KR102463320B1 - 펜타펩타이드를 유효성분으로 포함하는 통증의 완화, 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 펜타펩타이드를 유효성분으로 포함하는 통증의 완화, 개선, 예방, 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 본 발명의 펜타펩타이드는 염증을 유발하는 사이토카인의 발현을 억제하고, 통증을 전달하는 신경전달물질의 방출을 억제함으로써 통증의 예방, 완화, 개선, 또는 치료를 목적으로 하는 의약품, 의약외품 또는 화장품의 원료로 사용될 수 있다.

Description

펜타펩타이드를 유효성분으로 포함하는 통증의 완화, 예방 또는 치료용 조성물{Composition for Alleviating, Preventing or Treating Pain Comprising Pentapeptide as Active Ingredients}

본 발명은 신규한 펜타펩타이드의 통증 완화, 예방 또는 치료 용도에 관한 것이다.

통증은 다양한 원인에 의해 발생하며, 통증이 장시간 지속되거나 그 자극이 너무 심한 경우에는 일상생활에 지장이 생기고 불안과 공포를 느끼기도 한다. 일반적으로 통증은 발생 부위에 따라 두통, 흉통, 복통, 요통 등으로 부르며, 발생 기전에 따라 체성통(somatic pain), 내장통(visceral pain), 신경병증성 통증(neuropathic pain), 심인성 통증(psychogenic pain) 등으로 나뉘고, 시간적 개념에 따라 급성 통증과 만성통증으로 나뉜다. 임상적으로 중요한 의미를 갖는 만성 통증은 뚜렷하게 통증을 일으킬 만한 원인이 없는데도 불구하고 일반적으로 6개월 이상 통증이 지속됨을 호소하는 것을 말한다. 만성 통증의 대부분은 자발통 (spontaneous pain), 이질통 (allodynia) 및 통각과민 (hyperalgesia)을 특징으로 하는 신경병증성 통증의 형태로 발현되며, 경미한 온도 변화나 의복에 의한 가벼운 접촉 등에 의해서도 심한 통증이 유발되어 환자의 일상생활에 중대한 지장을 초래하고, 기존의 여러 가지 치료법에도 잘 반응 하지 않는 특징이 있다.

현재, 통증의 치료에는 신경 차단술 등의 침습적 치료법이나, 여러 종류의 약물 치료법 (아편계 약물, 신경계 이온통로 활성도 조절 약물, 항경련제 등)이 응용되고 있으나, 상기 약물들은 고용량으로 투여해야 그 효과를 나타내며, 초기에는 효과가 있더라도 장기간 사용시 내성이 생겨 효과가 없어지는 경우도 빈번하다. 또한, 위장관 출혈, 위장 장애, 간 손상 등의 부작용이 초래될 수 있다.

이에, 기존 치료법의 부작용을 해소할 수 있는 새로운 치료법으로 보툴리눔독소 A를 사용하는 방법이 소개되고 있다. Ranoux 등은 기계적 이질통을 가진 대상포진 후 통증, 수술 후 신경병성 통증 환자를 대상으로 보튤리눔 독소를 피내 주사를 시행 후 통증과 이질통 감소를 보고하였고(Ranoux et al., Annals of Neurology 64(3): 274-283 (2008)), Yuan 등은 당뇨병성 신경통 환자에서 통증 감소와 수면장애 개선을 보고하였다(Yuan et al., Neurology 72:1473-1478(2009)). 그러나 최근 위약을 투여하여 비교하였을 때 같은 효과를 보였다는 보고도 증가하고 있어 더 많은 연구 결과가 필요하다.

한편, 보툴리눔 톡신은 그 효과가 평균 6개월로 가역적이므로, 통증을 치료하기 위해 반복 주사가 필요하며 환자의 면역계에 의해 인식 될 수 있는 크기를 가지므로 약제에 대한 면역 반응이 유발될 수 있다. 따라서, 면역 반응을 유발하지 않고 보다 간단하고 안정한 분자 구조를 가지면서, 높은 통증 완화 활성을 가지고, 긴 지속성 및 적은 부작용을 갖는 비-침습적인 치료를 가능하게 하는 분자의 개발이 필요한 실정이다.

