TW202140522A - 上面部紋路之處理 - Google Patents

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尼可拉 葛瑞勾瑞
凱帝 路菲
菲利浦 彼卡特
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英商艾普森生物製藥有限公司
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Abstract

本發明係關於一種用於處理面部紋路之經修飾BoNT/A，其中該經修飾BoNT/A係藉著肌肉內注射而施用於受試者面部的多個位置，其中，該經修飾BoNT/A係藉由在每一位置施用單位劑量為1單位到41單位的經修飾BoNT/A之方式來進行給藥，且其中1單位係為對應於計算所得之小鼠半數致死劑量(LD50 )的經修飾BoNT/A劑量，其中該等多個位置係選自於：至多兩個之皺眉肌位置以及一個降眉間肌位置，以用於處理眉間皺紋；至多五個之額肌位置，以用於處理抬頭紋；以及至多三個之在眼輪匝肌外圍的位置，以用於處理外眥紋路，其中，在處理期間所施用之該經修飾BoNT/A的總劑量為至多574單位，並且其中該經修飾BoNT/A包含在選自於以下之一或多個胺基酸殘基上的修飾：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS 1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274與THR 1277，其中該修飾係選自於：i.以一鹼性胺基酸殘基來取代一酸性表面暴露胺基酸殘基；ii.以一不帶電荷的胺基酸殘基來取代一酸性表面暴露胺基酸殘基；iii.以一鹼性胺基酸殘基來取代一不帶電荷表面暴露胺基酸殘基；iv.插入一鹼性胺基酸殘基；以及v.刪除一酸性表面暴露胺基酸殘基。本發明還提供了對應之處理方法和用途，以及單位劑型與套組。

Description

上面部紋路之處理
本發明係與醫美處理(例如用於處理功能亢進的面部紋路)有關。更詳細地說，本發明提供了醫美處理方法，其包括施用更長效的神經毒素，並且更明確地說，本發明提供了一種使用更長效的肉毒桿菌神經毒素，來處理醫美對於面部不平整狀況之方法。
機能亢進的面部紋路是常見的外表不平整現象，其可以包括但不限於：眉間皺紋、外眥紋路、抬頭紋與皺紋、魚尾紋、眉紋路、鼻唇溝、唇紋路和木偶紋路(marionette line)。上面部紋路可能會出現在前額、眉間和以及眼眶外側區域。由於皺眉等面部表情，皺紋可也能會出現在眉間和前額區域，雖然皺紋也可能因為微笑的表情而出現在外眥區域。在該些區域中過度顯著的紋路通常會被誤解為疲勞，從而使得個體對其外貌產生極大的困擾。相反地，過度顯著的面部紋係由於皮下肌肉的功能性拉動而出現，最終會使得皮膚產生皺紋。在眉間複合肌理中，這些肌肉包括皺眉肌、降眉間肌與降眉肌，而眼輪匝肌則會生成外眥紋路。
在過去的幾十年中，隨著老齡化人口持續增長，人們對於醫美處理以逆轉外表年齡的需求不斷增加，特別是在面部區域上。對於外表的日益重視致使許多不同產品和處理程序被不斷地開發，例如醫美處理手術、各種類型的臉部表面重建、以及填充劑的運用。由於這些方法並非完全沒有風險，因此目前仍有必要進行持續的研究以提供最安全，且最有效的方法來處理臉部老化現象。
雖然所謂的臉部老化現象是在五個因素的相互作用下產生，然而相對於皺紋，更為顯著之紋路與皺褶的產生，主要是兩種因素(皮膚和皮下肌肉)之交互作用。目前已經開發出許多種處理法來處理皺紋以及紋路與皺摺的皮膚因素，其中包括各種類型之表面重建、皮膚病理學產品以及用於增強軟組織的注射劑。
另一種處理面部紋路外表的醫美方法，是將神經毒素(特別是肉毒桿菌神經毒素)施用於面部皮膚之皮下肌肉。Dysport®係為一種含有從肉毒桿菌A型菌株分離和純化，BoNT/A/甲血凝素複合物(BTX-A-HAC)之藥學物質之醫藥產品。在市場也已有其他幾種由肉毒桿菌天然產生之藥用BoNT/A產品。
BoNT/A會選擇性抑制從突觸前神經末梢釋放的乙醯膽鹼，從而阻斷在肌肉收縮和肌肉舒張所誘發，而於神經肌肉會合處之膽鹼傳遞，從而使得進行注射的肌肉放鬆。
Dysport®係被批准以最大總劑量達50單位，施用在皺眉肌與降眉間肌之間，來處理眉間皺紋(參見圖1)。Dysport®的臨床效果可以持續長達四個月。在臨床研究中重複給藥，證明了連續四次給藥的持續療效。然而，Dysport®的給藥頻率不得超過每三個月一次。迄今，Dysport®尚未獲得FDA批准可用於處理抬頭紋和外眥紋路上。
為了避免對全身神經系統造成影響，許多以梭菌毒素為基礎之醫美處理，係利用直接給藥而對目標部位(例如，目標組織)進行梭菌毒素處理。在進行以這種以施用梭菌毒素為基礎的處理時，所會面對的一個問題是毒素會從施用部位擴散，並散布至周圍組織或全身循環中。毒素會從目標組織擴散的情形，係被認定為造成不良副作用之原因，此種不良反應在極端情況下可能造成生命危險。在以高劑量、高濃度與高注射量下，使用梭菌毒素處理(例如BoNT療法)時，這可能會是一項特別令人擔憂的問題。商業化的BoNT/A處理，已經報導了與此一問題有關之不良反應，其包括有全身乏力、全身性肌肉無力、複視、上瞼下垂、吞嚥困難、發聲障礙、構音障礙、尿失禁與呼吸困難。吞嚥與呼吸困難可能會造成生命危險，並且據報導死亡案例係與毒素效力的擴散有關。
本發明克服了一或多個上述課題。
本案發明人驚訝地發現，該經修飾BoNT/A可以在醫美處理面部細紋中，找到特別的用途。該經修飾BoNT/A可以包含一或多種表面暴露胺基酸殘基，而致使淨正電荷增加之修飾。所增加的電荷可以促進多胜肽與陰離子細胞外成分之間的靜電相互作用，從而促進多胜肽與細胞表面之間的結合作用。此一作用繼而增加了在施用部位處的滯留作用(減少擴散現象)，並致使作用持續時間增長(例如6-9個月)。或者，經修飾BoNT/A可以包含一BoNT/A輕鏈與轉位結構域，以及一BoNT/B受體結合結構域(HC 結構域)，其同樣地會得到在施用部位處呈現滯留作用(減少擴散現象)，並具有較長作用持續時間(例如6-9個月)之一經修飾BoNT/A。有利的是，相較於未經修飾BoNT/A(例如Dysport®)，經修飾BoNT/A具有較佳的安全相關特性。此一較高的安全相關特性可以通過在此針對經修飾BoNT/A之較高安全比率來表示。
基於本文中的臨床前數據(參見實施例6)，目前已經證實經修飾BoNT/A可以更高的總量對受試者進行給藥，而在如此高的劑量下，仍可同時達到與未經修飾BoNT/A(例如Dysport®)相似的安全相關特性。因此，在面部紋路的醫美處理中，經修飾BoNT/A在達到最大總劑量之前，可以在更多的肌肉/部位進行注射。這是一項重要且有利的發現，並且可以為面部紋路提供更好的醫美處理程序，同時為臨床醫生提供範圍更廣泛的處理選擇。該處理在於其提供了比起未經修飾BoNT/A(例如的Dysport®)處理，更為持久的處理程序(而獲致較低之施用頻率)，以及/或者能夠針對受試者進行客製化，例如使得臨床醫生能夠根據受試者的審美要求，而在特定部位進行給藥等等方面提供改進。相較於傳統處理程序，本發明的處理程序取得了改善。
再者，本發明提供了一種更方便、安全而有效的單一劑量單位，以及可以在單次處理程序中安全施用之總(最大)劑量。本發明還提供了其中該劑量單位，可以進行施用於肌肉的次數(包括每條肌肉的注射部位數量)，而不會導致患者產毒性反應之相對應指南。因此對於臨床醫生而言，依據本發明的處理程序要簡單得多，並且有助於避免劑量施打不足及/或劑量施打過多。
在一態樣中，本發明提供了一種用於處理面部紋路之經修飾BoNT/A，其中該經修飾BoNT/A係通過肌肉內注射而施用在受試者面部的多個位置上， 其中，該經修飾BoNT/A係藉由在每一位置施用單位劑量為1單位到41單位(2單位至41單位)的經修飾BoNT/A之方式來進行給藥，且其中1單位係為對應於計算所得之小鼠半數致死劑量(LD50 )的經修飾BoNT/A劑量， 其中該等多個位置係選自於： 至多兩個之皺眉肌位置以及一個降眉間肌位置，以用於處理眉間皺紋， 至多五個之額肌位置，以用於處理抬頭紋；以及 至多三個之在眼輪匝肌外圍的位置，以用於處理外眥紋路， 其中，在處理期間所施用之該經修飾BoNT/A的總劑量為至多574單位，並且 其中該經修飾BoNT/A包含在選自於以下之一或多個胺基酸殘基上的修飾：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS 1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274與THR 1277，其中該修飾係選自於： i.以一鹼性胺基酸殘基來取代一酸性表面暴露胺基酸殘基； ii.以一不帶電荷的胺基酸殘基來取代一酸性表面暴露胺基酸殘基； iii.以一鹼性胺基酸殘基來取代一不帶電荷表面暴露胺基酸殘基； iv.插入一鹼性胺基酸殘基；以及 v.刪除一酸性表面暴露胺基酸殘基。
在另一相關態樣中，本發明提供了一種用於處理面部紋路之經修飾BoNT/A，其中該經修飾BoNT/A係通過肌肉內注射而施用在受試者面部的多個位置上， 其中，該經修飾BoNT/A係藉由在每一位置施用單位劑量為8.4 pg至344.4 pg經修飾BoNT/A之方式來進行給藥， 其中該等多個位置係選自於： 至多兩個之皺眉肌位置以及一個降眉間肌位置，以用於處理眉間皺紋， 至多五個之額肌位置，以用於處理抬頭紋；以及 至多三個之在眼輪匝肌外圍的位置，以用於處理外眥紋路， 其中，在處理期間所施用之該經修飾BoNT/A的總劑量為至多4821.6 pg，並且 其中該經修飾BoNT/A包含在選自於以下之一或多個胺基酸殘基上的修飾：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS 1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274與THR 1277，其中該修飾係選自於： i.以一鹼性胺基酸殘基來取代一酸性表面暴露胺基酸殘基； ii.以一不帶電荷的胺基酸殘基來取代一酸性表面暴露胺基酸殘基； iii.以一鹼性胺基酸殘基來取代一不帶電荷表面暴露胺基酸殘基； iv.插入一鹼性胺基酸殘基；以及 v.刪除一酸性表面暴露胺基酸殘基。
在一態樣中，本發明提供了一種用於處理面部紋路之經修飾BoNT/A，其中該經修飾BoNT/A係通過肌肉內注射而施用在受試者面部的多個位置上， 其中，該經修飾BoNT/A係藉由在每一位置施用單位劑量為2單位至41單位的經修飾BoNT/A之方式來進行給藥，且其中1單位係為對應於計算所得之小鼠半數致死劑量(LD50 )的經修飾BoNT/A劑量， 其中該等多個位置係選自於： 至多兩個之皺眉肌位置以及一個降眉間肌位置，以用於處理眉間皺紋， 至多五個之額肌位置，以用於處理抬頭紋；以及 至多三個之在眼輪匝肌外圍的位置，以用於處理外眥紋路， 其中，在處理期間所施用之該經修飾BoNT/A的總劑量為至多574單位，並且 其中，該經修飾BoNT/A包含一BoNT/A輕鏈與轉位結構域，以及一BoNT/B受體結合結構域(HC 結構域)。
在一相關態樣中，本發明提供了一種用於處理面部紋路的方法，該方法包括在受試者面部的多個位置上，通過肌肉內注射而施用經修飾的肉毒桿菌神經毒素A(BoNT/A)， 其中，該經修飾BoNT/A係藉由在每一位置施用單位劑量為1單位到41單位(2單位至41單位)的經修飾BoNT/A之方式來進行給藥，且其中1單位係為對應於計算所得之小鼠半數致死劑量(LD50 )的經修飾BoNT/A劑量， 其中該等多個位置係選自於： 至多兩個之皺眉肌位置以及一個降眉間肌位置，以用於處理眉間皺紋， 至多五個之額肌位置，以用於處理抬頭紋；以及 至多三個之在眼輪匝肌外圍的位置，以用於處理外眥紋路， 其中，在處理期間所施用之該經修飾BoNT/A的總劑量為至多574單位，並且 其中該經修飾BoNT/A包含在選自於以下之一或多個胺基酸殘基上的修飾：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS 1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274與THR 1277，其中該修飾係選自於： i.以一鹼性胺基酸殘基來取代一酸性表面暴露胺基酸殘基； ii.以一不帶電荷的胺基酸殘基來取代一酸性表面暴露胺基酸殘基； iii.以一鹼性胺基酸殘基來取代一不帶電荷表面暴露胺基酸殘基； iv.插入一鹼性胺基酸殘基；以及 v.刪除一酸性表面暴露胺基酸殘基。
在一相關態樣中，本發明提供了一種用於處理面部紋路的方法，該方法包括在受試者面部的多個位置上，通過肌肉內注射而施用經修飾的肉毒桿菌神經毒素A(BoNT/A)， 其中，該經修飾BoNT/A係藉由在每一位置施用單位劑量為8.4 pg至344.4 pg經修飾BoNT/A之方式來進行給藥，且其中1單位係為對應於計算所得之小鼠半數致死劑量(LD50 )的經修飾BoNT/A劑量， 其中該等多個位置係選自於： 至多兩個之皺眉肌位置以及一個降眉間肌位置，以用於處理眉間皺紋， 至多五個之額肌位置，以用於處理抬頭紋；以及 至多三個之在眼輪匝肌外圍的位置，以用於處理外眥紋路， 其中，在處理期間所施用之該經修飾BoNT/A的總劑量為至多574單位，並且 其中該經修飾BoNT/A包含在選自於以下之一或多個胺基酸殘基上的修飾：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS 1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274與THR 1277，其中該修飾係選自於： i.以一鹼性胺基酸殘基來取代一酸性表面暴露胺基酸殘基； ii.以一不帶電荷的胺基酸殘基來取代一酸性表面暴露胺基酸殘基； iii.以一鹼性胺基酸殘基來取代一不帶電荷表面暴露胺基酸殘基； iv.插入一鹼性胺基酸殘基；以及 v.刪除一酸性表面暴露胺基酸殘基。
在一相關態樣中，本發明提供了一種用於處理面部紋路的方法，該方法包括在受試者面部的多個位置上，通過肌肉內注射而施用經修飾的肉毒桿菌神經毒素A(BoNT/A)， 其中，該經修飾BoNT/A係藉由在每一位置施用單位劑量為2單位至41單位的經修飾BoNT/A之方式來進行給藥，且其中1單位係為對應於計算所得之小鼠半數致死劑量(LD50 )的經修飾BoNT/A劑量， 其中該等多個位置係選自於： 至多兩個之皺眉肌位置以及一個降眉間肌位置，以用於處理眉間皺紋， 至多五個之額肌位置，以用於處理抬頭紋；以及 至多三個之在眼輪匝肌外圍的位置，以用於處理外眥紋路， 其中，在處理期間所施用之該經修飾BoNT/A的總劑量為至多574單位，並且 其中，該經修飾BoNT/A包含一BoNT/A輕鏈與轉位結構域，以及一BoNT/B受體結合結構域(HC 結構域)。
在另一相關態樣中，本發明提供了一種將經修飾肉毒桿菌神經毒素A(BoNT/A)，用來製備用於處理面部紋路之藥物的用途，其中該經修飾BoNT/A係通過肌肉內注射而施用在受試者面部的多個位置上， 其中，該經修飾BoNT/A係藉由在每一位置施用單位劑量為1單位到41單位(2單位至41單位)的經修飾BoNT/A之方式來進行給藥，且其中1單位係為對應於計算所得之小鼠半數致死劑量(LD50 )的經修飾BoNT/A劑量， 其中該等多個位置係選自於： 至多兩個之皺眉肌位置以及一個降眉間肌位置，以用於處理眉間皺紋， 至多五個之額肌位置，以用於處理抬頭紋；以及 至多三個之在眼輪匝肌外圍的位置，以用於處理外眥紋路， 其中，在處理期間所施用之該經修飾BoNT/A的總劑量為至多574單位，並且 其中該經修飾BoNT/A包含在選自於以下之一或多個胺基酸殘基上的修飾：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS 1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274與THR 1277，其中該修飾係選自於： i.以一鹼性胺基酸殘基來取代一酸性表面暴露胺基酸殘基； ii.以一不帶電荷的胺基酸殘基來取代一酸性表面暴露胺基酸殘基； iii.以一鹼性胺基酸殘基來取代一不帶電荷表面暴露胺基酸殘基； iv.插入一鹼性胺基酸殘基；以及 v.刪除一酸性表面暴露胺基酸殘基。
在另一相關態樣中，本發明提供了一種將經修飾肉毒桿菌神經毒素A(BoNT/A)，用來製備用於處理面部紋路之藥物的用途，其中該經修飾BoNT/A係通過肌肉內注射而施用在受試者面部的多個位置上， 其中，該經修飾BoNT/A係藉由在每一位置施用單位劑量為8.4 pg至344.4 pg經修飾BoNT/A之方式來進行給藥，且其中1單位係為對應於計算所得之小鼠半數致死劑量(LD50 )的經修飾BoNT/A劑量， 其中該等多個位置係選自於： 至多兩個之皺眉肌位置以及一個降眉間肌位置，以用於處理眉間皺紋， 至多五個之額肌位置，以用於處理抬頭紋；以及 至多三個之在眼輪匝肌外圍的位置，以用於處理外眥紋路， 其中，在處理期間所施用之該經修飾BoNT/A的總劑量為至多574單位，並且 其中該經修飾BoNT/A包含在選自於以下之一或多個胺基酸殘基上的修飾：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS 1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274與THR 1277，其中該修飾係選自於： i.以一鹼性胺基酸殘基來取代一酸性表面暴露胺基酸殘基； ii.以一不帶電荷的胺基酸殘基來取代一酸性表面暴露胺基酸殘基； iii.以一鹼性胺基酸殘基來取代一不帶電荷表面暴露胺基酸殘基； iv.插入一鹼性胺基酸殘基；以及 v.刪除一酸性表面暴露胺基酸殘基。
在另一相關態樣中，本發明提供了一種將經修飾肉毒桿菌神經毒素A(BoNT/A)，用來製備用於處理面部紋路之藥物的用途，其中該經修飾BoNT/A係通過肌肉內注射而施用在受試者面部的多個位置上， 其中，該經修飾BoNT/A係藉由在每一位置施用單位劑量為2單位至41單位的經修飾BoNT/A之方式來進行給藥，且其中1單位係為對應於計算所得之小鼠半數致死劑量(LD50 )的經修飾BoNT/A劑量， 其中該等多個位置係選自於： 至多兩個之皺眉肌位置以及一個降眉間肌位置，以用於處理眉間皺紋， 至多五個之額肌位置，以用於處理抬頭紋；以及 至多三個之在眼輪匝肌外圍的位置，以用於處理外眥紋路， 其中，在處理期間所施用之該經修飾BoNT/A的總劑量為至多574單位，並且 其中，該經修飾BoNT/A包含一BoNT/A輕鏈與轉位結構域，以及一BoNT/B受體結合結構域(HC 結構域)。
