CN115916236A - 包含五肽作为活性成分的组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及包含五肽作为活性成分的组合物抑制过度出汗、抑制体味或者预防或治疗疼痛的用途。

Description

包含五肽作为活性成分的组合物

技术领域

本发明涉及包含五肽作为活性成分的组合物抑制过度出汗、抑制体味或者预防或治疗疼痛的用途。

背景技术

多汗症是一种皮肤疾病，其特征在于过度且异常地增加排汗或出汗，超过体温调节所需的量。多汗症是由遗传原因或身体或情绪压力引起的，并且可位于全身或身体的特定区域。当在手掌、脚掌、面部、腋窝或头皮局部出现过度出汗时，称为原发性或局限性多汗症。全身性或继发性多汗症通常涉及全身。

目前，治疗多汗症的方法包括使用止汗剂、暂时阻断汗腺的离子转移法、暂时阻断刺激出汗的神经和汗腺的肉毒杆菌疗法(参见文献WO2010-078242)。在这些方法中，在使用肉毒杆菌毒素暂时阻断神经的方法的情况下，麻痹效果是可逆的，平均为6个月，因此这种治疗需要反复注射肉毒杆菌毒素。由于肉毒杆菌毒素具有可被患者的免疫系统识别的尺寸，因而会诱导对药品的免疫应答。因此，需要开发这样的分子，其具有更简单且更稳定的分子结构，不诱导免疫应答，具有高的减少汗液的活性，并且能够进行长效且副作用更少的非侵入性治疗。

另一方面，当微生物或细菌分解汗腺分泌的汗液时，会产生体味。在微生物或细菌分解分布在全身的小汗腺和分布在诸如腋窝之类的具有大量体毛的区域的顶泌汗腺所分泌的汗液中所含的脂肪、蛋白、皮脂和污垢的过程中，会产生令人不悦的体味，例如腋下气味、足部气味和头部气味。一般来说，将诸如除臭、抗菌和掩蔽之类的方法用于控制体味，但如果使用了错误的香味来掩盖体味，则可产生难闻的气味，反而会起到相反的效果。此外，当在皮肤上使用除臭剂成分时，只能在处理后直至下一次清洗之前提供暂时性效果，存在着在清洗后要进行再处理的麻烦。

因此，本发明人认真努力地开发一种可以通过抑制汗液过度产生(这可以说是体味的根本原因)从而抑制体味的材料，结果，本发明人确认了本发明人新合成的五肽具有稳定的分子结构，会渗透穿过真皮到达皮肤组织，并且表现出高的减少汗液的活性，因此该五肽可以有效地用于治疗多汗症并控制体味，从而完成了本发明。

另一方面，各种原因会引起疼痛，并且如果疼痛长时间持续或刺激太严重，就会干扰日常生活，并且有时会引起焦虑和恐惧。一般来说，根据发生部位，疼痛被称为头痛、胸痛、腹痛、背痛等，根据发生机制，疼痛分为躯体疼痛、内脏疼痛、神经性疼痛、精神性疼痛等，根据时间概念，疼痛分为急性疼痛和慢性疼痛。慢性疼痛具有临床意义，是指虽然没有明确的原因，但疼痛持续6个月或更长时间的疾病。大多数慢性疼痛表现为神经性疼痛的形式，其特征为自发性疼痛、异常性疼痛和痛觉过敏，并且即使是轻微的温度变化或与衣物的轻微接触也会导致严重疼痛。因此，这对患者的日常生活造成严重干扰，并且对现有的各种治疗也响应不佳。

目前，诸如神经阻断之类的侵入性治疗方法和各种类型的药品治疗方法(阿片类药品、神经系统离子通道活性调节药品、抗痉挛药等)应用于治疗疼痛。然而，上述药品只有在高剂量施用时才示出其效果，并且即使它们在开始时有效，在长期使用过程中也会产生耐性，从而效果通常会消失。此外，会导致诸如胃肠道出血、胃肠道疾病和肝脏损伤之类的副作用。

因此，正在引入一种使用肉毒杆菌毒素A作为新疗法的方法，该方法可以解决现有治疗的副作用。Ranoux等人报道了在疱疹后疼痛和术后神经性疼痛伴机械异常性疼痛的患者中皮内注射肉毒杆菌毒素后，疼痛和异常性疼痛减轻(参见文献Ranoux et al.,Annalsof Neurology 64(3):274-283(2008))，并且Yuan等人报道了糖尿病神经痛患者的疼痛减轻和睡眠障碍的改善(参见文献Yuan et al.,Neurology 72:1473-1478(2009))。然而近年来，越来越多的报告表明，使用肉毒杆菌毒素A与施用安慰剂具有类似的效果，因此需要更多的研究结果。

另一方面，由于肉毒杆菌毒素的效果是可逆的，平均为6个月，因此需要反复注射以治疗疼痛，并且由于肉毒杆菌毒素具有可被患者的免疫系统识别的尺寸，因而会诱导对药品的免疫应答。因此，需要开发这样的分子，其具有更简单且更稳定的分子结构，不诱导免疫应答，具有高的疼痛缓解活性，并且能够进行长效且副作用更少的非侵入性治疗。

因此，本发明人认真努力地开发一种新的疼痛用治疗剂，结果，本发明人确认了新合成的五肽具有稳定的分子结构，会渗透穿过真皮到达皮肤组织，并且表现出高的疼痛抑制活性，因此该五肽可以有效地用于疼痛治疗，从而完成了本发明。

发明内容

[技术问题]

本发明的目的是提供一种用于预防或治疗多汗症的药物组合物。

本发明的另一目的是提供一种用于预防或治疗多汗症的方法。

本发明的还一目的是提供一种肽，其用于预防或治疗多汗症。

本发明的还一目的是提供一种用于预防或缓解多汗症或抑制体味的组合物。

本发明的还一目的是提供一种用于抑制体味的方法。

本发明的还一目的是提供一种肽，其用于抑制体味。

本发明的还一目的是提供一种用于缓解疼痛的组合物。

本发明的还一目的是提供一种用于预防或治疗疼痛的药物组合物。

本发明的还一目的是提供一种用于预防或治疗疼痛的方法。

本发明的还一目的是提供一种肽，其用于预防或治疗疼痛。

本发明的还一目的是提供一种用于缓解或改善疼痛的准药品组合物。

本发明的还一目的是提供一种用于缓解或改善疼痛的化妆品组合物。

[技术方案]

为了解决上述问题，本发明的一个方面提供了一种用于预防或治疗多汗症的药物组合物，其包含由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的五肽作为活性成分。

本发明的另一方面提供了一种用于预防或治疗多汗症的方法，包括向受试者施用由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的五肽。

本发明的还一方面提供了一种由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的五肽，用于预防或治疗多汗症。

本发明的还一方面提供了一种用于预防或缓解多汗症或抑制体味的组合物，其包含由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的五肽作为活性成分。

本发明的还一方面提供了一种用于抑制体味的方法，包括向受试者施用由SEQ IDNO:1的氨基酸序列组成的五肽。

本发明的还一方面提供了由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的五肽，用于抑制体味。

本发明的还一方面提供了一种用于缓解疼痛的组合物，其包含由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的五肽作为活性成分。

本发明的还一方面提供了一种用于预防或治疗疼痛的药物组合物，其包含由SEQID NO:1的氨基酸序列组成的五肽作为活性成分。

本发明的还一方面提供了一种用于预防或治疗疼痛的方法，包括向受试者施用由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的五肽。

