ES2488217T3 - Métodos de conversión intracelular de proteínas de cadena sencilla en su forma dicadena - Google Patents
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Abstract
Un método intracelular para convertir una toxina clostridial de cadena sencilla que comprende una región de bucle dicadena en su forma dicadena, comprendiendo el método las etapas de: a) hacer crecer una célula que comprende una construcción de expresión dual a 37°C durante aproximadamente 3,5 horas, comprendiendo la construcción de expresión dual; i) un marco de lectura abierta que codifica una toxina clostridial de cadena sencilla, comprendiendo la toxina clostridial de cadena sencilla un dominio enzimático, un dominio de translocación, un dominio de unión y una región de bucle dicadena que comprende un sitio de escisión de proteasa TEV; y ii) un marco de lectura abierta que codifica una proteasa TEV; b) hacer crecer la célula a 22°C durante aproximadamente 16 a aproximadamente 18 horas, en donde el crecimiento a la etapa (b) induce la expresión de la toxina clostridial de cadena sencilla y la proteasa TEV a partir de la construcción de expresión dual; y en donde la proteasa TEV producida escinde la toxina clostridial de cadena sencilla en el sitio de escisión de proteasa TEV situado en la región de bucle dicadena, convirtiendo así la toxina clostridial de cadena sencilla en su forma de dicadena.
Description
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Los métodos descritos en la presente memoria incluyen, en parte, una proteína que comprende una región de bucle dicadena que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena. Como se usa en esta memoria, el término "región de bucle dicadena" significa la secuencia de aminoácidos de una toxina clostridial que contiene un sitio de escisión de proteasa usado para convertir la forma de cadena sencilla de una toxina clostridial en la forma dicadena. Ejemplos no limitantes de una región de bucle dicadena de toxina clostridial, incluyen, una región de bucle dicadena de BoNT/A que comprende aminoácidos 430-454 de SEQ ID NO: 1; una región de bucle dicadena de BoNT/B que comprende aminoácidos 437-446 de SEQ ID NO: 2; una región de bucle dicadena de BoNT/C1 que comprende aminoácidos 437-453 de SEQ ID NO: 3; una región de bucle dicadena de BoNT/D que comprende aminoácidos 437450 de SEQ ID NO: 4; una región de bucle dicadena de BoNT/E que comprende aminoácidos 412-426 de SEQ ID NO: 5; una región de bucle dicadena de BoNT/F que comprende aminoácidos 429-445 de SEQ ID NO: 6; una región de bucle dicadena de BoNT/G que comprende aminoácidos 436-450 de SEQ ID NO: 7; una región de bucle dicadena de TeNT que comprende aminoácidos 439-467 de SEQ ID NO: 8; una región de bucle dicadena de BaNT que comprende aminoácidos 421-435 de SEQ ID NO: 9; y una región de bucle dicadena de BuNT que comprende aminoácidos 412-426 de SEQ ID NO: 10 (Tabla 2).