이에 본 발명자들은 새로운 통증 치료제를 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 새롭게 합성한 펜타펩타이드가 안정한 분자 구조를 가지며, 경피를 통해 피부 조직까지 침투하여 높은 통증 억제 활성을 나타내므로 통증 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 일 목적은 통증을 완화하기 위한 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 일 목적은 통증을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 일 목적은 통증을 완화 또는 개선하기 위한 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 일 목적은 통증을 완화 또는 개선하기 위한 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

이를 위하여, 본 발명의 일 측면은, KFLIK의 아미노산 서열로 구성되는 펜타펩타이드를 유효성분으로 포함하는 통증 완화용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 측면은, KFLIK의 아미노산 서열로 구성되는 펜타펩타이드를 유효성분으로 포함하는 통증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면은, KFLIK의 아미노산 서열로 구성되는 펜타펩타이드를 유효성분으로 포함하는 통증의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면은, KFLIK의 아미노산 서열로 구성되는 펜타펩타이드를 유효성분으로 포함하는 통증 완화용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 KFLIK의 아미노산 서열로 구성되는 펜타펩타이드는 근세포에서 전염증성 사이토카인의 발현을 억제하고, 신경말단에서 통증전달 인자의 방출을 억제하여 통증의 발생 및 전달을 억제할 수 있으므로, 통증을 완화, 개선, 예방 또는 치료하는 용도로 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 펜타펩타이드는 경피(피부)를 통해 피부 조직의 근육층까지 흡수되므로, 피부에 적용하는 의약품, 의약외품 및 화장료의 원료로 사용될 수 있다.

다만, 본 발명의 효과는 상기에서 언급한 효과로 제한되지 아니하며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 하기의 기재로부터 당업자에게 명확히 이해될 수 있을 것이다.

도 1a 및 도 1b는 KFLIK 펩타이드의 열안정성 평과 결과를 나타낸 것이다: 도 1a는 45℃에서 장기 보관시 펩타이드의 고온 안정성을 확인한 결과를 나타낸 것이고, 도 1b는 최대 가온 온도(121℃)에서 펩타이드의 고온 안정성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2a 및 도 2b는 근세포에서 KFLIK 펩타이드 처리에 의한 전염증성 사이토카인의 발현 억제 효과를 나타낸 것이다: 도 2a는 RT-PCR을 수행하여 IL-1α, TNF-α, IL-1β 및 COX-2 유전자의 mRNA 발현 수준을 확인한 결과를 나타낸 것이고, 도 2b는 웨스턴 블랏을 통해 COX-2, IL-1β, TNF-α 단백질의 발현 수준을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 신경세포에서 KFLIK 펩타이드 처리에 의해 통증전달인자인 P 물질(substance P)의 방출이 억제되는 효과를 나타낸 것이다.
도 4a 및 도 4b는 인체효능평가를 통해 본 발명의 KFLIK 펩타이드 처리에 의한 근육통 완화 효과를 나타낸 것이다: 도 4a는 통증 평가 척도(Numeric rating scale, NRS)의 측정을 통해 통증 강도의 평균 값을 산출한 결과이고, 도 4b는 KFLIK 펩타이드 처리에 의한 통증 경감 정도를 나타낸 것이다.
도 5는 KFLIK 펩타이드에 형광 물질인 로다민을 붙여서 신경세포 내로 KFLIK 펩타이드가 침투하는지 확인한 형광 현미경 사진이다: A는 파란색으로 염색된 신경세포의 핵과 붉은색의 로다민-펜타펩타이드가 공존하는 것을 나타낸 것이고, B의 파란색은 DAPI로 염색된 신경 세포의 핵을 나타내며, C의 붉은색은 로다민-펩타이드를 나타낸다.
도 6은 실험동물의 등에 로다민-KFLIK 펩타이드를 도포한 후 피부 조직을 채취하여 근육층까지 KFLIK 펩타이드가 침투하는지 확인한 형광 현미경 사진이다: A의 파란색은 DAPI로 염색된 세포의 핵을 나타내고, B는 녹색의 TrkB 신경섬유 마커를 나타내고, C는 붉은색의 로다민-펜타펩타이드를 나타내고, D의 노란색은 근육층의 신경 세포까지 본 발명의 펜타펩타이드가 침투한 것을 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 일 측면은 KFLIK의 아미노산 서열로 구성되는 펜타펩타이드를 유효성분으로 포함하는 통증 완화용 조성물을 제공한다.

본 명세서에서, 용어 '펩타이드'는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형 또는 환형의 분자를 의미한다. 상기 펩타이드의 제작은 본 기술분야에서 공지된 통상의 생물학적 또는 화학적 합성 방법에 의해 달성될 수 있는 것이고, 일 예로 고상 합성 기술(solid-phase synthesis techniques)과 같은 방법에 의해 달성될 수 있다.

본 명세서에서, 용어 '펜타펩타이드'는 5개의 아미노산 잔기로 이루어진 선형 분자를 의미하며, 본 발명의 펜타펩타이드는 Lys, Phe, Leu, Ile 및 Lys이 순서대로 연결된 선형 펩타이드 분자를 의미한다.

