ES2277854T3

ES2277854T3 - Neurotoxinas recombinantes activables.

Info

Publication number: ES2277854T3
Application number: ES00964920T
Authority: ES
Inventors: J. Oliver Dolly; Yan Li; Kuo Chion Chan
Original assignee: Allergan Inc
Current assignee: Allergan Inc
Priority date: 1999-08-25
Filing date: 2000-08-25
Publication date: 2007-08-01
Anticipated expiration: 2020-08-25
Also published as: EP2264052A3; HK1046020A1; US8273358B2; EP2264052A2; AU7573100A; EP2267008A2; US7419676B2; DE60032367D1; US8211671B2; BR0012759A; EP2267008A3; EP2267010A3; US20080182294A1; US20090005313A1; US20070259401A1; US7959933B2; US20080081355A1; US20080161226A1; EP2267009A3; EP2267009A2

Abstract

Un polipéptido de neurotoxina de clostridios de cadena sencilla que comprende: a) un primer dominio de secuencia de aminoácidos que comprende (i) un primer dominio que comprende un elemento de enlace que comprende al menos una porción de una neurotoxina de clostridios de cadena pesada capaz de enlazar de manera específica a un marcador superficial celular diana bajo condiciones fisiológicas; y (ii) un segundo dominio que comprende un elemento de translocación que comprende al menos una porción de una neurotoxina de clostridios de cadena pesada capaz de facilitar la transferencia de un polipéptido a través de una membrana vesicular; y b) un segundo dominio de secuencia de aminoácidos que comprende un elemento terapéutico que comprende al menos una porción de una neurotoxina de clostridios de cadena ligera que tiene actividad biológica cuando se libera en el citoplasma de la célula diana, c) un tercer dominio de secuencia de aminoácidos que comprende un emplazamiento de rotura de la proteasaque no es un emplazamiento de rotura de la tripsina, quimotripsina o pepsina entre dichos primer y segundo dominios de secuencia de aminoácidos.

Description

Neurotoxinas recombinantes activables.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a los procedimientos y composiciones útiles en los campos de la neurobiología, biología molecular, y medicina, así como a los procedimientos para la producción de agentes terapéuticos potencialmente tóxicos y derivados de los mismos. La invención se refiere también a neurotoxinas recombinantes de clostridios (de manera concreta neurotoxinas botulínicas), a las versiones modificadas de las mismas, y a los procedimientos para fabricar dichas moléculas, para uso como agentes terapéuticos, moléculas transportadoras, aductos y similares.

Antecedentes de la invención

Las neurotoxinas, tales como las que se obtienen de Clostridium botulinum y Clostridium tetani, son venenos específicos y muy potentes de las células neurales, y de otras células cuando se liberan en el interior de dichas células con objetivos terapéuticos. Estas bacterias Gram positivas expresan dos tipos de toxinas distintas pero relacionadas, comprendiendo cada una dos cadenas de aminoácidos enlazadas mediante disulfuro: una cadena ligera (L) de aproximadamente 50 KDa y una cadena pesada (H) de aproximadamente 100 KDa, que son completamente responsables de los síntomas de estas enfermedades. La holotoxina se sintetiza in vivo en forma de una cadena sencilla, a continuación se corta en una modificación post-traduccional para formar la neurotoxina activa que comprende las cadenas L y H separadas.

Las toxinas del tétanos y del botulismo se encuentran entre las toxinas más letales conocidas por el hombre, y tienen una dosis letal en seres humanos de entre 0,1 ng y 1 ng por kilogramo de peso corporal: Tonillo y col., Adv. Exp. Med. Biol. 389:251-260 (1996). Ambas toxinas funcionan inhibiendo la liberación del neurotransmisor en las neuronas afectadas. La neurotoxina del tétanos (TeNT) actúa principalmente en el sistema nervioso central, mientras que la neurotoxina botulínica (BoNT) actúa en la articulación neuromuscular y otras sinapsis colinérgicas en el sistema nervioso periférico; ambas actúan inhibiendo la liberación del neurotransmisor del axón de la neurona afectada en la sinapsis, dando como resultado la parálisis.

Se conoce que la neurotoxina del tétanos (TeNT) existe en un tipo inmunológicamente distinto; se conoce que las neurotoxinas botulínicas (BoNT) se producen en siete tipos inmunogénicos diferentes, denominados de BoNT/A a BoNT/G. Mientras que todos estos tipos se producen por aislados procedentes de C. Botulinum, otras dos especies, C. baratii y C. butyricum producen también toxinas similares a /F y /E, respectivamente. Véase por ejemplo, Coffield y col., The Site and Mechanism of Action of Botulinum Neurotoxin Therapy with Botulinum Toxin 3-13 (Jankovic J. & Hallett N. eds. 1994), la descripción del cual se incorpora en el presente documento por referencia.

Sin tener en cuenta el tipo, parece que el mecanismo molecular de intoxicación es similar. En la primera etapa del procedimiento, la toxina se enlaza con la membrana presináptica de la neurona diana a través de una interacción específica entre la cadena pesada (H) y un receptor superficial de la célula; se piensa que el receptor es diferente para cada tipo de toxina botulínica y para el TeNT. Dolly y col., Seminars in Neuroscience 6:149-158 (1994). El término carboxilo de la cadena pesada parece ser importante para dirigir la toxina a la superficie de la célula. Id.

En la segunda etapa, la toxina cruza la membrana plasmática de la célula envenenada. En primer lugar, la toxina se sumerge en la célula a través de endocitosis mediada por el receptor, y se forma un endosoma que contiene la toxina. A continuación, la toxina escapa desde endosoma al citoplasma de la célula. Se piensa que esta última etapa está mediada por el término amino de la cadena H, que estimula un cambio conformacional de la toxina en respuesta a un pH se aproximadamente 5,5 o inferior. Se sabe que los endosomas poseen una bomba de protones que disminuye el pH en el interior del endosoma. El cambio conformacional expone los residuos hidrófobos en la toxina, lo que permite a la toxina embeberse en la membrana endosómica. A continuación la toxina se transloca a través de la membrana endosómica en el citosol.

La última etapa del mecanismo de actividad de la toxina botulínica parece implicar la reducción de la articulación del enlace disulfuro que une el H y la cadena ligera (L). La actividad tóxica completa de las toxinas botulínica y del tétanos está contenida en la cadena L de la holotoxina; la cadena L es una endopeptidasa de zinc (Zn^{++}) que rompe de manera selectiva las proteínas esenciales para el reconocimiento y reducción de las vesículas que contienen el neurotransmisor con la superficie citoplásmica de la membrana plasmática, y la fusión de las vesículas con la membrana plasmática. TxNT, BoNT/B BoNT/D, BoNT/F, y BoNT/G producen la degradación de la sinaptobrevina (denominada también proteína de membrana asociada a la vesícula (VAMP)), una proteína de membrana sinaptosómica. Se elimina la mayor parte de la región citosólica de la VAMP, que se extiende desde la superficie de la vesícula sináptica como resultado de uno cualquiera de estos episodios de rotura. Cada toxina (excepto TeNT y BoNT/B) rompe de manera específica un enlace diferente.

BoNT/A y /E rompen de manera selectiva la proteína SNAP-25 asociada con la membrana plasmática; esta proteína, que se rompe también mediante BoNT/C1 (Foran y col., Biochem. 35:2630-2636 (1996)), se enlaza de manera predominante a, y está presente en la superficie citosólica de la membrana plasmática. BoNT/C rompe la sintaxina, una proteína integral que tiene la mayor parte de su masa expuesta en el citosol. La sintaxina interactúa con los canales de calcio y las zonas activas terminales presinápticas. Véase Tonillo y col., Tetanus and Botulinum Neurotoxins in Intracellular Protein Catabolism 251-260 (Suzuki K. & Bond J. eds. 1996), la descripción del cual se incorpora por referencia como parte de esta especificación.

TeNT y BoNT se absorben en la articulación neuromuscular. BoNT permanece en el interior de las neuronas periféricas, y bloquea la liberación del neurotransmisor acetilcolina de estas células. A través de su receptor, el TeNT entra en las vesículas que se mueven de manera retrógrada a lo largo del axón hasta el soma, y se descarga en el espacio intersináptico entre las neuronas motoras y las neuronas inhibidoras de la médula espinal. En este punto, TeNT se enlaza con los receptores de las neuronas inhibidoras, se internaliza de nuevo, y la cadena ligera entra en el citosol para bloquear la liberación en los transmisores inhibidores del ácido 4-aminobutírico (GABA) y la glicina de estas células.

Debido a sus efectos específicamente localizados, se han usado desde 1981 dosis mínimas de BoNT como agentes terapéuticos en el tratamiento de pacientes que padecen de distonías, entre las que se incluyen estrabismo (desalineamiento del ojo), beflarospasmo (cierre involuntario del párpado) y espasmo hemifacial. Véase por ejemplo, Borodic y col, Pharmacology and Histology of the Therapeutic Application of Botulinum Toxin in Therapy with Botulinum Toxin 119-157 (Jankovic J. & Hallett eds. 1994). De los siete tipos de toxina BoNT/A es la más potente de las BoNT, y la mejor caracterizada. Se ha usado también de manera efectiva la inyección intramuscular de tejido espástico con cantidades pequeñas de BoNT/A para tratar la espasticidad debida a lesión en el cerebro, lesión en la médula espinal, apoplejía, esclerosis múltiple y parálisis cerebral. La extensión de la parálisis depende de la dosis y el volumen liberados en el emplazamiento diana.

Aunque la cadena L es la fracción responsable de la intoxicación neural, para que sea tóxica debe liberarse en el citoplasma neural. De manera similar, las preformas de la holotoxina de la cadena sencilla presentan toxicidad relativamente baja hasta que se rompen en uno o más enlaces péptidos en una región bucle expuesta entre sus cadenas H y L para crear las neurotoxinas maduras completamente activas. Tal como se implica en el mecanismo proporcionado anteriormente, la cadena H de cada neurotoxina es esencial para el enlace del receptor celular y la endocitosis, mientras que se necesitan las cadenas L y H (y un enlace disulfuro intacto) para la translocación de la toxina en el citoplasma. Tal como se ha indicado anteriormente, sólo la cadena L es responsable de la toxicidad producida por la inhibición de la secreción de acetilcolina.

A pesar de la evidente eficacia terapéutica de las preparaciones de neurotoxina de clostridio, es difícil la producción industrial de la toxina. La producción de neurotoxina procedente de cultivos anaeróbicos de Clostridium es un procedimiento incómodo y que consume tiempo, e incluye un protocolo de purificación multietapas que implica etapas de precipitación de diversas proteínas y la cristalización prolongada y repetida de la toxina, o bien diversas etapas de cromatografía en columna. De manera significativa, la elevada toxicidad del producto dicta que el procedimiento deba llevarse a cabo bajo condiciones estrictas de contención (BL-3). Durante el procedimiento de fermentación, se activan la neurotoxinas de cadena sencilla plegadas mediante las proteasas endógenas de clostridio mediante un procedimiento denominado cortado. Este implica la eliminación de aproximadamente 10 residuos de aminoácidos de la cadena sencilla para crear la forma dicadena en la que las dos cadenas permanecen enlazadas de manera covalente mediante el enlace disulfuro intercadena.

La neurotoxina cortada es mucho más activa que la forma sin cortar. La cantidad y localización precisa del corte varía con los serotipos de las bacterias que producen la toxina. Las variaciones en la activación de la neurotoxina de cadena sencilla y, por tanto, el rendimiento de la toxina cortada, se deben a las variaciones en el tipo y cantidades de actividad proteolítica producidos por una cepa dada. Por ejemplo, la cepa Hall A de C. botulinum activa más de un 99% de la neurotoxina de cadena sencilla de C. botulinum de tipo A, mientras que las cepas de tipo B y E producen toxinas con cantidades menores de activación (0 a 75% dependiendo del tipo de fermentación). De esta manera, la elevada toxicidad de la neurotoxina madura juega una parte principal en la fabricación comercial de las neurotoxinas como agentes terapéuticos.

El grado de activación de las toxinas de clostridios diseñadas es, por tanto, una consideración importante para la fabricación de estos materiales. Sería una ventaja principal si las neurotoxinas tales como BoNT y TeTx pudieran expresarse con un elevado rendimiento en bacterias que crecen rápidamente (tales como las células heterólogas de E. coli) en forma de cadenas únicas relativamente no tóxicas (o cadenas únicas que tienen actividad tóxica reducida), que sean seguras, fáciles de aislar y simples de convertir en la forma completamente activa.

Siendo la seguridad una preocupación principal, el trabajo previo se ha concentrado sobre la expresión en E, coli y la purificación de cadenas H y L individuales de TeTx y BoNT; estas cadenas aisladas son, por sí mismas, no tóxicas; véase Li y col., Biochemistry 33:7014-7020 (1994); Zhou y col., Biochemistry 34:15175-15181 (1995). Tras la producción separada de estas cadenas de péptidos y bajo condiciones estrictamente controladas se pueden combinar las subunidades H y L mediante el enlace disulfuro oxidativo para formar la dicadenas neuroparalíticas. Desafortunadamente, esta estrategia tiene diversos inconvenientes.

En primer lugar, no es práctico expresar y aislar grandes cantidades de las cadenas individuales; en concreto, en ausencia de la cadena L, la cadena H aislada es bastante insoluble en solución acuosa y es muy susceptible de degradación proteolítica. En segundo lugar, la oxidación in vitro de las cadenas H y L purificadas expresadas de manera individual para producir las dicadenas activas es muy ineficiente, y conduce a rendimientos bajos de toxina activa y a la producción de muchas formas inactivas plegadas u oxidadas de manera incorrecta. Es difícil la purificación de la toxina que contiene cadenas H y L oxidadas plegadas de manera correcta, tanto como su separación de estas formas inactivas y de las cadenas H y L separadas sin reaccionar.

Podría por tanto ser útil y ventajoso expresar las neurotoxinas de clostridios como formas de cadena sencilla inactivas (o menos activas), para eliminar la necesidad de una reconstitución de las cadenas constituyentes que necesita tiempo y es ineficiente, para mantener la solubilidad de las cadenas de proteína, para reducir el plegado incorrecto y la susceptibilidad consecuente al ataque de la proteasa, para mejorar el rendimiento de la toxina, y/o para proporcionar un procedimiento simple para la purificación de la toxina.

De manera adicional podría ser útil diseñar estas toxinas para proporcionar moléculas de neurotoxina modificadas, de cadena sencilla, que tengan propiedades terapéuticas nuevas y/o una duración más larga de la acción, o formas tóxicas o no tóxicas para uso como moléculas de transporte capaces de liberar una fracción terapéutica en el nervio y otros tipos de células. Expresando dichas proteínas como cadena sencilla, podrían mejorarse vastamente el rendimiento y la purificación de las proteínas diseñadas.

