，
其中至少单个单位剂量被施用至受影响的颈部肌肉，
其中在治疗期间施用的总剂量高达9,480U的修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274、和THR 1277，其中所述修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；
(ii)用不带电荷的氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代表面暴露的不带电荷的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；和
(v)删除表面暴露的酸性氨基酸残基。
在相关方面，本发明提供了治疗颈肌张力障碍的方法，所述方法包括通过肌内注射向受试者受影响的颈部肌肉施用修饰的BoNT/A，
其中修饰的BoNT/A以53U至948U的修饰的BoNT/A的单位剂量的方式施用，其中1单位是对应于在小鼠中计算的半数致死剂量(LD50)的修饰的BoNT/A的量，
其中至少单个单位剂量被施用至受影响的颈部肌肉，
其中在治疗期间施用的总剂量高达9,480U的修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274、和THR 1277，其中所述修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；
(ii)用不带电荷的氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代表面暴露的不带电荷的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；和
(v)删除表面暴露的酸性氨基酸残基。
在相关方面，本发明提供了用于治疗受试者的颈肌张力障碍的方法，其持续时间比用未修饰的BoNT/A(例如SEQ ID NO:2)治疗的持续时间更长，所述方法包括通过肌内注射向受试者受影响的颈部肌肉施用修饰的BoNT/A，
其中修饰的BoNT/A以53U至948U的修饰的BoNT/A的单位剂量的方式施用，其中1单位是对应于在小鼠中计算的半数致死剂量(LD50)的修饰的BoNT/A的量，
其中至少单个单位剂量被施用至受影响的颈部肌肉，
其中在治疗期间施用的总剂量高达9,480U的修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274、和THR 1277，其中所述修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；
(ii)用不带电荷的氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代表面暴露的不带电荷的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；和
(v)删除表面暴露的酸性氨基酸残基。
在另一个相关的方面，本发明提供了修饰的肉毒杆菌神经毒素A(BoNT/A)在制备用于治疗颈肌张力障碍的药物中的用途，其中修饰的BoNT/A通过肌内注射施用至受试者受影响的颈部肌肉,
其中修饰的BoNT/A以53U至948U的修饰的BoNT/A的单位剂量的方式施用，其中1单位是对应于在小鼠中计算的半数致死剂量(LD50)的修饰的BoNT/A的量，
其中至少单个单位剂量被施用至受影响的颈部肌肉，
其中在治疗期间施用的总剂量高达9,480U的修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274、和THR 1277，其中所述修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；
(ii)用不带电荷的氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代表面暴露的不带电荷的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；和
(v)删除表面暴露的酸性氨基酸残基。
在相关方面，本发明提供了修饰的BoNT/A在制备用于治疗受试者的颈肌张力障碍的药物中的用途，其持续时间比用未修饰的BoNT/A(例如SEQ ID NO:2)治疗的持续时间更长，其中修饰的BoNT/A通过肌内注射施用至受试者受影响的颈部肌肉，
其中修饰的BoNT/A以53U至948U的修饰的BoNT/A的单位剂量的方式施用，其中1单位是对应于在小鼠中计算的半数致死剂量(LD50)的修饰的BoNT/A的量，
其中至少单个单位剂量被施用至受影响的颈部肌肉，
其中在治疗期间施用的总剂量高达9,480U的修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274、和THR 1277，其中所述修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；
(ii)用不带电荷的氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代表面暴露的不带电荷的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；和
(v)删除表面暴露的酸性氨基酸残基。
单位剂量可以是53单位至948单位的修饰的BoNT/A，其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274、和THR 1277，其中所述修饰选自：(i)用碱性氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；(ii)用不带电荷的氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；(iii)用碱性氨基酸残基取代表面暴露的不带电荷的氨基酸残基；(iv)插入碱性氨基酸残基；(v)删除表面暴露的酸性氨基酸残基。单位剂量范围的上限可以是925、900、850、800、750、700、650、600、550、500、450、400、350、300、250、200、150或100单位的修饰的BoNT/A，优选上限为889个单位。单位剂量范围的下限可以是55、60、65、70、75、80、85、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850或900单位的修饰的BoNT/A，优选下限为59单位。优选地，修饰的BoNT/A的单位剂量是59单位至889单位的修饰的BoNT/A，例如200单位至600单位。最优选地，修饰的BoNT/A的单位剂量是237单位至355单位，例如284单位至308单位。
单位剂量可以是大于118.5单位或大于592.5单位的修饰的BoNT/A，其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN1242、ASN 1243、SER 1274、和THR 1277，其中所述修饰选自：(i)用碱性氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；(ii)用不带电荷的氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；(iii)用碱性氨基酸残基取代表面暴露的不带电荷的氨基酸残基；(iv)插入碱性氨基酸残基；(v)删除表面暴露的酸性氨基酸残基。单位剂量的修饰的BoNT/A可以是大于118.5单位至高达888单位的修饰的BoNT/A，例如大于592.5单位至高达888单位的修饰的BoNT/A。
进行本发明的治疗方案时施用的总剂量可以是高达9,480单位的修饰的BoNT/A，其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274、和THR 1277，其中所述修饰选自：(i)用碱性氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；(ii)用不带电荷的氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；(iii)用碱性氨基酸残基取代表面暴露的不带电荷的氨基酸残基；(iv)插入碱性氨基酸残基；(v)删除表面暴露的酸性氨基酸残基。换句话说，在给定治疗疗程施用的修饰BoNT/A总量可以高达9,480单位。总剂量可以高达9,000、8,000、7,000、6,000、5,000、4,000、3,000、2,000或1,000单位。优选地，总剂量可以是高达8,890单位的修饰的BoNT/A。总剂量可以是至少83、95、106、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1,000、1,500、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000或9,000单位。优选地，总剂量可以是至少106单位、更优选至少118单位的修饰的BoNT/A，例如至少355单位。总剂量可以是371单位至9,480单位，优选413单位至8,890单位。更优选地，施用的总剂量为889单位至8,890单位。
施用的总剂量可以是大于118.5单位或大于592.5单位的修饰的BoNT/A，其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN1242、ASN 1243、SER 1274、和THR 1277，其中所述修饰选自：(i)用碱性氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；(ii)用不带电荷的氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；(iii)用碱性氨基酸残基取代表面暴露的不带电荷的氨基酸残基；(iv)插入碱性氨基酸残基；(v)删除表面暴露的酸性氨基酸残基。优选地，总剂量可以是大于118.5单位的修饰的BoNT/A，例如大于592.5单位的修饰的BoNT/A。
“受影响的颈部肌肉”可以是在受试者中促成(例如引起)颈肌张力障碍和/或其症状的颈部肌肉，或者是促成(例如引起)受试者中颈肌张力障碍和/或其症状的颈部肌肉。这并不意味着“受影响的颈部肌肉”必须一定是在治疗时促成(例如引起)颈肌张力障碍和/或其症状，尽管这是优选的。例如，颈部肌肉可以是过去在受试者中促成(例如引起)颈肌张力障碍和/或其症状的肌肉，或者预期未来将在受试者中促成(例如引起)颈肌张力障碍和/或其症状的肌肉。在一个实施方案中，两个或更多个颈部肌肉(例如颈部肌肉的主动肌对和拮抗肌对)可以在受试者中促成(例如引起)颈肌张力障碍和/或其症状。在这种情况下，可以将修饰的BoNT/A施用至两个或更多个颈部肌肉(例如，施用至该颈部肌肉对的主动颈部肌肉和拮抗颈部肌肉)。
受影响的颈部肌肉优选地通过收缩而促成(例如引起)受试者的颈肌张力障碍和/或其症状。因此，受影响的颈部肌肉优选是受试者的颈部肌肉，其收缩或其收缩导致受试者颈肌张力障碍和/或其症状。所述颈部肌肉优选地是例如在治疗时不自主地收缩或已经不自主地收缩的颈部肌肉。颈部肌肉可以是有效地连接至受试者的颈部和/或头部的任何肌肉(例如骨骼肌)，例如能够改变受试者的头部定位的任何肌肉(例如当收缩时)。受影响的颈部肌肉可以是能够：引起受试者的下巴向受试者的肩膀方向扭转，从而导致头部侧向旋转(斜颈)；引起受试者的头部向前倾斜(屈颈)；引起受试者的头部向后倾斜(伸颈)；引起受试者的头部侧向倾斜(侧颈)；引起受试者的头部前矢状移位(向前移位)；和/或引起受试者的头部后矢状移位(向后移位)。
受影响的颈部肌肉可包括胸锁乳突肌(sternocleidomastoid)、胸锁乳突肌(sternocleidomastoideus)、头夹肌、颈夹肌、斜角肌复合体(例如前斜角肌和/或中斜角肌)、斜方肌(例如上斜方肌和/或斜方肌下部)、肩胛提肌、头半棘肌或最长肌(例如头最长肌和/或颈最长肌)。受影响的颈部肌肉可包括胸锁乳突肌、头夹肌、颈夹肌、斜角肌复合体(例如前斜角肌和/或中斜角肌)、斜方肌(例如上斜方肌和/或斜方肌下部)、肩胛提肌、头半棘肌、最长肌(例如头最长肌和/或颈最长肌)、后椎旁肌(例如后斜角肌、中斜角肌和/或前斜角肌，优选后斜角肌)、颏下复合体(例如二腹肌、颏舌骨肌、下颌舌骨肌、下颌舌骨肌扣眼和/或茎突舌骨肌)、上颈线—锁骨(外侧部分)、棘突C3-Th3-乳突、棘突Th3-Th5—横突C1-C2、横突C3-Th6、棘突C3-Th1—上颈线、横突Th1-Th6—棘突C2-C7、横突C3-Th3—乳突、横突Th1-Th6—横突C2-C6、头下斜肌、棘突C2—横突C1、胸骨上切迹和锁骨(内侧部分)—乳突和上颈线、横突C1-C4—肩胛骨(肩胛上角)、横突C2-C7—第一肋骨、横突C3-C6—第一肋骨、头长肌、横突C3-C6—枕骨(基底部分)、颈长肌或横突C2-C5—寰椎(前结节)。受影响的颈部肌肉可包括右肩胛提肌、左肩胛提肌、右斜方肌、左斜方肌、右胸锁乳突肌、左胸锁乳突肌、右头夹肌、左头夹肌、中斜角肌、前斜角肌、右头半棘肌、左头半棘肌、右头最长肌或左头最长肌。受影响的颈部肌肉可包括胸锁乳突肌(例如左或右胸锁乳突肌)、左或右头夹肌、前斜角肌或中斜角肌、左或右斜方肌(例如左或右上斜方肌)、左或右肩胛提肌、左或右头半棘肌、最长肌(例如左或右头最长肌和/或颈最长肌)、颈夹肌、斜角肌复合体(例如前斜角肌和/或中斜角肌)、后椎旁肌(例如后斜角肌、中斜角肌和/或前斜角肌，优选后斜角肌)、颏下复合体(例如二腹肌、颏舌骨肌、下颌舌骨肌、下颌舌骨肌扣眼和/或茎突舌骨肌)、斜方肌下部、上项线—锁骨(外侧部分)、棘突C3-Th3-乳突、棘突Th3-Th5—横突C1-C2、横突C3-Th6、棘突C3-Th1—上项线、横突Th1-Th6—棘突C2-C7、横突C3-Th3—乳突、横突Th1-Th6—横突C2-C6、头下斜肌、头上斜肌、棘突C2—横突C1、胸骨上切迹和锁骨(内侧部分)—乳突和上项线、横突C1-C4—肩胛骨(肩胛上角)、横突C2-C7—第一肋骨、横突C3-C6—第一肋骨、头长肌、横突C3-C6—枕骨(基底部分)、颈长肌、颈半棘肌、头后大直肌、头后小直肌、头前直肌、多裂肌或横突C2-C5—寰椎(前结节)。
受影响的颈部肌肉可包括：颈半棘肌、肩胛提肌、颈夹肌、颈最长肌、斜方肌下部、胸锁乳突肌、头半棘肌、头下斜肌、头最长肌、头夹肌、颈半棘肌、中斜角肌、头最长肌、颈长肌或头长肌。
根据本发明治疗的多个受影响的颈部肌肉可以包括本文描述的任何肌肉中的至少一个(例如至少两个)。
在一个实施方案中，修饰的BoNT/A可以施用至一个或多个受影响的颈部肌肉，所述受影响的颈部肌肉选自：胸锁乳突肌、头夹肌、颈夹肌、斜角肌复合体(例如前斜角肌和/或中斜角肌)、斜方肌(例如上斜方肌和/或斜方肌下部)、肩胛提肌、头半棘肌和最长肌(例如头最长肌和/或颈最长肌)。优选地，将修饰的BoNT/A施用至多个受影响的颈部肌肉。例如，修饰的BoNT/A可以施用至至少两个(例如，至少三个、四个、五个、六个或七个，优选八个)受影响的颈部肌肉，所述受影响的颈部肌肉选自：胸锁乳突肌、头夹肌、颈夹肌、斜角肌复合体(例如前斜角肌和/或中斜角肌)、斜方肌(例如上斜方肌和/或斜方肌下部)、肩胛提肌、头半棘肌和最长肌(例如头最长肌和/或颈最长肌)。
在一个实施方案中，修饰的BoNT/A可以施用至一个或多个受影响的颈部肌肉，所述受影响的颈部肌肉选自右肩胛提肌、左肩胛提肌、右斜方肌、左斜方肌、右胸锁乳突肌、左胸锁乳突肌、右头夹肌、左头夹肌、中斜角肌、前斜角肌、右头半棘肌、左头半棘肌、右头最长肌和左头最长肌。
在一个实施方案中，修饰的BoNT/A可以施用至一个或多个受影响的颈部肌肉，所述受影响的颈部肌肉选自：胸锁乳突肌、胸锁乳突肌、头夹肌、颈夹肌、斜角肌复合体(例如前斜角肌和/或中斜角肌)、斜方肌(例如上斜方肌和/或斜方肌下部)、肩胛提肌、头半棘肌、最长肌(例如头最长肌和/或颈最长肌)、后椎旁肌(例如后斜角肌、中斜角肌和/或前斜角肌，优选后斜角肌)、颏下复合体(例如二腹肌、颏舌骨肌、下颌舌骨肌、下颌舌骨肌扣眼和/或茎突舌骨肌)、上颈线—锁骨(外侧部分)、棘突C3-Th3-乳突、棘突Th3-Th5—横突C1-C2、横突C3-Th6、棘突C3-Th1—上颈线、横突Th1-Th6—棘突C2-C7、横突C3-Th3—乳突、横突Th1-Th6—横突C2-C6、头下斜肌、棘突C2—横突C1、胸骨上切迹和锁骨(内侧部分)—乳突和上颈线、横突C1-C4—肩胛骨(肩胛上角)、横突C2-C7—第一肋骨、横突C3-C6—第一肋骨、头长肌、横突C3-C6—枕骨(基底部分)、颈长肌和横突C2-C5—寰椎(前结节)。优选地，将修饰的BoNT/A施用至多个受影响的颈部肌肉。例如，修饰的BoNT/A可以施用至至少两个(例如，至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个)受影响的颈部肌肉，所述受影响的颈部肌肉选自：胸锁乳突肌、胸锁乳突肌、头夹肌、颈夹肌、斜角肌复合体(例如前斜角肌和/或中斜角肌)、斜方肌(例如上斜方肌和/或斜方肌下部)、肩胛提肌、头半棘肌、最长肌(例如头最长肌和/或颈最长肌)、后椎旁肌(例如后斜角肌、中斜角肌和/或前斜角肌，优选后斜角肌)、颏下复合体(例如二腹肌、颏舌骨肌、下颌舌骨肌、下颌舌骨肌扣眼和/或茎突舌骨肌)、上颈线—锁骨(外侧部分)、棘突C3-Th3-乳突、棘突Th3-Th5—横突C1-C2、横突C3-Th6、棘突C3-Th1—上颈线、横突Th1-Th6—棘突C2-C7、横突C3-Th3—乳突、横突Th1-Th6—横突C2-C6、头下斜肌、棘突C2—横突C1、胸骨上切迹和锁骨(内侧部分)—乳突和上颈线、横突C1-C4—肩胛骨(肩胛上角)、横突C2-C7—第一肋骨、横突C3-C6—第一肋骨、头长肌、横突C3-C6—枕骨(基底部分)、颈长肌和横突C2-C5—寰椎(前结节)。
在一个实施方案中，修饰的BoNT/A可以施用至一个或多个受影响的颈部肌肉，所述受影响的颈部肌肉包括：胸锁乳突肌(例如左或右胸锁乳突肌)、左或右头夹肌、前斜角肌或中斜角肌、左或右斜方肌(例如左或右上斜方肌)、左或右肩胛提肌、左或右头半棘肌、头半棘肌中部、最长肌(例如左或右头最长肌和/或颈最长肌)、颈夹肌、斜角肌复合体(例如前斜角肌和/或中斜角肌)、后椎旁肌(例如后斜角肌、中斜角肌和/或前斜角肌，优选后斜角肌)、颏下复合体(例如二腹肌、颏舌骨肌、下颌舌骨肌、下颌舌骨肌扣眼和/或茎突舌骨肌)、斜方肌下部、上项线—锁骨(外侧部分)、棘突C3-Th3-乳突、棘突Th3-Th5—横突C1-C2、横突C3-Th6、棘突C3-Th1—上项线、横突Th1-Th6—棘突C2-C7、横突C3-Th3—乳突、横突Th1-Th6—横突C2-C6、头下斜肌、头上斜肌、棘突C2—横突C1、胸骨上切迹和锁骨(内侧部分)—乳突和上项线、横突C1-C4—肩胛骨(肩胛上角)、横突C2-C7—第一肋骨、横突C3-C6—第一肋骨、头长肌、横突C3-C6—枕骨(基底部分)、颈长肌、颈半棘肌、头后大直肌、头后小直肌、头前直肌、多裂肌或横突C2-C5—寰椎(前结节)。优选地，将修饰的BoNT/A施用至多个受影响的颈部肌肉。例如，修饰的BoNT/A可以施用至至少两个(例如，至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个)受影响的颈部肌肉，所述受影响的颈部肌肉选自：胸锁乳突肌(例如左或右胸锁乳突肌)、左或右头夹肌、前斜角肌或中斜角肌、左或右斜方肌(例如左或右上斜方肌)、左或右肩胛提肌、左或右头半棘肌、头半棘肌中部、最长肌(例如左或右头最长肌和/或颈最长肌)、颈夹肌、斜角肌复合体(例如前斜角肌和/或中斜角肌)、后椎旁肌(例如后斜角肌、中斜角肌和/或前斜角肌，优选后斜角肌)、颏下复合体(例如二腹肌、颏舌骨肌、下颌舌骨肌、下颌舌骨肌扣眼和/或茎突舌骨肌)、斜方肌下部、上项线—锁骨(外侧部分)、棘突C3-Th3-乳突、棘突Th3-Th5—横突C1-C2、横突C3-Th6、棘突C3-Th1—上项线、横突Th1-Th6—棘突C2-C7、横突C3-Th3—乳突、横突Th1-Th6—横突C2-C6、头下斜肌、头上斜肌、棘突C2—横突C1、胸骨上切迹和锁骨(内侧部分)—乳突和上项线、横突C1-C4—肩胛骨(肩胛上角)、横突C2-C7—第一肋骨、横突C3-C6—第一肋骨、头长肌、横突C3-C6—枕骨(基底部分)、颈长肌、颈半棘肌、头后大直肌、头后小直肌、头前直肌、多裂肌和/或横突C2-C5—寰椎(前结节)。
在一个实施方案中，修饰的BoNT/A可以施用至一个或多个受影响的颈部肌肉，所述受影响的颈部肌肉选自：胸锁乳突肌(例如左或右胸锁乳突肌)、左或右头夹肌、前斜角肌或中斜角肌、左或右斜方肌(例如左或右上斜方肌)、左或右肩胛提肌、左或右头半棘肌、最长肌(例如左或右头最长肌和/或颈最长肌)、颈夹肌、斜角肌复合体(例如前斜角肌和/或中斜角肌)、后椎旁肌(例如后斜角肌、中斜角肌和/或前斜角肌，优选后斜角肌)、颏下复合体(例如二腹肌、颏舌骨肌、下颌舌骨肌、下颌舌骨肌扣眼和/或茎突舌骨肌)、斜方肌下部、上项线—锁骨(外侧部分)、棘突C3-Th3-乳突、棘突Th3-Th5—横突C1-C2、横突C3-Th6、棘突C3-Th1—上项线、横突Th1-Th6—棘突C2-C7、横突C3-Th3—乳突、横突Th1-Th6—横突C2-C6、头下斜肌、头上斜肌、棘突C2—横突C1、胸骨上切迹和锁骨(内侧部分)—乳突和上项线、横突C1-C4—肩胛骨(肩胛上角)、横突C2-C7—第一肋骨、横突C3-C6—第一肋骨、头长肌、横突C3-C6—枕骨(基底部分)、颈长肌、颈半棘肌、头后大直肌、头后小直肌、头前直肌、多裂肌和横突C2-C5—寰椎(前结节)。优选地，将修饰的BoNT/A施用至多个受影响的颈部肌肉。例如，修饰的BoNT/A可以施用至至少两个(例如，至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个)受影响的颈部肌肉，所述受影响的颈部肌肉选自：胸锁乳突肌(例如左或右胸锁乳突肌)、左或右头夹肌、前斜角肌或中斜角肌、左或右斜方肌(例如左或右上斜方肌)、左或右肩胛提肌、左或右头半棘肌、最长肌(例如左或右头最长肌和/或颈最长肌)、颈夹肌、斜角肌复合体(例如前斜角肌和/或中斜角肌)、后椎旁肌(例如后斜角肌、中斜角肌和/或前斜角肌，优选后斜角肌)、颏下复合体(例如二腹肌、颏舌骨肌、下颌舌骨肌、下颌舌骨肌扣眼和/或茎突舌骨肌)、斜方肌下部、上项线—锁骨(外侧部分)、棘突C3-Th3-乳突、棘突Th3-Th5—横突C1-C2、横突C3-Th6、棘突C3-Th1—上项线、横突Th1-Th6—棘突C2-C7、横突C3-Th3—乳突、横突Th1-Th6—横突C2-C6、头下斜肌、头上斜肌、棘突C2—横突C1、胸骨上切迹和锁骨(内侧部分)—乳突和上项线、横突C1-C4—肩胛骨(肩胛上角)、横突C2-C7—第一肋骨、横突C3-C6—第一肋骨、头长肌、横突C3-C6—枕骨(基底部分)、颈长肌、颈半棘肌、头后大直肌、头后小直肌、头前直肌、多裂肌和横突C2-C5—寰椎(前结节)。
在一个实施方案中，修饰的BoNT/A可以施用至一个或多个受影响的颈部肌肉，所述受影响的颈部肌肉包括：颈半棘肌、肩胛提肌、颈夹肌、颈最长肌、斜方肌下部、胸锁乳突肌、头半棘肌、头下斜肌、头最长肌、头夹肌、颈半棘肌、中斜角肌、头最长肌、颈长肌或头长肌。在一个实施方案中，修饰的BoNT/A可以施用至一个或多个受影响的颈部肌肉，所述受影响的颈部肌肉选自：颈半棘肌、肩胛提肌、颈夹肌、颈最长肌、斜方肌下部、胸锁乳突肌、头半棘肌、头下斜肌、头最长肌、头夹肌、颈半棘肌、中斜角肌、头最长肌、颈长肌和头长肌。例如，修饰的BoNT/A可以施用至至少两个(例如至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个)所述受影响的颈部肌肉。
当颈部两侧有两块同等的颈部肌肉(例如胸锁乳突肌，例如左胸锁乳突肌和右胸锁乳突肌)时，可以单侧(例如，对其中只有一块肌肉收缩的肌肉之一)或双侧(例如，对其中两块肌肉均收缩的两块肌肉)施用修饰的BoNT/A。当治疗多个受影响的肌肉时，优选的是，治疗多个不同类型的受影响的肌肉。例如，当对两个受影响的胸锁乳突肌进行双侧施用时，优选当如本文所述治疗多个受影响的肌肉时治疗另外的肌肉。
当颈部两侧有两个同等的颈部肌肉时，可以单侧施用至所述同等颈部肌肉中的任一个。例如，可以对收缩的肌肉或非收缩的同等肌肉进行施用。在一个实施方案中，单侧施用至受试者颈部一侧的肌肉，其中受试者颈部的一侧表现出颈肌张力障碍的症状，或单侧施用至受试者颈部对侧的同等肌肉，其中受试者颈部的对侧没有表现出颈肌张力障碍的症状。
选择用于根据本发明的治疗的受影响的颈部肌肉可以取决于待治疗的受试者的颈肌张力障碍的具体表现(例如斜颈、侧颈、屈颈、伸颈或其组合)。
选择用于根据本发明的治疗的受影响的颈部肌肉可以取决于待治疗的受试者的颈肌张力障碍的具体表现(例如斜颈、侧颈、屈颈、伸颈、侧头、斜头、屈头、伸头、侧向移位、矢状移位或其组合)。
在一个实施方案中，当治疗斜颈时，可以将修饰的BoNT/A施用至选自以下的一个或多个受影响的颈部肌肉：胸锁乳突肌、斜方肌(例如上斜方肌)、前斜角肌、头夹肌、颈夹肌、肩胛提肌和最长肌(例如头最长肌和/或颈最长肌)。优选地，当治疗斜颈时，可以将修饰的BoNT/A对侧施用至选自以下的一个或多个受影响的颈部肌肉：胸锁乳突肌、斜方肌(例如上斜方肌)和前斜角肌；和/或同侧施用至选自以下的一个或多个受影响的颈部肌肉：头夹肌、颈夹肌、肩胛提肌和最长肌(例如头最长肌和/或颈最长肌)。
在一个实施方案中，当治疗斜颈时，可以将修饰的BoNT/A施用至选自以下的一个或多个受影响的颈部肌肉：胸锁乳突肌、斜方肌(例如上斜方肌)、前斜角肌、头夹肌、颈夹肌、肩胛提肌和最长肌(例如头最长肌和/或颈最长肌)和颈半棘肌。在一个实施方案中，当治疗斜颈时，可以将修饰的BoNT/A对侧施用至选自以下的一个或多个受影响的颈部肌肉：胸锁乳突肌、斜方肌(例如上斜方肌)和前斜角肌；和/或同侧施用至选自以下的一个或多个受影响的颈部肌肉：头夹肌、颈夹肌、肩胛提肌和最长肌(例如头最长肌和/或颈最长肌)和颈半棘肌。
在一个实施方案中，当治疗斜颈时，可以将修饰的BoNT/A施用至选自以下的一个或多个受影响的颈部肌肉：胸锁乳突肌、斜方肌(例如上斜方肌)、前斜角肌、头夹肌、颈夹肌、肩胛提肌、最长肌(例如头最长肌和/或颈最长肌)、颈半棘肌、头后大直肌、多裂肌和头下斜肌。在一个实施方案中，当治疗斜颈时，可以将修饰的BoNT/A对侧施用至选自以下的一个或多个受影响的颈部肌肉：胸锁乳突肌、斜方肌(例如上斜方肌)、前斜角肌、颈半棘肌和多裂肌；和/或同侧施用至选自以下的一个或多个受影响的颈部肌肉：头夹肌、颈夹肌、肩胛提肌、最长肌(例如头最长肌和/或颈最长肌)、头后大直肌和头下斜肌。
在一个实施方案中，当治疗斜颈时，可以将修饰的BoNT/A施用至一个或多个受影响的颈部肌肉，所述受影响的颈部肌肉包括：胸锁乳突肌、斜方肌(例如上斜方肌)、前斜角肌、头夹肌、颈夹肌、肩胛提肌、最长肌(例如头最长肌和/或颈最长肌)、颈半棘肌、头后大直肌、多裂肌或头下斜肌。在一个实施方案中，当治疗斜颈时，可以将修饰的BoNT/A对侧施用至一个或多个受影响的颈部肌肉，所述受影响的颈部肌肉包括：胸锁乳突肌、斜方肌(例如上斜方肌)、前斜角肌、颈半棘肌或多裂肌；和/或同侧施用至一个或多个受影响的颈部肌肉，所述受影响的颈部肌肉包括：头夹肌、颈夹肌、肩胛提肌、最长肌(例如头最长肌和/或颈最长肌)、头后大直肌，或头下斜肌。
在一个实施方案中，当治疗侧颈时，可以将修饰的BoNT/A施用至选自以下的一个或多个受影响的颈部肌肉：肩胛提肌、斜方肌(例如上斜方肌)、斜角肌复合体(例如前斜角肌和/或中斜角肌)、胸锁乳突肌、头夹肌、颈夹肌和最长肌(例如头最长肌和/或颈最长肌)。优选地，当治疗侧颈时，可以将修饰的BoNT/A同侧施用至一个或多个所述受影响的颈部肌肉。
在一个实施方案中，当治疗侧颈时，可以将修饰的BoNT/A施用至选自以下的一个或多个受影响的颈部肌肉：肩胛提肌、斜方肌(例如上斜方肌)、斜角肌复合体(例如前斜角肌和/或中斜角肌)、胸锁乳突肌、头夹肌、颈夹肌和最长肌(例如头最长肌和/或颈最长肌)和颈半棘肌。在一个实施方案中，当治疗侧颈时，可以将修饰的BoNT/A同侧施用至一个或多个所述受影响的颈部肌肉。
在一个实施方案中，当治疗侧颈时，可以将修饰的BoNT/A施用至选自以下的一个或多个受影响的颈部肌肉：肩胛提肌、斜方肌(例如上斜方肌)、斜角肌复合体(例如前斜角肌和/或中斜角肌)、胸锁乳突肌、头夹肌、颈夹肌、最长肌(例如头最长肌和/或颈最长肌)和多裂肌。在一个实施方案中，当治疗侧颈时，可以将修饰的BoNT/A同侧施用至一个或多个所述受影响的颈部肌肉。
在一个实施方案中，当治疗侧颈时，可以将修饰的BoNT/A施用至选自以下的一个或多个受影响的颈部肌肉：肩胛提肌、斜方肌(例如上斜方肌)、斜角肌复合体(例如前斜角肌和/或中斜角肌)、胸锁乳突肌、头夹肌、颈夹肌和最长肌(例如头最长肌和/或颈最长肌)、颈半棘肌和多裂肌。在一个实施方案中，当治疗侧颈时，可以将修饰的BoNT/A同侧施用至一个或多个所述受影响的颈部肌肉。
在一个实施方案中，当治疗侧颈时，可以将修饰的BoNT/A施用至一个或多个受影响的颈部肌肉，所述受影响的颈部肌肉包括：肩胛提肌、斜方肌(例如上斜方肌)、斜角肌复合体(例如前斜角肌和/或中斜角肌)、胸锁乳突肌、头夹肌、颈夹肌、最长肌(例如头最长肌和/或颈最长肌)、颈半棘肌或多裂肌。在一个实施方案中，当治疗侧颈时，可以将修饰的BoNT/A同侧施用至一个或多个所述受影响的颈部肌肉。
在一个实施方案中，当治疗屈颈时，可以将修饰的BoNT/A施用至选自以下的一个或多个受影响的颈部肌肉：胸锁乳突肌、前斜角肌和中斜角肌。优选地，当治疗屈颈时，可以双侧施用修饰的BoNT/A。
在一个实施方案中，当治疗屈颈肌时，可以将修饰的BoNT/A施用至选自以下的一个或多个受影响的颈部肌肉：胸锁乳突肌、前斜角肌、中斜角肌、肩胛提肌、颈长肌和颏下复合体(例如，二腹肌、颏舌骨肌、下颌舌骨肌、下颌舌骨肌扣眼和/或茎突舌骨肌)。优选地，当治疗屈颈时，可以双侧施用修饰的BoNT/A。
在一个实施方案中，当治疗屈颈肌时，可以将修饰的BoNT/A施用至选自以下的一个或多个受影响的颈部肌肉：胸锁乳突肌、前斜角肌、中斜角肌、头长肌、颈长肌和头前直肌。在一个实施方案中，当治疗屈颈时，可以双侧施用修饰的BoNT/A。
在一个实施方案中，当治疗屈颈肌时，可以将修饰的BoNT/A施用至选自以下的一个或多个受影响的颈部肌肉：胸锁乳突肌、前斜角肌、中斜角肌、肩胛提肌、颈长肌、颏下复合体(例如，二腹肌、颏舌骨肌、下颌舌骨肌、下颌舌骨肌扣眼和/或茎突舌骨肌)、头长肌和头前直肌。在一个实施方案中，当治疗屈颈时，可以双侧施用修饰的BoNT/A。
在一个实施方案中，当治疗屈颈肌时，可以将修饰的BoNT/A施用至一个或多个受影响的颈部肌肉，包括：胸锁乳突肌、前斜角肌、中斜角肌、肩胛提肌、颈长肌、颏下复合体(例如二腹肌、颏舌骨肌、下颌舌骨肌、下颌舌骨肌扣眼和/或茎突舌骨肌)、头长肌或头前直肌。在一个实施方案中，当治疗屈颈时，可以双侧施用修饰的BoNT/A。
在一个实施方案中，当治疗伸颈时，可以将修饰的BoNT/A施用至选自以下的一个或多个受影响的颈部肌肉：肩胛提肌、斜方肌(例如上斜方肌)、最长肌(例如头最长肌和/或颈最长肌))、头夹肌、颈夹肌和头半棘肌。优选地，当治疗伸颈时，可以双侧施用修饰的BoNT/A。
