CN103327978A - 用表皮生长因子受体抑制剂治疗肝纤维化和前肝硬化的方法 - Google Patents

Abstract

本发明通常涉及表皮生长因子受体抑制剂的治疗用法以减少纤维化，例如受试者的肝纤维化，或前肝硬化。

Description

用表皮生长因子受体抑制剂治疗肝纤维化和前肝硬化的方法

技术领域

本公开涉及通过摄入包含表皮生长因子受体抑制剂的组合物治疗纤维化，例如，肝纤维化和前肝硬化的方法。

技术背景

由于上升的嗜酒症、慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎、糖尿病、以及肥胖症的人数，慢性肝病的患病率在世界范围内急速攀升。在肝纤维化和前肝硬化中，肝星形细胞(HSCs)被活化并将纤维状胶原沉积在窦周隙。因此，正常的肝脏结构被破坏并且正常的称之为肝实质细胞的肝脏细胞不再与血浆交换营养成分和废物。这样最终导致肝硬化，形成的肝实质细胞的再生性结节被纤维状瘢痕组织包围。在肝硬化中，肝细胞癌(HCC)发生的风险显著提高因为肝细胞癌以级进形式从再生性结节到退变性结节发展成分化良好的肿瘤。HCC的治疗选项目前都是无效的，同样的，HCC是少数发生率和死亡率相当的癌症中的一种。因此，早期干预对减少纤维化和前肝硬化以及发生大结节性肝硬化和HCC的风险是可取的。

发明概述

本发明至少在某种程度上是基于表皮生长因子(EGFR)抑制剂可用于治疗纤维化，例如，肝纤维化和前肝硬化的发现。一般来说，本方法包括给所需或决定进行此类治疗的患者摄入治疗上有效剂量的EGFR抑制剂，如领域内所知的或描述于此的例如，厄洛替尼(erlotinib)，吉非替尼(gefitinib)，拉帕替尼(lapatinib)，凡德他尼(vandetanib)，HKI-272(来那替尼)，BIBW2992(阿法替尼Tovok)，XL647和PF00299804。文中所用的，“纤维化的治疗”指的是改善至少一种与纤维化相关的疾病症状。“前肝硬化的治疗”指的是改善至少一种与前肝硬化相关的疾病症状。“前肝硬化”指的是不具有大结节性肝硬化的肝硬化，例如发生大结节性肝硬化前的肝硬化。

一方面，本发明强调了治疗方法，例如减轻患者的肝纤维化或前肝硬化的严重性或进展。该方法可包括选择患有或具有得肝纤维化和/或前肝硬化风险的，但还没有大结节性肝硬化或HCC的患者，或者接受外科手术切除肝肿瘤组织后依然有纤维化或前肝硬化存在的患者。患者的选择包括通过肝活检、验血、肝脏影像检查来检测肝纤维和/或前肝硬化的存在（和/或证实无大结节性肝硬化或HCC）。如果检查结果表明患者患有纤维化或前肝硬化，本方法也包括摄入治疗上有效剂量的EGFR抑制剂，如领域内所知的或描述于此的例如厄洛替尼、吉非替尼、拉帕替尼、凡德他尼、HKI-272(来那替你)、BIBW2992(阿法替尼Tovok)、XL647和PF00299804，并且检测该抑制剂对患者肝纤维化或前肝硬化的效果，从而减少患者中肝纤维化和前肝硬化。

表皮生长因子受体抑制剂包括小分子酪氨酸激酶抑制剂来阻碍EGFR信号发送，例如喹唑啉或单克隆抗体或其能特异结合EGFR的，如领域内所知的或描述于此的抗原结合片段。抑制剂可口服或注射，例如腹腔或静脉注射，经皮给药或粘膜给药。

表皮生长因子受体抑制剂包括抗体如西妥昔单抗，帕尼单抗，扎鲁单抗(zalutumumab)，尼妥珠单抗(nimotuzuma)和马妥珠单抗(matuzumab)。

在描述于此的方法中，表皮生长因子受体抑制剂剂量可容易地由领域内的技术人员用领域内熟知的方法决定，并且根据特定的抑制剂决定。在某些实施方案中，例如当抑制剂是小分子时，日剂量可以从每公斤体重约0.1到5.0毫克。

在某些实施方案中，本方法包括通过进行肝活检、验血、或肝放射影像评估肝功能的步骤。验血是通过测定天冬氨酸转氨酶，丙氨酸转氨酶，胆红素，葡萄糖或透明质酸的水平来评估肝功能。

本发明提供了多项优点。本公开的方法减轻肝纤维化和前肝硬化的严重性和进展，因此可以抑制纤维化或前肝硬化到大结节性肝硬化的演变，并且降低发生肝癌的风险。目前还没有可选的治疗能有效降低HCC患者的死亡率。本公开的方法减少了肝纤维化和前肝硬化的程度因此提高了肝功能，这些肝功能包括但不限于凝血因子的产生，白蛋白和其它蛋白的合成，血液中胆红素的清除，以及减少肝细胞死亡。

除非另外定义，这里用到的所有技术和科学用语有着如通常为本发明所属领域内普通技术人员所知的相同意思。用于本发明的方法和材料描述于此；另外，合适的领域内所知的方法和材料也可用。材料、方法以及例子仅供说明而不做限定。所有发表论文、专利申请书、专利、序列、数据库条目、以及这里提到的其它参考文献全部通过引用结合到本文中。如有存在矛盾，以本说明书包括定义为准。

