JP6162135B2 - 短縮された生物活性を示す神経毒 - Google Patents
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Description
本発明は、医薬分野に関する。詳細には、本発明は、被験体における生物学的効果の持続期間の減少を示す神経毒ポリペプチドであって、軽鎖中に少なくとも1個のE3リガーゼ認識モチーフを含み、前記E3リガーゼ認識モチーフがE3リガーゼMDM2のための結合モチーフであるのが好ましい前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを企図する。本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドならびに1個以上のアミノ酸置換を含むポリペプチドに関する。前記ポリヌクレオチドを含むベクターおよび宿主細胞、それによりコードされるポリペプチドおよび該ポリペプチドに特異的に結合する抗体も本発明によりさらに包含される。さらに、本発明は、前記ポリヌクレオチドおよびポリペプチドを含む医薬、ならびにその特定の治療適用に関する。さらに、本発明は、前記ポリペプチドおよび医薬の製造のための方法を企図する。
クロストリジウム・ボツリナム(Clostridium botulinum)およびクロストリジウム・テタニ(Clostridium tetani)は、それぞれ、非常に強力な神経毒、すなわち、ボツリヌス毒素(BoNT)および破傷風毒素(TeNT)を産生する。これらのクロストリジウム神経毒(CNT)は神経細胞に特異的に結合し、神経伝達因子放出を破壊する。それぞれの毒素は、不活性なプロセッシングされていない約150kDaの一本鎖タンパク質として合成される。翻訳後プロセッシングは、ジスルフィド架橋の形成、および細菌プロテアーゼによる限定的タンパク質分解(ニッキング)を含む。活性な神経毒は、2本の鎖、ジスルフィド結合により連結された約50kDaのN末端軽鎖および約100kDaの重鎖からなる。CNTは3つのドメイン、すなわち、触媒的軽鎖、転移ドメインを包含する重鎖(N末端の半分)および受容体結合ドメイン(C末端の半分)からなる。Krieglstein 1990, Eur. J. Biochem. 188, 39; Krieglstein 1991, Eur. J. Biochem. 202, 41; Krieglstein 1994, J. Protein Chem. 13, 49を参照されたい。ボツリヌス神経毒は、150kDaの神経毒タンパク質および関連する非毒性複合体化タンパク質を含む分子複合体として合成される。複合体サイズはクロストリジウム株および300kDa〜900kDaの範囲の様々な神経毒血清型に基づいて異なる。これらの複合体における複合体化タンパク質は神経毒を安定化し、分解に対してそれを保護する。Chen 1998, Infect. Immun. 66(6): 2420-2425を参照されたい。
クロストリジウム・ボツリナムは、A〜Gと命名された7つの抗原的に異なる血清型のボツリヌス神経毒(BoNT)を分泌する。全ての血清型はクロストリジウム・テタニにより分泌される関連する破傷風神経毒(TeNT)と一緒になって、SNAREタンパク質を切断することによりシナプス開口放出を遮断するZn2+エンドプロテアーゼである。Couesnon, 2006, Microbiology, 152, 759。BoNTは、ボツリヌス中毒症において見られる弛緩性筋肉麻痺を引き起こす。Fischer 2007, PNAS 104, 10447を参照されたい。
その毒性効果にも拘らず、ボツリヌス毒素は多くの疾患または障害のための治療剤として用いられてきた。ボツリヌス毒素血清型Aは、斜視、眼瞼けいれん、および他の障害の処置のために1989年に米国でヒトにおける使用について認可された。それは、例えば、商標名BOTOX(Allergan Inc.)の下で、または商標名DYSPORT(Ipsen Ltd.)の下で、複合体化タンパク質を含むボツリヌスA神経毒として商業的に入手可能である。改良された、複合体を含まない神経毒Aポリペプチド調製物が、商標名XEOMIN(Merz Pharmaceuticals LLC)の下で入手可能である。ボツリヌス毒素の効果は一時的なものに過ぎないが、これが、治療効果を維持するためにボツリヌス毒素の反復投与が必要である理由である。
クロストリジウム神経毒は、随意筋強度を弱体化し、斜視、頸部ジストニアなどの限局性筋失調症、および良性特発性眼瞼けいれんのための有効な治療剤である。それらは片側顔面けいれん、および限局性けいれんを軽減し、さらに、胃腸障害、多汗症、および美容しわ取りなどの様々な他の適応症において有効であることがさらに示されている。Jost 2007, Drugs 67, 669を参照されたい。
しかしながら、筋肉強度および収縮の弱体化はまた、創傷治癒、骨折および腱断裂処置のための固定、特に、痔核切除術に関連する術後固定、歯科インプラントの導入、または股関節置換(内部プロテーゼ）、膝関節形成術、眼科手術、にきび、過敏性腸疾患、膣痙、腰痛、または良性前立腺肥大などの医学的状態または疾患にとっても望ましい。神経毒は通常、前記疾患または状態の効率的な処置にとって実際に必要とされるものよりも長い期間にわたってその生物学的効果を示す。しかしながら、長期的な筋肉麻痺は、前記医学的状態または疾患の療法において有害であるか、または少なくともあまり好ましいものではない。しかしながら、所望の期間にわたってのみその生物学的効果を示す神経毒は、まだ入手可能ではない。
従って、本発明に内在する技術的課題は、上記必要性に応じるための手段および方法の提供と見ることができる。この技術的課題は、特許請求の範囲および本明細書の以下の部分で特徴付けられる実施形態によって解決される。
従って、本発明は、被験体における生物学的効果の持続期間の減少を示す神経毒ポリペプチドであって、軽鎖中に少なくとも1個のE3リガーゼ認識モチーフを含み、前記E3リガーゼ認識モチーフがE3リガーゼMDM2のための結合モチーフであるのが好ましい前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。かくして改変されたポリペプチドの生物活性の持続期間の減少は、BoNT/E-MDM2について例示された。さらに、前記神経毒ポリペプチドを、軽鎖中の特定のアミノ酸残基の部位特異的突然変異誘発によってさらに最適化した。この目的のために、導入されるE3リガーゼMDM2認識モチーフに空間的に近いところに位置する神経毒軽鎖中の露出したアミノ酸残基を、三次元構造分析によって同定した。続いて、神経毒軽鎖中の同定された露出したアミノ酸残基を、リシン残基によって置換した。この最適化手法は、以下の実施例に示されるように、非突然変異BoNT/E-MDM2ポリペプチドと比較して、突然変異BoNT/E-MDM2ポリペプチドのさらにより速い分解をもたらした。
従って、本発明のそのような改変または突然変異された神経毒ポリペプチドは、神経毒の生物学的効果の持続期間の短縮または減少を必要とする疾患の療法にとって特に有用である。
以下、本発明の実施形態を示す。
（１）被験体における生物学的効果の持続期間の減少を示す神経毒ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、前記ポリペプチドが軽鎖中に少なくとも1個のE3リガーゼ認識モチーフを含み、前記E3リガーゼ認識モチーフがE3リガーゼMDM2のための結合モチーフである、前記ポリヌクレオチド。
（２）E3リガーゼMDM2のための前記結合モチーフが、ETFSDLWKLLPE (配列番号26)、TSFAEYWNLLSP (配列番号27)、LTFEHYWAQLTS (配列番号28)、LTFEHWWAQLTS (配列番号29)、LTFEHSWAQLTS (配列番号30)、ETFEHNWAQLTS (配列番号31)、LTFEHNWAQLTS (配列番号32)、LTFEHWWASLTS (配列番号33)、LTFEHWWSSLTS (配列番号34)、LTFTHWWAQLTS (配列番号35)、ETFEHWWAQLTS (配列番号36)、LTFEHWWSQLTS (配列番号37)、LTFEHWWAQLLS (配列番号38)、ETFEHWWSQLLS (配列番号39)、RFMDYWEGL (配列番号40)、MPRFMDYWEGLN (配列番号41)、SQETFSDLWKLLPEN (配列番号42)および/またはLTFEHNWAQLEN (配列番号78)からなる群より選択される、（１）に記載のポリヌクレオチド。
（３）前記生物学的効果が被験体における筋肉麻痺を引き起こす、（１）または（２）に記載のポリヌクレオチド。
（４）前記持続期間の減少が、被験体、好ましくはヒトにおいて、5、4、3、2週間未満または1週間未満持続する、（１）〜（３）のいずれか１に記載のポリヌクレオチド。
（５）ポリペプチドの軽鎖が、
a)配列番号1、3、5、7、9、81、11、13または15に示されるヌクレオチド配列を有する核酸配列；
b)配列番号2、4、6、8、10、82、12、14または16に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列；および
c)a)またはb)の核酸配列と少なくとも40%同一である核酸配列
からなる群より選択される核酸配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる軽鎖からの改変により得られる、（１）〜（４）のいずれか１に記載のポリヌクレオチド。
（６）前記ポリヌクレオチドが、
a)配列番号51または79に示されるヌクレオチド配列を有する核酸配列；
b)配列番号52または80に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列；および
c)a)またはb)の核酸配列と少なくとも40%同一である核酸配列
からなる群より選択される核酸配列を含む、（１）〜（５）のいずれか１に記載のポリヌクレオチド。
（７）（１）〜（６）のいずれか１に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
（８）（１）〜（６）のいずれか１に記載のポリヌクレオチドまたは（７）に記載のベクターを含む宿主細胞。
（９）前記細胞が大腸菌細胞またはクロストリジウムもしくはバチルス細胞である、（８）に記載の宿主細胞。
（１０）（１）〜（６）のいずれか１に記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド。
（１１）神経毒ポリペプチドの軽鎖中にリシンによる少なくとも1個のアミノ酸置換をさらに含む、（１０）に記載のポリペプチド。
（１２）Q53K、N72K、N378K、N379K、R394KおよびT400Kからなる群より選択される少なくとも1個のアミノ酸置換を含む、（１０）または（１１）に記載のポリペプチド。
（１３）（１０）〜（１２）のいずれか１に記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体。
（１４）医薬としての使用のための（１）〜（６）のいずれか１に記載のポリヌクレオチド。
（１５）医薬としての使用のための（１０）〜（１２）のいずれか１に記載のポリペプチド。
（１６）医薬が、創傷治癒、骨折および腱断裂処置のための固定、特に、痔核切除術に関連する術後固定、歯科インプラントの導入、または股関節置換(内部プロテーゼ）、上顆炎、膝関節形成術、眼科手術、にきび、過敏性腸疾患、膣痙、腰痛、または良性前立腺肥大の処置のためのものである、（１４）に記載のポリヌクレオチドまたは（１５）に記載のポリペプチド。
（１７）（１）〜（６）のいずれか１に記載のポリヌクレオチドによりコードされる神経毒ポリペプチドの製造のための方法であって、
a)（１）〜（６）のいずれか１に記載のポリヌクレオチドによりコードされる神経毒ポリペプチドの発現を可能にする条件下で、（８）または（９）に記載の宿主細胞を培養するステップと、
b)a)の宿主細胞から、（１）〜（６）のいずれか１に記載のポリヌクレオチドによりコードされる神経毒ポリペプチドを取得するステップと
を含む、前記方法。
（１８）（１７）に記載の方法のステップと、医薬として（１）〜（６）のいずれか１に記載のポリヌクレオチドによりコードされる神経毒ポリペプチドを製剤化するさらなるステップとを含む、医薬の製造のための方法。
