CN106148371A - 人β‑防御素3基因果蝇生殖系统特异表达载体的制备方法 - Google Patents

人β‑防御素3基因果蝇生殖系统特异表达载体的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了人β‑防御素3基因果蝇生殖系统特异表达载体的制备方法，通过构建重组载体NosP‑attB，人β‑防御素3基因片段的制备及扩增，然后将人β‑防御素3基因片段插入到pet28a载体中，制备pet28a‑hBD‑3重组载体；再以pet28a‑hBD‑3重组质粒为模板，PCR扩增His‑hBD‑3片段；将His‑hBD‑3片段插入到NosP‑attB质粒中，制备果蝇生殖系统表达载体NosP‑attB‑His‑hBD3。该载体可以在果蝇生殖系统内特异高效表达，为下一步利用果蝇生殖系统大量表达人防御素3蛋白奠定基础，该方法的公开填补了目前尚无人β‑防御素3昆虫表达载体构建方法的空白。

Description

人β-防御素3基因果蝇生殖系统特异表达载体的制备方法
技术领域
本发明涉及人β-防御素3基因果蝇生殖系统特异表达载体的制备方法。具体涉及过渡载体NosP-attB的制备方法，以及利用此载体构建人β-防御素3基因果蝇生殖系统特异表达载体的方法。
背景技术
防御素是近年来发现的一类内源性小分子多肽，具有高效、广谱的抗菌作用，对革兰氏阳性、阴性细菌、真菌、包膜病毒及某些寄生虫等具有较强的杀伤作用。迄今为止共发现五类:α-防御素、β-防御素、θ-防御素、植物防御素和昆虫防御素。
人类防御素包括α-防御素、β-防御素。人β-防御素3在人体皮肤细胞和黏膜组织中广泛表达，其分子结构稳定，具有促进皮肤伤口愈合、参与呼吸道免疫防御反应及维持人体肠道菌落平衡等多方面功能。此外，β-防御素还可以作为趋化因子连接先天性免疫和获得性免疫应答，在人体多种疾病中发挥重要作用。
人β-防御素3(humanβ-defensin-3，hBD-3)是2001年Harder等在银屑病患者皮损组织中发现的防御素家族抑菌活性最高的肽。hBD-3由67个氨基酸组成，蛋白分子质量为5154.59u，6个保守的半胱氨酸形成的二硫键连接顺序为1-5，2-4，3-6。与hBD-1和hBD-2的成熟肽蛋白序列比较，hBD-3含有13个Arg(精氨酸)和Lys(赖氨酸)，比前两者分别多6个和7个带正电荷的氨基酸，因此hBD-3的电荷密度大约是hBD-1和hBD-2的3倍与2倍，这对于hBD-3的抗菌活性可能有很大的提高。相对于hBD-1和hBD-2，hBD-3显示出更广的抗菌谱，对革兰阴性和阳性菌均有抗菌活性；而且，抑菌所需浓度远低于其它的人β防御素。对多重耐药菌，hBD-3也显示出强有力的抗性。更重要的是，其抗菌活性受盐离子浓度影响相对较小，对宿主细胞的毒性很低。这些特点使其有望成为一种新型肽类抗菌素。
国内外学者利用基因工程技术对人β-防御素3进行了广泛的研究，包括基因的获得、表达载体的构建以及用融合表达策略使人β-防御素3在大肠杆菌内高效表达。
在原核生物中，李春丽等根据已知人β-防御素3的成熟区氨基酸序列和酵母密码子的偏好，人工合成人β-防御素3基因，并成功构建表达载体pPIC9K-hBD3(河南农业大学报，2005，39(3)：282-285)。黄蓬亮等根据大肠杆菌对精氨酸密码子使用偏好合成了人β-防御素3基因序列，在大肠杆菌中诱导表达成功(生命科学研究，2005，9(2)：129-133)。何国庆等嵌合人β-防御素3与植物甜蛋白基因，在大肠杆菌中成功诱导表达(农业生物技术学报，2005，13(2))。陈姗、何凤田等提取中国人扁桃体组织总RNA，以RT-PCR技术扩增编码hBD3成熟肽的cDNA，构建了原核表达载体pQE-80L-DHFR-hBD3，在细菌中进行了表达(生物工程学报，2004，20(4)：490-495)。
在真核生物中，庹晓晔、柴家科等将人β-防御素3与细菌膜穿透增加蛋白(BPI)基因融合在一起，采用毕赤酵母系统进行了表达(全国烧伤外科学年会.2007:648-650)。同时，庹晓晔、柴家科等还采用脂质体转染法将pcDNA3-hBD3重组载体导入COS-7真核细胞，对hBD3进行表达(军事医学,2004,28(4):344-346)。吴晖、陈艺等将人hBD-3基因转入酿酒酵母中进行表达，提取纯化蛋白，并对其抗菌活性进行研究(现代食品科技,2012(9):1123-1127)。暴元元、赵青君以巴西甜蛋白为融合表达伴侣，通过一段连接子(含凝血酶切割位点)将hBD3和巴西甜蛋白连接起来，并在酵母细胞中转化成功(河南农业大学学报,2013,47(1):77-82)。