在一態樣中，本發明提供了一種用於處理面部紋路之經修飾BoNT/A，其中該經修飾BoNT/A係通過肌肉內注射而施用在受試者面部的多個位置上， 其中該經修飾BoNT/A係以每一位置施用單位劑量為0.5單位至73單位的經修飾BoNT/A之方式來進行給藥，且其中1單位係為對應於計算所得之小鼠半數致死劑量(LD50 )的經修飾BoNT/A劑量， 其中該等多個位置係選自於： 至多兩個之皺眉肌位置以及一個降眉間肌位置，以用於處理眉間皺紋， 至多五個之額肌位置，以用於處理抬頭紋；以及 至多三個之在眼輪匝肌外圍的位置，以用於處理外眥紋路， 其中，在處理期間所施用之該經修飾BoNT/A的該總劑量係為至多1019單位，並且 其中，該經修飾BoNT/A包含一BoNT/A輕鏈與轉位結構域，以及一BoNT/B受體結合結構域(HC 結構域)。
在另一態樣中，本發明提供了一種用於處理面部紋路之經修飾BoNT/A，其中該經修飾BoNT/A係通過肌肉內注射而施用在受試者面部的多個位置上， 其中，該經修飾BoNT/A係藉由在每一位置施用12 pg至1754 pg經修飾BoNT/A之單位劑量的方式來進行給藥， 其中該等多個位置係選自於： 至多兩個之皺眉肌位置以及一個降眉間肌位置，以用於處理眉間皺紋， 至多五個之額肌位置，以用於處理抬頭紋；以及 至多三個之在眼輪匝肌外圍的位置，以用於處理外眥紋路， 其中，在處理期間所施用之該經修飾BoNT/A的該總劑量係為至多24500 pg，並且 其中，該經修飾BoNT/A包含一BoNT/A輕鏈與轉位結構域，以及一BoNT/B受體結合結構域(HC 結構域)。
在一相關態樣中，本發明提供了一種用於處理面部紋路的方法，該方法包括在受試者面部的多個位置上，通過肌肉內注射而施用經修飾的肉毒桿菌神經毒素A(BoNT/A)， 其中該經修飾BoNT/A係以每一位置施用單位劑量為0.5單位至73單位的經修飾BoNT/A之方式來進行給藥，且其中1單位係為對應於計算所得之小鼠半數致死劑量(LD50 )的經修飾BoNT/A劑量， 其中該等多個位置係選自於： 至多兩個之皺眉肌位置以及一個降眉間肌位置，以用於處理眉間皺紋， 至多五個之額肌位置，以用於處理抬頭紋；以及 至多三個之在眼輪匝肌外圍的位置，以用於處理外眥紋路， 其中，在處理期間所施用之該經修飾BoNT/A的該總劑量係為至多1019單位，並且 其中，該經修飾BoNT/A包含一BoNT/A輕鏈與轉位結構域，以及一BoNT/B受體結合結構域(HC 結構域)。
在一相關態樣中，本發明提供了一種用於處理面部紋路的方法，該方法包括在受試者面部的多個位置上，通過肌肉內注射而施用經修飾的肉毒桿菌神經毒素A(BoNT/A)， 其中，該經修飾BoNT/A係藉由在每一位置施用單位劑量為12 pg至1754 pg經修飾BoNT/A之方式來進行給藥， 其中該等多個位置係選自於： 至多兩個之皺眉肌位置以及一個降眉間肌位置，以用於處理眉間皺紋， 至多五個之額肌位置，以用於處理抬頭紋；以及 至多三個之在眼輪匝肌外圍的位置，以用於處理外眥紋路， 其中，在處理期間所施用之該經修飾BoNT/A的該總劑量係為至多24500 pg，並且 其中，該經修飾BoNT/A包含一BoNT/A輕鏈與轉位結構域，以及一BoNT/B受體結合結構域(HC 結構域)。
在另一相關態樣中，本發明提供了一種將經修飾肉毒桿菌神經毒素A(BoNT/A)，用來製備用於處理面部紋路之藥物的用途，其中該經修飾BoNT/A係通過肌肉內注射而施用在受試者面部的多個位置上， 其中該經修飾BoNT/A係以每一位置施用單位劑量為0.5單位至73單位的經修飾BoNT/A之方式來進行給藥，且其中1單位係為對應於計算所得之小鼠半數致死劑量(LD50 )的經修飾BoNT/A劑量， 其中該等多個位置係選自於： 至多兩個之皺眉肌位置以及一個降眉間肌位置，以用於處理眉間皺紋， 至多五個之額肌位置，以用於處理抬頭紋；以及 至多三個之在眼輪匝肌外圍的位置，以用於處理外眥紋路， 其中，在處理期間所施用之該經修飾BoNT/A的該總劑量係為至多1019單位，並且 其中，該經修飾BoNT/A包含一BoNT/A輕鏈與轉位結構域，以及一BoNT/B受體結合結構域(HC 結構域)。
在另一相關態樣中，本發明提供了一種將經修飾肉毒桿菌神經毒素A(BoNT/A)，用來製備用於處理面部紋路之藥物的用途，其中該經修飾BoNT/A係通過肌肉內注射而施用在受試者面部的多個位置上， 其中，該經修飾BoNT/A係藉由在每一位置施用單位劑量為12 pg至1754 pg經修飾BoNT/A之方式來進行給藥， 其中該等多個位置係選自於： 至多兩個之皺眉肌位置以及一個降眉間肌位置，以用於處理眉間皺紋， 至多五個之額肌位置，以用於處理抬頭紋；以及 至多三個之在眼輪匝肌外圍的位置，以用於處理外眥紋路， 其中，在處理期間所施用之該經修飾BoNT/A的該總劑量係為至多24500 pg，並且 其中，該經修飾BoNT/A包含一BoNT/A輕鏈與轉位結構域，以及一BoNT/B受體結合結構域(HC 結構域)。
在此所引用的「肌肉」一詞，係指會對於本發明所針對之潛在醫美問題造會成影響(例如，藉著過度緊張、拉張或緊拉)之肌肉。
第一組肌肉係界定為降眉間肌，第二組肌肉係界定為皺眉肌，第三組肌肉係界定為眼輪匝肌，第四組肌肉則係界定為額肌。
該等多個位置可以是位在相同肌肉群上(例如，右與左皺眉肌，左與右眼輪匝肌)。同樣地，該等多個位置可以位在同一肌肉上(例如，右皺紋肌或左皺紋肌；或是右眼輪狀肌或左眼輪狀肌)。同樣地，該等多個位置可以位在該肌肉與該肌肉群的組合上。因此，本發明可以提供客製化的處理方案。
本發明使用的經修飾BoNT/A可以是包含在選自於以下之一或多個胺基酸殘基上的修飾之經修飾BoNT/A：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS 1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274與THR 1277，其中該修飾係選自於：以一鹼性胺基酸殘基來取代一酸性表面暴露胺基酸殘基；以一不帶電荷的胺基酸殘基來取代一酸性表面暴露胺基酸殘基；以一鹼性胺基酸殘基來取代一不帶電荷表面暴露胺基酸殘基；插入一鹼性胺基酸殘基；以及刪除一酸性表面暴露胺基酸殘基；或者係為包含一BoNT/A輕鏈與轉位結構域，以及一BoNT/B受體結合結構域(HC 結構域)之一經修飾BoNT/A。
較佳地，本發明使用的經修飾BoNT/A為包含在選自於以下之一或多個胺基酸殘基上的修飾之經修飾BoNT/A：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS 1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274與THR 1277，其中該修飾係選自於：以一鹼性胺基酸殘基來取代一酸性表面暴露胺基酸殘基；以一不帶電荷的胺基酸殘基來取代一酸性表面暴露胺基酸殘基；以一鹼性胺基酸殘基來取代一不帶電荷表面暴露胺基酸殘基；插入一鹼性胺基酸殘基；以及刪除一酸性表面暴露胺基酸殘基。
依據本發明所使用之經修飾BoNT/A的效價，係較佳地依據標準技術而藉由小鼠LD50 測定法來確定。在該測定法中，1單位係被界定為對應於計算所得之小鼠半數致死劑量(LD50 )的該經修飾BoNT/A劑量。較佳地係為該計算所得的小鼠半數致死腹膜劑量。在該測定法中對應於1單位之經修飾BoNT/A的劑量，可以是至少1 pg、2 pg、3 pg、4 pg、5 pg、6 pg、7 pg、8 pg或9 pg。在該測定法中對應於1單位之經修飾的BoNT/A劑量，可以是≤45 pg、≤40 pg、≤30 pg、≤25 pg、≤20 pg、≤19 pg、≤18 pg、≤17 pg、≤16 pg、≤15 pg、≤14 pg、≤13 pg、≤12 pg、≤11 pg、≤10 pg、≤9 pg、≤8 pg、≤7 pg或≤6 pg。
其中用於本發明之經修飾BoNT/A為包含在選自於以下之一或多個胺基酸殘基上的修飾之經修飾BoNT/A：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS 1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274與THR 1277，其中該修飾係選自於：以一鹼性胺基酸殘基來取代一酸性表面暴露胺基酸殘基；以一不帶電荷的胺基酸殘基來取代一酸性表面暴露胺基酸殘基；以一鹼性胺基酸殘基來取代一不帶電荷表面暴露胺基酸殘基；插入一鹼性胺基酸殘基；以及刪除一酸性表面暴露胺基酸殘基；在該測定法中，對應於1單位之經修飾BoNT/A的劑量可以是1-15 pg，例如5-10 pg。較佳地，在該測定法中，對應於1單位之經修飾BoNT/A的劑量可以是8-9 pg，更佳地為8.4 pg。
其中用於本發明之該經修飾BoNT/A為包含一BoNT/A輕鏈與轉位結構域，以及一BoNT/B受體結合結構域(HC 結構域)的經修飾BoNT/A；在該測定法中，對應於1單位之經修飾BoNT/A的劑量可以是15-35 pg，例如20-30 pg。較佳地，在該測定法中，對應於1單位之經修飾BoNT/A的劑量可以是23-25 pg，更佳地為24.0pg。
「至多」這個術語在用於引述一個數值(例如，至多574單位)時，係指最大為並包括該數值。因此，舉例來說，在提及施用「至多574單位」的經修飾BoNT/A，係包括施用574單位的經修飾BoNT/A以及少於574單位的經修飾BoNT/A。
一劑的經修飾BoNT/A係通過肌肉內注射施用在多個位置上。「施用單一個單位劑量」這個術語，係指基本上單一個單位劑量的全部都已被施用。較佳地，至多僅會留下單位劑量之殘留量(例如，至多1%、0.1%或0.01%)在經修飾BoNT/A已被復原的小瓶中。然而，較佳地，所有單一單位劑量都會被施用。隨著肌肉群的不同，單一單位劑量係典型地施用於選自於第一組的肌肉(如在此所描述的)；2×單位係典型地施用於選自於第二組的肌肉(如在此所描述的)；3×單位係典型地施用於選自於第三組的肌肉(如在此所描述的)；並且5×單位係典型地施用於選自於第四組的肌肉(如在此所描述的)。
該單位劑量可以用經修飾BoNT/A之單位來表示。
該單位劑量可以是2單位至41單位的經修飾BoNT/A。該單位劑量範圍的上限，可以是40、35、30、25、20、15或10。經修飾BoNT/A的單位，較佳地其上限為35單位。該單位劑量範圍的下限，可以是5、10、15、20、25、30或35。較佳地，該經修飾BoNT/A單位劑量係為12單位至35單位，12單位至24單位，更佳地為12至18單位。
可替代地或另外地，單位劑量可以用經修飾BoNT/A的劑量來表示。因此，在一態樣中，本發明提供了一種用於處理面部紋路之經修飾BoNT/A，其中該經修飾BoNT/A係通過肌肉內注射而施用在受試者面部的多個位置上， 其中該經修飾BoNT/A係以每一位置施用單位劑量為18 pg至350 pg的經修飾BoNT/A之方式來進行給藥，且其中1單位係為對應於計算所得之小鼠半數致死劑量(LD50 )的經修飾BoNT/A劑量， 其中該等多個位置係選自於： 至多兩個之皺眉肌位置以及一個降眉間肌位置，以用於處理眉間皺紋， 至多五個之額肌位置，以用於處理抬頭紋；以及 至多三個之在眼輪匝肌外圍的位置，以用於處理外眥紋路， 其中，在處理期間所施用之該經修飾BoNT/A的該總劑量係為至多4850 pg，並且 其中該經修飾BoNT/A包含在選自於以下之一或多個胺基酸殘基上的修飾：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS 1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274與THR 1277，其中該修飾係選自於： i.以一鹼性胺基酸殘基來取代一酸性表面暴露胺基酸殘基； ii.以一不帶電荷的胺基酸殘基來取代一酸性表面暴露胺基酸殘基； iii.以一鹼性胺基酸殘基來取代一不帶電荷表面暴露胺基酸殘基； iv.插入一鹼性胺基酸殘基；以及 v.刪除一酸性表面暴露胺基酸殘基。
在另一態樣中，本發明提供了一種用於處理面部紋路之經修飾BoNT/A，其中該經修飾BoNT/A係通過肌肉內注射而施用在受試者面部的多個位置上， 其中該經修飾BoNT/A係以每一位置施用單位劑量為18 pg至350 pg 的經修飾BoNT/A之方式來進行給藥，且其中1單位係為對應於計算所得之小鼠半數致死劑量(LD50 )的經修飾BoNT/A劑量， 其中該等多個位置係選自於： 至多兩個之皺眉肌位置以及一個降眉間肌位置，以用於處理眉間皺紋， 至多五個之額肌位置，以用於處理抬頭紋；以及 至多三個之在眼輪匝肌外圍的位置，以用於處理外眥紋路， 其中，在處理期間所施用之該經修飾BoNT/A的該總劑量係為至多4850 pg，並且 其中，該經修飾BoNT/A包含一BoNT/A輕鏈與轉位結構域，以及一BoNT/B受體結合結構域(HC 結構域)。
本發明還提供了相對應的用途(用於製造藥物)以及處理方法。
該單位劑量可以是18 pg至350 pg之經修飾BoNT/A。該單位劑量範圍的上限，可以是325、300、275、250、225、200、175、150、125、100或50 pg之經修飾BoNT/A，較佳地該上限係為300 pg。該單位劑量範圍的下限，可以是20、25、30、35、40、45、50、60、65、70、75、80、85、90、100、125、150、175、200、250或300 pg的經修飾BoNT/A，較佳地該下限為20 pg。該經修飾BoNT/A的該單位劑量係選自於：18 pg至350 pg、20 pg至300 pg，最佳為100 pg至150 pg。較佳地，該經修飾BoNT/A的該單位劑量係為20 pg至300 pg之經修飾BoNT/A，例如50 pg至250 pg。
最佳地，該經修飾BoNT/A的單位劑量係為80至180 pg，例如100 pg至150 pg。
經修飾BoNT/A的單位劑量可以是2單位至41單位。該單位劑量範圍的上限，可以是35、30、25、20、15、10或5單位的經修飾BoNT/A，較佳地該上限係為35單位。該單位劑量範圍的下限，可以是0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2單位的經修飾BoNT/A，較佳地該下限係為2單位。較佳地，經修飾BoNT/A的單位劑量，係為2單位至35單位的經修飾BoNT/A，例如15單位至25單位。
經修飾BoNT/A的單位劑量係選自於：2單位至35單位、6至35單位、12單位至35單位、12單位至24單位，最佳為12單位至18單位。
最佳地，經修飾BoNT/A的單位劑量係為5至25單位，例如12至18單位。
該單位劑量可以是8.4 pg至350 pg之經修飾BoNT/A。該單位劑量範圍的上限，可以是325、300、275、250、225、200、175、150、125、100或50 pg的經修飾BoNT/A，較佳地該上限係為300pg。該單位劑量範圍的下限，可以為5、10、20、25、30、35、40、45、50、60、65、70、75、80、85、90、100、125、150、175、200、250或300 pg的經修飾BoNT/A，較佳地該下限係為10 pg。較佳地，經修飾BoNT/A的單位劑量係為10 pg至300 pg的經修飾BoNT/A，更佳地為10 pg至200 pg，例如50 pg至250 pg。
經修飾BoNT/A的單位劑量係選自於：8.4 pg至350 pg、10 pg至300 pg、最佳為60 pg至120 pg。
最佳地，該經修飾BoNT/A的單位劑量係為80至180 pg，例如60 pg至120 pg。
經修飾BoNT/A的單位劑量可以是1單位至41單位。該單位劑量範圍的上限，可以是35、30、25、20、15、10或5單位的經修飾BoNT/A，較佳地該上限係為35單位。單位劑量範圍的下限，可以是0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9，或1單位之經修飾BoNT/A，較佳地該下限為1單位。較佳地，經修飾BoNT/A的單位劑量係為1至35單位的經修飾BoNT/A，例如10至20單位。
經修飾BoNT/A的單位劑量選自：1單位至35單位、3.5至35單位、7單位至35單位、7單位至24單位、最佳地7單位至14單位。
最佳地，經修飾BoNT/A的單位劑量係為5單位至20單位，例如7單位至14單位。
該單位劑量可以是0.5單位到73單位之經修飾BoNT/A。該單位劑量範圍的上限，可以是70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10或5單位之經修飾BoNT/A，較佳地該上限為62單位。單位劑量範圍的下限，可以是0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5或9單位之經修飾BoNT/A，該下限係較佳為0.8單位。較佳地，經修飾BoNT/A的單位劑量係為0.8單位至62單位的經修飾BoNT/A，例如20至40單位。
最佳地，經修飾BoNT/A的單位劑量係為5單位至25單位，例如10單位至21單位。
該單位劑量可以是12 pg至1754 pg之經修飾BoNT/A。該單位劑量範圍的上限，可以是1700、1600、1500、1400、1300、1200、1100、1000、800、600、400、200、100或50 pg之經修飾BoNT/A，較佳地該上限係為1000 pg。該單位劑量範圍的下限，可以是5、10、20、25、30、35、40、45、50、60、65、70、75、80、85、90、100、125、150、175、200、250或300 pg之經修飾BoNT/A，較佳地該下限係為20 pg。較佳地，該該經修飾BoNT/A的單位劑量係為20 pg至1500 pg，更佳地為20 pg至1000 pg之經修飾BoNT/A，例如500 pg至750 pg。