以下、本発明の実施形態を示す。
（１）被験体における生物学的効果の持続期間の減少を示す神経毒ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、前記ポリペプチドが軽鎖中に少なくとも1個のE3リガーゼ認識モチーフを含み、前記E3リガーゼ認識モチーフがE3リガーゼMDM2のための結合モチーフである、前記ポリヌクレオチド。
（２）E3リガーゼMDM2のための前記結合モチーフが、ETFSDLWKLLPE (配列番号26)、TSFAEYWNLLSP (配列番号27)、LTFEHYWAQLTS (配列番号28)、LTFEHWWAQLTS (配列番号29)、LTFEHSWAQLTS (配列番号30)、ETFEHNWAQLTS (配列番号31)、LTFEHNWAQLTS (配列番号32)、LTFEHWWASLTS (配列番号33)、LTFEHWWSSLTS (配列番号34)、LTFTHWWAQLTS (配列番号35)、ETFEHWWAQLTS (配列番号36)、LTFEHWWSQLTS (配列番号37)、LTFEHWWAQLLS (配列番号38)、ETFEHWWSQLLS (配列番号39)、RFMDYWEGL (配列番号40)、MPRFMDYWEGLN (配列番号41)、SQETFSDLWKLLPEN (配列番号42)および/またはLTFEHNWAQLEN (配列番号78)からなる群より選択される、（１）に記載のポリヌクレオチド。
（３）前記生物学的効果が被験体における筋肉麻痺を引き起こす、（１）または（２）に記載のポリヌクレオチド。
（４）前記持続期間の減少が、被験体、好ましくはヒトにおいて、5、4、3、2週間未満または1週間未満持続する、（１）〜（３）のいずれか１に記載のポリヌクレオチド。
（５）ポリペプチドの軽鎖が、
a)配列番号1、3、5、7、9、81、11、13または15に示されるヌクレオチド配列を有する核酸配列；
b)配列番号2、4、6、8、10、82、12、14または16に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列；および
c)a)またはb)の核酸配列と少なくとも40%同一である核酸配列
からなる群より選択される核酸配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる軽鎖からの改変により得られる、（１）〜（４）のいずれか１に記載のポリヌクレオチド。
（６）前記ポリヌクレオチドが、
a)配列番号51または79に示されるヌクレオチド配列を有する核酸配列；
b)配列番号52または80に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列；および
c)a)またはb)の核酸配列と少なくとも40%同一である核酸配列
からなる群より選択される核酸配列を含む、（１）〜（５）のいずれか１に記載のポリヌクレオチド。
（７）（１）〜（６）のいずれか１に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
（８）（１）〜（６）のいずれか１に記載のポリヌクレオチドまたは（７）に記載のベクターを含む宿主細胞。
（９）前記細胞が大腸菌細胞またはクロストリジウムもしくはバチルス細胞である、（８）に記載の宿主細胞。
（１０）（１）〜（６）のいずれか１に記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド。
（１１）神経毒ポリペプチドの軽鎖中にリシンによる少なくとも1個のアミノ酸置換をさらに含む、（１０）に記載のポリペプチド。
（１２）Q53K、N72K、N378K、N379K、R394KおよびT400Kからなる群より選択される少なくとも1個のアミノ酸置換を含む、（１０）または（１１）に記載のポリペプチド。
（１３）（１０）〜（１２）のいずれか１に記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体。
（１４）医薬としての使用のための（１）〜（６）のいずれか１に記載のポリヌクレオチド。
（１５）医薬としての使用のための（１０）〜（１２）のいずれか１に記載のポリペプチド。
（１６）医薬が、創傷治癒、骨折および腱断裂処置のための固定、特に、痔核切除術に関連する術後固定、歯科インプラントの導入、または股関節置換(内部プロテーゼ）、上顆炎、膝関節形成術、眼科手術、にきび、過敏性腸疾患、膣痙、腰痛、または良性前立腺肥大の処置のためのものである、（１４）に記載のポリヌクレオチドまたは（１５）に記載のポリペプチド。
（１７）（１）〜（６）のいずれか１に記載のポリヌクレオチドによりコードされる神経毒ポリペプチドの製造のための方法であって、
a)（１）〜（６）のいずれか１に記載のポリヌクレオチドによりコードされる神経毒ポリペプチドの発現を可能にする条件下で、（８）または（９）に記載の宿主細胞を培養するステップと、
b)a)の宿主細胞から、（１）〜（６）のいずれか１に記載のポリヌクレオチドによりコードされる神経毒ポリペプチドを取得するステップと
を含む、前記方法。
（１８）（１７）に記載の方法のステップと、医薬として（１）〜（６）のいずれか１に記載のポリヌクレオチドによりコードされる神経毒ポリペプチドを製剤化するさらなるステップとを含む、医薬の製造のための方法。
本明細書で用いられる用語「ポリヌクレオチド」とは、一本鎖または二本鎖DNA分子ならびにRNA分子を指す。前記用語により包含されるのは、ゲノムDNA、cDNA、hnDNA、mRNAならびにそのような分子種の全ての天然に存在するか、または人工的に改変された誘導体である。ポリヌクレオチドは、一態様においては、線状または環状分子であってもよい。さらに、上記神経毒ポリペプチドをコードする核酸配列に加えて、本発明のポリヌクレオチドは、5’または3’UTR配列などの適切な転写および/または翻訳にとって必要とされるさらなる配列を含んでもよい。本発明のポリヌクレオチドは、抗原的に異なる血清型のボツリヌス神経毒、すなわち、BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/Gのうちの1つ、または破傷風神経毒(TeNT)から誘導可能な改変された神経毒ポリペプチドをコードする。本発明の一態様においては、前記ポリヌクレオチドは、(本発明の改変、すなわち、少なくとも1つのE3リガーゼ認識モチーフによる軽鎖の改変の前に)配列番号1 (BoNT/A)、配列番号3 (BoNT/B)、配列番号5 (BoNT/C1)、配列番号7 (BoNT/D)、配列番号9もしくは81 (BoNT/E)、配列番号11 (BoNT/F)、配列番号13 (BoNT/G)または配列番号15 (TeNT)に示される核酸配列を含む。さらに、包含されるのは、一態様においては、(本発明の改変、すなわち、少なくとも1つのE3リガーゼ認識モチーフによる軽鎖の改変の前に)配列番号2 (BoNT/A)、配列番号(BoNT/B)、配列番号6 (BoNT/C1)、配列番号8 (BoNT/D)、配列番号10もしくは82 (BoNT/E)、配列番号12 (BoNT/F)、配列番号14 (BoNT/G)または配列番号16 (TeNT)のいずれか1つに示されるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドである。別の態様において、前記ポリヌクレオチドは、1個以上のヌクレオチド置換、欠失および/または付加を含む上記のポリヌクレオチドの変異体であり、これはさらに別の態様において、1個以上のアミノ酸置換、欠失および/または付加を有するコードされたアミノ酸をもたらしてもよい。さらに、本発明の変異体ポリヌクレ
オチドは、別の態様において、配列番号1、3、5、7、9、81、11、13もしくは15のいずれか1つに示される核酸配列と少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%同一であるか、もしくは100%同一である核酸配列変異体または配列番号2、4、6、8、10、82、12、14もしくは16のいずれか1つに示されるアミノ酸配列と少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%同一であるか、もしくは100%同一であるアミノ酸配列をコードする核酸配列変異体を含む。一態様において、上記変異体ポリヌクレオチドはそれぞれ、1つ以上の生物学的特性、別の態様においては、対応する神経毒ポリペプチド、すなわち、BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/Gまたは破傷風神経毒(TeNT)の全ての生物学的特性を保持する変異体ポリペプチドをコードする。当業者であれば、プロセッシングされていない前駆体がいくらかの生物学的機能を示すことができるか、または部分的に活性であることが考えられる場合であっても、完全な生物活性はタンパク質分解的活性化後にのみ維持されることを理解するであろう。本明細書で用いられる用語「生物学的特性」とは、(a)受容体結合、(b)内在化、(c)細胞質ゾル中へのエンドソーム膜を通過する転移、および/または(d)シナプス小胞膜融合に関与するタンパク質の細胞内タンパク質分解的切断を指す。さらなる態様において、変異体ポリヌクレオチドは、改善されたか、または変化した生物学的特性を有する変異体ポリペプチドをコードしてもよく、例えば、それらは酵素認識について改善されるか、または受容体結合もしくは上記で特定された任意の他の特性について改善することができる切断部位を含んでもよい。さらなる態様において、変異体ポリヌクレオチドは、異なる血清型の少なくとも2つの神経毒ポリペプチド、例えば、BoNT/Aの重鎖およびBoNT/Eの軽鎖またはBoNT/Eの結合ドメインならびにBoNT/Aの転移ドメインおよび軽鎖を含む融合神経毒の一部を含む融合神経毒ポリペプチドをコードする。
オチドは、別の態様において、配列番号1、3、5、7、9、81、11、13もしくは15のいずれか1つに示される核酸配列と少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%同一であるか、もしくは100%同一である核酸配列変異体または配列番号2、4、6、8、10、82、12、14もしくは16のいずれか1つに示されるアミノ酸配列と少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%同一であるか、もしくは100%同一であるアミノ酸配列をコードする核酸配列変異体を含む。一態様において、上記変異体ポリヌクレオチドはそれぞれ、1つ以上の生物学的特性、別の態様においては、対応する神経毒ポリペプチド、すなわち、BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/Gまたは破傷風神経毒(TeNT)の全ての生物学的特性を保持する変異体ポリペプチドをコードする。当業者であれば、プロセッシングされていない前駆体がいくらかの生物学的機能を示すことができるか、または部分的に活性であることが考えられる場合であっても、完全な生物活性はタンパク質分解的活性化後にのみ維持されることを理解するであろう。本明細書で用いられる用語「生物学的特性」とは、(a)受容体結合、(b)内在化、(c)細胞質ゾル中へのエンドソーム膜を通過する転移、および/または(d)シナプス小胞膜融合に関与するタンパク質の細胞内タンパク質分解的切断を指す。さらなる態様において、変異体ポリヌクレオチドは、改善されたか、または変化した生物学的特性を有する変異体ポリペプチドをコードしてもよく、例えば、それらは酵素認識について改善されるか、または受容体結合もしくは上記で特定された任意の他の特性について改善することができる切断部位を含んでもよい。さらなる態様において、変異体ポリヌクレオチドは、異なる血清型の少なくとも2つの神経毒ポリペプチド、例えば、BoNT/Aの重鎖およびBoNT/Eの軽鎖またはBoNT/Eの結合ドメインならびにBoNT/Aの転移ドメインおよび軽鎖を含む融合神経毒の一部を含む融合神経毒ポリペプチドをコードする。