Tabla 2. Región de bucle dicadena de toxinas clostridiales
- Toxina
- Región de cadena ligera Región de bucle dicadena que contiene el sitio de escisión de proteasa que se da de forma natural Región de cadena pesada
- BoNT/A
- NMNFTKLKNFTGLFEFYKLL CVRGIITSKTKSLDKGYNK*----ALNDLC IKVNNWDL
- BoNT/B
- KQAYEEISKEHLAVYKIQM CKSVK*-------------------APGIC IDVDNEDL
- BoNT/C1
- PALRKVNPENMLYLFTKF CHKAIDGRSLYNK*------------TLDC RELLVKNTDL
- BoNT/D
- PALQKLSSESVVDLFTKV CLRLTKNSR*---------------DDSTC IKVKNNRL
- BoNT/E
- PRIITPITGRGLVKKIIRF CKNIVSVKGIR*--------------KSIC IEINNGEL
- BoNT/F
- PKIIDSIPDKGLVEKIVKF CKSVIPRKGTK*------------APPRLC IRVNNSEL
- BoNT/G
- KEAYEEISLEHLVIYRIAM CKPVMYKNTGK*--------------SEQC IIVNNEDL
- TeNT
- TNAFRNVDGSGLVSKLIGL CKKIIPPTNIRENLYNRTA*SLTDLGGELC IKIKNEDL
- BaNT
- SRIVGPIPDNGLVERFVGL CKS-IVSKKGTK*------------NSLC IKVNNRDL
- BuNT
- PRIITPITGRGLVKKIIRF CKN-IVSVKGIR*--------------KSIC IEINNGEL
- La secuencia de aminoácidos presentada son como sigue: BoNT/A, residuos 410-462 de SEQ ID No: 1; BoNT/B, residuos 418-454 de SEQ ID No: 2; BoNT/C1, residuos 419-463 de SEQ ID No: 3; BoNT/D, residuos 419-458 de SEQ ID No: 4; BoNT/E, residuos 393-434 de SEQ ID No: 5; BoNT/F, residuos 410-453 de SEQ ID No: 6; BoNT/G, residuos 419-458 de SEQ ID No: 7; TeNT, residuos 422-475 de SEQ ID No: 8; BaNT, residuos 402-443 de SEQ ID No: 9; y BuNT, residuos 393-434 de SEQ ID No: 10. Un asterisco (*) indica el enlace peptídico que se escinde mediante una proteasa de toxina clostridial.
Como se menciona anteriormente, las toxinas clostridiales se traducen como un polipéptido de cadena sencilla de aproximadamente 150 kDa que se escinde posteriormente por escisión proteolítica en un bucle disulfuro mediante una proteasa que se da de forma natural. Este procesado post-traduccional da una molécula dicadena que comprende una cadena ligera de aproximadamente 50 kDa (CL) y una cadena pesada (CP) de aproximadamente 100 kDa unidas mediante un enlace disulfuro sencillo e interacciones no covalentes. Mientras la identidad de la proteasa se desconoce normalmente, el sitio de escisión de proteasa del bucle dicadena para muchas toxinas clostridiales se ha determinado. En BoNTs, la escisión en K448-A449 convierte la forma polipeptídica sencilla de BoNT/A en la forma dicadena; la escisión en K441-A442 convierte la forma polipeptídica sencilla de BoNT/B en la forma dicadena; la escisión en K449-T450 convierte la forma polipeptídica sencilla de BoNT/C1 en la forma dicadena; la escisión en R445-D446 convierte la forma polipeptídica sencilla de BoNT/D en la forma dicadena; la escisión en R422-K423 convierte la forma polipeptídica sencilla de BoNT/E en la forma dicadena; la escisión en K439-A440 convierte la forma polipeptídica sencilla de BoNT/F en la forma dicadena; y la escisión en K446-S447 convierte la forma polipeptídica sencilla de BoNT/G en la forma dicadena. La escisión proteolítica de la forma polipeptídica sencilla de TeNT a A457-S458 da por resultado la forma dicadena. La escisión proteolítica de la forma polipeptídica sencilla de BaNT a K4317-N432 da por resultado la forma dicadena. La escisión proteolítica de la forma polipeptídica sencilla de BuNT a R422-K423 da por resultado la forma dicadena. Dicho sitio de escisión de proteasa de bucle dicadena está unido de forma operable en el marco a una toxina clostridial modificada como una proteína de fusión. Sin embargo, debería notarse también que los sitios de escisión adicionales en el bucle dicadena también
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polinucleótido se clonó usando métodos de biología molecular estándar en un vector de transporte pUCBHB1 en el sitio SmaI para generar plásmidos pUCBHB1/TEV. La molécula de polinucleótido sintetizada se verificó por secuenciación usando BIG DYE TERMINATOR™ Química 3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA) y un secuenciador ABI 3100 (Applied Biosystems, Foster City, CA).
