KR102469721B1 - 보툴리눔 톡신 유사 활성을 갖는 펩타이드 및 이의 용도 - Google Patents

보툴리눔 톡신 유사 활성을 갖는 펩타이드 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 근육 수축 완화 활성 및 세포외 기질 증가 활성을 갖는 트롤록스-펩타이드 결합체에 관한 것으로, 근육의 이완, 신경근육질환의 예방 또는 치료, 또는 피부주름을 포함하는 피부상태의 개선을 목적으로 하는 의약품, 의약외품 또는 화장품의 유효성분으로 사용될 수 있다.

Description

보툴리눔 톡신 유사 활성을 갖는 펩타이드 및 이의 용도{Peptide Having Botulinum Toxin-Like Activity and Uses thereof}
본 발명은 트롤록스(Trolox)와 펩타이드가 화학적으로 결합된 구조를 갖는 트롤록스-펩타이드 결합체 및 그의 용도에 관한 것이다.
근육의 이완과 수축을 조절하기 위하여 근육의 상층에는 신경근육 접합부가 있으며, 이 신경 말단에는 시냅스 소포가 장전되어 있다. 근육들은 일종의 신경소포 내부에서 전달되는 신경전달물질의 메시지를 받아 수축하게 된다. 신경전달물질들이 방출되려면, SNARE(soluble Nethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor; SNAP Receptor)라 불리는 수용복합체가 있어야만 하며, 이 복합체가 신경물질들이 근육과 도킹하게 한다. 만약, SNARE 수용복합체가 약간 불안정하다면, 전달체는 신경전달물질을 활성적으로 분비할 수 없으며, 이로 인해 신경근연접에서 발생한 임펄스가 근육으로 전달되지 않고, 임펄스가 중단되므로 근육이 이완되게 된다. 즉, 근육 수축이 덜 일어나며 이것은 주름 생성이 감소된다는 것을 의미한다.
한편, 안면 표정 주름의 형성 원인이나 그 메커니즘은 피부를 내부로 당기는 표피 근육 긴장에 있다. 이러한 근육 긴장은 안면 근육 약화, 신경의 활동 과다의 결과이다. 신경의 과잉 활동은 근육 섬유를 자극하는 제어되지 않은 과도한 신경전달물질의 방출 특성이다. 이 때문에, 신경전달물질의 방출을 조절하는 분자는 근육의 긴장을 이완시켜, 안면 주름을 제거하는데 기여한다.
이러한 메커니즘을 기초로 하여 많은 주름 생성 억제를 위한 물질들이 연구되고 시판되고 있다.
보툴리눔 톡신(Botulinum neurotoxin, BoNT)은 신경전달물질 배출에 관여하는 핵심 단백질인 SNARE 단백질을 절단하는 프로테아제(protease)로 안면 주름 제거 용도로 임상 실험과 미용에 가장 보편적으로 사용된다. 보툴리눔 톡신은 SNARE 단백질을 절단함으로써 신경전달물질의 분비 억제 및 신경전달을 차단하여 결과적으로 보툴리눔 톡신이 침투된 근육세포가 마비되도록 한다.
그러나, 보툴리눔 톡신의 마비 효과는 평균 6개월간 가역적이므로, 보툴리눔 톡신의 반복 주입이 필요하며, 환자의 면역계에 의해 인식될 수 있는 크기를 가지므로 약제에 대한 면역 반응이 유발될 수 있다. 보툴리눔 톡신에 대한 항체의 형성은 현저한 치료 효능 손실을 초래하므로 심각한 문제이다.
따라서, 면역 반응을 유발하지 않는 보다 간단하고 안정한 분자 구조를 가지면서, 신경전달물질의 방출을 조절하여 근육 경련을 치료하고, 안면 비대칭 및/또는 안면 주름(특히, 안면 표정 주름)을 감소하거나 제거하는데 효능이 있는 신규 활성 성분을 개발할 필요가 있다.
삭제
선행기술 1: GenBank: BAP25669.1, hypothetical protein (plasmid) [Clostridium botulinum] 선행기술 2: Takuya Arai et al., 'Design, synthesis, and evaluation of Trolox-conjugated amyloid-b C-terminal peptides for therapeutic intervention in an in vitro model of Alzheimer's disease', Bioorganic & Medicinal Chemistry, Vol. 24, pp. 4138-4143, 2016.