本发明的还一方面提供了一种由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的五肽，用于预防或治疗疼痛。

本发明的还一方面提供了一种预防或改善疼痛用准药品组合物，其包含由SEQ IDNO:1的氨基酸序列组成的五肽作为活性成分。

本发明的还一方面提供了一种用于缓解疼痛的化妆品组合物，其包含由SEQ IDNO:1的氨基酸序列组成的五肽作为活性成分。

[有利效果]

由本发明的SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的五肽通过皮肤吸收至皮肤组织的肌肉层，抑制了神经末梢的神经递质的异常释放，并可减少出汗。因此，本发明的五肽可以通过单独施用从而预防、减轻、改善或治疗多汗症的症状。

此外，本发明的五肽可以通过抑制汗液过度产生从而预先阻断体味的起因，并提供半永久性的体味抑制效果。

本发明的由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的五肽可以通过抑制肌细胞中促炎细胞因子的表达和神经末梢中疼痛传递因子的释放从而抑制疼痛的产生和传递，因此本发明的五肽可用于减轻、改善、预防或治疗疼痛。

此外，由于本发明的五肽通过皮肤吸收至皮肤组织的肌肉层，因此它可用作施加至皮肤的药物、准药品和化妆品的原料。

然而，本发明的效果不限于上述效果，并且本领域技术人员将根据以下描述清楚地理解未提及的其他效果。

附图说明

图1a和图1b示出了KFLIK肽的热稳定性评估的结果：

图1a示出了在45℃长期储存期间确认的肽的高温稳定性的结果，并且图1b示出了在最高加热温度(121℃)确认的肽的高温稳定性的结果。

图2a和图2b示出了KFLIK肽处理抑制了神经细胞中的SNARE复合物形成的效果：图2a示出了通过蛋白印迹(Western-blot)确认SNARE复合物的形成的结果，并且图2b示出了确认构成SNARE复合物的突触融合蛋白1a的降解程度的结果。

图3示出了KFLIK肽处理对神经细胞中的神经递质释放的抑制效果。

图4示出了用本发明的KFLIK肽治疗多汗症患者的手掌的相对汗液减少效果：A为碘-淀粉试验结果的图像，并且B示出了使用Image J软件进行强度分析的结果，即汗液减少效果。

图5示出了用本发明的KFLIK肽治疗多汗症患者的脚掌的相对汗液减少效果：A为碘-淀粉试验结果的图像，并且B示出了使用Image J软件进行强度分析的结果，即汗液减少效果。

图6示出了用本发明的KFLIK肽治疗多汗症患者的腋窝的相对汗液减少效果：A为碘-淀粉试验结果的图像，并且B示出了使用Image J软件进行强度分析的结果，即汗液减少效果。

图7为荧光显微镜图像，其通过将荧光物质罗丹明附接至KFLIK肽，示出了KFLIK肽渗透至神经细胞中：A示出了蓝色染色的神经元细胞核和红色罗丹明-五肽共存，B中的蓝色表示DAPI染色的神经元细胞核，并且C中的红色表示罗丹明-肽。

图8为荧光显微镜图像，其通过将罗丹明-KFLIK肽施加至实验动物的背部后收集皮肤组织，示出了KFLIK肽渗透至肌肉层中：A中的蓝色表示DAPI染色的细胞核，B中的绿色表示TrkB神经纤维标记物，C中的红色表示罗丹明-五肽，并且D中的黄色表示本发明的五肽渗透至肌肉层的神经细胞中。

图9示出了本发明的KFLIK肽的体味抑制效果，并且使用分光光度计的吸光度测定结果示出了对棒状杆菌(Corynebacterium)的生长抑制效果。P/C为作为阳性对照的1％三氯生。

图10a和图10b示出了KFLIK肽处理抑制了肌细胞中促炎细胞因子表达的效果：图10a示出了通过进行RT-PCR确认的IL-1α、TNF-α、IL-1β和COX-2基因的mRNA表达水平的结果，并且图10b示出了通过蛋白印迹确认的COX-2、IL-1β和TNF-α蛋白的表达水平的结果。

图11示出了KFLIK肽处理抑制了神经细胞的疼痛递质物质P释放的效果。

图12a和图12b示出了经人体功效评估，本发明的KFLIK肽的治疗对肌肉疼痛的缓解效果：图12a为通过数值评定量表(NRS)的测定计算疼痛强度平均值的结果，并且图12b示出了KFLIK肽的治疗对疼痛的缓解程度。

具体实施方式

以下，将详细描述本发明。

本发明的一个方面是提供一种用于预防或治疗多汗症的药物组合物，其包含由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的五肽作为活性成分。

在此，术语“肽”是指通过肽键将氨基酸残基彼此组合而形成的线性或环状分子。可以通过本领域已知的常规生物或化学合成的方法完成肽的制备，例如，可以通过诸如固相合成技术之类的方法完成肽的制备。

在此，术语“五肽”是指由五个氨基酸残基组成的线性分子，并且本发明的五肽是指由SEQ ID NO:1(KFLIK)的氨基酸序列组成的线性肽分子。

“肽”和“五肽”可以是通过在不影响功能的范围内的氨基酸残基的缺失、插入、置换或它们的组合而得到的具有不同序列的氨基酸变体或片段。不完全改变肽的活性的氨基酸交换在本领域中是已知的。在一些情况下，可以通过磷酸化、硫酸化、丙烯酸酯化、糖基化、甲基化、法尼基化等对氨基酸交换进行修饰。因此，本发明包括具有与由KFLIK的氨基酸序列组成的五肽基本相同的氨基酸序列的肽，以及该肽的变体或活性片段。基本上相同的蛋白是指与KFLIK的氨基酸序列的序列同源性为至少75％、优选至少80％、例如至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的氨基酸序列，但不限于此，并且当氨基酸序列的序列同源性为75％以上且具有相同活性时，该氨基酸序列包括在本发明的范围内。此外，本发明的肽还可包括为了增加肽的半衰期或稳定性的特定目的而制备的靶向序列、标签、标记的残基、氨基酸序列。

此外，为了获得更好的化学稳定性、增强的药理学性质(半衰期、吸收性、效价、功效等)、经修饰的特异性(例如，宽的生物活性谱)和降低的抗原性，可以将保护基结合至本发明的肽的N端或C端。例如，保护基可为乙酰基、芴基甲氧基羰基、甲酰基、棕榈酰基、肉豆蔻基、硬脂基或聚乙二醇(PEG)，然而，当保护基是能够修饰肽、特别是改善肽稳定性的组分时，这种保护基可以包括在内而不受限制。所使用的“稳定性”不仅包括保护本发明的肽在体内免受蛋白水解酶攻击的体内稳定性，而且包括储存稳定性(例如，室温储存稳定性)。

本发明的由KFLIK的氨基酸序列组成的五肽可以通过抑制SNARE复合物的形成并抑制神经末梢的神经递质的过度释放从而预防或治疗多汗症。

此外，本发明的由KFLIK的氨基酸序列组成的五肽可以通过在出现多汗症的皮肤区域中抑制汗液的产生从而预防或减轻多汗症。

此外，由于本发明的由KFLIK的氨基酸序列组成的五肽经皮吸收渗透至皮肤组织的肌肉层中，因此仅通过将其施加至病变处即可改善或减轻多汗症的症状。

在此，“多汗症”是指这样的疾病状态，其特征在于过度且不受控制的出汗，超过了冷却身体所需的水平，并且是指由于汗腺机能亢进和胆碱能刺激紊乱而分泌过多汗液的疾病或症状。在此，多汗症包括局限性多汗症(原发性多汗症)和全身性多汗病(继发性多汗症)，并且可以发生在选自由(例如)面部、前额、颈部、手部、足部和腋窝组成的组中的任意一个皮肤区域，但不限于此。