本明細書で用いられる用語「同一」とは、最も高い次数の一致が得られるように配列を整列させた場合に、2つの核酸配列またはアミノ酸配列の間で同一のアミノ酸の数を決定することを特徴とする配列同一性を指す。それを、例えば、BLASTP、BLASTNまたはFASTA(Altschul 1990, J. Mol. Biol. 215, 403)などのコンピュータプログラム中で体系化された公開された技術または方法を用いて算出することができる。同一性パーセント値は、一態様において、全アミノ酸配列にわたって算出される。様々なアルゴリズムに基づく一連のプログラムが、異なる配列を比較するために当業者にとって利用可能である。この文脈において、NeedlemanおよびWunschまたはSmithおよびWatermanのアルゴリズムにより、特に信頼できる結果が得られる。配列アラインメントを実行するために、GCGソフトウェアパケット(Genetics Computer Group 1991, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711)の一部であるプログラムPileUP(Higgins 1989, CABIOS 5, 151)またはプログラムGapおよびBestFit (Needleman 1970, J. Mol. Biol. 48; 443; Smith 1981, Adv. Appl. Math. 2, 482)を用いることができる。上記でパーセント(%)で記載された配列同一性の値は、本発明の別の態様においては、別途特定しない限り、配列アラインメントのための標準的な設定として常に用いるべきである以下の設定：ギャップ重量:50、長さ重量:3、平均一致:10.000及び平均不一致:0.000を用いて配列領域全体にわたってプログラムGAPを用いて決定されるべきである。
本明細書で用いられる神経毒の用語「活性」、「機能」、「生物活性」、「生物学的機能」または「生物学的効果」は、単位時間あたりに細胞から阻害される細胞開口放出の量、例えば、ニューロンなどの標的細胞からの、神経伝達因子、例えば、アセチルコリンの開口放出の量を示す。より詳細には、それは、a)受容体結合、b)内在化、c)細胞質ゾルへのエンドソーム膜を通過する転移、および/またはd)シナプス小胞融合に関与するタンパク質の細胞内タンパク質分解的切断を示す成熟二本鎖神経毒ポリペプチドの生物活性を指す。本明細書で用いられる用語「被験体における(神経毒の)生物学的効果の持続期間」は、神経毒が適用された被験体における神経毒の生物活性の時間を意味する。生物活性を評価するためのin vivoアッセイとしては、マウスLD50アッセイならびにPearceら(Pearce 1994, Toxicol. Appl. Pharmacol. 128: 69-77)およびDresslerら(Dressler 2005, Mov. Disord. 20:1617-1619、Keller 2006, Neuroscience 139: 629-637)により記載されたex vivoマウス片側横隔膜アッセイが挙げられる。生物活性を、例えば、Whitemarshら(Whitemarshら、2012, Toxicol. Sci. 126: 426-435)により記載された細胞に基づくアッセイにより評価することもできる。生物活性は一般的に、マウス単位(MU)で表される。本明細書で用いられる場合、1MUは、腹腔内注射後に特定のマウス集団の50%を殺傷する神経毒成分の量、すなわち、マウスi.p. LD50である。本明細書で用いられる用語「被験体」は、哺乳動物、好ましくは、ヒトを意味する。
さらに、検出可能なマーカーペプチドまたはタグをさらに含む融合ポリペプチドが、軽鎖中の少なくとも1個のE3リガーゼ認識モチーフに起因して、被験体における生物学的効果の持続期間の減少を示す本発明の神経毒ポリペプチドのさらなる態様において包含される。一態様において、好適なタグは、例えば、FLAGタグ、Mycタグ、Hisタグ、HAタグまたはGSTタグであり、タグ付けされたポリペプチドのより効率的な精製をも可能にする。検出可能なマーカーペプチドは、一態様において、GFP、BFP、YFPなどの蛍光タンパク質を含む。前記融合ポリペプチドは、いくつかの態様において、さらなるポリペプチドドメインを含んでもよい。例えば、本発明の神経毒ポリペプチドは、神経毒軽鎖の作用部位、すなわち、神経標的細胞の細胞質に接近するために細胞透過を媒介するペプチドドメインを含んでもよい。この目的のために、例えば、当業界で周知である本発明の神経毒ポリペプチドへの融合のためにポリアルギニンペプチドを用いることができる。
本発明の神経毒ポリペプチド(ポリヌクレオチドによりコードされる)は、その軽鎖中に少なくとも1個のE3リガーゼ認識モチーフをさらに含む。本明細書の他の場所により詳細に説明され、以下の実施例に示されるように、被験体における神経毒の生物学的効果の持続期間を、軽鎖中への少なくとも1個のE3リガーゼ認識モチーフの組込みまたは軽鎖のNもしくはC末端への少なくとも1個のE3リガーゼ認識モチーフの付加により、影響させる、すなわち、変化させることができる。かくして、一態様において、本発明の神経毒ポリペプチドは、軽鎖中に少なくとも1個の内部または末端に導入されたE3リガーゼ認識モチーフを含む。そのような改変は、E3リガーゼ認識モチーフを含まない神経毒と比較して、被験体における本発明の神経毒の生物学的効果の持続期間の減少をもたらす。本発明の一態様において、本発明のポリヌクレオチドによりコードされる神経毒ポリペプチドの前記軽鎖は、上記の特定の核酸配列のいずれか1つまたは上記のその変異体を含むポリヌクレオチドによりコードされる軽鎖からの改変により得られる。上記のように、および当業界で周知のように、神経毒ポリペプチドの軽鎖は、前駆体ポリペプチドのタンパク質分解的切断により生成される。この軽鎖は、前記タンパク質分解的切断の結果として得られる前駆体ポリペプチドのN末端部分である。上記の神経毒ポリペプチドの軽鎖のアミノ酸配列を、一態様においては、表1に示される野生型神経毒の切断部位から推定することができる。組換え神経毒においては、切断部位(トロンビン切断部位またはエンテロキナーゼ切断部位など）を、重鎖と軽鎖との間でジスルフィド架橋を形成する2個のシステインの間の配列中に、好ましくは、本明細書の他の場所で定義されるリンカー中に導入する。
本明細書で用いられる用語「E3リガーゼ認識モチーフ」とは、神経毒が適用される被験体中に存在する内因性分解経路による本発明の神経毒ポリペプチドの分解の加速をもたらす前記神経毒ポリペプチドの軽鎖の1つまたは複数の改変を指す。E3リガーゼ認識モチーフは、モチーフの認識およびE3リガーゼの該モチーフへの結合を可能にする構造モチーフである。タンパク質の細胞性分解を媒介するさらなるペプチド分解シグナルは当業界で公知であり、例えば、PESTモチーフ、WWモチーフ、またはWD40モチーフを含む。分解経路は、プロテアソーム分解経路またはリソソーム分解経路であってもよい。別の態様においては、分解経路は単に、例えば、1つ以上のタンパク質分解的切断ステップにより、本発明の神経毒ポリペプチドの部分的分解をもたらしてもよい。前記E3リガーゼ認識モチーフを、軽鎖中に導入する、すなわち、軽鎖内に配置(内部的に)するか、またはNもしくはC末端に連結することができる。後者の場合、本発明の神経毒ポリペプチドは、例えば、神経毒軽鎖と、神経毒重鎖との間に挿入されたE3リガーゼ認識モチーフを担持してもよい。例えば、そのような構築物は、一態様において、N末端からC末端に向かって、神経毒軽鎖-E3リガーゼ認識モチーフ-神経毒重鎖の配置を有してもよい。あるいは、ドメイン配置は、N末端からC末端に向かって、神経毒重鎖-E3リガーゼ認識モチーフ-神経毒軽鎖であってもよい。さらなる態様において、例えば、ポリグリシンリンカーなどのさらなるリンカーを用いて、前記神経毒軽鎖と重鎖とを相互接続することができる。そのような構築物を、N末端からC末端に向かって、神経毒軽鎖-E3リガーゼ認識モチーフ-リンカー-神経毒重鎖に配置することができる。あるいは、ドメイン配置は、N末端からC末端に向かって、神経毒重鎖-リンカー-E3リガーゼ認識モチーフ-神経毒軽鎖であってもよい。リンカーは、好ましくは、プロテアーゼ切断部位、例えば、エンテロキナーゼ切断部位またはトロンビン切断部位を含む。E3リガーゼ認識モチーフの位置は、軽鎖の第1のジスルフィド架橋形成システインおよびプロテアーゼ切断部位のN末端であるのが好ましい；図1を参照されたい。それぞれのプロテアーゼによる切断時に、神経毒軽鎖(E3リガーゼ認識モチーフを含む)は上記構築物から遊離する。他の態様において、本発明の神経毒ポリペプチドは、天然の組換え軽鎖中、またはそれに結合した1個のE3リガーゼ認識モチーフだけでなく、2、3、4またはさらにより多くのE3リガーゼ認識モチーフを含む。本明細書で用いられる場合、被験体における生物学的効果の持続期間の減少を示す用語「改変された」神経毒ポリペプチドは、本発明の神経毒ポリペプチドが、好ましくは、神経毒軽鎖中の1個以上の突然変異と共に、天然の組換え軽鎖中、またはそれに結合した少なくとも1個のE3リガーゼ認識モチーフを含むことを意味する。さらにより好ましくは、神経毒軽鎖中の前記突然変異は、本明細書の他の場所で定義されるアミノ酸置換である。
当業者であれば、好適なE3リガーゼ認識モチーフおよびそれらを神経毒ポリペプチドの軽鎖に導入または連結する方法をよく知っている。さらに、当業者であれば、組換え分子生物学技術または化学的改変を適用することにより、少なくとも1個のE3リガーゼ認識モチーフを含むそのような神経毒ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを生成することができる。例えば、部位特異的突然変異誘発を、本明細書に記載のE3リガーゼ認識モチーフを導入するために用いることができる。あるいは、神経毒ポリペプチドおよび想定されたE3リガーゼ認識モチーフのコード配列を含むポリヌクレオチドの核酸配列を設計した後、ポリヌクレオチド全体を化学的に合成することができる。
一態様において、前記E3リガーゼ認識モチーフは、少なくとも1個の内部または末端に導入されたE3リガーゼ認識および/またはE3リガーゼ結合モチーフである。好ましくは、それぞれのE3リガーゼの認識および結合モチーフは同一である、すなわち、前記モチーフはE3リガーゼの認識および結合の両方のために用いられる。この態様において、E3リガーゼ認識モチーフは、本発明の神経毒ポリペプチドの軽鎖を、ユビキチン媒介性プロテアソーム分解経路による細胞分解に標的化する。ユビキチン-プロテアソーム経路による分解は、2つの個別的かつ連続的ステップ：(i)ポリ-ユビキチン鎖を形成するための複数のユビキチン分子の、本発明の神経毒ポリペプチドの軽鎖への共有結合および(ii)かくして、26Sプロテアソーム経路によるタグ付けされた本発明の神経毒ポリペプチドの軽鎖の分解を含む。当業界で記載されたように、ユビキチン、高度に保存された76アミノ酸タンパク質は、3ステップの機構による標的タンパク質にコンジュゲートされる。最初に、ユビキチンのC末端カルボキシル基は、ユビキチン活性化酵素(E1)により活性化される。次いで、E1酵素へのユビキチンの結合により形成されるチオエステルは、ユビキチンコンジュゲート化酵素(E2)へのトランスアシル化反応を介して移される。次いで、含まれるE3リガーゼに応じて、ユビキチンはE3リガーゼ(HECT E3リガーゼ)に直接移されるか、またはE2ユビキチン複合体はE3リガーゼ(RING E3リガーゼ)に結合する。最後に、両方の場合、E3リガーゼは基質に特異的に結合し、基質、この場合は本発明の神経毒ポリペプチドの軽鎖へのユビキチンの共有結合である、コンジュゲーションプロセスの最後のステップを触媒する(MarmorおよびYarden 2004, Oncogene 23:2057-2070)。以前に付加されたユビキチン分子の内部リシンへのユビキチンの連続的コンジュゲーションは、ポリ-ユビキチン鎖の形成をもたらす。次いで、ポリ-ユビキチン化標的タンパク質は、26Sプロテアソームにより認識され、排除される(Schrader 2009, Nat. Chem. Biol. 5:815-22)。好ましくは、本明細書で定義されるE3リガーゼ認識モチーフは、不可逆的分解を媒介する。そのような不可逆的分解は、例えば、ペプチド分解シグナルドメイン「ALAPYIP」(配列番号25)について記載されている。特定の態様において、E3リガーゼ認識および/または結合モチーフは、50アミノ酸残基未満の長さ、40残基未満の長さ、30残基未満の長さ、20残基未満の長さ、または15残基未満の長さを有するペプチドまたはペプチド模倣体である。特定のE3リガーゼ認識モチーフの例は、表2に示されるか、またはアミノ酸配列ETFSDLWKLLPE (配列番号26)、TSFAEYWNLLSP (配列番号27)、LTFEHYWAQLTS (配列番号28)、LTFEHWWAQLTS (配列番号29)、LTFEHSWAQLTS (配列番号30)、ETFEHNWAQLTS (配列番号31)、LTFEHNWAQLTS (配列番号32)、LTFEHWWASLTS (配列番号33)、LTFEHWWSSLTS (配列番号34)、LTFTHWWAQLTS (配列番号35)、ETFEHWWAQLTS (配列番号36)、LTFEHWWSQLTS (配列番号37)、LTFEHWWAQLLS (配列番号38)、ETFEHWWSQLLS (配列番号39)、RFMDYWEGL (配列番号40)、MPRFMDYWEGLN (配列番号41)、SQETFSDLWKLLPEN (配列番号42)および/またはLTFEHNWAQLEN (配列番号78)を含むE3リガーゼ認識モチーフである。好ましくは、E3リガーゼ認識モチーフは、細胞内の本発明の神経毒ポリペプチドの軽鎖の少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、または90%、より好ましくは、100%の分解を媒介する。分解は、当業界で記載されたアッセイにより、例えば、定量的細胞ベースアッセイのようなin vitroアッセイ、またはマウスランニングアッセイ、ディジットアブダクションアッセイ(DAS)、またはラット握力アッセイなどのin vivoアッセイにより決定することができる。