目前现有技术生产人β-防御素3蛋白存在以下问题：其一，化学合成法成本高，价格昂贵；其二，基因工程菌中表达的防御素蛋白对宿主具有毒性，宿主生长受限制，影响人β-防御素3蛋白的大量生产；其三，从基因工程菌中纯化的防御素蛋白带有少量细菌毒蛋白，影响其应用。其四，大肠杆菌等原核表达体系表达的防御素常无生物活性。其五，酵母菌生产人β-防御素3蛋白也存在工艺复杂，成本较高的特点。
1993年Brand和Perrimon构建了最初的转基因UAST载体(development，1993，118(2)：401-415)，其后，2007年Bischof等人继续对UAST载体进行改造，将细菌-噬菌体的attP-attB系统引入到果蝇体系。通过转基因手段，首先在果蝇基因组上插入attP序列，然后在随机插入型的转基因载体UAST上添加了attB序列，得到了pUAST-attB定点插入型转基因载体(Proceedings of the National Academy of Sciences，2007，104(9)：3312-3317)，大大地缩短了转基因果蝇的制备时间。
发明内容
针对这些不足，本发明提供了人β-防御素3基因果蝇生殖系表达载体的构建方法，以填补目前尚无人β-防御素3昆虫表达载体构建方法的空白。该载体可以在果蝇生殖系统内特异高效表达，为下一步利用果蝇生殖系统大量表达人防御素3蛋白奠定基础。
本发明还提供了重组载体NosP-attB的制备方法。
本发明采取的技术方案为：
重组载体NosP-attB的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(a)以NosP-ote载体为模板，P1、P2为特异性引物，PCR扩增Nos基因启动子的序列；所述引物P1、P2的序列如下：
P1：5’-tttcctgcagggaattcctcgagaccggtcgaccgttttaacctcgaaatatgcac-3’；下划线字母表示Sbf1酶切位点；
P2：5’-aaatctagagcggccgctggtaccggcgcgccgtaactaaactcgcttttgggttaa-3’；下划线字母表示Xba1酶切位点。
(b)将步骤(a)得到的PCR产物和pUAST-attB质粒载体分别使用sbf1与xba1双酶切，载体加入CIAP，37℃孵育30分钟，去除DNA末端的5’磷酸根基团，以降低载体的自连接背景，再用T4DNA连接酶将目的片段与UAST-attB载体连接，最后经转化、鉴定后得到重组载体NosP-attB。
一种人β-防御素3基因果蝇生殖系统特异表达载体的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)采用上述制备方法制备得到重组载体NosP-attB；
(2)人β-防御素3基因的制备与扩增；
(3)将人β-防御素3基因片段插入到pet28a载体中，制备pet28a-hBD-3重组载体；
(4)以步骤(3)得到的pet28a-hBD-3重组质粒为模板，PCR扩增His-hBD-3片段；
(5)将步骤(4)得到的His-hBD-3片段插入到NosP-attB质粒中，制备果蝇生殖系统表达载体NosP-attB-His-hBD3。
所述步骤(2)具体包括：
将四条特异性引物P3，P4，P5和P6经PCR扩增，且在P3和P6中分别引入限制性酶切位点，所述四条特异性引物如下：
P3：5’-aaaGGATCCggaatcataaacacattacagaaatattattgcCGTgtcCGTgg-3’，下划线字母表示BamH1酶切位点；
P4：5’-ctttggaaggcagctgagcacagcacaAcggccgccACGgacACGgcaataa-3’；
P5：5’-ctcagctgccttccaaaggaggaacagatcggcaagtgctcgacgcgtggcc-3’；