在具体实施方案中，当将包含本发明五肽的组合物施加至多汗症患者的一个手掌、脚掌和腋窝时，与未施加该组合物的相反侧部位的对照区域相比，确认了出汗量减少了45％至90％。

在此，术语“预防”是指通过施用包含五肽的组合物抑制或延迟疼痛的任何作用。

在此，术语“治疗”是指通过施用包含五肽的组合物“缓解”或“改善”或者有益地改变疼痛的任何作用。

根据本发明的用于预防或治疗多汗症的药物组合物可以根据常规方法以诸如粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂和气雾剂之类的口服制剂、外用制剂、栓剂和无菌注射液的形式配制和使用。对于制剂，可包括通常用于制备药物组合物的合适载体、赋形剂或稀释剂。

药学上可接受的载体可以包括制剂中通常使用的乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、金合欢胶、树胶、磷酸钙、海藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油等。

除了上述成分之外，药物组合物还可以包含润滑剂、润湿剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂等。

药物组合物可以根据所需方法口服施用或肠胃外施用(例如，肌内、静脉内、腹腔内、皮下、皮内或局部)。剂量根据患者的状况和体重、疾病的严重程度、药品形式以及施用途径和时间而变化，而且可以由本领域技术人员适当地选择。

本发明的药物组合物以药学有效量施用。在本发明中，“药学有效量”是指以适用于医学治疗的合理的效益/风险比治疗疾病的足够的量，并且可以根据包括疾病类型和严重程度、药品活性、药品敏感性、施用时间、施用途径和排出速率、治疗持续时间和同时使用的药品在内的因素以及医学领域中公知的其他要素来确定有效剂量水平。药物组合物可以作为单独的治疗剂施用或者可以与其他抗肥胖药品组合施用，药物组合物可以与常规治疗剂同时、分开或顺序施用，并且药物组合物可以单独或多次施用。重要的是，在考虑所有上述因素的情况下，施用能够以最少用量获得最大效果而没有副作用的量，该量可以由本领域技术人员容易地确定。

药物组合物的有效量可以根据患者的年龄、性别、状况、体重、活性成分在体内的吸收、失活速率、排泄速率、疾病类型、组合使用的药品而变化，并且药物组合物的有效量可以根据施用途径、肥胖的严重程度、性别、体重、年龄等而增加或减少。例如，可以以每天每1kg患者体重约0.0001μg至500mg、优选0.01μg至100mg施用药物组合物。

在另一方面，本发明提供了一种用于预防或缓解多汗症或抑制体味的组合物，其包含由KFLIK的氨基酸序列组成的五肽作为活性成分。

本发明的由KFLIK的氨基酸序列组成的五肽可以通过抑制SNARE复合物的形成并抑制神经末梢的神经递质的过度释放从而预防或治疗多汗症，并且可以抑制由过度产生汗液而引起的体味。

此外，本发明的由KFLIK的氨基酸序列组成的五肽可以通过在出现多汗症的皮肤区域中显示出抑制汗液产生的效果从而预防或减轻多汗症。

此外，本发明的由KFLIK的氨基酸序列组成的五肽可以抑制引起体味的菌株的生长，从而抑制由汗液中所含物质的降解引起的体味的产生。

肽、五肽和多汗症的具体细节如上文所述。

在此，“体味”是指当细菌降解汗腺分泌物(即，与汗液一起分泌的脂肪、蛋白、皮脂和/或废物)时产生的降解产物的气味，并且具体而言，“体味”可为在产生大量汗液的身体部位如腋窝、足部、手部、前额、颈部、面部或头皮产生的气味。

在此，“抑制体味”是指预防由微生物降解汗腺分泌物的降解产物产生的气味，或抑制汗液产生，这是体味的起因。具体而言，抑制体味可为预防腋窝、足部、手部、前额、颈部、面部或头皮的气味，或者抑制该区域的汗液产生，并且更具体而言为预防腋臭。

在还一方面，本发明提供了一种用于预防或缓解多汗症或抑制体味的化妆品组合物，其包含由KFLIK的氨基酸序列组成的五肽作为活性成分。

可以以本领域通常制备的任何制剂制备化妆品组合物，例如，可以以溶液、混悬剂、乳剂、糊剂、凝胶剂、霜剂、洗剂、粉末剂、肥皂、含表面活性剂的清洗剂、油剂、粉末粉底、乳液粉底、蜡质粉底和喷雾剂等形式进行配制，但不限于此。

化妆品组合物可以制备成诸如溶液、溶胶凝胶、乳液、油、蜡、气雾剂等各种形式，例如，柔肤水、滋养乳液、滋养霜、按摩霜、精华液、眼霜、清洁霜、清洁泡沫、洁肤水、面膜、喷雾、粉末、除臭剂、生发油、发乳、洗发液、洗发香波、染发剂、护发素、头发喷雾剂、头发气雾剂、润发油、凝胶等，但不限于此。

除了由KFLIK的氨基酸序列组成的五肽之外，本发明的化妆品组合物还可以包含其他添加剂，例如赋形剂和载体，并且可以根据需要应用和掺混那些掺入一般化妆品中的常用成分。

当化妆品组合物的制剂为糊剂、霜剂或凝胶剂时，可以使用动物油、植物油、蜡、石蜡、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅树脂、膨润土、二氧化硅、滑石、氧化锌等作为载体成分。

当化妆品组合物的制剂为粉末剂或喷雾剂时，可使用乳糖、滑石粉、二氧化硅、氢氧化铝、硅酸钙或者聚酰胺粉末作为载体成分。特别是，当制剂为喷雾剂时，制剂还可包含诸如氯氟烃、丙烷/丁烷或者二甲醚之类的推进剂，但不限于此。

当化妆品组合物的制剂为溶液或乳剂时，可使用溶剂、增溶剂或者乳化剂作为载体成分，例如可以使用水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇油、丙三醇脂肪族酯、聚乙二醇或者山梨糖醇的脂肪酸酯。

当化妆品组合物的制剂为混悬剂时，可使用诸如水、乙醇和丙二醇之类的液体稀释剂、诸如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙基山梨醇酯及聚氧乙烯山梨聚糖酯之类的悬浮剂、微晶性纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂或黄蓍胶等作为载体成分。

当化妆品组合物的制剂为含表面活性剂的清洗剂时，可使用脂肪醇硫酸盐、脂肪醇醚硫酸盐、磺基琥珀酸单酯、羟乙基磺酸盐、咪唑啉鎓衍生物、甲基牛磺酸盐、肌氨酸盐、脂肪酸酰胺醚硫酸盐、烷基酰胺甜菜碱、脂肪醇、脂肪酸甘油酯、脂肪酸二乙醇酰胺、植物油、羊毛脂衍生物或乙氧基化甘油脂肪酸酯等作为载体成分。