在一个实施方案中，当治疗伸颈时，可以将修饰的BoNT/A施用至选自以下的一个或多个受影响的颈部肌肉：肩胛提肌、斜方肌(例如上斜方肌)、最长肌(例如头最长肌和/或颈最长肌)、头夹肌、颈夹肌、头半棘肌、颈半棘肌和后椎旁肌(例如后斜角肌、中斜角肌和/或前斜角肌，优选后斜角肌)。优选地，当治疗伸颈时，可以双侧施用修饰的BoNT/A。
在一个实施方案中，当治疗伸颈时，可以将修饰的BoNT/A施用至选自以下的一个或多个受影响的颈部肌肉：肩胛提肌、斜方肌(例如上斜方肌)、最长肌(例如头最长肌和/或颈最长肌)、头夹肌、颈夹肌、头半棘肌、颈半棘肌、头棘肌、头后大直肌、头后小直肌、头上斜肌。优选地，当治疗伸颈时，可以双侧施用修饰的BoNT/A。
在一个实施方案中，当治疗伸颈时，可以将修饰的BoNT/A施用至选自以下的一个或多个受影响的颈部肌肉：肩胛提肌、斜方肌(例如上斜方肌)、最长肌(例如头最长肌和/或颈最长肌)、头夹肌、颈夹肌、头半棘肌、颈半棘肌、后椎旁肌(例如后斜角肌、中斜角肌和/或前斜角肌，优选后斜角肌)、头棘肌、头后大直肌、头后小直肌和头上斜肌。优选地，当治疗伸颈时，可以双侧施用修饰的BoNT/A。
在一个实施方案中，当治疗伸颈时，可以将修饰的BoNT/A施用至一个或多个受影响的颈部肌肉，包括：肩胛提肌、斜方肌(例如上斜方肌)、最长肌(例如头最长肌和/或颈最长肌)、头夹肌、颈夹肌、头半棘肌、颈半棘肌、后椎旁肌(例如后斜角肌、中斜角肌和/或前斜角肌，优选后斜角肌)、头棘肌、头后大直肌、头后小直肌或头上斜肌。优选地，当治疗伸颈时，可以双侧施用修饰的BoNT/A。
在一个实施方案中，当治疗侧向移位时，可以将修饰的BoNT/A施用至选自以下的一个或多个受影响的颈部肌肉：肩胛提肌、斜方肌(例如上斜方肌或斜方肌下部)、斜角肌复合体(例如前斜角肌和/或中斜角肌)、胸锁乳突肌、头夹肌、颈夹肌、最长肌(例如头最长肌和/或颈最长肌)和颈半棘肌。优选地，当治疗侧向移位时，可以将修饰的BoNT/A施用至颈部第一侧(例如左侧)上的受影响的颈部肌肉，所述受影响的颈部肌肉选自：肩胛提肌、颈半棘肌、中斜角肌和颈最长肌，并且可以将修饰的BoNT/A施用至颈部第二侧(例如右侧)上的受影响的肌肉，所述受影响的肌肉选自胸锁乳突肌、斜方肌下部、头夹肌、头半棘肌、头最长肌和肩胛提肌。
在一个实施方案中，当治疗侧向移位时，可以将修饰的BoNT/A施用至一个或多个受影响的颈部肌肉，所述颈部肌肉包括：肩胛提肌、斜方肌(例如上斜方肌或斜方肌下部)、斜角肌复合体(例如前斜角肌和/或中斜角肌)、胸锁乳突肌、头夹肌、颈夹肌、最长肌(例如头最长肌和/或颈最长肌)或颈半棘肌。优选地，当治疗侧向移位时，可以将修饰的BoNT/A施用至颈部第一侧(例如左侧)上的受影响的颈部肌肉，所述受影响的颈部肌肉包括：肩胛提肌、颈半棘肌、中斜角肌或颈最长肌，并且可以将修饰的BoNT/A施用至颈部第二侧(例如右侧)上的受影响的肌肉，所述受影响的肌肉包括胸锁乳突肌、斜方肌下部、头夹肌、头半棘肌、头最长肌或肩胛提肌。
在一个实施方案中，当治疗侧头时，可以将修饰的BoNT/A施用至一个或多个受影响的颈部肌肉，所述颈部肌肉选自：斜方肌下部、胸锁乳突肌、头最长肌、头夹肌、头半棘肌、肩胛提肌、以及后椎旁肌(例如后斜角肌、中斜角肌和/或前斜角肌，优选后斜角肌)。优选地，当治疗侧头时，可以将修饰的BoNT/A同侧施用。
在一个实施方案中，当治疗侧头时，可以将修饰的BoNT/A施用至一个或多个受影响的颈部肌肉，包括：斜方肌下部、胸锁乳突肌、头最长肌、头夹肌、头半棘肌、肩胛提肌、或后椎旁肌(例如后斜角肌、中斜角肌和/或前斜角肌，优选后斜角肌)。优选地，当治疗侧头时，可以将修饰的BoNT/A同侧施用。
在一个实施方案中，当治疗斜头时，可将修饰的BoNT/A施用至一个或多个受影响的颈部肌肉，所述受影响的颈部肌肉选自：斜方肌下部、胸锁乳突肌、头最长肌、头夹肌、头半棘肌中部和头下斜肌。优选地，当治疗斜头时，可以将修饰的BoNT/A同侧或对侧施用。例如，可以将修饰的BoNT/A对侧施用至一个或多个受影响的颈部肌肉，所述受影响的颈部肌肉选自：斜方肌下部、胸锁乳突肌和头半棘肌中部；和/或可以将修饰的BoNT/A同侧施用至一个或多个颈部肌肉，所述颈部肌肉选自：头下斜肌、头最长肌和头夹肌。
在一个实施方案中，当治疗斜头时，可将修饰的BoNT/A施用至一个或多个受影响的颈部肌肉，所述受影响的颈部肌肉包括：斜方肌下部、胸锁乳突肌、头最长肌、头夹肌、头半棘肌中部或头下斜肌。优选地，当治疗斜头时，可以将修饰的BoNT/A同侧或对侧施用。例如，可以将修饰的BoNT/A对侧施用至一个或多个受影响的颈部肌肉，所述受影响的颈部肌肉包括：斜方肌下部、胸锁乳突肌或头半棘肌中部；和/或可以将修饰的BoNT/A同侧施用至一个或多个颈部肌肉，所述颈部肌肉包括：头下斜肌、头最长肌或头夹肌。
在一个实施方案中，当治疗屈头时，可将修饰的BoNT/A施用至一个或多个受影响的颈部肌肉，所述受影响的颈部肌肉选自：头长肌、肩胛提肌和胸锁乳突肌。优选地，当治疗屈头时，可以双侧施用修饰的BoNT/A。
在一个实施方案中，当治疗屈头时，可以将修饰的BoNT/A施用至一个或多个受影响的颈部肌肉，包括：头长肌、肩胛提肌或胸锁乳突肌。优选地，当治疗屈头时，可以双侧施用修饰的BoNT/A。
在一个实施方案中，当治疗伸头时，可将修饰的BoNT/A施用至一个或多个受影响的颈部肌肉，所述受影响的颈部肌肉选自：头下斜肌、头半棘肌、斜方肌下部和头夹肌。优选地，当治疗伸头时，可以双侧施用修饰的BoNT/A。
在一个实施方案中，当治疗伸头时，可以将修饰的BoNT/A施用至一个或多个受影响的颈部肌肉，包括：头下斜肌、头半棘肌、斜方肌下部或头夹肌。优选地，当治疗伸头时，可以双侧施用修饰的BoNT/A。
在一个实施方案中，当治疗矢状移位时，可以将修饰的BoNT/A施用至一个或多个受影响的颈部肌肉，所述受影响的颈部肌肉选自：胸锁乳突肌、前斜角肌、中斜角肌、肩胛提肌、颈长肌、颏下复合体(例如，二腹肌、颏舌骨肌、下颌舌骨肌、下颌舌骨肌扣眼和/或茎突舌骨肌)、头下斜肌、头半棘肌、斜方肌下部和头夹肌。优选地，当治疗矢状移位时，可以将修饰的BoNT/A施用至在颈部第一侧(例如左侧)上的受影响的颈部肌肉，所述受影响的颈部肌肉选自：胸锁乳突肌、前斜角肌、中斜角肌、肩胛提肌、颈长肌、和颏下复合体(例如，二腹肌、颏舌骨肌、下颌舌骨肌、下颌舌骨肌扣眼和/或茎突舌骨肌)、并且可以将修饰的BoNT/A施用至在颈部第二侧(例如右侧)上的受影响的颈部肌肉，所述受影响的颈部肌肉选自：头下斜肌、头半棘肌、斜方肌下部和头夹肌。
在一个实施方案中，当治疗矢状移位时，可以将修饰的BoNT/A施用至一个或多个受影响的颈部肌肉，所述受影响的颈部肌肉包括：胸锁乳突肌、前斜角肌、中斜角肌、肩胛提肌、颈长肌、颏下复合体(例如，二腹肌、颏舌骨肌、下颌舌骨肌、下颌舌骨肌扣眼和/或茎突舌骨肌)、头下斜肌、头半棘肌、斜方肌下部或头夹肌。优选地，当治疗矢状移位时，可以将修饰的BoNT/A施用至在颈部第一侧(例如左侧)上的受影响的颈部肌肉，所述受影响的颈部肌肉包括：胸锁乳突肌、前斜角肌、中斜角肌、肩胛提肌、颈长肌、或颏下复合体(例如，二腹肌、颏舌骨肌、下颌舌骨肌、下颌舌骨肌扣眼和/或茎突舌骨肌)、并且可以将修饰的BoNT/A施用至在颈部第二侧(例如右侧)上的受影响的颈部肌肉，所述受影响的颈部肌肉包括：头下斜肌、头半棘肌、斜方肌下部或头夹肌。
通过在受影响的颈部肌肉进行肌内注射来施用修饰的BoNT/A。可以将一个或多个单位剂量(例如至少两个单位剂量)的修饰的BoNT/A施用至受影响的颈部肌肉。然而，优选对每个受影响的颈部肌肉仅施用单个单位剂量。当颈部肌肉是胸锁乳突肌时，可以施用两个单位剂量。例如，可以向左胸锁乳突肌施用两个单位剂量和/或可以向右胸锁乳突肌施用两个单位剂量。当颈部肌肉是斜方肌(例如斜方肌下部)时，可以施用两个单位剂量。例如，可以向左斜方肌(例如左上斜方肌)施用两个单位剂量和/或可以向右斜方肌(例如右上斜方肌)施用两个单位剂量。
可以在单个注射部位向受影响的颈部肌肉施用单位剂量。因此，在一些实施方案中，修饰的BoNT/A以单位剂量的方式在受影响的颈部肌肉处的每个注射部位施用。然而，优选，在单个注射部位施用少于单位剂量，在这种情况下，单位剂量可以在受影响的颈部肌肉的两个或更多个注射部位之间分配(相等或不等)。因此，修饰的BoNT/A可以在两个或更多个注射部位施用至受影响的颈部肌肉。在优选的实施方案中，在受影响的颈部肌肉的每个注射部位以少于单位剂量的方式施用修饰的BoNT/A。有利地，这可以允许临床医生通过在与受影响较小的区域相比时，在所述区域施用更多修饰的BoNT/A来勾画特别受影响的肌肉区域的肌肉轮廓和/或治疗该受影响的肌肉区域。
最优选地，每个注射部位施用单位剂量。
每个注射部位可以施用750-4,000pg剂量的修饰的BoNT/A，其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域，以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。优选地，每个注射部位施用1,000pg或2,000pg剂量的修饰的BoNT/A，其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域，以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
每个注射部位可以施用31-166.4单位的剂量的修饰的BoNT/A，其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域，以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。优选地，每个注射部位施用41.6单位或83.2单位的剂量的修饰的BoNT/A，其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域，以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
术语“施用至少单个单位剂量”是指施用至少基本上所有的单个单位剂量。例如，在修饰的BoNT/A已被重构的小瓶中，可以保留残余量的单位剂量(例如高达1％、0.1％或0.01％)。然而，优选施用至少单个单位剂量的全部(例如在一个或多个注射部位)。
根据本发明使用的修饰的BoNT/A的效力可以根据标准技术通过小鼠LD50测定法来确定。在所述测定法中，1单位定义为对应于小鼠中计算的半数致死剂量(LD50)的修饰的BoNT/A的量。优选地，计算的小鼠腹膜内半数致死剂量。
当用于本发明的修饰的BoNT/A是包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)的修饰的BoNT/A时，对应于所述测定法中的1单位的修饰的BoNT/A的量优选为24.04pg。
当用于本发明的修饰的BoNT/A是在一个或多个选自以下的氨基酸残基处包含修饰的修饰的BoNT/A时：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR1277，其中所述修饰选自：用碱性氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；用不带电荷的氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；用碱性氨基酸残基取代表面暴露的不带电荷的氨基酸残基；插入碱性氨基酸残基；和表面暴露的酸性氨基酸残基的缺失，对应于所述测定法中的1单位的修饰的BoNT/A的量优选为8.44pg。
当涉及数值使用时，术语“至多”(例如，至多170,000pg)意味着至多并包括所列举的值。因此，作为实例，提及施用“至多170,000pg”修饰的BoNT/A涵盖施用170,000pg修饰的BoNT/A以及施用少于170,000pg修饰的BoNT/A。
单位剂量可以用修饰的BoNT/A的量、修饰的BoNT/A的单位或其组合来表示。
在一个实施方案中，修饰的BoNT/A可以按如下剂量施用于一个或多个以下颈部肌肉：
颈部肌肉 剂量(单位剂量)
胸锁乳突肌 1x UD
头夹肌 1x UD
颈夹肌 1x UD
斜方肌 1x UD
肩胛提肌 1x UD
中斜角肌 1x UD
前斜角肌 1x UD
头半棘肌 1x UD
最长肌 1x UD
在一个实施方案中，修饰的BoNT/A可以按如下剂量施用于一个或多个以下颈部肌肉：
在一个实施方案中，修饰的BoNT/A可以按如下剂量施用于一个或多个以下颈部肌肉(只要当修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域，以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)时，在治疗期间施用的总剂量不超过170,000pg或7,070单位的上限；或者当修饰的BoNT/A包含一个或多个选自以下的氨基酸残基处的修饰时，不超过80,000pg或9,480单位：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，其中所述修饰选自：用碱性氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；用不带电荷的氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；用碱性氨基酸残基取代表面暴露的不带电荷的氨基酸残基；插入碱性氨基酸残基；和表面暴露的酸性氨基酸残基的缺失：
优选地，修饰的BoNT/A可以按如下剂量施用于以下颈部肌肉(只要当修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域，以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)时，在治疗期间施用的总剂量不超过170,000pg或7,070单位的上限；或者当修饰的BoNT/A包含一个或多个选自以下的氨基酸残基处的修饰时，不超过80,000pg或9,480单位：ASN 886、ASN 905、GLN915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，其中所述修饰选自：用碱性氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；用不带电荷的氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；用碱性氨基酸残基取代表面暴露的不带电荷的氨基酸残基；插入碱性氨基酸残基；和表面暴露的酸性氨基酸残基的缺失。
颈部肌肉 剂量(单位剂量)
右肩胛提肌 1x UD
左肩胛提肌 1x UD
右斜方肌 1x UD
左斜方肌 1x UD
右胸锁乳突肌 1x UD
左胸锁乳突肌 1x UD
右头夹肌 1x UD
左头夹肌 1x UD
中斜角肌 1x UD
前斜角肌 1x UD
右头半棘肌 1x UD
左头半棘肌 1x UD
右头最长肌 1x UD
左头最长肌 1x UD
优选地，修饰的BoNT/A可以按如下剂量施用于一个或多个以下颈部肌肉：
颈部肌肉 剂量(单位剂量)
右肩胛提肌或左肩胛提肌 1x UD
右斜方肌或左斜方肌 1x UD
右胸锁乳突肌或左胸锁乳突肌 1x UD
右头夹肌或左头夹肌 1x UD
中斜角肌或前斜角肌 1x UD
右头半棘肌或左头半棘肌 1x UD
右头最长肌或左头最长肌 1x UD
优选地，修饰的BoNT/A可以按如下剂量施用于以下颈部肌肉：
颈部肌肉 剂量(单位剂量)
右肩胛提肌或左肩胛提肌 1x UD
右斜方肌或左斜方肌 1x UD
右胸锁乳突肌或左胸锁乳突肌 1x UD
右头夹肌或左头夹肌 1x UD
中斜角肌或前斜角肌 1x UD
右头半棘肌或左头半棘肌 1x UD
右头最长肌或左头最长肌 1x UD
如本文所使用的，术语“右”和“左”具有其正常含义。例如，受试者的右肩胛提肌将是在受试者右手侧的肩胛提肌，而受试者的左肩胛提肌将是在受试者左手侧的肩胛提肌。
在给定治疗中施用的单位剂量总数可以至多10x单位剂量或至多7x单位剂量。单位剂量的总数可以根据所治疗的受影响的颈部肌肉来划分，例如，在一个实施方案中，当治疗期间要递送的剂量的数量是1x单位剂量时，则可以仅治疗一个受影响的颈部肌肉，然而，如果总数为2x单位剂量，则可以治疗两个受影响的颈部肌肉。施用的单位剂量总数可以至多9x、8x、7x或6x。施用的单位剂量的总数可以是至少2x、3x、4x、5x、6x、7x单位剂量，优选至少2x。施用的单位剂量的总数可以是1x至10x，或5x至10x，优选7x至10x。
在给定治疗中施用的单位剂量总数可以至多20x或15x(优选至多14x或至多7x)单位剂量，只要当修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域，以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)时，在治疗期间施用的总剂量不超过170,000pg或7,070单位的上限；或者当修饰的BoNT/A包含一个或多个选自以下的氨基酸残基处的修饰时，不超过80,000pg或9,480单位：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，其中所述修饰选自：用碱性氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；用不带电荷的氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；用碱性氨基酸残基取代表面暴露的不带电荷的氨基酸残基；插入碱性氨基酸残基；和表面暴露的酸性氨基酸残基的缺失。因此，施用的单位剂量总数可以至多13x、12x、10x、9x、8x、7x或6x，只要当修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域，以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)时，在治疗期间施用的总剂量不超过170,000pg或7,070单位的上限；或者当修饰的BoNT/A包含一个或多个选自以下的氨基酸残基处的修饰时，不超过80,000pg或9,480单位：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，其中所述修饰选自：用碱性氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；用不带电荷的氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；用碱性氨基酸残基取代表面暴露的不带电荷的氨基酸残基；插入碱性氨基酸残基；和表面暴露的酸性氨基酸残基的缺失。施用的单位剂量总数可以至少为2x、3x、4x、5x、6x、7x、8x、9x、10x单位剂量，优选至少2x(例如7x或14x)，只要当修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域，以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)时，在治疗期间施用的总剂量不超过170,000pg或7,070单位的上限；或者当修饰的BoNT/A包含一个或多个选自以下的氨基酸残基处的修饰时，不超过80,000pg或9,480单位：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，其中所述修饰选自：用碱性氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；用不带电荷的氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；用碱性氨基酸残基取代表面暴露的不带电荷的氨基酸残基；插入碱性氨基酸残基；和表面暴露的酸性氨基酸残基的缺失。施用的单位剂量总数可以是1x至20x(例如，12x至16x)、1x至15x、1x至14x或5x至14x,优选7x至14x，只要当修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域，以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)时，在治疗期间施用的总剂量不超过170,000pg或7,070单位的上限；或者当修饰的BoNT/A包含一个或多个选自以下的氨基酸残基处的修饰时，不超过80,000pg或9,480单位：ASN 886、ASN 905、GLN915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，其中所述修饰选自：用碱性氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；用不带电荷的氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；用碱性氨基酸残基取代表面暴露的不带电荷的氨基酸残基；插入碱性氨基酸残基；和表面暴露的酸性氨基酸残基的缺失。
技术人员将考虑受试者最近(或随后正在)用梭菌神经毒素(例如BoNT)进行额外治疗，例如作为美容治疗或针对不同适应症的治疗的一部分。使用本领域常规技术，技术人员将相应地调整本治疗方案。
当与未修饰的BoNT/A(例如)相比时，本发明的修饰的BoNT/A优选具有更长的作用持续时间(例如，在一种或多种症状中改善至少5％、10％、25％或50％)。所述作用持续时间可以是至少1.25x、1.5x、1.75x、2.0x或2.25x。修饰的BoNT/A的作用持续时间可以在6至9个月之间。例如，作用持续时间可以至少是：4.5个月(从发生开始)、5.0个月、5.5个月、6个月、6.5个月、7.0个月、7.5个月、8.0个月、8.5个月或9.0个月。在具体实施方案中，作用持续时间可以大于9.0个月。
当施用至多个受影响的颈部肌肉时，优选地所述施用发生在相同的治疗疗程中。
可以在施用修饰的BoNT/A后的适当时间段重复治疗。考虑到作用持续时间大约是未修饰的BoNT/A(例如)的两倍，后续施用之间的时间段比用未修饰的BoNT/A(例如)治疗的受试者适当地延长。可以在之前的施用后至少18、20、25或30周向受试者重新施用根据本发明的修饰的BoNT/A。例如，可以在之前的施用后至少18-45周，优选20-35周向受试者重新施用根据本发明的修饰的BoNT/A。
治疗的功效(包括受试者症状的严重程度)可以使用多伦多西部痉挛性斜颈评定量表(Toronto Western Spasmodic Torticollis Rating Scale，TWSTRS)进行评估，见Jost等人2013J Neural Transm(Vienna)120(3):487-496的综述。TWSTRS是一个复合量表，由TWSTRS-严重程度量表、TWSTRS-残疾量表和TWSTRS-疼痛量表组成。TWSTRS分数越高表明疾病越严重。TWSTRS-严重程度量表包括以下项目：A.最大偏移(旋转、倾斜、屈颈或伸颈、侧向移位、矢状移位)，B.持续时间因素，C.感觉技巧的作用，D.肩部抬高/前移，E.运动范围(不借助感觉技巧)，F.时间(患者能够在不使用感觉技巧的情况下将头部保持在中立位置10°内长达60秒)。A到F的总和最高为35分，持续时间因素加权两次。TWSTRS-残疾量表是一个六项目量表，包括对可能受到CD影响的日常活动表现的评估：工作表现(工作或家务)、日常生活活动(进食、穿衣、卫生)、驾驶、阅读、看电视以及户外休闲活动。每个项目按6分量表评分(0＝没有困难，5＝最高程度的残疾)，各项目的总和最高为30分。TWSTRS-疼痛量表由患者上周一般、最严重和最佳的疼痛严重程度评分，以及持续时间成分和疼痛对残疾影响的评估组成。评分范围在0到20之间，其中20分配给可能经历的最高疼痛。
本文使用的“受试者”可以是哺乳动物，例如人或其他哺乳动物。优选地，“受试者”是指人受试者。“受试者”优选是成年受试者，即至少18岁的受试者。术语“受试者”和“患者”在本文中作为同义词使用。
如本文所用，术语“治疗”或“治疗”包括预防性治疗(例如，防止病患发作)以及纠正性治疗(治疗已经患有病患的受试者)。如本文所用，优选地“治疗”或“治疗”是指纠正性治疗。如本文所用，术语“治疗”或“治疗”是指病患和/或其症状。
合适的修饰的BoNT/A多肽(以及编码其的核苷酸序列，如果存在的话)描述于WO2015/004461A1和WO2017/191315，两者均通过引用整体并入本文。
BoNT/A是由梭菌属细菌产生的梭菌神经毒素的一个例子。此类梭菌神经毒素的其他示例包括由破伤风梭状芽胞杆菌(C.Tetani，TeNT)和肉毒梭状芽胞杆菌(C.botulinum，BoNT)血清型B-G，以及巴拉特梭菌(C.Baratii)和丁酸梭菌(C.Butyricum)产生的神经毒素。所述神经毒素是高效且特异性的，并且能够毒害它们所递送到的神经元和其他细胞。梭菌毒素是已知最具毒力的毒素。举例来说，取决于血清型，肉毒杆菌神经毒素对小鼠具有0.5至5ng/kg的半数致死剂量(LD50)值。破伤风毒素和肉毒杆菌毒素均通过抑制受影响的神经元的功能，特别是抑制神经递质的释放而起作用。肉毒杆菌毒素作用于神经肌接头并抑制周围神经系统的胆碱能传递，而破伤风毒素作用于中枢神经系统。
在自然界中，梭菌神经毒素(包括BoNT/A)作为单链多肽合成，其在翻译后通过蛋白水解切割事件被修饰，形成通过二硫键连接在一起的两条多肽链。切割发生在特定的切割位点，通常称为活化位点，即，位于提供链间二硫键的半胱氨酸残基之间。正是这种双链形式作为毒素的活性形式。这两条链称为重链(H链)和轻链(L链)，其中重链(H链)的分子量约为100kDa，而轻链(L链)的分子量约为50kDa。H链包含N-末端易位组分(HN结构域)和C-末端靶向组分(HC结构域)。切割位点位于L链和易位结构域组分之间。在Hc结构域与其靶神经元结合并通过内体将结合的毒素内化到细胞中后，HN结构域使L链穿过内体膜易位并进入细胞质，L链提供蛋白酶功能(也称为非细胞毒性蛋白酶)。
非细胞毒性蛋白酶通过蛋白水解切割称为SNARE蛋白(例如SNAP-25、VAMP、或突触融合蛋白(Syntaxin))的细胞内转运蛋白发挥作用–参见Gerald K(2002)“Cell andMolecular Biology”(第4版)John Wiley&Sons,Inc.。首字母缩略词SNARE源自术语可溶性NSF附着受体(Soluble NSF Attachment Receptor)，其中NSF表示N-乙基马来酰亚胺敏感性因子(N-ethylmaleimide-Sensitive Factor)。SNARE蛋白是细胞内囊泡融合不可缺少的，并因此是通过囊泡转运从细胞分泌分子所不可缺少的。蛋白酶功能是锌依赖性内肽酶活性，并对SNARE蛋白表现出高的底物特异性。因此，一旦递送至目的靶细胞，非细胞毒性蛋白酶能够抑制靶细胞的细胞分泌。梭菌毒素的L链蛋白酶是切割SNARE蛋白的非细胞毒性蛋白酶。
鉴于SNARE蛋白的普遍存在的性质，梭状神经毒素(例如肉毒毒素)已成功应用于多种治疗中。
有关肉毒梭状芽胞杆菌(Clostridium botulinum)和破伤风梭状芽胞杆菌(C.tetani)产生毒素的遗传基础的更多详细信息，参见Henderson等人(1997)，Thelostridia:Molecular Biology and Pathogenesis,Academic press。
如上所述，梭菌神经毒素由两条多肽链，重链和轻链形成，重链(H链)的分子量约为100kDa，轻链(L链)的分子量约为50kDa。H链包含C-末端靶向组分(受体结合结构域或HC结构域)和N-末端易位组分(HN结构域)。
下面更详细地描述梭菌神经毒素结构域。
L链参考序列的示例包括：
A型肉毒杆菌神经毒素：氨基酸残基1-448
B型肉毒杆菌神经毒素：氨基酸残基1-440
以上鉴定的参考序列应被视为指导，因为根据血清亚型可能会发生细微变化。举例来说，US2007/0166332(通过引用整体并入本文)引用了略有不同的梭菌序列：
A型肉毒杆菌神经毒素：氨基酸残基M1-K448
B型肉毒杆菌神经毒素：氨基酸残基M1-K441
易位结构域是梭菌神经毒素的H链的片段(大约等同于H链的氨基端的一半)，或与完整H链中的该片段相对应的结构域。
参考易位结构域的示例包括：
A型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(449-871)
B型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(441-858)
以上鉴定的参考序列应被视为指导，因为根据血清亚型可能会发生细微变化。举例来说，US2007/0166332(通过引用整体并入本文)引用了略有不同的梭菌序列：
A型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(A449-K871)
B型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(A442-S858)
在本发明的上下文中，包含易位结构域的多种BoNT/A HN区可用于本发明的方面。BoNT/A重链的HN区长度约为410-430个氨基酸，包含易位结构域。研究表明，来自梭菌神经毒素重链的HN区的全长对于易位结构域的易位活性不是必需的。因此，该实施方案的方面可包括BoNT/A HN区，其包含长度为例如至少350个氨基酸、至少375个氨基酸、至少400个氨基酸或至少425个氨基酸的易位结构域。该实施方案的其他方面可以包括BoNT/A HN区，其包含长度为例如至多350个氨基酸、至多375个氨基酸、至多400个氨基酸或至多425个氨基酸的易位结构域。
术语HN包括天然存在的BoNT/A HN部分和修饰的BoNT/A HN部分，所述修饰的BoNT/A HN部分具有在自然界中不存在的氨基酸序列和/或合成的氨基酸残基。优选地，所述修饰的BoNT/A HN部分仍然表现出上述易位功能。
梭菌神经毒素受体结合域(HC)参考序列的示例包括：
BoNT/A-N872-L1296
BoNT/B-E859-E1291
梭菌神经毒素(例如BoNT)的约50kDa的HC结构域包含两个不同的结构特征，称为HCC和HCN结构域，每个结构特征通常为约25kDa。据信参与受体结合的氨基酸残基主要位于HCC结构域中。天然梭菌神经毒素的HC结构域可包含约400-440个氨基酸残基。以下出版物证实了这一事实，每个出版物均通过引用整体并入本文：Umland TC(1997)Nat.Struct.Biol.4:788-792；Herreros J(2000)Biochem.J.347:199-204；Halpern J(1993)J.Biol.Chem.268:15,pp.11188-11192；Rummel A(2007)PNAS104:359-364；LaceyDB(1998)Nat.Struct.Biol.5:898-902；Knapp(1998)Am.Cryst.Assoc.Abstract Papers25:90；Swaminathan and Eswaramoorthy(2000)Nat.Struct.Biol.7:1751-1759；andRummel A(2004)Mol.Microbiol.51(3),631-643.