最佳地，該經修飾BoNT/A的單位劑量係為200至750 pg，例如250 pg至500 pg。
在經修飾BoNT/A包含包含一BoNT/A輕鏈與轉位結構域，以及一BoNT/B受體結合結構域(HC 結構域)時，這些單位劑量可以是特別具相關性的。
經修飾BoNT/A的單位劑量也可以同時以單位和劑量(pg)來表示。
在處理面部紋路時，可以用經修飾BoNT/A對選自於以下之多個位置進行給藥：至多兩個之皺眉肌位置以及一個降眉間肌位置，以用於處理眉間皺紋，至多五個之額肌位置，以用於處理抬頭紋；以及至多三個之在眼輪匝肌外圍的位置，以用於處理外眥紋路。
在實施本發明的處理方案時，所施用的總劑量最多可以達574單位。換句話說，在特定的處理期間所施用的經修飾BoNT/A總量可為至多574單位。該總劑量可為至多570、560、550、540、530、520、510、500、490、480、470、460、450或440單位。較佳地，該總劑量可為至多288單位的經修飾BoNT/A。
在實施本發明的處理方案時所施用的總劑量，可為至多4850、4500、4000、3550、3000、2750、2500 pg，較佳為至多2400 pg。
在實施針對於眉間皺紋之處理方案時所施用的總劑量，可為至多1500、1400、1300、1200、1100、1000、800、600、400、200、100或50，較佳為至多1000 pg。
當在實施針對於抬頭紋之處理方案時所施用的總劑量，可為至多1500、1400、1300、1200、1100、1000、800、600、400、200、100或50，較佳為至多1000 pg。
在實施針對於外眥紋路之處理方案時所施用的總劑量，可為至多1800、1700、1600、1500、1400、1300、1200、1100、1000、800、600、400、200、80、60、40或20，較佳為至多1200 pg。
在實施本發明的處理方案時所施用的總劑量，可為至多1019單位。換句話說，在特定的處理期間所施用的經修飾BoNT/A總量可為至多1019單位。該總劑量可為至多1000、950、900、850、800、750、700、650、600、550、500、450、400或400單位。較佳地，該總劑量可以為至多333單位的經修飾BoNT/A。
在實施本發明的處理方案時所施用的總劑量，可以為至多24500、24000、23500、23000、22500、22000 pg，較佳為至多8000 pg。在經修飾BoNT/A包含包含一BoNT/A輕鏈與轉位結構域，以及一BoNT/B受體結合結構域(HC 結構域)時，這些總劑量可以是特別具相關性的。
在進行眉間皺紋的處理方案時，所施用的總劑量可為至多5000、4500、4000、3500、3000、2500、2000、1500、1000、500、400、300、200、100、或50，較佳為至多5000pg。
在進行抬頭紋的處理方案時，所施用的總劑量可為至多5000、4500、4000、3500、3000、2500、2000、1500、1000、500、400、300、200、100或50，較佳為至多5000 pg。
在進行外眥紋路的處理方案時，所施用的總劑量可為至多6000、5500、4500、4000、3500、3000、2500、2000、1000、500、400、300、200、100或50，較佳為至多6000 pg。
在經修飾BoNT/A包含包含一BoNT/A輕鏈與轉位結構域，以及一BoNT/B受體結合結構域(HC 結構域)時，這些總劑量可以是特別具相關性的。
習於此藝者將會考量受試者最近是否曾接受(或隨後將接受)梭菌神經毒素(例如BoNT)的其他處理，例如作為醫美處理或不同適應症處理的部分程序。在使用本技術領域例行常規技術時，習於此藝者將會對應地調整本案之處理方案。
依據本發明來對多條肌肉進行給藥時，係較佳地會在同一處理期間中進行。
在施用經修飾BoNT/A後，可以在適當的時間周期下重複進行處理。有鑑於作用持續時間大約是未經修飾BoNT/A(例如的Dysport的®)的兩倍，後續的施用時間間隔係適當地比起以未經修飾BoNT/A(例如Dysport®)進行處理的受試者更長。受試者可以在前次給藥後至少18、20、25或30週，再次施用依據本發明之經修飾BoNT/A。舉例來說，受試者可以在前次施用後至少18-45週，較佳為20-35周才再次施用依據本發明的經修飾BoNT/A。
在此所使用的「受試者」一詞可以是哺乳動物，例如人或其他哺乳動物。較佳地，該「受試者」係指人類受試者。
在此所使用的「處理」或「處置」之術語，可以涵蓋預防性處理(例如，預防失調發作)以及矯正處理(對已經罹患失調的受試者進行處理)。較佳地，在此所使用的「處理」或「處置」一詞係指矯正處理。在此所使用的「處理」或「處置」一詞，係針對於失調及/或其症狀。
在WO 2015/00446 1 A1與WO 2017/191315中，描述合適之經修飾BoNT/A多胜肽(以及編碼該核苷酸之核苷酸序列，如果存在的話)，其之整體內容係在此被併入以供參考。
BoNT/A係為由梭菌屬細菌所產生的梭菌神經毒素的一例。此類梭菌神經毒素的其他例，包括由破傷風梭菌(TeNT)與肉毒桿菌(BoNT)血清型B-G所產生者，以及由巴氏梭菌與丁酸梭菌所產生者。該等神經毒素係具有高度效價與專一性，並且可以使得其等所遞送處之神經元與其他細胞中毒。在梭菌毒素中，有一些已知的最有效的毒素。舉例來說，隨著血清型的不同，肉毒桿菌神經毒素係具有0.5至5 ng/kg之半數致死劑量(LD50 )值。破傷風毒素與肉毒桿菌毒素均係通過抑制受影響之神經元的功能，特別是神經傳遞物質之釋放而起作用。雖然肉毒桿菌毒素係作用於神經肌肉會合處，並抑制周圍神經系統的膽鹼傳遞，然而破傷風毒素則係作用於中樞神經系統。
實際上，梭菌神經毒素(包括BoNT/A)係先合成為單鏈多胜肽，再通過蛋白質水解切割作用進行轉譯後修飾，以形成兩條通過雙硫鍵連接在一起的多胜肽鏈。切割作用發生在特定的切割位置(通常被稱為活化位置)，其係位於提供鏈間雙硫鍵的半胱胺酸殘基之間。此種雙鏈形式係為該毒素的活性形式。這兩條鏈係被稱為重鏈(H鏈，其分子量約為100 kDa)，以及輕鏈(L鏈，其分子量約為50 kDa)。H鏈包括一N-端轉位成分(HN 結構域)以及一C-端的靶定成分(HC 結構域)。該切割位置係位於L鏈與轉位結構域成分之間。在將HC 結構域與其之目標神經元結合，並通過胞內體將已結合的毒素內噬到細胞內之後，該HN 結構域會將該L鏈轉位越過胞內體膜，而進入細胞質液內，並且該L鏈可以提供了一蛋白酶功能(亦稱為非細胞毒性蛋白酶)。
非細胞毒性蛋白酶係通過將被稱為SNARE蛋白之細胞內轉運蛋白(例如SNAP-25、VAMP或突觸融合蛋白(Syntaxin))進行蛋白水解切割而起作用–參見Gerald K (2002) "Cell and Molecular Biology" (4th edition) John Wiley & Sons, Inc。SNARE此一縮寫係衍生自可溶性NSF附著蛋白(Soluble NSF Attachment Receptor)的字首，其中NSF係指N-乙基順丁烯二醯亞胺敏感因子(N-ethylmaleimide-Sensitive Factor)。SNARE蛋白係與細胞內囊泡融合作用整合，從而使得細胞分子自細胞內，經由囊泡運輸而分泌。該蛋白酶的功能係為一鋅依賴性內胜肽酶活性，並對於SNARE蛋白呈現出高受質專一性。因此，一旦其等被遞送制所欲目標細胞，該非細胞毒性蛋白酶便能夠抑制目標細胞之分泌作用。該梭菌毒素之L鏈蛋白酶係為切割SNARE蛋白之非細胞毒性蛋白酶。
在此所使用的「HC 結構域」之術語，係指分子量約為50kDa的神經毒素重鏈之功能相異區域，其可以使得神經毒素結合至位於目標細胞表面上之受體。該HC 結構域係由兩個結構上不同的次結構域所構成，即該「HCN 次結構域」(在HC 結構域的N端部分)以及「HCC 次結構域」(在HC 結構域的C 端部分)，其等每個均具有大約25kDa的分子量。
在此所使用的「LHN 結構域」之術語，係指不含HC 結構域的神經毒素，並且其係由內胜肽酶結構域(「L」或「輕鏈」)以及負責將內胜肽酶轉位至細胞質的結構域(重鏈之HN 結構域)所構成。
如上所討論者，梭菌毒素由兩條多胜肽鏈所形成，該重鏈(H鏈)的分子量約為100 kDa，而該輕鏈(L鏈)的分子量則約為50 kDa。該H鏈包含C-端靶定成分(受體結合結構域或HC 結構域)，以及N-端轉位成分(HN 結構域)。
輕鏈之參考序列的範例包括： 肉毒桿菌A型神經毒素：胺基酸殘基1-448 肉毒桿菌B型神經毒素：胺基酸殘基1-440
以上經確認之參考序列應被視為一指引，因為依據亞血清型的不同可能會發生輕微變異。藉著例示說明的方式，US 2007/0166332(其之整體內容在此被併入以供參考)係引述了略為不同之梭菌序列： 肉毒桿菌A型神經毒素：胺基酸殘基M1-K448 肉毒桿菌B型神經毒素：胺基酸殘基M1-K441
較佳的經修飾BoNT/A係包含在一或多個選自於以下的胺基酸殘基之修飾：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS 1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277。相較於使用已知的BoNT/A，此種經修飾BoNT/A可以減低或消除副作用。相對於採用已知的梭菌毒素療程，本發明的經修飾BoNT/A所增加之組織滯留性，還可以提供更佳的作用效果及/或持續時間，並且可以允許減少劑量(或是在不帶來任何額外不利影響下增加劑量)，從而提供更進一步的優勢。
該修飾可以是在與SEQ ID NO：2所顯示之未經修飾BoNT/A相比較時的修飾，其中該胺基酸殘基編號係藉著與SEQ ID NO：2比對而決定。由於在SEQ ID NO：2的位置1處存在有一甲硫胺酸殘基(以及對應於在此所描述之經修飾BoNT/A多胜肽的SEQ ID NOs)係為可選擇的，因此習於此藝者在決定胺基酸殘基編號時，會將甲硫胺酸殘基的存在/不存在納入考量。舉例來說，在SEQ ID NO：2包括有甲硫胺酸的情況下，位置編號將會與上述所界定者一般(例如，ASN 886將是SEQ ID NO：2的ASN 886)。或者，在SEQ ID NO：2中不存在甲硫胺酸的情況下，胺基酸殘基編號則應該要修改-1(例如，ASN 886將會是SEQ ID NO：2的ASN 885)。當位置1處的甲硫胺酸存在/不存在於在此所描述之其他多胜肽序列時，也適用類似的考量，並且習於此藝者將可以使用本技術領結構域之常用技術，而輕易地確定正確的胺基酸殘基編號。
上述指出的進行修飾之胺基酸殘基，係為暴露於表面之胺基酸殘基。
經修飾BoNT/A可以在選自於以下之一或多個胺基酸殘基上包含有修飾：ASN 886、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1052、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277。該經修飾BoNT/A可以由與選自於SEQ ID NO：3、5、7和9之核酸序列，具有至少70%的序列一致性的核酸序列所編碼。例如，與選自於SEQ ID NO：3、5、7和9的核酸序列，具有至少80%、90%、95%或99.9%的序列一致性之核酸序列。較佳地，用於本發明之經修飾BoNT/A可以包含由SEQ ID NO：3、5、7或9的核酸所編碼(或是由其等所組成)。該經修飾BoNT/A可以包含與選自於SEQ ID NO：4、6、8和10之多胜肽序列，具有至少70%序列一致性的多胜肽序列。舉例來說，與選自於SEQ ID NO：4、6、8和10之多胜肽序列，具有至少80%、90%、95%或99.9%之序列一致性的多胜肽序列。較佳地，用於本發明的經修飾BoNT/A，可以包括選自於SEQ ID NO：4、6、8和10的多胜肽序列(更佳地係由其等所組成)。
當「一或多個胺基酸殘基」這個術語被用在經修飾BoNT/A中時，其較佳地係指至少2、3、4、5、6或7個所示的胺基酸殘基。因此，經修飾BoNT/A可以在所示之胺基酸殘基上包含至少2、3、4、5、6或7個(較佳為7個)修飾。經修飾BoNT/A可以包含1-30、3-20或5-10個胺基酸修飾。更佳地，當「一或多個胺基酸殘基」這個術語被用在經修飾BoNT/A中時，其係指所有的所示胺基酸殘基。
較佳地，除了在所指胺基酸殘基處的一或多個胺基酸修飾之外，該經修飾BoNT/A相較於SEQ ID NO：2，並不包含任何其他胺基酸修飾。
最佳地，經修飾BoNT/A係在一或多個選自於以下的胺基酸殘基上(更佳地係由其等所組成)，包含有修飾：ASN 886、ASN 930、SER 955、GLN 991、ASN 1026、ASN 1052和GLN 1229。該經修飾BoNT/A可以由與SEQ ID NO：3具有至少70%序列一致性的核酸序列所編碼。舉例來說，與SEQ ID NO：3具有至少80%、90%、95%或99.9%的序列一致性的核酸序列。較佳地，用於本發明的經修飾BoNT/A可以由包含SEQ ID NO：3(或由其組成)的核酸所編碼。該經修飾BoNT/A可以包含與SEQ ID NO：4具有至少70%序列一致性的多胜肽序列。舉例來說，與SEQ ID NO：4具有至少80%、90%、95%或99.9%的序列一致性的多胜肽序列。較佳地，用於本發明的經修飾BoNT/A可以包含SEQ ID NO：4(更佳地係由其所組成)。
該等修飾可以選自於： i.以一鹼性胺基酸殘基來取代一酸性表面暴露胺基酸殘基； ii.以一不帶電荷的胺基酸殘基來取代一酸性表面暴露胺基酸殘基； iii.以一鹼性胺基酸殘基來取代一不帶電荷表面暴露胺基酸殘基； iv.插入一鹼性胺基酸殘基；以及 v.刪除一酸性表面暴露胺基酸殘基。
上述修飾可以獲致相較於未經修飾BoNT/A，具有更多正表面電荷以及更高的等電點之經修飾BoNT/A。
等電點(pI)是給定蛋白質的特定性質。如在本技術領結構域中所熟知的，蛋白質係由特定的胺基酸序列所構成(在蛋白質鏈中也被稱為胺基酸殘基)。在標準的二十個胺基酸群組中，每個胺基酸都具有不同的側鏈(或R基團)，這代表蛋白質中的每個胺基酸殘基都會具有不同的化學性質，例如帶電荷與疏水性。這些性質可能會受到周遭化學環境(例如溫度與pH值)所影響。蛋白質的整體化學特徵將由這些因素之總和來決定。
某些胺基酸殘基(細節如下)係具有可游離的側鏈，依據周遭的pH值，這些側鏈可能會呈現出電荷。此等側鏈在給定的pH值下是否帶有電荷，係取決於相關的可游離部分之pKa值，其中pKa值係為共軛鹼之特定質子的酸解離常數(Ka)之負對數。
舉例來說，諸如天冬胺酸與麩胺酸之酸性殘基，係具有pKa值約為4.1之側鏈羧酸基團(精確的pKa值可能會隨著溫度、離子強度以及可游離基團之微環境而改變)。因此，這些側鏈在pH 7.4(通常稱為「生理pH值」)下呈現帶負電荷。這些側鏈在低pH值下，將會質子化並失去電荷。
相反地，諸如離胺酸和精胺酸之類的鹼性殘基，係具有含氮側鏈基團，其pKa值約為10-12。因此，這些側鏈在pH值為7.4時會呈現正電荷。這些側鏈在高pH值下，會去質子化並失去電荷。
因此，蛋白質分子之總(淨)電荷係由在蛋白質中，所存在的酸性和鹼性殘基的數量(以及其等之表面暴露程度)，以及周圍的pH值所決定。改變周圍的pH值將會改變蛋白質上的總電荷值。因此，對於每一種蛋白質，都有一特定的pH值，在該pH值下，正電荷與負電荷的數量相等，並且該蛋白質將會呈現出不帶有整體淨電荷。該數值點係被稱為等電點(pI)。等電點係為蛋白質生物化學中習於此藝者所熟悉之標準概念。
因此，等電點(pI)係被定義為蛋白質呈現之淨電荷為零的pH值。pI值越高代表該蛋白質需要在更高的pH值下，才能呈現出為零之淨電荷。因此，pI值越高代表該蛋白質在給定的pH值下之淨正電荷越多。相反，pI越低則代表該蛋白質需要較低的pH值，才能呈現出為零的淨電荷。因此，pI值越低代表該蛋白質在給定pH值下之淨正電荷越少。
用於確認蛋白質之pI值的方法係為本技術領結構域所已知的，並且對於習於此藝者而言將會是其所熟知者。舉例來說，蛋白質的pI值可以由蛋白質中所存在的每個胺基酸之平均pKa值來進行計算(「計算所得pI值」)。此一計算過程可以使用本技術領結構域已知之電腦程式(例如來自ExPASy公司(https://web.expasy.org/compute_pi/)的Compute pI/MW Tool)來進行此類計算，這是根據計算方法計算pI的首選方法。本發明。應該使用相同的計算技術/程序對不同分子之間的pI值進行比較。
在適當的情況下，可以使用等電電聚焦技術，通過實驗來確認蛋白質之計算所得pI值(「觀察所得pI值」)。此一技術係採用電泳而依據蛋白質的pI值來分離蛋白質。等電點聚焦通常會使用具有固定pH梯度之凝膠來進行。在施加電場時，蛋白質會通過pH梯度而遷移，直到其到達淨電荷為零之pH值位置為止，而這就是該蛋白質的pI值。等電點聚焦技術所提供之結果，通常係典型地解析力相對較低，因此，本案發明人認為，由計算所得pI值(如上所述)所提供的結果，更適合被採用。
在整份說明書中，除非有另外說明，「pI值」係指計算所得「pI值」。
蛋白質的pI值可以藉著改變其在表面上所呈現之鹼性及/或酸性基團的數量，而增加或減少。其可以通過修飾蛋白質的一或多個胺基酸來實現。例如，可以通過減少酸性殘基之數量，或是通過增加鹼性殘基的數量，來增加pI值。
本發明之經修飾BoNT/A的pI值，可以比未經修飾BoNT/A(例如SEQ ID NO：2)的pI值，高至少0.2、0.4、0.5或1 pI單位。較佳地，經修飾BoNT/A可以具有至少為6.6，例如至少為6.8之pI值。
下表列出了20種標準胺基酸之性質：
胺基酸 側鏈
天冬胺酸 Asp D 帶電荷(酸性)
麩胺酸 Glu E 帶電荷(酸性)
精胺酸 Arg R 帶電荷(鹼性)
離胺酸 Lys K 帶電荷(鹼性)
組胺酸 His H 不帶電荷(極性)
天冬醯胺酸 Asn N 不帶電荷(極性)
麩醯胺酸 Gln Q 不帶電荷(極性)
絲胺酸 Ser S 不帶電荷(極性)
蘇胺酸 Thr T 不帶電荷(極性)