Resumen de la invención

La presente invención se dirige a los polipéptidos de neurotoxinas de clostridios aislados y recombinantes que comprenden una región de enlace funcional, una región de translocación, y una región terapéutica, en la que dichos polipéptidos incluyen también una secuencia de aminoácidos que es susceptible a la rotura específica in vitro tras la expresión como una cadena sencilla. Los polipéptidos pueden incluir neurotoxinas de clostridio y los derivados de las mismas, tales como aquellas proteínas descritas en la Patente de los Estados Unidos 5.989.545, y la Solicitud de Patente Internacional WO 95/32738.

En una forma de realización de la invención, la proteína comprende las regiones funcionales de una cadena H de neurotoxina de clostridio y alguna o todas las funciones de una cadena L de neurotoxina de clostridio en una cadena sencilla de polipéptido, y que tiene un emplazamiento de rotura proteolítica insertado que no es un emplazamiento de rotura de tripsina, quimotripsina o pepsina, localizado entre la región H y la región L por el que se puede romper la proteína de cadena sencilla para producir las cadenas individuales, enlazadas preferiblemente de manera covalente mediante un enlace disulfuro. La invención incluye también los procedimientos para fabricar dichas proteínas y expresarlas en el interior de una célula, así como los vectores de ácido nucleico para la transferencia y expresión de las regiones de secuencias de nucleótidos que codifican dichas proteínas y las células que contienen dichos vectores. Los emplazamientos de rotura proteolítica comprenden las secuencias de aminoácidos que se reconocen y rompen de manera selectiva mediante un enzima específico.

Las proteínas de cadena sencilla expresadas comprenden las regiones biológicamente activas de la cadena H y la cadena L de una neurotoxina de clostridios. La escisión en el emplazamiento de rotura proteolítica interna que separa las regiones de la cadena da como resultado de esta manera en la activación de una neurotoxina que tiene la actividad completa.

De manera preferible, las proteínas de la presente invención se harán a medida para contener una secuencia de aminoácidos adicional que comprende una etiqueta de enlace capaz de enlazar un compuesto diana con una eficiencia suficientemente alta para facilitar el aislamiento rápido de la proteína de la toxina. Las proteínas que contienen dichos emplazamientos de enlace son mucho y bien conocidos por aquellos expertos en la técnica, y pueden comprender, sin limitación, anticuerpos monoclonales, la proteína de enlace con la maltosa, la glutatión-S-transferasa, la proteína A, una etiqueta His_{6}, y similares.

Debido a que dichas proteínas presentan selectividad de enlace a algún compuesto o tipo de compuesto, se puede inmovilizar el compuesto diana en un soporte sólido, que incluye sin limitación, una resina de cromatografía o pocillo microvalorador y usarse para la purificación por afinidad de la toxina modificada. A continuación puede eluirse la neurotoxina de clostridios mediante procedimientos estándar, tales como a través del uso de una solución de alto contenido en sal o los antagonistas específicos.

Para minimizar los riesgos de seguridad asociados con el manejo de la neurotoxina de clostridios, la neurotoxina de clostridios de la presente invención se expresa como sus preformas de cadena sencilla de baja actividad (o inactivas), a continuación mediante una reacción proteolítica cuidadosamente controlada in vitro, se activaron, de manera preferible con el mismo nivel de potencia que la neurona nativa a partir de la cual fueron derivadas. Para mejorar la eficiencia y velocidad de rotura proteolítica, los emplazamientos de rotura proteolítica se pueden diseñar para que aparezcan en un bucle especialmente diseñado entre las porciones H y L de la cadena sencilla de aminoácido, lo que mejora la accesibilidad de la proteasa al sustrato de la holotoxina.

Para reducir el riesgo de activación no intencionada de la neurotoxina de clostridios mediante proteasas humanas o habituales, de manera preferible las secuencias de aminoácidos del emplazamiento de rotura se diseñan para que tengan un alto grado de especificidad a las enzimas proteolíticas que no se encuentran normalmente en seres humanos (ya sea como proteasas humanas o que se encuentran en parte de la fauna y flora humana previsible). Una lista no exclusiva de ejemplos de dichas proteasas incluye la enteroquinasa bovina, que rompe la secuencia de aminoácidos DDDDK; la proteasa del virus etch del tabaco (TEV), que rompe la secuencia EXXYXQS/G; GENENASE® de Bacillus amyliquifaciens, que rompe la secuencia HY o YH; y la proteasa PRESCISSION® del rinovirus 3C humano, que rompe la secuencia de aminoácidos LEVLFQGP. Tal como se ha usado anteriormente, la letra X indica cualquier aminoácido. Todas las secuencias de aminoácidos que se muestran en la presente especificación están en la dirección desde el término amino al término carboxilo, y todas las secuencias de nucleótidos desde 5' a 3', (de izquierda a derecha) a no ser que se indique otra cosa.

En un aspecto de la invención, el polipéptido de cadena sencilla es un polipéptido aislado. Por "aislado" se entiende retirado de su ambiente natural. Por ejemplo, para una proteína expresada en el interior de la célula, el aislamiento incluye la preparación de un lisado de células así como las etapas de purificación subsiguientes.

En otro aspecto de la invención, se modifica la región bucle intercadena de la neurotoxina del C. botulinum subtipo E, que es normalmente resistente al cortado proteolítico en la bacteria y los mamíferos, para incluir el emplazamiento de rotura proteolítica insertado, y se usa esta región bucle como la región bucle intercadena en las moléculas de toxina de cadena sencilla o toxina modificada de la presente invención. Se cree que usando el bucle de C. botulinum subtipo E se estabilizará la molécula de toxina no cortada in vivo, haciendo esta resistente a la rotura no deseada hasta que se activa a través del uso de la proteasa seleccionada.

En otro aspecto más de la invención se contemplan las composiciones que comprenden formas recombinantes de BoNT/E expresadas como un polipéptido de cadena sencilla.

En otro aspecto adicional se contemplan los derivados recombinantes de la neurotoxina de clostridios quimérica y/o modificada, expresados como un polipéptido de cadena sencilla. Dicho polipéptido puede ser un transportador mole-
cular, tal como, sin limitación, los que se describen en Dolly y col., Memoria de Patente Europea EP 0 760 681 B1.

En un aspecto adicional, la invención incluye derivados de neurotoxina de clostridios que comprenden al menos una porción de una cadena ligera de neurotoxina de clostridios o subtipo de la misma, y al menos una porción de una cadena pesada de otra neurotoxina o subtipo de neurotoxina, así como los procedimientos para su producción. En una forma de realización, la neurotoxina híbrida puede contener la cadena ligera completa o una cadena ligera de un subtipo de neurotoxina y la cadena pesada de otro subtipo de neurotoxina. En otra forma de realización, un derivado quimérico de neurotoxina puede contener una porción (por ejemplo, la región de enlace) de la cadena pesada de un subtipo de neurotoxina, con otra porción de la cadena pesada siendo de otro subtipo de neurotoxina. De manera similar o alternativa, el elemento terapéutico puede comprender porciones de cadena ligera de diferentes neurotoxinas.

Dichos derivados de neurotoxina híbrida o quimérica son útiles, por ejemplo, como medio para suministrar los beneficios terapéuticos de dichas neurotoxinas a pacientes que son inmunológicamente resistentes para un subtipo de neurotoxina dado, a pacientes que pueden tener una concentración de receptores inferior a la media para el resto que une con una cadena pesada de neurotoxina dada, o a pacientes que pueden tener una variante resistente a la proteasa del sustrato de la toxina de la membrana o la vesícula (por ejemplo, SNAP-25, VAMP y sintaxina). La creación de derivados recombinantes de neurotoxina quimérica o híbrida que tienen una cadena ligera con diferente sustrato podría permitir a dicho pacientes responder a la terapia con neurotoxina.

Con respecto a la resistencia inmunológica, se conoce que la mayor parte de epitopos de neurotoxina se encuentran sobre la porción de cadena pesada de la toxina. De esta manera, si un paciente tiene anticuerpos neutralizantes para, por ejemplo, BoNT/A, una neurotoxina que contenga la cadena pesada de BoNT/E y la cadena ligera de BoNT/A (que tiene una duración más larga de la actividad terapéutica que otras cadenas ligeras de neurotoxina) podría superar esta resistencia. De manera similar, si el paciente tiene células con pocos receptores superficiales para BoNT/A, son mayores las posibilidades de que el mismo paciente pudiera tener receptores adecuados par otro subtipo de BoNT. Creando una neurotoxina híbrida o quimérica (tal como una que contenga al menos una porción de una cadena pesada seleccionada entre el grupo constituido por HC_{A}, HC_{B}, HC_{C}, HC_{D}, HC_{E}, HC_{F} y HC_{G} y al menos una porción de una cadena ligera seleccionada entre el grupo constituido por LC_{A}, LC_{B}, LC_{C}, LC_{D}, LC_{E}, LC_{F}, y LC_{G}) combinando la cadena pesada de este subtipo con la cadena ligera más terapéuticamente apropiada (por ejemplo, la cadena ligera BoNT/A) el paciente podría responder mejor a la terapia con neurotoxina.

Otra ventaja de los derivados de neurotoxina híbrida o quimérica descrita anteriormente se relaciona con el hecho que algunas de las cadenas ligeras (por ejemplo, LC_{A}) tienen una duración de acción larga, teniendo otras una duración de acción corta (por ejemplo, LC_{E} y LC_{F}) mientras otros tienen una duración intermedia de la actividad (por ejemplo LC_{B}). De esta manera, las neurotoxinas híbridas y quiméricas representan la segunda y tercera generación de fármacos en los que la actividad de la neurotoxina puede hacerse a medida de la necesidad o estado terapéutico específico, con diferentes fármacos que tienen diferentes actividades, las especificidades del sustrato o la duración de la actividad.

Dichas neurotoxinas híbridas o quiméricas podrían ser también útiles en el tratamiento de un paciente (tal como un soldado o trabajador de laboratorio) que se haya inoculado con la vacuna BoNT pentavalente. Dichas vacunas no contienen BoNT/F; de esta manera, combinando la cadena ligera apropiada con la cadena pesada BoNT/F se podría crear un agente terapéutico que sea efectivo en dicho paciente cuando las neurotoxinas terapéuticas habituales pueden no serlo.

Puede ser útil la misma estrategia en el uso de derivados de neurotoxina de clostridios con una fracción terapéutica que en una cadena ligera de neurotoxina activa. Como la cadena pesada de dicho agente podría derivarse de una neurotoxina, puede ser ventajoso usar una cadena pesada menos conocida, o más rara, para evitar que los mecanismos de resistencia neutralicen la efectividad del derivado de neurotoxina terapéutica.

Por la misma fórmula, la fracción de enlace puede ser diferente a la fracción de enlace derivada de una cadena pesada de neurotoxina de clostridios, proporcionando de esta manera una función de dirección hacia otros tipos de células diferentes de las neuronas motoras.

Quedan incluidos también en el presente documento los procedimientos para la construcción, expresión, y purificación de dichas moléculas de alto rendimiento como entidades biológicamente activas.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1A es una vista en diagrama del constructo TeTx de cadena sencilla en el plásmido pTrcHisA y la secuencia de nucleótidos de la región de unión.

La Figura 1B muestra el y la secuencia de aminoácidos que conectan el término carboxilo de la cadena L y el término amino de la cadena H y una región bucle diseñada que contiene el emplazamiento de rotura de la enteroquinasa.

La Figura 2A es una representación de un Western blot de un gel SDS-PAGE de extracto celulares de los transformantes de E. coli JM 109 que contienen 2 toxinas recombinantes diferentes de cadena sencilla, antes o después de la inducción de la expresión de la proteína del plásmido con IPTG. El anticuerpo usado para la detección es un anticuerpo monoclonal anti-His_{6}.

La Figura 2B es un Western blot de extractos celulares inducidos por IPTG a partir de células transformadas con el constructo E234 A.

La Figura 3A muestra los resultados de un experimento en el que se corta con enteroquinasa la TeTx de cadena sencilla recombinante purificada por afinidad (SC), a continuación se separa usando SDS-PAGE y se visualiza usando Azul Brillante de Coomassie bajo condiciones de reducción y no reducción.

La Figura 3B muestra los resultados de un experimento en el que se corta con enteroquinasa la TeTx de cadena sencilla recombinante purificada por afinidad (SC), a continuación se separa usando SDS-PAGE bajo condiciones de reducción y no reducción y se somete a un Western blot usando el anticuerpo de cadena pesada anti TeT%X.

La Figura 4 es una representación gráfica del grado de parálisis inducido en una preparación in vitro de nervio/músculo usando TeTx nativo, y antes una neurotoxina recombinante de cadena sencilla, y tras el cortado, como función del tiempo.

La Figura 5 es una representación de los fragmentos de péptido generados tr as la incubación de la cadena TeTx sencilla recombinante con tripsina y la proteasa Arg C, y la deducción, de las secuencias N-terminales de uno de los fragmentos resultantes, de la secuencia de aminoácidos reconocida por estos agentes.

La Figura 6 muestra la digestión de la SC TeTx y la SC R496G TeTx sin cortar con varias concentraciones de tripsina.

La Figura 7 muestra el efecto inhibidor de la inhibición estimulada por TeTx de la liberación del neurotransmisor dependiente de Ca^{++} de células cerebelares en preincubación con la TeTx del mutante E234A.

La Figura 8 muestra el efecto de la liberación del neurotransmisor dependiente de Ca^{++} de las neuronas cerebelares expuestas a la cadena sencilla del mutante E234A nativo recombinante, y al TeTx de cadena sencilla del mutante R496G recombinante.

La Figura 9 muestra el efecto inhibidor de la actividad paralítica estimulada por TeTx de los hemidiafragmas en preincubación de ratón con la TeTx del mutante E234A.

La Figura 10 muestra el esquema para la construcción de un plásmido que codifica la BoNT/E de cadena única, y un electroforetograma en gel de agarosa del fragmento PCR obtenido durante la construcción del plásmido.

La Figura 11 muestra el esquema para la construcción de un plásmido que codifica el E212Q del mutante BoNT/E de cadena sencilla proteolíticamente inactivo, y un electroforetograma en gel de agarosa del fragmento PCR inverso obtenido durante la construcción del plásmido.

La Figura 12 muestra el esquema de expresión y purificación para la BoNT/E recombinante de cadena sencilla, y un electroforetograma SDS-PAGE y el Western blot de las fracciones de purificación.

La Figura 13 muestra los electroforetogramas SDS-PAGE bajo condiciones de reducción y no reducción de la BoNT/E cortada recombinante nativo y del cortado recombinante, y los Western Blot dirigidos hacia las cadenas pesada y ligera de la toxina.

La Figura 14 muestra los resultados de la incubación de la BoNT/E nativa, la BoNT/E cortada recombinante y la no cortada, y el mutante E212Q con el sustrato de la proteasa GST-SNAP-24[140-205].