(参考)HCN结构域的示例包括：
A型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(872-1110)
B型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(859-1097)
上述序列位置可能会根据血清型/亚型略有差别，(参考)HCN结构域的其他示例包括：
A型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(874-1110)
B型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(861-1097)
(参考)HCC结构域的示例包括：
A型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(Y1111-L1296)
B型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(Y1098-E1291)
L链和HN结构域(任选地包括完整或部分活化环，例如当修饰的BoNT/A为单链形式时的完整活化环和当为双链形式时的切割/部分活化环)可以统称为LHN结构域。因此LHN结构域不进一步包含HC结构域。
用于本发明的修饰的BoNT/A可以是在选自以下的一个或多个氨基酸残基处包含修饰的修饰的BoNT/A：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR1277。与使用已知的BoNT/A相比，这种修饰的BoNT/A表现出副作用的减少或不存在。与已知的梭菌毒素治疗剂相比，本发明的修饰的BoNT/A的增加的组织保留性质还提供了增加的效力和/或作用持续时间，并且可以允许使用减少的剂量(或增加的剂量而没有任何额外的副作用)，从而提供进一步的优势。
该修饰可以是与如SEQ ID NO:2所示的未修饰的BoNT/A相比时的修饰，其中氨基酸残基编号是通过与SEQ ID NO：2的比对确定的。由于在SEQ ID NO:2(以及对应于本文所述的修饰的BoNT/A多肽的SEQ ID NO)的第1位存在甲硫氨酸残基是任选的，技术人员在确定氨基酸残基编号时将考虑甲硫氨酸残基的存在/不存在。例如，其中SEQ ID NO：2包含甲硫氨酸，则位置编号将如上文所定义(例如ASN 886将是SEQ ID NO:2的ASN 886)。或者，当SEQ ID NO：2中不存在甲硫氨酸时，氨基酸残基编号应修改为-1(例如，ASN 886将是SEQ IDNO:2的ASN 885)。当本文所述的其他多肽序列的第1位存在/不存在甲硫氨酸时，类似的考虑适用，并且技术人员将使用本领域常规技术容易地确定正确的氨基酸残基编号。
本文描述的用于确定氨基酸残基编号的比对可以使用本文描述的用于确定序列同源性和/或％序列同一性的任何方法进行。
指出的用于修饰的氨基酸残基是表面暴露的氨基酸残基。
修饰的BoNT/A可以包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1052、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277。修饰的BoNT/A可以由与选自SEQ ID NO:3、5、7和9的核酸序列具有至少70％序列同一性的核酸序列编码。例如，与选自SEQ ID NO:3、5、7和9的核酸序列具有至少80％、90％、95％或99.9％序列同一性的核酸序列。优选地，用于本发明的修饰的BoNT/A可以由包含SEQ ID NO:3、5、7或9(或由其组成)的核酸编码。修饰的BoNT/A可以包含与选自SEQ ID NO:4、6、8和10的多肽序列具有至少70％序列同一性的多肽序列。例如，与选自SEQ ID NO:4、6、8和10的多肽序列具有至少80％、90％、95％或99.9％序列同一性的多肽序列。优选地，用于本发明的修饰的BoNT/A可以包含选自SEQ ID NO:4、6、8和10的多肽序列(更优选由其组成)。
当在修饰的BoNT/A的上下文中使用时，术语“一个或多个氨基酸残基”优选意指至少2、3、4、5、6或7个指定的氨基酸残基。因此，修饰的BoNT/A可以在指定的氨基酸残基处包含至少2、3、4、5、6或7个(优选7个)修饰。修饰的BoNT/A可以包含1-30、3-20或5-10个氨基酸修饰。更优选地，当在修饰的BoNT/A的上下文中使用时，术语“一个或多个氨基酸残基”意指所有指定的氨基酸残基。
优选地，当与SEQ ID NO:2相比时，除了指定氨基酸残基处的一个或多个氨基酸修饰之外，修饰的BoNT/A不含有任何进一步的氨基酸修饰。
最优选地，修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰(更优选由其组成)：ASN 886、ASN 930、SER 955、GLN 991、ASN 1026、ASN 1052和GLN 1229。修饰的BoNT/A可以由与SEQ ID NO：3具有至少70％序列同一性的核酸序列编码。例如，与SEQID NO:3具有至少80％、90％、95％或99.9％序列同一性的核酸序列。优选地，用于本发明的修饰的BoNT/A可以由包含SEQ ID NO:3(或由其组成)的核酸编码。修饰的BoNT/A可以包含与SEQ ID NO：4具有至少70％序列同一性的多肽序列。例如，与SEQ ID NO:4具有至少80％、90％、95％或99.9％序列同一性的多肽序列。优选地，用于本发明的修饰的BoNT/A可以包含SEQ ID NO：4(更优选由其组成)。
修饰可以选自：
i.用碱性氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；
ii.用不带电荷的氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；
iii.用碱性氨基酸残基取代表面暴露的不带电荷的氨基酸残基；
iv.插入碱性氨基酸残基；和
v.删除表面暴露的酸性氨基酸残基。
如上所述的修饰产生修饰的BoNT/A，与相应的未修饰的BoNT/A相比，其具有增加的正表面电荷和增加的等电点。
等电点(pI)是给定蛋白质的特定性质。如本领域众所周知的，蛋白质是由特定的氨基酸序列(当在蛋白质中时也称为氨基酸残基)组成的。二十个标准组中的每个氨基酸都有不同的侧链(或R基团)，这意味着蛋白质中的每个氨基酸残基显示出不同的化学特性，例如电荷和疏水性。这些特性可能会受到周围化学环境的影响，例如温度和pH值。蛋白质的整体化学特性取决于这些不同因素的总和。
某些氨基酸残基(如下详述)具有可电离侧链，其可根据周围pH显示电荷。这种侧链在给定pH下是否带电取决于相关可电离部分的pKa，其中pKa是来自共轭碱的指定质子的酸解离常数(Ka)的负对数。
例如，酸性残基，如天冬氨酸和谷氨酸的具有pKa值约为4.1的侧链羧酸基团(精确的pKa值可能取决于温度、离子强度和可电离基团的微环境)。因此，这些侧链在pH值为7.4(通常称为“生理pH值”)时表现出负电荷。在低pH值下，这些侧链将质子化并失去其电荷。
相反，碱性残基如赖氨酸和精氨酸具有含氮侧链基团，pKa值约为10-12。因此，这些侧链在pH值为7.4时表现出正电荷。这些侧链将在高pH值下去质子化并失去其电荷。
因此，蛋白质分子的总(净)电荷取决于蛋白质中存在的酸性和碱性残基的数量(及其表面暴露程度)以及周围的pH值。改变周围的pH值会改变蛋白质的总电荷。因此，对于每种蛋白质，都有一个给定的pH值，在该pH值下，正电荷和负电荷的数量相等，并且蛋白质总体不显示净电荷。该点称为等电点(pI)。等电点是技术人员熟悉的蛋白质生物化学中的标准概念。
因此，等电点(pI)定义为蛋白质表现出净电荷为零时的pH值。pI增加意味着蛋白质需要更高的pH值才能表现出净电荷为零。因此，pI的增加代表给定pH值下蛋白质净正电荷的增加。相反，pI的降低意味着蛋白质需要较低的pH值才能表现出净电荷为零。因此，pI的降低代表给定pH值下蛋白质净正电荷的减少。
确定蛋白质的pI的方法是本领域已知的并且是技术人员熟悉的。举例来说，蛋白质的pI可以根据蛋白质中存在的每个氨基酸的平均pKa值来计算(“计算的pI”)。这种计算可以使用本领域已知的计算机程序来进行，例如来自ExPASy的计算pI/MW工具(.expasy.org/compute_pi/)，其是根据本发明计算pI的优选方法。不同分子之间的pI值的比较应使用相同的计算技术/程序进行。
在适当的情况下，计算出的蛋白质pI可以使用等电聚焦技术通过实验进行确认(“观察到的pI”)。该技术使用电泳根据蛋白质的pI来分离蛋白质。等电聚焦通常使用具有固定pH梯度的凝胶进行。当施加电场时，蛋白质会通过pH梯度迁移，直到达到净电荷为零的pH值，这一点就是蛋白质的pI。由等电聚焦提供的结果本质上通常分辨率相对较低，因此本发明人相信由计算的pI(如上所述)提供的结果更适合使用。
在整个本说明书中，除非另有说明，“pI”表示“计算的pI”。
蛋白质的pI可以通过改变其表面上展示的碱性和/或酸性基团的数量来增加或减少。这可以通过修饰蛋白质的一个或多个氨基酸来实现。例如，pI的增加可以通过减少酸性残基的数量或通过增加碱性残基的数量来提供。
本发明的修饰的BoNT/A可以具有比未修饰的BoNT/A(例如SEQ ID NO：2)高至少0.2、0.4、0.5或1pI单位的pI值。优选地，修饰的BoNT/A可以具有至少6.6，例如至少6.8的pI。
20种标准氨基酸的特性如下表所示：
以下氨基酸被认为是带电的氨基酸：天冬氨酸(负电)、谷氨酸(负电)、精氨酸(正电)和赖氨酸(正电)。
在pH值为7.4时，天冬氨酸(pKa 3.1)和谷氨酸(pKa 4.1)的侧链带负电荷，而精氨酸(pKa 12.5)和赖氨酸(pKa 10.8)的侧链带正电荷。天冬氨酸和谷氨酸被称为酸性氨基酸残基。精氨酸和赖氨酸被称为碱性氨基酸残基。
以下氨基酸被认为是不带电荷的极性(意味着它们可以参与氢键结合)氨基酸：天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸和色氨酸。
以下氨基酸被认为是不带电荷的疏水氨基酸：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸和甘氨酸。
在氨基酸插入中，额外的氨基酸残基(通常不存在的氨基酸残基)被掺入BoNT/A多肽序列中，从而增加所述序列中氨基酸残基的总数。在氨基酸缺失中，从梭菌毒素氨基酸序列中除去氨基酸残基，从而减少所述序列中氨基酸残基的总数。
优选地，修饰是取代，其有利地在修饰的BoNT/A中保持相同数量的氨基酸残基。在氨基酸取代中，形成BoNT/A多肽序列的一部分的氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代。取代氨基酸残基可以是20种标准氨基酸之一，如上所述。或者，氨基酸取代中的取代氨基酸可以是非标准氨基酸(不属于上述20个标准组的一部分的氨基酸)。举例来说，取代氨基酸可以是碱性非标准氨基酸，例如L-鸟氨酸、L-2-氨基-3-胍基丙酸或赖氨酸、精氨酸和鸟氨酸的D-异构体。将非标准氨基酸引入蛋白质的方法是本领域已知的，并且包括使用大肠杆菌营养缺陷型表达宿主的重组蛋白质合成。
在一个实施方案中，取代选自：用碱性氨基酸残基取代酸性氨基酸残基、用不带电氨基酸残基取代酸性氨基酸残基、以及用碱性氨基酸取代不带电氨基酸残基。在一个实施方案中，其中取代是用不带电氨基酸残基取代酸性氨基酸残基，所述酸性氨基酸残基被其相应的不带电酰胺氨基酸残基取代(即天冬氨酸被天冬酰胺取代，而谷氨酸被谷氨酰胺取代)。
优选地，碱性氨基酸残基是赖氨酸残基或精氨酸残基。换句话说，取代是用赖氨酸或精氨酸取代。最优选地，修饰是用赖氨酸取代。
在根据本发明的修饰后，修饰的BoNT/A能够结合未修饰的BoNT/A(例如SEQ IDNO：2)结合的靶细胞受体。
用于本发明的修饰的BoNT/A可以包含位于梭菌毒素HCN结构域中的4至40个氨基酸修饰。所述修饰的BoNT/A还优选具有至少6.6的pI。所述修饰的BoNT/A优选包含选自以下的至少4个氨基酸的修饰：ASN 886、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、ASN 1025、ASN 1026和ASN 1052，其中所述修饰包括用赖氨酸残基或精氨酸残基取代氨基酸。例如，所述修饰的BoNT/A或其片段可以包含选自以下的至少5个氨基酸的修饰：ASN 886、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1052和GLN 1229，其中所述修饰包括用赖氨酸残基或精氨酸残基取代氨基酸。
本文所用的术语“修饰的BoNT/A”或“嵌合神经毒素”优选是指包含(优选由其组成)来自第一梭菌神经毒素血清型的梭菌神经毒素轻链和易位结构域(HN结构域)和源自不同的第二梭菌神经毒素血清型的受体结合结构域(HC结构域)。具体地，用于本发明的修饰的BoNT/A包含肉毒杆菌神经毒素A(BoNT/A)轻链和易位结构域(HN结构域)，以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。修饰的BoNT/A的BoNT/A LHN结构域与BoNT/B HC结构域共价连接。本发明的修饰的BoNT/A可以称为嵌合肉毒杆菌神经毒素。所述修饰的BoNT/A在本文中也称为“BoNT/AB”、“mrBoNT/AB”或“BoNT/AB嵌合体”。
最优选地，用于本发明的修饰的BoNT/A可以包含BoNT/A轻链和易位结构域(BoNT/A LHN结构域)和BoNT/B HC结构域。BoNT/A LHN结构域与BoNT/BHC结构域共价连接。所述修饰的BoNT/A在本文中也称为“BoNT/AB”、或“BoNT/AB嵌合体”。
LHN结构域的C-末端氨基酸残基可以对应于分隔BoNT/A的LHN和HC结构域的310螺旋的第一氨基酸残基，以及HC结构域的N-末端氨基酸残基可以对应于分隔BoNT/B中的LHN和HC结构域的310螺旋的第二氨基酸残基。
BoNT/B多肽序列的示例作为SEQ ID NO:16提供(UniProt登录号B1INP5)。
本文提及的“分隔BoNT/A的LHN和HC结构域的310螺旋的第一氨基酸残基”是指分隔LHN和HC结构域的310螺旋的N-末端残基。
本文提及的“分隔BoNT/B的LHN和HC结构域的310螺旋的第二氨基酸残基”是指分隔LHN和HC结构域的310螺旋的N-末端残基之后的氨基酸残基。
“310螺旋”是蛋白质和多肽中发现的一种二级结构类型，还有α螺旋、β折叠和反转。310螺旋中的氨基酸以右旋螺旋结构排列，其中每个完整的圈由三个残基和十个原子实现，这些原子将它们之间的分子内氢键分开。每个氨基酸对应于螺旋中的120°转角(即螺旋在每个圈具有3个残基)，沿螺旋轴平移并且在通过构成氢键形成的环中具有10个原子。最重要的是，氨基酸的N-H基团与比该氨基酸靠前三个残基的氨基酸的C＝O基团形成氢键；这个重复的i+3→i氢键定义为310螺旋。310螺旋是结构生物学中技术人员熟悉的标准概念。
该310螺旋对应于形成实际螺旋的四个残基和两个帽(或过渡)残基，在这四个残基的每一端都有一个帽残基。本文使用的术语“分隔LHN和HC结构域的310螺旋”由那6个残基组成。
通过进行结构分析和序列比对，鉴定出分隔LHN和HC结构域的310螺旋。该310螺旋在其N-末端(即LHN结构域的C-末端部分)被α螺旋包围，在其C-末端(即Hc结构域的N-末端部分)被β链包围。310螺旋的第一(N-末端)残基(帽或过渡残基)也对应于该α螺旋的C-末端残基。
分隔LHN和HC结构域的310螺旋可以例如从肉毒杆菌神经毒素的公开可用的晶体结构确定，例如分别针对肉毒杆菌神经毒素A1和B1的3BTA w.rcsb.org/pdb/explore/explore.do？structureId＝3BTA)和1EPW w.rcsb.org/pdb/explore/explore.do？structureId＝1EPW)。
公开可用的计算机建模和比对工具也可用于确定其他神经毒素中分隔LHN和HC结构域的310螺旋的位置，例如同源建模服务器LOOPP(学习、观察和输出蛋白质模式,p.org)、PHYRE(蛋白质同源/模拟识别引擎,w.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/)和Rosettaw.rosettacommons.org/)，蛋白质叠加服务器SuperPose t.biology.ualberta.ca/superpose/)、比对程序Clustal Omega w.clustal.org/omega/)以及分子和细胞生物学家的互联网资源l-tools.ca/)中列出的许多其他工具/服务。特别是，“HN/HCN”连接处周围的区域在结构上可高度保守，这使其成为叠加不同血清型的理想区域。
例如，以下方法可用于确定其他神经毒素中该310螺旋的序列：
1.结构同源建模工具LOOP p.org)可用于根据BoNT/A1晶体结构(3BTA.pdb)获得其他BoNT血清型的预测结构；
2.由此获得的结构(pdb)文件可以编辑为仅包含HCN结构域的N-末端及其之前的约80个残基(它们是HN结构域的一部分)，从而保留结构高度保守的“HN/HCN”区域；
3.蛋白质叠加服务器SuperPose t.biology.ualberta.ca/superpose/)可用于将每种血清型叠加到3BTA.pdb结构上；
4.可以检查叠加的pdb文件以定位BoNT/A1的HC结构域起始处的310螺旋，然后可以鉴定其他血清型中的相应残基。
5.其他BoNT血清型序列可以与Clustal Omega比对，以检查相应的残基是否正确。
通过该方法测定的LHN、HC和310螺旋结构域的示例如下所示：
使用结构分析和序列比对，发现分隔LHN和HC结构域的310螺旋后的β链是所有肉毒杆菌和破伤风神经毒素中的保守结构，并且从分隔LHN和HC结构域的310螺旋的第一残基开始时，该β链从第8残基开始(例如，BoNT/A1的残基879)。
BoNT/AB嵌合体可以包含与来自BoNT/B的HC结构域共价连接的来自BoNT/A的LHN结构域，其中LHN结构域的C-末端氨基酸残基对应于位于BoNT/A的HC结构域的起始端(N-末端)的β链N-末端第八氨基酸残基，并且其中HC结构域的N-末端氨基酸残基对应于位于BoNT/B的HC结构域的起始端(N-末端)的β链N-末端第七氨基酸残基。
BoNT/AB嵌合体可以包含与来自BoNT/B的HC结构域共价连接的来自BoNT/A的LHN结构域，其中LHN结构域的C-末端氨基酸残基对应于位于BoNT/A的LHN结构域的终止端(C-末端)的α螺旋的C-末端氨基酸残基，并且其中HC结构域的N-末端氨基酸残基对应于位于BoNT/B的LHN结构域的终止端(C-末端)的α螺旋的C-末端氨基酸残基的C-末端紧邻氨基酸残基。
BoNT/AB嵌合体设计过程的基本原理是尽量确保二级结构不受影响，从而最大限度地减少对三级结构和每个结构域功能的任何改变。不希望受理论束缚，假设通过不破坏BoNT/AB嵌合体中310螺旋的四个中心氨基酸残基，确保嵌合神经毒素的最佳构象，从而允许嵌合神经毒素发挥其作用，以充分发挥其功能。事实上，令人惊讶的是，仅保留BoNT/A的310螺旋的第一氨基酸残基和BoNT/B的310螺旋向前的第二氨基酸残基，不仅允许产生可溶性和功能性的BoNT/AB嵌合体，而且进一步导致比其他BoNT/AB嵌合体改进的特性，特别是增加的效力、增加的安全比和/或更长的作用持续时间(以及与未修饰的BoNT/A相比增加的安全比和/或作用持续时间)。
BoNT/A轻链、BoNT/A易位结构域和/或BoNT/B HC结构域可以是修饰的BoNT/A轻链、BoNT/A易位结构域、和/或BoNT/B HC结构域或其衍生物，包括但不限于下文描述的那些。修饰的BoNT/A轻链、BoNT/A易位结构域和/或BoNT/B HC结构域或衍生物可以含有与BoNT/A轻链、BoNT/A易位结构域和/或BoNT/B Hc结构域的天然的(未修饰的)形式相比已经修饰的一个或多个氨基酸，或者可以含有在BoNT/A轻链、BoNT/A易位结构域和/或BoNT/BHc结构域的天然的(未修饰的)形式中不存在的一个或多个插入氨基酸。举例来说，修饰的BoNT/A轻链、BoNT/A易位结构域和/或BoNT/B HC结构域可以在相对于天然(未修饰)的BoNT/A轻链、BoNT/A易位结构域和/或BoNT/B Hc结构域的一个或多个结构域中具有修饰的氨基酸序列。此类修饰可以改变其功能方面，例如生物活性或持久性。因此，在一个实施方案中，BoNT/A轻链、BoNT/A易位结构域和/或BoNT/B HC结构域是修饰的BoNT/A轻链、BoNT/A易位结构域和/或BoNT/B HC结构域，或修饰的BoNT/A轻链、BoNT/A易位结构域和/或BoNT/BHC结构域衍生物。
修饰的BoNT/B Hc结构域可以具有一个或多个改变与靶神经细胞结合的修饰，例如，当与天然(未修饰)的BoNT/B HC结构域相比时，提供更高或更低的亲和力结合。在BoNT/B HC结构域中这样的修饰可包括修饰在HC结构域的神经节苷脂结合位点中的残基，或修饰在改变与神经节苷脂受体和/或靶神经细胞的蛋白受体的结合的蛋白(例如，突触结合蛋白)结合位点中的残基。此类修饰的神经毒素的示例描述于WO 2006/027207和WO 2006/114308中，二者均在此通过引用整体并入本文。
修饰的轻链可在其氨基酸序列中具有一个或多个修饰，例如在底物结合或催化结构域中的修饰，其可改变或修饰修饰的轻链的SNARE蛋白特异性，优选地条件是所述修饰不会催化失活所述轻链。此类修饰的神经毒素的示例描述于WO 2010/120766和US2011/0318385中，二者均在此通过引用整体并入本文。
来自BoNT/A的LHN结构域可以对应于SEQ ID NO：2的氨基酸残基1至872，或与其具有至少70％序列同一性的多肽序列。来自BoNT/A的LHN结构域可以对应于SEQ ID NO：2的氨基酸残基1至872，或与其具有至少80％、90％或95％序列同一性的多肽序列。优选地，来自BoNT/A的LHN结构域对应于SEQ ID NO：2的氨基酸残基1至872。
来自BoNT/B的HC结构域可以对应于SEQ ID NO：16的氨基酸残基860至1291，或与其具有至少70％序列同一性的多肽序列。来自BoNT/B的HC结构域可以对应于SEQ ID NO：16的氨基酸残基860至1291，或与其具有至少80％、90％或95％序列同一性的多肽序列。优选地，来自BoNT/B的HC结构域对应于SEQ ID NO：16的氨基酸残基860至1291。
优选地，BoNT/AB嵌合体包含BoNT/A1 LHN结构域和BoNT/B1 HC结构域。更优选地，LHN结构域对应于BoNT/A1(SEQ ID NO：2)的氨基酸残基1至872，并且HC结构域对应于BoNT/B1(SEQ ID NO：16)的氨基酸残基860至1291。
优选地，与天然BoNT/B序列相比，BoNT/B HC结构域还在HCC子结构域中包含至少一个氨基酸残基取代、添加或缺失，其具有增加BoNT/B神经毒素对人Syt II的结合亲和力的作用。BoNT/B HCC子结构域中合适的氨基酸残基取代、添加或缺失已经公开于WO 2013/180799和WO 2016/154534中(均通过引用并入本文)。
BoNT/B HCC子结构域中合适的氨基酸残基取代、添加或缺失可以包括选自以下的取代突变：V1118M；Y1183M；E1191M；E1191I；E1191Q；E1191T；S1199Y；S1199F；S1199L；S1201V；E1191C，E1191V，E1191L，E1191Y，S1199W，S1199E，S1199H，W1178Y，W1178Q，W1178A，W1178S，Y1183C，Y1183P，及其组合。
BoNT/B HCC子结构域中合适的氨基酸残基取代、添加或缺失还可以包括选自以下的两个取代突变的组合：E1191M和S1199L,E1191M和S1199Y,E1191M和S1199F,E1191Q和S1199L,E1191Q和S1199Y,E1191Q和S1199F,E1191M和S1199W,E1191M和W1178Q,E1191C和S1199W,E1191C和S1199Y,E1191C和W1178Q,E1191Q和S1199W,E1191V和S1199W,E1191V和S1199Y,或E1191V和W1178Q。
BoNT/B HCC子结构域中合适的氨基酸残基取代、添加或缺失还可以包括三个取代突变的组合，即E1191M、S1199W和W1178Q。
最优选地，BoNT/B HCC子结构域中合适的氨基酸残基取代、添加或缺失包括两个取代突变的组合，即E1191M和S1199Y。此类修饰存在于，例如，BoNT/AB嵌合体SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14中。
该修饰可以是与如SEQ ID NO:16所示的未修饰的BoNT/B相比时的修饰，其中氨基酸残基编号是通过与SEQ ID NO：16的比对确定的。由于在SEQ ID NO:16(以及对应于本文所述的修饰的BoNT/A多肽的SEQ ID NO)的第1位存在甲硫氨酸残基是任选的，技术人员在确定氨基酸残基编号时将考虑甲硫氨酸残基的存在/不存在。例如，其中SEQ ID NO：16包含甲硫氨酸，则位置编号将如上文所定义(例如E1191将是SEQ ID NO:16的E1191)。或者，当SEQ ID NO：16中不存在甲硫氨酸时，氨基酸残基编号应修改为-1(例如，E1191将是SEQ IDNO:16的E1190)。当本文所述的其他多肽序列的第1位存在/不存在甲硫氨酸时，类似的考虑适用，并且技术人员将使用本领域常规技术容易地确定正确的氨基酸残基编号。
用于本发明的修饰的BoNT/A可以包含与选自SEQ ID NO:11-15的多肽序列具有至少70％序列同一性的多肽序列。例如，与选自SEQ ID NO:11-15的多肽序列具有至少80％、90％、95％或99.9％序列同一性的多肽序列。优选地，用于本发明的修饰的BoNT/A可以包含选自SEQ ID NO:11-15的多肽序列(更优选由其组成)。
当修饰的BoNT/A是BoNT/AB嵌合体时，优选修饰的BoNT/A包含与SEQ ID NO:14具有至少70％序列同一性的多肽序列。例如，与SEQ ID NO:14具有至少80％、90％、95％或99.9％序列同一性的多肽序列。最优选地，用于本发明的修饰的BoNT/A可以包含SEQ IDNO：14(更优选由其组成)。
通过取代、插入或删除氨基酸残基修饰蛋白质的方法是本领域已知的。举例来说，可以通过编码BoNT/A(例如编码未修饰的BoNT/A)的DNA序列的修饰来引入氨基酸修饰。这可以使用标准的分子克隆技术来实现，例如通过定点诱变，通过使用聚合酶，其中编码所需氨基酸的短链DNA(寡核苷酸)用于代替原始编码序列，或通过用各种酶(例如连接酶和限制性核酸内切酶)插入/删除基因的一部分。或者，可以化学合成修饰的基因序列。
当本文所述的修饰的BoNT/A的多肽序列包含例如用于纯化的标签，例如His标签时，所述标签是任选的。优选地，在使用根据本发明的修饰的BoNT/A之前去除所述标签。
如上所讨论的，本文所述的修饰的BoNT/A具有增加的组织保留特性，其还提供增加的效力和/或作用持续时间，并且可以允许增加剂量而没有任何额外的负面影响。定义这些有利特性的一种方式是根据修饰的BoNT/A的安全比。在这方面，可以通过测量相关动物模型(例如小鼠，其中在施用7天内检测体重丧失)中体重丧失的百分比来实验性地评估梭菌毒素不希望的影响(由毒素从施用部位扩散导致)。相反，可以通过趾外展分数(DigitalAbduction Score，DAS)测定法(肌肉麻痹的测量)来实验性地评估梭菌毒素的预期目标效应。DAS测定法可通过将20μl在磷酸明胶缓冲液中配制的梭菌毒素注射到小鼠腓肠肌/比目鱼肌复合体中进行，然后使用Aoki方法(Aoki KR,Toxicon39:1815-1820；2001)评估趾外展分数。在DAS测定法中，将小鼠经尾巴短暂悬挂，以引发特有的惊吓反应，其中小鼠伸出后肢并外展其后趾。梭菌毒素注射后，不同程度的趾外展按五分量表评分(0＝正常，4＝趾外展和腿伸展最大程度减少)。
然后，本发明的修饰的BoNT/A(或用于比较的未修饰的BoNT/A)的安全比可表示为体重下降10％所需的毒素量(在小鼠给药后前7天内的峰值效应时测量)与DAS分数为2所需的毒素量之间的比率。因此，高安全比分数是理想的，表明毒素能够有效地麻痹目标肌肉，而几乎没有不希望的脱靶效应。本发明的修饰的BoNT/A的安全比高于同等的未修饰的(天然)BoNT/A的安全比。
高安全比在治疗中特别有利，因为它代表治疗指数的增加。换句话说，这意味着与替代的梭菌神经毒素治疗剂相比可以使用减少的剂量和/或可以使用增加的剂量而没有任何额外的(例如有害的)作用。有害作用包括全身毒性和不希望的向邻近肌肉的扩散。使用更高剂量的神经毒素而没有额外作用的可能性是特别有利的，因为更高的剂量通常导致神经毒素的作用持续时间更长。
修饰的BoNT/A的效力可以表示为当施用于小鼠腓肠肌/比目鱼肌复合体时，导致给定DAS分数的神经毒素的最小剂量，例如DAS分数为2(ED50剂量)或DAS分数为4。修饰的BoNT/A的效力还可以表示为在测量神经毒素对SNARE切割的细胞测定法中的EC50剂量，例如在测量修饰的BoNT/A对SNAP25切割的细胞测定法中的EC50剂量。
修饰的BoNT/A的作用持续时间可以表示为向小鼠腓肠肌/比目鱼肌复合体施用给定剂量的神经毒素后恢复DAS分数为0所需的时间，所述给定剂量为，例如导致DAS分数为4的神经毒素的最小剂量。
因此，在一个实施方案中，本发明的修饰的BoNT/A具有大于7(例如，至少8、9、10、15、20、25、30、35、40、45或50)的安全比，其中安全比计算为：-10％体重变化所需的毒素剂量(pg/小鼠)除以DAS ED50(pg/小鼠)[ED50＝产生DAS评分为2所需的剂量]。
在一个实施方案中，本发明的修饰的BoNT/A具有至少10的安全比。在一个实施方案中，本发明的修饰的BoNT/A具有至少15的安全比。
优选地，其中修饰的BoNT/A是包含一个或多个选自以下的氨基酸残基的BoNT/A：ASN 886、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1052、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，如本文所述，所述修饰的BoNT/A具有至少20、更优选至少22(例如23-25)的安全比。
优选地，当修饰的BoNT/A是包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B HC结构域的BoNT/A时，所述修饰的BoNT/A具有至少10、更优选至少12的安全比(例如14-15)。
修饰的BoNT/A优选为非复合形式(即不含天然存在于BoNT/A中的复合蛋白)。这种复合蛋白的示例包括神经毒素相关蛋白(NAP)和无毒非血凝素成分(NTNH)。然而，优选修饰的BoNT/A是重组修饰的BoNT/A。本发明的这种修饰的BoNT/A可以使用重组核酸技术来产生。
在一个实施方案中，提供了包含编码修饰的BoNT/A的核酸序列的核酸(例如，DNA)。在一个实施方案中，将核酸序列制备为包含启动子和终止子的DNA载体的一部分。核酸序列可以选自本文描述的任何核酸序列。
在优选的实施方案中，载体具有选自以下的启动子：
启动子 诱导剂 典型诱导条件
Tac(杂合) IPTG 0.2mM(0.05-2.0mM)
AraBAD L-阿拉伯糖 0.2％(0.002-0.4％)
T7-lac操纵子IPTG 0.2mM(0.05-2.0mM)
在另一个优选的实施方案中，载体具有选自以下的启动子：
启动子 诱导剂 典型诱导条件
Tac(杂合) IPTG 0.2mM(0.05-2.0mM)
AraBAD L-阿拉伯糖 0.2％(0.002-0.4％)
T7-lac操纵子 IPTG 0.2mM(0.05-2.0mM)
T5-lac操纵子 IPTG 0.2mM(0.05-2.0mM)
可以使用本领域已知的任何合适方法来制备核酸分子。因此，可以使用化学合成技术来制备核酸分子。或者，可以使用分子生物学技术来制备本发明的核酸分子。
本发明的DNA构建体优选在计算机上设计，然后通过常规DNA合成技术合成。