본 발명의 일 목적은 신경전달물질의 방출을 억제하는, 신규한 펩타이드와 트롤록스가 결합된 트롤록스-펩타이드 결합체를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 일 목적은 근육의 수축을 완화하거나 근육을 이완하기 위한 용도의 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 일 목적은 신경근육질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 일 목적은 주름 개선을 포함하는 피부상태 개선용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 측면은, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드와 트롤록스가 결합된 트롤록스-펩타이드 결합체를 제공한다.
본 발명의 다른 측면은, 상기 트롤록스-펩타이드 결합체를 유효성분으로 포함하는 근육 이완용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 트롤록스-펩타이드 결합체를 유효성분으로 포함하는 신경근육질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 트롤록스-펩타이드 결합체를 유효성분으로 포함하는 피부상태 개선용 조성물을 제공한다.
본 발명의 트롤록스-펩타이드 결합체는 신경전달물질의 분비를 억제함으로써 SNARE 및 신경전달물질이 관여하는 세포내 반응의 조절제로 유용하다. 이에, 본 발명의 트롤록스-펩타이드 결합체는 근육 이완용 조성물, 신경근육질환의 예방 또는 치료용 조성물, 또는 주름 개선을 포함하는 피부상태 개선용 조성물로 활용될 수 있다.
다만, 본 발명의 효과는 상기에서 언급한 효과로 제한되지 아니하며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 하기의 기재로부터 당업자에게 명확히 이해될 수 있을 것이다.
도 1은 신경세포에서 본 발명의 트롤록스-펩타이드 결합체 처리에 의해 신경전달물질의 방출이 억제되는 효과를 나타낸 것이다: 니코틴(Nicotine)과 염화칼륨(KCl)은 신경전달물질의 분비를 촉진하기 위한 유도 인자; 테타누스(Tetanus)는 양성 대조군.
도 2a는 실험동물에 본 발명의 트롤록스-펩타이드 결합체를 처리하여 근육 이완 효과를 확인한 사진이다; BoNT는 보툴리눔 톡신으로 양성 대조군.
도 2b는 실험동물에 본 발명의 트롤록스-펩타이드 결합체를 처리하여 근육 이완 효과의 지속시간을 확인한 그래프이다: A는 트롤록스-펩타이드 결합체를 처리하였을 때의 DAS 결과, B는 보툴리눔 톡신을 처리하였을 때의 DAS 결과.
도 3은 섬유모세포(fibrolast)에서 본 발명의 트롤록스-펩타이드 결합체에 의해 진피를 구성하는 COL1A1, 피브로넥틴, 및 엘라스틴의 발현이 증가하는 효과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 일 측면은 하기와 같은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 및 상기 펩타이드에 활성물질이 결합된 활성물질-펩타이드 결합체를 제공한다.
[서열번호 1] KFLIK
본 발명의 펩타이드의 합성은 예를 들어 기기를 이용하거나 유전공학 기법을 이용하여 수행할 수 있다. 기기를 이용하여 합성하는 경우, 자동 펩타이드 합성기에서 원하는 펩타이드를 Fmoc 고체상(Fmoc solid-phase) 방법으로 합성할 수 있다.
구체적인 일 실시예에서, 본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드는 Fmoc 고체상(Fmoc solid-phase) 방법을 이용하여 합성 및 동정하였고, 동정된 펩타이드의 효능을 검증하는 것에 의해 선별되었다.
구체적인 일 실시예에서, 동정된 펩타이드의 효능을 검증하기 위해, ⅰ) SNARE 복합체 형성 억제 효과, ⅱ) 신경전달물질 분비 억제 효과에 대한 유효성 검증을 통해 신경전달물질 분비 억제용 펩타이드를 선별하였다.
나아가, 본 발명의 활성물질-펩타이드 결합체는 위의 과정을 통해 선별된 펩타이드와 활성물질을 결합시켜 제조할 수 있다. 구체적인 일 실시예에서, 상기 활성물질을 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드와 화학적으로 결합시켜 제조한 활성물질-펩타이드 결합체들의 효능을 검증하는 것에 의해 선별되었다.
구체적인 일 실시예에서, 10종의 활성물질-펩타이드 결합체들을 마우스에 투여하여 DAS 분석 결과가 4로 나온 결합체들을 1차 선별한 후 근육 이완 효과의 지속시간을 관찰하여 동일 투여량에서 가장 긴 지속시간을 보인 활성물질-펩타이드 결합체를 최종 선별하였다.