其它的特点和优势可以在以下详细的描述、图表和权利要求中显而易见。

附图说明

图1A为描述雄性大鼠接受18周每周一次的腹腔注射50mg/kg的二乙基甲硝胺(DEN)并且在12周到18周期间只注射载体(n=16)、0.5mg/kg厄洛替尼(Erl0.5;n=8)、或2mg/kg厄洛替尼(Erl2;n=8)的肿瘤结节数目的条形图。

图1B、1C和1D为一系列图像，显示取自接受18周每周一次的腹腔注射50mg/kg的二乙基甲硝胺(DEN)以及在12周到18周期间(B)只注射载体、(C)0.5mg/kg厄洛替尼(Erl0.5)、或(D)2mg/kg厄洛替尼(Erl2)的雄性大鼠的典型肝脏。

图2A是描绘雄性大鼠接受18周每周一次的腹腔注射50mg/kg的二乙基甲硝胺(DEN)以及在12周到18周期间只注射载体(n=16)、0.5mg/kg厄洛替尼(Erl0.5;n=8)、或2mg/kg厄洛替尼(Erl2;n=8)的Ishak分值的条形图。

图2B-2G为6组显示取自接受18周每周一次的腹腔注射二乙基甲硝胺(DEN)(50mg/kg)以及在12周到18周期间(E)只注射载体、(C and F)0.5mg/kg厄洛替尼(Erl0.5)、或(D and G)2mg/kg厄洛替尼(Erl2)大鼠的肝脏横截面典型的Masson染色图(B-D)和α-SMA染色图(E-G)。

图3A-3D显示厄洛替尼抑制大鼠纤维增生并且逆转DEN诱发的肝硬化。图3A为实验方案。雄性大白鼠接受18周每周一次的腹腔注射二乙基甲硝胺(DEN)(50mg/kg)。12周后，大鼠经受存活的肝切除术，而移除肝组织活检。然后在13-18周期间大鼠每天（5天/周）接受载体或厄洛替尼(2mg/kg)。一个星期DEN的处理后大鼠在19周的时候被处死。图3B是每只动物Masson染色的肝横截面Ishak分值的条形图。与载体比较**p<0.01。图3C为描绘接受载体或厄洛替尼大鼠中直径大于5mm的肿瘤结节数量的条形图。与载体比较**p<0.01。图3D是显示处死时表示成体重百分比的肝脏重量的条形图。

图4A、4B、和4C是3个条形图显示取自用PBS处理18周或DEN(50mg/kg)18周外加12-18周期间载体、0.5mg/kg厄洛替尼(Erl0.5)、或2mg/kg厄洛替尼(Erl2)的大鼠血清中(A)天冬氨酸转氨酶(AST)、(B)总胆红素(TBIL)、以及(C)总葡萄糖(Glu)水平。*,显著。

图5A是描绘接受18周每周一次的腹腔注射50mg/kg二乙基甲硝胺(DEN)以及12-18周期间仅载体(n=8)或18mg/kg拉帕替尼(n=8)大白鼠的肿瘤结节数量条形图。

图5B和5C为一组图像显示取自接受18周每周一次的腹腔注射二乙基甲硝胺(DEN)(50mg/kg)以及12-18周期间仅(B)载体或(C)18mg/kg拉帕替尼大鼠的典型肝脏。

图6A是描绘雄性大鼠接受18周每周一次的腹腔注射二乙基甲硝胺(DEN)(50mg/kg)以及在12周到18周期间只注射载体(n=8)或18mg/kg拉帕替尼(n=8)的Ishak分值的条形图。*,显著。

图6B-6E是4组显示取自接受18周每周一次的腹腔注射二乙基甲硝胺(DEN)(50mg/kg)以及在12周到18周期间(B和D)只注射载体或(C和E)18mg/kg拉帕替尼大鼠的肝脏横截面典型的Masson染色图(B-D)和α-SMA染色图(E-G)。

图7A,7B,和7C是3个条形图显示在用DEN(50mg/kg)处理18周外加12-18周期间载体或18mg/kg拉帕替尼的大鼠血清中(A)天冬氨酸转氨酶(AST)、(B)总胆红素(TBIL)、以及(C)总葡萄糖(Glu)水平。*,显著。

图8A为一组图片显示取自分别接受8周，12周或15周每周一次的腹腔注射二乙基甲硝胺(DEN)(50mg/kg)的大鼠典型肝脏。可见的肝硬化直到15周都不显著。

图8B是描绘接受18周每周一次的腹腔注射50mg/kg的二乙基甲硝胺(DEN)以及在8周、12周或15周开始仅注射载体(n=8)或2mg/kg吉非替尼(n=8)大鼠的Ishak分值的条形图。*,显著。

发明详述

肝纤维化是发生在大多数类型的慢性肝病中的细胞外基质蛋白质包括胶原蛋白的过度积累。晚期肝纤维化往往导致肝硬化、增高的肝细胞癌风险、以及需要肝移植。因此，对患有肝纤维化和前肝硬化患者在疾病进程中早期进行的治疗可以导致肝硬化严重程度的减轻和/或使纤维化或前肝硬化严重程度降低、演变的速度变缓，和/或减少肝细胞癌的风险，和/或提高肝功能和肝形态学指标。正如这里所证实的，患有肝纤维化或前肝硬化患者中，摄入有效治疗剂量的EGFR抑制剂导致肝病的减少。