상기 '펩타이드' 및 '펜타펩타이드'는 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서, 아미노산 잔기의 결실, 삽입, 치환 또는 이들의 조합에 의해서 상이한 서열을 가지는 아미노산의 변이체들, 또는 단편들일 수 있다. 상기 펩타이드의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 아미노산 교환은 본 기술 분야에 공지되어 있다. 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 변형될 수 있다. 따라서, 본 발명은 KFLIK의 아미노산 서열로 구성된 펜타펩타이드와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 포함한다. 상기 실질적으로 동일한 단백질이란 상기 KFLIK의 아미노산 서열과 75% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 예컨대, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 의미하나 이에 한정되지 않으며, 75% 이상의 아미노산 서열의 상동성을 가지며 동일한 활성을 가진다면 본 발명의 범위에 포함된다. 또한, 본 발명의 펩타이드는 표적화 서열, 태그(tag), 표지된 잔기, 반감기 또는 펩타이드 안정성을 증가시키기 위한 특정 목적으로 제조된 아미노산 서열을 추가적으로 포함할 수 있다.

또한, 보다 나은 화학적 안정성, 강화된 약리 특성(반감기, 흡수성, 역가, 효능 등), 변경된 특이성(예를 들어, 광범위한 생물학적 활성 스펙트럼), 감소된 항원성을 획득하기 위하여, 본 발명의 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 보호기가 결합되어 있을 수 있다. 예컨대, 상기 보호기는 아세틸기, 플루오레닐 메톡시 카르보닐기, 포르밀기, 팔미토일기, 미리스틸기, 스테아릴기 또는 폴리에틸렌글리콜(PEG)일 수 있으나, 펩타이드의 개질, 특히 펩타이드의 안정성 증진시킬 수 있는 성분이라면, 제한없이 포함할 수 있다. 상기 '안정성'은 생체 내 단백질 절단 효소의 공격으로부터 본 발명의 펩타이드를 보호하는 생체 내(in vivo)에서의 안정성뿐만 아니라, 저장안정성(예컨대, 상온 저장 안정성)도 포함하는 의미로 사용된다.

본 발명의 KFLIK의 아미노산 서열로 구성되는 펜타펩타이드는 근세포에서 전염증성 사이토카인의 발현을 억제하여 염증반응을 억제하므로 미세 열상 등에 의한 통증을 예방 또는 치료할 수 있다.

또한, 본 발명의 KFLIK의 아미노산 서열로 구성되는 펜타펩타이드는 시냅스 뉴런에서 분비되는 통증전달인자인 물질 P(substance P)의 방출을 억제하여 통증의 전달을 방지하므로 통증을 예방 또는 치료할 수 있다.

또한, 본 발명의 KFLIK의 아미노산 서열로 구성되는 펜타펩타이드는 경피흡수를 통해 피부 조직의 근육층까지 침투하므로, 병변 부위에 바르는 것 만으로 통증을 예방, 완화 또는 치료 할 수 있다.

본 발명에서 '통증'은 통증 수용체를 지닌 특수한 신경에 대한 자극으로 인해 생기는 불쾌한 감각을 의미하며, 본 발명의 펜타펩타이드에 의해 그 감각이 완화, 예방 또는 치료되는 모든 증상을 포함한다. 본 발명에 따른 통증은 급성 또는 만성 통증일 수 있다.

본 발명에서, 상기 통증은 염증성 통증, 신경병증성 통증, 통각수용성 통증 및 심인성 통증으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 예를 들어, 통각성수용성 통증, 염증성 통증 등이 복합적으로 작용하는 암성 통증(cancer pain) 및 수술 후 통증(postoperative pain); 신경병성 통증에 해당하는 삼차 신경통(trigeminal neuralgia pain), 특발성 통증(idiopathic pain) 및 당뇨성 신경병성 통증(diabetic neuropathic pain); 및 내장통에 해당하는 편두통 및 생리통으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 펜타펩타이드를 포함하는 조성물은 피부 또는 근골격계에 발생하는 통증에 적용할 수 있으며, 예를 들어, 당뇨신경병증(diabetic neuropathy), 당뇨말초신경병증(diabetic peripheral neuropathy), 바이러스 감염에 의한 통증, 침해성 통증(nociceptive pain), 안면신경통, 대상포진후통증(postherpetic neuralgia), 요통, 디스크, 신경근병증(radiculopathy), 신경병증(neuropathy), 통각과민증(hyperalgesia), 중추신경감작(central sensitization) 관련 통증, 이질통(allodynia), 암통증(cancer pain), 근막통증증후군, 손목터널증후군, 팔꿉굴증후군(척골신경병증), 드퀘르뱅증후군, 회전근개증후군, 골관절염(osteoarthritis), 힘줄염, 힘줄윤활막염, 외측상과염, 내측상과염, 힘줄손상, 윤활낭염증, 인대염증, 테니스엘보, 골프엘보, 무릎관절통, 무릎주변힘줄염, 반월상연골 손상, 손가락관절통, 손목힘줄염, 손목염좌, 발목염좌, 염좌, 섬유근육통(fibromyalgia), 족저근막염, 염증성 관절염, 감염성 관절염, 류마티스관절염, 퇴행성 관절통증, 오십견(frozen shoulder), 통풍, 산후관절통, 골수염, 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 퇴행성 척추장애, 요추관 협착증, 대퇴부 통증(cruralgia), 염좌, 타박상, 관절통 및 좌골신경통(sciatica)에서 선택되는 하나 이상에 수반되는 통증일 수 있다.