본 명세서에서, 용어 '펩타이드'란 아미노산 잔기로 이루어진 선형의 분자를 의미하며, 구체적으로 본 발명의 펩타이드는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 '펩타이드'는 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서, 아미노산 잔기의 결실, 삽입, 치환 또는 이들의 조합에 의해서 상이한 서열을 가지는 아미노산의 변이체들, 또는 단편들일 수 있다. 상기 펩타이드의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 아미노산 교환은 본 기술 분야에 공지되어 있다. 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 변형될 수 있다. 따라서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 포함한다. 상기 실질적으로 동일한 단백질이란 상기 서열번호 1의 아미노산 서열과 75% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 예컨대, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 의미하나 이에 한정되지 않으며, 75% 이상의 아미노산 서열의 상동성을 가지며 동일한 활성을 가진다면 본 발명의 범위에 포함된다. 또한, 본 발명의 펩타이드는 표적화 서열, 태그(tag), 표지된 잔기, 반감기 또는 펩타이드 안정성을 증가시키기 위한 특정 목적으로 제조된 아미노산 서열을 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 보다 나은 화학적 안정성, 강화된 약리 특성(반감기, 흡수성, 역가, 효능 등), 변경된 특이성(예를 들어, 광범위한 생물학적 활성 스펙트럼), 감소된 항원성을 획득하기 위하여, 본 발명의 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 보호기가 결합되어 있을 수 있다. 예컨대, 상기 보호기는 아세틸기, 플루오레닐 메톡시 카르보닐기, 포르밀기, 팔미토일기, 미리스틸기, 스테아릴기 또는 폴리에틸렌글리콜(PEG)일 수 있으나, 펩타이드의 개질, 특히 펩타이드의 안정성 증진시킬 수 있는 성분이라면, 제한없이 포함할 수 있다. 상기 '안정성'은 생체 내 단백질 절단 효소의 공격으로부터 본 발명의 펩타이드를 보호하는 생체내(in vivo)에서의 안정성뿐만 아니라, 저장안정성(예컨대, 상온 저장 안정성)도 포함하는 의미로 사용된다.
본 명세서에서, 용어 '활성물질'은 적어도 하나의 카르복시기를 가지고, 본 발명의 펩타이드의 N-말단에 화학적으로 결합될 수 있으며, 펩타이드의 활성을 상승적으로 유도하는 물질을 의미하며, 구체적으로 상기 활성물질은 트롤록스(trolox) 일 수 있다.
본 발명의 상기 '트롤록스'는 6-하이드록시-2,5,7,8-테트라메틸크로만-2-카르복실산으로, 비타민 E의 수용성 유사체이며 항산화제로 사용된다. 트롤록스의 구조는 하기 화학식 1과 같다.
[화학식 1]
Figure 112020060716668-pat00001
본 발명의 활성물질-펩타이드 결합체에서 활성물질이 트롤록스인 경우, 트롤록스와 결합된 펩타이드를 “트롤록스-펩타이드 결합체”로 명명하였다.
구체적으로, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드에 트롤록스가 결합된 트롤록스-펩타이드 결합체를 제공한다.
상기 트롤록스는 펩타이드의 N-말단, C-말단 또는 곁사슬에 결합할 수 있다. 구체적으로, 상기 트롤록스의 카르복시기는 펩타이드의 N-말단과 펩타이드 결합을 할 수 있다.
상기 트롤록스-펩타이드 결합체의 일구현예는 하기 화학식 2로 표시되는 것일 수 있다.
[화학식 2]
Figure 112020060716668-pat00002
본 발명의 구체적인 실시예에서, 상기 트롤록스-펩타이드 결합체는 신경세포의 말단에서 신경전달물질의 방출을 억제하는 효과가 우수함을 확인하였으며, 실험동물에서 수축된 근육을 이완하는 효과가 우수함을 확인하였다.
또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명의 트롤록스-펩타이드 결합체는 근육의 수축을 완화하는 효과가 우수할 뿐 아니라 진피를 구성하는 단백질의 발현을 증가시키므로 피부 주름 개선에도 현저한 효과가 있음을 확인하였다.
이에, 본 발명의 다른 일 측면은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드와 트롤록스가 결합된 트롤록스-펩타이드 결합체를 포함하는 근육 이완용 조성물을 제공한다.
상기 펩타이드, 트롤록스 및 트롤록스-펩타이드 결합체의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.