La Figura 15 muestra el efecto de la liberación del glutamato dependiente de Ca^{++} de la incubación de las células cerebelares con BoNT/E nativa, una BoNT de cadena sencilla recombinante no cortada, y una BoNT/E de cadena sencilla recombinante cortada.

La Figura 16A muestra los efectos sobre la tensión del músculo de los hemidiafragmas de incubación de nervio frénico de ratón con BoNT/E cortada recombinante 0,2 nM (\medcirc) o BoNT/E nativa 0,2 nM (\Box)

La Figura 16B muestra los efectos sobre la tensión del músculo de los hemidiafragmas de incubación de nervio frénico de ratón con BoNT/E no cortada recombinante 1 nM (\medcirc), cortada recombinante (\medbullet) o cortada recombinante 0,05 nM (\nabla).

La Figura 17 muestra la atenuación de la actividad paralítica en hemidiafragmas de preincubación de nervio frénico de ratón con el mutante E212Q inactivo antes de la exposición a la toxina BoNT/E cortada nativa.

Descripción detallada de la invención

Las composiciones y procedimientos de la presente invención implican las neurotoxinas de clostridios modificadas, su síntesis y uso. Se pueden modificar las neurotoxinas de dicadena que se activan normalmente por escisión de un polipéptido de cadena sencilla mediante proteasas indígenas en el nivel del ácido nucleico mediante la alteración o eliminación de la secuencia de nucleótidos que codifica el emplazamiento de rotura de la proteasa indígena y la inserción de una secuencia de nucleótidos que codifica otro emplazamiento de rotura proteolítica diferente resistente a la rotura por la célula huésped o las proteasas humanas. Se diseña la secuencia de aminoácidos insertada para romperse in vitro mediante el uso de un agente de rotura escogido en el avance de la expresión que está ausente del tejido humano y de la célula huésped.

Se puede escoger la secuencia de aminoácidos insertada para conferir susceptibilidad a un agente químico capaz de romper los enlaces péptidos, tal como bromuro de cianógeno. Sin embargo, y de manera mucho más preferible, la secuencia de aminoácidos codificada puede comprender un emplazamiento de rotura proteolítica muy específico para una proteasa seleccionada. La proteasa seleccionada es una que no esté normalmente presente en la célula que expresa la molécula de toxina de cadena sencilla (por ejemplo, E. coli o la bacteria clostridial nativa).

En otro aspecto, la invención se dirige a neurotoxinas de clostridios modificadas de cadena sencilla recombinante que se pueden romper mediante una proteasa para proporcionar una molécula dicadena activa. Dichas neurotoxinas modificadas no necesitan ser tóxicas; en algunas de estas proteínas se puede abrogar la actividad enzimática de la cadena L de la toxina, y unirse la toxina a un fármaco u otro agente bioactivo que tenga actividad terapéutica. De manera alternativa, en algunas otras toxinas modificadas la cadena L es enzimáticamente activa, pero se modifican las porciones de la cadena H para proporcionar especificidad a otras células diana que la diana natural de la neurotoxina, manteniendo a la vez las actividades que estimulan la translocación y la endocitosis de la toxina nativa.

Las neurotoxinas modificadas tales como las descritas en este aspecto de la invención se describen en, por ejemplo, las Publicaciones de Patente Internacional WO 95/32738, WO 99/55359, WO 96/33273, WO 89/07864 y WO 99/17806. La presente invención proporciona versiones de estas moléculas de cadena sencilla que se pueden romper, y procedimientos mejorados para fabricar dichas moléculas.

En otro aspecto, la invención comprende una neurotoxina de clostridios modificada derivada de la toxina del tétanos (TeNT), o uno o más de los subtipos de la toxina del botulismo (BoNT) en los que se ha sustituido la región bucle intercadena que se produce de manera natural con una región bucle modificada que comprende una secuencia de aminoácidos diferente que confiere 1) resistencia a la rotura mediante las proteasas del huésped o la acción autolítica, y/o 2) labilidad a una proteasa seleccionada. De manera preferible el emplazamiento de rotura es muy específico para la proteasa seleccionada.

La región del bucle intercadena de algunas neurotoxinas de clostridios, por ejemplo, BoNT/E, es naturalmente resistente a la rotura proteolítica in vivo. Esta resistencia a la proteasa puede reflejar una estructura secundaria o terciaria que hace el bucle más resistente a las proteasas indígenas que otras neurotoxinas de clostridios. En una forma de realización de la presente invención, por tanto, se sustituye la región del bucle intercadena de BoNT/E por la región del bucle natural que se produce en otra BoNT que tiene mayor actividad terapéutica o duración de acción, por ejemplo, BoNT/A o/B. En otra forma de realización de la invención, se modifica la región del bucle de BONT/E para contener un emplazamiento de rotura proteolítica muy específico para una proteasa seleccionada antes de la subclonación. La anterior región del bucle de BoNT/E muy conservada podría ser resistente a las proteasas indígenas, o las que se encuentran en el interior de un ser humano, pero podría retener la capacidad de activarse mediante la digestión con una proteasa seleccionada.

Esencialmente, la proteasa seleccionada actúa por tanto como un "activador" de la toxicidad de la neurotoxina (o modifica la actividad de la toxina) que se puede añadir tras la expresión recombinante.

La proteasa seleccionada puede ser cualquier proteasa que reconozca una secuencia de aminoácidos específica y rompa un enlace péptido cerca o en la localización, pero es muy preferible que la proteasa seleccionada no sea una proteasa humana tal como tripsina humana, quimotripsina o pepsina, o una proteasa de la célula huésped. Por otra parte, la proteasa seleccionada no debe reconocer la misma secuencia de aminoácidos como las proteasas indígenas. Finalmente, la proteasa seleccionada no deberá ser una expresada por la célula huésped que contenga el plásmido que codifica la neurotoxina recombinante.

Se puede usar cualquier proteasa no humana que reconozca una secuencia de aminoácidos relativamente rara, siempre que se conozca también la secuencia de reconocimiento de los aminoácidos. Los ejemplos de proteasas que se van a seleccionar como activadores pueden incluir cualquiera de los siguientes, sin limitación: enteroquinasa bovina, proteasas de plantas tales como papaína (de Carica papaya) y legumaína, homóloga de la papaína en insectos (del gusano de seda Sitophilus zeamatus) y la homóloga de la papaína en crustáceos (decápodos), la proteasa del virus etch del tabaco (TEV), que rompe la secuencia EXXYXQS/G; GENENASE® de Bacillus amyliquifaciens, que rompe la secuencia HY o YH; y la proteasa PRESCISSION® del rinovirus 3C humano, que rompe la secuencia de aminoácidos LEVLFQGP. Tal como se ha usado anteriormente, la letra X indica cualquier aminoácido.

A no ser que se indique otra cosa, los siguientes términos tienen los siguientes significados en esta materia:

Por "elemento de enlace" se entiende una región de la secuencia de aminoácidos capaz de enlazar de manera preferente con un marcador de superficie celular característico de la célula diana bajo condiciones fisiológicas. El marcador de la superficie celular puede comprender un polipéptido, un polisacárido, un lípido, una glicoproteína, una lipoproteína, o puede tener características estructurales de más de una de estas. Por "actuar de manera preferente" se entiende que la constante de disociación (K_{d}) del elemento de enlace para el marcador de la superficie celular es al menos un orden de magnitud menor que la del elemento de enlace para cualquier otro marcador de superficie celular. De manera preferible, la constante disociación es al menos 2 órdenes de magnitud menor, incluso de manera más preferible la constante de disociación es al menos 3 órdenes de magnitud menor que la del elemento de enlace para cualquier otro marcador de superficie celular al cual se expone la neurotoxina o neurotoxina modificada.

El "elemento de translocación" comprende una porción de una cadena H de neurotoxina de clostridios que tiene una actividad de translocación. Por "translocación" se entiende la capacidad para facilitar el transporte de un polipéptido a través de una membrana vesicular, exponiendo por tanto alguno o todos los polipéptidos al citoplasma.

En las diversas neurotoxinas botulínicas, se piensa que la translocación implica un cambio conformacional alostérico de la cadena pesada producido por una disminución en el pH en el interior del endosoma.

Este cambio conformacional parece implicar y mediarse por la mitad N terminal de la cadena pesad y dar como resultado la formación de poros en la membrana vesicular; este cambio permite el movimiento de la cadena ligera proteolítica del interior de la vesícula endosómica en el citoplasma. Véase por ejemplo, Lacy, y col., Nature Struct. Biol. 5:898-902 (Octubre de 1998).

Las personas expertas en la técnica conocen la secuencia de aminoácidos de la porción que media la translocación de la cadena pesada de neurotoxina botulínica; de manera adicional, se conocen también aquellos residuos dentro de esta porción que se sabe que son esenciales para conferir la actividad de translocación.

Estará también dentro de la capacidad de una persona normalmente experta en la técnica, por ejemplo, el empleo de la mitad del péptido N-terminal que se produce de manera natural de la cadena pesada de cualquiera de los diversos subtipos de neurotoxina de Clostridium tetanus o Clostridium botulinum como elemento de translocación, o el diseño de un elemento de translocación análogo mediante el alineamiento de las secuencias primarias de las mitades N-terminales de las diversas cadenas pesadas y seleccionar una secuencia de translocación primaria consenso basadas en el aminoácido conservado, la polaridad, las características estéricas y de hidrofobicidad entre las secuencias.

El "elemento terapéutico" de la presente invención es un polipéptido que comprende una cadena ligera de neurotoxina de clostridios, o una porción de la misma que retiene la actividad de la endopeptidasa específica de la secuencia de la proteína SNARE de una cadena ligera de la neurotoxina de clostridios. Se han determinado las secuencias de aminoácidos de la cadena ligera de la neurotoxina botulínica (BoNT) subtipos A-G, tal como tiene la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de la neurotoxina del tétanos (TeNT). Cada cadena contiene la plantilla de enlace Zn^{++} con His-Glu-x-x-His (HELIH en TeNT, BoNT/A/B y /E; HELNH en BoNT/C; y HELTH en BoNT/D).

Estudios recientes de la cadena ligera BoNT/A han revelado algunas características importantes para la actividad y especificad de la toxina hacia su sustrato diana, SNAP-25. De esta manera, los estudios de Zhou y col. Biochemistry 34:15175-15181 (1995) indican que cuando la cadena ligera del residuo de aminoácido His_{227} se sustituye con tirosina, el polipéptido resultante es incapaz de romper SNAP-25; Kurazono y col., J. Biol. Chem. 14721-14729 (1992) han llevado a cabo estudios en las neuronas colinérgicas presinápticas del ganglio bucal de Aplysia californica usando la cadena ligera de BoNT/A recombinante que indican que la eliminación de 8 residuos N-terminales o de 32 C-terminales no eliminan la toxicidad, pero que la eliminación de 10 residuos N-terminales o 57 C-terminales eliminan la toxicidad en este sistema. De manera más reciente se ha resuelto la estructura cristalina de la holotoxina BoNT/A completa, se indica que el emplazamiento activo está implicado en la participación de His_{222}, Glu_{223}, His_{226}, Glu_{261} y Tyr_{365}. Lacy y col., más arriba (Estos residuos corresponden a His_{223}, Glu_{224}, His_{227}, Glu_{262} y Tyr_{366} o la cadena L de BoNT/A de Kurazono y col., más arriba.) De manera interesante, un alineamiento de BoNT/A a través de las cadenas ligeras E y TeNT revela que cada una de dichas cadenas tiene, de manera invariable, estos residuos en posiciones análogas a BoNT/A. Kurazono y col., más arriba.

La región catalítica de BoNT/A es muy específica para el término C de SNAP-25 y parece necesitar un mínimo de 17 aminoácidos de SNAP-25 para producirse la rotura. El emplazamiento catalítico se parece a un bolsillo; cuando la cadena ligera se enlaza a la pesada mediante el enlace disulfuro entre Cys_{429} y Cys_{453}, la región de translocación de la cadena pesada parece bloquear el acceso al bolsillo catalítico hasta que la cadena ligera consigue entrar en el citosol. Cuando se reduce a continuación el enlace disulfuro, el bolsillo catalítico se "abre" y la cadena ligera se activa de manera completa.

Tal como se ha descrito anteriormente, VAMP y la sintaxina se rompen mediante BONT/B, D, F, G y TeNT, y BoNT/C_{1}, respectivamente, mientras que SNAP-25 se rompe mediante BoNT/A, E y C1.

Se conocen las especificidades del sustrato de diversas cadenas ligeras de neurotoxina de clostridios diferentes de BoNT/A. Por tanto, la persona normalmente experta en la técnica podrá determinar fácilmente los residuos de toxina esenciales en estos subtipos para la rotura y el reconocimiento del sustrato (por ejemplo, mediante la mutagénesis dirigida al emplazamiento o la delección en diversas regiones de la molécula de toxina, seguida por el ensayo de la actividad proteolítica y la especificidad del sustrato) y podría por tanto diseñar fácilmente variantes de la cadena ligera de la neurotoxina nativa que retengan o carezcan de la misma o similar actividad.

En una forma de realización particularmente preferida, la neurotoxina de cadena ligera o derivado de la neurotoxina de la invención, alterada tal como se ha indicado anteriormente, se modifica de manera adicional para eliminar otros emplazamientos proteolíticos endógenos incidentales, tales como aquellos que rompe la tripsina, Arg C proteasa, quimotripsina, o proteasas de la célula huésped. Tal como se indica a continuación, la modificación de las secuencias primarias de aminoácidos en estas regiones que confieren resistencia a la proteasa puede aumentar el rendimiento de la neurotoxina y reducir la toxicidad de la neurotoxina de cadena sencilla antes de la rotura y activación.

Son bien conocidas por los expertos en la técnica las secuencias de aminoácidos reconocidas por muchas proteasas, y su especificidad a la rotura. De esta manera, el diseño de un emplazamiento de rotura proteolítica específica en la región bucle de las porciones de cadena L y H de la toxina de cadena sencilla, y la modificación de los emplazamientos incidentales de la proteasa en el polipéptido para que sea resistente a la proteasa es una forma rutinaria de comparar las secuencias de especificidad y reconocimiento para diversas proteínas. En el primer caso, la especificidad de un emplazamiento proteolítico candidato no necesita ser totalmente exclusiva, sino que necesita simplemente excluir los emplazamientos de rotura para las proteasas de la célula huésped y/o humana que pueden estar presentes durante el manejo, el almacenamiento y la purificación de la neurotoxina de cadena sencilla. Por supuesto, es preferible que el emplazamiento de la proteasa sea tan específico como sea posible. En el último caso, la modificación del emplazamiento de rotura proteolítica necesita únicamente ser suficiente para volver al emplazamiento resistente al proteasa activadora y para las proteasas de la célula huésped y humana.