別の態様において、E3リガーゼ認識モチーフは、E3リガーゼMDM2の結合モチーフである。対応するヒト核酸およびアミノ酸配列は、それぞれ、受託番号NM_002392およびNP_002383に示される。好ましくは、E3リガーゼMDM2の前記結合モチーフは、ETFSDLWKLLPE (配列番号26)、TSFAEYWNLLSP (配列番号27)、LTFEHYWAQLTS (配列番号28)、LTFEHWWAQLTS (配列番号29)、LTFEHSWAQLTS (配列番号30)、ETFEHNWAQLTS (配列番号31)、LTFEHNWAQLTS (配列番号32)、LTFEHWWASLTS (配列番号33)、LTFEHWWSSLTS (配列番号34)、LTFTHWWAQLTS (配列番号35)、ETFEHWWAQLTS (配列番号36)、LTFEHWWSQLTS (配列番号37)、LTFEHWWAQLLS (配列番号38)、ETFEHWWSQLLS (配列番号39)、RFMDYWEGL (配列番号40)、MPRFMDYWEGLN (配列番号41)、SQETFSDLWKLLPEN (配列番号42)および/またはLTFEHNWAQLEN (配列番号78)からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。さらにより好ましくは、E3リガーゼMDM2の前記結合モチーフは、アミノ酸配列LTFEHNWAQLTS (配列番号32)またはLTFEHNWAQLEN (配列番号78)を含むか、またはそれからなる。また、E3リガーゼMDM2の結合モチーフの長さは、9〜15アミノ酸残基であるのが好ましく、より好ましくは、12アミノ酸残基の長さである。図1は、E3リガーゼMDM2の結合モチーフ(MDM2モチーフ)を含む本発明の神経毒ポリペプチドの一例を例示する。図2は、図1に示される神経毒軽鎖と重鎖との間のE3リガーゼMDM2の結合モチーフの挿入が、E3リガーゼMDM2の認識およびかくしてその改変された神経毒軽鎖への結合を可能にし、細胞プロテアソーム系による周囲の表面露出されたリシン残基のユビキチン化および本発明のユビキチン化された神経毒軽鎖のより迅速な分解をもたらすことを示している。E3リガーゼMDM2の示された結合モチーフの配列を、例えば、さらに別の態様において、1個以上のアミノ酸置換、欠失および/または付加を有するコードされたアミノ酸配列をもたらし得る1個以上のヌクレオチド置換、欠失および/または付加によりさらに改変することができることが、本発明の範囲内に包含される。前記改変を、示された結合モチーフへのE3リガーゼMDM2の結合を変化させる(例えば、改善する)ために実行し、ユビキチン媒介性プロテアソーム分解経路による本発明の神経毒ポリペプチドのさらに増強された分解をもたらすことができる。
さらなる態様において、本発明の前記ポリヌクレオチドは、
a)配列番号51または79に示されるヌクレオチド配列を有する核酸配列；
b)配列番号52または80に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列；および
c)a)またはb)の核酸配列と少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%同一である核酸配列
からなる群より選択される核酸配列を含む。
a)配列番号51または79に示されるヌクレオチド配列を有する核酸配列；
b)配列番号52または80に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列；および
c)a)またはb)の核酸配列と少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%同一である核酸配列
からなる群より選択される核酸配列を含む。
以下の実施例に示されるように、軽鎖中に少なくとも1個のE3リガーゼ認識モチーフを含む本発明の神経毒ポリペプチド(ポリヌクレオチドによりコードされる)は、非改変神経毒ポリペプチド(軽鎖中に1個以上のE3リガーゼ認識モチーフを含まない)と比較して、投与時に被験体における生物学的効果の持続期間の減少を示す。かくして、改変されたポリペプチドの生物学的活性の持続期間の減少が、BoNT/E-MDM2について例示された。本発明の神経毒ポリペプチドの生物学的効果の持続期間の減少は、被験体におけるニューロンのプロテアソーム系による前記神経毒ポリペプチド(すなわち、触媒神経毒軽鎖)のより迅速な分解の結果である。
本発明者らは、MDM2認識モチーフに空間的に近いところに位置する軽鎖中の露出したアミノ酸残基の部位特異的突然変異誘発により、上記BoNT/E-MDM2ポリペプチドをさらに改善した。本明細書で用いられる「露出したアミノ酸残基」とは、アミノ酸残基が神経毒の軽鎖、例えば、BoNT/E軽鎖の表面に位置し、前記アミノ酸残基の側鎖が分子内相互作用に関与しないことを意味する。軽鎖内の前記露出したアミノ酸残基を三次元構造分析により最初に同定した後、リシン残基により置換した。この最適化手順により、E3リガーゼ認識モチーフを含む非突然変異BoNT/E-MDM2ポリペプチドと比較して、突然変異BoNT/E-MDM2ポリペプチドの分解のさらなる加速が得られる。リシンによるQ53、N72、N378、N379、R394および/またはT400での置換がプロテアソーム系によるBoNT/E-MDM2のより迅速な分解をもたらすことが予想外に見出された。対応するアミノ酸残基の示された部分は、配列番号52に示されるアミノ酸配列中の番号に基づく。特に、軽鎖中の(i) Q53、N72、N378、N379、R394およびT400 (配列番号57); (ii) Q53、N378およびN379 (配列番号58); (iii) N72、N378およびN379 (配列番号61);または(iv) N378、N379およびT400 (配列番号75)がリシン残基により置換されたBoNT/E-MDM2突然変異体は、培養された皮質ニューロンに対する生物学的効果の減少を示した。対照的に、いくつかの他の突然変異は、図3に示されるように、生物学的効果の持続期間のいかなる減少も示さなかった。従って、さらなる態様において、本発明のポリペプチドは、
a)配列番号57、58、61または75に示されるアミノ酸配列；および
b)a)のアミノ酸配列と少なくとも40%、好ましくは、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
a)配列番号57、58、61または75に示されるアミノ酸配列；および
b)a)のアミノ酸配列と少なくとも40%、好ましくは、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
好ましくは、b)のアミノ酸配列は、軽鎖中に、配列番号57 (Q53、N72、N378、N379、R394およびT400)、配列番号58 (Q53、N378およびN379)、配列番号61 (N72、N378およびN379)または配列番号75 (N378、N379およびT400)と同じセットの突然変異を担持する。別の態様においては、本発明は、上記のa)またはb)のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドに関する。
一態様において、被験体において観察される本発明の神経毒ポリペプチドの前記生物学的効果は、筋肉麻痺、すなわち、筋肉が収縮する能力の(可逆性)不活化を引き起こす。さらなる態様において、ヒト被験者における本発明の神経毒ポリペプチドの生物学的効果の持続時間の減少は、5、4、3、2週間未満またはさらには1週間未満持続する。別の態様において、前記効果を、いわゆるマウスランニングアッセイ(Keller 2006, Neuroscience 139: 629-637)、ディジットアブダクションアッセイ(Aoki 2001, Toxicon 12:1815-20)またはラット握力アッセイ(Torii 2011, Toxicon 57(1):93-9)によりin vivoで試験することができる。当業者であれば、生物学的効果を、さらに造作なく決定することができる。一態様において、生物学的効果の持続期間の減少とは、統計的に有意な持続期間の減少を指す。当業者であれば、ある効果の持続期間が統計的に有意に減少するかどうかを、標準的な統計的検定、例えば、信頼区間の決定、p値の決定、Studentのt検定、Mann-Whitney検定などを適用することにより決定することができる。好ましい信頼区間は、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%または少なくとも99%である。p値は、好ましくは、0.1、0.05、0.01、0.005、または0.0001である。好ましくは、本発明により想定される確率は、所与のコホートまたは集団の被験体の少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、または少なくとも90%について診断が正確であるということを可能にする。一態様において、前記持続期間の減少は、通常の持続期間、すなわち、未改変の神経毒ポリペプチド(軽鎖中またはそれに結合した1個以上のE3リガーゼ認識モチーフを含まない)の75%未満、70%未満、65%未満、60%未満、55%未満、50%未満、45%未満、40%未満、30%未満または20%未満持続する。一態様において、通常の持続期間は、BoNT/Aの場合は約4ヶ月間、BoNT/Bの場合は2ヶ月間、BoNT/Cの場合は約3〜4ヶ月間またはBoNT/Eの場合は約4〜6週間持続する(Foran, J. Biol. Chem. 278(2): 1363-1371、Eleopra 1998, Neurosci. Lett. 13, 256(3): 135-138、Eleopra 1997, Neurosci. Lett. 14,224(2): 91-94、Sloop 1997, Neurology 49(1): 189-194、Washbourne 1998, J. Physiol. Paris 92(2): 135-139)。効果の持続期間は遺伝的背景、年齢、生活スタイルなどの被験体における個々の影響に依存することが理解されるべきである。従って、本明細書で意味されるおおよその持続期間とは、25%以下、20%以下、15%以下、10%以下または5%以下の標準偏差を有するそれぞれの神経毒ポリペプチドに関して上記で示された持続期間(例えば、BoNT/Aについては4ヶ月またはBoNT/Eについては4〜6週間)を指す。