肝纤维化及硬化

肝纤维化与过度旺盛的伤口愈合过程相关，此过程由于细胞外基质的过度产生和/或降解不足导致肝脏中过多的结缔组织积累。一般来说，纤维化过程由慢性伤害引起的，尤其是当炎症因素存在的情况下。肝纤维化自身通常是无症状的，但能导致门静脉血压过高（在这种情况下瘢痕扭曲了肝血流）或肝硬化（未能适当地取代被破坏的肝细胞导致肝功能不全），结果导致正常肝脏形态的大规模变形。肝硬化是以存在由密集纤维化组织包围的再生性结节为特征的。与肝硬化相关的症状可能好多年不显露并且往往是非特异的（例如，厌食，疲劳，体重减轻）。晚期的临床表现包括门静脉血压过高、腹水、以及发生代偿失调时的肝功能衰竭。肝纤维化或肝硬化的诊断可由肝活检确定。

EGF生物学

EGF首次获得分离于1962年(Cohen,J Biol Chem237:1555-62,1962)。EGF基因转录成通常所说的前EGF mRNA(Bell et al.,Nucleic Acids Res14:8427-46,1986)，再翻译成一个大的前体蛋白，被称为EGF前体糖基化后有170KDa(Marti et al.,Hepatology9:126-38,1989)。因此，EGF合成为一种非渗透的糖基化膜相关前体，而暴露在细胞表面。溶蛋白性裂解释放EGF前体在过程中被称为胞外域脱落(Le Gall et al.,J Biol Chem278:45255-68,2003)，并由解聚素金属蛋白酶(ADAM)家族的一种金属蛋白酶调节。EGF的胞外域脱落已被证实受ADAM10(Sahin et al.,J Cell Biol164:769-79,2004)和ADAM17(Chen et al.,Am JPhysiol Cell Physiol291:C946-56,2006)调节。存在于胞外间隙/流体的额外的蛋白酶会进一步裂解EGF前体。检测到的亚型的大小范围取决于来源，有6KDa结构的被称为成熟EGF。所有的亚型已报导有生物活性的，尽管较小的亚型以较大的亲和力结合EGF受体(EGFR)。一旦EGF结合EGFR，EGFR会经过从未激活单体到激活二聚体的转变。二聚体激活自身固有的胞内蛋白--酪氨酸激酶活性并且多个信号通路被激活，包括磷脂酰肌醇激酶(PI3K)/AKT，JAK激酶/信号转导分子和转录激活子以及多种促分裂原活化蛋白激酶(MAPKs)，包括胞外信号调节激酶(ERK)和c-jun氨基末端激酶(JNK)(Yarden and Sliwkowski,NatRev Mol Cell Biol2:127-37,2001;Yarden and Shilo,Cell131:1018,2007)。结合EGFR后，EGF被细胞内化。

EGF和癌症

自从被发现，EGF被证明有许多生物学功能，包括促进表皮和上皮细胞的增殖和分化(Carpenter and Cohen,Annu Rev Biochem48:193-216,1979;Fisherand Lakshmanan,Endocr Rev11:418-42,1990)。EGF在肿瘤发生中也有重要作用因为它提高化学致癌作用和病毒转化(Stoscheck and King,Cancer Res46:1030-7,1986)，人上皮和间质细胞衍生的肿瘤的体外生长也一样(Singletary et al.,CancerRes47:403-6,1987)。而且，EGFR(c-ErbB1,HER1)的过表达是肿瘤性转化中常见事件(Herbst and Shin,Cancer94:1593-611,2002)。为此，EFGR已经成为一个重要的化学疗法的标靶(Ciardiello and Tortora,Clin Cancer Res7:2958-70,2001;Mendelsohn and Baselga,J Clin Oncol21:2787-99,2003;Roskoski,BiochemBiophys Res Commun319:1-11,2004)。

EGF和肝脏

EGF是已知的培养基培养的成年(Blanc et al.,Gastroenterology102:1340-50,1992)和胚胎肝细胞(Hoffmann et al.,J Cell Physiol139:654-62,1989)的促细胞分裂素。在肝再生的早-早期诱导EGF转录(Mullhaupt et al.,J Biol Chem269:19667-70,1994)，并在肝细胞的增殖中起重要作用。在啮齿类动物中，EGF主要来源于唾液腺(Fisher and Lakshmanan,Endocr Rev11:418-42,1990)，切除这些腺体降低了血浆(Noguchi et al.,J Endocrinol128:425-31,1991)和血清(Yamamoto et al.,Virchows Arch425:79-82,1994)中EGF的水平。此外，颌下腺切除大鼠(Lambotte et al.,Hepatology25:607-12,1997;Jones et al.,Am J Physiol268:G872-8,1995)和小鼠(Noguchi et al.,J Endocrinol128:425-31,1991)在肝部分切除术后的肝再生损坏，但可有外加的EGF恢复到正常(Lambotte et al.,Hepatology25:607-12,1997;Jones et al.,Am J Physiol268:G872-8,1995;Noguchiet al.,J Endocrinol128:425-31,1991)。另外的研究表明颌下腺切除小鼠在对致癌物质3-甲基-二甲基氨基偶氮苯的应答产生较少的HCC结节(Yamamoto et al.,Virchows Arch425:79-82,1994)。因此，肝再生时EGF表达的增加可能对再生过程是有利的，但也导致癌症风险的增加。