P6：5’-tttAAGCTTTTAtttcttACGAcggcagcatttAcggccacgcgtcgagcact-3’，下划线字母表示Hind III酶切位点。P3、P6引物中也可引入其它限制性内切酶位点，如P3引物中的BamH1酶切位点可替换为EcoR1酶切位点；P6引物中的Hind III酶切位点可替换为Xho1酶切位点。
所述人β-防御素3基因片段的核苷酸序列如右：ggaatcataaacacattacagaaatattattgcCGTgtcCGTggcggccgTtgtgctgtgctcagctgccttccaaaggaggaacagatcggcaagtgctcgacgcgtggccgTaaatgctgccgTCGTaagaaaTAA。此基因片段与GenBank中注册的人β-防御素3基因(GenBank登录号为NM018661)序列相比，对少部分核苷酸进行了改造，具体参见图11，经改进后的人β-防御素3基因片段，其表达水平将有所提高。由于人的基因组模板难以获得，故将138bp的hBD-3基因分为四部分，设计出四条引物(即P3，P4，P5，P6)，每条引物大约50bp左右，利用引物搭桥的方法，将四种引物混合后进行PCR扩增10个循环，获得大量的人hBD-3基因。
选取这一片段构建果蝇生殖系统特异表达载体的原因在于：GenBank中注册的人β-防御素3基因的长度为138个核苷酸，包括编码45个氨基酸的肽段、1个终止密码子TAA。此45个氨基酸肽段即人β防御素3基因的成熟肽序列：“G I I N T L Q K Y Y C R V R G G RC A V L S C L P K E E Q I G K C S T R G R K C C R R K K”(参见文献Journal ofBiological Chemistry，2001，276(8)：5707-13)，此成熟肽具有很强的抗菌功能。
所述步骤(3)具体包括：用限制性内切酶BamH1和Hind III双酶切人β-防御素3基因片段和pet28a载体，将人β-防御素3基因片段插入到pet28a载体的BamH1和Hind III之间。此步骤中也可使用其它限制性内切酶进行双酶切，如EcoR1与Xho1。为了把hBD-3带上His标签，除了可以把hBD-3基因插入到pet28a载体上，插入到其它原核表达载体上也可以实现，如pRSETB质粒载体。
所述步骤(3)还包括pet28a载体酶切后加入CIAP，37℃孵育30分钟，去除DNA末端的5’磷酸根基团，以降低载体的自连接背景，再用T4DNA连接酶将目的片段与pet28a载体连接，将人hBD-3基因插入到pet28a载体的BamH1和Hind III之间。最后经转化、鉴定后得到重组载体pet28a-hBD-3。
所述步骤(4)具体包括：以步骤(3)得到的pet28a-hBD-3重组质粒为模板，P7，P8为特异性引物，PCR扩增His-hBD-3片段，所述P7，P8特异性引物如下：
P7：5’-AAAggtaccATGGGCAGCAGCCATC-3’，下划线字母表示Kpn1酶切位点；
P8：5’-TTTgcggccgcTTAtttcttACGAcggcagc-3’，下划线字母表示Not1酶切位点；
在PCR扩增His-hBD-3片段时，除了选择Kpn1和Not1作为酶切位点，还可以将P7引物中的Kpn1换成Asc1酶切位点，也能实现本发明。
所述步骤(5)具体包括：将步骤(4)扩增得到的His-hBD-3片段和步骤(1)构建的NosP-attB质粒用限制性内切酶Kpn1和Not1双酶切，再用T4连接酶将His-hBD-3片段与NosP-attB质粒连接起来。
所述步骤(5)还包括：将连接产物导入到大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞中，在含有氨苄抗性的固体培养基上过夜培养，挑选阳性克隆，经鉴定后即可得到NosP-attB-His-hBD-3果蝇生殖系统特异性表达载体。
与已有的人hBD-3转基因载体相比，本发明有着以下优点：
(1)目前，人hBD-3转基因大多为细菌、酵母等单细胞生物表达载体，尚无人hBD-3基因动物体内表达载体构建方法的报道；
(2)此项发明，构建了一种昆虫体内表达载体，利用果蝇生活周期短，排卵量大，易于收获等特点，为该种蛋白的大量表达提供条件；
(3)此载体上带有果蝇生殖系统特异高效表达的启动子，可直接从其卵中收获抗菌肽蛋白。
附图说明