当化妆品组合物的制剂为洗发香波时，用于香波组合物的基础成分如增稠剂、表面活性剂、粘度调节剂、保湿剂、pH调节剂、防腐剂、精油等可与本发明的Trolox-肽缀合物混合。CDE可用作增稠剂，阴离子表面活性剂LES和两性表面活性剂椰油甜菜碱可用作表面活性剂，聚季铵盐可以用作粘度调节剂，甘油可以用作保湿剂，并且柠檬酸和氢氧化钠可以用作pH调节剂。葡萄柚提取物等可用作防腐剂，并且还可以添加诸如杉木、薄荷和迷迭香之类的精油、丝氨基酸、戊醇或维生素E。

除了作为活性成分的本发明的Trolox-肽缀合物和载体成分之外，化妆品组合物中所含的成分还可以包括化妆品组合物中通常使用的成分，例如常规助剂如抗氧化剂、稳定剂、增溶剂、维生素、色素和芳香剂等，但不限于此。

在还一方面，本发明提供了一种用于预防或治疗多汗症的方法，包括向受试者施用由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的五肽。

在还一方面，本发明提供了由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的五肽，用于预防或治疗多汗症。

在还一方面，本发明提供了一种用于抑制体味的方法，包括向受试者施用由SEQID NO:1的氨基酸序列组成的五肽。

在还一方面，本发明提供了由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的五肽，用于抑制体味。

“受试者”可包括人。此外，术语“受试者”可以是需要施用本发明的五肽的对象，并且需要施用的受试者可以包括已经诊断出患有多汗症或臭气症的个体、已经出现多汗症或臭气症相关症状的个体、以及希望给予施用以预防疾病或症状的发展或改善健康的个体。

“施用”是指通过任何合适的方法向患者提供预定物质，并且本发明的五肽的施用途径可以是通过任何一般途径的口服施用或胃肠外施用，只要可以到达靶组织即可。此外，可以通过能够将活性剂输送至靶细胞的任何装置施用该五肽。

如上文所述，本发明的五肽通过抑制神经细胞中SNARE复合物的形成从而抑制神经递质的过度释放，并且仅通过将本发明的五肽施加至过度产生汗液的区域，就可以渗透至肌肉层的神经细胞中从而具有抑制汗液产生的优异效果。因此，本发明的五肽可用作药物组合物或化妆品组合物的原料，以用于预防、改善、减轻或治疗多汗症或抑制体味。

本发明的还一方面提供了一种用于缓解疼痛的组合物，其包含由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的五肽作为活性成分。

在此，术语“肽”是指通过肽键将氨基酸残基彼此组合而形成的线性或环状分子。可以通过本领域已知的常规生物或化学合成的方法完成肽的制备，例如，可以通过诸如固相合成技术之类的方法完成肽的制备。

在此，术语“五肽”是指由五个氨基酸残基组成的线性分子，并且本发明的五肽是指由SEQ ID NO:1(KFLIK)的氨基酸序列组成的线性肽分子。

“肽”和“五肽”可以是通过在不影响功能的范围内的氨基酸残基的缺失、插入、置换或它们的组合而得到的具有不同序列的氨基酸变体或片段。不完全改变肽的活性的氨基酸交换在本领域中是已知的。在一些情况下，可以通过磷酸化、硫酸化、丙烯酸酯化、糖基化、甲基化、法尼基化等对氨基酸交换进行修饰。因此，本发明包括具有与由KFLIK的氨基酸序列组成的五肽基本相同的氨基酸序列的肽，以及该肽的变体或活性片段。基本上相同的蛋白是指与KFLIK的氨基酸序列的序列同源性为至少75％、优选至少80％、例如至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的氨基酸序列，但不限于此，并且当氨基酸序列的序列同源性为75％以上且具有相同活性时，该氨基酸序列包括在本发明的范围内。此外，本发明的肽还可包括为了增加肽的半衰期或稳定性的特定目的而制备的靶向序列、标签、标记的残基、氨基酸序列。

此外，为了获得更好的化学稳定性、增强的药理学性质(半衰期、吸收性、效价、功效等)、经修饰的特异性(例如，宽的生物活性谱)和降低的抗原性，可以将保护基结合至本发明的肽的N端或C端。例如，保护基可为乙酰基、芴基甲氧基羰基、甲酰基、棕榈酰基、肉豆蔻基、硬脂基或聚乙二醇(PEG)，然而，当保护基是能够修饰肽、特别是改善肽稳定性的组分时，这种保护基可以包括在内而不受限制。所使用的“稳定性”不仅包括保护本发明的肽在体内免受蛋白水解酶攻击的体内稳定性，而且包括储存稳定性(例如，室温储存稳定性)。

本发明的由KFLIK的氨基酸序列组成的五肽抑制了肌细胞中促炎细胞因子的表达并抑制了炎症反应，因此可以预防或治疗由微小裂伤引起的疼痛。

此外，本发明的由KFLIK的氨基酸序列组成的五肽可以通过抑制突触神经元分泌的疼痛递质物质P的释放来防止疼痛的传递，从而预防或治疗疼痛。

此外，本发明的由KFLIK的氨基酸序列组成的五肽经皮吸收渗透至皮肤组织的肌肉层中，因此可以通过将本发明的五肽施加至病变处从而预防、减轻或治疗疼痛。

在此，“疼痛”是指由具有疼痛受体的特定神经的刺激引起的不愉快感觉，并且包括通过本发明的五肽减轻、预防或治疗这种感觉的所有症状。根据本发明的疼痛可为急性疼痛或慢性疼痛。

在此，疼痛可为选自由以下组成的组中的至少一者：炎性疼痛、神经性疼痛、伤害性疼痛和精神性疼痛，例如，疼痛可为选自由癌症疼痛或术后疼痛组成的组中的至少一者，其中伤害性疼痛、炎性疼痛等联合作用；属于神经性疼痛的三叉神经痛、特发性疼痛和糖尿病神经性疼痛；以及属于内脏疼痛的偏头痛和月经疼痛，但不限于此。

此外，包含本发明五肽的组合物可应用于在皮肤或肌肉骨骼系统中发生的疼痛。例如，疼痛可为选自以下中至少一者的伴随性疼痛：糖尿病神经病变、糖尿病周围神经病变、由病毒感染引起的疼痛、伤害性疼痛、面部神经痛、疱疹后神经痛、背痛、椎间盘、神经根病、神经病变、痛觉过敏、中枢致敏相关疼痛、异常性疼痛、癌症疼痛、肌筋膜疼痛综合征、腕管综合征、肘管综合征(尺骨神经病变)、德奎尔万(de Quervain)综合征、肩袖综合征、骨关节炎、肌腱炎、肌腱滑膜炎、外侧上髁炎、内侧上髁炎、肌腱损伤、粘液囊炎、韧带炎症、网球肘、高尔夫肘、膝关节疼痛、髌骨肌腱炎，半月板损伤、手指关节疼痛、手腕肌腱炎、手腕扭伤、脚踝扭伤、扭伤、纤维肌痛、足底筋膜炎、炎性关节炎、感染性关节炎、类风湿关节炎、退行性关节疼痛、冰冻肩、痛风、产后关节疼痛、骨髓炎、强直性脊柱炎、退行性脊柱疾病、腰椎狭窄、小腿痛(cruralgia)、扭伤、挫伤、关节疼痛和坐骨神经痛。