EGF和HCC

肝脏中EGF的过表达在动物模型中诱发HCC。举例来说，Stern等构建了一种质粒来表达称为IgEGF的人类EGF的分泌形式(Stern et al.,Science235:321-4,1987)。当通过添加白蛋白启动子/增强子而使IgEGF在肝脏表达时，高水平表达所转基因的转基因小鼠产生HCC并且在7个月内死亡，然而低表达的小鼠在8-13个月内出现HCC(Tonjes et al.,Oncogene10:765-8,1995;Borlak etal.,Oncogene24:1809-19,2005)。该研究表明EGF水平和HCC风险之间存在剂量效应。

EGF表达和慢性肝病

慢性肝损伤引起纤维化或前肝硬化，最终导致肝硬化并且提高HCC的风险。肝脏EGF的合成是微不足道的；但是它的表达被报道在硬化肝脏中增加。(Komuves et al.,J Histochem Cytochem48:821-30,2000)。与此相一致，最近一报道表明在接受可能治愈性切除术的HCC患者中，EGF出现在一种与的复发和低存活相关的周边非肿瘤性肝组织中的一种基因表达图谱中(Hoshida et al.,N EnglJ Med359:1995-2004,2008)。慢性肝损伤引起内皮细胞、巨噬细胞(Kupffer细胞)以及肝星形细胞的局部集群而变得活跃并且分泌多种对周边肝细胞有刺激作用的细胞因子和生长因子到肝环境中(Bataller and Brenner,J Clin Invest115:209-18,2005)。

已知的EGFR靶向治疗

EGFR已显现出作为一种有前景的化学治疗标靶因为它在很多种类的癌症中过表达，并且在细胞生长和存活中起着重要的作用(Ciardiello and Tortora,Clin Cancer Res7:2958-70,2001)。多种以EGFR作为标靶的药物已经出现包括小分子酪氨酸激酶抑制剂，例如喹唑啉类，例如厄洛替尼（4-喹唑啉胺，N-(3-乙炔苯基)-6,7-二(2-甲氧基乙氧基)；商品名为

来自OSI制药)；吉非替尼（4-喹唑啉胺，N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-6-(3-(4-吗啉基)丙氧基)；商品名为

来自阿斯利康)；拉帕替尼(4-喹唑啉胺,N-(3-氯-4-((3-氟苯基)甲氧基)酚)-6-(5-(((2-(甲磺酰基)乙基)氨基)甲基)-2-呋喃基)；商品名为

来自葛兰素史克)；凡德他尼(4-喹唑啉胺,N-(4-溴-2-氟苯基)-6-甲氧基-7-((1-甲基-4-哌啶基)甲氧基);商品名为

来自阿斯利康);HKI-272(来那替尼,(2E)-N-(4-((3-氯-4-((吡啶-2-基)甲氧基)苯基)氨基)-3-氰基-7-乙氧基喹啉-6-基)-4-(二甲氨基)丁-2-稀酰胺,来自惠氏公司),BIBW2992(2-巴豆酰胺,N-(4-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-7-(((3S)-四氢化-3-呋喃基)氧基)-6-喹唑啉基)-4-(二甲基胺);商品名为

来自勃林格殷格翰公司),XL647(来自Exelixis)；和PF00299804(来自辉瑞制药);以及选择性结合EGFR的单克隆抗体，或抗体结合片段，例如，西妥昔单抗

帕尼单抗

扎鲁单抗(HuMax-EGFr,来自GenMab)，尼妥珠单抗(来自YM Biosciences),和马妥珠单抗(Merck Serono/Takeda)。(Mendelsohn and Baselga,J Clin Oncol21:2787-99,2003)。先前报道证明EGFR在HCC中过表达(Ito et al.,Br J Cancer84:1377-83,2001)。不幸的是，最近的临床试验中，厄洛替尼仅在少数晚期HCC患者中改善了疾病的控制(Philip et al.,JClin Oncol23:6657-63,2005;Thomas et al.,Cancer110:1059-67,2007)，并且在用西妥昔单抗治疗后未发现有应答(Zhu et al.,Cancer110:581-9,2007)。也见US2008/0166358。

HCC的厄洛替尼化学预防

考虑到缺乏成功的治疗HCC的可选方案，高危患者的化学预防已经被提议做为一种替代策略(Llovet et al.,Lancet362:1907-17,2003)。尽管EGFR抑制剂作为化疗不是很有效，但我们公布于此的数据表明它很可能成为一种良好的化学预防策略。二甲基亚硝胺(DEN)诱导的相继肝硬化和HCC的大鼠模型已经成为不仅能对研究慢性肝病的过程而且对检测化学预防药物的效果都有用的一种工具，因为它与人类的疾病进程较相似(Lee et al.,Korean J Hepatol13:70-80,2007;Schiffer et al.,Hepatology41:307-14,2005)。该模型中，DEN在12周后诱发肝硬化而大约18周后诱发HCC，可以允许充足的机会来进行预防性干预。使用该模型，当作为一种化学预防药物在12-18周期间摄入，厄洛替尼被证实可以降低肿瘤的形成(见以下实例1-2)。吉非替尼也有类似的效果(Schiffer et al.,Hepatology41:307-14,2005)。