酪胺酸 Tyr Y 不帶電荷(極性)
甲硫胺酸 Met M 不帶電荷(極性)
色胺酸 Trp W 不帶電荷(極性)
半胱胺酸 Cys C 不帶電荷(極性)
丙胺酸 Ala A 不帶電荷(疏水性)
甘胺酸 Gly G 不帶電荷(疏水性)
纈胺酸 Val V 不帶電荷(疏水性)
白胺酸 Leu L 不帶電荷(疏水性)
異白胺酸 Ile I 不帶電荷(疏水性)
脯胺酸 Pro P 不帶電荷(疏水性)
苯丙胺酸 Phe F 不帶電荷(疏水性)
以下的胺基酸係被認為是帶有電荷的胺基酸：天冬胺酸(負電性)、麩胺酸(負電性)、精胺酸(正電性)與離胺酸(正電性)。
在pH值為7.4時，天冬胺酸(pKa 3.1)與麩胺酸(pKa 4.1)的側鏈帶有負電荷，而精胺酸(pKa 12.5)與離胺酸(pKa 10.8)的側鏈則帶有正電荷。天冬胺酸與麩胺酸係被稱為酸性胺基酸殘基。精胺酸與離胺酸則被稱為鹼性胺基酸殘基。
以下胺基酸則被認為是不帶電荷的，具極性(意味著其等可以參與氫鍵鍵結)的胺基酸：天冬醯胺酸、麩醯胺酸、組胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、甲硫胺酸以及色胺酸。
以下胺基酸則被認為是不帶電荷的疏水性胺基酸：丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸以及甘胺酸。
在插入胺基酸時，額外的胺基酸殘基(通常並不存在的胺基酸殘基)係被併入BoNT/A多胜肽序列中，從而增加了該序列中胺基酸殘基的總數。在刪除胺基酸時，胺基酸殘基系自梭菌毒素胺基酸序列中刪除，因此該序列中胺基酸殘基的總數將會減少。
較佳地，該修飾係為取代作用，其係有利地在經修飾BoNT/A中維持相同數目的胺基酸殘基。在取代胺基酸時，形成BoNT/A多胜肽序列之一部分的胺基酸殘基，係被替換為不同的胺基酸殘基。替換之胺基酸殘基可以是如上所述之20種標準胺基酸之一。任擇地，在胺基酸取代作用中所取代的胺基酸，可以是非標準胺基酸(不屬於上述20個標準群組中之一部分的胺基酸)。舉例來說，所替換的胺基酸可以是一鹼性非標準胺基酸，例如L-鳥胺酸、L-2-胺基-3-胍基丙酸、或是離胺酸、精胺酸、以及鳥胺酸的D-異構物。將非標準胺基酸引入蛋白質的方法，係為本技術領結構域所已知者，其包括使用大腸桿菌營養缺陷型表現宿主之重組蛋白質合成法。
在一具體實施例中，該取代作用係選自於：用鹼性胺基酸殘基來取代酸性胺基酸殘基、用不帶電荷的胺基酸殘基來取代酸性胺基酸殘基、以及用鹼性胺基殘基來取代不帶電荷胺基酸殘基。在一具體實施例中，其中該取代基係為以不帶電荷的胺基酸殘基來替換酸性胺基酸殘基、以用其之對應不帶電荷的醯胺胺基酸殘基來替換酸性胺基酸殘基(即天冬胺酸係以天冬醯胺酸來替換，而麩胺酸則以麩醯胺酸來替換)。
較佳地，鹼性胺基酸殘基係為離胺酸殘基或精胺酸殘基。換句話說，該取代作用係以離胺酸或精胺酸來進行取代。最佳地，該修飾係以離胺酸來進行取代。
下述依據本發明之修飾，該經修飾BoNT/A係能夠與目標細胞之會與未經修飾BoNT/A(例如SEQ ID NO：2)結合的受體結合。
用於本發明的經修飾BoNT/A可以包含BoNT/A輕鏈與轉位結構域(BoNT/A LHN 結構域)以及BoNT/B HC 結構域。該BoNT/A LHN 結構域係與BoNT/B HC 結構域共價連接。該經修飾BoNT/A在本文中也被稱為「BoNT/AB」或「BoNT/AB嵌合體」。
該LHN 結構域之C-端胺基酸殘基，可以對應於分離BoNT/A的LHN 和HC 結構域之310 螺旋的第一個胺基酸殘基，並且該HC 結構域之N-端胺基酸殘基，則可以對應於分隔BoNT/B 中之LHN 和HC 結構域的310 螺旋的第二個胺基酸殘基。
BoNT/B多胜肽序列的範例係被提供為SEQ ID NO：16(UniProt登錄號B1INP5)。
在此，「分離BoNT/A的LHN 和HC 結構域之310 螺旋的第一個胺基酸殘基」此一敘述，係指分離該LHN 和HC 結構域之310 螺旋的N-端殘基。
在此，「分離BoNT/B的LHN 和HC 結構域之310 螺旋的第二個胺基酸殘基」此一敘述，係指在分離LHN 和HC 結構域的310 螺旋之N-端殘基之後的胺基酸殘基。
「310 螺旋」係為一種可以在蛋白質與多胜肽中發現的二級結構，其還包括α螺旋、β摺板和回折。310 螺旋中之胺基酸係排列成右旋螺旋結構，其中每一個全幅轉彎係由三個殘基與十個原子所完成，其等會將其等之間的分子內氫鍵分開。每個胺基酸係對應於螺旋中之120°轉角(即，該螺旋中每個轉彎係具有3個殘基)，並且係沿著螺旋軸而平移為2.0Å(=0.2 nm)，同時在由造成氫鍵而形成的環中具有10個原子。最重要的是，胺基酸的N-H基團係與之前三個殘基的胺基酸之C=O基團形成氫鍵。此一重複的i + 3→i之氫鍵界定了310 螺旋。310 螺旋係為習於此藝者所熟悉的結構生物學標準概念。
該310 螺旋係對應於形成實際螺旋之四個殘基，以及位在這四個殘基的每一末端各一個之兩個帽端(或過渡)殘基。如在此所採用者，「將LHN 和HC 結構域分開的310 螺旋」此一描述，係由這6個殘基所組成。
通過進行結構分析與序列比對，可以鑑定分離LHN 和HC 結構域之310 螺旋。該310 螺旋在其N-端(即LHN 結構域的C端部分)係被一個α螺旋所圍繞，並且在其C-端(即HC 結構域的N端部分)則被一β鏈所圍繞。該310 螺旋的第一個(N-端)殘基(帽端或過渡殘基)，也是對應於此一α螺旋的C-端殘基。
分離LHN 和HC 結構域之該310 螺旋，可以由例如分別為肉毒桿菌神經毒素A1和B1之3BTA (http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=3BTA)與1EPW(http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=1EPW)之公眾可取得的肉毒桿菌神經毒素晶體結構來確認。
公眾可取得之計算機模擬與比對工具，也可以被用於確認在其他神經毒素中，分隔LHN 和HC 結構域之該310 螺旋的位置，例如同源性模擬伺服器LOOPP(Learning, Observing and Outputting Protein Patterns，http://loopp.org )、蛋白質同源/相似性辨識引擎(PHYRE，http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/)、以及Rosetta(https://www.rosettacommons.org /)、蛋白質疊加伺服器SuperPose (http://wishart. biology. ualberta. ca/superpose/)、比對程式Clustal Omega (http://www.clustal.org/omega/)、以及在分子與細胞生物學者的網路資源(http://molbiol-tools.ca/)中所列出的其他一些工具/服務。特別是在該「HN /HCN 」連結周圍的區域，在結構上係具備高度保留性的，而其使得其成為疊加不同血清型之理想區域。
舉例來說，以下方法可以用來確認在其他神經毒素中，此一310 螺旋的序列： 1.使用結構同源性建模工具LOOPP(http://loopp.org)，來取得以BoNT/A1晶體結構(3BTA.pdb)為基礎之其他BoNT血清型的預測結構； 2.對如此獲得之結構(pdb)檔案進行編輯，使其僅包含HCN 結構域之N-端以及在其之前的大約80個殘基(其等係屬於HN 結構域的一部分)，從而保留了結構上具備高度保留性的「HN /HCN 」區域； 3.該蛋白質疊加伺服器SuperPose (http://wishart.biology.ualberta.ca/superpose/)係被用來將每一種血清型疊加至該3BTA.pdb結構上。 4.對該經疊加的pdb檔案進行了檢視以確定在該BoNT/A1的HC 結構域處之該310 螺旋的位置，然後對其他血清型的對應殘基進行鑑定。 5.將其他BoNT血清型序列以Clustal Omega來進行比對，以檢查對應的殘基是否正確。
通過此方法確定的LHN ，HC 和310 螺旋結構域的示例如下所示：
神經毒素 登錄號 ( 小數點後附加序列版本 ) LHN HC 310 螺旋
BoNT/A1 (SEQ ID NO: 2) A5HZZ9.1 1-872 873-1296 872 NIINTS877
BoNT/A2 X73423.3 1-872 873-1296 872 NIVNTS877
BoNT/A3 DQ185900.1 (亦稱為Q3LRX9.1) 1-872 873-1292 872 NIVNTS877
BoNT/A4 EU341307.1 (亦稱為Q3LRX8.1) 1-872 873-1296 872 NITNAS877
BoNT/A5 EU679004.1 (亦稱為C1IPK2.1) 1-872 873-1296 872 NIINTS877
BoNT/A6 FJ981696.1 1-872 873-1296 872 NIINTS877
BoNT/A7 JQ954969.1 (亦稱為K4LN57.1) 1-872 873-1296 872 NIINTS877
BoNT/A8 KM233166.1 1-872 873-1297 872 NITNTS877
BoNT/B1 (SEQ ID NO: 16) B1INP5.1 1-859 860-1291 859 EILNNI864
BoNT/B2 AB084152.1 (亦稱為Q8GR96.1) 1-859 860-1291 859 EILNNI864
BoNT/B3 EF028400.1 (亦稱為A2I2S2.1) 1-859 860-1291 859 EILNNI864
BoNT/B4 EF051570.1 (亦稱為A2I2W0.1) 1-859 860-1291 859 EILNNI864
BoNT/B5 EF033130.1 (亦稱為A2I2U6.1) 1-859 860-1291 859 DILNNI864
BoNT/B6 AB302852.1 (亦稱為A8R089.1) 1-859 860-1291 859 EILNNI864
BoNT/B7 JQ354985.1 (亦稱為H9CNK9.1) 1-859 860-1291 859 EILNNI864
BoNT/B8 JQ964806.1 (亦稱為I6Z8G9.1) 1-859 860-1292 859 EILNNI864
藉著採用結構分析與序列比對，在分隔LHN 和HC 結構域的310 螺旋之後的β鏈，被發現在所有肉毒桿菌和破傷風神經毒素中，在從該分隔LHN 和HC 結構域之310 螺旋開始算起時，係為一種自第8殘基(例如，在BoNT/A1之879個殘基處)開始的保留結構。
BoNT/AB嵌合體可以包含與來自BoNT/B之HC 結構域，共價連接之來自BoNT/A的LHN 結構域， ●     其中該LHN 結構域的C-端胺基酸殘基，係對應於位在該BoNT/A之HC 結構域的開頭(N-端)之β鏈的該N-端第八個胺基酸殘基，並且 ●     其中該HC 結構域的N-端胺基酸殘基，係對應於位於BoNT/B之HC 結構域的開頭(N-端)之β鏈的該N-端第七個胺基酸殘基。
BoNT/AB嵌合體可以包含與來自BoNT/B之HC 結構域，共價連接之來自BoNT/A的LHN 結構域， ●     其中該LHN 結構域的C-端胺基酸殘基，係對應於位在該BoNT/A之LHN 結構域的開頭(C-端)之α-螺旋的該C-端胺基酸殘基，並且 ●     其中該HC 結構域的N-端胺基酸殘基，係對應於位於BoNT/B之LHN 結構域的結尾(C-端)之α-螺旋的該C-端胺基酸殘基之緊鄰C-端的胺基酸殘基。
BoNT/AB嵌合體設計過程之基本原理，是要試圖確保二級結構不受到損害，從而使得三級結構以及每個結構域的功能的任何變化最小化。在不被理論所束縛的前提下，假定不破壞BoNT/AB嵌合體中310 螺旋之四個中心胺基酸殘基而確保該嵌合神經毒素具有最佳構形，從而允許該嵌合神經毒素得以將其之作用發揮至最大效能。
實際上，令人驚訝的是，僅保留BoNT/A的310 螺旋之該第一個胺基酸殘基，以及BoNT/B的310 螺旋之第二個以後的胺基酸殘基，不僅允許產生具可溶性與功能性之BoNT/AB嵌合體，而更進一步可以獲致具有比其他BoNT/AB嵌合體更佳之特性，尤其是效果增加、安全比率增加及/或更長的作用持續時間(以及比起未經修飾的BoNT/A更高的安全比率及/或作用持續時間)。
來自BoNT/A的LHN 結構域可以對應於SEQ ID NO：2之胺基酸殘基1至872，或是與其具有至少70%序列一致性之多胜肽序列。來自BoNT/A的LHN 結構域可以對應於SEQ ID NO：2之胺基酸殘基1至872，或是與其具有至少80%、90%或95%的序列一致性之多胜肽序列。較佳地，來自BoNT/A的LHN 結構域係對應於SEQ ID NO：2之胺基酸殘基1至872。
來自BoNT/B的HC 結構域可以對應於SEQ ID NO：16之胺基酸殘基860到1291，或是與其具有至少70%序列一致性之多胜肽序列。來自BoNT/B的HC 結構域可以對應於SEQ ID NO：16之胺基酸殘基860到1291，或是與其具有至少80%、90%或95%序列一致性之多胜肽序列。較佳地，來自BoNT/B的HC 結構域係對應於SEQ ID NO：16之胺基酸殘基860到1291。
較佳地，該BoNT/AB嵌合體包含一BoNT/A1 LHN 結構域與一BoNT/B1 HC 結構域。更佳地，該LHN 結構域係對應於BoNT/A1(SEQ ID NO：2)的胺基酸殘基1至872，而該HC 結構域則係對應於BoNT/B1(SEQ ID NO：16)的胺基酸殘基860至1291。
較佳地，BoNT/B HC 結構域係在HCC 次結構域，進一步包括至少一胺基酸殘基取代、插入或刪除作用，相較於天然的BoNT/B序列，其具有增加BoNT/B 毒素對人類Syt II之結合親和力的效果。在BoNT/B HCC 次結構域之適當的胺基酸殘基取代、插入或刪除作用，已經被揭露於WO 2013/180799與WO 2016/154534中(其等均在此被併入以供參考)。
在BoNT/B HCC 次結構域中之適當的胺基酸殘基取代、插入或刪除作用，包括選自以下的取代突變：V1118M、Y1183M、E1191M、E1191I、E1191Q、E1191T、S1199Y、S1199F、S1199L、S1201V、E1191C、E1191V、E1191L、E1191Y、S1199W、S1199E、S1199H、W1178Y、W1178Q、W1178A、W1178S、Y1183C、Y1183P以及其等之組合。
在BoNT/B HCC 次結構域中之適當的胺基酸殘基取代、插入或刪除作用，包括選自以下之兩個取代突變的組合：E1191M和S1199L、E1191M和S1199Y、E1191M和S1199F、E1191Q和S1199L、E1191Q和S1199Y、E1191Q和S1199F、E1191M和S1199W、E1191M和W1178Q、E1191C和S1199W、E1191C和S1199Y、E1191C和W1178Q、E1191Q和S1199W、E1191V和S1199W、E1191V和S1199Y、或是E1191V和W1178Q。
在BoNT/B HCC 次結構域中之適當的胺基酸殘基取代、插入或刪除作用，還包括選自以下之三個取代突變的組合：其等係為E1191M、S1199W和W1178Q。
較佳地，在BoNT/B HCC 次結構域中之適當的胺基酸殘基的取代、插入或刪除作用，包括E1191M和S1199Y的2個取代突變的組合。此一修飾係存在於BoNT/AB嵌合體SEQ ID NO：13與SEQ ID NO：14中。
該修飾可以是與如SEQ ID NO：16所示之未修飾BoNT/B 進行比較之修飾，其中該胺基酸殘基編號係通過與SEQ ID NO：16進行比對而確定。由於在SEQ ID NO：16(以及對應於如在此所描述之經修飾BoNT/A多胜肽的SEQ ID NOs)之的位置1處的甲硫胺酸殘基係可選擇性存在的，習於此藝者在確定胺基酸殘基編號時，會將甲硫胺酸殘基是否存在納入考量。舉例來說，在SEQ ID NO：16包括甲硫胺酸的情況下，該位置編號將會如上述所界定者(例如，E1191將是SEQ ID NO：16的E1191)。可選擇地，在SEQ ID NO：16中不存在甲硫胺酸的情況下，胺基酸殘基編號則會被修改為-1(例如，E1191將為SEQ ID NO：16的E1190)。當如在此所描述之於其他多胜肽序列的位置1處之甲硫胺酸存在/不存在時，也適用類似的的考量，同時習於此藝者將可以採用本技術領域常規技術，而輕易地確定正確的胺基酸殘基編號。
用於本發明之經修飾BoNT/A可以包含與選自SEQ ID NO：11-15之多胜肽序列，具有至少70%序列一致性的多胜肽序列。舉例來說，與選自SEQ ID NO：11-15之多胜肽序列，具有至少80%、90%、95%或99.9%的序列一致性之多胜肽序列。較佳地，用於本發明的經修飾BoNT/A可以包含選自於SEQ ID NO：11-15的多胜肽序列(或更佳地係由其等所組成)。
當該經修飾BoNT/A係為BoNT/AB嵌合體時，該經修飾BoNT/A係較佳地包含與SEQ ID NO：14，具有至少70%序列一致性的多胜肽序列。舉例來說，與SEQ ID NO：14具有至少80%、90%、95%或99.9%序列一致性之多胜肽序列。較佳地，用於本發明之經修飾BoNT/A可以包含SEQ ID NO：14(更佳地係由其所組成)。
通過取代、插入或刪除胺基酸殘基來修飾蛋白質的方法，係為本技術領域中所已知的。舉例來說，胺基酸修飾可以通過修飾編碼了BoNT/A(例如編碼了未經修飾BoNT/A)之DNA序列來引入。其可以使用標準的分子選殖技術來達成，例如通過定點突變法，其中編碼了所需胺基酸之短鏈DNA(寡核苷酸)，係使用聚合酶來替換原始編碼序列；或是通過運用各種酶(例如連接酶與限制性核酸內切酶)來插入/刪除該基因的一部分。或者，也可以進行化學合成來修飾基因序列。