根据将使用的最终宿主细胞(例如大肠杆菌)表达系统，任选地修饰上述核酸序列信息以用于密码子偏好。
术语“核苷酸序列”和“核酸”在本文中同义使用。优选地，核苷酸序列是DNA序列。
本发明的修饰的BoNT/A可以作为单链或作为双链存在。然而，优选修饰的BoNT/A作为双链存在，其中L链通过二硫键连接至H链(或其组分，例如HN结构域)。
具有轻链和重链的单链修饰的BoNT/A的产生可以使用以下方法来实现，该方法包括在表达宿主中表达编码修饰的BoNT/A的核酸，裂解宿主细胞以提供含有单链修饰的BoNT/A的宿主细胞匀浆，以及分离单链修饰的BoNT/A。本文所述的单链修饰的BoNT/A可以使用以下方法进行蛋白水解加工，所述方法包括使单链修饰的BoNT/A与蛋白酶接触，所述蛋白酶水解修饰的BoNT/A的活化环中的肽键，从而将单链修饰的BoNT/A转换为相应的双链修饰的BoNT/A(例如，其中轻链和重链通过二硫键连接在一起)。双链修饰的BoNT/A优选可通过这样的方法获得。
因此，本发明中使用的修饰的BoNT/A优选是由单链BoNT/A产生的双链修饰的BoNT/A，其中所述单链BoNT/A包含本文所述的多肽序列或由其组成。例如，优选地，本发明中使用的修饰的BoNT/A是双链修饰的BoNT/A，其由多肽产生，所述多肽包含与SEQ ID NO:14具有至少70％(例如至少80％、90％、95％或99.9％)序列同一性的多肽序列。最优选地，本发明中使用的修饰的BoNT/A是双链修饰的BoNT/A，其由包含SEQ ID NO:14(甚至更优选由其组成)的多肽产生。因此，在一些实施方案中，修饰的BoNT/A是双链修饰的BoNT/A，其中轻链(L链)通过二硫键连接至重链(H链)，所述修饰的BoNT/A可通过以下方法获得，所述方法包括使包含SEQ ID NO:14的单链修饰的BoNT/A与蛋白酶接触，所述蛋白酶水解其活化环中的肽键，从而将单链修饰的BoNT/A转换为相应的双链修饰的BoNT/A。在一些实施方案中，修饰的BoNT/A是双链修饰的BoNT/A，其中L链通过二硫键连接至H链，所述修饰的BoNT/A可通过以下方法获得，所述方法包括使由SEQ ID NO:14组成的单链修饰的BoNT/A与蛋白酶接触，所述蛋白酶水解其活化环中的肽键，从而将单链修饰的BoNT/A转化为相应的双链修饰的BoNT/A。
在一个实施方案中，本发明中使用的修饰的BoNT/A是从多肽产生的双链修饰的BoNT/A，所述多肽包含与SEQ ID NO:4具有至少70％(例如至少80％、90％、95％或99.9％)序列同一性的多肽序列。优选地，本发明中使用的修饰的BoNT/A是双链修的BoNT/A，其由包含SEQ ID NO:4(更优选由其组成)的多肽产生。因此，在一些实施方案中，修饰的BoNT/A是双链修饰的BoNT/A，其中轻链(L链)通过二硫键连接至重链(H链)，所述修饰的BoNT/A可通过以下方法获得，所述方法包括使包含SEQ ID NO:4的单链修饰的BoNT/A与蛋白酶接触，所述蛋白酶水解其活化环中的肽键，从而将单链修饰的BoNT/A转换为相应的双链修饰的BoNT/A。在一些实施方案中，修饰的BoNT/A是双链修饰的BoNT/A，其中L链通过二硫键连接至H链，所述修饰的BoNT/A可通过以下方法获得，所述方法包括使由SEQ ID NO:4组成的单链修饰的BoNT/A与蛋白酶接触，所述蛋白酶水解其活化环中的肽键，从而将单链修饰的BoNT/A转化为相应的双链修饰的BoNT/A。
如本文所用的术语“可获得的”还包括术语“获得的”。在一个实施方案中，术语“可获得”是指获得。
用于切割活化环的蛋白酶优选Lys-C。用于切割活化环以产生双链梭菌神经毒素的合适的蛋白酶和方法教导于WO 2014/080206、WO2014/079495和EP2677029A2，其通过引用并入本文。Lys-C可以切割其中存在的一个或多个赖氨酸残基的C-端的活化环。当Lys-C多次切割活化环时，技术人员将理解，当与本文所示的SEQ ID NO相比时，双链修饰的BoNT/A的活化环的小肽可能不存在。
本发明的修饰的BoNT/A可以以任何合适的方式配制以施用给受试者，例如作为药物组合物的一部分配制。因此，一方面，本发明提供了药物组合物，其包含本发明的修饰的BoNT/A和药学上可接受的运载体、赋形剂、佐剂和/或盐。
液体剂型通常使用修饰的BoNT/A和无热原的无菌载体来制备。根据所使用的载体和浓度，修饰的BoNT/A可以溶解或悬浮在载体中。在制备溶液时，可以将修饰的BoNT/A溶解在载体中，如有必要，可通过添加氯化钠使溶液等渗，并使用无菌技术通过无菌过滤器过滤灭菌，然后填充到合适的无菌小瓶或安瓿瓶中并密封。或者，如果溶液的稳定性足够，则可以通过高压灭菌对密封容器中的溶液进行灭菌。有利地，可以将添加剂溶解在载体中，所述添加剂例如为缓冲剂、增溶剂、稳定剂、防腐剂或杀菌剂、助悬剂或乳化剂和/或局部麻醉剂。
通过使用无菌技术在无菌区域将预先灭菌的成分填充到无菌容器中，可以制备干粉，以在使用前溶解或悬浮在合适的载体中。可替代地，可以使用无菌技术在无菌区域中将成分溶解到合适的容器中。然后将产品冷冻干燥，并将容器无菌密封。
以基本上相同的方式制备适合于本文所述的施用途径的肠胃外悬浮剂，不同之处在于将无菌组分悬浮在无菌载体中，而不是溶解，并且不能通过过滤来实现灭菌。可以以无菌状态分离组分，或者可选地，可以在分离后例如通过γ辐射将其灭菌。
有利地，在一种或多种组合物中包括助悬剂，例如聚乙烯吡咯烷酮，以促进组分的均匀分布。
另一方面，本发明提供了用于治疗颈肌张力障碍的修饰的肉毒杆菌神经毒素A(BoNT/A)的单位剂型，所述单位剂型包含：
a.31-707单位的修饰的BoNT/A，其中1单位是对应于小鼠中计算的半数致死剂量(LD50)的修饰的BoNT/A的量；或者
b.750Pg至17,000pg修饰的BoNT/A；和
c.任选地药学上可接受的运载体、赋形剂、佐剂和/或盐，
其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域，以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
优选地，单位剂型的修饰的BoNT/A包含与SEQ ID NO：14具有至少70％序列同一性的多肽序列。例如，与SEQ ID NO:14具有至少80％、90％、95％或99.9％序列同一性的多肽序列。最优选地，修饰的BoNT/A可以包含SEQ ID NO：14(更优选由其组成)。
用于治疗颈肌张力障碍的单位剂型可以包含750pg至17,000pg的修饰的BoNT/A，其中750pg至17,000pg的修饰的BoNT/A，其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域和BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。单位剂量范围的上限可以是16,500、15,500、14,500、13,500、12,500、11,500、10,500、9,500、8,500、7,500、6,500、5,500、4,500、3,500、2,500、2,250、2,000、1,500、1,250、1,000或750pg的修饰BoNT/A，优选上限为16,000pg。单位剂量范围的下限可以是800、850、950、1,000、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、3,500、4,000、4,500或5,000pg的修饰的BoNT/A，优选下限是1,000pg。优选地，修饰的BoNT/A的单位剂量是1,000pg至16,000pg的修饰的BoNT/A，例如950pg至1,250pg、1,750pg至2,250pg、或8,000pg至12,000pg。优选地，修饰的BoNT/A的单位剂量可以是1,000、2,000、3,000、8,000或16,000pg。
用于治疗颈肌张力障碍的单位剂型可包含31单位至707单位的修饰的BoNT/A，其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域，以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。单位剂量范围的上限可以是700、650、600、550、500、450、400、350、300、250、200、150、100、95、90、85、65、60、55、50或31单位的修饰BoNT/A，优选上限为666单位。单位剂量范围的下限可以是35、40、45、50、60、65、70、75、80、85、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650或700单位的修饰的BoNT/A，优选下限是42单位。优选地，修饰的BoNT/A的单位剂量是42单位至666单位的修饰的BoNT/A，例如40单位至50单位、70单位至95单位、或333单位至499单位。优选地，修饰的BoNT/A的单位剂量可以是41.6单位、83.2单位、124.8单位、332.8单位或665.6单位。
另一方面，本发明提供了用于治疗颈肌张力障碍的修饰的肉毒杆菌神经毒素A(BoNT/A)的单位剂型，所述单位剂型包含：
a.53U至948U单位的修饰的BoNT/A，其中1单位是对应于小鼠中计算的半数致死剂量(LD50)的修饰的BoNT/A的量；或者
b.450Pg至8,000pg修饰的BoNT/A；和
c.任选地药学上可接受的运载体、赋形剂、佐剂和/或盐，
其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274、和THR 1277，其中所述修饰选自：
i.用碱性氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；
ii.用不带电荷的氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；
iii.用碱性氨基酸残基取代表面暴露的不带电荷的氨基酸残基；
iv.插入碱性氨基酸残基；和
v.删除表面暴露的酸性氨基酸残基。
用于治疗颈肌张力障碍的单位剂型可包含450pg至8,000pg的修饰的BoNT/A，其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274、和THR 1277，其中所述修饰选自：(i)用碱性氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；(ii)用不带电荷的氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；(iii)用碱性氨基酸残基取代表面暴露的不带电荷的氨基酸残基；(iv)插入碱性氨基酸残基；(v)删除表面暴露的酸性氨基酸残基。该范围的上限可以是7,750、7,500、7,000、6,000、5,000、4,000、3,000、2,000或1,000pg的修饰的BoNT/A，优选上限是7,500pg。该范围的下限可以是475、500、600、700、800、900、1,000、1,500、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000或7,000pg的修饰的BoNT/A，优选下限是500pg。优选地，单位剂型包含500pg至7,500pg的修饰的BoNT/A，例如4,000pg至6,000pg。最优选地，单位剂型包含2,000pg至3,000pg，例如2,400pg至2,600pg。
用于治疗颈肌张力障碍的单位剂型可包含53单位至948单位的修饰的BoNT/A，其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274、和THR 1277，其中所述修饰选自：(i)用碱性氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；(ii)用不带电荷的氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；(iii)用碱性氨基酸残基取代表面暴露的不带电荷的氨基酸残基；(iv)插入碱性氨基酸残基；(v)删除表面暴露的酸性氨基酸残基。该范围的上限可以是925、900、850、800、750、700、650、600、550、500、450、400、350、300、250、200、150或100单位的修饰的BoNT/A，优选地，上限为889个单位。该范围的下限可以是55、60、65、70、75、80、85、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850或900单位的修饰的BoNT/A，优选下限为59单位。优选地，单位剂型包含59单位至889单位的修饰的BoNT/A，例如200单位至600单位。最优选地，单位剂型包含237单位至355单位，例如284单位至308单位。
在另一个方面，本发明提供了一种试剂盒，其包含：
a.根据本发明的单位剂型；和
b.用于治疗颈肌张力障碍的说明书；和
c.任选地，稀释剂。
与本发明的各种治疗用途相关的实施方案可以应用于本发明的方法、组合物(例如单位剂型)和试剂盒，反之亦然。
序列同源性
多种序列比对方法中的任何都可以用于确定同一性百分比，包括但不限于全局方法、局部方法和混合方法，例如区段方法。确定同一性百分比的方案是本领域技术人员范围内的常规程序。全局方法从分子的开始到结束比对序列，并通过累加各个残基对的分数和通过施加空位罚分来确定最佳比对。非限制性方法包括，例如CLUSTAL W，参见例如，JulieD.Thompson等人,CLUSTAL W:Improving the Sensitivity of Progressive MultipleSequence Alignment Through Sequence Weighting,Position-Specific Gap Penaltiesand Weight Matrix Choice,22(22)Nucleic Acids Research 4673-4680(1994)；和迭代改进，参见例如，Osamu Gotoh,Significant Improvement in Accuracy of MultipleProtein Sequence Alignments by Iterative Refinement as Assessed by Referenceto Structural Alignments,264(4)J.MoI.Biol.823-838(1996)。局部方法通过鉴定所有输入序列共有的一个或多个保守基序来比对序列。非限制性方法包括，例如火柴盒(Match-box)，参见例如Eric Depiereux and Ernest Feytmans,Match-Box:A Fundamentally NewAlgorithm for the Simultaneous Alignment of Several Protein Sequences,8(5)CABIOS 501 -509(1992)；Gibbs采样，参见例如C.E.Lawrence等人,Detecting SubtleSequence Signals:A Gibbs Sampling Strategy for Multiple Alignment,262(5131)Science 208-214(1993)；Align-M，参见，例如，Ivo Van WaIIe等人，Align-M-A NewAlgorithm for Multiple Alignment of Highly Divergent Sequences,20(9)Bioinformatics:1428-1435(2004)。
因此，通过常规方法确定序列同一性百分比。参见，例如，Altschul等人,Bull.Math.Bio.48:603-16,1986and Henikoff and Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915-19,1992。简而言之，如下所示，使用空位开放罚分10，空位延伸罚分1，以及Henikoff和Henikoff的“blosum 62”评分矩阵(同上)对两个氨基酸序列进行比对，以优化比对分数(氨基酸由标准的单字母代码表示)；优选地，该方法用于比对序列与本文的主题序列(例如SEQ ID NO：2)，以限定如本文所述的氨基酸位置编号。
两个或更多个核酸或氨基酸序列之间的“序列同一性百分比”是该序列共有的相同位置数目的函数。因此，同一性％可以计算为相同核苷酸/氨基酸的数目除以核苷酸/氨基酸的总数，再乘以100。％序列同一性的计算也可以考虑需要引入以优化两个或更多个序列比对的空位的数目，以及每个空位的长度。可以使用本领域技术人员熟悉的特定数学算法(例如BLAST)进行序列比较和确定两个或多个序列之间的同一性百分比。
确定序列同一性的比对分数
然后，百分比同一性计算为：
基本上同源的多肽的特征在于具有一个或多个氨基酸取代、缺失或添加。这些变化优选是不重要的，即，保守的氨基酸取代(见下文)和不显著影响多肽折叠或活性的其他取代；小的缺失，通常缺失1至约30个氨基酸；和小的氨基或羧基末端延伸，例如氨基末端甲硫氨酸残基，最多约20-25个残基的小接头肽或亲和标签。
保守氨基酸取代
碱性：精氨酸
赖氨酸
组氨酸
酸性：谷氨酸
天冬氨酸
极性：谷氨酰胺
天冬酰胺
疏水性：亮氨酸
异亮氨酸
缬氨酸
芳香族：苯丙氨酸
色氨酸
酪氨酸
小的：甘氨酸
丙氨酸
丝氨酸
苏氨酸
甲硫氨酸
除20个标准氨基酸外，非标准氨基酸(例如4-羟基脯氨酸、6-N-甲基赖氨酸、2-氨基异丁酸、异缬氨酸和α-甲基丝氨酸)可以取代本发明多肽的氨基酸残基。有限数量的非保守氨基酸、不是由遗传密码子编码的氨基酸和非天然氨基酸可以取代多肽氨基酸残基。本发明的多肽还可以包含非天然存在的氨基酸残基。
非天然存在的氨基酸包括但不限于，反式-3-甲基脯氨酸、2,4-甲醇基-脯氨酸、顺式-4-羟基脯氨酸、反式-4-羟基脯氨酸、N-甲基甘氨酸、别苏氨酸、甲基苏氨酸、羟乙基半胱氨酸、羟乙基高半胱氨酸、硝基谷氨酰胺、高谷氨酰胺、哌啶酸、叔亮氨酸、正缬氨酸、2-氮杂苯丙氨酸、3-氮杂苯丙氨酸、4-氮杂苯丙氨酸和4-氟苯丙氨酸。用于将非天然存在的氨基酸残基并入蛋白中的几种方法是本领域已知的。例如，可以使用体外系统，其中使用化学氨酰化的抑制子tRNA抑制无义突变。合成氨基酸和氨酰化tRNA的方法是本领域已知的。包含无义突变的质粒的转录和翻译是在无细胞系统中进行的，该系统包含大肠杆菌S30提取物以及可商购的酶和其他试剂。蛋白通过色谱法纯化。参见，例如，Robertson等人,J.Am.Chem.Soc.113:2722,1991；Ellman等人,Methods Enzymol.202:301,1991；Chung等人,Science259:806-9,1993；和Chung等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:10145-9,1993)。在第二种方法中，通过显微注射突变的mRNA和化学氨酰化的抑制子tRNA在非洲爪蟾卵母细胞中进行翻译(Turcatti等人,J.Biol.Chem.271:19991-8,1996)。在第三种方法中，在不存在待替代的天然氨基酸(例如，苯丙氨酸)和存在期望的非天然存在的氨基酸(例如，2-氮杂苯丙氨酸、3-氮杂苯丙氨酸、4-氮杂苯丙氨酸或4-氟苯丙氨酸)的情况下培养大肠杆菌细胞。将非天然存在的氨基酸并入多肽，代替其天然对应物。参见，Koide等人,Biochem.33:7470-6,1994。可通过体外化学修饰将天然存在的氨基酸残基转化为非天然存在的物质。化学修饰可以与定点诱变组合使用，以进一步扩大取代范围(Wynn and Richards,ProteinSci.2:395-403,1993)。
有限数量的非保守氨基酸、不是由遗传密码子编码的氨基酸、非天然存在的氨基酸和非天然氨基酸可以取代本发明多肽的氨基酸残基。
可以根据本领域已知的程序来鉴定本发明多肽中的必需氨基酸，例如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham and Wells,Science 244:1081-5,1989)。也可以通过结构的物理分析来确定生物相互作用的位点，如通过核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记等技术，结合假定的接触位点氨基酸突变来确定。参见，例如，de Vos等人,Science 255:306-12,1992；Smith et al.,J.Mol.Biol.224:899-904,1992；Wlodaver等人,FEBS Lett.309:59-64,1992。还可以从与本发明多肽的相关组分(例如易位或蛋白酶组分)的同源性分析中推断出必需氨基酸的鉴定。
可以使用诱变和筛选的已知方法进行多种氨基酸取代，并进行测试，例如Reidhaar-Olson and Sauer(Science 241:53-7,1988)或Bowie and Sauer(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:2152-6,1989)中公开的那些方法。简而言之，这些作者公开了同时使多肽中的两个或更多个位置随机化，选择功能性多肽，然后对诱变的多肽进行测序以确定每个位置上允许取代的谱的方法。可以使用的其他方法包括噬菌体展示(例如，Lowman等人,Biochem.30:10832-7,1991；Ladner等人,美国专利号5,223,409；Huse,WIPO公开WO 92/06204)和区域定向诱变(Derbyshire等人,Gene 46:145,1986；Ner等人,DNA 7:127,1988)。
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。Singleton等人,DICTIONARY OF MICROBIOLOGY ANDMOLECULAR BIOLOGY,第20版,John Wiley and Sons,New York(1994),和Hale&Marham,THEHARPER COLLINSDICTIONARY OF BIOLOGY,Harper Perennial,NY(1991)，为熟练的技术人员提供了本公开中使用的许多术语的通用词典。
本公开内容不受本文公开的示例性方法和材料的限制，并且与本文描述的那些方法或材料类似或等同的任何方法和材料都可以用于本公开内容的实施方案的实践或测试。数字范围包括定义范围的数字。除非另有说明，否则任何核酸序列都以5'至3'的方向从左至右书写；氨基酸序列分别以氨基至羧基的方向从左至右书写。
本文提供的标题不是对本公开的各个方面或实施方案的限制。
在本文中，使用氨基酸名称、三字母缩写或单字母缩写来指代氨基酸。如本文所用，术语“蛋白”包括蛋白、多肽和肽。如本文所用，术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白”同义。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“肽”同义。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“酶”同义。术语“蛋白”和“多肽”在本文可互换使用。在本公开和权利要求中，可以使用氨基酸残基的常规单字母和三字母密码子。根据IUPACIUB生化命名联合委员会(JCBN)定义氨基酸的3个字母密码子。还应理解，由于遗传密码子的简并性，多肽可以被一个以上的核苷酸序列编码。
术语的其他定义可能在整个说明书中出现。在更详细地描述示例性实施方案之前，应当理解，本公开不限于所描述的特定实施方案，并因此可以变化。还应理解，本文中使用的术语仅出于描述具体实施方案的目的，而不旨在进行限制，因为本公开的范围仅由所附权利要求书限定。
在提供值的范围的情况下，应理解的是，除非上下文另外明确指出，否则在该范围的上限和下限之间、每个居中值，以下限单位的十分之一计，具体包括在本公开内。在指定范围内的任何指定值或居中值与该指定范围内的任何其他指定值或居中值之间的每个较小范围都包括在本公开中。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在该范围内或排除在该范围内，并且每个范围也包括在本公开内，其中包括在较小范围内的上下限之一、均不包括、或包括二者，以所述范围内的任何明确排除的限为准。在所述范围包括一个或两个限的情况下，排除这些限中所包括的任一个或两个的范围也包括在本公开中。
必须注意的是，如本文和所附权利要求书中所使用的，单数形式的“一个”，“一种”和“该”包括复数指示物，除非上下文另外明确指出。因此，例如，提及“修饰的肉毒杆菌神经毒素A”包括多种这样的候选试剂，并且提及“修饰的肉毒杆菌神经毒素A”包括提及一种或多种修饰的肉毒杆菌神经毒素A及其本领域技术人员已知的等同物，等等。
本文所讨论的出版物仅在本申请的提交日期之前提供其公开内容。本文中的任何内容均不应解释为承认此类出版物构成了所附权利要求的现有技术。
附图说明
现在将参考以下附图和实施例仅以举例的方式描述本发明的实施方案。
图1显示FDA批准的用于治疗颈肌张力障碍的剂量。
图2显示了阳离子构建体的等电聚焦(IEF)凝胶。
图3显示了Cat5v2(K1064H/N954K)(A)、Cat5v2(K1064H/N886K)(B)和Cat5v2(K1064H/N1025K)(C)在大鼠胚胎脊髓神经元(eSCN)中的SNAP-25切割百分比，以及相对于nBoNT/A1的pEC50的总结。(A、B、C)将大鼠胚胎脊髓神经元培养三周，并用Cat5v4处理24小时，然后用SNAP-25特异性抗体进行蛋白质印迹。数据是来自三个独立实验一式三份的平均值±SEM。(D)在大鼠eSCN SNAP-25切割效力测定法中Cat5v2(K1064H/N886K)、Cat5v2(K1064H/N954K)和Cat5v2(K1064H/N1025K)相对于nBoNT/A1(List BiologicalLaboratories)的相对效力。每个点对应于单独的批次，并且是基于8点浓度响应曲线(CRC)的3个独立的pEC50测定的平均值。CRC中的每个浓度一式三份进行评估。与List批次的平均值进行效力比较，合并数据n＝24。数据为每个Cat5v4 n＝3批次的平均值±SEM。
图4显示了在小鼠膈神经半膈测定法(mPNHD)中nBoNT/A1和Cat5v4的效力(t50)。如所示，将小鼠膈神经半膈组织与Cat5v4或天然BoNT/A1一起孵育。记录膈收缩力直至不再检测到收缩或140分钟后。每个点对应于独立的测定。t50值是抑制小鼠半膈收缩力50％所需的时间。
图5显示纯化的重组BoNT/AB嵌合体1、2和3A(分别为SEQ ID NO：11、12和13)的蛋白质印记。泳道标记为“Marker”(分子量标记)、“-DTT”(氧化的BoNT/AB嵌合体样品)和“+DTT”(还原的BoNT/AB嵌合体样品)。
图6显示重组BoNT/AB嵌合体1、2和3A(分别为SEQ ID NO：11、12和13，转换成双链形式)在大鼠脊髓神经元中的SNAP-25切割。将培养的大鼠原代脊髓神经元(SCN)暴露于不同浓度的重组BoNT/AB嵌合体1、2或3A，在37℃、含有10％ CO2的潮湿气氛中持续24小时。然后用补充有DTT和苯佐酶(Benzonase)的1x NuPAGE缓冲液裂解细胞。将样品转移至微量离心管中，在热块上于90℃下加热5分钟，并在-20℃下保存，然后通过蛋白质印迹分析SNAP-25切割。使用多克隆抗体检测SNAP-25，该抗体可检测SNAP-25的全长和切割形式(Sigma#S9684)。抗兔HRP(Sigma#A6154)用作二抗。
图7显示了小鼠趾外展评分测定法。在短暂的全身麻醉下，注射到小鼠一侧后肢的腓肠肌-比目鱼肌复合体肌肉中；使用趾外展分数(DAS)按0-4量表测量肌肉无力。确定每个剂量的DAS最大值并针对剂量作图，将数据拟合到4参数逻辑方程，确定导致DAS 4的ED50和剂量(DAS4剂量)值。
图8显示纯化的重组BoNT/AB嵌合体3B和3C(分别为SEQ ID NO：14和15)的蛋白质印记。泳道标记为“Marker”(分子量标记)、“-DTT”(氧化的BoNT/AB嵌合体样品)和“+DTT”(还原的BoNT/AB嵌合体样品)。
图9显示未修饰的BoNT/A和BoNT/AB嵌合体3B和3C(分别为SEQ ID No：2、14和15，转换成双链形式)在人诱导多能干细胞衍生的外周神经元(PERI.4U–Axiogenesis，德国)中对SNAP-25的切割。将PERI.4U细胞暴露于不同浓度的重组BoNT/A或BoNT/AB嵌合体3B或3C，在37℃、含有5％CO2的湿润CO2气氛中持续24小时。然后用补充有DTT和苯佐酶(Benzonase)的1x NuPAGE缓冲液裂解细胞。将样品转移至微量离心管中，在热块上于90℃下加热5分钟，并在-20℃下保存，然后通过蛋白质印迹分析SNAP-25切割。使用多克隆抗体检测SNAP-25，该抗体可检测SNAP-25的全长和切割形式(Sigma#S9684)。抗兔HRP(Sigma#A6154)用作二抗。
图10显示了在小鼠趾外展评分测定法中随着时间的推移肌肉无力的持续时间。在短暂的全身麻醉下，注射到小鼠一侧后肢的腓肠肌-比目鱼肌复合体肌肉中；使用趾外展分数(DAS)按0-4量表测量肌肉无力。对注射最低剂量的组中的动物进行监测，该最低剂量在注射的前四天内诱导DAS为4，直到肌肉无力完全恢复至DAS为0(未观察到肌肉无力)。
序列表
在任何以下SEQ ID NO中指示初始Met氨基酸残基或相应的初始密码子时，所述残基/密码子是任选的。
SEQ ID NO:1(未修饰的BoNT/A的核苷酸序列)
ATGCCATTCGTCAACAAGCAATTCAACTACAAAGACCCAGTCAACGGCGTCGACATCGCATACATCAAGATTCCGAACGCCGGTCAAATGCAGCCGGTTAAGGCTTTTAAGATCCACAACAAGATTTGGGTTATCCCGGAGCGTGACACCTTCACGAACCCGGAAGAAGGCGATCTGAACCCGCCACCGGAAGCGAAGCAAGTCCCTGTCAGCTACTACGATTCGACGTACCTGAGCACGGATAACGAAAAAGATAACTACCTGAAAGGTGT
GACCAAGCTGTTCGAACGTATCTACAGCACGGATCTGGGTCGCAT
GCTGCTGACTAGCATTGTTCGCGGTATCCCGTTCTGGGGTGGTAG
CACGATTGACACCGAACTGAAGGTTATCGACACTAACTGCATTAAC
GTTATTCAACCGGATGGTAGCTATCGTAGCGAAGAGCTGAATCTG
GTCATCATTGGCCCGAGCGCAGACATTATCCAATTCGAGTGCAAG
AGCTTTGGTCACGAGGTTCTGAATCTGACCCGCAATGGCTATGGTA
GCACCCAGTACATTCGTTTTTCGCCGGATTTTACCTTCGGCTTTGA
AGAGAGCCTGGAGGTTGATACCAATCCGTTGCTGGGTGCGGGCAA
ATTCGCTACCGATCCGGCTGTCACGCTGGCCCATGAACTGATCCAC
GCAGGCCACCGCCTGTACGGCATTGCCATCAACCCAAACCGTGTG
TTCAAGGTTAATACGAATGCATACTACGAGATGAGCGGCCTGGAA
GTCAGCTTCGAAGAACTGCGCACCTTCGGTGGCCATGACGCTAAA
TTCATTGACAGCTTGCAAGAGAATGAGTTCCGTCTGTACTACTATA
ACAAATTCAAAGACATTGCAAGCACGTTGAACAAGGCCAAAAGCA
TCGTTGGTACTACCGCGTCGTTGCAGTATATGAAGAATGTGTTTAA
AGAGAAGTACCTGCTGTCCGAGGATACCTCCGGCAAGTTTAGCGT
TGATAAGCTGAAGTTTGACAAACTGTACAAGATGCTGACCGAGATT
TACACCGAGGACAACTTTGTGAAATTCTTCAAAGTGTTGAATCGTA
AAACCTATCTGAATTTTGACAAAGCGGTTTTCAAGATTAACATCGT