厄洛替尼抑制纤维增生

如此所述，厄洛替尼在DEN诱导的大鼠模型中抑制纤维生成。而且，检测到降低的血清天冬氨酸转氨酶水平显示厄洛替尼还能降低肝毒性，检测到降低的血清胆红素水平和升高的血清葡萄糖水平显示厄洛替尼还能提高肝功能。作为一种理论，而不具有限制性，上述作用可能通过厄洛替尼预防肝星状细胞活化的功能得到解释。这与先前证明EGF可激活肝星状细胞的报道相一致(Yang et al.,Gastroenterology124:147-59,2003;Chang et al.,Hepatobiliary PancreatDis Int7:401-5,2008)。EGFR靶向治疗已经证实可以减少肺纤维化(Ishii et al.,Am J Respir Crit Care Med174:550-6,2006;Hardie et al.,Am J Physiol Lung CellMol Physiol294:L1217-25,2008)和肾纤维化(Francois et al.,FASEB J18:926-8,2004)。但是，这是首次报道EGFR靶向治疗可减少或抑制肝纤维化和前肝硬化。

接受治疗的患者

描述于此的方法的一个方面，可治疗的患者可以根据患有肝纤维化或前肝硬化，或者具有发生纤维化或前肝硬化风险来选择。许多类型的纤维化都可以治疗，包括肝纤维化、胰腺和肺的囊性纤维化、特发性肺纤维化、心内膜纤维化、纵膈纤维化、骨髓纤维化、腹膜后纤维化、进行性大块纤维化、注入性纤维化、以及肾源性系统纤维化。这里所用的“前肝硬化”指的是一种以不存在大结节性肝硬化为特征的肝硬化状况，例如发展为大结节性肝硬化之前的肝硬化阶段。

患有肝纤维化或前肝硬化或具有纤维化或前肝硬化风险的患者可以通过领域中技术人员基于包括一种或多种症状存在的全部证据诊断或确定。肝纤维化或前肝硬化的症状很多并为领域内技术人员所知，包括但不限于缩小的肝脏、肝痛黄疸、黄疸类似症状（例如黄皮肤，黄眼睛）、异常肝功能测试、腹痛、肾痛、肾衰竭、异常神经功能、胆结石、脱发、皮肤瘙痒、肌无力、食欲不振、体重减轻、门静脉血压高、手掌红肿、皮肤蜘蛛状静脉、围绕食管或胃的扩张的静脉（静脉曲张）、小睾丸(萎缩)、脾脏肿大、血小板不足、乳房肿大(男性乳房发育症)、以及唾液腺肿大。

肝纤维化和前肝硬化可以进一步通过以下方法诊断，例如活检、血清天冬氨酸转氨酶、胆红素、葡萄糖、透明质酸盐(Patel et al.,J Gastroenterol Hepatol18:253-257,2003)、III型前胶原N-肽(Guechot et al.,Clin Chem42:558-563,1996)、层粘连蛋白(Pilette et al.,J Hepatol28:439-446,1998)、IV型胶原蛋白(Castera et al.,J Hepatol32:412-418,2000)、基质金属蛋白酶(Murawaki et al.,JGastroenterol Hepatol14:138-145,1999)、金属蛋白酶组织抑制剂1(Boeker et al.,Clin Chim Acta316:71-81,2002)、转化生长因子β(Nelson et al.,J Viral Hepat4:29-35,1997)、YKL-40(Johansen et al.,J Hepatol32:911-920,2000)、凝血酶原指数(Oberti et al.,Gastroenterology113:1609-1616,1997)、γ-球蛋白、血小板计数(Pohl et al.,Am J Gastroenterol96:3142-3146,2001)、天冬氨酸转氨酶(AST)/丙氨酸转氨酶(ALT)比率(Imperiale et al,Am J Gastroenterol95:2328-2332,2000)，以及纤维化指数(Koda et al.,Hepatology45:297-306,2007)。影像学研究也可用于诊断纤维化或前肝硬化，例如肝的X-射线、核磁共振成像、CT扫描、或磁共振弹性成像。这种方法用于排除大结节性肝硬化的存在。“具有纤维化或前肝硬化风险”的患者是指有发生肝纤维化或前肝硬化倾向的人（例如，发生肝纤维化或前肝硬化的遗传易感性如涉及肝纤维增生基因中的一个突变，如IL-10,TNF-α,IL-4R,TGF-β1,AT-II,CTLA-4,或MMP-3(Friedman,Gastroenterology134:1655-16692008)），或有已经出现的导致肝纤维化或前肝硬化情况的人。因此，“具有纤维化或前肝硬化风险”的受试者可以是有嗜酒症、慢性B型肝炎、慢性C型肝炎、糖尿病、或肥胖症其中一种或多种的人。在某些实施方案中，用描述于此的方法治疗的受试者患有肝纤维化，但没有患上大结节性肝硬化或HCC。在某些实施方案中，用描述于此的方法治疗的受试者患有前肝硬化，但未患有大结节性肝硬化或HCC。

本方法对各种患者包括哺乳动物，例如人类及其他动物，实验动物例如小鼠、大鼠、兔子或猴子，或者驯化或家养的动物例如猫、狗、山羊、绵羊、猪、奶牛或马有效。

化合物的摄入

描述于此的有效抑制EGFR的化合物的全身给药可以是非经肠道的例如输液（如静脉注射）或注射（如腹膜内注射）、透粘膜的、或经皮肤的。对于透粘膜或透皮给药，可以在剂型中加入适合的渗透剂。这些渗透剂通常为领域内所知，包括，举例来说，对于透粘膜给药，洗涤剂、胆汁盐、和梭链孢酸衍生物。透粘膜给药可通过鼻腔喷雾或肛门塞药来实现。对于经皮给药，活性成分可以如领域内所知被制成软膏、药膏、凝胶或面霜。在某些实施方案中，化合物直接输送到肝脏，经肝总动脉、腹腔动脉、或门静脉输液。EGFR抑制剂也可口服给药。