본 발명의 근육 이완용 조성물에서 트롤록스-펩타이드 결합체는 신경세포 말단에서 신경전달물질의 방출을 억제함으로써, 근육의 수축을 완화하거나, 근육을 이완시킬 수 있다.
본 발명의 근육 이완용 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예컨대, 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 트롤록스-펩타이드 결합체를 유효성분으로 포함하는 신경근육질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 트롤록스-펩타이드 결합체는 SNARE 복합체의 형성을 저해함으로써 신경전달물질을 억제하는 역할을 수행할 수 있는바, 근육 수축을 완화하거나, 근육 이완을 목적으로 하는 신경근육질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 이용할 수 있다.
본 명세서에서 '신경근육질환'은 신경전달물질의 과도한 방출에 의하여 근육이 수축되거나 경직된 상태로 인해 유발될 수 있는 질환을 의미하며, 예를 들어 근육간대경련(myoclonus), 반측성 안면경련(hemifacial spasm), 경련성 사경(spasmodic torticollis), 열항(anal fissure), 안검경련(blepharospasm), 안면 경련(facial spasm), 뇌성마비(cerebral palsy), 사시(strabismus), 측두 하악장애(temperomandibular disorder), 신경 통증(neuralgia), 근육통(myalgia), 과민성 방광(overactive bladder), 절박성 요실금(urge urinary incontinence), 근긴장 이상증(dystonia), 다한증(hyperhydrosis) 및 콜린성 신경계에 의해 제어되는 선(gland)의 과다 분비에 의해 발현되는 질환으로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 신경근육질환의 예방 또는 치료용 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구제 제형, 외용제, 좌제, 및 멸균 주사용액 형태로 제형화되어 사용할 수 있고, 제형화를 위하여 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다.
상기 약학적으로 허용되는 담체는 제제시 통상적으로 이용되는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아, 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세 결정성 셀룰로스, 폴리비닐 피로리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필 히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등을 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 더 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 근육 내, 정맥 내, 복강 내, 피하, 피내, 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 '약학적으로 유효한 양'은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 상기 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 비만 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 동시에, 별도로, 또는 순차적으로 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
상기 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성율, 배설 속도, 질병 종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라 증감될 수 있으며, 예를 들어 상기 약학적 조성물을 1일당 환자 체중 1㎏ 당 약 0.0001㎍ 내지 500mg, 바람직하게는 0.01㎍ 내지 100mg 투여할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드와 트롤록스가 결합된 트롤록스-펩타이드 결합체를 유효성분으로 함유하는 피부상태 개선용 조성물을 제공한다.
상기 펩타이드, 트롤록스 및 트롤록스-펩타이드 결합체의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.
본 명세서에서 '피부상태'는 피부 노화에 의한 피부의 탄력 감소, 주름의 생성 또는 안면에 미세라인이 생성되는 것을 의미하며, 상기 노화는 시간의 흐름 또는 외부 환경 등에 의해 유발되는 내인성 노화와 외인성 노화를 모두 포함한다.
또한, 상기 주름은 안면을 포함하는 모든 신체 부위에서 발생하는 주름을 의미하고, 정적인 주름(static rhytides)과 동적인 주름(dynamic rhytides)을 모두 포함할 수 있다.
본 명세서에서 '피부상태 개선'은 피부의 주름 및 탄력과 관련된 능력을 유지 또는 강화시키는 것을 의미하며, 예를 들어, 미세 라인(fine line)의 외형(appearance) 감소, 주름의 외형 감소, 눈의 확장(widening), 구각 리프팅(lifting the corner of the mouth), 근육양의 감소, 안면 비대칭의 감소, 및 윗 입술로부터 전개되는 라인의 평탄화로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 피부상태 개선용 조성물에서 트롤록스-펩타이드 결합체는 SNARE 복합체의 형성을 억제함으로써, 신경전달물질을 분비할 수 없도록 하며, 따라서 안면근육의 수축을 완화함으로써 피부상태를 개선하는 효과를 나타낼 수 있다.
나아가, 본 발명의 피부주름 개선용 조성물에서 트롤록스-펩타이드 결합체는
i) ColⅠα1(collagen type Ⅰ alpha 1) 발현 증가, ii) 피브로넥틴(fibronectin) 유전자의 발현 증가 또는 iii) 엘라스틴(elastin) 유전자의 발현 증가를 유도하여 피부 주름을 예방 또는 개선함으로써 피부상태를 개선하는 효과를 나타낼 수 있다.