En otra forma de realización preferida, se modifica de manera adicional la neurotoxina de cadena sencilla modificada recombinante uniendo la cadena a una etiqueta de enlace que comprende un miembro de un complejo de enlace específico. Por "complejo de enlace específico" se entiende dos o más entidades químicas o bioquímicas que enlazarán una con respecto a la otra bajo condiciones ambientales definidas y que no enlazarán de manera significativa con otras entidades químicas o bioquímicas presentes en el medioambiente bajo las mismas condiciones. Los ejemplos de miembros de un complejo de enlace específico incluyen, sin limitación, un anticuerpo y su antígeno, una lectina y su carbohidrato diana, una cadena de ácido nucleico y su cadena de ácido nucleico complementaria, un receptor superficial celular y su ligando, un metal y un compuesto capaz de formar un complejo de coordinación o quelación con este metal, y similares.

En esta forma de realización se puede unir la etiqueta de enlace con la toxina de cadena sencilla mediante un ligante, de manera preferible un ligante que se puede romper. Los ejemplos de ligantes posibles, aunque no en una lista exhaustiva, incluyen 1) ácidos dicarboxílicos alifáticos de fórmula HOOC-(CH_{2})_{n}-COOH, en los que n = 1-12 (se pueden enlazar a un grupo amino libre); 2) HO-(CH_{2})_{n}-COOH, en el que n > 10 (adecuado para la unión en el término amino del polipéptido), 3) estructuras de polibenceno sustituido, y 4) un ligante del éster de una N-hidroxisuccinimida (NHS). El uso de un ligante que contiene un éster permite la rotura del ligante del éster tras su uso en la purificación de la neurotoxina de cadena sencilla bajo condiciones ácidas relativamente suaves.

De manera alternativa, y muy preferiblemente, la etiqueta de enlace puede comprender alguna o todas las secuencias de aminoácidos de un polipéptido apropiadamente escogido coexpresado con la toxina de cadena sencilla como una proteína de fusión; dichos polipéptidos pueden comprender, sin limitación, la región de enlace de la maltosa de la proteína de enlace de la maltosa (MBP); una etiqueta His_{6} (una migración de 6 residuos de histidina); la región de enlace de la calmolidina de la proteína de enlace de la calmodulina; y la región de enlace del glutatión-S-transferasa. Son bien conocidas por aquellos expertos en la técnica otras etiquetas de enlace de polipéptidos, y se pueden adaptar fácilmente para el uso en la presente invención.

De manera adicional, se puede construir la etiqueta de enlace para que tenga un emplazamiento de rotura de la proteasa entre sí misma y cualquier término amino o término carboxilo de la toxina de cadena sencilla, de forma que se pueda eliminar tras la purificación del péptido. Se puede diseñar el emplazamiento de rotura proteolítica que se va a romper mediante la proteasa activadora escogida para cortar la toxina de cadena sencilla entre las cadenas H y L.

Es por tanto un objetivo de la invención proporcionar una molécula de neurotoxina de cadena sencilla activable por recombinación que tenga actividad reducida en comparación con la neurotoxina nativa hasta la activación mediante la reacción de una proteasa no clostridial. La neurotoxina de cadena sencilla se purifica más fácilmente, es menos peligrosa de manipular durante el procedimiento de purificación, y se puede modificar de manera opcional para proporcionar las propiedades más deseables de la toxina.

Es también un objetivo de la invención proporcionar un procedimiento para fabricar una neurotoxina de cadena sencilla activable recombinante modificando la secuencia de nucleótidos que codifica la neurotoxina para sustituir la secuencia de rotura proteolítica de los aminoácido nativos separando las cadenas H y L con una secuencia de aminoácidos estable a las proteasa de la célula huésped o de los clostridios indígenas pero susceptible a la rotura in vitro por la proteasa escogida.

Es un objetivo adicional de la presente invención proporcionar polipéptidos de neurotoxina más estables mediante la modificación de la secuencia de nucleótidos de la región que codifica las cadenas H y L de la misma, eliminando los emplazamientos de rotura proteolítica incidentales produciendo la sustitución de los aminoácidos lábiles con otros residuos de aminoácidos que confieren resistencia a la toxina frente a la degradación proteolítica no deseada.

De manera adicional, es un objetivo de la invención proporcionar procedimientos de purificación de neurotoxinas recombinantes en forma de cadena sencilla uniendo la neurotoxina de cadena sencilla expresada a una fracción de enlace que comprende el compañero de un complejo de enlace específico que se puede usar en la purificación por afinidad con el compañero de enlace que comprende la otra mitad del complejo de enlace. Se puede llevar a cabo la purificación en lotes o en una columna de cromatografía. A continuación puede eliminarse la fracción de enlace tras la etapa de afinidad, y separarse de la neurotoxina.

Es también un objetivo de la invención proporcionar moléculas de neurotoxina modificada recombinante de cadena sencilla para uso como agentes terapéuticos. Las moléculas de neurotoxina modificada pueden tener una especificidad diana alterada o una actividad alterada en comparación con la neurotoxina nativa de la cual se derivan, o ambas.

Es también un objetivo de la invención proporcionar una neurotoxina de cadena sencilla que se activa por recombinación que se pueda purificar más fácilmente que la neurotoxina del tipo salvaje. Dicha neurotoxina permite la preparación a gran escala de toxinas muy puras correctamente plegadas para uso clínico.

Los siguientes Ejemplos sirven para ilustrar las formas concretas de realización de la invención, y no limitan en ningún modo el alcance de la invención definido en las reivindicaciones.

Ejemplo 1 Construcción de un vector de expresión que contiene una región que codifica TeTx de cadena sencilla

Se puede ejemplificar la presente invención describiendo la construcción de un plásmido que expresará TeTx en E. coli como una proteína sencilla que se purifica fácilmente, es decir, mediante cromatografía de afinidad. Se puede escoger TeTx como sistema piloto debido (i) a la disponibilidad de una vacuna excelente que reduce grandemente el riesgo de su manipulación y (ii) es la más comprehensiblemente estudiada de las toxinas en términos de expresión de las regiones HC y LC. Sin embargo, las personas expertas en la técnica entenderán que se pueden emplear estrategias iguales o análogas usando cualquier dicadena o toxina binaria u otra molécula bioactiva expresada como un polipéptido sencillo y activada mediante rotura proteolítica. Se construyeron las moléculas de cadena sencilla que contenían la cadena TeTx de tipo salvaje y una versión mutada de la cadena ligera TeTx en la que se cambió un residuo de ácido glutámico en la posición 234 por una alanina (denominada "E234A", Ala^{234}, o "la cadena ligera del mutante E234A"), respectivamente. Esta última mutación da como resultado una cadena ligera TeTx inactiva, y se construyó un plásmido que codifica la cadena ligera del mutante E234A (pMAL-E234A) tal como se describe en Li y col., Biochemistry 33:7014-7020 (1994) incorporado por tanto por referencia en el presente documento). Se usó el siguiente protocolo para la construcción de cada toxina de cadena sencilla.

Se modificó el vector pTrcHisA, comercializado por Invitrogen, usando un kit de mutagénesis dirigida al emplazamiento Stratagene QuickChange® (para las técnicas de mutagénesis dirigida al emplazamiento, véase Smith y col., J. Biol. Chem. 253:6651-6560 (1979); incorporado por referencia en el presente documento en su totalidad) para crear dos emplazamientos de restricción extra (SalI y HindIII) corriente arriba de los nucleótidos que codifican un emplazamiento de rotura de la enteroquinasa preexistente (EK). El plásmido contiene también un codón de inicio de traducción (ATG) seguido por una serie de codones que codifican 6 residuos de histidina inmediatamente corriente arriba del emplazamiento de rotura de la enteroquinasa. Un emplazamiento de clonación múltiple que contiene los emplazamientos de rotura Bam HI, XhoI, Bgl II, Pst I, Kpn I, Eco RI BstB I y Hind III, se localiza inmediatamente corriente abajo del emplazamiento EK; se eliminó el emplazamiento Hind III mediante mutagénesis dirigida al emplazamiento. Se emplearon los siguientes cebadores para insertar los emplazamientos de restricción (subrayados) corriente arriba del emplazamiento de rotura EK:

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El plásmido resultante contiene los emplazamientos Sal y Hind III localizados en el lado 5' de la secuencia de nucleótidos que codifica el emplazamiento de rotura de la enteroquinasa bovina (EK).

La secuencia de nucleótidos que codifica la cadena TeTx de tipo salvaje se obtiene del plásmido pMAL-LC, descrito en Li y col., Biochemistry 33, 7014-7020 (1994), incorporado por referencia en el presente documento. El plásmido codifica la cadena ligera TeTx en forma de proteína de fusión con la proteína de enlace de la maltosa (MBP) localizada inmediatamente corriente arriba de la secuencia que codifica la cadena L. Las porciones de cadena MBP y L de la proteína de fusión se diseñan para contener el emplazamiento de rotura del factor Xa de coagulación de la sangre humano (Ile-Glu-Gly-Arg) para facilitar la eliminación de la MBP una vez se ha llevado a cabo la purificación por afinidad.

El fragmento de ADN que contiene la secuencia que codifica la cadena L se escinde del plásmido pMAL-LC digiriendo el plásmido con Sal y Hind III, purificando en gel el fragmento de ADN resultante que contiene la cadena L, y ligando este fragmento en el plásmido pTrcHisA en los emplazamientos Sal y Hind III creados de nuevo corriente arriba del emplazamiento EK. Este fragmento da como resultado la excisión de las secuencias de proteína que enlazan la maltosa del término N de la cadena L.

Se usó un procedimiento idéntico para subclonar el fragmento de ADN que contiene una cadena L mutante procedente del plásmido pMAL-LC-Ala^{234}, en el que se hace un cambio en la cadena de aminoácidos sencilla en el aminoácido 234 de la cadena L, sustituyendo el ácido glutámico nativo con alanina. Este cambio es suficiente para abrogar la actividad de la endopeptidasa de zinc de la cadena L, y para volver no tóxica una toxina te tétanos reconstituida que contiene la cadena H nativa y la cadena Ala^{234}L.

Se obtiene el fragmento de ADN que contiene la cadena H a partir del plásmido pMAL-HC; se describe la construcción de este vector en Li y col., J. Biochem. 125:1200-1208 (1999), incorporado por tanto por referencia en el presente documento. De manera breve, se construyó el gen que codificaba la cadena H juntando tres fragmentos de ADN que contenían diferentes porciones de la secuencia que codifica la cadena H que se había clonado en plásmidos separados. Se amplificaron en primer lugar los fragmentos que comprenden la mitad amino terminal de H usando los procedimientos de la reacción en cadena de la polimerasa (véase, por ejemplo, Mullis, Patente de los Estados Unidos Nº 4.683.202 y Mullis y col., patente de los Estados Unidos Nº 4.800.159 , incorporadas ambas por referencia en el presente documento en su totalidad) y los siguientes cebadores: se usaron cebadores PCR a (que contienen un emplazamiento de rotura Xba I) y b (que contienen un emplazamiento de rotura Bgl II) (SEC DE ID Nº: 3 y 4, respectivamente) para amplificar el fragmento de cadena H contenido en un plásmido denominado pTet8; se usaron cebadores PCR c (que contiene un emplazamiento de rotura Bgl II) y d (que contienen un emplazamiento de rotura Hind III y un Sal I) (SEC DE ID Nº: 5 y 6, respectivamente) para amplificar el fragmento de la cadena H contenido en un plásmido denominado pTet14. Se proporcionan a continuación las secuencias de nucleótidos de este cebador, con los emplazamientos de restricción subrayados.

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\newpage

Tras la amplificación mediante PCR y purificación en gel de los fragmentos de la cadena H amplificados, se digirió cada fragmento con Bgl II y se ligaron para dar como resultado la mitad N terminal completa de la región de codificación de la cadena H. Se digirió a continuación este producto de ligadura con Xba I y Hind III y se subclonó en el emplazamiento de clonación múltiple de pMAL-c2-T (cortándose también el plásmido con Xba I y Hind III), que se localizó corriente abajo de la región que codifica MBP y el emplazamiento del factor Xa. pMAL-c2 es un vector comer-
cialmente disponible bien conocido por las personas expertas en la técnica. El plásmido resultante es pMAL-H_{N}.

Se ensambló como sigue la región que codifica la cadena H completa. Se digirió el plásmido pMAL-H_{N} con Sac I y Sal I para dar como resultado el fragmento de ADN que codifica el término N de la cadena H. se digirió el plásmido pTet215 con Sal I y Bam HI para dar como resultado el fragmento de ADN que codifica el término carboxilo de la cadena H. Se digirió el vector pMAL-c2-T con Sac I y Bam HI, y se ligó con los fragmentos de la cadena H digeridos, que se juntarán en la orientación apropiada debido al uso de distintas endonucleasas. El plásmido resultante es pMAL-HC.

Los fragmentos de ADN que codifican las cadenas H y L (que incluyen la cadena Ala^{234}L) se cortan y purifican directamente a partir de los constructos pMAL-LC o pMALE234A y pMAL-HC, y se subclonan en el vector pTrHisA modificado descrito anteriormente. Se ligó en primer lugar esta cadena H en el vector modificado en el emplazamiento Bam HI inmediatamente corriente abajo del emplazamiento EK, y el plásmido resultante se purificó en gel. Tras la digestión de este plásmido con Hind III y Sal I, se ligó la cadena L en una posición justo corriente arriba del emplazamiento de rotura EK.

El constructo del plásmido resultante contiene la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de la toxina de cadena sencilla, que comprende (desde el término amino al carboxilo): seis residuos de histidina (la etiqueta His), seguidos por la cadena L, un emplazamiento de rotura de la enteroquinasa, y la cadena H. Se muestra a continuación la unión traducida entre las cadenas L y H que contiene el emplazamiento de rotura EK (DDDDK) (en la dirección desde el término N al término C) y en la Figura 1.

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Para permitir la expresión de dos cadenas en forma de unidad sencilla, se eliminó una secuencia de nucleótidos que comprendía un codón de parada presente en el extremo 3' de la secuencia que codifica la cadena L en el pMAL-LC mediante mutagénesis dirigida al emplazamiento usando dos cebadores (SEC DE ID Nº: 8 y 9), dando como resultado un marco de lectura sencillo que contiene las cadenas H y L.

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Se transformó el constructo basado en el pTrcHisA resultante en la cepa de E. coli JM109 mediante shock térmico usando el procedimiento de Hanahan, y se aislaron las colonias transformantes sobre placas de agar Luria que contenían 100 \mug de ampicilina. Se purificaron los plásmidos procedentes de estos transformantes y se confirmaron las inserciones mediante la digestión analítica con endonucleasa de restricción y electroforesis en gel de agarosa.

Ejemplo 2 Expresión y caracterización física de TeTx de cadena sencilla

Se indujo la expresión del constructo TeTx de cadena sencilla basado en pTrcHisA (bajo el control de un promotor trp/lac híbrido) mediante la adición de IPTG 1 mM (isopropil tio-galactopiranósido) hasta un cultivo confluente de un clon transformante representativo en 200 ml de caldo de Luria que contenía 100 \mug/ml de ampicilina e incubando de manera adicional a 37ºC durante 16 horas antes de la cosecha celular mediante centrifugación.