El marco de lectura abierta que codifica las variantes TEV se optimizaron con codones para la expresión de E. coli y todas codifican un fragmento proteolítico de aproximadamente 250 aminoácidos de aproximadamente 27,5 kDa, que corresponden a residuos 2038-2279 de la poliproteína TEV de longitud completa condensada a etiqueta de purificación con afinidad a la polihistidina tanto N como C terminal. La expresión recombinante de proteasa TEV de tipo salvaje da por resultado una proteína que tiene una propensión para escindirse a sí misma en Serina 219 para generar una proteasa truncada con actividad proteolítica altamente disminuida. Así, para eliminar enormemente la autoproteólisis y posterior generación de este producto truncado, se sintetizaron variantes TEV donde la Serina 219 se cambió o bien a Asparraguina (S219N) o Valina (S219V). Además, está bien documentado que aunque la proteasa TEV de tipo salvaje recombinante se expresa a niveles muy altos en E. coli, se casi enteramente insoluble (Kapust et al., 2001). Así, para mejorar la solubilidad del TEV expresado, se hicieron varias variantes de aminoácidos y se ensayaron para determinar si los cambios dieron por resultado solubilidad aumentada de proteína. Las variantes de TEV sintetizadas se muestran en la Tabla 3. La variante 1 representó una construcción TEV con codón optimizado fabricado con una etiqueta de His C terminal y la mutación S219N. La variante 11 fue una construcción con secuencia de ADN nativo de proteasa TEV fabricada con una etiqueta N terminal y la mutación S219N.
- Tabla 3. Variantes de proteasa TEV
- Variante
- Cambio para Eliminación de Autoproteólisis Cambios que Mejoran la Solubilidad Etiqueta de afinidad ADN SEQ ID NO: Proteína SEQ ID NO:
- 1
- S219N — Extremo C 65 66
- 2
- S219N L56V, S135G Extremo N 67 68
- 3
- S219N T17S, N68D, I77V Extremo N 69 70
- 4
- S219N N44V, L56V, S135G Extremo N 71 72
- 5
- S219N L56V, N68D, S135G Extremo N 73 74
- 6
- S219N T17S, L56V, N68D, I77V Extremo N 75 76
- 7
- S219N T17S, N68D, I77V, S135G Extremo N 77 78
- 8
- S219N T17S, N44V, L56V, N68D, I77V, S135G Extremo C 79 80
- 9
- S219V T17S, N44V, L56V, N68D, I77V, S135G Extremo N 81 82
- 10
- S219N T17S, N44V, L56V, N68D, I77V, S135G Extremo N 83 84
- 11
- S219N — Extremo N 85 86
Para construir las construcciones de expresión variantes pET29/TEV, se digirió una construcción pUCBHB1/TEV con endonucleasas de restricción que 1) escinden la inserción que comprende el marco de lectura abierta que codifica la TEV; y 2) permite a esta inserción estar unida de forma operable a un vector pET29 (EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI). Usando un procedimiento de ADN ligasa T4 esta inserción se ligó direccionalmente en un vector pET29 digerido con las mismas endonucleasas de restricción en el sitio de clonado múltiple. La mezcla de ligado se transformó en células Acella BL21(DE3) de E. coli electrocompetentes (Edge BioSystems, Gaithersburg, MD) por electroporación, se pusieron en platos en platos de agar Luria-Bertani al 1,5% (pH 7,0) que contenían 50 µg/mL de canamicina, y se colocaron en una incubadora a 37°C para el crecimiento toda la noche. Las bacterias que contienen las construcciones de expresión se identificaron como colonias resistentes a la canamicina. Las construcciones candidatas se aislaron usando un procedimiento de mini-preparación de plásmido de lisis alcalina y se analizaron por mapeo por digestión con endonucleasas de restricción y secuenciación de ambas hebras de ADN para confirmar la presencia e integridad de la inserción génica TEV. Esta estrategia de clonado dio una construcción de expresión pET29 que comprende la molécula de polinucleótido que codifica variantes TEV unidas de forma operable a péptido de purificación de afinidad de polihistidina o bien carboxilo terminal o amino terminal.
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-
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