如上所討論者，在此所描述之經修飾BoNT/A具有更久之組織滯留性，其還可以提供更高的效價及/或作用持續時間，並且可以允許增加劑量而不會帶來任何其他負面影響。可以用來界定這些有利特性(其代表治療處理指數增加)的一種方式，係為經修飾BoNT/A之安全比率。在這一方面，梭菌毒素的不良反應(毒素由給藥部位擴散所導致)，可以透過在相關動物模型中，測量體重減輕的百分比而通過實驗來進行評估(例如小鼠，其中在給藥7天內測量其之體重減輕量)。相反地，所欲之梭菌毒素達到治療效果(on-target effects)，可以透過足趾外展得分(DAS)分析(肌肉麻痺的一種測量方法)，而通過實驗來進行評估。該DAS分析可以藉著將20μl的配製於明膠磷酸鹽緩衝液中之梭菌毒素，注射至小鼠腓腸肌/比目魚肌群中，接著使用Aoki的方法(Aoki KR, Toxicon 39: 1815-1820; 2001)來進行。在該DAS分析中，小鼠係用尾巴來短暫地懸吊以引起特徵性驚嚇反應，其中小鼠伸展其後肢並外展其後足趾。在注射梭菌毒素之後，以五分制對不同程度的足趾外展現象進行評分(0 =正常至4 =最大幅度減少足趾外展和後腿伸展現象)。
然後，本發明之經修飾BoNT/A(或用於進行比較之未經修飾BoNT/A)的安全比率，可以被表示為體重下降10%所需的毒素量(在對小鼠給藥後第一個7天內之最高影響)，以及DAS評分為2所需的毒素量之間的比率。因此，較高之安全比率評分係為較佳，這代表該毒素能夠有效地麻痺目標肌肉而幾乎沒有非所欲之脫靶效應(off-target effects)。本發明的經修飾BoNT/A係具有比等效未經修飾(天然的)BoNT/A更高的安全比率。
因此，在一具體實施例中，本發明之經修飾BoNT/A係具有大於7的安全比率(例如，至少為8、9、10、15、20、25、30、35、40、45或50)，其中該安全比率的計算方式為：體重變化-10%(pg/小鼠)所需之毒素劑量除以DAS ED50 (pg/小鼠)[ED50 =產生DAS評分2所需劑量]。
在一具體實施例中，本發明之經修飾BoNT/A的安全比率係為至少10。在一具體實施例中，本發明之經修飾BoNT/A的安全比率係為至少15。
較佳地，其中一經修飾BoNT/A係為包含一或多個選自以下之在此所描述的胺基酸殘基者：ASN 886、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1052、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，該經修飾BoNT/A的安全比率係至少為20，更佳地至少為22(例如23-25)。
較佳地，其中該經修飾BoNT/A係為一包含BoNT/A輕鏈與轉位結構域，以及BoNT/B HC 結構域者，該經修飾BoNT/A具有至少為10的安全比率，更佳地至少為12(例如14-15)。
在使用時，本發明之經修飾BoNT/A係為雙鏈形式。
該經修飾BoNT/A係較佳為非複合形式(即不含天然BoNT/A中所存在的複合蛋白)。此種複合蛋白之範例包括有神經毒素相關蛋白(NAP)以及非毒性非血凝素成分(NTNH)。較佳地，該經修飾BoNT/A係為一重組經修飾BoNT/A。
該經修飾BoNT/A可以藉著一種產生具有一輕鏈與一重鏈的單鏈經修飾BoNT/A之方法來產生，該方法包括在適當的細胞宿主中表現核酸(如上所述之核酸)、裂解該宿主細胞以提供含有該單鏈經修飾BoNT/A之宿主細胞均質物，並分離該單鏈經修飾BoNT/A。然後可以通過以下方法來活化該經修飾BoNT/A，該方法包括提供可由上述之該生產單鏈經修飾BoNT/A的方法，所獲得的單鏈經修飾BoNT/A蛋白，並使得該經修飾BoNT/A與一蛋白酶接觸，該蛋白酶會在位於該輕鏈與該重鏈之間的一識別位置(切割位置)處切割該多胜肽，藉以將該多胜肽轉化為一雙鏈經修飾BoNT/A，其中該輕鏈與該重鏈係通過雙硫鍵而連接在一起。
本發明的經修飾BoNT/A可以任何適當的方式配製，以例如作為醫藥組成物的一部分來施用於受試者。因此，在一態樣中，本發明提供了一種醫藥組成物，其包含本發明之經修飾BoNT/A以及藥學上可接受的載體、賦形劑、佐劑及/或鹽類。
在一態樣中，本發明提供了一種經修飾的肉毒桿菌神經毒素A(BoNT/A)的單位劑型，該單位劑型包括： a.   1單位至41單位(2單位至41單位)之經修飾BoNT/A，其中1單位係為對應於計算所得之小鼠半數致死劑量(LD50 )的該經修飾BoNT/A之劑量；或者 b.   8.4 pg至350 pg(18 pg至350 pg)之經修飾BoNT/A；以及 c.   可選擇包括之藥學上可接受之載體、賦形劑、佐劑及/或鹽類， 其中該經修飾BoNT/A包含在選自於以下之一或多個胺基酸殘基上的修飾：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS 1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274與THR 1277，其中該修飾係選自於： i.以一鹼性胺基酸殘基來取代一酸性表面暴露胺基酸殘基； ii.以一不帶電荷的胺基酸殘基來取代一酸性表面暴露胺基酸殘基； iii.以一鹼性胺基酸殘基來取代一不帶電荷表面暴露胺基酸殘基； iv.插入一鹼性胺基酸殘基；以及 v.刪除一酸性表面暴露胺基酸殘基。
在一具體實施例中，本發明提供了一種單位劑型，其包括： a.   1單位至35單位之經修飾BoNT/A；或者 b.   10 pg至300 pg之經修飾BoNT/A。
在一態樣中，本發明提供了一種經修飾的肉毒桿菌神經毒素A(BoNT/A)的單位劑型，該單位劑型包括： a.   2單位至41單位之經修飾BoNT/A，其中1單位係為對應於計算所得之小鼠半數致死劑量(LD50 )的該經修飾BoNT/A之劑量；或者 b.   18 pg至350 pg之經修飾BoNT/A；以及 c.   可選擇包括之藥學上可接受之載體、賦形劑、佐劑及/或鹽類， 其中，該經修飾BoNT/A包含一BoNT/A輕鏈與轉位結構域，以及一BoNT/B受體結合結構域(HC 結構域)。
在一態樣中，本發明提供了一種經修飾的肉毒桿菌神經毒素A(BoNT/A)的單位劑型，該單位劑型包括： a.   0.5單位至73單位之經修飾BoNT/A，其中1單位係為對應於計算所得之小鼠半數致死劑量(LD50 )的該經修飾BoNT/A之劑量；或者 b.   12 pg至1754 pg之經修飾BoNT/A；以及 c.   可選擇包括之藥學上可接受之載體、賦形劑、佐劑及/或鹽類， 其中，該經修飾BoNT/A包含一BoNT/A輕鏈與轉位結構域，以及一BoNT/B受體結合結構域(HC 結構域)。
本發明提供一種單位劑型，其包含： a.   0.8單位至62單位之經修飾BoNT/A；或者 b.   20 pg至1500 pg之經修飾BoNT/A。
一單位劑型可以包含6單位至35單位、12單位至35單位、12單位至24單位，較佳為12單位至18單位之經修飾BoNT/A。
該單位劑型可以包含50 pg至300 pg、100至300 pg、100至200 pg，較佳為100至150 pg之經修飾BoNT/A。
一種套組，其包括： a.如上所述之單位劑型；以及 b.與如何使用其來處理面部紋路有關之說明；以及 c.可選擇包括之稀釋劑。
相關的各種具體實施例處理用途的本發明的可應用於該方法，組成物(例如單位劑量形式)，和試劑盒本發明的和反之亦然。序列同源性
許多種序列比對方法中之任何一種，都可以用來確定一致性百分比，其等包括但不限於整體法(global method)、局部法、以及雜合體法，如區段逼近法(segment approach method)。用來確定一致性百分比的操作流程，係屬於落入習於此藝者領域內之常規程序。整體法係從分子的起始端到末端來比對序列，並通過對各個殘基對之評分進行累加，同時對空位施加扣分來確認最佳比對結果。非侷限性之範例方法包括例如CLUSTAL W，參見例如Julie D. Thompson et al., CLUSTAL W: Improving the Sensitivity of Progressive Multiple Sequence Alignment Through Sequence Weighting, Position- Specific Gap Penalties and Weight Matrix Choice, 22(22) Nucleic Acids Research 4673-4680 (1994)；以及疊代細化(iterative refinement)，參見例如Osamu Gotoh, Significant Improvement in Accuracy of Multiple Protein. Sequence Alignments by Iterative Refinement as Assessed by Reference to Structural Alignments, 264(4) J. MoI. Biol. 823-838 (1996)。局部法則係透過鑑定所有被輸入序列之共有的一或多個保留模體，來進行序列比對。非侷限性之範例方法包括例如Match-box，參見例如Eric Depiereux and Ernest Feytmans, Match-Box: A Fundamentally New Algorithm for the Simultaneous Alignment of Several Protein Sequences, 8(5) CABIOS 501 -509 (1992)；吉布斯抽樣(Gibbs sampling)，參見例如C. E. Lawrence et al., Detecting Subtle Sequence Signals: A Gibbs Sampling Strategy for Multiple Alignment, 262(5131 ) Science 208-214 (1993)； Science 208-214(1993)。Align-M，參見例如Ivo Van WaIIe et al., Align-M-A New Algorithm for Multiple Alignment of Highly Divergent Sequences, 20(9) Bioinformatics:1428-1435 (2004)。
因此，序列一致性百分比係藉由傳統方法來確定。參見例如Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48: 603-16, 1986 and Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-19, 1992。簡要地說，如下所示，兩段胺基酸序列係採用空位開放罰分為10、空位延伸，罰分為1、以及Henikoff and Henikoff的「blosum 62」評分矩陣(出處同上)來進行比對(胺基酸係以標準的單一字母代碼來表示)以使得比對評分最佳化。
兩段或更多段核酸或胺基酸序列之間的「序列一致性百分比」，係為該等序列所共有之相同位置數量的函數。因此，%一致性可以用相同核苷酸/胺基酸的數目，除以核苷酸/胺基酸的總數再乘以100%來計算。序列一致性的計算還可以將空位的數目與長度等等，需要被導入以使得兩段或多段序列之比對最佳化的條件納入考量。可以採用本技術領域習於此藝者所熟悉之特定數學演算法(例如BLAST)，來進行序列比對並確定兩段或多段序列之間的一致性百分比。確定序列一致性之比對評分
Figure 02_image001
然後，可以如下所示來計算一致性百分比：
Figure 02_image003
實質上同源之多胜肽係以具有一或多個胺基酸取代、刪除或插入作用來確認。這些變化係較佳地係為次要的，也就是保留性胺基酸取代作用(參見下文)，並且不會顯著影響該多胜肽的摺疊或活性；少量刪除作用，通常刪除1至大約30個胺基酸；以及少量的胺基或羧基末端延伸作用，例如胺基末端甲硫胺酸殘基、最多約20-25個殘基之小型連接仔胜肽、或是親和性標籤。
保留性胺基酸取代作用
鹼性： 精胺酸
   離胺酸
   組胺酸
酸性： 麩胺酸
   天冬胺酸
極性： 麩醯胺酸
   天冬醯胺酸
疏水性： 白胺酸
   異白胺酸
   纈胺酸
芳香族： 苯丙胺酸
   色胺酸
   酪胺酸
小型： 甘胺酸
   丙胺酸
   絲胺酸
   蘇胺酸
   甲硫胺酸
除20種標準胺基酸之外，非標準胺基酸(例如4-羥基脯胺酸、6-N-甲基離胺酸、2-胺基異丁酸、異纈胺酸、與α-甲基絲胺酸)，也可以取代本發明之多胜肽的胺基酸殘基。有限數量的非保留性胺基酸(並非由遺傳密碼所編碼之胺基酸)以及非天然胺基酸，也可以用來取代多胜肽胺基酸殘基。本發明之多胜肽還可以包含非天然存在之胺基酸殘基。
非天然存在的胺基酸包括有但不限於，反式-3-甲基脯胺酸、2,4-甲醇基-脯胺酸、順式-4-羥基脯胺酸、反式-4-羥基脯胺酸、N-甲基甘胺酸、別蘇胺酸、甲基蘇胺酸、羥乙基半胱胺酸、羥乙基同半胱胺酸、硝基麩醯胺酸、同麩醯胺酸、六氫菸生僉酸、三級白胺酸、正纈胺酸、2-氮雜苯丙胺酸(2-azaphenylalanine)、3-氮雜苯丙胺酸、4-氮雜苯丙胺酸、以及4-氟苯丙胺酸。數種用於將非天然存在之胺基酸殘基併入蛋白質中的方法，係為本技術領域中已知者。例如，可以使用其中採用化學胺基醯化的抑制子tRNA，來抑制無意義突變之活體外系統。用於合成胺基酸與胺基醯化tRNA之方法，係為本技術領域中已知者。包含有無意義突變之質體的轉錄和轉譯作用，是在無細胞系統中進行，該系統包含大腸桿菌S30的萃取物以及可商業上取得之酶與其他試劑。蛋白質係通過層析管柱法來進行純化。參見，例如，Robertson et al., J. Am. Chem. Soc. 113:2722, 1991;；Ellman et al., Methods Enzymol. 202:301, 1991; Chung et al., Science 259:806-9, 1993；以及 Chung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10145-9, 1993。在第二種方法中，轉譯作用係將突變的mRNA和化學胺基醯化的抑制性tRNA，通過顯微注射而在非洲爪蟾卵母細胞中進行(Turcatti et al., J. Biol. Chem. 271:19991-8, 1996)。在第三種方法中，大腸桿菌細胞係被培養在不存在欲進行取代之天然胺基酸(例如，苯丙胺酸)，卻存在所欲之非天然存在胺基酸(例如，2-氮雜苯丙胺酸、3-氮雜苯丙胺酸、4-氮雜苯丙胺酸、或4-氟苯丙胺酸)的情況下。該非天然存在的胺基酸會取代其天然對應物而併入該多胜肽內。參見，Koide et al., Biochem. 33:7470-6, 1994。天然存在的胺基酸殘基可以通過活體外化學修飾，而轉化為非天然存在的種類。化學修飾可以與定點突變結合，以進一步擴大取代的範圍(Wynn and Richards, Protein Sci. 2:395-403, 1993)。
有限數量的非保留性胺基酸(並非由遺傳密碼所編碼之胺基酸)以及非天然胺基酸、以及非天然胺基酸，也可以用來取代本發明的多胜肽胺基酸殘基。
在本發明的多胜肽中之必需胺基酸，可以根據本技術領域已知的方法，例如定點突變或是丙胺酸掃描式突變(Cunningham and Wells，Science 244：1081-5，1989)來鑑定。生物性相互作用的位置，也可以通過結構物理分析來確定，例如通過諸如核磁共振、晶體學、電子繞射、或光親和性標籤之類的技術，來與推定接觸位置之胺基酸突變結合而加以確認。參見，例如，de Vos et al., Science 255:306-12, 1992；Smith et al., J. Mol. Biol. 224:899-904, 1992；Wlodaver et al., FEBS Lett. 309:59-64, 1992。必需胺基酸的成分還可以從與本發明多胜肽之相關部分(例如轉位或蛋白酶部分)的同源性分析中推斷出來。
已知可以採用突變與篩選之方法，來進行許多種胺基酸取代作用和測試，例如由Reidhaar-Olson與Sauer(Science 241:53-7, 1988)或是Bowie與Sauer(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2152-6, 1989)所揭露者。簡而言之，這些作者揭露了同時使得多胜肽中之兩個或多個位置隨機變化，選擇功能性多胜肽，然後對突變之多胜肽進行定序，以確認在每個位置上可以允許取代作用之分布狀態的方法。可以採用之其他方法包括有噬菌體顯示法(phage display)(例如，Lowman et al., Biochem. 30:10832-7, 1991；Ladner et al., U.S. Patent No. 5,223,409；Huse, WIPO Publication WO 92/06204)以及區域-導向突變法(Derbyshire et al., Gene 46:145, 1986; Ner et al., DNA 7:127, 1988)。
除非有另有定義，否則本文中採用的所有技術與科學術語，均係與本揭露內容所屬技術領域之一般習於此藝者通常所理解者具有相同含義。Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 20 ED., John Wiley and Sons, New York (1994), 以及 Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991)，提供了習於此藝者，對於本揭露內容中所採用的許多術語之通用詞典。
本揭露內容並不侷限於在此所揭露之範例性方法與材料，同時那些與如在此所描述之方法或材料類似或是均等之任何方法和材料，都可以用於實施或測試本揭露內容之具體實施例。數值範圍都包括用於界定該範圍之數值。除非有另外說明，否則任何核酸序列都係以5'至3'的方向從左至右書寫；胺基酸序列則係分別以胺基至羧基的方向從左至右書寫。
本案在此所提供的標題，並不會對於本案揭露內容之各種態樣或具體實施例構成限制。