Se volvieron a suspender los residuos celulares en 30 ml de Tampón A (Na_{2}PO_{4} 20 mM, NaCl 500 mM (pH 7,8)), a continuación se lisaron mediante ultrasonicación a 4ºC, usando períodos de 10 segundos en un medio de sedimentación. Se eliminaron los residuos insolubles mediante centrifugación a 9.000 X g durante 30 min a 4ºC, y se recuperó el sobrenadante mediante centrifugación.

Se incubó el sobrenadante que contenía cada constructo de cadena sencilla durante 20 minutos a 22ºC con 2 ml de resina iónica de níquel (Invitrogen Corp.) para la purificación por afinidad por medio de quelación entre los residuos de histidina en el término amino de la molécula de toxina de cadena sencilla y el níquel. A continuación se cargaron las resinas sobre minicolumnas y se lavaron con 200 ml de tampón de lavado (Na_{2}PO_{4} 20 mM, NaCl 500 mM (pH 6,0)) para eliminar cualquier material de enlace no específico, se eluyeron las proteínas de cadena sencilla recombinante en fracciones de 0,5 ml con 8-15 ml de imidazol 100 mM en Tampón A. Se midió la concentración de las cadenas sencillas eluidas mediante el ensayo de proteínas de Bradford (Bio-Rad Laboratorios); se recuperó aproximadamente 1 miligramo de la proteína de fusión.

Ejemplo 3 Análisis SDS-PAGE y Western Blot de TeTx de cadena sencilla recombinante

Se hacen crecer los constructos TeTx de cadena sencilla en caldo de Luria que contiene ampicilina a 37ºC, se toman alícuotas antes y después de la inducción de la expresión de la proteína con IPTG. Se prepararon extractos celulares crudos para SDS-PAGE mediante dilución en un tampón de muestra bajo condiciones reducidas en presencia de \beta-mercaptoetanol (BME). Tras la electroforesis SDS-PAGE, las proteínas separadas se sometieron a Western blotting como sigue: se transfirieron las proteínas electroforéticamente a una membrana de disulfuro de polivinilideno (PVDF) usando procedimientos estándar (véase, por ejemplo., Sambrook y col., Molecular Cloning. A Laboratory Manual (2ª ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989), incorporado por tanto por referencia en su totalidad), se trató la membrana para reducir el enlace Ig de fondo, y a continuación se sondaron usando un anticuerpo anti-His_{6}, seguido por la detección usando un anticuerpo secundario conjugado con fosfatasa alcalina y desarrollo con un sustrato de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato/azul de tetrazolio nitro.

Tal como se muestra en la hileras 1 y 2 de la Figura 2A, el Western blot no reveló expresión de TeTx detectable antes de la inducción de la síntesis de la proteína; por contra, se reveló una banda sencilla de un peso molecular aproximado de 150 kDa en las alícuotas tomadas tras la inducción de la proteína (Véase hileras 3 y 4). En la Fig 2A, las hileras 1 y 3 son el constructo de cadena sencilla WT y las hileras 2 y 4 contienen el constructo del mutante E234A.

La Fig. 2B es un Western blot de los extractos celulares inducidos por IPTG de células transformadas con el constructo E234A. De manera significativa, no se observaron productos de rotura proteolítica discernibles de peso molecular bajo de la cadena ligera, que proporcionan evidencia de la estabilidad relativa de la toxina de cadena sencilla tras la expresión y la purificación.

La Figura 3 muestra los resultados de un segundo experimento, en el que se cortó la afinidad de la TeTx de cadena sencilla recombinante purificada (SC) con enteroquinasa como sigue. Se incubaron treinta microgramos de la toxina de cadena sencilla purificada con 1 unidad de enteroquinasa en una solución que contenía Tris-HCl 50 mM (pH 8,0) CaCl_{2} 1 mM y Tween-20 al 0,1% (v/v). Como control, se incubó la proteína recombinante en la misma mezcla de reacción que no contenía EK. Se sometieron estas muestras, más una alícuota de TeTx nativo (no recombinante) a SDS-PAGE en un gel de poliacrilamida al 8% bajo condiciones de reducción (+BME) o no reductoras (-BME). Se usó el gel resultante para un Western blot y la detección subsiguiente usando anticuerpos anti-H reivindicados (Fig 3B), y tiñendo de manera directa con Azul de Coomassie (Fig 3A).

Tal como se indica por la Figura 3, las tres muestras bajo condiciones no reductoras (TeTX Nativa (Hilera 1), la toxina recombinante no cortada (Hilera 2), y la toxina recombinante cortada con enteroquinasa (Hilera 3)) migrarán como dobletes (conformadores aparentemente diferentes que se resuelven en una banda sencilla tras la reducción) con pesos moleculares aparentes esencialmente indistinguibles de aproximadamente 150 kDa. El gel no reductor confirma que 1) se obtienen altos niveles de expresión, 2) los enlaces disulfuro que enlazan las cadenas ligera y pesada están completamente formados, y 3) la toxina de cadena sencilla recombinante no esta sujeta a degradación proteolítica observable.

Por contra, bajo condiciones de reducción, las toxinas recombinantes cortada y de tipo salvaje dieron como resultado una cadena H que tiene un peso molecular de aproximadamente 100 KDa mediante tanto con Western blot como con tinción de Coomassie. De manera adicional, en el gel teñido con Coomassie, esta muestras muestran también una especie de peso molecular bajo de aproximadamente 50 kDa, que corresponde a la cadena L. La cadena L de tipo salvaje migrará con un peso molecular aparente más bajo que el de la cadena L recombinante, que tiene 22 residuos de aminoácidos adicionales debido a la presencia de la fracción His_{6} y a la región de unión intercadena que contiene el emplazamiento de rotura EK modificado. La toxina recombinante no cortada (Hilera 2) migra como una banda sencilla con un peso molecular aparente de aproximadamente 150 kDa. De manera notable, no se han visto trazas de la toxina no cortada en la hilera 3, lo que indica la efectividad del tratamiento con enteroquinasa.

Ejemplo 4 Parálisis inducida por la toxina in vitro mediante la TeTx de cadena sencilla recombinante

Se examinó también la actividad biológica de la TeTx recombinante y se comparó con la toxina de tipo salvaje usando hemidiafragma de nervio frénico de ratón, ya que se sabe que la toxina nativa produce parálisis neuromuscular, no obstante a concentraciones más altas que las que actúan en el SNC. Para este experimento se diseccionó el hemidiafragma del nervio frénico izquierdo de ratón (cepa T/O, 4 semanas de edad y \sim 20 g de peso) y se transfirió de manera inmediata a un sistema de superfusión circulatorio cerrado que contenía 10 ml de solución Krebs-Ringer (NaCl 118 mM, KCl 4,7 mM, MgSO_{4} 1,2 mM, CaCl_{2} 2,5 mM, NaHCO_{4} 23,8 mM, KH_{2}PO_{4} 1,2 mM, glucosa 11,7 mM (pH 7,4), se burbujeó con O_{2} al 95% y CO_{2} al 5% y se suplementó con albúmina de suero bovino al 0,1% (p/v) para disminuir la adsorción no específica de las toxinas (Li y col., Biochemistry 33:7014-7020 (1994)). Se mantuvieron los hemidiafragmas en un baño que contenía 10 ml de tampón Krebs-Ringer a 37ºC durante 10 minutos antes de exponerse a 4 o TeTx 10 nM (\ding{116} y \Delta, respectivamente) o TeTx recombinante cortada 10 nM (\medbullet) o TeTx recombinante no cortado 10 nM, respectivamente (\medcirc). (Véase Figura 4).

Se estimularon las contracciones locales menores del músculo mediante la estimulación supra-máxima del nervio frénico con electrodos bipolares y se registró mediante un transductor de fuerza-desplazamiento (Lectromed, Reino Unido) conectado a un amplificador y a un sistema de ordenador (MacLab, AD Instruments, Reino Unido). Los parámetros de la estimulación del nervio son ondas cuadradas de 2 Hz de 0,1 ms de duración con una amplitud de 1,5-2,5 V. Se cuantificó la transmisión muscular de la parálisis inducida por la toxina como el tiempo necesario de contracción del músculo estimulada por el nervio para disminuir a un 10% (reducción del 90%) del valor original.

Tal como se muestra en la Figura 4, se encontró que la TeTx cortada recombinante 10 nM era tan potente como la toxina nativa 10 nM en el bloqueo de las contracciones locales menores del músculo inducidas por el nervio, dando como resultado en las preparaciones una reducción del 90% en la tensión del músculo en aproximadamente 170 minutos. De esta manera, esta nueva preparación de TeTx expresada en E. coli a alto nivel en forma de polipéptido activable de cadena sencilla y purificado mediante una etapa simple de cromatografía de afinidad demostró ser completamente activo en todos los criterios examinados.

Por contra, 10 nM de la preparación TeTx no cortada requieren aproximadamente tanto como dos veces para reducir la tensión del músculo y fue aproximadamente tan activo como 4 nM de la TeTx de tipo salvaje. Como control, se incubaron los hemidiafragmas con tampón KR y se encontró que la cantidad traza de enteroquinasa presente en las muestras experimentales mostró una disminución despreciable en la tensión del músculo durante 5 h.

De esta manera, este experimento indica que la TeTx no cortada es considerablemente menos tóxica que cualquiera de las proteínas cortadas recombinantes o de tipo salvaje in vitro.

Ejemplo 5 La modificación adicional de la TeTx de cadena sencilla para eliminar emplazamientos de rotura proteolítica reduce la toxicidad de la toxina recombinante no cortada

Aunque la forma de TeTx de cadena sencilla recombinante no cortada presenta toxicidad reducida en comparación con la forma cortada, la actividad de la toxina residual aumenta de manera probable a partir de la activación de la toxina mediante proteasas adicionales in vivo. Para ensayar esta posibilidad, se identificaron los emplazamientos en la molécula de toxina de cadena sencilla susceptibles de rotura proteolítica mediante tripsina y Arg C proteasa mediante la incubación de TeTx de cadena sencilla con estos enzimas como sigue. Se incubaron cincuenta microgramos \mug de Arg-C a 37ºC durante 4 h; 0,1 \mug de tripsina a 37ºC durante 0,5 h; o tampón sin proteasa como control. Se terminaron estas reacciones mediante la adición de un tampón muestra de SDS-PAGE que contenía SDS al 0,1%, seguido por una transferencia electroforética Western a una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF). Se emborronó la membrana con IgG específico para la etiqueta His_{6} y se detectó usando un sistema de tinción de peroxidasa de rábano picante.

Tal como se muestra en la Figura 5, el Western blot revela que la tripsina y la Arg C proteasa dan como resultado un fragmento de cadena L (y por tanto una cadena H) del mismo tamaño. De manera adicional, la transferencia de un gel duplicado se tiñó para la proteína con rojo de Ponceau y se escindió la banda de la cadena H de peso molecular aproximado de 100 kDa de cada hilera y se analizó mediante secuenciamiento N-terminal.

En la TeTx de cadena sencilla recombinante se enlazaron LC y HC mediante 17 aminoácidos (GEKLYDDDDK
DRWGSSR), seguido por el comienzo de la secuencia H (SLTDLGGEL…). El secuenciamiento del aminoácido N-terminal del fragmento más grande producido por la tripsina y la Arg C proteasa revela que los primeros 5 aminoácidos de la proteína del producto de rotura de la Arg C proteasa y la tripsina de 100 kDa son SLTDL; de esta manera, estas proteasas parecen romper la toxina de cadena sencilla entre el enlace R-S (véase la Figura 1) con el fin de liberar la cadena H y la cadena L que contienen el ligante EK y su término C, dando como resultado por tanto esta variante una toxina de dicadena esencialmente idéntica a la toxina cortada EK.

\newpage

La arginina en el término carboxi de la secuencia ligante EK se muta mediante mutagénesis dirigida al emplazamiento de una glicina (R496G), y el polipéptido de la toxina de cadena sencilla resultante se expresa y purifica tal como anteriormente.

La valoración de 6 microgramos de la toxina de cadena sencilla mutada R496G (WT LC) y la SC TeTx que carece de dicha mutación frente a 0, 0,01, 0,1, 1, 10 \mug de tripsina, seguida por SDS-PAGE y la tinción con Azul Brillante de Coomassie, dan como resultado el modelo de rotura visto en la Figura 6. Tal como se puede ver, ambas moléculas de cadena sencilla son susceptibles a la rotura con tripsina; sin embargo, el mutante R496G da como resultado menos fragmentos que la toxina SC que no contiene una mutación en la región bucle entre las cadenas. Por ejemplo, Aunque pueden verse claramente tres bandas de péptidos de tripsina próximas a la banda de la cadena ligera tras la rotura con tripsina de la toxina SC WT, únicamente se ven dos de dichas bandas en la digestión de R496G.

El hecho de que existan emplazamientos de tripsina que permanecen en la toxina SC del mutante R496G tiene en cuenta de manera probable el hecho que este mutante no produce la disminución de la toxicidad en comparación con la toxina SC no cortada; ambas preparaciones dan valores similares en los ensayos de letalidad y parálisis neuromuscular en ratón descritos anteriormente.

Se usó un sistema de ensayo diferente para medir la actividad de la neurotoxina hacia las neuronas del SNC, las células naturalmente afectadas por TeTx. Las células usadas son neuronas cerebelares; se disociaron estas células a partir del cerebelo de ratas de 7 días de edad. Se suspendieron las neuronas a 1-2 x 10^{6}/mL en medio constituido por 3 partes de Medio Eagle Basal y 1 parte de un tampón constituido por HEPES-NaOH 40 mM (pH 7,3), KCl 78,4 mM, D-glucosa 37,6 mM, CaCl_{2} 2,8 mM, MgSO_{4} 1,6 mM y NaH_{2}PO_{4} 1,0 mM, así como un suplemento de 1 x N2, L-glutamina 1,0 mM, 60 unidades/mL de penicilina, 60 \mug/mL de estreptomicina y suero de caballo dializado al 5% (v/v). Se añadió un mililitro de esta suspensión celular a unos pocillos recubierto con poli-D-lisina de 22 mm de diámetro. Se añadió citosina \beta-D-arabinofuranósido (Ara-C, 40 \muM) tras 20-24 horas en el cultivo con CO_{2} al 5% (v/v) y se mantuvieron las neuronas mediante la sustitución semanal del medio anteriormente señalado que contenía 40 \muM de Ara-C.