GCCGAAGGTGAACTACACCATCTATGACGGTTTTAACCTGCGTAAC
ACCAACCTGGCGGCGAACTTTAACGGTCAGAATACGGAAATCAAC
AACATGAATTTCACGAAGTTGAAGAACTTCACGGGTCTGTTCGAGT
TCTATAAGCTGCTGTGCGTGCGCGGTATCATCACCAGCAAAACCAA
AAGCCTGGACAAAGGCTACAACAAGGCGCTGAATGACCTGTGCAT
TAAGGTAAACAATTGGGATCTGTTCTTTTCGCCATCCGAAGATAAT
TTTACCAACGACCTGAACAAGGGTGAAGAAATCACCAGCGATACG
AATATTGAAGCAGCGGAAGAGAATATCAGCCTGGATCTGATCCAG
CAGTACTATCTGACCTTTAACTTCGACAATGAACCGGAGAACATTA
GCATTGAGAATCTGAGCAGCGACATTATCGGTCAGCTGGAACTGA
TGCCGAATATCGAACGTTTCCCGAACGGCAAAAAGTACGAGCTGG
ACAAGTACACTATGTTCCATTACCTGCGTGCACAGGAGTTTGAACA
CGGTAAAAGCCGTATCGCGCTGACCAACAGCGTTAACGAGGCCCT
GCTGAACCCGAGCCGTGTCTATACCTTCTTCAGCAGCGACTATGTT
AAGAAAGTGAACAAAGCCACTGAGGCCGCGATGTTCCTGGGCTGG
GTGGAACAGCTGGTATATGACTTCACGGACGAGACGAGCGAAGTG
AGCACTACCGACAAAATTGCTGATATTACCATCATTATCCCGTATA
TTGGTCCGGCACTGAACATTGGCAACATGCTGTACAAAGACGATTT
TGTGGGTGCCCTGATCTTCTCCGGTGCCGTGATTCTGCTGGAGTTC
ATTCCGGAGATTGCGATCCCGGTGTTGGGTACCTTCGCGCTGGTG
TCCTACATCGCGAATAAGGTTCTGACGGTTCAGACCATCGATAACG
CGCTGTCGAAACGTAATGAAAAATGGGACGAGGTTTACAAATACA
TTGTTACGAATTGGCTGGCGAAAGTCAATACCCAGATCGACCTGAT
CCGTAAGAAAATGAAAGAGGCGCTGGAGAATCAGGCGGAGGCCAC
CAAAGCAATTATCAACTACCAATACAACCAGTACACGGAAGAAGAG
AAGAATAACATTAACTTCAATATCGATGATTTGAGCAGCAAGCTGA
ATGAATCTATCAACAAAGCGATGATCAATATCAACAAGTTTTTGAA
TCAGTGTAGCGTTTCGTACCTGATGAATAGCATGATTCCGTATGGC
GTCAAACGTCTGGAGGACTTCGACGCCAGCCTGAAAGATGCGTTG
CTGAAATACATTTACGACAATCGTGGTACGCTGATTGGCCAAGTTG
ACCGCTTGAAAGACAAAGTTAACAATACCCTGAGCACCGACATCCC
ATTTCAACTGAGCAAGTATGTTGATAATCAACGTCTGTTGAGCACT
TTCACCGAGTATATCAAAAACATCATCAATACTAGCATTCTGAACC
TGCGTTACGAGAGCAATCATCTGATTGATCTGAGCCGTTATGCAAG
CAAGATCAACATCGGTAGCAAGGTCAATTTTGACCCGATCGATAAG
AACCAGATCCAGCTGTTTAATCTGGAATCGAGCAAAATTGAGGTTA
TCCTGAAAAACGCCATTGTCTACAACTCCATGTACGAGAATTTCTC
CACCAGCTTCTGGATTCGCATCCCGAAATACTTCAACAGCATTAGC
CTGAACAACGAGTATACTATCATCAACTGTATGGAGAACAACAGCG
GTTGGAAGGTGTCTCTGAACTATGGTGAGATCATTTGGACCTTGCA
GGACACCCAAGAGATCAAGCAGCGCGTCGTGTTCAAGTACTCTCAAATGATCAACATTTCCGATTACATTAATCGTTGGATCTTCGTGACCATTACGAATAACCGTCTGAATAACAGCAAGATTTACATCAATGGTCGCTTGATCGATCAGAAACCGATTAGCAACCTGGGTAATATCCACGCAAGCAACAACATTATGTTCAAATTGGACGGTTGCCGCGATACCCATCGTTATATCTGGATCAAGTATTTCAACCTGTTTGATAAAGAACTGAATGAGAAGGAGATCAAAGATTTGTATGACAACCAATCTAACAGCGGCATTTTGAAGGACTTCTGGGGCGATTATCTGCAATACGATAAGCCGTACTATATGCTGAACCTGTATGATCCGAACAAATATGTGGATGTCAATAATGTGGGTATTCGTGGTTACATGTATTTGAAGGGTCCGCGTGGCAGCGTTATGACGACCAACATTTACCTGAACTCTAGCCTGTACCGTGGTACGAAATTCATCATTAAGAAATATGCCAGCGGCAACAAAGATAACATTGTGCGTAATAACGATCGTGTCTACATCAACGTGGTCGTGAAGAATAAAGAGTACCGTCTGGCGACCAACGCTTCGCAGGCGGGTGTTGAGAAAATTCTGAGCGCGTTGGAGATCCCTGATGTCGGTAATCTGAGCCAAGTCGTGGTTATGAAGAGCAAGAACGACCAGGGTATCACTAACAAGTGCAAGATGAACCTGCAAGACAACAATGGTAACGACATCGGCTTTATTGGTTTCCACCAGTTCAACAATATTGCTAAACTGGTAGCGAGCAATTGGTACAATCGTCAGATTGAGCGCAGCAGCCGTACTTTGGGCTGTAGCTGGGAGTTTATCCCGGTCGATGATGGTTGGGGCGAACGTCCGCTG
SEQ ID NO:2(未修饰的BoNT/A的多肽序列)
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SEQ ID NO:3(修饰的BoNT/A“Cat-A”的核苷酸序列)
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AGCTTTGGTCACGAGGTTCTGAATCTGACCCGCAATGGCTATGGTA
GCACCCAGTACATTCGTTTTTCGCCGGATTTTACCTTCGGCTTTGA
AGAGAGCCTGGAGGTTGATACCAATCCGTTGCTGGGTGCGGGCAA
ATTCGCTACCGATCCGGCTGTCACGCTGGCCCATGAACTGATCCAC
GCAGGCCACCGCCTGTACGGCATTGCCATCAACCCAAACCGTGTG
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GTCAGCTTCGAAGAACTGCGCACCTTCGGTGGCCATGACGCTAAA
TTCATTGACAGCTTGCAAGAGAATGAGTTCCGTCTGTACTACTATA
ACAAATTCAAAGACATTGCAAGCACGTTGAACAAGGCCAAAAGCA
TCGTTGGTACTACCGCGTCGTTGCAGTATATGAAGAATGTGTTTAA
AGAGAAGTACCTGCTGTCCGAGGATACCTCCGGCAAGTTTAGCGT
TGATAAGCTGAAGTTTGACAAACTGTACAAGATGCTGACCGAGATT
TACACCGAGGACAACTTTGTGAAATTCTTCAAAGTGTTGAATCGTA
AAACCTATCTGAATTTTGACAAAGCGGTTTTCAAGATTAACATCGT
GCCGAAGGTGAACTACACCATCTATGACGGTTTTAACCTGCGTAAC
ACCAACCTGGCGGCGAACTTTAACGGTCAGAATACGGAAATCAAC
AACATGAATTTCACGAAGTTGAAGAACTTCACGGGTCTGTTCGAGT
TCTATAAGCTGCTGTGCGTGCGCGGTATCATCACCAGCAAAACCAA
AAGCCTGGACAAAGGCTACAACAAGGCGCTGAATGACCTGTGCAT
TAAGGTAAACAATTGGGATCTGTTCTTTTCGCCATCCGAAGATAAT
TTTACCAACGACCTGAACAAGGGTGAAGAAATCACCAGCGATACG
AATATTGAAGCAGCGGAAGAGAATATCAGCCTGGATCTGATCCAG
CAGTACTATCTGACCTTTAACTTCGACAATGAACCGGAGAACATTA
GCATTGAGAATCTGAGCAGCGACATTATCGGTCAGCTGGAACTGA
TGCCGAATATCGAACGTTTCCCGAACGGCAAAAAGTACGAGCTGG
ACAAGTACACTATGTTCCATTACCTGCGTGCACAGGAGTTTGAACA
CGGTAAAAGCCGTATCGCGCTGACCAACAGCGTTAACGAGGCCCT
GCTGAACCCGAGCCGTGTCTATACCTTCTTCAGCAGCGACTATGTT
AAGAAAGTGAACAAAGCCACTGAGGCCGCGATGTTCCTGGGCTGG
GTGGAACAGCTGGTATATGACTTCACGGACGAGACGAGCGAAGTG
AGCACTACCGACAAAATTGCTGATATTACCATCATTATCCCGTATA
TTGGTCCGGCACTGAACATTGGCAACATGCTGTACAAAGACGATTT
TGTGGGTGCCCTGATCTTCTCCGGTGCCGTGATTCTGCTGGAGTTC
ATTCCGGAGATTGCGATCCCGGTGTTGGGTACCTTCGCGCTGGTG
TCCTACATCGCGAATAAGGTTCTGACGGTTCAGACCATCGATAACG
CGCTGTCGAAACGTAATGAAAAATGGGACGAGGTTTACAAATACA
TTGTTACGAATTGGCTGGCGAAAGTCAATACCCAGATCGACCTGAT
CCGTAAGAAAATGAAAGAGGCGCTGGAGAATCAGGCGGAGGCCAC
CAAAGCAATTATCAACTACCAATACAACCAGTACACGGAAGAAGAG
AAGAATAACATTAACTTCAATATCGATGATTTGAGCAGCAAGCTGA
ATGAATCTATCAACAAAGCGATGATCAATATCAACAAGTTTTTGAA
TCAGTGTAGCGTTTCGTACCTGATGAATAGCATGATTCCGTATGGC
GTCAAACGTCTGGAGGACTTCGACGCCAGCCTGAAAGATGCGTTG
CTGAAATACATTTACGACAATCGTGGTACGCTGATTGGCCAAGTTG
ACCGCTTGAAAGACAAAGTTAACAATACCCTGAGCACCGACATCCC
ATTTCAACTGAGCAAGTATGTTGATAATCAACGTCTGTTGAGCACT
TTCACCGAGTATATCAAAAACATCATCAATACTAGCATTCTGAACC
TGCGTTACGAGAGCAAGCATCTGATTGATCTGAGCCGTTATGCTAG
CAAGATCAACATCGGTAGCAAGGTCAATTTTGACCCGATCGATAAG
AACCAGATCCAGCTGTTTAATCTGGAATCGAGCAAAATTGAGGTTA
TCCTGAAAAAGGCCATTGTCTACAACTCCATGTACGAGAATTTCTC
CACCAGCTTCTGGATTCGCATCCCGAAATACTTCAACAAGATTAGC
CTGAACAACGAGTATACTATCATCAACTGTATGGAGAACAACAGCG
GTTGGAAGGTGTCTCTGAACTATGGTGAGATCATTTGGACCTTGCA
GGACACCAAAGAGATCAAGCAGCGCGTCGTGTTCAAGTACTCTCA
AATGATCAACATTTCCGATTACATTAATCGTTGGATCTTCGTGACC
ATTACGAATAACCGTCTGAATAAGAGCAAGATTTACATCAATGGTC
GCTTGATCGATCAGAAACCGATTAGCAACCTGGGTAATATCCACGC
AAGCAACAAGATTATGTTCAAATTGGACGGTTGCCGCGATACCCAT
CGTTATATCTGGATCAAGTATTTCAACCTGTTTGATAAAGAACTGAATGAGAAGGAGATCAAAGATTTGTATGACAACCAATCTAACAGCGGCATTTTGAAGGACTTCTGGGGCGATTATCTGCAATACGATAAGCCGTACTATATGCTGAACCTGTATGATCCGAACAAATATGTGGATGTCAATAATGTGGGTATTCGTGGTTACATGTATTTGAAGGGTCCGCGTGGCAGCGTTATGACGACCAACATTTACCTGAACTCTAGCCTGTACCGTGGTACGAAATTCATCATTAAGAAATATGCCAGCGGCAACAAAGATAACATTGTGCGTAATAACGATCGTGTCTACATCAACGTGGTCGTGAAGAATAAAGAGTACCGTCTGGCGACCAACGCTTCGCAGGCGGGTGTTGAGAAAATTCTGAGCGCGTTGGAGATCCCTGATGTCGGTAATCTGAGCCAAGTCGTGGTTATGAAGAGCAAGAACGACAAGGGTATCACTAACAAGTGCAAGATGAACCTGCAAGACAACAATGGTAACGACATCGGCTTTATTGGTTTCCACCAGTTCAACAATATTGCTAAACTGGTAGCGAGCAATTGGTACAATCGTCAGATTGAGCGCAGCAGCcGTACTTTGGGCTGTAGCTGGGAGTTTATCCCGGTCGATGATGGTTGGGGCGAACGTCCGCTG
SEQ ID NO:4(修饰的BoNT/A“Cat-A”的多肽序列)
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SEQ ID NO:5(修饰的BoNT/A“Cat-B”的核苷酸序列)
ATGCCATTCGTCAACAAGCAATTCAACTACAAAGACCCAGTCAACGGCGTCGACATCGCATACATCAAGATTCCGAACGCCGGTCAAATGCAGCCGGTTAAGGCTTTTAAGATCCACAACAAGATTTGGGTTATCCCGGAGCGTGACACCTTCACGAACCCGGAAGAAGGCGATCTGAACCCGCCACCGGAAGCGAAGCAAGTCCCTGTCAGCTACTACGATTCGACGTACCTGAGCACGGATAACGAAAAAGATAACTACCTGAAAGGTGTGACCAAGCTGTTCGAACGTATCTACAGCACGGATCTGGGTCGCATGCTGCTGACTAGCATTGTTCGCGGTATCCCGTTCTGGGGTGGTAGCACGATTGACACCGAACTGAAGGTTATCGACACTAACTGCATTAACGTTATTCAACCGGATGGTAGCTATCGTAGCGAAGAGCTGAATCTGGTCATCATTGGCCCGAGCGCAGACATTATCCAATTCGAGTGCAAGAGCTTTGGTCACGAGGTTCTGAATCTGACCCGCAATGGCTATGGTAGCACCCAGTACATTCGTTTTTCGCCGGATTTTACCTTCGGCTTTGAAGAGAGCCTGGAGGTTGATACCAATCCGTTGCTGGGTGCGGGCAAATTCGCTACCGATCCGGCTGTCACGCTGGCCCATGAACTGATCCACGCAGGCCACCGCCTGTACGGCATTGCCATCAACCCAAACCGTGTG
TTCAAGGTTAATACGAATGCATACTACGAGATGAGCGGCCTGGAA
GTCAGCTTCGAAGAACTGCGCACCTTCGGTGGCCATGACGCTAAA
TTCATTGACAGCTTGCAAGAGAATGAGTTCCGTCTGTACTACTATA
ACAAATTCAAAGACATTGCAAGCACGTTGAACAAGGCCAAAAGCA
TCGTTGGTACTACCGCGTCGTTGCAGTATATGAAGAATGTGTTTAA
AGAGAAGTACCTGCTGTCCGAGGATACCTCCGGCAAGTTTAGCGT
TGATAAGCTGAAGTTTGACAAACTGTACaAGATGCTGACCGAGATT
TACACCGAGGACAACTTTGTGAAATTCTTCAAAGTGTTGAATCGTA
AAACCTATCTGAATTTTGACAAAGCGGTTTTCAAGATTAACATCGT
GCCGAAGGTGAACTACACCATCTATGACGGTTTTAACCTGCGTAAC
ACCAACCTGGCGGCGAACTTTAACGGTCAGAATACGGAAATCAAC
AACATGAATTTCACGAAGTTGAAGAACTTCACGGGTCTGTTCGAGT
TCTATAAGCTGCTGTGCGTGCGCGGTATCATCACCAGCAAAACCAA
AAGCCTGGACAAAGGCTACAACAAGGCGCTGAATGACCTGTGCAT
TAAGGTAAACAATTGGGATCTGTTCTTTTCGCCATCCGAAGATAAT
TTTACCAACGACCTGAACAAGGGTGAAGAAATCACCAGCGATACG
AATATTGAAGCAGCGGAAGAGAATATCAGCCTGGATCTGATCCAG
CAGTACTATCTGACCTTTAACTTCGACAATGAACCGGAGAACATTA
GCATTGAGAATCTGAGCAGCGACATTATCGGTCAGCTGGAACTGA
TGCCGAATATCGAACGTTTCCCGAACGGCAAAAAGTACGAGCTGG
ACAAGTACACTATGTTCCATTACCTGCGTGCACAGGAGTTTGAACA
CGGTAAAAGCCGTATCGCGCTGACCAACAGCGTTAACGAGGCCCT
GCTGAACCCGAGCCGTGTCTATACCTTCTTCAGCAGCGACTATGTT
AAGAAAGTGAACAAAGCCACTGAGGCCGCGATGTTCCTGGGCTGG
GTGGAACAGCTGGTATATGACTTCACGGACGAGACGAGCGAAGTG
AGCACTACCGACAAAATTGCTGATATTACCATCATTATCCCGTATA
TTGGTCCGGCACTGAACATTGGCAACATGCTGTACAAAGACGATTT
TGTGGGTGCCCTGATCTTCTCCGGTGCCGTGATTCTGCTGGAGTTC
ATTCCGGAGATTGCGATCCCGGTGTTGGGTACCTTCGCGCTGGTG
TCCTACATCGCGAATAAGGTTCTGACGGTTCAGACCATCGATAACG
CGCTGTCGAAACGTAATGAAAAATGGGACGAGGTTTACAAATACA
TTGTTACGAATTGGCTGGCGAAAGTCAATACCCAGATCGACCTGAT
CCGTAAGAAAATGAAAGAGGCGCTGGAGAATCAGGCGGAGGCCAC
CAAAGCAATTATCAACTACCAATACAACCAGTACACGGAAGAAGAG
AAGAATAACATTAACTTCAATATCGATGATTTGAGCAGCAAGCTGA
ATGAATCTATCAACAAAGCGATGATCAATATCAACAAGTTTTTGAA
TCAGTGTAGCGTTTCGTACCTGATGAATAGCATGATTCCGTATGGC
GTCAAACGTCTGGAGGACTTCGACGCCAGCCTGAAAGATGCGTTG
CTGAAATACATTTACGACAaTCGTGGTACGCTGATTGGCCAAGTTG
ACCGCTTGAAAGACAAAGTTAACAATACCCTGAGCACCGACATCCC
ATTTCAACTGAGCAAGTATGTTGATAATCAACGTCTGTTGAGCACT
TTCACCGAGTATATCAAAAACATCATCAATACTAGCATTCTGAACC
TGCGTTACGAGAGCAATCATCTGATTGATCTGAGCCGTTATGCTAG
CAAGATCAACATCGGTAGCAAGGTCAATTTTGACCCGATCGATAAG
AACCAGATCCAGCTGTTTAATCTGGAATCGAGCAAAATTGAGGTTA
TCCTGAAAAAGGCCATTGTCTACAACTCCATGTACGAGAATTTCTC
CACCAGCTTCTGGATTCGCATCCCGAAATACTTCAAGAAGATTAGC
CTGAACAACGAGTATACTATCATCAACTGTATGGAGAACAACAGCG
GTTGGAAGGTGTCTCTGAACTATGGTGAGATCATTTGGACCTTGCA
GGACACCAAAGAGATCAAGCAGCGCGTCGTGTTCAAGTACTCTCA
AATGATCAACATTTCCGATTACATTAATCGTTGGATCTTCGTGACC
ATTACGAATAACCGTCTGAATAAGAGCAAGATTTACATCAATGGTC
GCTTGATCGATCAGAAACCGATTAGCAACCTGGGTAATATCCACGC
AAGCAACAAGATTATGTTCAAATTGGACGGTTGCCGCGATACCCAT
CGTTATATCTGGATCAAGTATTTCAACCTGTTTGATAAAGAACTGA
ATGAGAAGGAGATCAAAGATTTGTATGACAACCAATCTAACAGCG
GCATTTTGAAGGACTTCTGGGGCGATTATCTGCAATACGATAAGCC
GTACTATATGCTGAACCTGTATGATCCGAACAAATATGTGGATGTC
AATAATGTGGGTATTCGTGGTTACATGTATTTGAAGGGTCCGCGTG
GCAGCGTTATGACGACCAACATTTACCTGAACTCTAGCCTGTACCGTGGTACGAAATTCATCATTAAGAAATATGCCAGCGGCAACAAAGATAACATTGTGCGTAATAACGATCGTGTCTACATCAACGTGGTCGTGAAGAATAAAGAGTACCGTCTGGCGACCAACGCTTCGCAGGCGGGTGTTGAGAAAATTCTGAGCGCGTTGGAGATCCCTGATGTCGGTAATCTGAGCCAAGTCGTGGTTATGAAGAGCAAGAACGACAAGGGTATCACTAACAAGTGCAAGATGAACCTGCAAGACAACAATGGTAACGACATCGGCTTTATTGGTTTCCACCAGTTCAACAATATTGCTAAACTGGTAGCGAGCAATTGGTACAATCGTCAGATTGAGCGCAGCAGCCGTACTTTGGGCTGTAGCTGGGAGTTTATCCCGGTCGATGATGGTTGGGGCGAACGTCCGCTG
SEQ ID NO:6(修饰的BoNT/A“Cat-B”的多肽序列)
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SEQ ID NO:7(修饰的BoNT/A“Cat-C”的核苷酸序列)
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AGAGAAGTACCTGCTGTCCGAGGATACCTCCGGCAAGTTTAGCGT
TGATAAGCTGAAGTTTGACAAACTGTACAAGATGCTGACCGAGATT
TACACCGAGGACAACTTTGTGAAATTCTTCAAAGTGTTGAATCGTA
AAACCTATCTGAATTTTGACAAAGCGGTTTTCAAGATTAACATCGT
GCCGAAGGTGAACTACACCATCTATGACGGTTTTAACCTGCGTAAC
ACCAACCTGGCGGCGAACTTTAACGGTCAGAATACGGAAATCAAC
AACATGAATTTCACGAAGTTGAAGAACTTCACGGGTCTGTTCGAGT
TCTATAAGCTGCTGTGCGTGCGCGGTATCATCACCAGCAAAACCAA
AAGCCTGGACAAAGGCTACAACAAGGCGCTGAATGACCTGTGCAT
TAAGGTAAACAATTGGGATCTGTTCTTTTCGCCATCCGAAGATAAT
TTTACCAACGACCTGAACAAGGGTGAAGAAATCACCAGCGATACG
AATATTGAAGCAGCGGAAGAGAATATCAGCCTGGATCTGATCCAG
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AGCACTACCGACAAAATTGCTGATATTACCATCATTATCCCGTATA
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ATTCCGGAGATTGCGATCCCGGTGTTGGGTACCTTCGCGCTGGTG
TCCTACATCGCGAATAAGGTTCTGACGGTTCAGACCATCGATAACG
CGCTGTCGAAACGTAATGAAAAATGGGACGAGGTTTACAAATACA
TTGTTACGAATTGGCTGGCGAAAGTCAATACCCAGATCGACCTGAT
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GAGCCAAGTCGTGGTTATGAAGAGCAAGAACGACAAGGGTATCACTAACAAGTGCAAGATGAACCTGCAAGACAACAATGGTAACGACATCGGCTTTATTGGTTTCCACCAGTTCAACAATATTGCTAAACTGGTAGCGAGCAATTGGTACAATCGTCAGATTGAGCGCAGCAGCCGTACTTTGGGCTGTAGCTGGGAGTTTATCCCGGTCGATGATGGTTGGGGCGAACGTCCGCTG
SEQ ID NO:8(修饰的BoNT/A“Cat-C”的多肽序列)
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKKAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNKISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTKEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLKKSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNKIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDKGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPL
SEQ ID NO:9(修饰的BoNT/A“Cat-D”的核苷酸序列)
ATGCCATTCGTCAACAAGCAATTCAACTACAAAGACCCAGTCAACGGCGTCGACATCGCATACATCAAGATTCCGAACGCCGGTCAAATGCAGCCGGTTAAGGCTTTTAAGATCCACAACAAGATTTGGGTTATCCCGGAGCGTGACACCTTCACGAACCCGGAAGAAGGCGATCTGAACCCGCCACCGGAAGCGAAGCAAGTCCCTGTCAGCTACTACGATTCGACGTACCTGAGCACGGATAACGAAAAAGATAACTACCTGAAAGGTGTGACCAAGCTGTTCGAACGTATCTACAGCACGGATCTGGGTCGCATGCTGCTGACTAGCATTGTTCGCGGTATCCCGTTCTGGGGTGGTAGCACGATTGACACCGAACTGAAGGTTATCGACACTAACTGCATTAACGTTATTCAACCGGATGGTAGCTATCGTAGCGAAGAGCTGAATCTGGTCATCATTGGCCCGAGCGCAGACATTATCCAATTCGAGTGCAAGAGCTTTGGTCACGAGGTTCTGAATCTGACCCGCAATGGCTATGGTAGCACCCAGTACATTCGTTTTTCGCCGGATTTTACCTTCGGCTTTGAAGAGAGCCTGGAGGTTGATACCAATCCGTTGCTGGGTGCGGGCAAATTCGCTACCGATCCGGCTGTCACGCTGGCCCATGAACTGATCCACGCAGGCCACCGCCTGTACGGCATTGCCATCAACCCAAACCGTGTGTTCAAGGTTAATACGAATGCATACTACGAGATGAGCGGCCTgGAAGTCAGCTTCGAAGAACTGCGCACCTTCGGTGGCCATGACGCTAAATTCATTGACAGCTTGCAAGAGAATGAGTTCCGTCTGTACTACTATAACAAATTCAAAGACATTGCAAGCACGTTGAACAAGGCCAAAAGCATCGTTGGTACTACCGCGTCGTTGCAGTATATGAAGAATGTGTTTAAAGAGAAGTACCTGCTGTCCGAGGATACCTCCGGCAAGTTTAGCGTTGATAAGCTGAAGTTTGACAAACTGTACAAGATGCTGACCGAGATTTACACCGAGGACAACTTTGTGAAATTCTTCAAaGTGTTGAATCGTAAAACCTATCTGAATTTTGACAAAGCGGTTTTCaAGATTAACATCGTGCCGAAGGTGAACTACACCATCTATGACGGTTTTAACCTGCGTAACAC
CAACCTGGCGGCGAACTTTAACGGTCAGAATACGGAAATCAACAA
CATGAATTTCACGAAGTTGAAGAACTTCACGGGTCTGTTCGAGTTC
TATAAGCTGCTGTGCGTGCGCGGTATCATCACCAGCAAAACCAAA
AGCCTGGACAAAGGCTACAACAAGGCGCTGAATGACCTGTGCATT
AAGGTAAACAATTGGGATCTGTTCTTTTCGCCATCCGAAGATAATT
TTACCAACGACCTGAACAAGGGTGAAGAAATCACCAGCGATACGA
ATATTGAAGCAGCGGAAGAGAATATCAGCCTGGATCTGATCCAGC
AGTACTATCTGACCTTTAACTTCGACAATGAACCGGAGAACATTAG
CATTGAGAATCTGAGCAGCGACATTATCGGTCAGCTGGAACTGAT
GCCGAATATCGAACGTTTCCCGAACGGCAAAAAGTACGAGCTGGA
CAAGTACACTATGTTCCATTACCTGCGTGCACAGGAGTTTGAACAC