구체적으로 피부를 구성하는 주 단백질인 콜라겐은 피부 진피에 존재하는 섬유아세포에서 프로콜라겐의 형태로 합성된 후 세포외 기질로 분비되고, 활성형 콜라겐으로 전환되는데, 본 발명의 트롤록스-펩타이드 결합체는 피부 진피에서 활성 콜라겐 단백질의 합성을 증가시킴에 따라, 주름 형성을 억제할 수 있다. 또한, 피부의 진피는 교원섬유인 콜라겐과 탄력섬유인 엘라스틴으로 구성되어 있는데, 상기 콜라겐 섬유는 피부 장력 형성과 구조적인 통합을 이루게 하고, 엘라스틴 섬유는 피부 탄력에 관여함으로써 피부 탄력을 증진시킬 수 있다. 구체적으로, 본 발명에 다른 트롤록스-펩타이드 결합체는 엘라스틴의 발현을 촉진함으로써, 피부 탄력 증진 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명의 상기 피부상태 개선용 조성물은 화장료 조성물일 수 있다.
상기 화장료 조성물은 본 기술분야에서 통상적으로 제조되는 임의의 제형으로 제조될 수 있고, 예를 들면, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화 될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 화장료 조성물은 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이, 파우더, 헤어토닉, 헤어크림, 헤어로션, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어컨디셔너, 헤어스프레이, 헤어 에어졸, 포마드, 젤 등과 같은 용액, 솔젤, 에멀젼, 오일, 왁스, 에어졸 등의 다양한 형태로 제조될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 화장료 조성물은 본 발명의 트롤록스-펩타이드 결합체에 더하여 부형제, 담체 등 기타 첨가제를 포함할 수 있으며 일반 피부 화장료에 배합되는 보통의 성분을 필요한 만큼 적용 배합하는 것이 가능하다.
상기 화장료 조성물의 제형의 형태가 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀루로오스 유도체, 폴리에틸렌글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
상기 화장료 조성물의 제형의 형태가 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토오스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 사용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체가 포함될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 화장료 조성물의 제형의 형태가 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용될 수 있고, 예를 들면 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
상기 화장료 조성물의 제형의 형태가 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 등과 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
상기 화장료 조성물의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
상기 화장료 조성물의 제형이 헤어샴푸인 경우에는 본 발명의 트롤록스-펩타이드 결합체에 증점제, 계면활성제, 점도 조절제, 보습제, pH 조절제, 방부제, 에센셜 오일 등과 같이 샴푸를 조성하기 위한 베이스 성분들이 혼합될 수 있다. 상기 증점제로는 CDE가 사용될 수 있고, 상기 계면활성제로는 음이온 계면활성제인 LES와, 양쪽성 계면활성제인 코코 베타인이 사용될 수 있고, 상기 점도조절제로는 폴리 쿼터가 사용될 수 있으며, 상기 보습제로는 글리세린이 사용될 수 있고, 상기 pH 조절제로는 구연산, 수산화나트륨이 사용될 수 있다. 상기 방부제로는 자몽 추출물 등이 사용될 수 있고, 이 외에도 시더우드, 페퍼민트, 로즈마리 등의 에센셜 오일과 실크 아미노산, 펜타올 또는 비타민 E가 첨가될 수 있다.
상기 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서 본 발명의 상기 트롤록스-펩타이드 결합체와 담체 성분 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 사용되는 성분들, 예를 들면 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 등을 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 피부상태 개선용 조성물은 의약외품 조성물일 수 있다.
본 명세서에서 '의약외품'은 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 개선, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 물품들 중에서 의약품보다 작용이 경미한 물품들을 의미하는 것으로, 예를 들어 약사법에 따르면 의약외품이랑 의약품의 용도로 사용되는 물품을 제외한 것으로 사람/동물의 질병 치료나 예방에 쓰이는 제품, 인체에 대한 작용이 경미하거나 직접 작용하지 않는 제품 등이 포함된다.