本案在此係採用胺基酸名稱之三字母縮寫或單字母縮寫，來指稱胺基酸。本案所使用之「蛋白質」此一術語包括蛋白質、多胜肽和胜肽。如在此所採用者，「胺基酸序列」此一術語係與「多胜肽」此一術語及/或「蛋白質」此一術語具有相同涵義。在某些情況下，「胺基酸序列」此一術語係與「胜肽」此一術語具有相同涵義。在某些情況下，「胺基酸序列」此一術語係與「酶」此一術語具有相同涵義。「蛋白質」與「多胜肽」此等術語，在本案中可以互換使用。在本案揭露內容與申請專利範圍中，可以使用胺基酸殘基之傳統的單一字母與三字母代碼。胺基酸的該三字母代碼，係根據IUPACIUB生物化學命名聯合委員會(Joint Commission on Biochemical Nomenclature；JCBN)所定義者。還應理解的是，由於遺傳密碼的簡併性，一多胜肽可以由一個以上的核苷酸序列所編碼。
在整份說明書中可能出現該等術語之其他定義。在更詳細地描述範例性具體實施例之前，應當要理解的是，本案揭露內容並未侷限於在此所描述之特定具體實施例，並且其因此可以進行變化。還應理解的是，本案中所採用之術語僅係出於描述特定具體實施例之目的，而並非意欲限制本發明，因為本案揭露內容之範圍將僅由隨附之申請專利範圍所限定。
在提供數值範圍的情況下，應當理解的是，除非在內文中有另外明確指明，否則在該範圍的上限和下限之間的每個中間值(直到下限單位的十分之一)，也都被具體地揭露了。在所描述之範圍內的每一較小範圍，或是在所描述之範圍內的中間值，以及所描述之範圍內的任何其他指定值或中間值，都包括在本案揭露內容中。這些較小範圍之上限與下限，可以被單獨地包括或排除於該範圍內，並且在每個範圍之界限值之任一、均未包含或是兩者均包含的範圍，也包括在本案揭露內容之較小範圍內，但仍以本發明中有針對所描述之範圍內明確排除之限制為準。在所描述的範圍包括有一或兩個界限值的情況下，排除那些界限中之一或兩者的範圍，也包括在本案揭露內容內。
必須要注意的是，除非在內文中有另外明確指明，如在此與隨附之請專利範圍中所使用的，單數形式的「一個」、「一種」與「該」均包括複數個指述物。因此，舉例來說，「一種肉毒桿菌神經毒素A」之敘述包括複數個此種候選藥劑，並且「該肉毒桿菌神經毒素A」之敘述包括一或多個梭菌神經毒素以及此技術領域習於此藝者所已知的等效物，等等。
在此所討論的文獻僅係為了揭露本案申請日之前的習知技藝而提供提供。在本案中之任何內容均不應被解讀為，承認此等文獻已構成了隨附申請專利範圍之先前技術。序列表
當下列任何SEQ ID NOs中指出起始Met胺基酸殘基或是對應的起始密碼子時，該殘基/密碼子係具備選擇性的。
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具體實施例 實施例 1 選殖、表現與純化
編碼野生型BoNT/A(SEQ ID NO：2)的核苷酸序列SEQ ID NO：1，係被突變以引入以下取代作用，而形成以下表1所示之四個構築體：
構築體 突變 核苷酸序列 多肽序列
Cat-A N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K、N886K 3 4
Cat-B N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K、N954K 5 6
Cat-C N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K、N1025K 7 8
Cat-D* N1188R、D1213R、G1215R、N1216R、N1242R、N1243R、S1274R、T1277R 9 10
表1：構築體。 *Cat-D計算的pI為7.45，分子量為149,859。
合成編碼了上述經修飾BoNT/A分子之DNA構築體，選殖到PJ401表現載體內，然後轉型至BL21(DE3)大腸桿菌中。這一處理允許在BL21(DE3)大腸桿菌中，可溶性地過量表現重組Cat-A、Cat-B、Cat-C與Cat-D蛋白。
該重組經修飾的BoNT係採用傳統的層析技術，而自從大腸桿菌裂解物中純化。採用運用了陽離子交換樹脂之的初始純化步驟，然後使用疏水性作用樹脂進行中間純化步驟。該重組的經修飾BoNT單鏈然後通過蛋白水解作用而切割，以得到活化之雙鏈經修飾BoNT。然後採用最後的純化步驟以刪除殘留的污染物。適當的技術係被教示於WO2015/166242、WO2017055274A1、EP2524963B1、EP2677029B1和US10087432B2中。實施例 2 純化後的經修飾 BoNT/A 之定性
在上述實施例1所描述之該經修飾BoNT中，係如以下進行實驗定性。
對pI值的測量結果顯示，該修飾BoNT之等電點係大於未修飾(天然)BoNT/A1之等電點-參見以下面圖2與表2。
BoNT/A1 分子 pI ( 計算得到 ) pI ( 觀察 得 到 )
經修飾「Cat-A」 [Cat5v2(K1064H/N886K] (SEQ ID NO: 4) 6.9 ~8.0
經修飾「Cat-B」 [Cat5v2(K1064/N954K)] (SEQ ID NO: 6) 6.9 ~8.0
經修飾「Cat-C」 [Cat5v2(K1064H/N1025K)] (SEQ ID NO: 8) 6.9 7.8-8.0
天然BoNT/A1 [rBoNT/A1] (SEQ ID NO: 2) 6.05 ~7.4
表2：經修飾BoNT/A的pI值。
經修飾BoNT進入神經元並切割SNAP-25(BoNT/A1之標的)的能力，係使用大鼠胚胎脊髓神經元(eSCN)來進行評估。圖3顯示該經修飾BoNT保留了與天然BoNT/A1相同之進入神經元並切割SNAP-25的能力。
該經修飾BoNT的效價可以通過膈神經半邊橫膈測定法(mPNHD)來進一步評估。圖4顯示該經修飾BoNT保有與天然BoNT/A1相同之抑制小鼠半邊橫膈之收縮的能力。
在活體內之小鼠足趾外展得分(DAS)測定，係用於評估相對於天然BoNT/A1之效價以及安全性。相對於天然BoNT/A1，這兩種分子(Cat-A [SEQ ID NO：4]與Cat-B [SEQ ID NO：6])均呈現出更高的安全比率，並且效價更高。以下表3中列出了這些數據：
分子 DAS ED50 (pg/ 小鼠 ) DAS 4 劑量 (pg/ 小鼠 ) 劑量 -10% ΔBW (pg/ 小鼠 ) 安全比率
天然BoNT/A1 (n=5) (SEQ ID NO: 2) 2 10-20 9.9-14.5 7
經修飾「Cat-A」(SEQ ID NO: 4) 1.16 10-20 27.4 24
經修飾「Cat-B」 (SEQ ID NO: 6) 1.79 25 47.6 27
表3：DAS分析和安全比率。 -   DASE D50 ：誘發DAS 2之計算所得劑量 -   DAS 4劑量：誘導DAS 4之實驗劑量 -   BW：體重 -   -10%ΔBW之劑量：相較於在D0時的BW，BW減少10%之計算所得劑量 -   安全比率：-10%∆BW之劑量/DAS ED50
安全比率是相對於效力(足趾外展得分(DAS)最大值之半數)，衡量BoNT處理之負面影響(體重減輕)的衡量方式。其係以-10%體重(BW)與DAS ED50 之間的比率來計算，其中-10%BW係指體重減輕10%所需的BoNT劑量(pg/動物)，而ED50 則是指產生DAS為2所需之BoNT劑量(pg/動物)。
該DAS分析係通過將配製於明膠磷酸鹽緩衝液中之20μl的經修飾BoNT/A，注射至小鼠腓腸肌/比目魚肌群中，接著以前述之Aoki的足趾外展評估方法(Aoki KR, Toxicon 39: 1815-1820; 2001)來進行。實施例 3 BoNT/AB 嵌合體的選殖、表現與純化
BoNT/AB嵌合構築體1、2、3A、3B與3C(分別為SEQ ID NO：11至15)，係使用標準分子生物學技術，由編碼了親本血清型分子之DNA與適當的寡核苷酸所構築。然後將其等選殖至帶有或不帶有C-端His10 標籤的pJ401表現載體中，並轉型至BLR(DE3)大腸桿菌細胞中進行過表現。這些細胞係在裝有1 L之改良Terrific Broth(mTB)，並添加了適當抗生素的培養液之帶有擋板之2 L錐形瓶中，於37°C與225 RPM搖動下生長。一旦A600 達到＞0.5，將培養箱之溫度降至16°C，然後以1 mM IPTG誘導1小時後，於225 RPM搖動培養20 h，以表現重組BoNT/AB構築體。
藉由超音波來裂解所收穫的細胞，並在4°C下以4500 RPM離心1 h取得澄清液。然後在硫酸銨中萃取重組BoNT/AB嵌合分子，並藉由標準快速蛋白質液相層析(FPLC)技術來進行純化。此一步驟與使用疏水性作用樹脂來進行捕獲，並使用陰離子交換樹脂來進行中間純化步驟有關。該經部分純化的分子然後以內蛋白酶Lys-C來蛋白水解，以產生具活性之雙鏈。將其以第二種疏水性作用樹脂來進一步純化，以獲得最終之BoNT/AB嵌合體。
對於具有十組胺酸之標籤(H10 )(嵌合體1、2、3A)之BoNT/AB嵌合分子而言，所採用之捕獲步驟係運用固定化鎳樹脂而不是疏水性作用樹脂。
每一種嵌合體之序列係被呈現於表4中。
分子 SEQ ID NO 序列
嵌合體1 11 A1:1-871 + B1:858-1291 (E1191M/S1199Y) + His10 -標籤
嵌合體2 12 A1:1-874 + ELGGGGSEL + B1:858-1291 (E1191M/S1199Y) + His10 -標籤
嵌合體3A 13 A1:1-872 + B1: 860-1291 (E1191M/S1199Y) + His10 -標籤
嵌合體3B 14 A1:1-872 + B1: 860-1291 (E1191M/S1199Y)
嵌合體3C 15 A1:1-872 + B1: 860-1291
表4：嵌合BoNT/AB構築體實施例 4 BoNT/AB 嵌合體 1 、 2 和 3A 的比較
具有C-端His10 標籤以及E1191M/S1199Y雙突變之BoNT/AB嵌合體1、2和3A，係如實施例3(圖5)中所描述的來進行純化，並測試功能活性。 [大鼠脊髓神經元SNAP-25切割測試]
製備大鼠脊髓神經元(SCN)之原代培養物，並在96孔組織培養板中培養3週(如Masuyer et al., 2011, J. Struct. Biol. Structure and activity of a functional derivative of Clostridium botulinum neurotoxin B；以及 Chaddock et al., 2002, Protein Expr. Purif. Expression and purification of catalytically active, non-toxic endopeptidase derivatives of Clostridium botulinum toxin type A中所述)。在SCN進料培養液中製備BoNT/AB的連續稀釋液。來自欲進行處理之孔中的生長培養液，係被收集並過濾(0.2 μm過濾器)。將125 μL之經過濾的培養液，加回至每一個測試孔中。然後將125 μL之經稀釋毒素，加入到該板中(一組三份的孔板)。將經處理的細胞在37℃，10%CO2 下培養24±1h)。 [使用SNAP-25切割分析法來分析BoNT的活性]
在經過處理之後，刪除BoNT並將細胞在PBS(Gibco，UK)中洗滌一次。將細胞在補充有0.1 M二硫蘇糖醇(DTT)以及250單位/mL苯甲酸酶(Sigma)之1x NuPAGE裂解緩衝液(Life Technologies)中進行裂解。裂解蛋白質以SDS-PAGE分離，並轉移至硝酸纖維素膜上。採用對SNAP-25具有專一性的一級抗體(Sigma#S9684)作為探針進行探測，該抗體可以辨認未經切割之SNAP-25，以及被BoNT/A內胜肽酶所切割之SNAP-25。所採用之二級抗體係綴合有HRP之抗兔IgG(Sigma #A6154 )。通過增強化學發光法來檢測條帶，並使用pXi6 Access(英國Synoptics)形成影像。使用GeneTools軟體(Syngene，Cambridge，UK)來確定條帶的強度，並計算在每一種BoNT濃度下所裂解之SNAP-25的百分比。將數據彙整為4-參數推理方程式，並運用GraphPad Prism版本6(GraphPad)來計算pEC50 。
以下表5提供了在大鼠SCN SNAP-25切割測定中，所確定之嵌合體1、2和3A的pEC50 值。這些結果顯示，這三個BoNT/AB嵌合體都保留了進入大鼠脊髓神經元並切割其之目標受質的能力。然而，在該測定中，嵌合體3A比嵌合體1和2更為有效(同樣參見圖6)。
   pEC50 ±SEM
異原嵌合體1 12.42 ±0.04
異原嵌合體2 12.57 ±0.01
異原嵌合體3A 12.89 ±0.04
表5：pEC50 值。 [足趾外展評分(DAS)測試]
用於在DAS分析中測量BoNT/AB嵌合體1、2和3A之活性的方法，係以小鼠在短暫以尾巴懸吊下，所誘發之足趾伸展反射的驚嚇反應為基礎。此一反射反應係被評量為足趾外展得分(DAS)，並且在對後肢腓腸肌/比目魚肌群注射BoNT會被抑制。小鼠被短暫以尾巴懸吊以引起特徵性的驚嚇反應，其中該動物會伸展其後肢並外展其後趾(Aoki et al. 1999, Eur. J. Neurol.; 6 (suppl. 4) S3-S10)。
在注射當天，將小鼠在接受含3%異氟烷之氧氣的誘導室中進行麻醉。每隻小鼠都會在右後肢的腓腸肌/比目魚肌群內注射BoNT/AB嵌合體或是載體(含有0.2%明膠之磷酸鹽緩衝液)。
在注射神經毒素之後，以零到四的等級對足趾外展程度進行評分，其中0 =正常，而4 =最大程度地減低足趾外展與後腿伸展。ED50 係使用每個劑量之最大效用平均值，通過非線性調整分析而確定。所採用之數學模型係為4參數邏輯模型。
在給藥後的第一天，每2個小時執行一次DAS；此後每天進行3次，共計4天。
圖7顯示嵌合體1、2和3A(SEQ ID NO分別為：11、12與13)的擬合曲線。嵌合體3A的曲線向左移動，這代表相較於嵌合體1和2，較低劑量的嵌合體3A可以獲得類似的DAS反應，這因此顯示，在小鼠DAS中嵌合體3A比其他嵌合體更為有效。亦可參見以下表格(表6)，其提供用於計算每個嵌合體的ED50 以及會導致DAS 4(最高分)之劑量值。
以下表6提供了在小鼠DAS分析中，針對未經修飾的重組BoNT/A1(rBoNT/A1–SEQ ID NO：2)以及嵌合體1、2和3A，所確定之ED50與DAS 4劑量。這些結果顯示，在這三種嵌合體中，嵌合體3A在誘發肌肉弱化現象方面，具有最高的活體內效價。在圖7和表6所顯示的研究中，係在由Charles River實驗室所取得之小鼠中進行。
   ED50 (pg/小鼠) DAS 4 劑量(pg/小鼠)
rBoNT/A1 1 5
嵌合體1 23 200
嵌合體2 89 ＞300
嵌合體3A 18 133
表6：ED50 值。實施例 5 BoNT/AB 嵌合體 3B 、 3C 與未經修飾 BoNT/A1 的比較
分別具有和不具有E1191M/S1199Y雙突變(SEQ ID NO：14和15)之不具標籤的BoNT/AB嵌合體3B和3C，係如實施例3(圖8)所述進行純化，並使用未經修飾BoNT/A(SEQ ID NO：2)作為參考來測試功能活性。 [人類富潛能幹細胞SNAP-25切割測試]
冷凍保存之PERI.4U細胞係自Axiogenesis(Cologne, Germany)購得。按照製造商的建議進行解凍與平板培養。簡而言之，將含有細胞的冷凍小管在37℃的水浴池中融化2分鐘。在輕輕重新懸浮之後，將細胞轉移至50 mL試管中。以製造商所提供之1mL的Peri.4U®解凍培養液洗滌冷凍管，然後將培養液逐滴轉移至細胞所懸浮之50mL管中，然後再將2mL的Peri.4U®解凍培養液逐滴添加滴入50mL試管中。然後使用血球計來計算細胞。在此之後，將另外6mL的Peri.4U®解凍培養液添加至細胞懸液中。在室溫下以260 xg(例如1,100 RPM)離心6分鐘以取得細胞沉澱。然後將細胞重新懸浮在製造商所提供之完整Peri.4U®培養液中。將細胞以每cm2 具有50,000至150,000個細胞的密度，鋪在塗有聚-L-鳥胺酸與層黏結蛋白之細胞培養板上。將細胞培養在37°C濕潤的CO2 環境中，並且在培養過程中每2-3天更換一次培養液。
針對於毒素處理，以Peri.4U®培養液來製備BoNT的連續稀釋液。收集並過濾(0.2 μm過濾器)來自待處理孔中之培養液。將125 μL之過濾後的培養液加回至每個測試孔中。然後將125 μL之稀釋毒素添加入該培養板(一組三份的孔板)。將經處理的細胞在37℃，10%CO2 下培養48±1小時。 [使用SNAP-25裂解分析法分析BoNT活性]
在經過處理之後，刪除BoNT並將細胞在PBS(Gibco，UK)中洗滌一次。將細胞在補充有0.1 M二硫蘇糖醇(DTT)以及250單位/mL苯甲酸酶(Sigma)之1x NuPAGE裂解緩衝液(Life Technologies)中進行裂解。裂解蛋白質以SDS-PAGE分離，並轉移至硝酸纖維素膜上。採用對SNAP-25具有專一性的一級抗體(Sigma#S9684)作為探針進行探測，該抗體可以辨認未經切割之SNAP-25，以及被BoNT/A內胜肽酶所切割之SNAP-25。所採用之二級抗體係綴合有HRP之抗兔IgG(Sigma #A6154 )。通過增強化學發光法來檢測條帶，並使用pXi6 Access(英國Synoptics)形成影像。使用GeneTools軟體(Syngene，Cambridge，UK)來確定條帶的強度，並計算在每一種BoNT濃度下所裂解之SNAP-25的百分比。將數據彙整為4-參數推理方程式，並運用GraphPad Prism版本6(GraphPad)來計算pEC50 。
圖9顯示，嵌合體3B和3C在切割經誘導人類富潛能幹細胞中之SNAP-25方面，呈現出比rBoNT/A1更大的效價，但前者顯然更多。這可解釋為該雙突變可以增加嵌合體3B對於存在於這些細胞中，人類突觸結合蛋白II蛋白接受器的親和力(圖9，表7)。
   pEC50 ±SEM