GGTAAAAGCCGTATCGCGCTGACCAACAGCGTTAACGAGGCCCTG
CTGAACCCGAGCCGTGTCTATACCTTCTTCAGCAGCGACTATGTTA
AGAAAGTGAACAAAGCCACTGAGGCCGCGATGTTCCTGGGCTGGG
TGGAACAGCTGGTATATGACTTCACGGACGAGACGAGCGAAGTGA
GCACTACCGACAAAaTTGCTGATaTTACCATCATTATCCCGTATATT
GGTCCGGCACTGAACATTGGCAACATGCTGTACAAAGACGATTTT
GTGGGTGCCCTGATCTTCTCCGGTGCCGTGATTCTGCTGGAGTTCA
TTCCGGAGATTGCGATCCCGGTGTTGGGTACCTTCGCGCTGGTGT
CCTACATCGCGAATAAGGTTCTGACGGTTCAGACCATCGATAACGC
GCTGTCGAAACGTAATGAAAAATGGGACGAGGTTTACAAATACATT
GTTACGAATTGGCTGGCGAAAGTCaATACCCAGATCGACCTGATCC
GTAAGAAAATGAAAGAGGCGCTGGAGAATCAGGCGGAGGCCACCA
AAGCAATTATCAACTACCAATACAACCAGTACACGGAAGAAGAGAA
GAATAACATTAACTTCAATATCGATGATTTGAGCAGCAAGCTGAAT
GAATCTATCAACAAAGCGATGATCAATATCAACAAGTTTTTGAATC
AGTGTAGCGTTTCGTACCTGATGAATAGCATGATTCCGTATGGCGT
CAAACGTCTGGAGGACTTCGACGCCAGCCTGAAAGATGCGTTGCT
GAAATACATTTACGACAATCGTGGTACGCTGATTGGCCAAGTTGAC
CGCTTGAAAGACAAAGTTAACAATACCCTGAGCACCGACATCCCAT
TTCAACTGAGCAAGTATGTTGATAATCAACGTCTGTTGAGCACTTT
CACCGAGTATATCAAAAACATCATCAATACTAGCATTCTGAACCTG
CGTTACGAGAGCAATCATCTGATtGATCTGAGCCGTTATGCAAGCA
AGATCAACATCGGTAGCAAGGTCAATTTTGACCCGATCGATAAGAA
CCAGATCCAGCTGTTTAATCTGGAATCGAGCAAAATTGAGGTTATC
CTGAAAAACGCCATTGTCTACAACTCCATGTACGAGAATTTCTCCA
CCAGCTTCTGGATTCGCATCCCGAAATACTTCAACAGCATTAGCCT
GAACAACGAGTATACTATCATCAACTGTATGGAGAACAACAGCGG
TTGGAAGGTGTCTCTGAACTATGGTGAGATCATTTGGACCTTGCAG
GACACCCAAGAGATCAAGCAGCGCGTCGTGTTCAAGTACTCTCAA
ATGATCAACATTTCCGATTACATTAATCGTTGGATCTTCGTGACCA
TTACGAATAACCGTCTGAATAACAGCAAGATTTACATCAATGGTCG
CTTGATCGATCAGAAACCGATTAGCAACCTGGGTAATATCCACGCA
AGCAACAACATTATGTTCAAATTGGACGGTTGCCGCGATACCCATC
GTTATATCTGGATCAAGTATTTCAACCTGTTTGATAAAGAACTGAA
TGAGAAGGAGATCAAAGATTTGTATGACAACCAATCTAACAGCGG
CATTTTGAAGGACTTCTGGGGCGATTATCTGCAATACGATAAGCCG
TACTATATGCTGAACCTGTATGATCCGAACAAATATGTGGATGTCA
ATAATGTGGGTATTCGTGGTTACATGTATTTGAAGGGTCCGCGTGG
CAGCGTTATGACGACCAACATTTACCTGAACTCTAGCCTGTACCGT
GGTACGAAATTCATCATTAAGAAATATGCCAGCGGCAACAAAGATA
ACATTGTGCGTAATAACGATCGTGTCTACATCAACGTGGTCGTGAA
GCGTAAAGAGTACCGTCTGGCGACCAACGCTTCGCAGGCGGGTGT
TGAGAAAATTCTGAGCGCGTTGGAGATCCCTCGTGTCCGTCGTCT
GAGCCAAGTCGTGGTTATGAAGAGCAAGAACGACCAGGGTATCAC
TAACAAGTGCAAGATGAACCTGCAAGACCGTCGTGGTAACGACAT
CGGCTTTATTGGTTTCCACCAGTTCAACAATATTGCTAAACTGGTA
GCGAGCAATTGGTACAATCGTCAGATTGAGCGCCGTAGCCGTCGT
TTGGGCTGTAGCTGGGAGTTTATCCCGGTCGATGATGGTTGGGGC
GAACGTCCGCTG
SEQ ID NO:10(修饰的BoNT/A“Cat-D”的多肽序列)
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKRKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPRVRRLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDRRGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERRSRRLGCSWEFIPVDDGWGERPL
SEQ ID NO: 11(修饰的BoNT/A“嵌合体1”的多肽序列)
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKSEILNNIILNLRYKDNNLIDLSGYGAKVEVYDGVELNDKNQFKLTSSANSKIRVTQNQNIIFNSVFLDFSVSFWIRIPKYKNDGIQNYIHNEYTIINCMKNNSGWKISIRGNRIIWTLIDINGKTKSVFFEYNIREDISEYINRWFFVTITNNLNNAKIYINGKLESNTDIKDIREVIANGEIIFKLDGDIDRTQFIWMKYFSIFNTELSQSNIEERYKIQSYSEYLKDFWGNPLMYNKEYYMFNAGNKNSYIKLKKDSPVGEILTRSKYNQNSKYINYRDLYIGEKFIIRRKSNSQSINDDIVRKEDYIYLDFFNLNQEWRVYTYKYFKKEEMKLFLAPIYDSDEFYNTIQIKEYDEQPTYSCQLLFKKDEESTDEIGLIGIHRFYESGIVFEEYKDYFCISKWYLKEVKRKPYNLKLGCNWQFIPKDEGWTEHHHHHHHHHH
SEQ ID NO: 12(修饰的BoNT/A“嵌合体2”的多肽序列)
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIIELGGGGSELSEILNNIILNLRYKDNNLIDLSGYGAKVEVYDGVELNDKNQFKLTSSANSKIRVTQNQNIIFNSVFLDFSVSFWIRIPKYKNDGIQNYIHNEYTIINCMKNNSGWKISIRGNRIIWTLIDINGKTKSVFFEYNIREDISEYINRWFFVTITNNLNNAKIYINGKLESNTDIKDIREVIANGEIIFKLDGDIDRTQFIWMKYFSIFNTELSQSNIEERYKIQSYSEYLKDFWGNPLMYNKEYYMFNAGNKNSYIKLKKDSPVGEILTRSKYNQNSKYINYRDLYIGEKFIIRRKSNSQSINDDIVRKEDYIYLDFFNLNQEWRVYTYKYFKKEEMKLFLAPIYDSDEFYNTIQIKEYDEQPTYSCQLLFKKDEESTDEIGLIGIHRFYESGIVFEEYKDYFCISKWYLKEVKRKPYNLKLGCNWQFIPKDEGWTEHHHHHHHHHH
SEQ ID NO:13(修饰的BoNT/A“Chimera3A”的多肽序列)
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNILNNIILNLRYKDNNLIDLSGYGAKVEVYDGVELNDKNQFKLTSSANSKIRVTQNQNIIFNSVFLDFSVSFWIRIPKYKNDGIQNYIHNEYTIINCMKNNSGWKISIRGNRIIWTLIDINGKTKSVFFEYNIREDISEYINRWFFVTITNNLNNAKIYINGKLESNTDIKDIREVIANGEIIFKLDGDIDRTQFIWMKYFSIFNTELSQSNIEERYKIQSYSEYLKDFWGNPLMYNKEYYMFNAGNKNSYIKLKKDSPVGEILTRSKYNQNSKYINYRDLYIGEKFIIRRKSNSQSINDDIVRKEDYIYLDFFNLNQEWRVYTYKYFKKEEMKLFLAPIYDSDEFYNTIQIKEYDEQPTYSCQLLFKKDEESTDEIGLIGIHRFYESGIVFEEYKDYFCISKWYLKEVKRKPYNLKLGCNWQFIPKDEGWTEHHHHHHHHHH
SEQ ID NO: 14(修饰的BoNT/A“嵌合体3B”的多肽序列)
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNILNNIILNLRYKDNNLIDLSGYGAKVEVYDGVELNDKNQFKLTSSANSKIRVTQNQNIIFNSVFLDFSVSFWIRIPKYKNDGIQNYIHNEYTIINCMKNNSGWKISIRGNRIIWTLIDINGKTKSVFFEYNIREDISEYINRWFFVTITNNLNNAKIYINGKLESNTDIKDIREVIANGEIIFKLDGDIDRTQFIWMKYFSIFNTELSQSNIEERYKIQSYSEYLKDFWGNPLMYNKEYYMFNAGNKNSYIKLKKDSPVGEILTRSKYNQNSKYINYRDLYIGEKFIIRRKSNSQSINDDIVRKEDYIYLDFFNLNQEWRVYTYKYFKKEEMKLFLAPIYDSDEFYNTIQIKEYDEQPTYSCQLLFKKDEESTDEIGLIGIHRFYESGIVFEEYKDYFCISKWYLKEVKRKPYNLKLGCNWQFIPKDEGWTE
SEQ ID NO:15(修饰的BoNT/A“Chimera3C”的多肽序列)
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNILNNIILNLRYKDNNLIDLSGYGAKVEVYDGVELNDKNQFKLTSSANSKIRVTQNQNIIFNSVFLDFSVSFWIRIPKYKNDGIQNYIHNEYTIINCMKNNSGWKISIRGNRIIWTLIDINGKTKSVFFEYNIREDISEYINRWFFVTITNNLNNAKIYINGKLESNTDIKDIREVIANGEIIFKLDGDIDRTQFIWMKYFSIFNTELSQSNIEERYKIQSYSEYLKDFWGNPLMYNKEYYMFNAGNKNSYIKLKKDSPVGEILTRSKYNQNSKYINYRDLYIGEKFIIRRKSNSQSINDDIVRKEDYIYLDFFNLNQEWRVYTYKYFKKEEEKLFLAPISDSDEFYNTIQIKEYDEQPTYSCQLLFKKDEESTDEIGLIGIHRFYESGIVFEEYKDYFCISKWYLKEVKRKPYNLKLGCNWQFIPKDEGWTE
SEQ ID NO:16(BoNT/B的多肽序列)
MPVTINNFNYNDPIDNNNIIMMEPPFARGTGRYYKAFKITDRIWIIPERYTFGYKPEDFNKSSGIFNRDVCEYYDPDYLNTNDKKNIFLQTMIKLFNRIKSKPLGEKLLEMIINGIPYLGDRRVPLEEFNTNIASVTVNKLISNPGEVERKKGIFANLIIFGPGPVLNENETIDIGIQNHFASREGFGGIMQMKFCPEYVSVFNNVQENKGASIFNRRGYFSDPALILMHELIHVLHGLYGIKVDDLPIVPNEKKFFMQSTDAIQAEELYTFGGQDPSIITPSTDKSIYDKVLQNFRGIVDRLNKVLVCISDPNININIYKNKFKDKYKFVEDSEGKYSIDVESFDKLYKSLMFGFTETNIAENYKIKTRASYFSDSLPPVKIKNLLDNEIYTIEEGFNISDKDMEKEYRGQNKAINKQAYEEISKEHLAVYKIQMCKSVK
APGICIDVDNEDLFFIADKNSFSDDLSKNERIEYNTQSNYIENDFPINELI
LDTDLISKIELPSENTESLTDFNVDVPVYEKQPAIKKIFTDENTIFQYLY
SQTFPLDIRDISLTSSFDDALLFSNKVYSFFSMDYIKTANKVVEAGLFAG
WVKQIVNDFVIEANKSNTMDKIADISLIVPYIGLALNVGNETAKGNFEN
AFEIAGASILLEFIPELLIPVVGAFLLESYIDNKNKIIKTIDNALTKRNEK
WSDMYGLIVAQWLSTVNTQFYTIKEGMYKALNYQAQALEEIIKYRYN
IYSEKEKSNINIDFNDINSKLNEGINQAIDNINNFINGCSVSYLMKKMIPL
AVEKLLDFDNTLKKNLLNYIDENKLYLIGSAEYEKSKVNKYLKTIMPF
DLSIYTNDTILIEMFNKYNSEILNNIILNLRYKDNNLIDLSGYGAKVEVY
DGVELNDKNQFKLTSSANSKIRVTQNQNIIFNSVFLDFSVSFWIRIPKYK
NDGIQNYIHNEYTIINCMKNNSGWKISIRGNRIIWTLIDINGKTKSVFFE
YNIREDISEYINRWFFVTITNNLNNAKIYINGKLESNTDIKDIREVIANG
EIIFKLDGDIDRTQFIWMKYFSIFNTELSQSNIEERYKIQSYSEYLKDFW
GNPLMYNKEYYMFNAGNKNSYIKLKKDSPVGEILTRSKYNQNSKYIN
YRDLYIGEKFIIRRKSNSQSINDDIVRKEDYIYLDFFNLNQEWRVYTYK
YFKKEEEKLFLAPISDSDEFYNTIQIKEYDEQPTYSCQLLFKKDEESTD
EIGLIGIHRFYESGIVFEEYKDYFCISKWYLKEVKRKPYNLKLGCNWQ
FIPKDEGWTE
实施例
实施例1
克隆、表达和纯化
核苷酸序列SEQ ID NO：1编码野生型BoNT/A(SEQ ID NO：2)，被突变以引入以下取代，形成下表1中所示的四种构建体：
表1构建体
*Cat-D的计算pI为7.45，分子量为149,859。
合成编码上述修饰的BoNT/A分子的DNA构建体，克隆到pJ401表达载体中，然后转化到BL21(DE3)大肠杆菌中。这使得重组Cat-A、Cat-B、Cat-C和Cat-D蛋白在BL21(DE3)大肠杆菌中可溶性过表达。
使用经典色谱技术从大肠杆菌裂解物中纯化重组修饰的BoNT。采用使用阳离子交换树脂的初始纯化步骤，随后使用疏水相互作用树脂进行中间纯化步骤。然后通过蛋白水解切割重组修饰的BoNT单链，产生活化的双链修饰的BoNT。然后采用最后的纯化步骤去除剩余的污染物。合适的技术在WO2015/166242、WO2017055274A1、EP2524963B1、EP2677029B1和US10087432B2中教导。
实施例2
纯化修饰的BoNT/A的表征
上述实施例1中描述的修饰的BoNT通过实验表征如下。
pI测量表明，修饰的BoNT的等电点高于未修饰(天然)的BoNT/A1的等电点-参见图2和下表2。
表2修饰的BoNT/A pI值。
使用大鼠胚胎脊髓神经元(eSCN)评估修饰的BoNT进入神经元并切割SNAP-25(BoNT/A1的靶标)的能力。图3显示，修饰的BoNT保留了与天然BoNT/A1相同的进入神经元和切割SNAP-25的能力。
使用小鼠膈神经半隔测定(mPNHD)进一步评估修饰的BoNT的效力。图4显示修饰的BoNT保留了与天然BoNT/A1相同的抑制小鼠半膈收缩能力的能力。
体内小鼠趾外展分数(DAS)测定用于评估相对于天然BoNT/A1的效力和安全性。两种分子(转换成双链形式的Cat-A[SEQ ID NO：4]和Cat-B[转换成双链形式的SEQ ID NO:6])相对于天然BoNT/A1表现出更高的安全比，并且效力稍强。这些数据如下表3所示：
表3DAS测定法和安全比。
-DAS ED50：诱导DAS2的计算剂量
-剂量DAS 4：诱导DAS 4的实验剂量
-BW:体重
--10％ΔBW的剂量：与D0时的BW相比，计算的诱导BW减少10％的剂量
-安全比：-10％ΔBW的剂量/DAS ED50
安全比是BoNT治疗的负面影响(体重减轻)相对于效力(半数最大趾外展分数(DAS))的量度。其计算为-10％体重(BW)与DAS ED50之间的比率，其中-10％ BW是指体重减少10％所需的BoNT的量(pg/动物)，ED50是指产生DAS为2的BoNT的量(pg/动物)。
DAS测定法是通过将在明胶磷酸盐缓冲液中配制的20μl修饰的BoNT/A注射到小鼠腓肠肌/比目鱼肌复合体中进行的，然后按照先前Aoki(Aoki KR,Toxicon 39:1815-1820；2001)报道的那样评估趾外展。
实施例3
修饰的BoNT/A(BoNT/AB嵌合体)的克隆、表达和纯化
使用标准分子生物学技术，通过编码亲本血清型分子的DNA和适当的寡核苷酸构建BoNT/AB嵌合构建体1、2、3A、3B和3C(分别为SEQ ID NO:11至15)。然后将它们克隆到带有或不带有C-末端His10标签的pJ401表达载体中，并转化到BLR(DE3)大肠杆菌细胞中，用于过表达。这些细胞在37℃和225RPM振荡下在2L带挡板锥形烧瓶中生长，其中含有1L修饰的Terrific肉汤(mTB)，并补充了适当的抗生素。一旦A600达到>0.5，将孵育箱温度降至16℃，然后在一小时后，用1mM IPTG在225RPM振荡下诱导20小时，以表达重组的BoNT/AB构建体。
收获的细胞通过超声裂解并通过在4℃下以4500RPM离心1小时来澄清。然后用硫酸铵提取重组BoNT/AB嵌合分子，并通过标准快速蛋白液相色谱(FPLC)技术纯化。这涉及使用疏水相互作用树脂进行捕获，并使用阴离子交换树脂进行中间纯化步骤。然后用内切蛋白酶Lys-C对部分纯化的分子进行蛋白水解切割，产生活性双链。用第二疏水相互作用树脂进一步纯化以获得最终的BoNT/AB嵌合体。
对于带有十组氨酸标签(H10)的BoNT/AB嵌合分子(嵌合体1、2、3A)，捕获步骤采用固定化镍树脂代替疏水相互作用树脂。
每个嵌合体的序列示于表4中。
表4–嵌合BoNT/AB构建体
实施例4
BoNT/AB嵌合体1、2和3A的比较
如实施例3(图5)中所述纯化具有C-末端His10标签和E1191M/S1199Y双变的BoNT/AB嵌合体1、2和3A，并测试功能活性。
大鼠脊髓神经元SNAP-25切割测定法
制备大鼠脊髓神经元(SCN)的原代培养物，并在96孔组织培养板中培养3周(如下所述：Masuyer等人,2011,J.Struct.Biol.Structure and activity of a functionalderivative of Clostridium botulinum neurotoxin B；以及，Chaddock等人,2002,Protein Expr.Purif.Expression and purification of catalytically active,non-toxic endopeptidase derivatives of Clostridium botulinum toxin type A)。在SCN补料培养基中制备BoNT/AB的系列稀释液。收集并过滤来自待处理孔的生长培养基(0.2μm过滤器)。将125μL过滤的培养基加回到每个测试孔中。然后将125μL稀释的毒素添加到板中(一式三份)。将处理的细胞在37℃、10％ CO2下孵育24±1小时。
使用SNAP-25切割测定法分析BoNT活性
处理后，去除BoNT并将细胞在PBS(Gibco，英国)中洗涤一次。将细胞在补充有0.1M二硫苏糖醇(DTT)和250单位/mL苯佐酶(Sigma)的1x NuPAGE裂解缓冲液(LifeTechnologies)中裂解。通过SDS-PAGE分离裂解物蛋白质并转移到硝酸纤维素膜上。使用SNAP-25特异性一抗(Sigma#S9684)探针检测膜，该抗体可识别未切割的SNAP-25以及被BoNT/A内肽酶切割的SNAP-25。使用的二抗是HRP缀合的抗兔IgG(Sigma#A6154)。通过增强化学发光检测条带，并使用pXi6 Access(Synoptics，英国)成像。使用GeneTools软件(Syngene，剑桥，英国)测定条带强度，并计算在每个BoNT浓度下切割的SNAP-25的百分比。将数据拟合至4参数逻辑方程，并使用GraphPad Prism第6版(GraphPad)计算pEC50。
下表5提供了在大鼠SCN SNAP-25切割测定法中针对嵌合体1、2和3A测定的pEC50值。这些结果表明，三种BoNT/AB嵌合体保留了进入大鼠脊髓神经元并切割其靶底物的能力。然而，在此测定法中，嵌合体3A比嵌合体1和2更有效(也见图6)。
pEC50±SEM
嵌合体1 12.42±0.04
嵌合体2 12.57±0.01
嵌合体3A 12.89±0.04
表5.pEC50值。
趾外展分数(DAS)测定法
在DAS测定法中测量BoNT/AB嵌合体1、2和3A活性的方法是基于小鼠经尾巴短暂悬挂时的惊吓反应脚趾张开反射。这种反射被评分为趾外展分数(DAS)，并且在将BoNT施用到后爪的腓肠肌-比目鱼肌后受到抑制。将小鼠的尾巴短暂悬挂起来，以引发特征性的惊吓反应，其中动物伸出其后肢并外展其后趾。(Aoki等人，1999,Eur.J.Neurol.；6(suppl.4)S3-S10)。
注射当天，将小鼠在接受含3％异氟醚的氧气的诱导室中麻醉。每只小鼠在右后爪的腓肠肌-比目鱼肌中接受BoNT/AB嵌合体或载剂(含有0.2％明胶的磷酸盐缓冲液)的肌内注射。
注射神经毒素后，对不同程度的趾外展进行评分，量表从0到4，其中0＝正常，4＝趾外展和腿伸展的最大程度减少。通过非线性调整分析使用每个剂量的最大效应的平均值确定ED50。使用的数学模型是4参数逻辑模型。
给药后第一天每2小时进行一次DAS；此后每天进行3次，持续4天。
图7显示了嵌合体1、2和3A(分别为转换成双链形式的SEQ ID NO：11、12和13)的拟合曲线。嵌合体3A的曲线向左移动，意味着与嵌合体1和2相比，较低剂量的嵌合体3A实现了相似的DAS反应，因此表明嵌合体3A在小鼠DAS测定法中比其他嵌合体更有效；还参见下表(表6)，其提供了每个嵌合体的计算的ED50值和导致DAS 4(最高分数)的剂量。
下表6提供了小鼠DAS测定法中针对未修饰的重组BoNT/A1(rBoNT/A1-转换成双链形式的SEQ ID NO：2)和嵌合体1、2和3A确定的ED50和DAS 4剂量。这些结果表明，在三种嵌合体中，嵌合体3A在诱导肌肉无力方面具有最高的体内效力。图7和表6所示的研究是在从Charles River实验室获得的小鼠上进行的。
表6ED50值。
实施例5
BoNT/AB嵌合体3B、3C和未修饰的BoNT/A1的比较
如实施例3中所述纯化未标记的BoNT/AB嵌合体3B和3C，其分别具有或不具有E1191M/S1199Y双突变(SEQ ID NO:14和15)(图8)，使用未修饰的BoNT/A(转换成双链形式的SEQ ID NO：2)作为参照测试功能活性。
人多能干细胞SNAP-25切割测定法
冷冻保存的PERI.4U细胞购自Axiogenesis(德国科隆)。按照制造商的推荐进行细胞的解冻和铺板。简而言之，将含有细胞的冷冻管在37℃水浴中解冻2分钟。轻轻重悬后，将细胞转移至50mL管中。用制造商提供的1mL 解冻培养基洗涤冷冻管，并将培养基滴加转移到50mL管中的细胞悬浮液中，然后再添加2mL解冻培养基，滴加至50mL管中。然后使用血细胞计数器对细胞进行计数。此后，将另外6mL解冻培养基添加到细胞悬浮液中。通过在室温下以260xg(例如1,100RPM)离心6分钟获得细胞沉淀。然后将细胞重悬于制造商提供的完全培养基中。将细胞以50,000至150,000个细胞/cm2的密度铺板在包被有聚-L-鸟氨酸和层粘连蛋白的细胞培养板上。将细胞在37℃、湿润的CO2气氛中培养，培养期间每2-3天彻底更换培养基。
对于毒素处理，在培养基中制备连续稀释的BoNT。收集并过滤来自待处理孔的培养基(0.2μm过滤器)。将125μL过滤的培养基加回到每个测试孔中。然后将125μL稀释的毒素添加到板中(一式三份)。将处理的细胞在37℃、10％CO2下孵育48±1小时。
使用SNAP-25切割测定法分析BoNT活性
处理后，去除BoNT并将细胞在PBS(Gibco，英国)中洗涤一次。将细胞在补充有0.1M二硫苏糖醇(DTT)和250单位/mL苯佐酶(Sigma)的1x NuPAGE裂解缓冲液(LifeTechnologies)中裂解。通过SDS-PAGE分离裂解物蛋白质并转移到硝酸纤维素膜上。使用SNAP-25特异性一抗(Sigma#S9684)探针检测膜，该抗体可识别未切割的SNAP-25以及被BoNT/A内肽酶切割的SNAP-25。使用的二抗是HRP缀合的抗兔IgG(Sigma#A6154)。通过增强化学发光检测条带，并使用pXi6 Access(Synoptics，英国)成像。使用GeneTools软件(Syngene，剑桥，英国)测定条带强度，并计算在每个BoNT浓度下切割的SNAP-25的百分比。将数据拟合至4参数逻辑方程，并使用GraphPad Prism第6版(GraphPad)计算pEC50。
图9显示嵌合体3B和3C在诱导人多能干细胞中在切割SNAP-25方面表现出比rBoNT/A1更大的效力，但前者明显更有效。这可以通过双突变来解释，双突变增加了嵌合体3B对这些细胞中存在的人突触结合蛋白II蛋白受体的亲和力(图9、表7)。
pEC50±SEM
rBoNT/A1 10.21±0.05
嵌合体3B 12.38±0.06
嵌合体3C 10.72±0.08
表7.pEC50值。
趾外展分数(DAS)测定法–安全比
在DAS测定法中测量BoNT活性的方法是基于小鼠经尾巴短暂悬挂时的惊吓反应脚趾张开反射。这种反射被评分为趾外展分数(DAS)，并且在将BoNT施用到后爪的腓肠肌-比目鱼肌后受到抑制。将小鼠的尾巴短暂悬挂起来，以引发特征性的惊吓反应，其中动物伸出其后肢并外展其后趾。(Aoki等人，1999,Eur.J.Neurol.；6(suppl.4)S3-S10)。
注射当天，将小鼠在接受含3％异氟醚的氧气的诱导室中麻醉。每只小鼠在右后爪的腓肠肌-比目鱼肌中接受BoNT或载剂(含有0.2％明胶的磷酸盐缓冲液)的肌内注射。
注射神经毒素后，对不同程度的趾外展进行评分，量表从0到4，其中0＝正常，4＝趾外展和腿伸展的最大程度减少。通过非线性调整分析使用每个剂量的最大效应的平均值确定ED50。使用的数学模型是4参数逻辑模型。
给药后第一天每2小时进行一次DAS；此后每天进行3次，对所有剂量持续4天。此后对注射载剂和最低剂量的组中的动物进行监测，该最低剂量在注射的前四天内诱导DAS为4，直到肌肉无力完全恢复至DAS为0(未观察到肌肉无力)。
为了计算安全比，在毒素注射前一天(D0)对所有动物进行称重，此后在整个研究期间每天称重一次。每天计算每个剂量组的平均体重、其标准偏差和标准误差平均值。为了获得BoNT的安全比(-10％ΔBW/ED50)，使研究期间任何时间剂量组的平均体重低于同一剂量组在D0时平均体重的10％的剂量除以所研究的BoNT的ED50。致死剂量定义为该剂量组内一只或多只动物死亡的剂量。
图10显示了在小鼠趾外展评分测定法中，未修饰的BoNT/A、嵌合体3B和嵌合体3C(转换成双链形式的SEQ ID NO:2、14和15)的随时间肌肉弱化的持续时间，表明嵌合体具有更长的作用持续时间。
下表8提供了在小鼠DAS测定法中针对rBoNT/A1和嵌合体3B和3C确定的ED50和DAS4剂量。该表还提供了直至肌肉无力完全恢复至DAS 0(未观察到肌肉无力)的DAS 4剂量的总作用持续时间。此外，该表还显示了小鼠致死剂量和安全比(-10％ΔBW/ED50)，如上文所定义。与rBoNT/A1相比，嵌合体3B和3C具有更长的作用持续时间、更好的安全比和更高的致死剂量。图10和表8所示的研究是在从Janvier实验室获得的小鼠上进行的。
表8.BoNT/AB嵌合体的DAS和安全比。
实施例6
修饰的BoNT/A(转换成双链形式的SEQ ID NO:4)的临床前测试
对修饰的BoNT/A“Cat-A”(转换成双链形式的SEQ ID NO：4)进行了另外的临床前测试。
材料与方法
大鼠趾外展分数(DAS)测定法
为了评估修饰的BoNT/A(转换成双链形式的SEQ ID NO:4)对体内肌肉活性的影响，使用大鼠DAS测定法进行剂量反应研究。大鼠DAS测定法基于脚趾张开反射，这是动物被短暂抓住时的一种特征性惊吓反应。将单次神经毒素注射到左腓骨肌复合体后，肌肉无力会导致趾外展减少。基于5分量表对不同程度的趾外展进行评分：0＝正常到4＝趾外展和腿伸展的最大程度减少(Broide RS,Rubino J,Nicholson GS,等人，The rat DigitAbduction Score(DAS)assay:A physiological model for assessing botulinumneurotoxin-induced skeletal muscle paralysis.Toxicon 013；71:18-24)。在注射毒素后连续的前五天测量DAS值，此后每隔两至三天测量DAS值，直至修饰的BoNT/A(转换成双链形式的SEQ ID NO：4)的较低剂量对脚趾伸展反射的作用完全消失，并且导致DAS4的剂量对脚趾伸展反射的作用恢复至DAS2。短暂BoNT诱导的剂量依赖性的体重增加作用被认为是普遍毒素作用的证据(Torii Y,Goto Y,Nakahira S,等人，Comparison of SystemicToxicity between Botulinum Toxin Subtypes A1 and A2 in Mice and Rats.BasicClin.Pharmacol.Toxicol.2015；116:524-528)。在每个评估时间点对大鼠进行称重并记录副作用。BoNT的给药溶液在注射前直到研究结束均被掩盖(分配随机字母)。效力被确定为诱导50％效果所需的剂量(ED50：导致DAS值为2的剂量)。为了确定ED50和95％置信区间(CI)，测试了2.5至750pg/kg的剂量范围。还施用了1、1.5、2、2.4、3、4和5ng/kg的更高剂量，以评估可能的副作用。
为了评估修饰的BoNT/A(转换成双链形式的SEQ ID NO:4)的作用持续时间并将其与未修饰的BoNT/A(转换成双链形式的SEQ ID NO:2)的作用持续时间进行比较，在两项独立的、直接头对头的研究中评估了两种毒素最高耐受剂量(与未经治疗的大鼠相比，对体重变化没有影响)的返回至DAS2读数2所需的中位时间。
大鼠单剂量研究
大鼠接受单次肌内(i.m.)注射修饰的BoNT/A(转换成双链形式的SEQ ID NO:4)，以0、0.1、1和3ng/kg的剂量施用到右侧腓肠肌。对照动物在右侧腓肠肌接受SEQ ID NO：4稀释液。治疗后7天(每组10只雄性和10只雌性)或13或26周观察期(每个剂量5只雄性和5只雌性)后对动物实施安乐死。用于评估中枢神经系统功能的欧文测试观察在预测试(第-1天)、第8天以及第13周和第27周期间进行。评估的其他临床(不良)体征是跛行、小注射毒素的肌肉尺寸和腹部软胀。
猴子研究