神経毒ポリペプチドを、投与時に被験体において短縮された生物学的効果を示すように改変することができることが、本発明に従って有利に見出された。軽鎖の持続性は生物学的効果の持続期間と相関することがわかったため、前記神経毒ポリペプチドの軽鎖にE3リガーゼ認識モチーフを導入または連結することによって、これを達成することができる。本発明の神経毒ポリペプチドにより惹起される生物学的効果の持続期間の短縮は、前記神経毒の生物学的効果の持続期間の減少を必要とする本明細書に他の場所に記載の様々な医学的適用にとって有益である。そのような持続期間の減少は、神経毒を用いる短期間または急性の処置の場合、例えば、瘢痕を形成することなく迅速で痛みのない創傷治癒を容易にするための外科的創傷の処置において、または眼が乾燥による損傷を受け得る人工的昏睡にある患者の眼瞼筋の麻痺において、特に重要である。本発明の神経毒ポリペプチドのさらなる適用は、本明細書の他の場所に列挙される。
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを企図する。
用語「ベクター」は、好ましくは、ファージ、プラスミド、ウイルスまたはレトロウイルスベクターならびに人工染色体、例えば、細菌または酵母人工染色体を包含する。さらに、この用語は、ゲノムDNA中への標的化構築物の無作為的または部位特異的組込みを可能にする標的化構築物にも関する。そのような標的構築物は、以下で詳細に説明される相同的または異種的組換えにとって十分な長さのDNAを含むのが好ましい。本発明のポリヌクレオチドを包含するベクターは、一態様において、宿主における増殖および/または選択のための選択可能なベクターをさらに含む。ベクターを、当業界で周知の様々な技術により、宿主細胞中に組込むことができる。例えば、プラスミドベクターを、リン酸カルシウム沈降物もしくは塩化ルビジウム沈降物などの沈降物中に、または荷電した脂質もしくはフラーレンなどの炭素に基づくクラスターとの複合体中に導入することができる。あるいは、プラスミドベクターを、熱ショックまたはエレクトロポレーション技術により導入することができる。ベクターがウイルスであれば、それを宿主細胞への適用の前に適切なパッケージング細胞系を用いてin vitroでパッケージングすることができる。レトロウイルスベクターは複製能力を有するか、または複製欠損であってもよい。後者の場合、ウイルス増殖は一般に、宿主/細胞を補完する時にのみ起こる。さらに、本発明の一態様において、ポリヌクレオチドは、原核もしくは真核宿主細胞中での発現を可能にする発現制御配列または前記ベクター中の単離されたその画分に機能し得る形で連結される。ポリヌクレオチドの発現は、翻訳可能なmRNAへのポリヌクレオチドの転写を含む。宿主細胞中での発現を確保する調節エレメントは、当業界で周知である。一態様において、それらは転写の開始を確保する調節配列ならびに/または転写の終結および転写物の安定化を確保するポリAシグナルを含む。さらなる調節エレメントは、転写ならびに翻訳エンハンサーを含んでもよい。原核宿主細胞中での発現を許容する可能な調節エレメントは、大腸菌におけるlac-、trp-またはtac-プロモーターを含み、真核宿主細胞中での発現を許容する調節エレメントの例は、酵母におけるAOX-もしくはGAL1-プロモーターまたは哺乳動物および他の動物細胞におけるCMV-、SV40-、RSV-プロモーター(ラウス肉腫ウイルス)、CMV-エンハンサー、SV40-エンハンサーもしくはグロビンイントロンである。さらに、誘導性発現制御配列を、本発明により包含される発現ベクター中で用いることができる。そのような誘導性ベクターは、tetまたはlacオペレーター配列または熱ショックもしくは他の環境因子によって誘導可能な配列を含んでもよい。好適な発現制御配列は、当業界で周知である。転写の開始を担うエレメントの他に、そのような調節エレメントは、ポリヌクレオチドの下流に、SV40-ポリA部位またはtk-ポリA部位などの転写終結シグナルをも含んでもよい。これに関連して、Okayama-Berg cDNA発現ベクターpcDV1(Pharmacia)、pBluescript(Stratagene)、pCDM8、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3(Invitrogen)またはpSPORT1(Invitrogen)などの好適な発現ベクターが当業界で公知である。好ましくは、前記ベクターは発現ベクターおよび遺伝子導入または標的化ベクターである。レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、またはウシパピローマウイルスなどのウイルスから誘導される発現ベクターを、標的細胞集団中への本発明のポリヌクレオチドまたはベクターの送達のために用いることができる。当業者には周知である方法を用いて、組換えウイルスベクターを構築することができる；例えば、Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (2001) N.Y.およびAusubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1994)に記載の技術を参照されたい。
さらに、本発明は、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを含む宿主細胞に関する。
本明細書で用いられる用語「宿主細胞」は、原核および真核宿主細胞を包含する。好ましくは、宿主細胞は、単離された原核または真核宿主細胞である。一態様において、宿主細胞は細菌細胞であり、別の態様においては、フィルミクテス(Firmicutes)細菌細胞である。一態様において、前記細菌宿主細胞は、大腸菌宿主細胞である。別の態様において、それはクロストリジウム宿主細胞である。さらなる態様において、前記クロストリジウム宿主細胞は、クロストリジウム・ボツリナム宿主細胞であり、さらなる態様においては、上記の7つの異なる血清型のクロストリジウム・ボツリナムのうちの1つの細胞である。さらに別の態様において、細菌宿主細胞は、クロストリジウム・テタニ宿主細胞である。さらなる態様において、宿主細胞は、バチルス宿主細胞であり、特定の態様においては、バチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)宿主細胞である。真核宿主細胞は、一態様において、毒性タンパク質の産生にとって好適な動物細胞系の細胞または酵母宿主細胞などの菌類宿主細胞である。
また、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドも本発明によって包含される。本発明のポリペプチドの一態様においては、ポリペプチドは神経毒ポリペプチドの軽鎖中に(本明細書で定義されるMDM2結合モチーフ中ではない)少なくとも1個のアミノ酸置換をさらに含む。好ましくは、軽鎖中の天然アミノ酸の置換は、リシンによるものである。より好ましくは、前記ポリペプチドは、Q53K、N72K、N378K、N379K、R394KおよびT400Kからなる群より選択される少なくとも1個のアミノ酸置換を含む。ポリペプチドは、前記アミノ酸置換の1個だけでなく、2、3、4、5、6個またはさらにより多くのアミノ酸置換を含んでもよい。軽鎖中の(i) Q53、N72、N378、N379、R394およびT400 (配列番号57)、(ii) Q53、N378およびN379 (配列番号58)、(iii) N72、N378およびN379 (配列番号61)または(iv) N378、N379およびT400 (配列番号75)がリシン残基により置換されたBoNT/E-MDM2突然変異体が特に好ましい。本発明のポリペプチドの他の態様においては、ポリペプチドは、軽鎖中の上記アミノ酸配列置換に加えて、例えば、本発明のポリペプチドへのE3リガーゼMDM2の結合を改善するために、MDM2結合モチーフ中に1個以上のアミノ酸配列置換を含んでもよい。
本明細書で用いられる用語「ポリペプチド」は、クロストリジウム・ボツリナムの複合体化タンパク質(HA70、HA17、HA33、もしくはNTNH(NBP))を含む他のポリペプチドを本質的に含まない単離されたか、もしくは本質的に精製されたポリペプチドまたは他のタンパク質をさらに含むポリペプチド調製物を包含する。さらに、この用語は、組換えポリペプチドおよび化学的に改変されたポリペプチドを含む。そのような改変は、人工的改変または天然の改変であってもよい。上記の通り、本発明のポリペプチドは、上記の神経毒ポリペプチドの生物学的特性を有する。さらに、それは投与時に被験体において生物学的効果の持続期間の短縮を示す。さらに、本発明のポリペプチドは、他の細胞型を標的化する新しい結合ドメインを有するボツリヌス毒素から構成されていてもよい。本発明のポリペプチドは、一態様において、本明細書の他の場所でより詳細に説明されるポリペプチドを製造する方法によって製造することができる。本発明の一態様においては、神経毒ポリペプチドとその複合体化タンパク質との複合体を含むポリペプチド調製物も想定される。
さらに、本発明は、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体に関する。さらなる態様において、抗体は配列番号52、57、58、61または75に示されるアミノ酸配列に特異的に結合する。
本発明のポリペプチドに対する抗体を、抗原として本発明による精製されたポリペプチドまたはそれから誘導された好適な断片を用いて、周知の方法により調製することができる。抗原として好適である断片を、当業界で周知の抗原性決定アルゴリズムにより同定することができる。そのような断片を、タンパク質分解的消化によって本発明のポリペプチドから取得することができるか、またはそれらは合成ペプチドであってもよい。一態様において、本発明の抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、一本鎖抗体、ヒトもしくはヒト化抗体もしくは霊長類化抗体、キメラ化抗体またはその断片である。また、二特異的もしくは二特異的一本鎖抗体、合成抗体、抗体断片、例えば、Fab、FvもしくはscFv断片など、またはこれらのいずれかの化学的に改変された誘導体も、本発明による抗体として含まれる。本発明の抗体は、本発明のポリペプチドに特異的に結合する(すなわち、他のポリペプチドまたはペプチドと交叉反応しない)。詳細には、抗体は、未改変の神経毒ポリペプチド(MDM2結合モチーフを担持しない)とも交叉反応しない。さらに、抗体はE3リガーゼMDM2と交叉反応しない。特異的結合を、様々な周知の技術により試験することができる。抗体またはその断片を、例えば、HarlowおよびLane、「Antibodies, A Laboratory Manual」、CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988に記載された方法を用いることにより取得することができる。モノクローナル抗体を、抗原、すなわち、本発明のポリペプチドまたはその免疫原性断片により免疫された哺乳動物から誘導された脾臓細胞へのマウスミエローマ細胞の融合を含む、Kohlerら(Kohler 1975, Nature 256:495)またはGalfre (Galfre 1981, Meth. Enzymol. 73)により元々記載された技術により調製することができる。抗体を、例えば、本発明のポリペプチドの免疫沈降および免疫局在化のため、ならびに例えば、組換え生物における前記ポリペプチドの存在のモニタリングのため、および本発明によるタンパク質と相互作用する化合物の同定のために用いることができる。例えば、BIAcoreシステムにおいて用いられる表面プラズモン共鳴を用いて、本発明のタンパク質のエピトープに結合するファージ抗体の効率を増加させることができる(Schier 1996, Human Antibodies Hybridomas 7:97-105; Malmborg 1995, J.Immunol. Methods 183:7-13)。別の態様において、本発明の抗体は、Q53K、N72K、N378K、N379K、R394KおよびT400Kからなる群より選択される1個以上のアミノ酸置換に特異的に結合し、その位置番号は配列番号52のものに対応する。