구체적으로, 본 발명에 따른 펜타펩타이드는 피부에 바르는 것 만으로도 근육층까지 도달하고, 피부를 통해 흡수되어 우수한 진통 효과를 나타내므로, 특히 피부 또는 피부와 가까이 위치한 조직의 통증, 특히 피하지방이 얇은 부위의 주위의 통증에도 효과적으로 작용할 수 있다. 예를 들어, 무릎, 팔꿈치, 손가락, 어깨 발목, 발 등의 부위의 염좌, 타박상, 관절통, 힘줄염증, 인대염증, 오십견, 회전근개질환 등과 테니스엘보, 골프엘보, 드퀘르뱅 증후군에 수반되는 통증을 효과적으로 예방, 또는 치료할 수 있다.

본 발명의 다른 일 측면은, KFLIK의 아미노산 서열로 구성되는 펜타펩타이드를 유효성분으로 포함하는 통증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서 용어 '예방'은 상기 펜타펩타이드를 포함하는 조성물의 투여로 통증을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 용어 '치료'는 상기 펜타펩타이드를 포함하는 조성물의 투여로 통증이 '완화' 또는 '개선'되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에 따른 통증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구제 제형, 외용제, 좌제, 및 멸균 주사용액 형태로 제형화되어 사용할 수 있고, 제형화를 위하여 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다.

상기 약학적으로 허용되는 담체는 제제시 통상적으로 이용되는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아, 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세 결정성 셀룰로스, 폴리비닐 피로리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필 히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등을 포함할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 더 포함할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 근육 내, 정맥 내, 복강 내, 피하, 피내, 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여 경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 '약학적으로 유효한 양'은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 상기 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 통증 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 동시에, 별도로, 또는 순차적으로 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

상기 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성율, 배설 속도, 질병 종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라 증감될 수 있으며, 예를 들어 상기 약학적 조성물을 1일당 환자 체중 1㎏ 당 약 0.0001㎍ 내지 500mg, 바람직하게는 0.01㎍ 내지 100mg 투여할 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 측면은, 본 발명은 KFLIK의 아미노산 서열로 구성되는 펜타펩타이드를 유효성분으로 포함하는 통증의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공한다.

상기 펩타이드, 펜타펩타이드 및 통증의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.

본 발명의 용어 '의약외품'은 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 개선, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 물품들 중에서 의약품보다 작용이 경미한 물품들을 의미하는 것으로, 예를 들어 약사법에 따르면 의약외품이랑 의약품의 용도로 사용되는 물품을 제외한 것으로 사람/동물의 질병 치료나 예방에 쓰이는 제품, 인체에 대한 작용이 경미하거나 직접 작용하지 않는 제품 등이 포함된다.

본 발명의 의약외품 조성물은 바디 클렌저, 폼, 비누, 마스크, 연고제, 크림, 로션, 에센스 및 스프레이로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상으로 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 조성물은 밴드, 생리대 등의 형태로 제조될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 펜타펩타이드를 의약외품 첨가물로 사용할 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 의약외품 또는 의약외품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 KFLIK의 아미노산 서열로 구성되는 펜타펩타이드를 유효성분으로 포함하는 통증 완화용 화장료 조성물을 제공한다.

상기 펩타이드, 펜타펩타이드 및 통증의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.

상기 화장료 조성물은 본 기술분야에서 통상적으로 제조되는 임의의 제형으로 제조될 수 있고, 예를 들면, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 화장료 조성물은 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이, 파우더, 헤어토닉, 헤어크림, 헤어로션, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어컨디셔너, 헤어스프레이, 헤어 에어졸, 포마드, 젤 등과 같은 용액, 솔젤, 에멀젼, 오일, 왁스, 에어졸 등의 다양한 형태로 제조될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 화장료 조성물은 KFLIK의 아미노산 서열로 구성되는 펜타펩타이드에 더하여 부형제, 담체 등 기타 첨가제를 포함할 수 있으며 일반 피부 화장료에 배합되는 보통의 성분을 필요한 만큼 적용 배합하는 것이 가능하다.