猴子接受单次肌内注射，向右侧腓肠肌施用剂量为0、0.1、0.25和0.75ng/kg的修饰的BoNT/A(转换成双链形式的SEQ ID NO：4)。治疗后7天(每组3只雄性和3只雌性)或13或26周观察期(每个剂量2只雄性和2只雌性)后对动物实施安乐死。第8天和第15天通过外部遥测预测试进行心血管检查，包括血流动力学、心电图和呼吸参数。
妊娠大鼠中初步增强的EFD
该研究的目的是提供关于修饰的BoNT/A(转换成双链形式的SEQ ID NO：4)在整个器官发生期间通过肌内途径施用时，对大鼠胚胎和胎儿发育的影响的初步信息。从妊娠第6天(G6)至第17天(G17)(包含G6和G17)，每天通过肌内注射(腓肠肌)向9只交配雌性Sprague-Dawley大鼠的组施用修饰的BoNT/A(转换成双链形式的SEQ ID NO：4)，剂量水平为0.02、0.05和0.1ng/kg/天。在整个研究过程中监测临床状况、体重和食物消耗。对雌性在G21进行剖腹产检查并记录窝仔参数。在尸检时，对雌性进行肉眼检查，对妊娠子宫进行称重，对于那些表现出小的被注射的腓肠肌的雌性，对该肌肉和对侧肌肉进行称重。对所有胎儿进行称重。然后检查胎儿的外部和内脏异常并确定性别。大约一半胎儿的头部被固定以通过连续切片进行内部检查。所有胎儿的去内脏尸体均被处理以进行骨骼检查。
妊娠兔中初步延长的EFD
该研究的目的是提供关于修饰的BoNT/A(转换为双链形式的SEQ ID NO：4)在整个器官发生期间通过肌内途径施用时，对兔胚胎和胎儿发育的影响的初步信息。从妊娠第6天(G6)至第19天(G19)(包含G6和G19)，每天通过肌内注射(腓肠肌)向9只交配雌性新西兰白兔的组施用修饰的BoNT/A(转换成双链形式的SEQ ID NO：4)，剂量水平为0.002、0.005和0.01ng/kg/天。在整个研究过程中监测临床状况、体重和食物消耗。对雌性在G29进行剖腹产检查并记录窝仔参数。在尸检时，对雌性进行肉眼检查，对妊娠子宫进行称重，对于那些表现出小的被注射的腓肠肌的雌性，对该肌肉和对侧肌肉进行称重。对所有胎儿进行称重。然后检查胎儿的外部和内脏异常并确定性别。大约一半胎儿的头部被固定以通过连续切片进行内部检查。
结果
通过进行如上所述的研究，对于施用修饰的BoNT/A的许多不同物种获得了以下药理学数据(在下表9中示出)。
表9.临床前结果。
另外，在大鼠DAS测定法中测试了修饰的BoNT/A(转换成双链形式的SEQ ID NO:4)，以确定与相比的作用持续时间。结果如下表10所示：
表10.作用持续时间。
这些数据表明，修饰的BoNT/A的作用持续时间是的两倍以上。
实施例7
确定用于治疗颈肌张力障碍的修饰的BoNT/A(转换成双链形式的SEQ ID NO:4)的 单位剂量
鉴于以上实施例6中获得的临床前药理学数据，已经确定了用于在人中施用修饰的BoNT/A的合适的单位剂量范围(UD)。研究表明，修饰的BoNT/A比未修饰的BoNT/A具有更长的作用持续时间，同时表现出更高的安全性。这种改进的安全性可以通过本文所述的修饰的BoNT/A的高安全性比来表达。
由于修饰的BoNT/A与具有相同的作用机制(尽管由于其修饰的特性而增加了安全比)，用于治疗受试者的修饰BoNT/A的最低剂量已根据在相同肌肉群的背景下相对于的标签剂量进行了定位：
·在趾外展分数大鼠模型中，修饰的BoNT/A的ED50为13pg/kg，比在相同动物物种中1500pg/kg的估计未观察到不良效应水平(NOAEL)低100倍以上。在相同大鼠模型中，的ED50为0.5U/kg。根据这些动物数据，2.6ng修饰的BoNT/A的剂量可估计为100U的剂量。
·小鼠腹膜内LD50确定为8.44pg。在这些条件下，0.84ng修饰的BoNT/A的剂量相当于100U的剂量。
因此，计算的最低剂量为500pg(0.5ng)。为了提供一些背景信息并使用上述腹膜内小鼠LD50数据，0.5ng修饰的BoNT/A相当于约60U因此在肌内注射治疗颈肌张力障碍时将具有活性。
在大鼠中1.5ng/kg修饰的BoNT/A的估计的NOAEL相当于体重60kg的人中的90ng剂量。在猴子(所测试的两个非临床物种中更敏感的物种)中，0.125ng/kg修饰BoNT/A的估计NOAEL相当于60kg体重的人中的7.5ng剂量。
因此，单位剂量的上限确定为7,500pg(7.5ng)，因为这仍然低于换算为人剂量的大鼠NOAEL。
因此，使用修饰的BoNT/A治疗颈肌张力障碍的合适单位剂量已确定为500-7,500pg。根据获得的临床前数据，如使用小鼠腹膜内致死剂量测定法测定的，根据计算的小鼠腹膜内半数致死剂量(LD50)，该剂量为约59-889单位的修饰的BoNT/A(也对应于约59-889单位的)。
鉴于如实施例6的临床前数据所确定的与相比改进的安全性，预期在颈肌张力障碍中施用的总剂量(以单位计)几乎是的9倍。治疗颈肌张力障碍的最大总剂量为1,000单位(见图1)。
有利地，在治疗颈肌张力障碍中，在达到最大剂量之前，可以注射更多修饰的BoNT/A和/或可以在更多数量的颈部肌肉/部位处注射。这是一个重要且有利的发现，产生了改进的颈肌张力障碍治疗，同时为临床医生提供了更广泛的治疗选择。
实施例8
治疗宫颈肌张力障碍的剂量方案
修饰的BoNT/A(例如转换成双链形式的SEQ ID NO：4)以冻干粉末的形式提供在2mL透明玻璃小瓶中，每瓶含有15ng修饰的BoNT/A。将冻干粉末用无菌氯化钠0.9％v/w无防腐剂溶液和稀释剂(仅含有修饰的BoNT/A的赋形剂的配制缓冲液)的混合物重构。重构后，根据需要进一步稀释溶液。
单位剂量(UD)为500-7,500pg(约59-889单位)。
根据以下剂量方案通过肌内注射治疗颈肌张力障碍(表11)：
颈部肌肉 剂量(单位剂量)
胸锁乳突肌 1x UD
头夹肌 1x UD
颈夹肌 1x UD
斜方肌 1x UD
肩胛提肌 1x UD
中斜角肌 1x UD
前斜角肌 1x UD
头半棘肌 1x UD
最长肌 1x UD
表11.剂量方案。
根据具体表现的需要，施用可以是单侧或双侧。
施用的最大总剂量是10x UD(例如，在一些情况下，向指定的一个或多个颈部肌肉施用2x UD)。这对应于75,000pg/约8,890单位。这几乎是在颈肌张力障碍治疗期间可以施用、而不会接近毒性极限(传统治疗方案的关注问题)的的最大总剂量的9倍。因此，临床医生能够在知道可以施用10x UD而无需担心毒性的情况下为患者量身定制治疗，从而允许治疗受试者的额外颈部肌肉和/或确保每个颈部肌肉收到药学有效剂量。
实施例9
修饰的BoNT/A(BoNT/AB嵌合体[转换成双链形式的SEQ ID NO:14])的临床前测试
在小鼠LD50测定法中测试了BoNT/AB嵌合体SEQ ID NO:14(转换成双链形式)，得到的结果为1.202ng/kg。因此，在本测定法中1单位的SEQ ID NO：14(转换为双链形式)对应于24.04pg。
另外，在大鼠DAS测定法中测试了所述BoNT/AB嵌合体，以确定与相比的作用持续时间(根据实施例6)。结果如下表12所示：
表12.作用持续时间。
总之，BoNT/AB的作用持续时间远高于并且与SEQ ID NO：4(转换成双链形式)相似。因此，预期SEQ ID NO:4(转换成双链形式)的单位剂量和剂量方案同样可以应用于BoNT/AB，以提供改善的颈肌张力障碍的治疗。
实施例10
确定用于治疗颈肌张力障碍的修饰的BoNT/A(转换成双链形式的SEQ ID NO:14) 的单位剂量
根据临床前药理学数据，已经确定了用于在人中施用修饰的BoNT/A的合适的单位剂量范围(UD)。
计算的SEQ ID NO：14(转换成双链形式)的DAS ED50是13pg/kg。ED50被认为是最小药理活性剂量，比相同动物物种中4ng/kg的未观察到不良反应水平(NOAEL)低约300倍。在大鼠中SEQ ID NO:14(转换成双链形式)的13pg/kg的ED50相当于体重60kg的人的0.8ng剂量。
因此，选择单位剂量的下限为1,000pg。选择单位剂量的上限为16,000pg，低于换算成60kg体重的人剂量的两种非临床安全物种(大鼠和猴)的4ng/kg的NOAEL。因此，单位剂量确定为1,000pg至16,000pg(约42单位至约666单位)。
鉴于安全性的提高，治疗颈肌张力障碍的最大总剂量设定为160,000pg(约7,070单位)，该剂量源自转换为60kg体重人剂量的两种非临床安全物种(大鼠和猴)的4ng/kg的NOAEL。
鉴于如实施例9的临床前数据所确定的与相比改进的安全性，预期在颈肌张力障碍中施用的总剂量(以单位计)几乎是的7倍。治疗颈肌张力障碍的最大总剂量为1,000单位(见图1)。
有利地，在治疗颈肌张力障碍中，在达到最大剂量之前，可以注射更多修饰的BoNT/A(转换成双链形式的SEQ ID NO:14)和/或可以在更多数量的颈部肌肉/部位处注射。这是一个重要且有利的发现，产生了改进的颈肌张力障碍治疗，同时为临床医生提供了更广泛的治疗选择。
实施例11
使用修饰的BoNT/A(转换成双链形式的SEQ ID NO：14)治疗颈肌张力障碍的剂量 方案
修饰的BoNT/A(例如转换成双链形式的SEQ ID NO：14)以冻干粉末的形式提供在每瓶含有36ng修饰的BoNT/A的小瓶中。将冻干粉末重构。
单位剂量(UD)为1,000-16,000pg(约42-666单位[通过小鼠LD50测量])。
根据以下剂量方案通过肌内注射治疗颈肌张力障碍(表13)：
颈部肌肉 剂量(单位剂量)
胸锁乳突肌 1x UD
头夹肌 1x UD
颈夹肌 1x UD
斜方肌 1x UD
肩胛提肌 1x UD
中斜角肌 1x UD
前斜角肌 1x UD
头半棘肌 1x UD
最长肌 1x UD
表13.剂量方案。
根据具体表现的需要，施用可以是单侧或双侧。
施用的最大总剂量是10x UD(例如，在一些情况下，向指定的一个或多个颈部肌肉施用2x UD)。这对应于160,000pg/约6,660单位。这几乎是在颈肌张力障碍治疗期间可以施用、而不会接近毒性极限(传统治疗方案的关注问题)的的最大总剂量的7倍。因此，临床医生能够在知道可以施用10x UD而无需担心毒性的情况下为患者量身定制治疗，从而允许治疗受试者的额外颈部肌肉和/或确保每个颈部肌肉收到药学有效剂量。
实施例12
颈肌张力障碍(侧颈)患者的治疗
Jane，65岁，被全科医生诊断为颈肌张力障碍。具体表现为侧颈。将单个单位剂量(3，000pg)修饰的BoNT/A(转换为双链形式的SEQ ID NO：4)同侧施用至Jane的肩胛提肌，并且还将单个单位剂量同侧施用至Jane的胸锁乳突肌(导致治疗期间的总剂量为6,000pg)。侧颈得到缓解，并且由于修饰BoNT/A的持续时间较长，Jane超过9个月不需要进一步治疗。因此，与施用未修饰的BoNT/A的同等受试者相比，Jane接受较少频率的注射(例如每年)。此外，由于修饰的BoNT/A的安全性得到改善，Jane没有表现出任何副作用。
实施例13
颈肌张力障碍(伸颈)患者的治疗
Brian，48岁，被全科医生诊断为颈肌张力障碍。具体表现为伸颈。将修饰的BoNT/A(转换成双链形式的SEQ ID NO:14)双侧施用至Brian的以下每个肌肉：
·每个肩胛提肌施用10,000pg的1x单位剂量(UD)；
·每个斜方肌施用10,000pg的1xUD；
·每个最长肌施用10,000pg的1xUD；
·每个头夹肌施用10,000pg的1xUD；和
·每个颈夹肌施用10,000pg的1xUD。
施用的总剂量为10xUD(100,000pg)，完全在160,000pg的上限之内，并且考虑到与未修饰的BoNT/A相比，修饰的BoNT/A具有更高的安全性，这是可行的。伸颈得到缓解，并且由于修饰BoNT/A的持续时间较长，Brian在12个月内不需要进一步治疗。因此，与施用未修饰的BoNT/A的同等受试者相比，Brian接受较少频率的注射。
实施例14
修饰的BoNT/A (转换成双链形式的SEQ ID NO:14)在人中的安全性和效力
通过单个单位剂量的修饰的BoNT/A的方式，将SEQ ID NO:14(转换成双链形式)施用至人受试者。向5个队列施用不同(增加)量的修饰的BoNT/A(转换成双链形式的SEQ IDNO:14)。队列1施用2x 1,000pg单位剂量的修饰的BoNT/A(即，最大2,000pg)，而队列5施用2x 16,000pg单位剂量的修饰的BoNT/A(即，最大32,000pg)。
结果表明，所测试的所有单位剂量的修饰的BoNT/A(即，至多16,000pg单位剂量)对肌肉麻痹均有效，可安全耐受，并且尽管每个肌肉的剂量异常高，但未观察到不良反应。这表明修饰的BoNT/A不会从注射部位扩散，并突显了修饰的BoNT/A(转换成双链形式的SEQID NO:14)的异常的安全性。
实施例15
颈肌张力障碍患者的治疗
64岁的Sally被全科医生诊断为颈肌张力障碍。她通过1000pg单位剂量(UD)的SEQID NO:14(转换成双链形式)的方式进行治疗，如下进行施用：
颈部肌肉 剂量(单位剂量)
右肩胛提肌 1x UD
左肩胛提肌 1x UD
右斜方肌 1x UD
左斜方肌 1x UD
右胸锁乳突肌 1x UD
左胸锁乳突肌 1x UD
右头夹肌 1x UD
左头夹肌 1x UD
中斜角肌 1x UD
前斜角肌 1x UD
右头半棘肌 1x UD
左头半棘肌 1x UD
右头最长肌 1x UD
左头最长肌 1x UD
她接受了总剂量为14,000pg的SEQ ID NO:14(转换成双链形式)。治疗很成功，她的症状得到缓解。她超过9个月不需要治疗。
实施例16
颈肌张力障碍患者的治疗
Francesco，43岁，被全科医生诊断为颈肌张力障碍。他通过2000pg单位剂量(UD)的SEQ ID NO:14(转换成双链形式)的方式进行治疗，如下进行施用：
颈部肌肉 剂量(单位剂量)
右肩胛提肌 1x UD
左肩胛提肌 1x UD
右斜方肌 1x UD
左斜方肌 1x UD
右胸锁乳突肌 1x UD
左胸锁乳突肌 1x UD
右头夹肌 1x UD
左头夹肌 1x UD
中斜角肌 1x UD
前斜角肌 1x UD
右头半棘肌 1x UD
左头半棘肌 1x UD
右头最长肌 1x UD
左头最长肌 1x UD
他接受了总剂量为28,000pg的SEQ ID NO:14(转换成双链形式)。治疗很成功，他的症状得到缓解。她超过10个月不需要治疗。
以上说明书中提及的所有出版物均通过引用并入本文。在不脱离本发明的范围和主旨的情况下，本发明所描述的方法和系统的各种修改和变化对本领域技术人员将是显而易见的。尽管已经结合特定的优选实施方案描述了本发明，但是应当理解，所要求保护的发明不应不适当地限于这样的特定实施方案。实际上，对于生物化学和生物技术或相关领域的技术人员而言，对描述的用于执行本发明的方式进行各种修改是显而易见的，且落入以下权利要求的范围内。

Claims (66)

1.一种修饰的肉毒杆菌神经毒素A(BoNT/A)，用于治疗颈肌张力障碍的用途，其中修饰的BoNT/A通过肌内注射施用至受试者受影响的颈部肌肉，其中修饰的BoNT/A通过单位剂量750pg至17,000pg的修饰的BoNT/A的方式进行施用，
其中将至少单个单位剂量施用至受影响的颈部肌肉，其中在治疗期间施用的总剂量高达170,000pg修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域，以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
2.一种修饰的BoNT/A，其用于治疗受试者的颈肌张力障碍的用途，其持续时间比用未修饰的BoNT/A(例如SEQ ID NO:2)治疗的持续时间更长，其中修饰的BoNT/A通过肌内注射施用至受试者受影响的颈部肌肉，
其中修饰的BoNT/A通过单位剂量750pg至17,000pg的修饰的BoNT/A的方式进行施用，
其中将至少单个单位剂量施用至受影响的颈部肌肉，
其中在治疗期间施用的总剂量高达170,000pg修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域，以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
3.一种治疗颈肌张力障碍的方法，所述方法包括通过肌内注射向受试者受影响的颈部肌肉施用修饰的BoNT/A，
其中所述修饰的BoNT/A以单位剂量750pg至17,000pg的修饰的BoNT/A的方式施用，
其中向受影响的颈部肌肉施用至少单个单位剂量，
其中在治疗期间施用的总剂量高达170,000pg修饰的BoNT/A，并且
其中所述修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域，以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
4.一种治疗受试者颈肌张力障碍的方法，其持续时间比用未修饰的BoNT/A(例如SEQID NO：2)治疗的持续时间更长，所述方法包括通过肌内注射向受试者受影响的颈部肌肉施用修饰的BoNT/A，
其中所述修饰的BoNT/A以单位剂量750pg至17,000pg的修饰的BoNT/A的方式施用，
其中向受影响的颈部肌肉施用至少单个单位剂量，
其中在治疗期间施用的总剂量高达170,000pg修饰的BoNT/A，并且
其中所述修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域，以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
5.修饰的肉毒杆菌神经毒素A(BoNT/A)在制备用于治疗颈肌张力障碍的药物中的用途，其中修饰的BoNT/A通过肌内注射施用至受试者受影响的颈部肌肉，
其中修饰的BoNT/A通过单位剂量750pg至17,000pg的修饰的BoNT/A的方式进行施用，
其中将至少单个单位剂量施用至受影响的颈部肌肉，
其中在治疗期间施用的总剂量高达170,000pg修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域，以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
6.修饰的BoNT/A在制备用于治疗受试者的颈肌张力障碍的药物中的用途，其持续时间比用未修饰的BoNT/A(例如SEQ ID NO：2)治疗的持续时间更长，其中修饰的BoNT/A通过肌内注射施用至受试者受影响的颈部肌肉，
其中修饰的BoNT/A通过单位剂量750pg至17,000pg的修饰的BoNT/A的方式进行施用，
其中将至少单个单位剂量施用至受影响的颈部肌肉，
其中在治疗期间施用的总剂量高达170,000pg修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域，以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
7.根据权利要求1或权利要求2所述用途的修饰的BoNT/A、根据权利要求3或权利要求4所述的方法、或根据权利要求5或权利要求6所述的用途，其中施用的总剂量为5,250pg至170,000pg，优选7,000pg至160,000pg。
8.根据前述权利要求中任一项所述的修饰的BoNT/A、方法或用途，其中所述单位剂量是1,000pg至16,000pg。
9.根据前述权利要求中任一项所述用途的修饰的BoNT/A、方法或用途，其中在治疗期间施用的总剂量为高达160,000pg的修饰的BoNT/A。
10.根据前述权利要求中任一项所述用途的修饰的BoNT/A、方法或用途，其中所述修饰的BoNT/A在单个注射部位或在两个或更多个注射部位(例如两个注射部位)施用于受影响的颈部肌肉。
11.根据权利要求10所述用途的修饰的BoNT/A、方法或修饰的BoNT/A的用途，其中所述修饰的BoNT/A以每个注射部位750-4,000pg(优选1,000pg或2,000pg)的单位剂量施用。
12.一种修饰的肉毒杆菌神经毒素A(BoNT/A)，其用于治疗颈肌张力障碍的用途，其中修饰的BoNT/A通过肌内注射施用至受试者受影响的颈部肌肉，
其中修饰的BoNT/A以31单位(U)至707U的修饰的BoNT/A的单位剂量的方式进行施用，其中1单位是对应于小鼠中计算的半数致死剂量(LD50)的修饰的BoNT/A的量，
其中向受影响的颈部肌肉施用至少单个单位剂量，
其中在治疗期间施用的总剂量高达7,070U修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域，以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
13.一种修饰的BoNT/A，其用于治疗受试者的颈肌张力障碍的用途，其持续时间比用未修饰的BoNT/A(例如SEQ ID NO:2)治疗的持续时间更长，其中修饰的BoNT/A通过肌内注射施用至受试者受影响的颈部肌肉，
其中修饰的BoNT/A以31单位(U)至707U的修饰的BoNT/A的单位剂量的方式进行施用，其中1单位是对应于小鼠中计算的半数致死剂量(LD50)的修饰的BoNT/A的量，
其中向受影响的颈部肌肉施用至少单个单位剂量，
其中在治疗期间施用的总剂量至多7,070U修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域，以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
14.一种治疗颈肌张力障碍的方法，所述方法包括通过肌内注射向受试者受影响的颈部肌肉施用修饰的BoNT/A，
其中修饰的BoNT/A以31U至707U的修饰的BoNT/A的单位剂量的方式施用，其中1单位是对应于在小鼠中计算的半数致死剂量(LD50)的修饰的BoNT/A的量，
其中向受影响的颈部肌肉施用至少单个单位剂量，
其中在治疗期间施用的总剂量至多7,070U修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域，以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
15.一种治疗受试者颈肌张力障碍的方法，其持续时间比用未修饰的BoNT/A(例如SEQID NO：2)治疗的持续时间更长，所述方法包括通过肌内注射向受试者受影响的颈部肌肉施用修饰的BoNT/A，
其中修饰的BoNT/A以31U至707U的修饰的BoNT/A的单位剂量的方式进行施用，其中1单位是对应于小鼠中计算的半数致死剂量(LD50)的修饰的BoNT/A的量，
其中向受影响的颈部肌肉施用至少单个单位剂量，
其中在治疗期间施用的总剂量至多7,070U修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域，以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
16.修饰的肉毒杆菌神经毒素A(BoNT/A)在制备用于治疗颈肌张力障碍的药物中的用途，其中修饰的BoNT/A通过肌内注射施用至受试者受影响的颈部肌肉，
其中修饰的BoNT/A以31U至707U的修饰的BoNT/A的单位剂量的方式进行施用，其中1单位是对应于小鼠中计算的半数致死剂量(LD50)的修饰的BoNT/A的量，
其中向受影响的颈部肌肉施用至少单个单位剂量，
其中在治疗期间施用的总剂量至多7,070U修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域，以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
17.修饰的BoNT/A在制备用于治疗受试者的颈肌张力障碍的药物中的用途，其持续时间比用未修饰的BoNT/A(例如SEQ ID NO：2)治疗的持续时间更长，其中修饰的BoNT/A通过肌内注射施用至受试者受影响的颈部肌肉，
其中修饰的BoNT/A以31U至707U的修饰的BoNT/A的单位剂量的方式进行施用，其中1单位是对应于小鼠中计算的半数致死剂量(LD50)的修饰的BoNT/A的量，
其中向受影响的颈部肌肉施用至少单个单位剂量，
其中在治疗期间施用的总剂量至多7,070U修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域，以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
18.根据权利要求12或权利要求13所述用途的修饰的BoNT/A、根据权利要求14或权利要求15所述的方法、或根据权利要求16或权利要求17所述的修饰的BoNT/A的用途，其中施用的总剂量为217U至7,070U，优选294U至6,660U。
19.根据权利要求12、13或18中任一项所述用途的修饰的BoNT/A、根据权利要求14、15或18中任一项所述的方法、或根据权利要求16-18中任一项所述的修饰BoNT/A的用途，其中单位剂量为42U至666U。
20.根据权利要求12、13、18或19中任一项所述用途的修饰的BoNT/A、根据权利要求14、15、18或19中任一项所述的方法、或者根据权利要求16-19中任一项所述的修饰BoNT/A的用途，其中治疗期间施用的总剂量至多6,660U修饰的BoNT/A。
21.根据权利要求12、13或18-20中任一项所述用途的修饰的BoNT/A、根据权利要求14、15或18-20中任一项所述的方法、或者根据权利要求16-20中任一项所述的修饰BoNT/A的用途，其中所述修饰的BoNT/A在单个注射部位或在两个或更多个注射部位(例如两个注射部位)施用于受影响的颈部肌肉。
22.根据权利要求21所述用途的修饰的BoNT/A、方法或修饰的BoNT/A的用途，其中所述修饰的BoNT/A以每个注射部位31-166.4单位(优选41.6单位或83.2单位)的单位剂量的方式施用。
23.根据前述权利要求中任一项所述用途的修饰的BoNT/A、方法或修饰的BoNT/A的用途，其中所述修饰的BoNT/A包含两个取代突变的组合，所述两个取代突变为E1191M和S1199Y。
24.根据前述权利要求中任一项所述用途的修饰的BoNT/A、方法或修饰的BoNT/A的用途，其中所述修饰的BoNT/A包含与SEQ ID NO：14具有至少70％序列同一性的多肽序列。
25.根据前述权利要求中任一项所述用途的修饰的BoNT/A、方法或修饰的BoNT/A的用途，其中修饰的BoNT/A是双链修饰的BoNT/A，其中轻链(L链)通过二硫键连接至重链(H链)，所述修饰的BoNT/A可通过以下方法获得，所述方法包括使包含SEQ ID NO：14的单链修饰的BoNT/A与蛋白酶接触，所述蛋白酶水解其活化环中的肽键，从而将单链修饰的BoNT/A转化为相应的双链修饰的BoNT/A。
26.根据前述权利要求中任一项所述用途的修饰的BoNT/A、方法或修饰的BoNT/A的用途，其中修饰的BoNT/A是双链修饰的BoNT/A，其中L链通过二硫键连接至H链，所述修饰的BoNT/A可通过以下方法获得，所述方法包括使由SEQ ID NO：14组成的单链修饰的BoNT/A与蛋白酶接触，所述蛋白酶水解其活化环中的肽键，从而将单链修饰的BoNT/A转化为相应的双链修饰的BoNT/A。
27.一种修饰的肉毒杆菌神经毒素A(BoNT/A)，用于治疗颈肌张力障碍的用途，其中修饰的BoNT/A通过肌内注射施用至受试者受影响的颈部肌肉，
其中修饰的BoNT/A以单位剂量450pg至8,000pg的修饰的BoNT/A的方式进行施用，
其中将至少单个单位剂量施用至受影响的颈部肌肉，
其中在治疗期间施用的总剂量至多80,000pg修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A在选自以下的一个或多个氨基酸残基处包含修饰：ASN 886，ASN905，GLN 915，ASN 918，GLU 920，ASN 930，ASN 954，SER 955，GLN 991，GLU 992，GLN 995，ASN 1006，ASN 1025，ASN 1026，ASN 1032，ASN 1043，ASN 1046，ASN 1052，ASP 1058，HIS1064，ASN 1080，GLU 1081，GLU 1083，ASP 1086，ASN 1188，ASP 1213，GLY 1215，ASN1216，GLN 1229，ASN 1242，ASN 1243、SER 1274、和THR 1277，其中所述修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；
(ii)用不带电荷的氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代表面暴露的不带电荷的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；和
(v)删除表面暴露的酸性氨基酸残基。
28.一种修饰的BoNT/A，其用于治疗受试者的颈肌张力障碍的用途，其持续时间比用未修饰的BoNT/A(例如SEQ ID NO：2)治疗的持续时间更长，其中修饰的BoNT/A通过肌内注射施用至受试者受影响的颈部肌肉，
其中修饰的BoNT/A以单位剂量450pg至8,000pg的修饰的BoNT/A的方式进行施用，
其中将至少单个单位剂量施用至受影响的颈部肌肉，
其中在治疗期间施用的总剂量至多80,000pg修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A在选自以下的一个或多个氨基酸残基处包含修饰：ASN 886，ASN905，GLN 915，ASN 918，GLU 920，ASN 930，ASN 954，SER 955，GLN 991，GLU 992，GLN 995，ASN 1006，ASN 1025，ASN 1026，ASN 1032，ASN 1043，ASN 1046，ASN 1052，ASP 1058，HIS1064，ASN 1080，GLU 1081，GLU 1083，ASP 1086，ASN 1188，ASP 1213，GLY 1215，ASN1216，GLN 1229，ASN 1242，ASN 1243、SER 1274和THR 1277，其中所述修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；
(ii)用不带电荷的氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代表面暴露的不带电荷的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；和
(v)删除表面暴露的酸性氨基酸残基。
29.一种治疗颈肌张力障碍的方法，所述方法包括通过肌内注射向受试者受影响的颈部肌肉施用修饰的BoNT/A，
其中修饰的BoNT/A以单位剂量450pg至8,000pg的修饰的BoNT/A的方式进行施用，
其中将至少单个单位剂量施用至受影响的颈部肌肉，
其中在治疗期间施用的总剂量至多80,000pg修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A在选自以下的一个或多个氨基酸残基处包含修饰：ASN 886，ASN905，GLN 915，ASN 918，GLU 920，ASN 930，ASN 954，SER 955，GLN 991，GLU 992，GLN 995，ASN 1006，ASN 1025，ASN 1026，ASN 1032，ASN 1043，ASN 1046，ASN 1052，ASP 1058，HIS1064，ASN 1080，GLU 1081，GLU 1083，ASP 1086，ASN 1188，ASP 1213，GLY 1215，ASN1216，GLN 1229，ASN 1242，ASN 1243、SER 1274和THR 1277，其中所述修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；
(ii)用不带电荷的氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代表面暴露的不带电荷的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；和
(v)删除表面暴露的酸性氨基酸残基。