본 발명의 의약외품 조성물은 바디 클렌저, 폼, 비누, 마스크, 연고제, 크림, 로션, 에센스 및 스프레이로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상으로 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 조성물은 밴드, 생리대 등의 형태로 제조될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 트롤록스-펩타이드 결합체를 의약외품 첨가물로 사용할 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 의약외품 또는 의약외품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 다라 적절하게 사용할 수 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 트롤록스-펩타이드 결합체는 신경세포 말단에서 신경전달물질의 분비를 억제함으로써 근육 수축의 완화 또는 근육 이완 효과가 있으므로 근육 수축의 완화를 목적으로 하는 의약품, 의약외품 또는 화장료 조성물의 원료로 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
신규 펩타이드의 합성 및 물성 확인
1-1. 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드의 합성
서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 신규 펩타이드 서열 'KFLIK'은 공지의 방법을 이용하여 제조하였다. 분자량 측정기를 이용하여 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드의 분자량을 측정한 결과, 그 분자량이 647.4 Da에 해당함을 확인하였다.
1-2. 장기 보관시 고온안정성 평가
서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 본 발명의 펩타이드를 1000ppm 농도로 멸균 증류수에 녹이고, 45℃에서 7일, 14일, 28일, 60일, 75일 동안 보관한 후, HPLC 분석을 수행하였다.
그 결과, [도 1a]에 나타낸 바와 같이, 45℃ 조건에서 최대 관찰일인 75일 동안 본 발명의 펩타이드가 안정성을 유지하는 것을 확인할 수 있었다.
1-3. 고온 안정성 평가
본 발명의 펩타이드를 1000ppm 농도로 멸균 증류수에 녹이고, 121℃에서 15분, 30분 동안 가온 한 후 HPLC 분석을 수행하였다.
그 결과, [도 1b]에 나타낸 바와 같이, 121℃에서 최대 가온 시간인 30분 동안 본 발명의 펩타이드가 안정성을 유지하는 것을 확인할 수 있었다.
트롤록스-펩타이드 결합체의 제조
펩타이드 반응기에 1mole의 펩타이딜 수지와 10㎖의 1-메틸-2-피롤리돈(NMP)을 넣고, 270mg(2.0 equiv.)의 1-히드록시벤조트리아졸(1- hydroxybenzotriazole, 1-HOBt) 과 759 mg (2.0 equiv.)의 N,N,N',N'-테트라메일-O-(1H-벤조트리아졸-1-일)우로니움 헥사플루오로포스페이트(N,N,N′,N′-Tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate, HBTU)를 첨가하고 30분 동안 반응시켰다. 그런 다음, 상기 반응물에 388mg (3.0 equiv.)의 N,N'-디이소프로필에틸아민(N,N'-Diisopropylethylamine, DIEA)과 500mg (2.0 equiv.)의 트롤록스(trolox)를 첨가하여 상온에서 72시간 동안 반응시킨 뒤, 여과하였다. 그런 다음, 상기 여과물과 절단 용액(cleavage solution)을 상온에서 2시간 동안 반응시켜, 레진 및 보호기를 제거하였다. 마지막으로 10㎖의 디에틸에테르를 넣어 결정화시켜 트롤록스-펩타이드 결합체(즉, 서열번호 1의 펩타이드와 트롤록스의 결합체)를 제조하였다. 트롤록스-펩타이드 결합체를 제조하기 위한 반응식은 하기 반응식 1과 같다.
[반응식 1]
Figure 112020060716668-pat00003
생성된 트록록스-펩타이드 결합체에 대하여 질량 분석을 수행한 결과 분자량 880.1 Da에 해당하는 트롤록스-펩타이드 결합체가 합성되었음을 확인하였다.
[실험예 1]
신경세포에서의 신경전달물질 분비 억제 효과 확인
트롤록스-펩타이드 결합체에 의한 신경세포에서의 신경전달물질 분비 저해 효과를 확인하기 위하여, 신경아세포종 유래의 세포주(SH-SY5Y)를 사용하여 신경전달물질인 아세틸콜린(acetylcholine)의 분비량을 측정하였다.
구체적으로, SH-SY5Y 세포를 디쉬에 주입하고 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양한 후 배지를 무혈청 배지로 교체하였다. 그 후 1μM, 10μM, 50μM 농도의 트롤록스-펩타이드 결합체를 디쉬에 처리하고, 양성대조군으로는 50nM의 테타누스(tetanus)를 디쉬에 처리하여 48시간 동안 배양시켰다. 이 후 니코틴(NIC)과 염화칼륨(KCl)을 30분간 처리하여 아세틸콜린의 방출을 유도하였다. 그 다음, 배지에 포함되어 있는 아세틸콜린의 분비량을 아세틸콜린 분석 키트(Abcam)를 사용하여 측정하였다.