rBoNT/A1 10.21 ±0.05
嵌合體3B 12.38 ±0.06
嵌合體3C 10.72 ±0.08
表7：pEC50 值。 [足趾外展評分(DAS)測試–安全比率]
用於在DAS分析中測量BoNT之活性的方法，係以小鼠在短暫以尾巴懸吊下，所誘發之足趾外展反射的驚嚇反應為基礎。此一反射反應係被評量為足趾外展得分(DAS)，並且在對後肢腓腸肌/比目魚肌群注射BoNT會被抑制。小鼠被短暫以尾巴懸吊以引起特徵性的驚嚇反應，其中該動物會伸展其後肢並外展其後趾(Aoki et al. 1999, Eur. J. Neurol.; 6 (suppl. 4) S3-S10)。
在注射當天，將小鼠在接受含3%異氟烷的氧氣的誘導室中麻醉。每隻小鼠在右後爪的腓腸肌/比目魚肌群中，肌肉內注射BoNT或媒介物(含0.2%明膠的磷酸鹽緩衝液)。
在注射神經毒素之後，以零到四的等級對足趾外展程度進行評分，其中0=正常，而4=最大程度地減低足趾外展與後腿伸展。ED50 係使用每個劑量之最大效用平均值，通過非線性調整分析而確定。所採用之數學模型係為4參數邏輯模型。
在給藥後的第一天，每2個小時執行一次DAS；此後每天進行3次，共計4天。注射了載體以及會在前四天中誘發DAS為4之最低劑量的動物組，於此之後持續進行監測直到肌肉弱化現完全恢復為DAS為0(沒有觀察到肌肉弱化現象)。
為了計算安全比率，在毒素注射(D0)前一天為所有動物進行稱重，之後在整個研究過程中每天稱重一次。每天計算每一劑量組之平均體重、其之標準差、以及標平均值標準誤差值。為了獲得BoNT的安全比率(-10%ΔBW/ED50 )，在研究過程中之任何時候，一劑量組的平均重量低於該劑量組在D0時之平均重量的數值之10%，係被除以所研究之BoNT的該劑量組的ED50 。該致死劑量係被定義為該劑量組中之一隻或多隻動物死亡的劑量。
圖10顯示了在未經修飾BoNT/A、嵌合體3B與嵌合體3C(SEQ ID NO：2、14和15)中，於小鼠足趾外展評分中，隨著時間推移之肌肉弱化持續時間，其說明了嵌合體具有更長的持續作用時間。
以下表8提供了在小鼠DAS分析中，rBoNT/A1與嵌合體3B和3C之ED50和DAS 4劑量。該表還提供了直到肌肉弱化狀態完全恢復為DAS 0(未觀察到肌肉無力狀態)為止，DAS 4劑量的總作用持續時間。此外，該表還顯示了如上所述之該小鼠致死劑量與安全比率(-10%ΔBW/ED50 )。相較於rBoNT/A1，嵌合體3B和3C具有更長的作用時間、更佳的安全比率、以及更高的致死劑量。在圖10和表8中所顯示的研究，係在自Janvier實驗室所取得之小鼠中進行。
   ED50 (DAS 2)劑量 (pg/小鼠) DAS 4劑量 (pg/小鼠) 最低DAS 4劑量的總作用時間(天) 小鼠致死劑量 (pg) 安全比率 (-10%ΔBW/ED50 )
rBoNT/A1 0.9 2.3 29 18 4.5
嵌合體3B 8.0 89 42 200 14.1
嵌合體3C 5.0 26 42 8.9 7.4
表8：BoNT/AB嵌合體之DAS和安全比率。實施例 6 經修飾 BoNT/A(SEQ ID NO ： 4) 之臨床前測試
對經修飾BoNT/A「Cat-A」(SEQ ID NO：4)進行額外的臨床前測試。材料與方法 [大鼠足趾外展評分(DAS)分析]
為了評估經修飾BoNT/A(SEQ ID NO：4)對於活體內肌肉活性的作用，採用大鼠DAS分析來進行劑量-反應研究。大鼠DAS分析係以足趾伸展反射為基礎，這是一種動物被短暫抓住時的特徵性驚嚇反應。在將單一神經毒素注射至左腓骨肌群後，肌肉弱化狀態會導致足趾外展減少。以五分制對不同程度的足趾外展現象進行評分：0=正常至4=最大幅度減少足趾外展和後腿伸展現象(Broide RS, Rubino J, Nicholson GS, et al. The rat Digit Abduction Score (DAS) assay: A physiological model for assessing botulinum neurotoxin-induced skeletal muscle paralysis. Toxicon 2013;71:18-24)。在注射毒素後最初的連續五天測定DAS值，在此之後以兩至三天的時間間隔進行測定，直到較低劑量經修飾BoNT/A(SEQ ID NO：4)，對於足趾伸展反射的效果完全消失，以及直到會導致DAS 4的劑量恢復到DAS 2 為止。暫時BoNT誘發劑量相依性體重增加，係被視為全身性毒素效應的證據(Torii Y, Goto Y, Nakahira S, et al. Comparison of Systemic Toxicity between Botulinum Toxin Subtypes A1 and A2 in Mice and Rats. Basic Clin. Pharmacol. Toxicol. 2015;116:524-528)。因此，在每個評估時間點均對大鼠進行稱重，並記錄副作用。在注射之前和研究結束之前，將BoNT的劑量溶液標記(標示成隨機字母)。效價係被確定為誘發50%效應所需的劑量(ED50 ：導致DAS值為2的劑量)。為了確定ED50 和95%的信賴區間(CIs)，介於2.5至750 pg/kg之間的劑量係被進行測試。更高劑量的1、1.5、2、2.4、3、4和5ng/kg也被進行施用，以評估可能的副作用。
為了評估經修飾BoNT/A(SEQ ID NO：4)的作用持續時間，並將其與未經修飾BoNT/A (SEQ ID NO：2)的作用持續時間進行比較，在兩項獨立直接比較研究中，兩種毒素的最高耐受劑量(相較於未經處理大鼠，對於體重演變沒有產生影響)，回復至DAS 2讀數所需之中位數時間係被進行評估。 [大鼠單一劑量研究]
大鼠接受劑量為0、0.1、1和3 ng/kg之經修飾BoNT/A(SEQ ID NO：4)的單次肌肉內(i.m.)注射，並施用至右腓腸肌群。對照組動物在右腓腸肌中接受SEQ ID NO：4稀釋劑。在處理後7天(每組十隻雄性和十隻雌性)，或是在13或26週的觀察期之後(每劑量五隻雄性和五隻雌性)，將動物安樂死。在第-1天、第8天以及第13和27週，進行Irwin測試觀察以評估中樞神經系統功能。其他進行評估的臨床(異常)徵兆，包括跛行、小毒素注入肌肉尺寸、以及軟腹脹(soft distended abdomen)。 [猿猴研究]
猿猴接受劑量為0、0.1、0.25和0.75 ng/kg之經修飾BoNT/A(SEQ ID NO：4)的單次肌肉內(i.m.)注射，並施用至右腓腸肌群。在處理後7天(每組三隻雄性和三隻雌性)，或是在13或26週的觀察期之後(每劑量兩隻雄性和兩隻雌性)，將動物安樂死。在第8天和第15天通過外部遙測預測來進行心血管檢查，包括血液動力學、心電圖與呼吸參數。 [妊娠大鼠的初步增強胚胎發育試驗(EFD)]
該研究之目的是要提供經修飾BoNT/A(SEQ ID NO：4)，在器官發生期間通過肌肉內給藥途徑時，對於大鼠胚胎與胎兒發育之影響的初步資訊。經修飾BoNT/A(SEQ ID NO：4)係每天以0.02、0.05和0.1 ng/kg/day的劑量，通過肌肉內注射(腓腸肌)施用至9隻受孕雌性Sprague-Dawley大鼠組，涵蓋從懷孕第6天(G6)至第17天(G17)。在整個研究過程中監測臨床狀況、體重與食物消耗。在G21對雌性動物進行剖腹產檢查並記錄產仔參數。在進行屍檢時，對雌性動物進行肉眼檢視、稱量子宮重量，並且對於那些呈現出經注射腓腸肌萎縮的個體，稱量該肌肉和對側肌肉。所有的胎兒都進行稱重。然後檢查胎兒的外部與內臟異常，並進行性別檢查。通過連續切片將大約一半的胎兒的頭部固定以進行內部檢查。對所有胎兒之去內臟屠體係進行處理，以進行骨骼檢查。 [妊娠兔的初步增強胚胎發育試驗(EFD)]
該研究之目的是要提供經修飾BoNT/A(SEQ ID NO：4)，在器官發生期間通過肌肉內給藥途徑時，對於兔子胚胎與胎兒發育之影響的初步資訊。經修飾BoNT/A(SEQ ID NO：4)係每天以0.002、0.005和0.01ng/kg/day的劑量，通過肌肉內注射(腓腸肌)施用至9隻受孕雌性紐西蘭白兔組，涵蓋從懷孕第6天(G6)至第19天(G19)。在整個研究過程中監測臨床狀況、體重與食物消耗。在G29對雌性動物進行剖腹產檢查並記錄產仔參數。在進行屍檢時，對雌性動物進行肉眼檢視、稱量子宮重量，並且對於那些呈現出經注射腓腸肌萎縮的個體，稱量該肌肉和對側肌肉。所有的胎兒都進行稱重。然後檢查胎兒的外部與內臟異常，並進行性別檢查。通過連續切片將大約一半的胎兒的頭部固定以進行內部檢查。結果
通過進行如上所述之研究，可以對於施用經修飾BoNT/A，獲得許多種不同的以下藥理數據(載明於以下表9中)。
動物 研究類型 結果
小鼠 LD50 IP 0.422 ng/kg
大鼠 DAS ED50 0.013 ng/kg DAS4 0.125 pg/kg
CMAP單一劑量遠距離傳播 0.002 ng/kg:無傳播 0.3 ng/kg: -25% 0.8 ng/kg: -56%
單一劑量 估計的NOAEL 1.5 ng/kg 估計的致死劑量 3 ng/kg
表9：臨床前結果。
此外，該經修飾BoNT/A(SEQ ID NO：4)係在大鼠DAS測定中進行測試，以確定相較於Dysport®之作用持續時間。結果係被表列於以下表10：
   Dysport® 3 U/大鼠 15 U/kg 經修飾 BoNT/A 150 pg/大鼠 0.750 ng/kg
作用持續時間(中位數) 21.9 46.4
表10：作用持續時間。實施例 7 計算用於處理臉部紋路之經修飾 BoNT/A(SEQ ID NO ： 4) 的單位劑量
有鑑於在上述實施例6中所獲得之臨床前藥理學數據，用於施用經修飾BoNT/A之適當單位劑量範圍(UD)，已經被計算出來。該研究顯示，相較於未經修飾BoNT/A，經修飾BoNT/A可以提供更長的作用持續時間，同時具有更高的安全性。此一更佳的安全性可以藉由在此所描述的經修飾BoNT/A之較高安全比率來表示。
由於經修飾BoNT/A與Dysport®具有相同的作用機制(雖然其因為其之修飾特性而具有較高的治療指數(即較高的安全比率))，在相同肌肉群中用於處理受試者面部紋路的情況下，經修飾BoNT/A係被定位為相較於Dysport®的標記劑量之最低劑量： ●     在大鼠足趾外展評分模型中，用於臨床用途之批次所產生之經修飾BoNT/A的ED50 為13 pg/kg，比起在相同動物物種中所估計之未觀察到不良影響值(NOAEL)1500 pg/kg，低100倍以上。在應用了對應的異速生長因子後，此一ED50 可以轉化為130 pg的人體等效劑量(HED)。根據DAS大鼠的結果，可以將100 pg之經修飾BoNT/AB估計違大約4 U的Azzalure/Dysport市售劑量。如果使用相同方法來計算Azzalure/Dysport所建立之DAS大鼠ED50 的起始劑量(即0.5 U/kg 之ED50 )，則相當於5 U之總起始劑量，其係為用於暫時改善中度至重度GL之登記劑量50 U的1/10。 ●     腹膜內注射小鼠LD50 係被建立為0.422 ng/kg(8.44pg/動物)。在這些條件下，0.84ng經修飾BoNT/A的劑量係對應於100U的Dysport®之劑量。
因此，計算所得的最低起始總劑量係為100 pg。為了提供一些內容依據並運用上述之腹膜內注射小鼠LD50 數據，100pg經修飾BoNT/A係相當於大約12 U的Dysport®，且在用於以肌肉內注射來處理面部紋路時，將會是具有活性的。
因此，計算所得的單位劑量上限係為300 pg(0.3 ng)，向受試者施用的總劑量為4800 pg，而這仍然低於將大鼠NOAEL所轉換得到之人類劑量。
因此，用於使用經修飾BoNT/A處理面部紋路之適當單位劑量，已經被計算出為20-300pg。基於所獲得的臨床前數據，依據小鼠腹膜內致死劑量測定法來測定，在小鼠中計算所得的半數致死腹膜內劑量(LD50 )，其係為2-35單位之經修改BoNT/A。
有利的是，在處理面部紋路中，於達到最大劑量之前，可以將更多的經修飾BoNT/A注射到肌肉中。這是一項重要且有利的發現，可以使得上面部紋路的處理獲得改善，同時為臨床醫生提供更大的處理範圍選擇。實施例 8 處理眉間皺紋的劑量方案
經修飾BoNT/A係以每一2 mL透明玻璃小瓶含有15 ng之經修飾BoNT/A的凍乾粉末提供。該凍乾粉末係以不含防腐劑的0.9%v/w無菌氯化鈉溶液，以及稀釋劑(僅含有經修飾BoNT/A之賦形劑的調配緩衝液)之混合物來還原。在還原之後，將該溶液依照需求進一步稀釋。 依據圖11所示的注射方案，來處理中度至重度的眉間皺紋。 單位劑量為20-300 pg(2-35單位)。 在多達五個位置依據該單位劑量來施用肌肉內注射。所施用之最大總劑量為1500 pg (177單位)。實施例 9 用於處理眉間皺紋和抬頭紋的劑量方案
經修飾BoNT/A係以每一2 mL透明玻璃小瓶含有15 ng之經修飾BoNT/A的凍乾粉末提供。該凍乾粉末係以不含防腐劑的0.9%v/w無菌氯化鈉溶液，以及稀釋劑(僅含有經修飾BoNT/A之賦形劑的調配緩衝液)之混合物來還原。在還原之後，將該溶液依照需求進一步稀釋。 依據圖12所示的注射方案，來處理中度至重度的眉間和抬頭紋。 單位劑量為20-300 pg(2-35單位)。 在多達十個位置依據該單位劑量來施用肌肉內注射。所施用之最大總劑量為3000 pg (355單位)。實施例 10 處理外眥紋路的劑量方案
經修飾BoNT/A係以每一2 mL透明玻璃小瓶含有15 ng之經修飾BoNT/A的凍乾粉末提供。該凍乾粉末係以不含防腐劑的0.9%v/w無菌氯化鈉溶液，以及稀釋劑(僅含有經修飾BoNT/A之賦形劑的調配緩衝液)之混合物來還原。在還原之後，將該溶液依照需求進一步稀釋。 依據圖13所示的注射方案，來處理中度至重度外眥紋路。 單位劑量為20-300 pg(2-35單位)。 在多達六個位置依據該單位劑量來施用肌肉內注射。所施用之最大總劑量為1800 pg (213單位)。實施例 11 用於處理眉間、前額與外眥紋路的劑量方案
經修飾BoNT/A係以每一2 mL透明玻璃小瓶含有15 ng之經修飾BoNT/A的凍乾粉末提供。該凍乾粉末係以不含防腐劑的0.9%v/w無菌氯化鈉溶液，以及稀釋劑(僅含有經修飾BoNT/A之賦形劑的調配緩衝液)之混合物來還原。在還原之後，將該溶液依照需求進一步稀釋。 依據圖14所示的注射方案，來處理中度至重度的眉間、前額與外眥紋路。 單位劑量為20-300 pg(2-35單位)。 在多達十六個位置依據該單位劑量來施用肌肉內注射。所施用之最大總劑量為4800 pg (569單位)。實施例 12 經修飾 BoNT/A(SEQ ID NO ： 14) 的進一步示性
在小鼠LD50 分析中BoNT/AB嵌合體SEQ ID NO：14係進行測試，結果得到為1.202 ng/kg。因此，在此一測定中，1單位的SEQ ID NO：14係對應於24.04 pg。
此外，該BoNT/AB嵌合體係在大鼠DAS分析中進行測試，以確定相較於Dysport®之作用持續時間(如實施例6)。結果呈現於以下表13中：
   Dysport® 3 U/大鼠 15 U/kg BoNT/AB 300 pg/大鼠 1.5 ng/kg
作用持續時間(中位天數) 21.9 47.7
表13.作用持續時間。
總結來說，BoNT/AB的作用持續時間係比Dysport®還要高得多，並且係類似於SEQ ID NO：4。因此，可以預期的是，SEQ ID NO：4之單位劑量與給藥方案，可以應用於BoNT/AB以提供面部紋路改良處理方案。實施例 13 計算用於為上面部紋路之經修飾 BoNT/A (SEQ ID NO ： 14) 的單位劑量
有鑑於臨床前藥理學數據，用於在人體中施用經修飾BoNT/A之適當單位劑量範圍(UD)已經被計算出來。
經計算SEQ ID NO：14的DAS ED50 係為13pg/kg。ED50 係被認為是一種最小的藥理學活性劑量，其大約比4 ng/kg之未觀察到不良作用含量(NOAEL)低300倍。在大鼠中，SEQ ID NO：14的ED50 係為13 pg/kg，相當於在60kg體重之人類中0.8 ng的劑量。
因此，單位劑量的下限係選定為20 pg。單位劑量的上限係選定為1500 pg，其係低於從兩種非臨床安全性試驗物種(大鼠和猴子)，轉換為60 kg體重的人劑量的4 ng/kg的NOAEL。
有鑑於更高的安全性，處理上面部紋路之最大總劑量值係被設定為24,000 pg，這是從兩種非臨床安全性試驗物種(大鼠和猴子)之4 ng/kg的NOAEL值所推衍得到的，並將其轉換為體重60公斤的人類之劑量。實施例 14 使用經修飾 BoNT/A(SEQ ID NO ： 14) 來處理眉間皺紋的劑量方案
經修飾BoNT/A係以每一小瓶含有36 ng之經修飾BoNT/A的凍乾粉末提供。該凍乾粉末係被復原。 依據圖11所示的注射方案來處理中度至重度的眉間皺紋。 單位劑量為20-1500 pg(0.8-62單位)。 在多達五個位置依據該單位劑量來施用肌肉內注射。所施用之最大總劑量為7500 pg(312單位)。實施例 15 使用經修飾 BoNT/A(SEQ ID NO ： 14) 來處理眉間皺紋和抬頭紋的劑量方案
經修飾BoNT/A係以每一小瓶含有36 ng之經修飾BoNT/A的凍乾粉末提供。該凍乾粉末係被復原。 依據圖12所示的注射方案來處理中度至重度的眉間皺紋和抬頭紋。 單位劑量是20-1500pg(0.8-62單位)。 肌肉內注射一在施用重新最多十個位置，根據單位劑量。施用的最大總劑量為15,000 pg(624單位)。實施例 16 使用經修飾 BoNT/A(SEQ ID NO ： 14) 來處理外眥紋路的劑量方案
經修飾BoNT/A係以每一小瓶含有36 ng之經修飾BoNT/A的凍乾粉末提供。該凍乾粉末係被復原。 依據圖13所示的注射方案來處理中度至重度的外眥紋路。 單位劑量為20-1500 pg(0.8-62單位)。 在多達六個位置依據該單位劑量來施用肌肉內注射。所施用之最大總劑量為9000 pg(374單位)。實施例 17 使用經修飾 BoNT/A(SEQ ID NO ： 14) 來處理眉間皺紋、抬頭紋和外眥紋路的劑量方案