상기 화장료 조성물의 제형의 형태가 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀루로오스 유도체, 폴리에틸렌글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형의 형태가 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토오스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 사용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체가 포함될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 화장료 조성물의 제형의 형태가 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용될 수 있고, 예를 들면 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형의 형태가 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 등과 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 헤어샴푸인 경우에는 본 발명의 펜타펩타이드 결합체에 증점제, 계면활성제, 점도 조절제, 보습제, pH 조절제, 방부제, 에센셜 오일 등과 같이 샴푸를 조성하기 위한 베이스 성분들이 혼합될 수 있다. 상기 증점제로는 CDE가 사용될 수 있고, 상기 계면활성제로는 음이온 계면활성제인 LES와, 양쪽성 계면활성제인 코코 베타인이 사용될 수 있고, 상기 점도조절제로는 폴리 쿼터가 사용될 수 있으며, 상기 보습제로는 글리세린이 사용될 수 있고, 상기 pH 조절제로는 구연산, 수산화나트륨이 사용될 수 있다. 상기 방부제로는 자몽 추출물 등이 사용될 수 있고, 이 외에도 시더우드, 페퍼민트, 로즈마리 등의 에센셜 오일과 실크 아미노산, 펜타올 또는 비타민 E가 첨가될 수 있다.

상기 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서 본 발명의 상기 펜타펩타이드와 담체 성분 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 사용되는 성분들, 예를 들면 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 등을 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 펜타펩타이드는 근세포에서 전염증성 사이토카인의 발현을 억제함으로써 염증 반응에 의한 통증을 억제하고, 신경 말단에서 P 물질의 방출을 억제하여 통증의 전달을 방지하며, 피부에 바르는 것만으로도 근육층의 신경 세포까지 침투하여 통증을 억제하는 효과가 우수하므로 통증의 완화, 개선, 예방 또는 치료를 목적으로 하는 의약품, 의약외품 또는 화장료 조성물의 원료로 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

[실험예 1]

신규한 펜타펩타이드의 합성 및 물성 확인

1-1. 펜타펩타이드의 합성

서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 신규 펩타이드 서열 'KFLIK'은 공지의 방법을 이용하여 제조하였다. 분자량 측정기를 이용하여 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드의 분자량을 측정한 결과, 그 분자량이 647.4 Da에 해당함을 확인하였다.

1-2. 장기 보관시 고온안정성 평가

서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 본 발명의 펩타이드를 1000ppm 농도로 멸균 증류수에 녹이고, 45℃에서 7일, 14일, 28일, 60일, 75일 동안 보관한 후, HPLC 분석을 수행하였다.

그 결과, [도 1a]에 나타낸 바와 같이, 45℃ 조건에서 최대 관찰일인 75일 동안 본 발명의 펩타이드가 안정성을 유지하는 것을 확인할 수 있었다.

1-3. 고온 안정성 평가

본 발명의 펩타이드를 1000ppm 농도로 멸균 증류수에 녹이고, 121℃에서 15분, 30분 동안 가온 한 후 HPLC 분석을 수행하였다.

그 결과, [도 1b]에 나타낸 바와 같이, 121℃에서 최대 가온 시간인 30분 동안 본 발명의 펩타이드가 안정성을 유지하는 것을 확인할 수 있었다.

[실험예 2]

근세포에서 펜타펩타이드 처리에 의한 전염증성 사이토카인 방출 억제 효과 확인

2-1. 전염증성 사이토카인 유전자의 발현 수준 확인

본 발명의 펜타펩타이드에 의한 통증 개선 효과를 확인하기 위하여, 마우스 근원 세포(myoblast)를 사용하여 염증 관련 사이토카인의 발현 양상을 확인하였다. 전염증성 사이토카인은 신경병증의 통증에 관여하며, 신경 손상 후 TNF-α 등과 같은 전염증성 사이토카인이 발현되면 염증반응이 촉발되어 통증이 야기된다.

구체적으로, 마우스 근원 세포인 C2C12 세포를 2x10⁵cells/well의 밀도로 6-웰 플레이트에 접종한 후 DMEM(10% PBS) 배지에서 3일간 배양하였다. 세포가 플레이트의 70~80% 정도까지 자란 상태에서 분화 배지(DMEM, 5% horse serum)로 교체한 다음 3일 동안 배양하였다. 그 후, 분화 배지(DMEM, 2% horse serum)으로 교체 후 4일 동안 배양시켜 근원세포에서 근관(myotube)으로 분화를 유도하였다. 그런 다음 무혈청 배지로 교체하여 2시간 동안 배양하고, 1 μM, 10 μM, 100 μM 농도의 펜타펩타이드를 1시간 동안 전 처리 하였다. 이후 20nM의 TNF-α를 처리하고 24시간 동안 배양하여 염증 반응을 유도하였다.