图1为PCR扩增Nos基因的启动子序列。泳道M为2Kb DNA Marker，泳道1为在紫外光下可见796bp的目的条带，与理论符合；
图2为重组质粒NosP-attB的PCR鉴定。泳道M为2Kb DNA Marker，泳道1,3,4,5,6为在紫外光下可见796bp的目的条带,表明为阳性转化子，泳道“+”为阳性对照，泳道“─”为阴性对照；
图3为重组质粒NosP-attB用限制性内切酶sbf1与xba1的双酶切鉴定。泳道M为2KbDNA Marker，泳道1-4均为阳性转化子酶切条带：
图4为PCR扩增hBD-3基因。泳道M为2Kb DNA Marker，泳道1为在紫外光下可见138bp目的条带，与理论符合；
图5为重组质粒pet28a-hBD-3的PCR鉴定。泳道M为2Kb DNA Marker，泳道1-15均为阳性转化子，泳道“+”为阳性对照，泳道“─”为阴性对照；
图6为重组质粒pet28a-hBD-3的BamH1和Hind III的双酶切鉴定，泳道M为15KbDNA Marker，泳道1-3均为阳性转化子酶切条带；
图7为His-hBD-3片段的扩增。泳道M为2Kb DNA Marker，泳道1为在紫外光下可见约250bp左右的目的条带，与理论符合；
图8为重组质粒NosP-attB-His-hBD-3的PCR鉴定。泳道M为2Kb DNA Marker，泳道3，5分别为阳性转化子，泳道“+”为阳性对照，泳道“─”为阴性对照；
图9为重组质粒NosP-attB-His-hBD-3的Knp1和Not1的双酶切鉴定。泳道M为15KbDNA Marker，泳道1-2均为阳性转化子的酶切条带；
图10为载体NosP-attB-His-hBD-3的图谱；
图11为人hBD-3基因成熟肽改造前后的基因序列对比。
具体实施方式
本发明中所涉及的载体、试剂、材料、引物的来源如下：
NosP-ote质粒由中科院动物研究所干细胞与生殖生物学国家重点实验室惠赠；
pUAST-attB质粒由东南大学生命科学研究院惠赠；
受体菌DH5ɑ、质粒pet28a、pRSETB质粒均购自北京普如汀生物技术有限公司；
碱性磷酸水解酶CIAP、T4DNA连接酶、限制性内切酶sbf1、xba1、BamH1、Hind III、Kpn1、Not1、EcoR、Xho1和Asc1均购自TaKaRa公司；
限制性内切酶sbf1购自基赛生物有限公司；
引物9条(P1-P9)由上海生工生物工程有限公司合成与纯化。
实施例1
1.1NosP-attB载体的构建
根据果蝇数据库(http://www.flybase.org)中Nos基因(编号CG5637)序列，设计了一对引物(见下方)。然后以NosP-ote质粒载体为模板，采用PCR技术，扩增Nos基因启动子的片段。扩增条件如下：95℃变性3min进入循环，95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸30s，30个循环后72℃继续延伸5min，电泳检测如图1所示。
P1：5’-tttcctgcagggaattcctcgagaccggtcgaccgttttaacctcgaaatatgcac-3’。下划线字母表示Sbf1酶切位点；
P2：5’-aaatctagagcggccgctggtaccggcgcgccgtaactaaactcgcttttgggttaa-3’。下划线字母表示Xba1酶切位点。
将上述PCR产物和pUAST-attB载体质粒用sbf1与xba1双酶切，37℃酶切1h，载体加入CIAP，37℃孵育30分钟，去除DNA末端的5’磷酸根基团，再用T4DNA连接酶将目的片段与UAST-attB载体连接，16℃过夜。然后，将连接产物转化进DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆摇菌12小时，菌液PCR，如图2所示，图中1、3、4、5、6均为阳性克隆。
然后小提质粒并经sbf1与xba1双酶切鉴定，在紫外光下可见重组载体释放出796bp的目的条带，如图3所示，泳道M为2Kb bp DNA Marker，泳道1，2，3，4分别为挑取的4个阳性克隆质粒的双酶切结果。再挑取阳性转化子进行测序，结果表明，Nos基因796bp长度的启动子序列正确。序列如下：