그 결과, [도 1]에 나타난 바와 같이 니코틴(NIC)과 염화칼륨(KCl) 만을 처리한 군에서는 아무 것도 처리하지 않은 대조군 대비 3배 이상 아세틸콜린이 분비되었으나, 트롤록스-펩타이드 결합체를 처리한 군에서는 모두 유의성 있게 아세틸콜린의 분비가 억제되었다.
[실험예 2]
실험동물에서 근육 이완 효과 확인
2-1. 동물 모델의 준비
구체적으로, 7주령의 암컷 Sprague-Dawley 랫드(샘타코 BIO KOREA)를 동물실험에 사용하였으며, 랫드를 각각 보툴리눔 신경독소(botulinum neurotoxin, BoNT) 1U, 3U 처리군 및 본 발명의 트롤록스-펩타이드 결합체 2.5mg, 5mg/head 처리군으로 분류하였다.
실험동물의 오른쪽 종아리 근육에 보툴리눔 신경독소와 본 발명의 트롤록스-펩타이드 결합체를 각각 투여하였다.
2-2. 근육 수축 완화 효과 확인
트롤록스-펩타이드 결합체가 근육 이완에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 실시예 2-1의 각 처리군에 대하여 마비된 발가락 근육이 이완되는데 걸리는 시간을 육안관찰분석을 통해 비교하였다.
구체적으로, 각 처리군을 투여한 랫드의 오른쪽 발을 관찰하여 근육마비를 DAS(Digit Abduction Scoring) 분석을 이용하여 측정하였다. DAS 분석에서, 랫드에 그의 후지(hind limb)를 신장하고 그의 뒷 발가락(hind digit)을 벌리는 것인 특징적인 놀람 반응(startle response)을 유발하기 위해 마우스를 단시간 동안 그의 꼬리에 의해 부유하게 하였다. 랫드가 놀람 반응을 보일 수 있는 정도를 5점 척도(0 sowl 4)로 평가하고, O점은 정상적인 놀람 반응을 나타내며, 4점은 발가락 벌림(digit abduction) 및 다리 신장(leg extension)의 최대 감소를 나타낸다(0점: 다섯 발가락이 모두 떨어져 있는 것; 1점: 바깥 발가락 하나가 외전 동안 붙어있는 것; 2점: 세개의 발가락이 붙어있는 것. 3점: 네개의 발가락이 붙어있는 것; 4점: 다섯 개의 발가락이 모두 붙어있는 것).
그 결과, [표 2], [도 2a], [도 2b] 및 [도 2c]에 나타난 바와 같이 3일 후에는 모든 군에서 근육 이완 효과가 가장 높았고 시간이 지날수록 효과가 어느 정도 감소하였으며, 본 발명의 트롤록스-펩타이드 결합체를 주사한 군이 보톡스를 주사한 군 보다 근육 이완 효과가 더 오래 지속되었다.
시간 점수
BoNT/A (Meditoxin) Trolox-Peptide Conjugate
1 unit 3 unit 2.5 mg 5 mg
30 min 0 0 4 4
1 day 2 4 4 4
3 days 4 4 4 4
7 days 1 4 4 4
10 days 0 4 4 4
14 days 0 2 2 3
[실험예 3]
트롤록스-펩타이드 결합체에 의한 피부주름 개선 효과 확인
본 발명의 트롤록스-펩타이드 결합체가 피부주름을 개선하는 효과가 있는지 확인하기 위하여 마우스 섬유모세포(NIH3T3)를 사용하여 진피를 구성하는 단백질의 발현 양상을 확인하였다.
구체적으로, NIH3T3 세포를 1.5x105cells/well의 밀도로 6-웰 플레이트에 접종한 후 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 16시간 동안 배양하였다. 다음으로, 1μM, 10μM, 50μM 농도의 트롤록스-펩타이드 결합체를 플레이트에 처리하여 다시 16시간 동안 배양한 후 배양 세포로부터 RNA를 분리하였다. cDNA 합성 키트(Intron, Korea)를 사용하여 분리된 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. 이때 사용된 프라이머 염기서열은 표 3에 제시된 바와 같다. 증폭된 PCR 산물을 아가로오스 겔에 전기영동하여 DNA 밴드를 확인하였다.