이후, 세포를 회수하여 RNA를 분리한 후 cDNA 합성 키트(Intron, Korea)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA, PCR 프리믹스(Intron, Korea) 및 IL-1α, TNF-α, IL-1β 및 COX-2 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응을 수행하고, 증폭된 PCR 산물을 아가로스 겔에 전기영동하여 DNA 밴드 확인하여 상기 유전자들의 mRNA 발현 정도를 비교하였다. 이때 사용된 프라이머 서열은 [표 1]에 제시된 바와 같다.

유전자	프라이머	서열(5'->3')	서열번호
IL-1α	F	GAA GTC AGG CAG AAG TGC TC	2
	R	GTG CAC CCG ACT TTG TTC TT	3
TNF-α	F	CGT CAG CCG ATT TGC TAT CT	4
	R	CGG ACT CCG CAA AGT CTA AG	5
IL-1β	F	CAA GGA GAA CCA AGC AAC GA	6
	R	TTG GCC GAG GAC TAA GGA GT	7
COX-2	F	TGA GTG GTA GCC AGC AAA GC	8
	R	CTG CAG TCC AGG TTC AAT GG	9
GAPDH	F	ACCACAGTCCATGCCATCAC	10
	R	TCCACCACCCTGTTGCTGTA	11

그 결과, [도 2a]에 나타난 바와 같이, TNF-α를 처리하여 근관에 염증을 유도한 경우, 무처리군(control)에 비하여 IL-1α, IL-1β, COX-2, TNF-α의 mRNA 발현양, 즉 전염증성 사이토카인이 현저하게 증가하는 것을 확인하였다. 그러나, 본 발명의 펜타펩타이드 1 μM 처리군 및 10 μM 처리군의 경우, 증가된 전염증성 사이토카인의 발현이 감소됨을 확인하였다.

2-2. 전염증성 사이토카인 단백질의 발현 수준 확인

한편, 염증성 사이토카인 단백질의 발현량을 확인하기 위하여 2-1에서 회수한 세포 중 일부에 대해서는 (W.B.) cell lysate 분리 후 단백질을 정량하여 샘플 버퍼와 혼합하여 샘플을 준비하였다. SDS-PAGE 및 니트로셀룰로오스 막에 전개하여 5% 스킴 밀크로 블록킹하였다. COX-2 항체(Cell Signaling Technology, USA), IL-1β 항체(Cell Signaling Technology, USA), TNF-α 항체(Cell Signaling Technology, USA)를 1차적으로 바인딩 시킨 다음 2차 항체의 결합을 진행하였다. ECL 용액을 처리한 후 타겟 단백질의 발현 수준을 관찰하였다.

그 결과, [도 2b]에 나타난 바와 같이, TNF-α를 처리하여 근관에 염증을 유도한 경우, 무처리군(control)에 비하여 COX-2, IL-1β, TNF-α의 단백질 발현 수준, 즉 전염증성 사이토카인 단백질의 양이 현저하게 증가하는 것을 확인하였다. 그러나, 본 발명의 펜타펩타이드 처리군의 경우, 증가된 전염증성 사이토카인의 발현이 농도 의존적으로 감소됨을 확인하였다.

이를 통해, 본 발명의 펜타펩타이드는 근관에서 IL-1α, IL-1β, COX-2, TNF-α의 발현, 즉 전염증성 사이토카인의 발현을 mRNA 레벨 및 단백질 레벨에서 모두 감소시키는 효과를 나타내므로, 통증의 예방 또는 치료 물질로서 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.

[실험예 3]

신경세포에서 신경전달물질의 방출 억제 효과 확인

본 발명의 펜타펩타이드에 의한 통증 개선 효과를 확인하기 위하여, 마우스 신경세포를 사용하여 시냅스에서 P 물질(substance P)의 방출 정도를 확인하였다. P 물질은 말초로부터의 통증을 중추로 전달하므로 물질 P의 방출이 억제되면 통증 완화 효과를 나타낼 수 있다.

구체적으로, 6주령 랫드의 척수에서 후근신경절(dorsal root ganglion, DRG)을 분리하여 세척한 다음 신경세포를 분리하였다. 분리된 신경세포를 24웰-플레이트에 나누어 접종한 후 하루 동안 배양한 후, 유사분열 억제제를 신경세포가 배양되는 배지에 혼합하여, 순수 신경세포 만을 6일 동안 배양시켰다. 그런 다음, 영양성분을 추가하기 위해 B-27 배지(무혈청, 1% 페니실린)로 교체하여 24시간 동안 배양한 후, 1 μM, 10 μM 농도의 펜타펩타이드를 1시간 동안 전 처리하였다. 이후 100 μM의 캡사이신을 30분 동안 처리하여 P 물질의 방출을 유도하고, P 물질의 방출량을 ELISA로 분석하였다.