化合物的剂量、毒性和疗效可以测定，例如通过已知的细胞培养或实验动物的药学过程，例如测定半数致死量LD50（群体中50%致死的剂量）和半数有效量ED50（在50%的群体中有疗效的剂量）。毒性和疗效之间的剂量比率为药物治疗指数，可以表示为LD50/ED50。首选展示出高的药物治疗指数的混合物。当使用有毒副作用的化合物时，须小心设计输送系统将该化合物投放到受影响的组织以将对未感染细胞的潜在损伤最小化，因此减少毒副作用。

从细胞培养和动物研究中获得的数据可以用来制定用于人的剂量范围。此类化合物的剂量最好在几乎没有毒性的ED50血液循环浓度的范围内。剂量可能在范围内变化取决于使用的剂型和采用的给药途径。对于本发明方法中所使用的任一化合物，有疗效的剂量最先可通过细胞培养法估计。剂量可以在动物模型中制定以获得包括如细胞培养中测得的IC50（也就是说，达到症状的半数最大抑制的测试化合物的浓度）的循环血浆浓度范围。该信息可用于更精确地测定人类的有效剂量。血浆中的水平也可测得，举个例子，通过高效液相色谱法。

“有效剂量”是指能足够产生有效或预期结果的剂量。举例来说，治疗剂量是达到预期治疗效果，即纤维化或前肝硬化降低的剂量。该值可以与有效预防剂量即预防疾病发作或疾病病症发生的剂量一致或不同。有效剂量可以通过一次或多次摄入、应用或剂量。组合物的有效治疗剂量取决于组合物的选择。组合物的给药可以从每天一次或多次到每周一次或多次；包括每隔天一次。熟练的技术人员将会了解某些因素会影响有效治疗患者的剂量和时间，包括但不限于疾病或紊乱的严重程度、以往的治疗、患者的健康状况和/或年龄、以及其它并发的疾病。而且，患者用有效治疗剂量的描述于此的组合物治疗患者可以包括一次性治疗或一系列治疗。

以下为本发明的实施例。

实施例

本发明于下文实例中进一步描述，但不限制权利要求中描述的范围。

例1：厄洛替尼减少纤维生成并抑制肝星状细胞活化

厄洛替尼是一种用于治疗非小细胞肺癌和胰腺癌的药物。厄洛替尼特异地将在各种癌症中高表达的并且偶发突变的EGFR作为靶标(Raymond et al.,Drugs60Suppl1:15-23,2000)，结合受体的三磷酸腺苷(ATP)结合位点。为了研究厄洛替尼作为一种肝纤维生成化学预防策略，给予雄性Wistar大鼠每周一次的腹腔内注射50mg/kg DEN以诱发肝硬化和HCC(Lee et al.,Korean J Hepatol13:70-80,2007)。厄洛替尼在12-18周期间每天(5X每周)以2mg/kg的剂量通过腹腔内注射给药，相当于人的化学疗法给药方案。厄洛替尼在这条件下显著减少75%的肿瘤发生(图.1A)。在另一独立的研究中，厄洛替尼剂量降低到0.5mg/kg。在这第二个研究中，厄洛替尼被证实能抑制49%的肿瘤发生(图.1A)。

用厄洛替尼处理的来自DEN诱导大鼠的肝脏(图.1C和1D)与载体对照相比不仅表现出较少的肿瘤，而且表现出较少的硬化(图.5B)。肝脏的重复损伤引起肝细胞损伤并且激活称为Kupffer细胞的现存巨噬细胞。损伤的肝细胞和活化的Kupffer细胞分泌细胞因子和生长因子到肝环境，来激活肝星状细胞(Friedman,Gastroenterology134:1655-69,2008)。正常情况下，肝星状细胞是休眠的并储存维生素A和脂肪。激活后，它们分化成肌成纤维细胞表型并表达α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)(Friedman,Gastroenterology134:1655-69,2008)。活化的肝星状细胞沉积纤维状胶原到狄氏腔快速引起纤维化并慢性诱发肝硬化。肝病程度（肝纤维化和肝硬化）在病理上通过Ishak方法的胶原三色染色法评估(Mod Pathol7:690-713,1994)。

在肝纤维化的早期，胶原沉积定位在汇管区四周(Ishak分值1或2)，但在纤维化的后期将汇管区连接起来(Ishak分值3或4)并且最终在肝硬化过程中形成围绕再生肝细胞的结节(Ishak分值5或6)。虽然在该模型中存在一些异质性，腹膜内注射DEN在8周后引起Ishak分值为0.8(范围0-2)的纤维化，12周后引起Ishak分值为4.1(范围3–6)的纤维化/肝硬化，以及Ishak分值为5.1(范围4–6)的肝硬化。与此一致，通过α-SMA染色评估DEN给药后肝星状细胞的活化随时间增加。