“CGACCGTTTTAACCTCGAAATATGCACATGTAAGGACGGATGTGAGCGAACGCCAGTGATGACCGGGATCAGAGGTAACCTACCATGGTGGGGATTAGGTGACCGTTCGCAGGTAGTTTGATCGGAGCGAATGTTCGGGGGGTCTGGCGTCAGAGGCTCTAAACTTTATGTAATTCCTGCCGCGAAACACGCACGTATCAAGCAGTCAGCTGTTCTCTTCGTTCAGCGCGCGCCGGTGTTGCAAAACGAGCGCTCTTCGCCGGCGGTGGCTCGTGCGATAGTTCGTTTTGTCGGTAATCCGATGTTGCCGCGCCGATATCATGTGATGTTGTCACAGTGCGCGAAATTCGAATGGTGGTGTGCAGTGATTGTGTTGTGACGGCGAGTGGCGCGTGTGGGTGCTTAGTTTTGGGAGATGTTTTCGTATTTTTTTGTTGATAACTCAGGCTTTGTTGCTGTGTTGTAGTACTATTTTCCATTGCGCGGTGTCCAGCTTTTAATTAGTGGCACATATTCTTAGCAAGTAAAAATTATTTTGCATACTATTAAATTTCTTATAAATTATTTTCTAAAATTAAGTTTACCTTTTCAATTTTACTAAAAATATCGATATATTTATTATCGCTGGAAAACTACATTATTCCACCTCTAAGCAAGAACCGTTAGTTGGCGCGTAGCTTTACCACAAAATTCCTGGAATTGCCGTACGCTTCGCAGTTGTTTCAAGTTGTCTAAGGGACATACGATTTTTTTTGCCCCTGCGTCACGATTTTAACCCAAAAGCGAGTTTAGTTAC”。
1.2人hBD-3基因的改造与扩增
本着不改变氨基酸序列的原则，对人hBD-3基因成熟肽138个核苷酸的编码序列进行了改造，以提高其表达水平。序列改造如下：
人hBD-3基因成熟肽改造前序列：
“ggaatcataaacacattacagaaatattattgcagagtcagaggcggccggtgtgctgtgctcagctgccttccaaaggaggaacagatcggcaagtgctcgacgcgtggccgaaaatgctgccgaagaaagaaataa”
人hBD-3基因成熟肽改造后序列：
“ggaatcataaacacattacagaaatattattgcCGTgtcCGTggcggccgTtgtgctgtgctcagctgccttccaaaggaggaacagatcggcaagtgctcgacgcgtggccgTaaatgctgccgTCGTaagaaataa”
设计合成2对特异性的搭桥引物(即P3，P4，P5，P6见下方)，且在P3和P6引物的5’端分别引入限制性酶切位点BamH1和Hind III。
P3：5’-aaaggatccggaatcataaacacattacagaaatattattgccgtgtccgtgg-3’，下划线字母表示BamH1酶切位点；
P4：5’-ctttggaaggcagctgagcacagcacaacggccgccacggacacggcaataa-3’；
P5：5’-ctcagctgccttccaaaggaggaacagatcggcaagtgctcgacgcgtggcc-3’；
P6：5’-tttaagcttttatttcttacgacggcagcatttacggccacgcgtcgagcact-3’，下划线字母表示Hind III酶切位点。
将四条引物加入PCR反应体系中，PCR扩增条件如下：95℃变性3min进入循环，95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸10s，10个循环后72℃继续延伸5min，得到目的基因片段，将此PCR产物纯化后作为模板，利用引物P3和P6大量扩增，PCR扩增条件如下：95℃变性3min进入循环，95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸10s，10个循环后72℃继续延伸5min，最后得到末端带有BamH1和Hind III酶切位点的138bp的目的基因片段(如图4)。
1.3pet28a-hBD-3重组质粒的构建