그 결과, [도 3]에 나타난 바와 같이, 캡사이신을 처리하면 무처리 대조군(control)에 비하여 P 물질의 방출이 증가하였으나, 본 발명의 펜타펩타이드 처리군의 경우 증가된 P 물질의 방출량이 현저하게 감소됨을 확인하였다.

이를 통해, 본 발명의 펜타펩타이드는 신경세포에서 P 물질의 방출을 억제하여 통증 신호의 전달을 방지함으로써, 통증의 예방 또는 치료물질로서 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.

[실험예 4]

인체효능평가를 통한 펜타펩타이드의 통증 완화 효과 확인

본 발명에 따른 펜타펩타이드가 실제로 통증을 억제하는 효과를 나타내는지 확인하기 위하여, 피실험자 20명을 대상으로 지연성 근육통을 유발한 다음 본 발명의 펜타펩타이드가 함유된 로션을 통증 부위에 도포하여 통증 경감 정도에 대한 인체효능평가를 실시하였다.

구체적으로, 피실험자들에게 지연성 근육통(Delayed onset muscle soreness)를 유발하기 위해, 양 발을 골반 너비로 벌리고 허리를 곧게 펴고 서게 한 다음 발꿈치를 최대한 들어 올렸다 내리는 동작을 2분간 반복하게 하고 3분간 휴식을 취하게 하는 운동을 총 3세트 진행하였다. 24시간 후부터 통증 부위에 본 발명의 펜타펩타이드가 2000ppm 함유된 용액을 도포하였다. 그 후, 24시간, 48시간, 72시간 후 걸을 때 느껴지는 통증 평가 척도(Numeric rating scale, NRS)를 자가 측정하였다 (0은 통증 없음, 10은 상상할 수 있는 가장 심한 통증). 아래 수학식을 이용하여 통증 강도의 평균 값(Mean PID scores)을 산출하고, 72시간 시험 종료 후 통증 경감 정도를 피험자 설문을 통해 확인하였다.

[수학식]

통증 강도의 차이 (PID) = 본 발명의 펜타펩타이드 도포 후 통증 강도 - 본발명의 펜타펩타이드 도포 전 통증 강도

그 결과, [도 4a] 및 [도 4b]에 나타난 바와 같이, 운동 24시간 경과 후 유발된 통증의 정도가 본 발명의 펜타펩타이드를 도포한 실험군에서 운동 72시간 후(로션 도포 48시간 후)에 유의적으로 개선되는 것을 확인하였다.

이를 통해, 본 발명의 펜타펩타이드가 근육통이 유발된 환자들의 피부에 바르는 것 만으로도 통증 감소에 있어서 치료적 효과를 제공할 수 있음을 알 수 있다.

[실험예 5]

세포 내 또는 피부 조직 침투 양상 확인

5-1. 로다민-펜타펩타이드 접합체의 제조

본 발명의 펩타이드의 세포 내 침투 여부 또는 조직 침투 양상을 확인하기 위하여 형광 물질이 접합된 로다민-펜타펩타이드 접합체를 제조하였다. 먼저, 100mM 중탄산나트륨(pH 9.0)을 이용하여 10mg/ml의 펜타펩타이드 용액을 제조하고, 디메틸포름아미드를 이용하여 1mg/ml NHS-로다민(Thermo Scientific, 46406) 용액을 제조하였다. 제조된 용액을 펜타펩타이드:NHS-로다민 = 1:10(몰 비)가 되도록 혼합하였다. 차광 후 인버팅하면서 상온에서 1시간 동안 반응시키고, 반응물을 투석한 후 LC/MS로 접합 여부를 확인하였다.

5-2. 세포 내 침투 확인

본 발명에 펜타펩타이드가 신경 세포 내로 침투하는지 확인하기 위하여, SH-SY5Y 세포를 3X10⁵ 세포/웰의 밀도로 6-웰 플레이트에 접종하였다. 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 24시간 동안 배양한 후 배지를 무혈청 배지로 교체하였다. 로다민-펩타이드 접합체를 농도 별로 4시간 동안 처리한 후, 4% 파라포름알데히드를 처리하여 세포를 고정하고 DAPI 염색 키트(Invitrogen, USA)를 이용하여 핵을 염색하였다. 형광 현미경을 통해 세포 내 펩타이드 침투 여부를 관찰하였다. 파란색은 DAPI로 염색된 세포의 핵을 나타내며, 붉은색은 '로다민-펜타펩타이드' 접합체를 나타낸다.

그 결과, [도 5]에 나타난 바와 같이 파란색과 붉은색이 공존하는 것으로부터 본 발명의 펜타펩타이드가 신경 세포 내로 침투한 것을 확인하였다.