值得注意的是，厄洛替尼抑制纤维生成。接受2mg/kg厄洛替尼的大鼠显著回归到一个平均的纤维化Ishak分值2.6，而接受载体溶液的大鼠平均纤维化/肝硬化Ishak分值为4.9的大鼠(图2A)。接受0.5mg/kg厄洛替尼的大鼠也有一个较低的纤维化/肝硬化Ishak分值4.3。16只载体处理的对照动物的范围是2-6，其中分值为6的如图2B所示。相比之下，0.5mg/kg厄洛替尼处理得分值范围为3-6，其中分值为4的如图2C所示，2mg/kg厄洛替尼处理的分值范围为1-4，其中分值为2的如图2D所示。为进一步检测厄洛替尼对肝纤维化的作用，对活化的肝星状细胞进行α-SMA染色。相比于载体空白对照，厄洛替尼剂量依赖性地显著降低肝星状细胞的活化(图2E-G)。

例2：在13-18周之间接受作为预防性药物的厄洛替尼的DEN处理大鼠降低了纤维化和肝硬化水平。

有趣的是，厄洛替尼可以逆转DEN处理大鼠的纤维化和肝硬化。为进一步检测厄洛替尼逆转纤维化和肝硬化的能力，在DEN处理大鼠接受厄洛替尼之前和之后对其进行肝活检(图3A)以在同一动物中确定病程进展。与例1描述的研究相似，厄洛替尼处理的大鼠有显著减少的纤维化和肝硬化(图3B)而且肿瘤生成显著降低(图3C)，与所观察的肝重减轻相一致(图3D)。而且，8只动物中有2只厄洛替尼逆转了疾病发展(表1)。

表1.16只DEN处理大鼠的Ishak分值，8只只接受载体，剩下8只在第13-18周用厄洛替尼处理。

载体对照

	13周Ishak积分	19周Ishak积分	变化
				DEN 123	2	5	+3
DEN 129	4	6	+2
				DEN 130	5	6	+1
DEN 131	4	6	+2
				DEN 132	2	5	+3
DEN 133	3	6	+3
				DEN 134	5	6	+1
DEN 135	4	6	+2
				平均值	3.6	5.8	+2.2

埃罗替尼

	13周Ishak积分	19周Ishak积分	变化
				DEN 122	3	6	+3
DEN 125	3	5	+2
				DEN 126	2	4	+2
DEN 127	5	3	-2
				DEN 136	5	4	-1
DEN 137	2	3	+1
				DEN 138	3	4	+1
DEN 139	3	5	+2
				平均值	3.3	4.3＊	+1

例3：厄洛替尼减少肝毒性并提高肝功能

纤维化过程中，肝星形细胞被激活并沉积胶原在狄氏腔中，即肝细胞和包含血浆的血窦之间的区域。胶原的沉积抑制在肝细胞和血浆之间营养素和废料的正常交换而导致肝毒性和肝衰竭。肝毒性和衰竭程度可通过测定几种存在于血清的蛋白或糖类来评估。举例来说，天冬氨酸转氨酶(AST)是一种存在于肝细胞、当肝细胞死亡时释放到血清的酶。胆红素(TBIL)是血红素的分解产物，如果肝细胞不能适当地代谢，则它在血清中的水平升高。最后，肝功能衰竭会导致葡萄糖(Glu)产物水平降低引起血清Glu水平降低。

检测经厄洛替尼处理的大鼠血清中的AST、TBIL、和Glu水平。雄性Wistar大鼠(n=4)用PBS处理18周，或者每周一次腹腔内注射50mg/kg DEN处理18周并同时在第12-18周间附加载体、或0.5mg/kg的厄洛替尼(Erl0.5)、或2mg/kg厄洛替尼(Erl2)。分离出大鼠全血并在室温下两小时允许凝结成块。然后2,000rpm离心10分钟分离出血清(上层)。对大鼠血清进行肝功能检测。在当前模型中，通过该3种标记评估腹膜内注射DEN会导致肝毒性和肝衰竭随时间增加。然而，比较载体空白对照，厄洛替尼剂量依赖性地降低了肝毒性和肝衰竭程度。特别是，厄洛替尼降低了血清中AST和TBIL水平以及提高血清Glu水平(图4A-C)。

例4：拉帕替尼减少纤维生成并抑制肝星状细胞活化。

为研究拉帕替尼作为一种肝纤维化的化学预防策略，给雄性Wistar大鼠每周一次腹腔注射50mg/kg的DEN以诱发肝硬化和HCC(Lee et al.,Korean JHepatol13:70-80,2007)。在第12-18周期间，以18mg/kg的剂量每天通过腹腔注射拉帕替尼给药（每周5X）。拉帕替尼在此条件下显著减少大于50%的肿瘤形成(图5A)。用拉帕替尼处理的经DEN诱导大鼠的肝脏(图5C)与载体空白对照相比不仅表现出较少的肿瘤，而且表现出较少的硬化(图5B)。

与厄洛替尼相似，拉帕替尼也抑制纤维生成。接受18mg/kg拉帕替尼治疗的大鼠显著回归到平均纤维化Ishak分值4.3，而接受载体溶液的大鼠平均纤维化/肝硬化Ishak分值为5.6(图6A)，这一点如取自接受18周每周一次的腹腔注射二乙基甲硝胺(DEN)(50mg/kg)以及第12-18周期间仅载体(图6B)或18mg/kg拉帕替尼(图6C)大鼠的Masson’s三染色的肝横截面所示。