具体而言，根据本发明的五肽仅通过将其施加至皮肤即可到达肌肉层，并通过皮肤吸收，从而示出优异的镇痛效果。特别是，本发明的五肽可以有效地作用于皮肤或靠近皮肤的组织、特别是皮下脂肪薄的区域周围的疼痛。例如，本发明的五肽可以有效地预防或治疗伴随诸如膝盖、肘部、手指、肩膀、脚踝、足部等区域的扭伤、擦伤、关节疼痛、肌腱炎、韧带炎、冰冻肩、肩袖疾病、网球肘、高尔夫肘和德奎尔万综合征的疼痛。

本发明的还一方面提供了一种用于预防或治疗疼痛的药物组合物，其包含由SEQID NO:1的氨基酸序列组成的五肽作为活性成分。

在此，术语“预防”是指通过施用包含五肽的组合物抑制或延迟疼痛的任何作用。

在此，术语“治疗”是指通过施用包含五肽的组合物“缓解”或“改善”或者有益地改变疼痛的任何作用。

根据本发明的用于预防或治疗疼痛的药物组合物可以根据常规方法以诸如粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂和气雾剂之类的口服制剂、外用制剂、栓剂和无菌注射液的形式配制和使用。对于制剂，可包括通常用于制备药物组合物的合适载体、赋形剂或稀释剂。

药学上可接受的载体可以包括制剂中通常使用的乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、金合欢胶、树胶、磷酸钙、海藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁、矿物油等。

除了上述成分之外，药物组合物还可以包含润滑剂、润湿剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂等。

药物组合物可以根据所需方法口服施用或肠胃外施用(例如，肌内、静脉内、腹腔内、皮下、皮内或局部)。剂量根据患者的状况和体重、疾病的严重程度、药品形式以及施用途径和时间而变化，而且可以由本领域技术人员适当地选择。

本发明的药物组合物以药学有效量施用。在本发明中，“药学有效量”是指以适用于医学治疗的合理的效益/风险比治疗疾病的足够的量，并且可以根据包括疾病类型和严重程度、药品活性、药品敏感性、施用时间、施用途径和排出速率、治疗持续时间和同时使用的药品在内的因素以及医学领域中公知的其他要素来确定有效剂量水平。药物组合物可以作为单独的治疗剂施用或者可以与其他镇痛剂组合施用，药物组合物可以与常规治疗剂同时、分开或顺序施用，并且药物组合物可以单独或多次施用。重要的是，在考虑所有上述因素的情况下，施用能够以最少用量获得最大效果而没有副作用的量，该量可以由本领域技术人员容易地确定。

药物组合物的有效量可以根据患者的年龄、性别、状况、体重、活性成分在体内的吸收、失活速率、排泄速率、疾病类型、组合使用的药品而变化，并且药物组合物的有效量可以根据施用途径、肥胖的严重程度、性别、体重、年龄等而增加或减少。例如，可以以每天每1kg患者体重约0.0001μg至500mg、优选0.01μg至100mg施用药物组合物。

本发明的还一方面提供了一种用于预防或改善疼痛的准药品组合物，其包含由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的五肽作为活性成分。

肽、五肽和疼痛的具体细节如上文所述。

在此，术语“准药品”是指在用于诊断、治疗、改善、减轻、治疗或预防人或动物疾病的制品中，比药物的效果更温和的制品。例如，根据药事法(Pharmaceutical AffairsAct)，准药品是排除了用于药物目的的制品，并且包括用于治疗或预防人/动物疾病的制品、对人体作用较小或没有直接作用的制品等。

本发明的准药品组合物可以用选自由以下组成的组中的至少一者进行制备：身体清洁剂、泡沫剂、肥皂、面膜、软膏剂、霜剂、洗剂、精华液和喷雾剂，但不限于此。此外，可以将组合物制备成条带、卫生巾等形式，但不限于此。

当本发明的五肽用作准药品添加剂时，该组合物可以原样添加或与其他准药品或准药品成分一起使用，并且可以根据常规方法适当使用。

在还一方面，本发明提供了一种用于缓解疼痛的化妆品组合物，其包含由SEQ IDNO:1的氨基酸序列组成的五肽作为活性成分。

肽、五肽和疼痛的具体细节如上文所述。

可以以本领域通常制备的任何制剂制备化妆品组合物，例如，可以以溶液、混悬剂、乳剂、糊剂、凝胶剂、霜剂、洗剂、粉末剂、肥皂、含表面活性剂的清洗剂、油剂、粉末粉底、乳液粉底、蜡质粉底和喷雾剂等形式进行配制，但不限于此。

化妆品组合物可以制备成诸如溶液、溶胶凝胶、乳液、油、蜡、气雾剂等各种形式，例如，柔肤水、滋养乳液、滋养霜、按摩霜、精华液、眼霜、清洁霜、清洁泡沫、洁肤水、面膜、喷雾、粉末、生发油、发乳、洗发液、洗发香波、染发剂、护发素、头发喷雾剂、头发气雾剂、润发油、凝胶等，但不限于此。

除了由KFLIK的氨基酸序列组成的五肽之外，本发明的化妆品组合物还可以包含其他添加剂，例如赋形剂和载体，并且可以根据需要应用和掺混那些掺入一般化妆品中的常用成分。

当化妆品组合物的制剂为糊剂、霜剂或凝胶剂时，可以使用动物油、植物油、蜡、石蜡、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅树脂、膨润土、二氧化硅、滑石、氧化锌等作为载体成分。

当化妆品组合物的制剂为粉末剂或喷雾剂时，可使用乳糖、滑石粉、二氧化硅、氢氧化铝、硅酸钙或者聚酰胺粉末作为载体成分。特别是，当制剂为喷雾剂时，制剂还可包含诸如氯氟烃、丙烷/丁烷或者二甲醚之类的推进剂，但不限于此。

当化妆品组合物的制剂为溶液或乳剂时，可使用溶剂、增溶剂或者乳化剂作为载体成分，例如可以使用水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇油、丙三醇脂肪族酯、聚乙二醇或者山梨糖醇的脂肪酸酯。

当化妆品组合物的制剂为混悬剂时，可使用诸如水、乙醇和丙二醇之类的液体稀释剂、诸如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙基山梨醇酯及聚氧乙烯山梨聚糖酯之类的悬浮剂、微晶性纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂或黄蓍胶等作为载体成分。

当化妆品组合物的制剂为含表面活性剂的清洗剂时，可使用脂肪醇硫酸盐、脂肪醇醚硫酸盐、磺基琥珀酸单酯、羟乙基磺酸盐、咪唑啉鎓衍生物、甲基牛磺酸盐、肌氨酸盐、脂肪酸酰胺醚硫酸盐、烷基酰胺甜菜碱、脂肪醇、脂肪酸甘油酯、脂肪酸二乙醇酰胺、植物油、羊毛脂衍生物或乙氧基化甘油脂肪酸酯等作为载体成分。

当化妆品组合物的制剂为洗发香波时，用于香波组合物的基础成分如增稠剂、表面活性剂、粘度调节剂、保湿剂、pH调节剂、防腐剂、精油等可与本发明的五肽缀合物混合。CDE可用作增稠剂，阴离子表面活性剂LES和两性表面活性剂椰油甜菜碱可用作表面活性剂，聚季铵盐可以用作粘度调节剂，甘油可以用作保湿剂，并且柠檬酸和氢氧化钠可以用作pH调节剂。葡萄柚提取物等可用作防腐剂，并且还可以添加诸如杉木、薄荷和迷迭香之类的精油、丝氨基酸、戊醇或维生素E。

除了作为活性成分的本发明的五肽缀合物和载体成分之外，化妆品组合物中所含的成分还可以包括化妆品组合物中通常使用的成分，例如常规助剂如抗氧化剂、稳定剂、增溶剂、维生素、色素和芳香剂等，但不限于此。