Para cada ensayo se cultivaron las neuronas in vitro durante al menos 10 días, se lavaron cuatro veces con tampón de Krebs-Ringer HEPES gasificado con O_{2} (KRH, mM: 20 HEPES.NaOH pH 7,4, 128 NaCl, 5KCl, 1 NaH_{2}PO_{4}, 1,4 CaCl_{2}, MgSO4 1,2 mM, 10 D-glucosa y 0,05 mg/mL de BSA), y se añadieron 0,5 mL del último tampón que contiene 0,25 \muCi/mL [^{14}C]-glutamina (es decir, el precursor de glutamato). Se llevaron a cabo todas las etapas a 37ºC. tras un período de marcado de 45 minutos, se elimino el medio y se lavaron las neuronas cuatro veces como anteriormente. Se incubaron el control y las neuronas tratadas con toxina durante 5 minutos a 37ºC en tampón KRH que contenía cualquiera de Ca^{2+}1,4 mM o EGTA 0,5 mM (es decir, para evaluar la liberación independiente de Ca^{2+}); a continuación se eliminaron las alícuotas y se retuvieron para la evaluación del contenido de [^{14}C]-glutamato mediante conteo por centelleo. Inmediatamente después de la eliminación del medio basal anterior se añadieron un tampón KRH modificado que contenía KCl 50 mM (que contenía un contenido disminuido de NaCl 83 mM con el fin de mantener un potencial osmótico normal) y cualquiera de 1,4 Ca^{2+} o EGTA 0,5 mM durante un período de estimulación de 5 minutos. Finalmente, se solubilizaron las neuronas con EGTA.NaOH 20 mM pH 7,5 que contenía SDS al 1% (p/v), y se sometieron las alícuotas al conteo por centelleo con el fin de calcular sus contenidos radioactivos remanentes. Las cantidades de ^{14}C-glutamato en las muestras basales y estimuladas se expresa como porcentajes en relación con el contenido celular total calculado. El porcentaje de [^{14}C]-glutamato contenido en el tampón que contiene EGTA se resta de los valores registrados en las muestras que contienen Ca^{2+} con el fin de calcular el componente dependiente de Ca^{2+} relevante de la liberación y a su vez, las últimas lecturas basales se restan de los valores obtenidos para las muestras de KCl 50 mM para dar como resultados el componente de liberación del glutamato dependiente de Ca^{2+} estimulado por K^{+}.

La Figura 8 demuestra la capacidad de la toxina recombinante para inhibir la liberación del neurotransmisor. Se lavaron dos veces las neuronas cerebelares, mantenidas durante 10 días in vitro, con tampón KRH enfriado en hielo que contenía Mg^{2+} 5mM y Ca^{2+} 0,5 mM, a continuación se expusieron en este tampón a las concentraciones especificadas de TeTx nativa (\medbullet) R496G de TeTx cortada en EK (\medcirc), TeTx no cortada de cadena sencilla (\ding{116}), o E234A de TeTx cortada en EK (\nabla) durante 60 min a 4ºC (véase la Fig 8). A continuación se añadió la TeTx nativa (0,2 nM) a los pocillos especificados y, tras 3 min más, se lavaron las neuronas tres veces con tampón KRH enfriado en hielo y se incubaron durante 30 min a 37ºC. Se llevó a cabo la evaluación posterior a la liberación del neurotransmisor dependiente de Ca^{2+} estimulado por K^{+} tal como se ha detallado anteriormente. En la Figura 8, se muestran los resultados de este ensayo.

Cuando se expusieron las neuronas cerebelares a la TeTx recombinante cortada, se ve una inhibición dependiente de la dosis de la liberación del transmisor dependiente de Ca^{++} con una potencia similar a la de la toxina nativa. Respecto de la SC TETX recombinante cortada, WT y R496G, dieron valores similares en este ensayo. De esta manera, aunque la actividad de la toxina en la molécula de cadena sencilla no cortada no está abrogada mediante la eliminación de un emplazamiento sencillo de rotura de la tripsina, la eliminación de dichos emplazamientos adicionales es factible en las regiones de la toxina de cadena sencilla para conseguir una pro forma de cadena sencilla activable de la toxina que presenta incluso menos toxicidad a no ser que se active in vitro, cuando se puede conseguir su actividad completa.

Ejemplo 7 El mutante TeTx deficiente en proteasa antagoniza las acciones de TeTx sobre las neuronas periféricas y centrales

La Tabla 1 muestra los resultados tabulados de los constructos TeTx indicados ensayados en tres ensayos de actividad de la toxina; capacidad para romper el péptido HV62 (que únicamente mide la actividad proteolítica): parálisis neuromuscular (que es una indicación de la capacidad de las moléculas de toxina para entrar en la célula y, por consiguiente, inhibir la liberación del neurotransmisor), y la letalidad en ratón tras la inyección intraperitoneal de los diversos constructos de toxina. Se llevaron a cabo los dos primeros de estos ensayos tal como se ha descrito anteriormente.

Se llevó a cabo el ensayo de letalidad en ratón esencialmente como sigue: Se dividieron cada una de las muestras de la TeTx de cadena sencilla purificada recombinante, la TeTx del mutante R496G, y la TeTx del mutante E234A en dos alícuotas y se trató una alícuota con enteroquinasa para cortar la toxina. Se diluyeron todas las muestras en serie en tampón fosfato 50 mM (pH 7,0), NaCl 150 mM y albúmina de suero bovino al 0,25% (p/v) (BSA), y se inyectaron las preparaciones de toxina en ratones intraperitonealmente.

Tal como se muestra en la Tabla 1, las preparaciones de TeTx nativa y cortada fueron comparablemente activas en el ensayo de letalidad en ratón, teniendo una DL_{50} de aproximadamente 1 X 10^{8}/mg. La toxina recombinante no cortada y el mutante R496G no cortado fueron ambos la mitad de activos. Finalmente, la toxina E234A cortada proteolíticamente inactiva fue menos de 5 X 10^{7} veces menos activa.

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TABLA 1

1

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  ^{a}   \begin{minipage}[t]{150mm} Se midieron las velocidades
iniciales de la proteolísis usando el procedimiento basado en
RP-HPLC detallado en Foran  y col . (1994). Se
llevaron a cabo las incubaciones con 15  \mu M de un péptido
sintético que corresponden a los residuos 33 a 94 del
VAMP-2 humano (HV62) a 37ºC en HEPES.NaOH 50 mM pH
7,5 que contenía DTT 2 mM, 0,2 mg. ml ^{-1}  de BSA y ZnCl ^{2}  50
 \mu M usando la concentración apropiada de cada preparación de
toxina reducida requerida para proteolizar un 10-15%
del sustrato durante un período de 30 min. Los datos son promedios
( \pm  S.D.: n 0 4).\end{minipage} \cr   ^{b}  DL _{50}  es la
cantidad de toxina que mata el 50% de ratones inyectados en un
período de 4 días.\cr   ^{c}  Se cortaron las preparaciones de
toxina con EK (1 unidad/30  \mu g) a 22ºC durante 1 h.\cr   ^{d} 
 \begin{minipage}[t]{150mm} Este valor vº representa los límites
de detección del ensayo RP-HPLC; no se observó la
proteolísis de HV62 usando incubaciones
prolongadas.\end{minipage} \cr}

\newpage

La TeTx de SC E234A purificado, en la que se sustituyó el E catalítico en la posición 234 por un A, fracasó en mostrar cualquier proteolísis detectable de un péptido que contenía los residuos 33 a 94 del VAMP-2 humano (denominado HV62), antes o después del corte con EK. De acuerdo con esto, TeTx E234A cortado probó estar desprovista de toxicidad en ratones, y es incapaz de inhibir la liberación del transmisor en la unión neuromuscular o entre las neuronas cerebelares.

De manera importante, sin embargo, esta toxina mutante retuvo la capacidad de enlazar con los receptores superficiales de las células en las neuronas periféricas y centrales. La preincubación de neuronas cerebelares con TeTx E234A cortada (10-60 nM) o no cortada (7-40 nM) a 4ºC seguida por la adición de toxina nativa 0,2 nM, antagonizó la inhibición de la toxina nativa de la liberación del transmisor a 37ºC en extensiones similares (Fig. 7).

Tal como se ha demostrado en la Figura 9, la exposición del diafragma de ratón a TeTx E234A 100 nM a 4ºC durante 60 minutos antes de la adición de toxina nativa 1 nM prolongó el tiempo tomado para producir la parálisis neuromuscular.

Se incubó el hemidiafragma del nervio frénico de ratón en KR a 37ºC con TeTx E234A recombinante 20 nM (\Delta) estimulando a la vez el nervio (0,2 Hz, 1,5-2,5 v) y registrando la tensión del músculo. Para evaluar la competición, se incubaron los hemidiafragmas durante 60 minutos a 4ºC con MKR que contenía únicamente BSA al 0,1% (\Box), o el último más TeTx E234A cortado 100 nM (\medcirc), antes de la adición de TeTx nativa 1 nM. Tras 30 minutos de exposición al último, se lavaron los tejidos tres veces con MKR y dos veces con KR. Se aumentó la temperatura a 37ºC y se estimuló el nervio registrando las contracciones locales menores del músculo estimulado, tal como se ha reseñado anteriormente. Esta competición aparente por el enlace de la toxina por el mutante que se ve con ambos tejidos demuestra que la dicadena TeTx recombinante presenta mucha mayor afinidad por los receptores superficiales celulares que la cadena pesada o H_{c} de TeTx sola. Estos resultados sugieren que la conformación de la dicadena TeTx recombinante tiene una alta afinidad con el receptor superficial de la célula.

Más aún, y verdaderamente significativo, estos datos demuestran que se pueden fabricar moléculas recombinantes de acuerdo con los procedimientos inventivos de la solicitud de patente presente que tengan el enlace específico por el mismo receptor celular como TeTx. Sin embargo, dichas moléculas pueden, de manera similar al mutante E234A, ser inactivas como moléculas de toxina pero retendrán la capacidad de captarse por la célula diana; sirviendo de esta manera como moléculas transportadoras potenciales.

Ejemplo 8 Expresión de la BoNT/A de cadena sencilla

Usando procedimientos similares a aquellos descritos anteriormente, se ligaron conjuntamente las cadenas H y L de la neurotoxina BoNT subtipo A, se separaron mediante el emplazamiento de rotura EK. Se insertó esta toxina de cadena sencilla que codifica la secuencia en una variedad de vectores de expresión que contenían diferentes secuencias y promotores N terminales, tal como se muestra en la Tabla 2, a continuación.

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TABLA 2

3

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Las "etiquetas de fusión" comprenden cada una un miembro de un complejo de enlace específico como un coadyuvante de la purificación y para mejorar la solubilidad y estabilidad de la proteína expresada. Se transformaron estos plásmidos en las cepas de E. coli indicadas en la Tabla 2 y se monitorizó la expresión de la toxina de cadena sencilla.

En otro experimento, se insertó el constructo BoNT/A de cadena sencilla en el plásmido pMAL-c2 entre los emplazamientos de restricción Bam HI y Hind III dando como resultado una secuencia de codificación para un polipéptido de fusión que contiene la proteína de enlace con la maltosa en el término N, seguida por un emplazamiento de rotura del Factor Xa.

Se seleccionaron las colonias JM 109 transformantes en caldo de Luria que contenía ampicilina. Se indujo la expresión mediante la adición de IPTG hasta una concentración final de 0,3 mM. Tal como para el constructo TeTx, se recogieron alícuotas del cultivo celular antes y después de la inducción, se lisaron las células en cada muestra mediante sonicación, y se preparó el sobrenadante para SDS-PAGE bajo condiciones de reducción y no reductoras. Tras la electroforesis para separar las proteínas de acuerdo con el peso molecular aparente, se sometió el gel a Western blot usando un anticuerpo aumentado contra la cadena H de BoNT/A. El Western blot dio como resultado la aparición de una banda de toxina de cadena sencilla inmunológicamente reactiva de peso molecular aparente de 200 kDa. Las modificaciones adicionales de la molécula BoNT de cadena sencilla para eliminar emplazamientos de rotura de la proteasa fortuitos (similares a aquellas modificaciones hechas en el emplazamiento TeTx lábil a la tripsina y a la Arg C proteasa, descritas anteriormente) darán como resultado una estabilidad incluso mayor que la de la molécula BoNT/A de cadena sencilla.

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Ejemplo 9 Construcción de un vector plásmido que expresa BoNT/E

Se construyó como sigue un plásmido que expresa una versión recombinante de cadena sencilla de la neurotoxina de Clostridium botulinum subtipo E (cepa Beluga) (BoNT/E). Se diseñaron cebadores PCR basados en la secuencia del ADNc de la neurotoxina BoNT/E de la base de datos EMBL (Genbank con número de acceso X62089). Se representa esta secuencia de nucleótidos en el presente documento como SEC DE ID Nº: 10

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(Secuencia pasa a página siguiente)

6

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El cebador hacia delante tenía la siguiente secuencia de nucleótidos base:

104

en la que el emplazamiento de la endonucleasa BamHI está subrayado y la secuencia de la cadena ligera menos el codón de inicio está en negrita. El cebador inverso tenía la secuencia:

105

en la que el emplazamiento de la endonucleasa PstI está subrayado, el extremo de la región que codifica la cadena pesada está en negrita, y el codón de parada está en minúscula. Se fabrican estos cebadores usando la metodología estándar de síntesis del ADN.

Se usaron los dos cebadores en una reacción PCR que contenía diferentes cantidades de ADN cromosómico de Clostridium botulinum tipo E (cepa Beluga). La reacción PCR empleó una ADN polimerasa con actividad de corrección de pruebas (ADN polimerasa de Pfx, obtenida de Life Technology) con el fin de evitar los errores de secuencia en el gen amplificado. Las condiciones de la reacción de amplificación fueron como sigue: 30 ciclos de: un segundo desnaturalización de 45 a 95ºC, seguida por un segundo etapa de templado de 45 a 56ºC, seguida por una reacción de extensión del cebador durante 3 minutos 48 segundos a 68ºC.

Se digirió el producto de PCR con BamHI y HindIII, y se sometió la digestión a electroforesis en gel de agarosa. La tinción del gel de agarosa con bromuro de etidio reveló un fragmento de ADN principal de aproximadamente 3,5 kilobases (véase la Figura 10). La banda que contenía este fragmento se escindió a partir del gel, y el ADN purificado a partir de la agarosa se ligó a BamHI y al vector pQE30 cortado por HindIII (Qiagen). Se usó el plásmido ligado resultante para transformar la cepa JM 109 de E. coli tal como se ha descrito anteriormente y se plaquearon los transformante sobre placas de agar LB selectivo. Se recuperaron diversos clones y se comprobó la presencia del inserto de ADN de la BoNT/E correcta mediante el enzima de restricción. El constructo resultante contiene el gen BoNT/E (menos la metionina primera) fusionado con la etiqueta His_{6} del vector pQE30, y contiene 2 residuos de aminoácido extras (glicina, serina), que se contribuyen mediante el emplazamiento BamHI diseñado.