5-3. 조직 침투 확인

7주령 SD 랫드의 등 부위를 제모한 후 로다민-펜타펩타이드를 도포하고 1시간 후 분석을 위해 랫드를 희생시켰다. 도포 부위의 피부 조직을 채취하여 포르말린 고정을 하루 동안 수행하였다. 고정된 조직을 이용하여 파라핀 블록을 만들고 섹션한 후 신경 세포 마커인 TrkB 항체(Cell signaling, USA)를 사용하여 면역조직화학 염색을 수행하였다. 이 후 DAPI 염색 키트(Invitrogen, USA)를 이용하여 핵 염색을 수행하였다. 형광 현미경을 통해 조직 내 펩타이드 침투 양상을 관찰하였다. 파란색은 DAPI로 염색된 세포의 핵을 나타내며, 붉은색은 로다민-펜타펩타이드 접합체를 나타내고, 녹색은 TrkB(신경 섬유 마커)를 나타낸다.

그 결과, [도 6]에 나타난 바와 같이 본 발명의 펜타펩타이드가 피부 조직의 근육층까지 침투한 것을 확인하였고, 신경 세포 마커와 공존(co-localization)하는 것을 확인하였다.

이를 통해, 본 발명의 펜타펩타이드는 신경 세포 내로 침투 가능하고, 경피흡수를 통해 피부 조직의 근육층까지 침투되며, 근육층에서 신경 세포 마커와도 공존하므로 근육세포에서 전염증성 사이토카인의 발현 및 신경말단에서의 통증전달인자 방출 억제에 관여하여 통증의 발생 및 전달을 억제하는 효과를 나타낼 수 있음을 알 수 있다.

<110> CAREGEN CO., LTD. <120> Composition for Alleviating, Preventing or Treating Pain Comprising Pentapeptide as Active Ingredients <130> 2020-DPA-3657 <160> 11 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pentapeptide <400> 1 Lys Phe Leu Ile Lys 1 5 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for IL-1alpha <400> 2 gaagtcaggc agaagtgctc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for IL-1alpha <400> 3 gtgcacccga ctttgttctt 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for TNF-alpha <400> 4 cgtcagccga tttgctatct 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for TNF-alpha <400> 5 cggactccgc aaagtctaag 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for IL-1beta <400> 6 caaggagaac caagcaacga 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for IL-1beta <400> 7 ttggccgagg actaaggagt 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for COX-2 <400> 8 tgagtggtag ccagcaaagc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for COX-2 <400> 9 ctgcagtcca ggttcaatgg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for GAPDH <400> 10 accacagtcc atgccatcac 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for GAPDH <400> 11 tccaccaccc tgttgctgta 20

Claims (11)

1. KFLIK의 아미노산 서열로 구성되는 펜타펩타이드를 유효성분으로 포함하는 통증 완화용 조성물.
2. 청구항 1에 있어서,
   상기 펜타펩타이드는 i) IL-1α, IL-1β, COX-2 및 TNF-α로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 전염증성 사이토카인의 발현을 억제하고, ii) 통증 전달 인자인 P 물질(substance P)의 분비를 억제하는 것인, 조성물.
3. 청구항 1에 있어서,
   상기 통증은 염증성 통증, 신경병증성 통증, 통각수용성 통증 및 심인성 통증으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인, 조성물.
4. 청구항 1에 있어서,
   상기 통증은 무릎, 팔꿈치, 손가락, 어깨, 발목 또는 발 부위의 염좌, 타박상, 관절통, 힘줄염증, 인대염증, 오십견, 회전근개질환, 테니스엘보, 골프엘보 및 드퀘르뱅 증후군으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나에 수반되는 통증인, 조성물.
5. 청구항 1에 있어서,
   상기 통증은 수술 후 통증(postoperative pain), 암성 통증(cancer pain), 삼차 신경통(trigeminal neuralgia pain), 특발성 통증(idiopathic pain), 당뇨성 신경병성 통증(diagetic neuropathic pain), 근육통, 편두통, 생리통 및 관절염 통증으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인, 조성물.
6. KFLIK의 아미노산 서열로 구성되는 펜타펩타이드를 유효성분으로 포함하는 통증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
7. 청구항 6에 있어서,
   약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 것인, 약학적 조성물.
8. 청구항 6에 있어서,
   상기 약학적 조성물은 경구용 제제, 주사용 제제 또는 외용제의 형태로 제형화되는 것인, 약학적 조성물.
9. 청구항 8에 있어서,
   상기 외용제는 크림, 젤, 연고, 유화액, 현탁액, 분무제 및 경피 전달성 패치제로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 약학적 조성물.
10. KFLIK의 아미노산 서열로 구성되는 펜타펩타이드를 유효성분으로 포함하는 통증의 완화 또는 개선용 의약외품 조성물.
11. KFLIK의 아미노산 서열로 구성되는 펜타펩타이드를 유효성분으로 포함하는 통증 완화용 화장료 조성물.

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