30.一种治疗受试者颈肌张力障碍的方法，其持续时间比用未修饰的BoNT/A(例如SEQID NO：2)治疗的持续时间更长，所述方法包括通过肌内注射向受试者受影响的颈部肌肉施用修饰的BoNT/A，
其中修饰的BoNT/A以单位剂量450pg至8,000pg的修饰的BoNT/A的方式进行施用，
其中将至少单个单位剂量施用至受影响的颈部肌肉，
其中在治疗期间施用的总剂量至多80,000pg修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A在选自以下的一个或多个氨基酸残基处包含修饰：ASN 886，ASN905，GLN 915，ASN 918，GLU 920，ASN 930，ASN 954，SER 955，GLN 991，GLU 992，GLN 995，ASN 1006，ASN 1025，ASN 1026，ASN 1032，ASN 1043，ASN 1046，ASN 1052，ASP 1058，HIS1064，ASN 1080，GLU 1081，GLU 1083，ASP 1086，ASN 1188，ASP 1213，GLY 1215，ASN1216，GLN 1229，ASN 1242，ASN 1243、SER 1274和THR 127777，其中所述修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；
(ii)用不带电荷的氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代表面暴露的不带电荷的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；和
(v)删除表面暴露的酸性氨基酸残基。
31.修饰的肉毒杆茵神经毒素A(BoNT/A)在制备用于治疗颈肌张力障碍的药物中的用途，其中修饰的BoNT/A通过肌内注射施用至受试者受影响的颈部肌肉，
其中修饰的BoNT/A以单位剂量450pg至8,000pg的修饰的BoNT/A的方式进行施用，
其中将至少单个单位剂量施用至受影响的颈部肌肉，
其中在治疗期间施用的总剂量至多80,000pg修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A在选自以下的一个或多个氨基酸残基处包含修饰：ASN 886，ASN905，GLN 915，ASN 918，GLU 920，ASN 930，ASN 954，SER 955，GLN 991，GLU 992，GLN 995，ASN 100S，ASN 1025，ASN 1026，ASN 1032，ASN 1043，ASN 1046，ASN 1052，ASP 1058，HIS1064，ASN 1080，GLU 1081，GLU 1083，ASP 1086，ASN 1188，ASP 1213，GLY 1215，ASN 1216，GLN 1229，ASN 1242，ASN 1243、SER 1274、和THR 1277，其中所述修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；
(ii)用不带电荷的氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代表面暴露的不带电荷的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；和
(v)删除表面暴露的酸性氨基酸残基。
32.修饰的BoNT/A在制备用于治疗受试者的颈肌张力障碍的药物中的用途，其持续时间比用未修饰的BoNT/A(例如SEQ ID NO：2)治疗的持续时间更长，其中修饰的BoNT/A通过肌内注射施用至受试者受影响的颈部肌肉，
其中修饰的BoNT/A以单位剂量450pg至8,000pg的修饰的BoNT/A的方式进行施用，
其中将至少单个单位剂量施用至受影响的颈部肌肉，
其中在治疗期间施用的总剂量至多80,000pg修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A在选自以下的一个或多个氨基酸残基处包含修饰：ASN 886，ASN905，GLN 915，ASN 918，GLU 920，ASN 930，ASN 954，SER 955，GLN 991，GLU 992，GLN 995，ASN 1006，ASN 1025，ASN 1026，ASN 1032，ASN 1043，ASN 1046，ASN 1052，ASP 1058，HIS1064，ASN 1080，GLU 1081，GLU 1083，ASP 1086，ASN 1188，ASP 1213，GLY 1215，ASN1216，GLN 1229，ASN 1242，ASN 1243、SER 1274、和THR 1277，其中所述修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；
(ii)用不带电荷的氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代表面暴露的不带电荷的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；和
(v)删除表面暴露的酸性氨基酸残基。
33.根据权利要求27或权利要求28所述用途的修饰的BoNT/A、根据权利要求29或权利要求30所述的方法、或根据权利要求31或权利要求32所述的修饰的BoNT/A的用途，其中施用的总剂量为3,150pg至80,000pg，优选3,500pg至75,000pg。
34.根据权利要求27、28或33中任一项所述用途的修饰的BoNT/A、根据权利要求29、30或33中任一项所述的方法、或根据权利要求31-33中任一项所述的修饰BoNT/A的用途，其中单位剂量为500pg至7,500pg。
35.根据权利要求27、28、33或34中任一项所述用途的修饰的BoNT/A、根据权利要求29、30、33或34中任一项所述的方法、或者根据权利要求31-34中任一项所述的修饰BoNT/A的用途，其中治疗期间施用的总剂量至多75,000pg修饰的BoNT/A。
36.一种修饰的肉毒杆菌神经毒素A(BoNT/A)，其用于治疗颈肌张力障碍的用途，其中修饰的BoNT/A通过肌内注射施用至受试者受影响的颈部肌肉，
其中修饰的BoNT/A以53U至948U的修饰的BoNT/A的单位剂量的方式进行施用，其中1单位是对应于小鼠中计算的半数致死剂量(LD50)的修饰的BoNT/A的量，
其中向受影响的颈部肌肉施用至少单个单位剂量，
其中在治疗期间施用的总剂量至多9,480U修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A在选自以下的一个或多个氨基酸残基处包含修饰：ASN 886，ASN905，GLN 915，ASN 918，GLU 920，ASN 930，ASN 954，SER 955，GLN 991，GLU 992，GLN 995，ASN 1006，ASN 1025，ASN 1026，ASN 1032，ASN 1043，ASN 1046，ASN 1052，ASP 1058，HIS1064，ASN 1080，GLU 1081，GLU 1083，ASP 1086，ASN 1188，ASP 1213，GLY 1215，ASN1216，GLN 1229，ASN 1242，ASN 1243、SER 1274、和THR 1277，其中所述修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；
(ii)用不带电荷的氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代表面暴露的不带电荷的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；和
(v)删除表面暴露的酸性氨基酸残基。
37.一种修饰的BoNT/A，其用于治疗受试者的颈肌张力障碍的用途，其持续时间比用未修饰的BoNT/A(例如SEQ ID NO：2)治疗的持续时间更长，其中修饰的BoNT/A通过肌内注射施用至受试者受影响的颈部肌肉，
其中修饰的BoNT/A以53U至948U的修饰的BoNT/A的单位剂量的方式进行施用，其中1单位是对应于小鼠中计算的半数致死剂量(LD50)的修饰的BoNT/A的量，
其中向受影响的颈部肌肉施用至少单个单位剂量，
其中在治疗期间施用的总剂量至多9,480U修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A在选自以下的一个或多个氨基酸残基处包含修饰：ASN 886，ASN905，GLN 915，ASN 918，GLU 920，ASN 930，ASN 954，SER 955，GLN 991，GLU 992，GLN 995，ASN 1006，ASN 1025，ASN 1026，ASN 1032，ASN 1043，ASN 1046，ASN 1052，ASP 1058，HIS1064，ASN 1080，GLU 1081，GLU 1083，ASP 1086，ASN 1188，ASP 1213，GLY 1215，ASN1216，GLN 1229，ASN 1242，ASN 1243、SER 1274、和THR 1277，其中所述修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；
(ii)用不带电荷的氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代表面暴露的不带电荷的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；和
(v)删除表面暴露的酸性氨基酸残基。
38.一种治疗颈肌张力障碍的方法，所述方法包括通过肌内注射向受试者受影响的颈部肌肉施用修饰的BoNT/A，
其中修饰的BoNT/A以53U至948U的修饰的BoNT/A的单位剂量的方式进行施用，其中1单位是对应于小鼠中计算的半数致死剂量(LD50)的修饰的BoNT/A的量，
其中向受影响的颈部肌肉施用至少单个单位剂量，
其中在治疗期间施用的总剂量至多9，480U修饰的BoNT/A，并且其中修饰的BoNT/A在选自以下的一个或多个氨基酸残基处包含修饰：ASN 886，ASN 905，GLN 915，ASN 918，GLU920，ASN 930，ASN 954，SER 955，GLN 991，GLU 992，GLN 995，ASN 1006，ASN 1025，ASN1026，ASN 1032，ASN 1043，ASN 1046，ASN 1052，ASP 1058，HIS1064，ASN 1080，GLU 1081，GLU 1083，ASP 1086，ASN 1188，ASP 1213，GLY 1215，ASN 1216，GLN 1229，ASN 1242，ASN1243、SER 1274、和THR 1277，其中所述修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；
(ii)用不带电荷的氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代表面暴露的不带电荷的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；和
(v)删除表面暴露的酸性氨基酸残基。
39.一种治疗受试者颈肌张力障碍的方法，其持续时间比用未修饰的BoNT/A(例如SEQID NO：2)治疗的持续时间更长，所述方法包括通过肌内注射向受试者受影响的颈部肌肉施用修饰的BoNT/A，
其中修饰的BoNT/A以53U至948U的修饰的BoNT/A的单位剂量的方式进行施用，其中1单位是对应于小鼠中计算的半数致死剂量(LD50)的修饰的BoNT/A的量，
其中向受影响的颈部肌肉施用至少单个单位剂量，
其中在治疗期间施用的总剂量至多9,480U修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A在选自以下的一个或多个氨基酸残基处包含修饰：ASN 886，ASN905，GLN 915，ASN 918，GLU 920，ASN 930，ASN 954，SER 955，GLN 991，GLU 992，GLN 995，ASN 1006，ASN 1025，ASN 1026，ASN 1032，ASN 1043，ASN 1046，ASN 1052，ASP 1058，HIS1064，ASN 1080，GLU 1081，GLU 1083，ASP 1086，ASN 1188，ASP 1213，GLY 1215，ASN1216，GLN 1229，ASN 1242，ASN 1243、SER 1274、和THR 1277，其中所述修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；
(ii)用不带电荷的氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代表面暴露的不带电荷的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；和
(v)删除表面暴露的酸性氨基酸残基。
40.修饰的肉毒杆菌神经毒素A(BoNT/A)在制备用于治疗颈肌张力障碍的药物中的用途，其中修饰的BoNT/A通过肌内注射施用至受试者受影响的颈部肌肉，
其中修饰的BoNT/A以53U至948U的修饰的BoNT/A的单位剂量的方式进行施用，其中1单位是对应于小鼠中计算的半数致死剂量(LD50)的修饰的BoNT/A的量，
其中向受影响的颈部肌肉施用至少单个单位剂量，
其中在治疗期间施用的总剂量至多9,480U修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A在选自以下的一个或多个氨基酸残基处包含修饰：ASN 886，ASN905，GLN 915，ASN 918，GLU 920，ASN 930，ASN 954，SER 955，GLN 991，GLU 992，GLN 995，ASN 1006，ASN 1025，ASN 1026，ASN 1032。ASN 1043，ASN 1046，ASN 1052，ASP 1058，HIS1064，ASN 1080，GLU 10811，GLU 1083，ASP 1086，ASN 1188，ASP 1213，GLY 1215，ASN1216，GLN 1229，ASN 1242，ASN 1243、SER 1274、和THR 1277，其中所述修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；
(ii)用不带电荷的氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代表面暴露的不带电荷的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；和
(v)删除表面暴露的酸性氨基酸残基。
41.修饰的BoNT/A在制备用于治疗受试者的颈肌张力障碍的药物中的用途，其持续时间比用未修饰的BoNT/A(例如SEQ ID NO：2)治疗的持续时间更长，其中修饰的BoNT/A通过肌内注射施用至受试者受影响的颈部肌肉，
其中修饰的BoNT/A以53U至948U的修饰的BoNT/A的单位剂量的方式进行施用，其中1单位是对应于小鼠中计算的半数致死剂量(LD50)的修饰的BoNT/A的量，
其中向受影响的颈部肌肉施用至少单个单位剂量，
其中在治疗期间施用的总剂量至多9,480U修饰的BoNT/A，并且
其中修饰的BoNT/A在选自以下的一个或多个氨基酸残基处包含修饰：ASN 886，ASN905，GLN 915，ASN 918，GLU 920，ASN 930，ASN 954，SER 955，GLN 991，GLU 992，GLN 995，ASN 1006，ASN 1025，ASN 1026，ASN 1032，ASN 1043，ASN 1046，ASN 1052，ASP 1058，HIS1064，ASN 1080，GLU 1081，GLU 1083，ASP 1086，ASN 1188，ASP 1213，GLY 1215，ASN1216，GLN 1229，ASN 1242，ASN 1243、SER 1274、和THR 1277，其中所述修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；
(ii)用不带电荷的氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代表面暴露的不带电荷的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；和
(v)删除表面暴露的酸性氨基酸残基。
42.根据权利要求36或权利要求37所述用途的修饰的BoNT/A、根据权利要求38或权利要求39所述的方法、或根据权利要求40或权利要求41所述的修饰的BoNT/A的用途，其中施用的总剂量为371U至9，480U，优选413U至8，890U。
43.根据权利要求36、37或42中任一项所述用途的修饰的BoNT/A、根据权利要求38、39或42中任一项所述的方法、或根据权利要求40-42中任一项所述的修饰BoNT/A的用途，其中单位剂量为59单位至889单位。
44.根据权利要求26、37、42或43中任一项所述用途的修饰的BoNT/A、根据权利要求38、39、42或43中任一项所述的方法、或者根据权利要求40-43中任一项所述的修饰BoNT/A的用途，其中治疗期间施用的总剂量至多8，890U修饰的BoNT/A。
45.根据权利要求27-44中任一项所述用途的修饰的BoNT/A、方法或修饰的BoNT/A的用途，其中所述修饰包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰(优选由其组成)：ASN886、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1052、ASN 1188、ASP1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274、或THR 1277，其中修饰的BoNT/A由与选自SEQ ID NO:3、5、7和9的核酸序列具有至少70％序列同一性的核酸序列编码，和/或包含与选自SEQ ID NO:4、6、8和10的多肽序列具有至少70％序列同一性的多肽序列，优选地，其中所述修饰包含选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰(优选由其组成)：ASN 886、ASN 930、SER 955、GLN 991、ASN 1026、ASN 1052和GLN 1229，并且其中修饰的BoNT/A由与SEQ ID NO:3具有至少70％序列同一性的核酸序列编码，和/或包含与选自SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的多肽序列。
46.根据权利要求27-45中任一项所述用途的修饰的BoNT/A、方法或修饰的BoNT/A的用途，其中所述修饰是取代，优选用赖氨酸或精氨酸的取代。
47.根据权利要求27-46中任一项所述用途的修饰的BoNT/A、方法或修饰的BoNT/A的用途，其中修饰的BoNT/A是双链修饰的BoNT/A，其中轻链(L链)通过二硫键连接至重链(H链)，所述修饰的BoNT/A可通过以下方法获得，所述方法包括使包含SEQ ID NO:4的单链修饰的BoNT/A与蛋白酶接触，所述蛋白酶水解其活化环中的肽键，从而将单链修饰的BoNT/A转化为相应的双链修饰的BoNT/A。
48.根据权利要求27-47中任一项所述用途的修饰的BoNT/A、方法或修饰的BoNT/A的用途，其中修饰的BoNT/A是双链修饰的BoNT/A，其中L链通过二硫键连接至H链，所述修饰的BoNT/A可通过以下方法获得，所述方法包括使由SEQ ID NO:4组成的单链修饰的BoNT/A与蛋白酶接触，所述蛋白酶水解其活化环中的肽键，从而将单链修饰的BoNT/A转化为相应的双链修饰的BoNT/A。
49.根据前述权利要求中任一项所述用途的修饰的BoNT/A、方法或修饰的BoNT/A的用途，其中所述修饰的BoNT/A具有大于7的安全比，其中所述安全比计算为：以pg/小鼠测量的-10％体重变化所需的毒素剂量除以以pg/小鼠测量的DAS ED50，其中ED50＝产生DAS分数为2所需的剂量。
50.根据前述权利要求中任一项所述用途的修饰的BoNT/A、方法或修饰的BoNT/A的用途，其中：
所述受影响的颈部肌肉选自：胸锁乳突肌、头夹肌、颈夹肌、斜角肌复合体(例如前斜角肌和/或中斜角肌)、斜方肌(例如上斜方肌)、肩胛提肌、头半棘肌和最长肌(例如头最长肌和/或颈最长肌)；
所述受影响的颈部肌肉选自：右肩胛提肌、左肩胛提肌、右斜方肌、左斜方肌、右胸锁乳突肌、左胸锁乳突肌、右头夹肌、左头夹肌、中斜角肌、前斜角肌、右头半棘肌、左头半棘肌、右头最长肌和左头最长肌；
所述受影响的颈部肌肉选自：胸锁乳突肌(sternocleidomastoid)、胸锁乳突肌(sternocleidomastoideus)、头夹肌、颈夹肌、斜角肌复合体(例如前斜角肌和/或中斜角肌)、斜方肌(例如上斜方肌)、肩胛提肌、头半棘肌、最长肌(例如头最长肌和/或颈最长肌)、后椎旁肌(例如后斜角肌、中斜角肌和/或前斜角肌，优选后斜角肌)、颏下复合体(例如二腹肌、颏舌骨肌、下颌舌骨肌、下颌舌骨肌扣眼和/或茎突舌骨肌)、斜方肌下部、上颈线—锁骨(外侧部分)、棘突C3-Th3-乳突、棘突Th3-Th5—横突C1-C2、横突C3-Th6、棘突C3-Th1—上颈线、横突Th1-Th6—棘突C2-C7、横突C3-Th3—乳突、横突Th1-Th6—横突C2-C6、头下斜肌、棘突C2—横突C1、胸骨上切迹和锁骨(内侧部分)—乳突和上颈线、横突C1-C4—肩胛骨(肩胛上角)、横突C2-C7—第一肋骨、横突C3-C6—第一肋骨、头长肌、横突C3-C6—枕骨(基底部分)、颈长肌和横突C2-C5—寰椎(前结节)；或者
所述受影响的颈部肌肉选自胸锁乳突肌(例如左或右胸锁乳突肌)、左或右头夹肌、前斜角肌或中斜角肌、左或右斜方肌(例如左或右上斜方肌)、左或右肩胛提肌、左或右头半棘肌、最长肌(例如左或右头最长肌和/或颈最长肌)、颈夹肌、斜角肌复合体(例如前斜角肌和/或中斜角肌)、后椎旁肌(例如后斜角肌、中斜角肌和/或前斜角肌，优选后斜角肌)、颏下复合体(例如二腹肌、颏舌骨肌、下颌舌骨肌、下颌舌骨肌扣眼和/或茎突舌骨肌)、斜方肌下部、上项线—锁骨(外侧部分)、棘突C3-Th3-乳突、棘突Th3-Th5—横突C1-C2、横突C3-Th6、棘突C3-Th1—上项线、横突Th1-Th6—棘突C2-C7、横突C3-Th3—乳突、横突Th1-Th6—横突C2-C6、头下斜肌、头上斜肌、棘突C2—横突C1、胸骨上切迹和锁骨(内侧部分)—乳突和上项线、横突C1-C4—肩胛骨(肩胛上角)、横突C2-C7—第一肋骨、横突C3-C6—第一肋骨、头长肌、横突C3-C6—枕骨(基底部分)、颈长肌、颈半棘肌、头后大直肌、头后小直肌、头前直肌、多裂肌和横突C2-C5—寰椎(前结节)。
51.根据前述权利要求中任一项所述用途的修饰的BoNT/A、方法或修饰的BoNT/A的用途，其中所述修饰的BoNT/A通过肌内注射施用至受试者的多个受影响的颈部肌肉，并且其中向每个受影响的颈部肌肉施用至少单个单位剂量，
优选地，其中：
多个受影响的颈部肌肉选自：胸锁乳突肌、头夹肌、颈夹肌、斜角肌复合体(例如前斜角肌和/或中斜角肌)、斜方肌(例如上斜方肌)、肩胛提肌，头半棘肌和最长肌(例如头最长肌和/或颈最长肌)；
多个受影响的颈部肌肉选自：右肩胛提肌、左肩胛提肌、右斜方肌、左斜方肌、右胸锁乳突肌、左胸锁乳突肌、右头夹肌、左头夹肌、中斜角肌、前斜角肌、右头半棘肌、左头半棘肌、右头最长肌和左头最长肌；
多个受影响的颈部肌肉选自胸锁乳突肌、胸锁乳突肌、头夹肌、颈夹肌、斜角肌复合体(例如前斜角肌和/或中斜角肌)、斜方肌(例如上斜方肌)、肩胛提肌、头半棘肌、最长肌(例如头最长肌和/或颈最长肌)、后椎旁肌(例如后斜角肌、中斜角肌和/或前斜角肌，优选后斜角肌)、颏下复合体(例如二腹肌、颏舌骨肌、下颌舌骨肌、下颌舌骨肌扣眼和/或茎突舌骨肌)、斜方肌下部、上颈线—锁骨(外侧部分)、棘突C3-Th3-乳突、棘突Th3-Th5—横突C1-C2、横突C3-Th6、棘突C3-Th1—上颈线、横突Th1-Th6—棘突C2-C7、横突C3-Th3—乳突、横突Th1-Th6—横突C2-C6、头下斜肌、棘突C2—横突C1、胸骨上切迹和锁骨(内侧部分)—乳突和上颈线、横突C1-C4—肩胛骨(肩胛上角)、横突C2-C7—第一肋骨、横突C3-C6—第一肋骨、头长肌、横突C3-C6—枕骨(基底部分)、和颈长肌或横突C2-C5—寰椎(前结节)；或
多个受影响的颈部肌肉选自胸锁乳突肌(例如左或右胸锁乳突肌)、左或右头夹肌、前斜角肌或中斜角肌、左或右斜方肌(例如左或右上斜方肌)、左或右肩胛提肌、左或右头半棘肌、头半棘肌中部、最长肌(例如左或右头最长肌和/或颈最长肌)、颈夹肌、斜角肌复合体(例如前斜角肌和/或中斜角肌)、后椎旁肌(例如后斜角肌、中斜角肌和/或前斜角肌，优选后斜角肌)、颏下复合体(例如二腹肌、颏舌骨肌、下颌舌骨肌、下颌舌骨肌扣眼和/或茎突舌骨肌)、斜方肌下部、上项线—锁骨(外侧部分)、棘突C3-Th3-乳突、棘突Th3-Th5—横突C1-C2、横突C3-Th6、棘突C3-Th1—上项线、横突Th1-Th6—棘突C2-C7、横突C3-Th3—乳突、横突Th1-Th6—横突C2-C6、头下斜肌、头上斜肌、棘突C2—横突C1、胸骨上切迹和锁骨(内侧部分)—乳突和上项线、横突C1-C4—肩胛骨(肩胛上角)、横突C2-C7—第一肋骨、横突C3-C6—第一肋骨、头长肌、横突C3-C6—枕骨(基底部分)、颈长肌、颈半棘肌、头后大直肌、头后小直肌、头前直肌、多裂肌和横突C2-C5—寰椎(前结节)。
52.根据前述权利要求中任一项所述用途的修饰的BoNT/A、方法或修饰的BoNT/A的用途，其中所述修饰的BoNT/A以每个注射部位单位剂量的方式在受影响的颈部肌肉施用，或其中修饰的BoNT/A以每个注射部位小于单位剂量的方式施用。
53.根据前述权利要求中任一项所述用途的修饰的BoNT/A、方法或修饰的BoNT/A的用途，其中在受影响的颈部肌肉的多个注射部位施用单个单位剂量，和/或在受影响的颈部肌肉的多个注射部位施用两个或更多个单位剂量。
54.根据前述权利要求中任一项所述用途的修饰的BoNT/A、方法或修饰的BoNT/A的用途，其中在受影响的颈部肌肉施用单个单位剂量(例如，在每个受影响的颈部肌肉施用单个单位剂量)。
55.根据前述权利要求中任一项所述用途的修饰的BoNT/A、方法或修饰的BoNT/A的用途，其中所述受试者是人受试者。
56.一种修饰的BoNT/A的单位剂型(例如用于治疗颈肌张力障碍)，所述单位剂型包含：
(a)31单位至707单位的修饰的BoNT/A，其中1单位是对应于小鼠中计算的半数致死剂量(LD50)的修饰的BoNT/A的量；或者
(b)750pg至17,000pg修饰的BoNT/A；和
(c)任选地药学上可接受的运载体、赋形剂、佐剂和/或盐，
其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域，以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)。
57.根据权利要求56所述的单位剂型，其中所述修饰的BoNT/A包含两个取代突变的组合，所述两个取代突变为E1191M和S1199Y。
58.根据权利要求56或权利要求57所述的单位剂型，其中所述修饰的BoNT/A包含与SEQID NO:14具有至少70％序列同一性的多肽序列。
59.根据权利要求56-58中任一项所述的单位剂型，其中所述修饰的BoNT/A是双链修饰的BoNT/A，其中L链通过二硫键与H链连接，所述修饰的BoNT/A可通过以下方法获得：所述方法包括使包含SEQ ID NO:14的单链修饰的BoNT/A与蛋白酶接触，所述蛋白酶水解其活化环中的肽键，从而将单链修饰的BoNT/A转换为相应的双链修饰的BoNT/A。
60.根据权利要求56-59中任一项所述的单位剂型，其中所述修饰的BoNT/A是双链修饰的BoNT/A，其中L链通过二硫键与H链连接，所述修饰的BoNT/A可通过以下方法获得：所述方法包括使由SEQ ID NO:14组成的单链修饰的BoNT/A与蛋白酶接触，所述蛋白酶水解其活化环中的肽键，从而将单链修饰的BoNT/A转换为相应的双链修饰的BoNT/A。
61.一种修饰的BoNT/A的单位剂型(例如用于治疗颈肌张力障碍)，所述单位剂型包含：
(a)53单位至948单位的修饰的BoNT/A，其中1单位是对应于小鼠中计算的半数致死剂量(LD50)的修饰的BoNT/A的量；或者
(b)450pg至8,000pg修饰的BoNT/A；和
(c)任选地药学上可接受的运载体、赋形剂、佐剂和/或盐，
其中修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰：ASN 886、ASN905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274、和THR 1277，其中所述修饰选自：
(i)用碱性氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；
(ii)用不带电荷的氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；
(iii)用碱性氨基酸残基取代表面暴露的不带电荷的氨基酸残基；
(iv)插入碱性氨基酸残基；和
(v)删除表面暴露的酸性氨基酸残基。
62.根据权利要求61所述的单位剂型，其中所述修饰包含选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰(优选由其组成)：ASN 886、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、ASN1025、ASN 1026、ASN 1052、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274、或THR 1277，其中修饰的BoNT/A由与选自SEQ ID NO:3、5、7和9的核酸序列具有至少70％序列同一性的核酸序列编码，和/或包含与选自SEQ ID NO:4、6、8和10的多肽序列具有至少70％序列同一性的多肽序列，优选地，其中所述修饰包含选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰(优选由其组成)：ASN 886、ASN 930、SER 955、GLN 991、ASN1026、ASN 1052和GLN 1229，并且其中修饰的BoNT/A由与SEQ ID NO:3具有至少70％序列同一性的核酸序列编码，和/或包含与选自SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的多肽序列。
63.根据权利要求61或62所述的单位剂型，其中所述修饰是取代，优选用赖氨酸或精氨酸的取代。
64.根据权利要求61-63中任一项所述的单位剂型，其中所述修饰的BoNT/A是双链修饰的BoNT/A，其中轻链(L链)通过二硫键与重链(H链)连接，所述修饰的BoNT/A可通过以下方法获得：所述方法包括使包含SEQ ID NO:4的单链修饰的BoNT/A与蛋白酶接触，所述蛋白酶水解其活化环中的肽键，从而将单链修饰的BoNT/A转换为相应的双链修饰的BoNT/A。
65.根据权利要求61-64中任一项所述的单位剂型，其中所述修饰的BoNT/A是双链修饰的BoNT/A，其中L链通过二硫键与H链连接，所述修饰的BoNT/A可通过以下方法获得：所述方法包括使由SEQ ID NO:4组成的单链修饰的BoNT/A与蛋白酶接触，所述蛋白酶水解其活化环中的肽键，从而将单链修饰的BoNT/A转换为相应的双链修饰的BoNT/A。
66.一种试剂盒，其包含：
(a)根据权利要求56-65中任一项所述的单位剂型；和
(b)用于治疗颈肌张力障碍的说明书；和
(c)任选稀释剂。
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