Ejemplo 11 Construcción de un mutante de BoNT/E proteolíticamente inactivo mediante mutagénesis dirigida al emplazamiento

Mutando el ácido glutámico en la posición 212 (en el interior del emplazamiento activo) del constructo del polipéptido BoNT/E por glutamina, se obtuvo un polipéptido BoNT/E de cadena sencilla no tóxico y proteolíticamente inactivo.

Se introdujo la sustitución con la glutamina en el cebador hacia delante usando los procedimientos rutinarios de mutagénesis dirigida al emplazamiento. El cebador del ADN mutagénico tenía la secuencia

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en la que el codón que codifica la glutamina en la posición 212 se indica en minúsculas.

Se llevó a cabo una reacción PCR inversa usando el cebador anterior, junto con el cebador inverso

107

y una ADN polimerasa de Pfx (Life Technology) como anteriormente. La plantilla PCR fue el constructo BoNT/E de cadena sencilla de tipo salvaje (denominado pQEESCwt). Los parámetros de ciclado (30 ciclos) fueron como sigue: 1) un segundo etapa de desnaturalización de 45 a 95ºC; 2) un segundo etapa de templado de 45 a 56ºC; y 3) una etapa de extensión de 7 minutos 10 segundos a 68ºC.

Al final de la reacción de amplificación, se digirió la plantilla de ADN mediante el enzima de restricción DpnI para permitir la selección únicamente de clones mutados. Tras someter el producto de PCR a la electroforesis con gel de agarosa, se eliminó una banda de aproximadamente 7 kilobases y se usó el ADN purificado para la autoligadura en presencia de T4 ADN ligasa (Promega) y la polinucleótido quinasa (Promega) para permitir la fosforilación del producto PCR. Se usó la mezcla de ligadura para transformar la cepa DH10B de E. coli, y se plaquearon los transformantes sobre placas de agar selectivo. Se verificó la presencia del constructo del plásmido correcto en diversos transformantes representativos mediante la digestión de restricción y se confirmó también la mutación mediante el secuenciamiento del ADN. La Figura 11 muestra el protocolo para la construcción del plásmido BoNT/E mutante, y la mezcla de reacción PCR del gel de agarosa teñido con bromuro de etidio (hileras 2 y 3) frente a los marcadores del peso molecular (hilera 1).

Ejemplo 12 Purificación de BoNT/E recombinante de cadena sencilla

La presencia de la etiqueta de histidina en el término N de la proteína expresada permitió una purificación de etapa única de la neurotoxina recombinante mediante cromatografía de afinidad con metal.

Se usó la cepa M15 de E. coli (Qiagen) para la expresión del constructo BoNT/E de cadena sencilla. Esta cepa transporta un plásmido endógeno (pREP4, resistente a la kanamicina) que contiene una región que codifica el gen represor lac I^{q} con el fin de evitar la transcripción del gen de la neurotoxina antes de la inducción con IPTG. El vector pQE39 contiene un promotor de la ARN polimerasa del bacteriófago T5, que es también reconocido por la ARN polimerasa de E. coli.

Se hizo crecer una colonia de células M15 que contenían pQEESCwt a 37ºC durante la noche en 5 ml de medio 2TY que contenía 0,1 mg/ml de ampicilina; 0,025 mg/ml de kanamicina y glucosa al 0,2% (p/v), y se usó el cultivo resultante para inocular 500 ml del mismo medio. Cuando este segundo cultivo alcanzó una densidad óptica de 0,5-0,8 a 600 nm, se añadió IPTG hasta una concentración final de 0,3 mM y se incubó el cultivo a 25ºC durante la noche para permitir la expresión de la neurotoxina.

La centrifugación subsiguiente del cultivo dio como resultado \sim 2,3 g de residuo celular húmedo, que se volvió a suspender en 10 ml de tampón de extracción (HEPES 20 mM pH 7,00, NaCl 300 mM, benzamidina 5 mM, pepstatina 2 \muM y E-64 2 \muM). Se añadió lisozima hasta una concentración final de 0,25 mg/ml, y se incubó la suspensión celular en hielo durante 60 minutos. Se añadieron aproximadamente 0,5 ml de perlas de vidrio (de 0,1 mm de diámetro de Biospec) a la suspensión celular, sometido a vórtex durante 2 minutos para romper las células, Se obtuvieron los extractos libres de células mediante centrifugación a 10.000 xg durante 30 minutos a 4ºC. Se incubó el sobrenadante con 0,5 ml con resina de afinidad de metal cobalto Talon® (Clontech) prelavada con el tampón de extracción en una plataforma de vaivén durante 45 minutos a 4ºC. A continuación se cargó la resina en una columna de cromatografía disponible y se lavó dos veces con 10 volúmenes de lecho de tampón de lavado (HEPES 20 mM pH 7,0, NaCl 300 mM, imidazol 2 mM) antes de la elución de la neurotoxina de enlace en 6 volúmenes de lecho del tampón de elución (Hepes 20 mM pH 7,0, NaCl 300 mM, imidazol 150 mM).

Se dializó el eluído durante la noche a 4ºC frente a Hepes 10 mM (pH 7,0) que contenía NaCl 150 mM y se concentró mediante filtración en centrifuga (cortavapor MW 10 kDa) hasta una concentración final de 1 mg/ml de proteína.

Tal como se muestra en la Figura 12, se demostró la pureza de la toxina purificada mediante afinidad por SDS-PAGE bajo condiciones de reducción, seguida por tinción de Coomassie y Western-blotting, detectando el término N con un anticuerpo anti-His monoclonal de ratón de Quiagen (diluido 200 veces). Se usaron soluciones mejoradas por Quimioluminiscencia (Santa Cruz) y peroxidasa de rábano picante secundaria de ratón (purificada por afinidad de Sigma) para la detección del anticuerpo enlazado. Se cargaron aproximadamente 2 mg de muestra de proteína por pocillo.

Ejemplo 13 Activación mediante tripsina del polipéptido BoNT/E de cadena sencilla recombinante purificado

Se activaron las muestra del polipéptido BoNT/E de la neurotoxina de cadena sencilla purificada mediante corte de la cadena sencilla con tripsina (1,5 \mug/ml de concentración final) durante 60 minutos a una concentración de 1 mg de toxina/ml en Hepes 10 mM (pH 7,0), NaCl 150 mM. Tras la reacción, se inactivó la tripsina usando PMSF 150 mM y 10 \mug de inhibidor de la tripsina/ml. Se evaluó y verificó la calidad de la tripsinización mediante SDS-PAGE bajo condiciones de reducción y no reductoras, a continuación se tiñó con tinción de Coomassie y Western blotting y el gel de poliacrilamida usando un anticuerpo anti-His monoclonal de ratón (Quiagen, diluido 2000 veces) y un anti-Hc IgG monoclonal de ratón (diluido 26 veces). Tal como se muestra en la Figura 13, la proteína cortada teñida con Coomassie se resuelve en dos bandas bajo condiciones de reducción, mientras las cadenas pesada y ligera permanecen enlazadas por disulfuro bajo condiciones no reductoras, similares a las de la toxina nativa. La cadena pesada recombinante detectada mediante anticuerpo es de tamaño aproximadamente idéntico a su contraparte de Clostridium de tipo salvaje, mientras que la cadena ligera recombinante migra a un peso molecular ligeramente mayor en comparación con la proteína nativa. Esta última característica es debida a los residuos extra proporcionados por la etiqueta His_{6} en el término N.

Ejemplo 14 BoNT/E recombinante es proteolíticamente activa

Se prepararon soluciones stock (1 \muM) de toxina BoNT/E cortada nativa, toxina recombinante de cadena sencilla no cortada, toxina recombinante dicadena cortada y BoNT/E de (E212Q) mutante cortada, en solución salina tamponada con HEPES (HBS, NaCl 150 mM, HEPES 10 mM, pH 7,4, 10 \mug/ml de BSA). Se incubaron estas muestras durante 30 minutos a 37ºC en ausencia o presencia de DTT 20 mM, y a continuación se diluyeron en serie en 0,02 ml de HBS hasta la concentración final que se muestra en la Figura 14.

Se usó un péptido recombinante que contenía los aminoácidos 140-205 de SNAP-25 fusionado a la glutatión-S-transferasa (denominado GST-SNAP-25 [140-205] como sustrato de la proteasa para ensayar la actividad proteolítica de los polipéptidos BoNT/E recombinantes. Se incubaron diez microgramos de este sustrato de la proteasa con las muestras de toxina. Se dejó proceder la reacción de digestión durante 30 minutos a 37ºC en ausencia o presencia de DTT 2 mM, y se paró mediante la adición de tampón de muestra SDS-PAGE seguido por ebullición durante 5 minutos.

Se analizaron las muestras resultantes mediante SDS-PAGE (3 \mug de GST-SNAP-25 [140-205] por hilera) y tinción de plata. Tal como demuestra la Figura 14, incluso la toxina de cadena sencilla recombinante no cortada retiene la actividad proteolítica. Tal como se esperaba, el constructo BoNT/E de E212Q mutante no tiene actividad proteolítica detectable. La Figura 14 muestra únicamente las bandas GST-SNAP-25 [140-205].

Ejemplo 15 El corte produce BoNT/E recombinante completamente funcional

Se lavaron neuronas cerebelares mantenidas durante 10 días en cultivo (2 x 10^{6}/pocillo de 22 mm de diámetro) con tampón Krebs-Ringer HEPES (KRH), a continuación se expusieron a concentraciones especificadas de BoNT/E nativa (\medbullet) BoNT/E recombinante cortada con tripsina (\medcirc) y BoNT/E de cadena sencilla no cortada (\ding{116}) (Véase la Fig. 15). Tras 60 minutos a 37ºC, se retiró el tampón que contenía la toxina y se lavaron las células dos veces, a continuación se incubaron con tampón KRH que contenía 0,25 \muCi/ml de glutamina marcada con [^{14}C] (es decir, el precursor del glutamato). Tras 45 minutos, se retiró el último medio y se lavaron las neuronas cuatro veces a 37ºC antes de evaluar la liberación del transmisor del glutamato. Se incubaron las neuronas tratadas con toxina y el control durante 5 minutos a 37ºC en tampón KRH que contenía Ca^{2+} 1,4 mM o EGTA 0,5 mM para evaluar la liberación independiente de Ca^{2+}; a continuación se retiraron las alícuotas para la determinación de su contenido en [^{14}C]-glutamato (véase a continuación).

Inmediatamente después de la eliminación del medio basal se añadió tampón KRH que contenía KCl 50 mM y Ca^{2+} 1,4 mM o EGTA 0,5 mM; como anteriormente, se retiraron las alícuotas para el ensayo de [^{14}C]-glutamato tras un período de estimulación de 5 minutos. Finalmente, se solubilizaron las neuronas con EGTA.NaOH 20 mM pH 7,5, que contenía SDS al 1% (p/v) y se retiraron las alícuotas para determinar las cantidades de radioactividad que permanecían en el interior de las células. Se evaluó la cantidad de [^{14}C]-glutamato en cada una de las muestras mediante conteo por centelleo y se expresaron los niveles liberados bajo condiciones basal y estimulada como porcentajes en relación con el contenido celular total calculado.

Se restó el porcentaje de [^{14}C]-glutamato contenido en el tampón que contiene EGTA para cada muestra de los valores registrados en las muestras de KRH que contienen Ca^{2+} con el fin de obtener el componente de liberación dependiente de Ca^{2+}, y se restaron las últimas lecturas basales de los valores obtenidos para las muestra de KCl 50 mM para dar como resultado la liberación dependiente de Ca^{2+} estimulado por K^{+}. de esta manera, los valores obtenidos a partir de las neuronas tratadas con toxina se expresan en relación a los controles libres de toxina.

La Figura 15 muestra que, a pesar de la actividad proteolítica que retiene, la BoNT/E recombinante no cortada tiene marcadamente menos actividad que la BoNT/E nativa o la versión recombinante cortada. Este hallazgo puede reflejar la incapacidad de la toxina no cortada para entrar de manera adecuada en la célula diana. De manera adicional, parece que la versión recombinante cortada es más efectiva que la toxina nativa en la inhibición de la liberación del glutamato.

Ejemplo 16 BoNT/E recombinante tiene una actividad paralítica neuromuscular equivalente a la de la toxina nativa en los extremos aplanados neuromusculares de ratón: el cortado incrementa la potencia

Se bañaron los hemidiafragmas de nervio frénico de ratón en KR suplementado con BSA al 0,1% y se saturaron con O_{2} al 95%/CO_{2} al 5%. Se estimularon los nervios frénicos (0,2 Hz, 1,5 – 2,5 mV) y se registró la tensión del músculo estimulado por el nervio antes y después de la adición de (Fig. 16A) BoNT/E cortada recombinante (\medcirc) o BoNT/E nativa 0,2 nM (\Box), y (Fig 16B) BoNT/E no cortada recombinante 1 nM (\medcirc), BoNT/E cortada recombinante 1 nM (\medbullet) o BoNT/E cortada recombinante 0,05 nM (\nabla). Tal como se muestra en las Figuras 16A y 16B, BoNT/E cortada recombinante es un efectivo agente paralítico, que despliega mayor actividad en este ensayo que en el de la toxina nativa. La toxina no cortada despliega una actividad significativamente menor que la toxina cortada en este ensayo.

Se demostró también la actividad paralítica neuromuscular de la BoNT/E cortada recombinante en ratones mediante inyección intramuscular en los músculos de las extremidades posteriores. Esto dio como resultado una parálisis, tal como se evaluó mediante el ensayo sobre el reflejo expandido del dedo gordo del pie, con un modelo de síntomas típico del botulismo.

Se estableció la neurotoxicidad in vivo de la neurotoxina recombinante cortada por inyección de la toxina a ratones, y resultó una neurotoxicidad específica de menos de 10^{7} unidades de DL_{50} por mg en ratón.

Ejemplo 17 El mutante E212Q proteasa inactivo de BoNT/E antagoniza la neuroparálisis inducida por BoNT/E

Se expuso el hemidiafragma de nervio frénico de ratón al E212Q de BoNT/E 10 nM en medio KR, se estimuló el nervio y se registró la tensión del músculo despertada. Tal como se ha indicado por la Figura 17, el mutante E212Q de BoNT no presenta neurotransmisión, tal como se determinó por su fracaso para reducir la tensión del músculo estimulada por el nervio (\medcirc). Para evaluar la capacidad de este mutante no tóxico para antagonizar la actividad de la toxina nativa, se bañaron los hemidiafragmas de nervio frénico de ratón durante 60 minutos a 4ºC en MKR suplementado con BSA al 0,1% y se saturaron con O_{2} al 95%/CO_{2} al 5%, sin (\Box) o con (\Delta) la inclusión de E212Q de BoNT/E 5 nM. Se añadió BoENT/E cortada nativa a cada baño (0,05 nM final) y se incubaron los tejidos durante 30 minutos más. A continuación se lavaron los nervios/músculos tres veces cada uno con MKR seguido por KR, se aumentó antes la temperatura a 37ºC, se registró el nervio estimulado y la tensión despertada en el músculo.