在还一方面，本发明提供了一种用于预防或治疗疼痛的方法，包括向受试者施用由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的五肽。

在还一方面，本发明提供了由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的五肽，用于预防或治疗疼痛。

在还一方面，本发明提供了一种用于预防或改善疼痛的准药品组合物，其包含由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的五肽作为活性成分。

在还一方面，本发明提供了一种用于缓解疼痛的化妆品组合物，其包含由SEQ IDNO:1的氨基酸序列组成的五肽作为活性成分。

“受试者”可包括人。此外，术语“受试者”可以是需要施用本发明的五肽的对象，并且需要施用的受试者可以包括已经诊断出患有疼痛的个体、已经出现疼痛的个体、以及希望给予施用以预防疾病或症状的发展或改善健康的个体。

“施用”是指通过任何合适的方法向患者提供预定物质，并且本发明的组合物的施用途径可以是通过任何一般途径的口服施用或胃肠外施用，只要可以到达靶组织即可。此外，可以通过能够将活性剂输送至靶细胞的任何装置施用该组合物。

如上文所述，本发明的五肽通过抑制肌细胞中促炎细胞因子的表达从而抑制由炎症反应引起的疼痛，通过抑制神经末梢中的物质P的释放从而预防疼痛的传递，并且通过仅将其施加至皮肤而渗透至肌肉层的神经细胞中，从而有效地抑制疼痛。因此，本发明的五肽可以有效地用作药物、准药品或化妆品组合物的原料，以缓解、改善、预防或治疗疼痛。

以下，将通过实施例和实验例详细说明本发明。

然而，以下的实施例和实验例仅是对本发明的说明，并且本发明的内容不限于以下的实施例和实验例。

[实施例1]

新的五肽的合成和物理性质的确认

1-1.五肽的合成

使用已知方法制备由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的新的肽序列“KFLIK”。使用分子量测定仪测定包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列的肽的分子量，结果确认其分子量相当于647.4Da。

1-2.长期储存时的高温稳定性的评价

将由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的本发明的肽以1000ppm的浓度溶解于无菌蒸馏水中，在45℃储存7天、14天、28天、60天和75天，然后进行HPLC分析。

作为结果，如图1a所示，确认了在45℃，在75天的最长观察天数内，本发明的肽维持了稳定性。

1-3.高温稳定性的评价

将本发明的肽以1000ppm的浓度溶解于无菌蒸馏水中，在121℃加热15分钟和30分钟，然后进行HPLC分析。

作为结果，如图1b所示，确认了在121℃，在30分钟的最长加热时间内，本发明的肽维持了稳定性。

[实验例1]

对神经细胞中SNARE复合物的形成产生抑制效果的确认

1-1.对SNARE复合物的形成产生抑制效果的确认

为了确认本发明的五肽抑制神经细胞中神经递质释放的效果，将成神经细胞瘤衍生细胞系(SH-SY5Y)用于确定SNARE复合物的形成是否受到抑制。

具体而言，将SH-SY5Y细胞以3×10⁵个细胞/孔的密度接种在6孔板中，并在37℃、5％ CO₂培养箱中培养24小时，然后将培养基更换为无血清培养基。随后，将五肽以10μM、50μM和100μM的浓度添加至6孔板，作为阳性对照组则向其中添加0.2μM C型肉毒杆菌毒素轻链(BoNT/C LC)，并进行培养。24小时后，收集细胞，获得裂解物，并对突触融合蛋白1a抗体(synaptic systems，德国)进行蛋白印迹。

作为结果，如图2a所示，当用本发明的五肽处理时，SNARE复合物的形成受到抑制，这类似于用肉毒杆菌毒素处理的阳性对照。

由此可以看出，本发明的五肽抑制了SNARE复合物的形成，并防止了突触小泡与突触前膜融合，从而抑制了神经递质释放。

1-2.对突触融合蛋白1a蛋白的降解效果的确认

为了确认本发明的五肽抑制神经细胞中神经递质释放的效果，确认了本发明的五肽是否具有使构成t-SNARE的突触融合蛋白1a蛋白降解的能力。

具体而言，在实验组中，向反应缓冲液(50mM HEPES，40mM2-ME，20μM ZnCl₂，pH7.4)中添加1μg的重组突触融合蛋白1a蛋白(Novus biologicals，美国)和20μM、100μM和200μM的本发明的五肽，而在阴性对照组中，仅添加重组突触融合蛋白1a蛋白。在37℃反应4小时后，使用突触融合蛋白1a抗体(synaptic systems，德国)进行蛋白印迹。

作为结果，如图2b所示，确认了当用本发明的五肽处理时，重组突触融合蛋白1a蛋白的条带以浓度依赖性方式减弱。

由此可以看出，本发明的五肽通过降解突触融合蛋白1a蛋白并防止SNARE复合物的形成从而具有抑制神经递质释放的效果。

[实验例2]

对神经细胞中神经递质的释放产生抑制效果的确认

为了确认本发明的五肽抑制神经细胞中神经递质释放的效果，使用成神经细胞瘤衍生细胞系(SH-SY5Y)测定神经递质乙酰胆碱的分泌。

具体而言，将SH-SY5Y细胞注射至培养皿，并在37℃、5％ CO₂培养箱中培养24小时，然后将培养基更换为无血清培养基并培养48小时。随后，将五肽以1μM、10μM和50μM的浓度添加至培养皿，作为阳性对照组则向其中添加50nM破伤风毒素(tetanus)，并进行培养。经过一段时间后，通过烟碱(NIC)和氯化钾(KCl)处理诱导乙酰胆碱的释放。然后，使用乙酰胆碱分析试剂盒测定培养基中乙酰胆碱分泌的量。

作为结果，如图3所示，与未用任何试剂处理的对照组相比，在仅用烟碱(NIC)和氯化钾(KCl)处理的组中，乙酰胆碱释放量增加，但在用本发明的五肽处理的组中，显著抑制了乙酰胆碱的释放。

[实验例3]

经人体功效评估确认五肽对多汗症的抑制效果

为了确认根据本发明的五肽实际上对抑制手掌、脚掌和腋窝的汗液分泌有效果，使用淀粉和碘对汗液分泌程度拍摄图像，并使用Image J软件进行强度分析。

具体而言，对10名患有局部多汗症(手掌、脚掌、腋窝)的受试者的汗液分泌程度进行人体功效评估。使用微针滚轮将包含2000ppm的本发明五肽的溶液施加至受试者一侧的手掌、脚掌或腋窝。此时，将相反侧的手掌、脚掌和腋窝设置为对照组，并且在对照组的情况下，用微针滚轮施加PBS替代包含五肽的溶液。在充分吸收和自然干燥后，用无菌纱布垫将碘溶液施加至同一区域并使之自然干燥。当碘溶液完全干燥时，用棉花将玉米淀粉均匀地施加至碘涂覆区域，以形成淀粉层。当汗液分泌时，碘和淀粉溶解，颜色变为蓝紫色，因此，在受试者的手掌、脚掌或腋窝观察到颜色随时间的变化。在采集图像后，使用Image J软件进行强度分析。

作为结果，如图4所示，确认了施加包含本发明五肽的护理液的受试者手部分泌的汗液量减少了约74％。此外，如图5所示，确认了施加包含本发明五肽的护理液的受试者脚掌分泌的汗液量减少了约58％，并且如图6所示，确认了施加包含本发明五肽的护理液的受试者腋窝分泌的汗液量减少了约88％。