本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを、一般的には、医薬として用いることができる。
本明細書で用いられる用語「医薬」とは、一態様においては、本発明の生物学的に活性な神経毒ポリペプチドを含有する医薬組成物または医薬活性化合物としてそれをコードするポリヌクレオチドを指す。前記医薬を、治療上有効用量で様々な疾患または障害のヒトまたは動物療法のために用いることができる。医薬を、所望の適用目的に応じて様々な技術により製剤化することができる。本発明による医薬の様々な態様は、本明細書の以下で特定される。
一態様において、医薬は、医薬組成物として本発明の生物学的に活性な神経毒ポリペプチドと1つ以上の製薬上許容し得る担体とを含む。製薬上許容し得る担体は、製剤の他の成分と適合し、そのレシピエントに対して有害ではないという意味で許容し得るものでなければならない。用いられる医薬担体は、固体、ゲル、または液体を含んでもよい。固体担体の例は、ラクトース、白土、スクロース、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸などである。液体担体の例は、グリセロール、リン酸緩衝塩水溶液、水、乳濁液、様々な種類の湿潤剤などである。好適な担体は、上記のものおよび当業界で周知の他のものを含み、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvaniaを参照されたい。特に、医薬の活性成分が本発明のポリヌクレオチドである場合、担体は遺伝子療法にとって好適なウイルスまたはレトロウイルスであってもよいことが理解されるであろう。
医薬は、一態様においては、投与の前に希釈液中に溶解することができる。また、希釈液は、組合せの生物活性に影響しないように選択される。そのような希釈液の例は、蒸留水または生理食塩水である。さらに、医薬組成物または製剤は、他の担体または非毒性、非治療的、非免疫原性安定剤なども含んでもよい。かくして、本発明の神経毒ポリペプチドは、一態様においては、液体または凍結乾燥形態で存在してもよい。一態様において、それはグリセロール、タンパク質安定剤(HSA)または非タンパク質安定剤、例えば、ポリビニルピロリドン(PVP)、ヒアルロン酸もしくは遊離アミノ酸と一緒に存在してもよい。一態様において、好適な非タンパク質性安定剤は、WO2005/007185またはWO2006/020208に開示されている。
別の態様において、神経毒ポリペプチドを含む溶液として医薬を提供することができる。さらに、溶液は、同様に上記の担体または安定剤を含んでもよい。神経毒ポリペプチドの安定な液体製剤を、一態様においては、米国特許第7,211,261号により開示されたように提供することができる。
医薬組成物は、一態様においては、局所的に投与される。従来、所望の医学的適応に応じて、医薬を筋肉内投与または皮下投与(腺の近く)することができる。しかしながら、化合物の性質および作用様式に応じて、医薬組成物を同様に他の経路により投与することができる。
治療上有効用量とは、本明細書に記載の状態または疾患に伴う症状を防止、軽減または処置する本発明の神経毒ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの量を指す。例えば、ED50(集団の50%において治療上有効な用量)およびLD50(集団の50%に対して致死的な用量)などの、化合物の治療効果および毒性を、細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手順により決定することができる。治療効果と毒性効果との用量比は治療指数であり、それを比LD50/ED50として表すことができる。本発明の医薬は、一態様においては、個々のレシピエントに応じた用量調整を予測するための処方者用または使用者用説明書における用量推奨を含む。
本明細書に記載の医薬を、本明細書に記載の疾患または状態を処置または改善または防止するために少なくとも1回投与されるように開発する。しかしながら、前記医薬を、2回以上投与してもよい。
本発明による医薬は、本発明のさらなる態様においては、その製剤化の間に医薬組成物に添加される生物活性神経毒ポリペプチドに加えて薬剤を含む。
さらに、本発明は、創傷治癒、骨折および腱断裂処置のための固定、特に、痔核切除術に関連する術後固定、歯科インプラントの導入、または股関節置換(内部プロテーゼ）、上顆炎、膝関節形成術、眼科手術、にきび、過敏性腸疾患、膣痙、腰痛、または良性前立腺肥大の処置のための医薬の調製のための本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの使用に関する。
上記の医学的状態または疾患と関連する症状は当業者には周知であり、StedmanまたはPschyrembelなどの医学の標準的な教科書に記載されている。
さらに、本発明は、被験体が神経毒療法にとって感受性であるかどうかを決定するための診断用医薬の調製のための本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの使用にも関する。
上記の診断用医薬は、上記の神経毒ポリペプチド医薬である。しかしながら、医薬は、被験体が神経毒ポリペプチドに応答するかどうかの決定または好適な投薬レジメンの決定を可能にするだけの時間および投薬レジメンで適用されるべきである。上記神経毒ポリペプチドは、同様に治療的潜在能力を有するが、この態様においては処置または改善のためというよりは診断目的で枢動可能に用いられ、それを含む医薬は「診断用医薬」と呼ばれる。かくして、本発明の改変神経毒ポリペプチドを用いるそのような時間限定的予備スクリーニングは、非改変神経毒を用いる療法にとって感受性である被験体を選択し、ならびに好適な用量を決定するのに役立つ。本発明の改変神経毒ポリペプチドにより惹起される生物学的効果の持続期間の減少のため、通常はより長時間持続する非改変神経毒に基づく療法の潜在的な副作用を減少させることができる。
本発明は、本発明のポリヌクレオチドによりコードされる神経毒ポリペプチドの製造のための方法であって、
a)本発明のポリヌクレオチドによりコードされる神経毒ポリペプチドの発現を可能にする条件下で本発明の宿主細胞を培養するステップ、および
b)a)の宿主細胞培養物から本発明のポリヌクレオチドによりコードされる神経毒ポリペプチドを取得するステップ
を含む、前記方法を包含する。
a)本発明のポリヌクレオチドによりコードされる神経毒ポリペプチドの発現を可能にする条件下で本発明の宿主細胞を培養するステップ、および
b)a)の宿主細胞培養物から本発明のポリヌクレオチドによりコードされる神経毒ポリペプチドを取得するステップ
を含む、前記方法を包含する。
前記ポリペプチドを、一態様においては、アフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)などのあらゆる従来の精製技術および抗体沈降などの沈降技術により、培養物から取得することができる。別の態様においては、神経毒ポリペプチドを、神経毒ポリペプチドに加えて、複合体化タンパク質を含む複合体として取得することができる。さらに、本明細書で用いられる取得は、一態様においては、神経毒ポリペプチドの活性化を含む。内因性もしくは外因性(例えば、組換え発現された)プロテアーゼにより細胞内で、または上記の精製の前、間もしくは後に、切断を可能にする条件下で神経毒ポリペプチドをプロテアーゼと接触させることにより細胞外で、(一本鎖)神経毒ポリペプチドをタンパク質分解的に切断することにより、これを達成することができる。
さらに、本発明の上記方法のステップと、医薬として本発明のポリヌクレオチドによりコードされる神経毒ポリペプチドを製剤化するさらなるステップとを含む、医薬の製造方法が本発明に従って企図される。
医薬の製造のためのそのような方法は、医薬の品質、薬学的安全性、および効果を確保するために医薬のためのGMP基準に従って実行されることが理解されるであろう。医薬の好適な製剤は、本明細書の他の場所に記載されている。しかしながら、当業者であれば、そのような製剤を作製することができる方法を知っている。
本発明はまた、本発明の方法のステップと、化粧品組成物として神経毒ポリペプチドを製剤化するさらなるステップとを含む化粧品組成物の製造のための方法も包含する。
本明細書で用いられる「化粧品組成物」を、上記の医薬組成物について記載されたように製剤化および使用することができる。化粧品組成物については、同様に、本発明の化合物が、一態様においては、実質的に純粋な形態で用いられることが想定される。しかしながら、不純物は医薬にとってあまり重要ではない。化粧品組成物は、さらなる態様においては、筋肉内に適用される。本発明のさらなる態様においては、神経毒を含む化粧品組成物を、しわ取り剤として製剤化することができる。
本発明はまた、そのような化粧品組成物およびしわ取り剤として用いられる化粧品組成物の調製のための本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの使用に関する。
本明細書で引用される全ての参考文献は、その開示内容全体および本明細書で具体的に言及される開示内容に関して、参照により本明細書に組込まれる。
(実施例)
ここで、本発明を以下の実施例により例示するが、これらは本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
ここで、本発明を以下の実施例により例示するが、これらは本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
(MDM2認識モチーフを含む組換えBoNT/E(BoNT/E-MDM2；配列番号52)の構築、発現および精製)
配列番号32に示されるMDM2結合モチーフ「LTFEHNWAQLTS」を担持するボツリヌス神経毒野生型E(BoNT/E)のコード配列を遺伝子合成し、C末端精製タグ(例えば、Hisタグ)を付加する大腸菌発現ベクター中にサブクローニングした。タンパク質(配列番号52に示されるアミノ酸配列を有する、BoNT/E-MDM2)を、16℃で24h、LB培地を用いて大腸菌BL21中で発現させた。発現された神経毒を、3ステップのクロマトグラフィープロトコル(例えば、HisタグなどのC末端アフィニティタグを用いるアフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよび/またはサイズ排除クロマトグラフィー)を用いて精製した。その後、C末端プロテアーゼ切断部位(例えば、トロンビン切断部位)を用いるプロテアーゼ切断によりタグを除去し、タンパク質の純度をSDS-PAGEにより分析した。
配列番号32に示されるMDM2結合モチーフ「LTFEHNWAQLTS」を担持するボツリヌス神経毒野生型E(BoNT/E)のコード配列を遺伝子合成し、C末端精製タグ(例えば、Hisタグ)を付加する大腸菌発現ベクター中にサブクローニングした。タンパク質(配列番号52に示されるアミノ酸配列を有する、BoNT/E-MDM2)を、16℃で24h、LB培地を用いて大腸菌BL21中で発現させた。発現された神経毒を、3ステップのクロマトグラフィープロトコル(例えば、HisタグなどのC末端アフィニティタグを用いるアフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよび/またはサイズ排除クロマトグラフィー)を用いて精製した。その後、C末端プロテアーゼ切断部位(例えば、トロンビン切断部位)を用いるプロテアーゼ切断によりタグを除去し、タンパク質の純度をSDS-PAGEにより分析した。
(プロテアーゼ切断による精製されたBoNT/Eの活性化)
軽鎖と重鎖との間のリンカー中にトロンビン切断部位を担持する配列番号52に示されるアミノ酸配列を有する精製されたボツリヌス神経毒(実施例1を参照されたい)を、20℃でO/N、ビオチン化されたトロンビンと共にインキュベートした。アフィニティクロマトグラフィーによりトロンビンを除去し(例えば、ストレプトアビジンアガロースとのインキュベーション)、活性化された毒素をSDS-PAGEにより分析した後、クマシー染色を行い(図4を参照されたい)、免疫ブロッティングを行った。活性化された神経毒の最終濃度を、捕捉のためのウサギ抗BoNT/E抗体および検出のためのモルモット抗BoNT/E抗体を用いるELISAにより決定した。効力試験を、片側横隔膜アッセイ(HDA)を用いて実行した。