Tal como se muestra en la Figura 17, se retrasó y antagonizó el comienzo de la actividad de BoNT/E nativa en este ensayo cuando se preincubaron los hemidiafragmas de nervio frénico con el mutante E212Q proteasa inactivo, indicando por tanto que el mutante recombinante enlaza de manera completa con el mismo receptor superficial celular tal como hace la toxina nativa. De esta manera, se pueden usar los procedimiento de la presente solicitud de patente para producir toxinas recombinantes y modificadas que tengan las regiones de enlace con el receptor completamente funcionales, y las moléculas transportadas relacionadas con BoNT para la liberación intracelular de los agentes terapéuticos.

Las personas expertas en la técnica entenderán que los Ejemplos proporcionados en el presente documento describen composiciones y procedimientos preferidos, y que se pueden emplear una variedad de estrategias de clonación diferentes, emplazamiento de rotura de la proteasa, y miembros del complejo de enlace específico en la práctica y uso de la presente invención permaneciendo a la vez dentro del alcance de la invención. De manera adicional, se pueden usar dicadenas o moléculas de toxina binaria diferentes y las versiones modificadas de las mismas (por ejemplo, BoNT/B-E y las variantes modificadas de la misma) como base para los procedimientos y composiciones de la presente invención.

<110> Dolly, James Oliver

\hskip1cm

Li, Yan

\hskip1cm

Chan, C. K.

\hskip1cm

Aoki, Kei Roger

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<120> Neurotoxinas recombinantes activables

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<130> 17311

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<150> 60/150, 710

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<151> 25-08-1999

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<160> 14

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<170> FastSEQ para Windows versión 3.0

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<210> 1

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<211> 44

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<400> 1

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\hskip-.1em\dddseqskip

gactggtgga cagcaagtcg accggaagct ttacgacgat gacg

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44

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<210> 2

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<211> 44

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<400> 2

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cgtcatcgtc gtaaagcttc cggtcgactt gctgtccacc agtc

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44

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<210> 3

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<211> 30

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<400> 3

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\hskip-.1em\dddseqskip

aatagatcta gatcattaac agatttagga

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30

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<210> 4

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<211> 27

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<400> 4

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\hskip-.1em\dddseqskip

ttctaaagat ctatacattt gataact

\hfill

27

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<210> 5

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<211> 27

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<400> 5

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atgtatagat ctttagaata tcaagta

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27

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<210> 6

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<211> 45

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<400> 6

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atcgataagc ttttatcagt cgacccaaca atccagattt ttaga

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45

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<210> 7

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<211> 65

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<212> PTR

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<213> Secuencia artificial

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<400> 7

7

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<210> 8

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<211> 36

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<400> 8

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aatagaactg caggagaaaa gctttacgac gatgac

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36

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<210> 9

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<211> 36

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> cebador PCR

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<400> 9

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gtcatcgtcg taaagctttt ctcctgcagt tctatt

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36

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<210> 10

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<211> 4017

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<212> ADN

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<213> Clostridium botulinum

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<400> 10

8

9

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<210> 11

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<211> 37

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> cebador PCR

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<400> 11

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cccggatccc caaaaattaa tagttttaat tataatg

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37

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<210> 12

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<211> 36

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> cebadores PCR

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<400> 12

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\hskip-.1em\dddseqskip

cccctgcagt catttttctt gccatccatg ttcttc

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36

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<210> 13

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<211> 31

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> cebador

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<400> 13

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cagttaatac attcattaca tggactatat g

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31

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<210> 14

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<211> 26

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> cebador

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<400> 14

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\hskip-.1em\dddseqskip

atgcattaat gtaagagcag gatctt

\hfill

26

Claims

1. Un polipéptido de neurotoxina de clostridios de cadena sencilla que comprende:

a): un primer dominio de secuencia de aminoácidos que comprende

(i): un primer dominio que comprende un elemento de enlace que comprende al menos una porción de una neurotoxina de clostridios de cadena pesada capaz de enlazar de manera específica a un marcador superficial celular diana bajo condiciones fisiológicas; y

(ii): un segundo dominio que comprende un elemento de translocación que comprende al menos una porción de una neurotoxina de clostridios de cadena pesada capaz de facilitar la transferencia de un polipéptido a través de una membrana vesicular; y

b): un segundo dominio de secuencia de aminoácidos que comprende un elemento terapéutico que comprende al menos una porción de una neurotoxina de clostridios de cadena ligera que tiene actividad biológica cuando se libera en el citoplasma de la célula diana,

c): un tercer dominio de secuencia de aminoácidos que comprende un emplazamiento de rotura de la proteasa que no es un emplazamiento de rotura de la tripsina, quimotripsina o pepsina entre dichos primer y segundo dominios de secuencia de aminoácidos.

2. El polipéptido de la reivindicación 1 en el que el elemento de translocación de dicho primer dominio de secuencia de aminoácidos comprende al menos una porción de una cadena H de neurotoxina de clostridios, que es esencial para conferir la actividad de translocación.

3. El polipéptido de la reivindicación 2 en el que dicha porción de la cadena H de la neurotoxina de clostridios se deriva de la cadena pesada de la neurotoxina de C. Botulinum subtipo A.

4. El polipéptido de la reivindicación 2 en el que el elemento terapéutico de dicho segundo dominio de secuencia de aminoácidos comprende una cadena L de la neurotoxina de clostridios, o una porción de la misma que retiene la actividad de la endopeptidasa específica de la secuencia de la proteína SNARE de una cadena ligera de la neurotoxina de clostridios.

5. El polipéptido de la reivindicación 4 en el que dicha porción de la cadena L de la neurotoxina de clostridios se deriva de la obtenida a partir de un C. botulinum subtipo A, B, ó E.

6. El polipéptido de la reivindicación 2 en el que dicha porción de la cadena H de la neurotoxina de clostridios se deriva de la obtenida a partir de C. tetani.

7. El polipéptido de la reivindicación 2 en el que dicha porción de la cadena H de la neurotoxina de clostridios se deriva de la cadena pesada de la neurotoxina de un organismo seleccionado entre el grupo constituido por C. botulinum subtipo B; C. botulinum subtipo C; C. botulinum subtipo D; C. botulinum subtipo E; C. botulinum subtipo F; C. botulinum subtipo G; C. baratii; y C. butyricum.

8. El polipéptido de la reivindicación 7 en el que el elemento terapéutico de dicho segundo dominio comprende una cadena L de la neurotoxina de clostridios.

9. El polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 en el que dicho emplazamiento de rotura de la proteasa se rompe mediante una proteasa seleccionada entre el grupo constituido por:

a): una enteroquinasa no humana;

b): la proteasa del virus etch del tabaco;

c): una proteasa derivada de Bacillus subtilus;

d): una proteasa derivada de bacillus amyliquifaciens;

e): una proteína derivada de un rinovirus;

f): papaína;

g): un homólogo de la papaína de insecto, y

h): un homólogo de la papaína de crustáceo.

10. El polipéptido de la reivindicación 1 en el que dicho emplazamiento de rotura de la proteasa comprende una secuencia de aminoácido seleccionada entre el grupo constituido por:

a): DDDDK;

b): EXXYXQS/G;

c): HY;

d): YH; y

e): LEVLFQGP,

en el que X = cualquier aminoácido.

11. El polipéptido de la reivindicación 1 o la reivindicación 9 que comprende de manera adicional una etiqueta de enlace.

12. El polipéptido de la reivindicación 11 en el que dicha etiqueta de enlace comprende una porción de enlace a la diana de un polipéptido seleccionado entre el grupo constituido por His_{6}, anticuerpos monoclonales, proteína de enlace a la maltosa, glutatión-S-transferasa, proteína A, y proteína de enlace a la calmodulina.

13. El polipéptido de la reivindicación 1 en el que el elemento de translocación de dicho primer dominio de secuencia de aminoácidos comprende al menos una porción de una cadena pesada derivada de un primer subtipo de neurotoxina de clostridios, que es esencial para conferir la actividad de translocación y el elemento terapéutico de dicho segundo dominio de secuencia de aminoácidos comprende una cadena L de neurotoxina de clostridios o una porción de la misma que retiene la actividad de la endopeptidasa específica de la secuencia de la proteína SNARE de una cadena ligera de neurotoxina de clostridios derivada de un segundo subtipo de neurotoxina de clostridios, en el que dicho primer y segundo subtipos de neurotoxina de clostridios no son el mismo.

14. El polipéptido de la reivindicación 13 en el que dicha porción de cadena pesada procede de una cadena pesada seleccionada entre el grupo constituido por HCA, HCB, HCCl, HCD, HCE, HCF, y HCG; y dicha porción de cadena ligera procede de una cadena ligera seleccionada entre el grupo constituido por LCA, LCB, LCCl, LCD, LCE, LCF, LCG, y en el que dichas porciones de cadena pesada y ligera son de diferentes subtipos de neurotoxina de clostridios.

15. El polipéptido de la reivindicación 14 en el que al menos una de dichas porciones de cadena pesada y ligera comprende menos de la cadena pesada o ligera completa de dicho subtipo de neurotoxina de clostridios, respectivamente.

16. El polipéptido de la reivindicación 14 en el que al menos una de dichas porciones de cadena pesada y ligera comprende la cadena pesada o ligera completa de dicho subtipo de neurotoxina de clostridios, respectivamente.

17. El polipéptido de cualquiera de la reivindicaciones 1, 2 ó 13 en el que dicho primera o segundo dominio de secuencia de aminoácidos se modifica para eliminar al menos una secuencia de aminoácidos rota de manera específica mediante una proteasa.

18. Un plásmido que tiene una región de secuencia del ácido nucleico que comprende un marco de lectura abierto que codifica un polipéptido de la neurotoxina de clostridios de cadena sencilla rompible, comprendiendo dicho marco de lectura abierto:

a): un primer dominio de secuencia de nucleótidos que comprende

i): una primera porción que codifica un primer dominio de secuencia de aminoácidos que comprende un elemento de enlace que comprende al menos una porción de una cadena pesada de neurotoxina de clostridios capaz de enlazar de manera específica con un marcador superficial celular diana bajo condiciones fisiológicas; y

ii): una segunda porción que codifica un segundo dominio de secuencia de aminoácidos que comprende un elemento de translocación que comprende al menos una porción de una cadena pesada de neurotoxina de clostridios capaz de facilitar la transferencia de un polipéptido a través de una membrana vesicular; y

b): un segundo dominio de secuencia del nucleótido que codifica un tercer dominio de secuencia de aminoácidos que comprende un elemento terapéutico que comprende al menos una porción de la cadena ligera de neurotoxina de clostridios que tiene actividad biológica cuando se libera en el citoplasma de la célula diana,

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c): un tercer dominio de secuencia del nucleótido que codifica una cuarta región de secuencia de aminoácidos que comprende un emplazamiento de rotura de la proteasa que no es un emplazamiento de rotura de la tripsina, quimotripsina o pepsina entre dicha primer y segundo dominios de secuencia del nucleótido.

y en el que dicho polipéptido de neurotoxina de clostridios de cadena sencilla se expresa mediante dicho plásmido en el interior de una célula huésped adecuada.

19. El plásmido de la reivindicación 18 en el que dicha primer y segundo dominio de secuencia del nucleótido codifica de manera adicional una región de secuencia de aminoácidos que comprende una etiqueta de enlace.

20. El plásmido de la reivindicación 19 en el que dicha etiqueta de enlace comprende una porción de enlace a la diana de un polipéptido seleccionado entre el grupo constituido por His_{6}, anticuerpos monoclonales, proteína de enlace a la maltosa, glutatión-S-transferasa, proteína A, y proteína de enlace a la calmodulina.

21. El plásmido de la reivindicación 18 en el que el elemento de translocación de dicho primer dominio de secuencia de nucleótidos codifica al menos una porción de una cadena pesada de neurotoxina de clostridios, que es esencial para conferir la actividad de translocación.

22. El plásmido de la reivindicación 21 en el que dicho primer dominio de secuencia de nucleótidos codifica al menos una porción de la cadena pesada de la neurotoxina de Clostridium botulinum.

23. El plásmido de la reivindicación 21 en el que dicho primer dominio de secuencia de nucleótidos codifica al menos una porción de la cadena pesada de la neurotoxina de Clostridium tetani.

24. El plásmido de cualquiera de las reivindicaciones 18 o 21 en el que el elemento terapéutico de dicho segundo dominio de secuencia de nucleótidos codifica una cadena L de neurotoxina de clostridios o una porción de la misma que retiene la actividad de la endopeptidasa específica de la secuencia de la proteína SNARE de una cadena ligera de neurotoxina de clostridios.

25. El plásmido de la reivindicación 24 en el que dicho segundo dominio de secuencia de nucleótidos codifica al menos una porción de la cadena ligera de la neurotoxina de Clostridium botulinum.

26. El plásmido de la reivindicación 24 en el que dicho segundo dominio de secuencia de nucleótidos codifica al menos una porción de la cadena ligera de la neurotoxina de Clostridium tetani.

27. Un procedimiento para fabricar un polipéptido de cadena sencilla derivado de una neurotoxina de clostridios que comprende:

a): insertar el plásmido de una cualquiera de las reivindicaciones 18-27 en una célula huésped adecuada,

b): hacer crecer dicha célula huésped en el cultivo, y

c): permitir o inducir a la célula huésped expresar el polipéptido de cadena sencilla codificado por dicho plásmido.

28. Un procedimiento para purificar el polipéptido de cadena sencilla recombinante de la reivindicación 11 que comprende las etapas de: lisar una célula que expresa dicho polipéptido de cadena sencilla para producir un lisado celular, y poner en contacto dicho lisado celular con un compuesto diana con el fin de formar un complejo de enlace específico capaz de inmovilizarse que comprende dicha etiqueta de enlace y dicho compuesto diana.

29. Un polipéptido de neurotoxina de clostridios de cadena sencilla que comprende:

a): un primer dominio de secuencia de aminoácidos que comprende

i): un primer dominio que comprende un elemento de enlace que comprende al menos una porción de una cadena pesada de neurotoxina de clostridios capaz de enlazar de manera específica con un marcador superficial de la célula diana bajo condiciones fisiológicas; y

ii): un segundo dominio que comprende un elemento de translocación que comprende al menos una porción de una cadena pesada de neurotoxina de clostridios capaz de facilitar la transferencia de un polipéptido a través de una membrana vesicular; y

b): un segundo dominio de secuencia de aminoácidos que comprende un elemento terapéutico que comprende al menos una porción de una cadena ligera de neurotoxina de clostridios que tiene actividad biológica cuando se libera en el citoplasma de la célula diana,

c): un tercer dominio de secuencia de aminoácidos que comprende la región bucle intercadena de una toxina botulínica de Tipo E (BoNT/E) entre dicha primer y segundo dominios de secuencia de aminoácidos.