유전자 프라이머 염기서열(5'->3') 서열번호
collagen type I alpha 1 (Col1a1) F CACCCTCAAGAGCCTGAGTC 2
R AGACGGCTGAGTAGGGAACA 3
Fibronectin F CCAGGAACCGAGTACACCAT 4
R ATACCCAGGTTGGGTGATGA 5
Elastin F GGACCCCTGACTCGCGACCT 6
R GGGGAGGTGGGACTGCCCAA 7
Glyceraldehyde 3-phosphate
dehydrogenase (GAPDH)		 F GGTGTGAACGGATTTGGCCGTATTG 8
R CCGTTGAATTTGCCGTGAGTGGAGT 9
그 결과, [도 3]에 나타난 바와 같이 대조군 대비 트롤록스-펩타이드 결합체를 처리한 경우 콜라겐, 피브로넥틴 및 엘라스틴의 발현 수준이 현저하게 증가하는 것을 확인하였다.
이를 통해, 트롤록스-펩타이드 결합체는 진피를 구성하는 단백질의 발현 수준을 증가시킴으로써 피부 주름을 예방 또는 개선하는 효과를 나타낼 수 있음을 알 수 있다.
<110> CAREGEN CO., LTD. <120> Peptide Having Botulinum Toxin-Like Activity and Uses thereof <130> 2020-DPA-3710 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 1 Lys Phe Leu Ile Lys 1 5

Claims (13)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드와 트롤록스가 결합된 트롤록스-펩타이드 결합체이며,
    여기서 상기 트롤록스는 펩타이드의 N-말단과 펩타이드 결합을 하는 것인, 트롤록스-펩타이드 결합체.
  2. 삭제
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 트롤록스는 신경전달물질의 분비를 억제함으로써 근육의 수축을 완화시키는 것인, 트롤록스-펩타이드 결합체.
  4. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드와 트롤록스가 결합된 트롤록스-펩타이드 결합체를 함유하는 근육 이완용 조성물이고, 상기 트롤록스는 상기 펩타이드의 N-말단에 결합된 것인, 근육 이완용 조성물.
  5. 청구항 4에 있어서,
    상기 조성물은 신경전달물질의 분비를 억제함으로써 근육의 수축을 완화시키는 것인, 근육 이완용 조성물.
  6. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드와 트롤록스가 결합된 트롤록스-펩타이드 결합체를 유효성분으로 함유하는 신경근육질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물이며,
    상기 트롤록스는 펩타이드의 N-말단과 펩타이드 결합을 하는 것이고,
    상기 신경근육질환은 근육간대경련(myoclonus), 반측성 안면경련(hemifacial spasm), 경련성 사경(spasmodic torticollis), 열항(anal fissure), 안검경련(blepharospasm), 안면 경련(facial spasm), 뇌성마비(cerebral palsy), 사시(strabismus), 측두 하악장애(temperomandibular disorder), 신경 통증(neuralgia), 근육통(myalgia), 과민성 방광(overactive bladder), 절박성 요실금(urge urinary incontinence), 근긴장 이상증(dystonia) 및 다한증(hyperhydrosis)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 약학적 조성물.
  7. 삭제
  8. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드와 트롤록스가 결합된 트롤록스-펩타이드 결합체를 유효성분으로 함유하는 피부상태 개선용 조성물이며,
    상기 트롤록스는 펩타이드의 N-말단과 펩타이드 결합을 하는 것이고,
    상기 피부상태 개선은 미세 라인(fine line)의 외형(appearance) 감소, 주름의 외형 감소, 눈의 확장(widening), 구각 리프팅(lifting the corner of the mouth), 근육양의 감소, 안면 비대칭의 감소 및 윗 입술로부터 전개되는 라인의 평탄화로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 피부상태 개선용 조성물.
  9. 청구항 8에 있어서,
    상기 조성물은 신경전달물질의 분비를 억제함으로써 안면근육의 수축을 완화시키는 것인, 피부상태 개선용 조성물.
  10. 청구항 8에 있어서,
    상기 조성물은 i) ColⅠα1(collagen type Ⅰ alpha 1) 발현 증가, ii) 피브로넥틴(fibronectin) 유전자 발현 증가 또는 iii) 엘라스틴(elastin) 유전자 발현을 증가시킴으로써 주름을 개선하는 것인, 피부상태 개선용 조성물.
  11. 삭제
  12. 청구항 8에 있어서,
    상기 조성물은 화장료 조성물인 것인, 피부상태 개선용 조성물.
  13. 청구항 8에 있어서,
    상기 조성물은 의약외품 조성물인 것인, 피부상태 개선용 조성물.
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