經修飾BoNT/A係以每一小瓶含有36 ng之經修飾BoNT/A的凍乾粉末提供。該凍乾粉末係被復原。 依據圖14所示的注射方案來處理中度至重度的眉間皺紋、抬頭紋和外眥紋路。 單位劑量為20-1500 pg(0.8-62單位)。 在多達十六個位置依據該單位劑量來施用肌肉內注射。所施用之最大總劑量為24,0000 pg(998單位)。
在上述說明書內容中所提及的所有文獻，均在此被併入以供參考。在不背離本發明的範圍與精神的前提下，本發明所描述之方法與系統的各種修改與變化，對於本技術領域習於此藝者來說將是顯而易見的。儘管本發明已經結合特定的較佳實施例來進行描述，但是應當理解的是，本發明所請求保護之範圍不應該被不適當地侷限於該等特定實施例。實際上，對於生物化學與生物技術或相關技術領域的習於此藝者來說，用於實施本發明的方式的各種顯而易見的修改方式，皆屬落入隨附申請請專利範圍的範疇內。
無。
本發明的具體實施例現在將以例示的方式，參考隨附圖式與具體實施例來進行說明。 圖1顯示經美國FDA批准之用於處理成人的臉部紋路的Dysport劑量®。 圖2顯示以陽離子構築之等電點聚焦(IEF)凝膠。 圖3顯示在大鼠胚胎脊索神經元(eSCN)中，Cat5v2(K1064H/N954K)(A)、Cat5v2(K1064H/N886K)(B)、與Cat5v2(K1064H/N1025K)(C)之SNAP-25的切割百分比，以及pEC50相對於nBoNT/A1的概要。(A、B、C)將大鼠胚胎脊髓神經元培養三週，然後在以SNAP-25專一性抗體進行西方墨點法之前，用Cat5v4處理24小時。該些數據是來自三個獨立實驗之平均值±SEM，一式三份。(D)在大鼠eSCN中之SNAP-25切割能力測分析中，Cat5v2(K1064H/N886K)、Cat5v2(K1064H/N954K)、與Cat5v2(K1064H/N1025K)相較於nBoNT/A1(List Biological Laboratories)之相對效能。每個點均係對應於個別批次，並且係進行3次以8點濃度反應曲線(CRC)為基礎之獨立pEC50 測定的平均值。在該CRC中之每一濃度均採三份來進行評估。效能比較係以所列批次之平均值來進行比較，混合資料n=24。資料數據係為每一Cat5v4於n=3批次之平均值±SEM。 圖4顯示在小鼠膈神經半邊橫膈測定法(mPNHD)中，nBoNT/A1與Cat5v4的效價(t50 )。如其所示，將小鼠膈神經半邊橫膈組織係與Cat5v4或天然BoNT/A1培養。記錄橫膈膜片之收縮力，直到不再可以檢測到收縮現象，或在140分鐘之後。每個點均對應於獨立的確認結果。t50 值係為抑制小鼠半邊橫膈收縮力50%所需的時間。 圖5顯示經純化的重組BoNT/AB嵌合體1、2與3A(分別為SEQ ID NO：11、12與13)之SDS-PAGE電泳圖。該等通道係被分別標示為「標記」(分子量標記)、「-DTT」(經氧化的BoNT/AB嵌合體樣品)、以及「+DTT」(經還原的BoNT/AB嵌合體樣品)。 圖6顯示通過重組的BoNT/AB嵌合體1、2與3A(分別為SEQ ID NO：11、12與13)在大鼠脊髓神經元中SNAP-25的切割。將培養的大鼠原代脊髓神經元(SCN)在37℃的10%CO2 濕潤的空氣中，暴露於各種濃度的重組BoNT/AB嵌合體1、2或3A中24小時。然後用補充有DTT和Benzonase的1x NuPAGE緩衝液裂解細胞。將樣品轉移至微量離心管中，在加熱板上於90°C加熱5分鐘，並於-20°C保存，然後藉由西方墨點法(Western blot)分析SNAP-25的裂解。使用多株抗體檢測SNAP-25，該抗體可檢測SNAP-25的全長和裂解形式(Sigma#S9684)。抗兔HRP(Sigma#A6154)被用作二級抗體。 圖7顯示小鼠足趾外展評分測定的結果。在短暫的全身麻醉下，對小鼠一隻後肢的腓腸肌/比目魚肌群進行注射；運用足趾外展評分(DAS)而以0-4來評量肌肉無力狀態。針對每個劑量確認DAS之最大值，相對於劑量進行作圖，並將數據整合為4參數邏輯推理方程式，確定ED50以及會導致DAS 4的劑量(DAS 4劑量)。 圖8顯示經純化的重組BoNT/AB嵌合體3B與3C(分別為SEQ ID NO：14與15)之SDS-PAGE電泳圖。該等通道係被分別標示為「標記」(分子量標記)、「-DTT」(經氧化的BoNT/AB嵌合體樣品)、以及「+DTT」(經還原的BoNT/AB嵌合體樣品)。 圖9顯示在人類誘導富潛能幹細胞所衍生的外周神經元(PERI.4U-Axiogenesis，德國)中，以未經修飾的BoNT/A與BoNT/AB嵌合體3B和3C(分別為SEQ ID NO：2、14與15)來切割SNAP-25。PERI.4U細胞係在含有5%CO2 之濕潤CO2 環境中，於37°C下暴露於各種濃度的重組BoNT/A或是BoNT/AB嵌合體3B或3C中24小時。然後以補充有DTT與benzonase)之1x NuPAGE緩衝液來裂解細胞。在以西方墨點法來分析SNAP-25裂解結果之前，將該樣品轉移到微量離心管中，在加熱板上於90°C下加熱5分鐘，並保存在-20°C下。使用多株抗體來檢測SNAP-25，該抗體可以檢測全長和裂解形式SNAP-25(Sigma#S9684)。抗兔子HRP(Sigma#A6154)抗體，係被用來作為二級抗體。 圖10顯示在小鼠足趾外展評分測定中，在隨著時間的推移下肌肉弱化之持續時間。在短暫的全身麻醉下，對小鼠一隻後肢的腓腸肌/比目魚肌群進行注射；運用足趾外展評分(DAS)而以0-4來評量肌肉弱化狀態。注射最低劑量的該組動物在前四天中，所誘導的DAS為4，持續監測直到肌肉弱化狀態完全恢復到DAS為0(沒有觀察到的肌肉弱化狀態)為止。 圖11顯示在處理眉間皺紋時，肌肉內施用經修飾BoNT/A的注射部位。 圖12顯示在處理眉間皺紋和抬頭紋時，肌內施用經修飾BoNT/A的注射部位。 圖13顯示在僅處理外眥紋路時，肌肉內施用經修飾BoNT/A的注射部位。 圖14顯示在處理眉間皺紋、抬頭紋與外眥紋路時，用於肌內施用經修飾BoNT/A的注射部位。
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無。

Claims (29)

  1. 一種用於處理面部紋路的經修飾BoNT/A，其中該經修飾BoNT/A係通過肌肉內注射而施用在受試者臉部的多個位置， 其中，該經修飾BoNT/A係藉由在每一位置施用單位劑量為1單位到41單位的經修飾BoNT/A之方式來進行給藥，且其中1單位係為對應於計算所得之小鼠半數致死劑量(LD50 )的經修飾BoNT/A劑量， 其中該等多個位置係選自於： 至多兩個之皺眉肌位置以及一個降眉間肌位置，以用於處理眉間皺紋， 至多五個之額肌位置，以用於處理抬頭紋；以及 至多三個之在眼輪匝肌外圍的位置，以用於處理外眥紋路， 其中，在處理期間所施用之該經修飾BoNT/A的總劑量為至多574單位，並且 其中該經修飾BoNT/A包含在選自於以下之一或多個胺基酸殘基上的修飾：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS 1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274與THR 1277，其中該修飾係選自於： i.以一鹼性胺基酸殘基來取代一酸性表面暴露胺基酸殘基； ii.以一不帶電荷的胺基酸殘基來取代一酸性表面暴露胺基酸殘基； iii.以一鹼性胺基酸殘基來取代一不帶電荷表面暴露胺基酸殘基； iv.插入一鹼性胺基酸殘基；以及 v.刪除一酸性表面暴露胺基酸殘基。
  2. 一種用於處理面部紋路的經修飾BoNT/A，其中該經修飾BoNT/A係通過肌肉內注射而施用在受試者臉部的多個位置， 其中，該經修飾BoNT/A係藉由在每一位置施用單位劑量為8.4 pg至344.4 pg經修飾BoNT/A之方式來進行給藥， 其中該等多個位置係選自於： 至多兩個之皺眉肌位置以及一個降眉間肌位置，以用於處理眉間皺紋， 至多五個之額肌位置，以用於處理抬頭紋；以及 至多三個之在眼輪匝肌外圍的位置，以用於處理外眥紋路， 其中，在處理期間該經修飾BoNT/A所施用的該總劑量係多達4821.6 pg，並且 其中該經修飾BoNT/A包含在選自於以下之一或多個胺基酸殘基上的修飾：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS 1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274與THR 1277，其中該修飾係選自於： i.以一鹼性胺基酸殘基來取代一酸性表面暴露胺基酸殘基； ii.以一不帶電荷的胺基酸殘基來取代一酸性表面暴露胺基酸殘基； iii.以一鹼性胺基酸殘基來取代一不帶電荷表面暴露胺基酸殘基； iv.插入一鹼性胺基酸殘基；以及 v.刪除一酸性表面暴露胺基酸殘基。
  3. 如請求項1之經修飾BoNT/A，其中5-10pg(較佳為8.4 pg)的經修飾BoNT/A，係對應於計算所得的小鼠半數致死劑量(LD50 )。
  4. 如前述請求項中任一項之經修飾BoNT/A，其中該經修飾BoNT/A的該單位劑量係選自於：2單位至35單位、6至35個單位、12單位至35單位、12單位至24單位，最佳為12至18單位。
  5. 如請求項4之經修飾BoNT/A，其中在處理期間所施用之該經修飾BoNT/A的該總劑量係選自於：574單位、560單位、384單位，最佳為288單位； 較佳地，其中該總劑量係以在16個注射位置上施用16單位劑量為基礎。
  6. 如前述請求項中任一項之經修飾BoNT/A，其中該經修飾BoNT/A的單位劑量係選自於：18 pg至350 pg、20 pg至300 pg，最佳為100 pg至150 pg。
  7. 如前述請求項中任一項之經修飾BoNT/A，其中在處理期間所施用之該經修飾BoNT/A的該總劑量係選自於至多：4850pg、4800pg，最佳為2400pg。
  8. 一種用於處理面部紋路的經修飾BoNT/A，其中該經修飾BoNT/A係通過肌肉內注射而施用在受試者臉部的多個位置， 其中該經修飾BoNT/A係以每一位置施用單位劑量為0.5單位至73單位的經修飾BoNT/A之方式來進行給藥，且其中1單位係為對應於計算所得之小鼠半數致死劑量(LD50 )的經修飾BoNT/A劑量， 其中該等多個位置係選自於： 至多兩個之皺眉肌位置以及一個降眉間肌位置，以用於處理眉間皺紋， 至多五個之額肌位置，以用於處理抬頭紋；以及 至多三個之在眼輪匝肌外圍的位置，以用於處理外眥紋路， 其中，在處理期間所施用之該經修飾BoNT/A的該總劑量係為至多1019單位，並且 其中，該經修飾BoNT/A包含一BoNT/A輕鏈與轉位結構域，以及一BoNT/B受體結合結構域(HC 結構域)。
  9. 一種用於處理面部紋路的經修飾BoNT/A，其中該經修飾BoNT/A係通過肌肉內注射而施用在受試者臉部的多個位置， 其中，該經修飾BoNT/A係藉由在每一位置施用單位劑量為12 pg至1754 pg經修飾BoNT/A之方式來進行給藥， 其中該等多個位置係選自於： 至多兩個之皺眉肌位置以及一個降眉間肌位置，以用於處理眉間皺紋， 至多五個之額肌位置，以用於處理抬頭紋；以及 至多三個之在眼輪匝肌外圍的位置，以用於處理外眥紋路， 其中，在處理期間所施用之該經修飾BoNT/A的該總劑量係為至多24500 pg，並且 其中，該經修飾BoNT/A包含一BoNT/A輕鏈與轉位結構域，以及一BoNT/B受體結合結構域(HC 結構域)。
  10. 如請求項8之該經修飾BoNT/A，其中該經修飾BoNT/A包含一BoNT/A輕鏈與轉位結構域，以及一BoNT/B HC 結構域，且其中20-30 pg(較佳為24.04 pg)的經修飾BoNT/A，係對應於計算該計算所得的小鼠半數致死劑量(LD50 )。
  11. 如請求項8至10中任一項之經修飾BoNT/A，其中該經修飾BoNT/A的單位劑量係選自於：0.5單位到62單位、3單位到62單位、10至62單位、10單元到42單元，最佳為10單元到21單元。
  12. 如請求項11之經修飾BoNT/A，其中在處理期間所施用之該經修飾BoNT/A的該總劑量係選自於：1019單位、998單位、666單位，最佳為333單位； 較佳地，其中該總劑量係以在16個注射位置上施用16單位劑量為基礎。
  13. 如請求項8至12中任一項之經修飾BoNT/A，其中該經修飾BoNT/A的該單位劑量係選自於：12 pg至1750 pg、20 pg至1500 pg，最佳為250 pg到500 pg。
  14. 如請求項8至13中任一項之經修飾BoNT/A，其中處理期間所施用之該經修飾BoNT/A的該總劑量係選自於：24500 pg、24000 pg，最佳為8000 pg。
  15. 如前述請求項中任一項之經修飾BoNT/A，其中 該經修飾BoNT/A係具有大於7的安全比率，其中該安全比率的計算公式為：以pg/小鼠為單位測得之-10%體重變化所需的毒素劑量，除以以pg/小鼠測得的DAS ED50 ，其中ED50 =產生DAS得分2所需之劑量。
  16. 如前述請求項中任一項之經修飾BoNT/A，其中該經修飾BoNT/A係用於處理眉間皺紋，較佳地其中該經修飾BoNT/A係施用於兩個皺眉肌位置以及一個降眉間肌位置，以用於處理眉間皺紋，更佳地其中該經修飾BoNT/A係施用於總共五個位置處。
  17. 如請求項1至15中任一項之經修飾BoNT/A，其中該經修飾BoNT/A係用於處理抬頭紋，較佳地，其中該經修飾BoNT/A係施用在五個額肌位置。
  18. 如請求項1至15中任一項之經修飾BoNT/A，其中該經修飾BoNT/A係用於處理外眥紋路，較佳地其中該經修飾BoNT/A係施用於三個在眼輪匝肌外圍的位置，以用於處理外眥紋路，更佳地其中該經修飾BoNT/A係施用於總共六個位置處。
  19. 如請求項16至18中任一項之經修飾BoNT/A，其中該經修飾BoNT/A係被施用至8、10、12、14或16個位置。
  20. 如請求項16至18中任一項之經修飾BoNT/A，其中該經修飾BoNT/A係被施用至7、9、11、13或15個位置。
  21. 如請求項1至7或15至20中任一項之經修飾BoNT/A，其中該修飾包含(較佳地由係其等所組成)在選自於以下之一或多個胺基酸殘基上之修飾：ASN 886、ASN 930 、ASN 954、SER 955、GLN 991、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1052、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274或THR 1277，且其中該經修飾BoNT/A係由與選自於SEQ ID NO：3、5、7和9的核酸序列具有至少70%序列一致性的核酸序列所編碼，及/或包含與選自於SEQ ID NO：4、6、8和10的多胜肽序列具有至少70%序列一致性的多胜肽序列。
  22. 如請求項1至7或15至21中任一項之經修飾BoNT/A，其中該修飾包含(較佳地由係其等所組成)在選自於以下之一或多個胺基酸殘基上之修飾：ASN 886、ASN 930、SER 955、GLN 991、ASN 1026、ASN 1052和GLN 1229，且其中該經修飾BoNT/A係由與SEQ ID NO：3的核酸序列具有至少70%序列一致性的核酸序列所編碼，及/或包含與SEQ ID NO：4的多胜肽序列具有至少70%序列一致性的多胜肽序列。
  23. 如請求項1至7或15至22中任一項之經修飾BoNT/A，其中該修飾係為取代，較佳為以離胺酸或精胺酸進行的取代。
  24. 如請求項8至20中任一項之經修飾BoNT/A，其中該經修飾BoNT/A包含與SEQ ID NO：14具有至少70%序列一致性的多胜肽序列。
  25. 一種經修飾的肉毒桿菌神經毒素A(BoNT/A)的單位劑型，該單位劑型包括： a.   1單位至41單位之經修飾BoNT/A，其中1單位係為對應於計算所得之小鼠半數致死劑量(LD50 )的該經修飾BoNT/A之劑量；或者 b.   8.4 pg至350 pg之經修飾BoNT/A；以及 c.   可選擇包括之藥學上可接受之載體、賦形劑、佐劑及/或鹽類， d.   其中該經修飾BoNT/A包含在選自於以下之一或多個胺基酸殘基上的修飾：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS 1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274與THR 1277，其中該修飾係選自於： i.以一鹼性胺基酸殘基來取代一酸性表面暴露胺基酸殘基； ii.以一不帶電荷的胺基酸殘基來取代一酸性表面暴露胺基酸殘基； iii.以一鹼性胺基酸殘基來取代一不帶電荷表面暴露胺基酸殘基； iv.插入一鹼性胺基酸殘基；以及 v.刪除一酸性表面暴露胺基酸殘基。
  26. 如請求項25之單位劑型，其包括： a.   1單位至35單位的經修飾BoNT/A；或者 b.   10 pg至300 pg的經修飾BoNT/A。
  27. 一種經修飾的肉毒桿菌神經毒素A(BoNT/A)的單位劑型，該單位劑型包括： a.   0.5單位至73單位之經修飾BoNT/A，其中1單位係為對應於計算所得之小鼠半數致死劑量(LD50 )的該經修飾BoNT/A之劑量；或者 b.   12 pg至1754  pg之經修飾BoNT/A；以及 c.   可選擇包括之藥學上可接受之載體、賦形劑、佐劑及/或鹽類， d.   其中，該經修飾BoNT/A包含一BoNT/A輕鏈與轉位結構域，以及一BoNT/B受體結合結構域(HC 結構域)。
  28. 如請求項27之單位劑型，包括： a.   0.8單位至62單位的經修飾BoNT/A ；或者 b.   20 pg至1500 pg的經修飾BoNT/A。
  29. 一種套組，包括： a.   如請求項25至28中任一項之單位劑型；以及 b.   將其等用於面部紋路處理中之使用該說明書；以及 c.   可選擇包括之稀釋劑。
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