由此可以看出，仅通过将本发明的五肽施加至多汗症患者的皮肤，就可以在减少出汗和预防过度出汗方面提供治疗效果，从而提供了从根本上阻断出现体味的效果。

[实验例4]

细胞内或皮肤组织渗透模式的确认

4-1.罗丹明-五肽缀合物的制备

为了确认本发明的肽是否会渗透细胞或组织，制备了与荧光材料缀合的罗丹明-五肽缀合物。首先，使用100mM碳酸氢钠(pH 9.0)制备10mg/ml的五肽溶液，并使用二甲基甲酰胺制备1mg/ml的NHS-罗丹明(Thermo Scientific，46406)溶液。混合制备的溶液，使五肽:NHS-罗丹明＝1:10(摩尔比)。遮光后，在将溶液颠倒的同时在室温反应1小时，透析反应物，然后通过LC/MS确认了缀合。

4-2.细胞内渗透的确认

为了确认本发明的五肽渗透至神经细胞中，将SH-SY5Y细胞以3×10⁵个细胞/孔的密度接种在6孔板中，并在37℃、5％ CO₂培养箱中培养24小时，然后将培养基更换为无血清培养基。在用各种浓度的罗丹明-肽缀合物处理4小时后，通过用4％多聚甲醛处理，固定细胞，并使用DAPI染色试剂盒(Invitrogen，美国)对细胞核进行染色。使用荧光显微镜观察细胞内肽渗透的状况。蓝色表示用DAPI染色的细胞核，并且红色表示“罗丹明-五肽”缀合物。

作为结果，如图7所示，由蓝色和红色的共存确认了本发明的五肽渗透至神经细胞中。

4-3.渗透至组织中的确认

在7周龄SD大鼠的背部脱毛后，向其施加罗丹明-五肽，1小时后，处死大鼠以进行分析。从施加部位采集皮肤组织并进行一天的福尔马林固定。使用固定组织制作石蜡块并对其进行切片后，使用神经元细胞标记物TrkB Ab(Cell signaling，美国)进行免疫组织化学染色。然后，使用DAPI染色试剂盒(Invitrogen，美国)进行核染色，并使用荧光显微镜观察肽渗透至组织中的图像。蓝色表示用DAPI染色的细胞核，红色表示罗丹明-五肽缀合物，并且绿色表示TrkB(神经纤维标记物)。

作为结果，如图8所示，确认了本发明的五肽渗透至皮肤组织的肌肉层中，并与神经细胞标记物共定位。

由此可以看出，由于本发明的五肽可以渗透至神经细胞中，其经皮吸收渗透至皮肤组织的肌肉层中，并与肌肉层中的神经细胞标记物共存，因此五肽可以显示出抑制汗液分泌的效果和阻断产生由汗液分泌引起体味的效果。

由此可以看出，由于本发明的五肽可以渗透至神经细胞中，其经皮吸收渗透至皮肤组织的肌肉层中，并与肌肉层中的神经细胞标记物共存，因此五肽可以通过参与抑制肌肉细胞中促炎细胞因子的表达和神经末梢中疼痛递质的释放，显示出抑制疼痛的产生和传递的效果。

[实验例5]

使用引起体味的菌株确认五肽的体味抑制效果

使用棒状杆菌确认本发明的五肽的抗菌效果，已知棒状杆菌是通过分解汗液中所含的物质而产生气味的代表性的引起气味的细菌。

具体而言，使用购自韩国典型培养物保藏中心的干燥棒状杆菌(C.xerosis，KCTC9105)作为引起体味的菌株。将该菌株接种至脑心浸液(Difco，美国)培养基中，并在37℃的培养箱中培养2天。将通过向培养的菌株中添加相同的培养基从而稀释至10⁶CFU/ml的浓度的稀释溶液作为试验用菌液。在96孔板中等分100μL的试验用菌液后，按浓度添加五肽。在阳性对照组中，添加1％三氯生代替五肽。培养48小时后，用分光光度计测定在600nm处的吸光度，以确认抑制引起气味的细菌增殖的效果。

作为结果，如图9所示，确认了当用本发明的五肽处理时，明显抑制了引起体味的菌株的增殖。特别是，确认了在用1mg和2mg的五肽处理的组中，抗菌效果优异，与阳性对照组的抗菌效果具有相同水平。

由此可以看出，本发明的五肽可以通过抑制引起体味的菌株的增殖，有效地抑制出汗期间产生的独特体味。

[实验例6]

五肽处理对肌细胞中促炎细胞因子的释放产生抑制效果的确认6-1.促炎细胞因 子基因表达水平的确认

为了确认本发明的五肽的疼痛改善效果，使用小鼠成肌细胞确认了炎症相关细胞因子的表达模式。促炎细胞因子参与神经病变中的疼痛，当神经损伤后诸如TNF-α之类的促炎细胞因子表达时，引发炎症反应并引起疼痛。

具体而言，将小鼠成肌细胞C2C12细胞以2×10⁵个细胞/孔的密度接种在6孔板中，然后在DMEM(10％PBS)培养基中培养3天。当细胞生长至板的约70％至80％时，将培养基更换为分化培养基(DMEM，5％马血清)，并培养3天。随后，将培养基更换为分化培养基(DMEM，5％马血清)，培养细胞4天，以诱导成肌细胞向肌管分化。然后，将培养基更换为无血清培养基并孵育2小时，并且用1μM、10μM和100μM的五肽预处理1小时。然后，对其施用20nM的TNF-α处理，并将细胞培养24小时以诱导炎症反应。

然后，回收细胞，分离RNA，并使用cDNA合成试剂盒(Intron，韩国)合成cDNA。使用合成的cDNA、PCR预混物(Intron，韩国)和IL-1α、TNF-α、IL-1β和COX-2引物进行聚合酶链反应，并且将扩增的PCR产物在琼脂糖凝胶上电泳，并检查DNA条带以比较基因的mRNA表达水平。此时使用的引物序列如[表1]所示。

[表1]

作为结果，如图10a所示，确认了与未处理组(对照)相比，在通过用TNF-α处理诱导肌管炎症的情况下，IL-1α、IL-1β、COX-2和TNF-α(即，促炎细胞因子)的mRNA表达水平显著增加。然而，确认了在使用1μM和10μM的本发明五肽的处理组的情况下，促炎细胞因子增加的幅度减少。

6-2.促炎细胞因子蛋白的表达水平的确认

另一方面，为了确认炎性细胞因子蛋白的表达水平，对于6-1中回收的一些细胞(W.B.)，在分离细胞裂解物后对蛋白进行定量，并与样品缓冲液混合以制备样品。在SDS-PAGE和硝酸纤维素膜上展开样品，并用5％脱脂牛奶封闭。首先将COX-2抗体(CellSignaling Technology，美国)、IL-1β抗体(Cell Signaling Technology，美国)和TNF-α抗体(Cell Signaling Technology，美国)与样品结合，然后结合第二抗体。用ECL溶液处理后，观察靶蛋白的表达水平。

作为结果，如图10b所示，确认了与未处理组(对照)相比，当TNF-α处理在肌管中诱导炎症时，COX-2、IL-1β和TNF-α的蛋白表达水平(即，促炎细胞因子蛋白的量)显著增加。然而，确认了在本发明的五肽处理组的情况下，促炎细胞因子的表达增加的幅度以浓度依赖性方式减少。