軽鎖と重鎖との間のリンカー中にトロンビン切断部位を担持する配列番号52に示されるアミノ酸配列を有する精製されたボツリヌス神経毒(実施例1を参照されたい)を、20℃でO/N、ビオチン化されたトロンビンと共にインキュベートした。アフィニティクロマトグラフィーによりトロンビンを除去し(例えば、ストレプトアビジンアガロースとのインキュベーション)、活性化された毒素をSDS-PAGEにより分析した後、クマシー染色を行い(図4を参照されたい)、免疫ブロッティングを行った。活性化された神経毒の最終濃度を、捕捉のためのウサギ抗BoNT/E抗体および検出のためのモルモット抗BoNT/E抗体を用いるELISAにより決定した。効力試験を、片側横隔膜アッセイ(HDA)を用いて実行した。
(in vitroでの持続性の決定)
前頭皮質組織を、15〜16日胚のマウスから収穫した。細胞を0.5x106細胞/mLの密度でNeurobasal(商標)培地中に懸濁し、2000μLを6穴プレート上に播種した。培養物を3.5週間、4%CO2雰囲気中、37℃でインキュベートした。培養物を5-フルアロ-2'デソキシウリジン(25μM）およびウリジン(63μM)で処理して、さらなるグリア増殖を防止した。次いで、培養物を正確に18h、10pMの野生型BoNT/E(配列番号82)またはMDM2認識モチーフを含むBoNT/E(配列番号52、実施例2)のいずれかで処理した後、条件化細胞培養培地で洗浄した。この時点で、および3日、7日、10日、14日および21日後、細胞を収穫し、ウェスタンブロットにおける切断されたSNAP25と全SNAP25との比を、マウスモノクローナル抗体(Synaptic Systems #111111)を適用して決定した。MDM2認識モチーフを含むBoNT/E(配列番号52)で処理した細胞培養物における切断比は、野生型BoNT/E(配列番号82)と比較して約25%短い時間で50%の比(t50)に達することがわかった；図5を参照されたい。これは、神経細胞中の軽鎖の持続性が、25%減少することを示しており、生物学的効果の持続期間が25%減少することを証明している。
前頭皮質組織を、15〜16日胚のマウスから収穫した。細胞を0.5x106細胞/mLの密度でNeurobasal(商標)培地中に懸濁し、2000μLを6穴プレート上に播種した。培養物を3.5週間、4%CO2雰囲気中、37℃でインキュベートした。培養物を5-フルアロ-2'デソキシウリジン(25μM）およびウリジン(63μM)で処理して、さらなるグリア増殖を防止した。次いで、培養物を正確に18h、10pMの野生型BoNT/E(配列番号82)またはMDM2認識モチーフを含むBoNT/E(配列番号52、実施例2)のいずれかで処理した後、条件化細胞培養培地で洗浄した。この時点で、および3日、7日、10日、14日および21日後、細胞を収穫し、ウェスタンブロットにおける切断されたSNAP25と全SNAP25との比を、マウスモノクローナル抗体(Synaptic Systems #111111)を適用して決定した。MDM2認識モチーフを含むBoNT/E(配列番号52)で処理した細胞培養物における切断比は、野生型BoNT/E(配列番号82)と比較して約25%短い時間で50%の比(t50)に達することがわかった；図5を参照されたい。これは、神経細胞中の軽鎖の持続性が、25%減少することを示しており、生物学的効果の持続期間が25%減少することを証明している。
(in vivoでの回復の決定)
実施例2に記載されたBoNT/E-MDM2(配列番号52)を、ディジットアブダクションアッセイ(DAS)(Aoki, 2001 Toxicon.(12):1815-20)において分析した。等効力用量の野生型およびMDM2モチーフを含む突然変異BoNT/Eを、10匹のマウスの腓腹筋に注射した。マウスを、Aoki, 2001 Toxicon.(12):1815-20に記載されたスケールに従ってスコア化した。BoNT/E-MDM2(実施例2、配列番号52)で処理したマウスの回復時間は、野生型BoNT/E(配列番号82)と比較して、約20%減少した；図6を参照されたい。
実施例2に記載されたBoNT/E-MDM2(配列番号52)を、ディジットアブダクションアッセイ(DAS)(Aoki, 2001 Toxicon.(12):1815-20)において分析した。等効力用量の野生型およびMDM2モチーフを含む突然変異BoNT/Eを、10匹のマウスの腓腹筋に注射した。マウスを、Aoki, 2001 Toxicon.(12):1815-20に記載されたスケールに従ってスコア化した。BoNT/E-MDM2(実施例2、配列番号52)で処理したマウスの回復時間は、野生型BoNT/E(配列番号82)と比較して、約20%減少した；図6を参照されたい。
(MDM2認識モチーフを含む組換えBoNT/E(BoNT/E-MDM2;配列番号80)の構築、発現および精製)
配列番号78に示されるMDM2結合モチーフ「LTFEHNWAQLEN」を担持するボツリヌス神経毒E型(BoNT/E)のコード配列を遺伝子合成し、C末端精製タグ(例えば、Hisタグ)を付加する大腸菌発現ベクター中にサブクローニングした。タンパク質(配列番号80に示されるアミノ酸配列を有する、BoNT/E-MDM2)を、16℃で24h、LB培地を用いて大腸菌BL21中で発現させた。発現された神経毒を、3ステップのクロマトグラフィープロトコル(例えば、HisタグなどのC末端アフィニティタグを用いるアフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよび/またはサイズ排除クロマトグラフィー)を用いて精製した。その後、C末端プロテアーゼ切断部位(例えば、トロンビン切断部位)を用いるプロテアーゼ切断によりタグを除去し、タンパク質の純度をSDS-PAGEにより分析した。
配列番号78に示されるMDM2結合モチーフ「LTFEHNWAQLEN」を担持するボツリヌス神経毒E型(BoNT/E)のコード配列を遺伝子合成し、C末端精製タグ(例えば、Hisタグ)を付加する大腸菌発現ベクター中にサブクローニングした。タンパク質(配列番号80に示されるアミノ酸配列を有する、BoNT/E-MDM2)を、16℃で24h、LB培地を用いて大腸菌BL21中で発現させた。発現された神経毒を、3ステップのクロマトグラフィープロトコル(例えば、HisタグなどのC末端アフィニティタグを用いるアフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよび/またはサイズ排除クロマトグラフィー)を用いて精製した。その後、C末端プロテアーゼ切断部位(例えば、トロンビン切断部位)を用いるプロテアーゼ切断によりタグを除去し、タンパク質の純度をSDS-PAGEにより分析した。
(プロテアーゼ切断による精製されたBoNT/Eの活性化)
軽鎖と重鎖との間のリンカー中にトロンビン切断部位を担持する配列番号80に示されるアミノ酸配列を有する精製されたボツリヌス神経毒(実施例5)を、20℃でO/N、ビオチン化されたトロンビンと共にインキュベートした。アフィニティクロマトグラフィーによりトロンビンを除去し(例えば、ストレプトアビジンアガロースとのインキュベーション)、活性化された毒素をSDS-PAGEにより分析した後、クマシー染色を行い(図7を参照されたい)、免疫ブロッティングを行った。活性化された神経毒の最終濃度を、捕捉のためのウサギ抗BoNT/E抗体および検出のためのモルモット抗BoNT/E抗体を用いるELISAにより決定した。効力試験を、片側横隔膜アッセイ(HDA)を用いて実行した。
軽鎖と重鎖との間のリンカー中にトロンビン切断部位を担持する配列番号80に示されるアミノ酸配列を有する精製されたボツリヌス神経毒(実施例5)を、20℃でO/N、ビオチン化されたトロンビンと共にインキュベートした。アフィニティクロマトグラフィーによりトロンビンを除去し(例えば、ストレプトアビジンアガロースとのインキュベーション)、活性化された毒素をSDS-PAGEにより分析した後、クマシー染色を行い(図7を参照されたい)、免疫ブロッティングを行った。活性化された神経毒の最終濃度を、捕捉のためのウサギ抗BoNT/E抗体および検出のためのモルモット抗BoNT/E抗体を用いるELISAにより決定した。効力試験を、片側横隔膜アッセイ(HDA)を用いて実行した。
(in vitroでの持続性の決定)
前頭皮質組織を、15〜16日胚のマウスから収穫した。細胞を0.5x106細胞/mLの密度でNeurobasal(商標)培地中に懸濁し、2000μLを6穴プレート上に播種した。培養物を3.5週間、4%CO2雰囲気中、37℃でインキュベートした。培養物を5-フルアロ-2'デソキシウリジン(25μM）およびウリジン(63μM)で処理して、さらなるグリア増殖を防止した。次いで、培養物を正確に18h、10pMの野生型BoNT/E(配列番号82)またはMDM2認識モチーフを含むBoNT/E(配列番号80、実施例6)のいずれかで処理した後、条件化細胞培養培地で洗浄した。この時点で、および3日、7日、10日、14日および21日後、細胞を収穫し、ウェスタンブロットにおける切断されたSNAP-25と全SNAP-25との比を、マウスモノクローナル抗体(Synaptic Systems #111111)を適用して決定した。MDM2認識モチーフを含むBoNT/E(配列番号80)で処理した細胞培養物における切断比は、野生型BoNT/E(配列番号82)と比較して約25%短い時間で50%の比(t50)に達することがわかった。これは、神経細胞中の軽鎖の持続性が、25%減少することを示しており、生物学的効果の持続期間が25%減少することを証明している。
前頭皮質組織を、15〜16日胚のマウスから収穫した。細胞を0.5x106細胞/mLの密度でNeurobasal(商標)培地中に懸濁し、2000μLを6穴プレート上に播種した。培養物を3.5週間、4%CO2雰囲気中、37℃でインキュベートした。培養物を5-フルアロ-2'デソキシウリジン(25μM）およびウリジン(63μM)で処理して、さらなるグリア増殖を防止した。次いで、培養物を正確に18h、10pMの野生型BoNT/E(配列番号82)またはMDM2認識モチーフを含むBoNT/E(配列番号80、実施例6)のいずれかで処理した後、条件化細胞培養培地で洗浄した。この時点で、および3日、7日、10日、14日および21日後、細胞を収穫し、ウェスタンブロットにおける切断されたSNAP-25と全SNAP-25との比を、マウスモノクローナル抗体(Synaptic Systems #111111)を適用して決定した。MDM2認識モチーフを含むBoNT/E(配列番号80)で処理した細胞培養物における切断比は、野生型BoNT/E(配列番号82)と比較して約25%短い時間で50%の比(t50)に達することがわかった。これは、神経細胞中の軽鎖の持続性が、25%減少することを示しており、生物学的効果の持続期間が25%減少することを証明している。
(in vivoでの回復の決定)
わずかに改変された設定のDASアッセイ(実施例４を参照されたい)において、1−注射された足の長さに対する幅の比の間の差を算出することにより、スコアリングを置き換えた。BoNT/E-MDM2(実施例6、配列番号80)で処理したマウスの回復時間は、野生型BoNT/E(配列番号82)と比較して、約25%減少した；図8を参照されたい。
わずかに改変された設定のDASアッセイ(実施例４を参照されたい)において、1−注射された足の長さに対する幅の比の間の差を算出することにより、スコアリングを置き換えた。BoNT/E-MDM2(実施例6、配列番号80)で処理したマウスの回復時間は、野生型BoNT/E(配列番号82)と比較して、約25%減少した；図8を参照されたい。
(BoNT/E-MDM2突然変異体の生成)