例5：拉帕替尼降低肝毒性并提高肝功能

检测经拉帕替尼处理的大鼠血清中的AST、TBIL、和Glu水平。雄性

Wistar大鼠(n=4)用PBS处理18周，或者18周每周一次腹腔内注射50mg/kgDEN并在第12-18周附加载体或18mg/kg的拉帕替尼。抽取大鼠全血并在室温下两小时允许凝结成块。然后2,000rpm离心10分钟分离出血清(上层)。对大鼠血清进行肝功能检测。在当前模型中，通过该检测3种标记显示腹膜内注射DEN会导致肝毒性和肝衰竭随时间增加。然而，与载体空白对照相比较，拉帕替尼减少了肝毒性和肝衰竭程度。特别是，拉帕替尼降低了血清中AST和TBIL水平并提高了血清Glu水平(图7A-C)。

例6：雄性Wistar大鼠接受16周每周一次的DEN(50mg/kg)腹腔内注射。大鼠从第8、12、或15周开始每天接受载体对照或吉非替尼(2mg/kg)持续到18周。为了评价每次治疗开始时肝病的程度，一亚组大鼠在两周的清除DEN处理后被处死，割取并处理肝脏以便分析。每只动物Masson染色的肝横截面由（对大鼠处理用药与否不知情的）病理医生进行分析。DEN给药8周和12周后，在肝脏表面未观察到肉眼可见异常(图8A)。但是，显微检查显示大鼠在8周时患有早期肝纤维化，而在12周发展成为晚期纤维化/早期肝硬化。DEN给药15周后，大白鼠发展为在肝脏表面不但显微镜下可见而且肉眼可见(图8A)的晚期肝硬化。接受载体或吉非替尼的大鼠经过两个星期的清除DEN处理后于18周时处死。割取并处理肝脏以便分析。每只动物Masson染色的肝横截面有（对大鼠处理用药与否不知情的）病理医生通过Ishak方法评估。当吉非替尼在第8或12周开始给药，但非第15周开始给药，能抑制肝纤维化/前肝硬化的发展(图8B)。这些数据表明吉非替尼对肝病进展的疗效只发生在肝纤维化和前肝硬化期间。一旦病变进展到晚期肝硬化，例如肉眼可见肝硬化，就不能再被阻止。

例7：为了研究厄洛替尼做为一种肝纤维生成的治疗和预防策略，给大鼠每周腹腔注射50mg/kg的DEN以诱导肝硬化和HCC(Lee et al.,Korean JHepatol13:70-80,2007)。在第6-12、12-18、或10-12周期间，通过腹腔注射每天给予厄洛替尼（每周5X），其给药剂量或者以等同于人的化疗方案的2mg/kg或者是如上所述在12-18周期间给药能够抑制49%肿瘤形成的0.5mg/kg剂量。

肝功能测试如上述例3进行以评估肝毒性和肝衰竭。此外，进行组织学检查以评估纤维发生。结果用以解释用厄洛替尼治疗的动物中降低纤维生成。

其他实施方案

应该了解虽然本发明在它的详细说明书中已经做了描述，但前述说明目的是说明而不是限制由所附权利要求范围定义的本发明的范围。另有其它方面、优势、以及修饰在以下权利要求范围之内。

Claims (17)

1.降低患者纤维化或前肝硬化的方法，该方法包括：

选择患有或带有发生纤维化或前肝硬化风险的患者；

给予患者有效治疗剂量的表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂；并且

检测患者体内EGFR抑制剂对纤维化和前肝硬化的影响，从而降低患者的纤维化或前肝硬化。

2.权利要求1所述方法，其中所述选择患者包括检测肝纤维化或前肝硬化的存在。

3.权利要求2所述方法，其中所述检测肝纤维化的存在包括进行选自于一组包括肝活检、验血、肝放射显影中的一种或多种测试，并且其中所述测试的结果显示患者患有纤维化，但无大结节性肝硬化或肝细胞癌。

4.权利要求2所述方法，其中所述检测前肝硬化的存在包括进行选自于一组包括肝活检、验血、肝放射显影中的一种或多种测试，并且其中所述测试的结果显示患者患有前肝硬化，但无大结节性肝硬化或肝细胞癌。

5.权利要求3所述方法，其中所述验血检查用来评估肝功能包括检测天冬氨酸转氨酶、丙氨酸转氨酶、胆红素、葡萄糖或透明质酸中的一种或多种的水平。

6.权利要求4所述方法，其中所述验血检查用来评估肝功能包括检测天冬氨酸转氨酶、丙氨酸转氨酶、胆红素、葡萄糖或透明质酸中的一种或多种的水平。

7.权利要求1所述方法，其中所述EGFR抑制剂抑制EGFR信号传递。

8.权利要求1所述方法，其中所述EGFR抑制剂是一种酪氨酸激酶抑制剂。

9.权利要求8所述方法，其中所述酪氨酸激酶抑制剂抑制EGFR信号传递。

10.权利要求7所述方法，其中所述EGFR抑制剂是一种喹唑啉。

11.权利要求1所述方法，其中所述EGFR抑制剂是厄洛替尼。

12.权利要求7所述方法，其中所述EGFR抑制剂是一种选择性结合EGFR的单克隆抗体或其抗原结合片段。

13.权利要求1所述方法，其中所述EGFR抑制剂是口服、静脉、或通过注射给药的。

14.权利要求1所述方法，其中所述EGFR给药量为每公斤体重0.1到3.0毫克。

15.权利要求14所述方法，其中所述EGFR给药量为大约每公斤体重0.5毫克。

16.权利要求1所述方法，其中所述患者为哺乳动物。

17.权利要求1所述方法，其中所述患者为人。

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