由此可以看出，由于在mRNA水平和蛋白水平这两者上，本发明的五肽都表现出减少肌管中IL-1α、IL-1β、COX-2和TNF-α的表达(即，促炎细胞因子的表达)的效果，因此可以有效地用作用于预防或治疗疼痛的物质。

[实验例7]

对神经细胞的神经递质释放产生抑制效果的确认

为了确认本发明的五肽缓解疼痛的效果，使用小鼠神经细胞在突触处确认了物质P的释放程度。物质P将来自外周的疼痛传递到中枢，因此如果使物质P的释放受到抑制，就可以具有疼痛缓解效果。

具体而言，从6周龄大鼠的脊髓中分离背根神经节(DRG)并清洗，然后分离神经细胞。在24孔板中等分该分离的神经细胞并培养这些细胞一天后，将有丝分裂抑制剂与培养神经细胞的培养基混合，并且仅将纯神经细胞培养6天。然后，为了添加营养物，将培养基更换为B-27培养基(无血清，1％盘尼西林)，并且培养细胞24小时，随后用1μM和10μM的五肽预处理1小时。然后，用100μM的辣椒素处理30分钟以诱导物质P的释放，并通过ELISA分析物质P释放的量。

作为结果，如图11所示，确认了与未处理组(对照)相比，当用辣椒素处理时，物质P的释放增加，但在本发明的五肽处理组的情况下，物质P的释放增加的幅度显著减少。

由此可以看出，本发明的五肽可以通过抑制神经细胞释放物质P并防止疼痛信号的传递，从而有效地用作用于预防或治疗疼痛的物质。

[实验例8]

经人体功效评估确认五肽的疼痛缓解效果

为了确认根据本发明的五肽是否实际具有抑制疼痛的效果，在20名受试者中诱导延迟发作的肌肉酸痛后，将包含本发明的五肽的护理液施加至疼痛区域，以评估缓解人体疼痛的功效。

具体而言，为了使受试者产生延迟发作的肌肉酸痛，共进行了3组运动，其中要求受试者双脚分开与臀部同宽站立，背部挺直，并尽可能多地进行抬高和放下脚后跟的动作达2分钟，然后休息3分钟。24小时后，将包含2000ppm的本发明五肽的溶液施加至疼痛区域。然后，在24小时、48小时和72小时后，自我测定行走时感觉到的数值评分等级(NRS)(0为无疼痛，10为可以想象到的最严重的疼痛)。使用以下等式计算疼痛强度的平均值(平均PID评分)，并且在72小时测试后，通过受试者问卷确认疼痛缓解的程度。

[等式]

疼痛强度差(PID)＝施加本发明的五肽后的疼痛强度–施加本发明的五肽前的疼痛强度

作为结果，如图12a和图12b所示，确认了在施加本发明的五肽的实验组中，在距离运动72小时后(施加护理液后48小时)，距离运动24小时后诱发的疼痛程度得到显著改善。

由此可以看出，仅通过将本发明的五肽施加至肌肉疼痛患者的皮肤，就可以提供减少疼痛的治疗效果。

<110>    凯尔格恩有限公司

<120>    包含五肽作为活性成分的组合物

<130>    2021-OPA-5102

<150>    KR 10-2020-0071659

<151>    2020-06-12

<150>    KR 10-2020-0071660

<151>    2020-06-12

<160>    11

<170>    KoPatentIn 3.0

<210>    1

<211>    5

<212>    PRT

<213>    人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223>    五肽

<400>    1

Lys Phe Leu Ile Lys

1               5

<210>    2

<211>    20

<212>    DNA

<213>    人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223>    IL-1α的正向引物

<400>    2

gaagtcaggc agaagtgctc                                                  20

<210>    3

<211>    20

<212>    DNA

<213>    人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223>    IL-1α的反向引物

<400>    3

gtgcacccga ctttgttctt                                                  20

<210>    4

<211>    20

<212>    DNA

<213>    人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223>    TNF-α的正向引物

<400>    4

cgtcagccga tttgctatct                                                  20

<210>    5

<211>    20

<212>    DNA

<213>    人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223>    TNF-α的反向引物

<400>    5

cggactccgc aaagtctaag                                                  20

<210>    6

<211>    20

<212>    DNA

<213>    人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223>   IL-1β的正向引物

<400>    6

caaggagaac caagcaacga                                                  20

<210>    7

<211>    20

<212>    DNA

<213>    人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223>    IL-1β的反向引物

<400>    7

ttggccgagg actaaggagt                                                  20

<210>    8

<211>    20

<212>    DNA

<213>    人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223>    COX-2的正向引物

<400>    8

tgagtggtag ccagcaaagc                                                  20

<210>    9

<211>    20

<212>    DNA

<213>    人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223>    COX-2的反向引物

<400>    9

ctgcagtcca ggttcaatgg                                                  20

<210>    10

<211>    20

<212>    DNA

<213>    人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223>    GAPDH的正向引物

<400>    10

accacagtcc atgccatcac                                                  20

<210>    11

<211>    20

<212>    DNA

<213>    人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223>    GAPDH的反向引物

<400>    11

tccaccaccc tgttgctgta                                                  20

Claims (15)

1.一种用于预防或治疗多汗症的药物组合物，其包含由SEQ IDNO:1的氨基酸序列组成的五肽作为活性成分。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述多汗症包括局限性多汗症和全身性多汗症。

3.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述多汗症发生在选自由面部、前额、颈部、手部、足部和腋窝组成的组中的任意一个皮肤区域。

4.根据权利要求1所述的药物组合物，其中出汗量与未用所述组合物处理的对照组相比减少45％至90％。

5.一种用于预防或缓解多汗症或抑制体味的组合物，其包含由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的五肽作为活性成分。

6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述体味为由细菌分解汗腺分泌物产生的分解产物引起的难闻的气味。

7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述体味为来自腋窝、足部、手部、前额、颈部、面部或头皮的难闻的气味。

8.一种用于预防或缓解多汗症或抑制体味的化妆品，其包含权利要求5所述的组合物作为活性成分。

9.一种用于缓解疼痛的组合物，其包含由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的五肽作为活性成分。

10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述五肽抑制i)选自由IL-1α、IL-1β、COX-2和TNF-α组成的组中的任意一种或多种促炎细胞因子的表达，以及ii)疼痛递质物质P的释放。

11.根据权利要求9所述的组合物，其中所述疼痛为选自由炎性疼痛、神经性疼痛、伤害性疼痛和精神性疼痛组成的组中的任意一种或多种。

12.根据权利要求9所述的组合物，其中所述疼痛为伴随选自由膝盖、肘部、手指、肩部、脚踝或足部区域的扭伤、擦伤、关节疼痛、肌腱炎、韧带炎、冰冻肩、肩袖疾病、网球肘、高尔夫肘和德奎尔万综合征组成的组中的任意一种的疼痛。

13.根据权利要求9所述的组合物，其中所述疼痛是选自由术后疼痛、癌症疼痛、三叉神经痛、特发性疼痛、糖尿病神经性疼痛、肌肉疼痛、偏头痛、月经疼痛和关节炎疼痛组成的组中的至少一者。

14.一种用于预防或治疗疼痛的药物组合物，其包含权利要求9所述的组合物作为活性成分。

15.一种用于缓解疼痛的化妆品组合物，其包含权利要求9所述的组合物作为活性成分。

Images