2つの異なるBoNT/E-MDM2ポリペプチド(配列番号52および配列番号80)の生成が実施例1および5に記載された。続いて、MDM2認識モチーフの空間的に近いところに位置するBoNT/E軽鎖中の露出したアミノ酸残基を、BoNT/E軽鎖の三次元構造の分析によって同定した。本明細書で用いられる「露出したアミノ酸残基」とは、アミノ酸残基がBoNT/E軽鎖の表面に位置し、前記アミノ酸残基の側鎖が分子内相互作用に関与しないことを意味する。露出したアミノ酸残基を、分子動的(MD)シミュレーションおよび溶媒接近可能表面積(SASA)の算出によって同定した。60%(多く)より高いSASA値を、特異的カットオフとして選択した。図3に示されるようなリシン残基による同定された位置の露出したアミノ酸残基の交換を、この目的のために設計された特異的プライマー対と共に、QuikChange(商標)突然変異誘発キットを用いる部位特異的突然変異誘発により実行した。MDM2を含むE3リガーゼはリシン残基でその基質をユビキチン化するため、分子内相互作用に関与しない同定された露出したアミノ酸残基のリシン残基による置換を行った。この目的のために、E3リガーゼは最初に基質中のE3リガーゼ結合モチーフ、例えば、本明細書に記載のBoNT/E-MDM2タンパク質中のMDM2結合モチーフに結合した後、ユビキチン分子により改変することができる基質中の結合モチーフに空間的に近いところにあるリシン残基を「検出」する。従って、プロテアソーム分解の効果は、MDM2 E3リガーゼ結合モチーフを含む、本発明の神経毒ポリペプチドの軽鎖中へのさらなるリシン残基の導入により増加する。得られるDNA構築物を大腸菌発現株(BL21)中に形質転換し、かくして改変された組換えボツリヌス神経毒を発現させた。突然変異組換えボツリヌス神経毒を、アフィニティクロマトグラフィー(例えば、Hisタグ)、イオン交換クロマトグラフィーおよび/またはサイズ排除クロマトグラフィーにより大腸菌の細胞溶解物から精製した。前記突然変異神経毒を、プロテアーゼであるトロンビンを用いるタンパク質分解的切断、続いてプロテアーゼの除去により活性化した。以下において、かくして精製および活性化された突然変異神経毒を、以下の実施例に示されるように分析した。
2つの異なるBoNT/E-MDM2ポリペプチド(配列番号52および配列番号80)の生成が実施例1および5に記載された。続いて、MDM2認識モチーフの空間的に近いところに位置するBoNT/E軽鎖中の露出したアミノ酸残基を、BoNT/E軽鎖の三次元構造の分析によって同定した。本明細書で用いられる「露出したアミノ酸残基」とは、アミノ酸残基がBoNT/E軽鎖の表面に位置し、前記アミノ酸残基の側鎖が分子内相互作用に関与しないことを意味する。露出したアミノ酸残基を、分子動的(MD)シミュレーションおよび溶媒接近可能表面積(SASA)の算出によって同定した。60%(多く)より高いSASA値を、特異的カットオフとして選択した。図3に示されるようなリシン残基による同定された位置の露出したアミノ酸残基の交換を、この目的のために設計された特異的プライマー対と共に、QuikChange(商標)突然変異誘発キットを用いる部位特異的突然変異誘発により実行した。MDM2を含むE3リガーゼはリシン残基でその基質をユビキチン化するため、分子内相互作用に関与しない同定された露出したアミノ酸残基のリシン残基による置換を行った。この目的のために、E3リガーゼは最初に基質中のE3リガーゼ結合モチーフ、例えば、本明細書に記載のBoNT/E-MDM2タンパク質中のMDM2結合モチーフに結合した後、ユビキチン分子により改変することができる基質中の結合モチーフに空間的に近いところにあるリシン残基を「検出」する。従って、プロテアソーム分解の効果は、MDM2 E3リガーゼ結合モチーフを含む、本発明の神経毒ポリペプチドの軽鎖中へのさらなるリシン残基の導入により増加する。得られるDNA構築物を大腸菌発現株(BL21)中に形質転換し、かくして改変された組換えボツリヌス神経毒を発現させた。突然変異組換えボツリヌス神経毒を、アフィニティクロマトグラフィー(例えば、Hisタグ)、イオン交換クロマトグラフィーおよび/またはサイズ排除クロマトグラフィーにより大腸菌の細胞溶解物から精製した。前記突然変異神経毒を、プロテアーゼであるトロンビンを用いるタンパク質分解的切断、続いてプロテアーゼの除去により活性化した。以下において、かくして精製および活性化された突然変異神経毒を、以下の実施例に示されるように分析した。
(細胞培養系におけるBoNT/E-MDM2突然変異体の分解の分析)
この目的のために、マウスの前頭皮質細胞の細胞培養物を、実施例3に示されたように確立した。1x106個の細胞を、6穴プレート中、18時間、20pMのBoNT/E-MDM2(配列番号52)および対応するBoNT/E-MDM2突然変異体(図3を参照されたい)で処理した。18時間、3日、7日、10日、14日、および21日後、サンプルを単離し、SNAP-25ならびにBoNT/Eにより切断されたSNAP-25(Synaptic Systems #111111)の両方を認識する抗体を用いるウェスタンブロットにより分析した。切断されたSNAP-25と未切断のSNAP-25との比を、その濃度に関するものである前頭皮質細胞中でのボツリヌス神経毒の軽鎖の生物活性の測定値として取った。結果として、BoNT/E-MDM2突然変異体の軽鎖のタンパク質分解活性および従って濃度は、BoNT/E-MDM2のものと比較して、有意により迅速に減少したことがわかった；図3を参照されたい。特に、軽鎖中の(i) Q53、N72、N378、N379、R394およびT400 (配列番号57)、(ii) Q53、N378およびN379 (配列番号58)、(iii) N72、N378およびN379 (配列番号61)または(iv) N378、N379およびT400 (配列番号75)がリシン残基により置換されたBoNT/E-MDM2突然変異体は、皮質ニューロンに対する生物学的効果の減少を示した。その結果、BoNT/E-MDM2神経毒中へのリシン残基の導入は、皮質ニューロンにおける突然変異軽鎖のより速い分解をもたらした。対照的に、軽鎖中の他のいくつかの試験したアミノ酸置換およびその組合せは、神経毒の生物活性の持続期間に対する効果を示さなかった。
この目的のために、マウスの前頭皮質細胞の細胞培養物を、実施例3に示されたように確立した。1x106個の細胞を、6穴プレート中、18時間、20pMのBoNT/E-MDM2(配列番号52)および対応するBoNT/E-MDM2突然変異体(図3を参照されたい)で処理した。18時間、3日、7日、10日、14日、および21日後、サンプルを単離し、SNAP-25ならびにBoNT/Eにより切断されたSNAP-25(Synaptic Systems #111111)の両方を認識する抗体を用いるウェスタンブロットにより分析した。切断されたSNAP-25と未切断のSNAP-25との比を、その濃度に関するものである前頭皮質細胞中でのボツリヌス神経毒の軽鎖の生物活性の測定値として取った。結果として、BoNT/E-MDM2突然変異体の軽鎖のタンパク質分解活性および従って濃度は、BoNT/E-MDM2のものと比較して、有意により迅速に減少したことがわかった；図3を参照されたい。特に、軽鎖中の(i) Q53、N72、N378、N379、R394およびT400 (配列番号57)、(ii) Q53、N378およびN379 (配列番号58)、(iii) N72、N378およびN379 (配列番号61)または(iv) N378、N379およびT400 (配列番号75)がリシン残基により置換されたBoNT/E-MDM2突然変異体は、皮質ニューロンに対する生物学的効果の減少を示した。その結果、BoNT/E-MDM2神経毒中へのリシン残基の導入は、皮質ニューロンにおける突然変異軽鎖のより速い分解をもたらした。対照的に、軽鎖中の他のいくつかの試験したアミノ酸置換およびその組合せは、神経毒の生物活性の持続期間に対する効果を示さなかった。
Claims (16)
- 被験体における生物学的効果の持続期間の減少を示すBoNT/E神経毒ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、前記BoNT/E神経毒ポリペプチドが軽鎖中に少なくとも1個のE3リガーゼ認識モチーフを含み、前記E3リガーゼ認識モチーフがE3リガーゼMDM2のための結合モチーフであり、且つE3リガーゼMDM2のための前記結合モチーフが、LTFEHNWAQLTS (配列番号32)及び/又はLTFEHNWAQLEN (配列番号78)から成る群より選択される、前記ポリヌクレオチド。
- 前記生物学的効果が被験体における筋肉麻痺を引き起こす、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
- 前記持続期間の減少が、被験体において、5、4、3、2週間未満又は1週間未満持続する、請求項１又は２に記載のポリヌクレオチド。
- 前記被験体がヒト被験体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
- ポリペプチドの軽鎖が、
a)配列番号9又は81に示されるヌクレオチド配列を有する核酸配列；
b)配列番号10又は82に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列；及び
c)a)又はb)の核酸配列と少なくとも90％同一である核酸配列
から成る群より選択される核酸配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる軽鎖からの改変により得られる、請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。 - 前記ポリヌクレオチドが、
a)配列番号51又は79に示されるヌクレオチド配列を有する核酸配列；
b)配列番号52又は80に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列；及び
c)a)又はb)の核酸配列と少なくとも90％同一である核酸配列
から成る群より選択される核酸配列を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。 - 請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又は請求項７に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 前記細胞が大腸菌細胞又はクロストリジウム若しくはバチルス細胞である、請求項８に記載の宿主細胞。
- 請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド。
- 神経毒ポリペプチドの軽鎖中にリシンによる少なくとも1個のアミノ酸置換をさらに含む、請求項１０に記載のポリペプチドであって、前記少なくとも1個のアミノ酸置換がQ53K、N72K、N378K、N379K、R394K及びT400Kから成る群より選択される、前記ポリペプチド。
- 医薬としての使用のための請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
- 医薬としての使用のための請求項１０又は１１に記載のポリペプチド。
- 医薬が、創傷治癒、骨折及び腱断裂処置のための固定、痔核切除術に関連する術後固定、歯科インプラントの導入、又は股関節置換(内部プロテーゼ）、上顆炎、膝関節形成術、眼科手術、にきび、過敏性腸疾患、膣痙、腰痛、又は良性前立腺肥大の処置のためのものである、請求項１２に記載のポリヌクレオチド又は請求項１３に記載のポリペプチド。
- 請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドによりコードされる神経毒ポリペプチドの製造のための方法であって、
a)請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドによりコードされる神経毒ポリペプチドの発現を可能にする条件下で、請求項８又は９に記載の宿主細胞を培養するステップと、
b)a)の宿主細胞から、請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドによりコードされる神経毒ポリペプチドを取得するステップと
を含む、前記方法。 - 請求項１５に記載の方法のステップと、医薬として請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドによりコードされる神経毒ポリペプチドを製剤化するさらなるステップとを含む、医薬の製造のための方法。
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