将上述的PCR产物纯化后和pet28a载体用限制性内切酶BamH1和Hind III酶切，再用T4连接酶将人hBD-3基因插入到pet28a质粒中(16℃，过夜连接)。将连接产物导入到大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞中，在含有氨苄抗性的固体培养基上过夜培养，挑选阳性克隆，用PCR扩增(如图5)和BamH1，Hind III双酶切鉴定重组质粒(如图6)。从图中可以看出：图5显示出一条138bp的片段，图6显示pet28a-hBD-3质粒经BamH1，Hind III双酶切后得到一条约138bp的小片段和一条约5kb大片段。证明有138bp的外源片段插入到了质粒中，PCR和酶切结果显示成功制备了pet28a-hBD-3质粒载体。
1.4His-hBD-3片段的扩增
合成一对特异性引物(即P7，P8见下方)，在P7和P8中分别引入限制性酶切位点Kpn1和Not1，以上面构建的pet28a-hBD-3质粒为模板，PCR扩增His-hBD-3片段。PCR扩增条件如下：95℃变性3min进入循环，95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸10s，10个循环后72℃继续延伸5min，得到目的基因片段，其PCR结果如图7所示，图7显示出一条240bp的条带，与理论相符，证明得到了His-hBD-3基因片段。
P7：5’-aaaggtaccatgggcagcagccatc-3’，下划线字母表示Kpn1酶切位点；
P8：5’-tttgcggccgcttatttcttacgacggcagc-3’，下划线字母表示Not1酶切位点。
1.5果蝇NosP-attB-His-hBD-3质粒的构建
将上述扩增得到的His-hBD-3片段和步骤1.1构建的NosP-attB质粒用限制性内切酶Kpn1和Not1酶切，再用T4连接酶(16℃，过夜连接)将His-hBD-3片段插入到NosP-attB质粒中。将连接产物导入到大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞中，在含有氨苄抗性的固体培养基上过夜培养，挑选阳性克隆，用NosP-attB载体上的一条引物P9和His-hBD-3的下游引物P8进行菌液PCR初步鉴定，P9引物的基因序列为：
5’-gcaagaaccgttagttggcgcg-3’，得到400bp左右的目的条带，如图8所示，得到两个阳性克隆为3号与5号。将其分别提取质粒，用Kpn1与Not1双酶切鉴定，如图9所示，从图中可以看出：重组质粒释放出240bp左右的目的条带，证明成功制备了果蝇表达载体NosP-attB-His-hBD-3。将阳性克隆的菌液样品送至生物公司测序，将测序结果上网比对。结果表明，His-hBD3融合序列240bp的编码序列完全正确，具体序列如下：“ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGCGGATCCggaatcataaacacattacagaaatattattgcCGTgtcCGTggcggccgTtgtgctgtgctcagctgccttccaaaggaggaacagatcggcaagtgctcgacgcgtggccgTaaatgctgccgTCGTaagaaaTAA”。
此序列中，前面102bp为带有六个组氨酸标签(6xHis)的小肽，编码34个氨基酸残基。后面的138bp为人hBD3基因的编码序列，编码45个氨基酸残基。此融合基因序列为后续的蛋白质纯化提供了便利。
实施例2
将实施例1步骤1.2中的P3、P6引物的酶切位点分别替换为EcoR1、Xho1限制性酶切位点，并将1.3步骤中的双内切酶替换为EcoR1和Xho1限制性内切酶，其它与实施例1相同。
实施例3
将实施例1步骤1.3中的pet28a质粒载体替换为pRSETB质粒载体，制备了pRSETB-hBD-3质粒载体，以pRSETB-hBD-3质粒载体为模板，P7和P8为引物，PCR扩增His-hBD-3片段，其它同实施例1。
实施例4
将实施例1步骤1.4中的P7引物中的Kpn1酶切位点替换为Asc1酶切位点，并将步骤1.5中双内切酶替换为Asc1和Not1限制性内切酶，其它同实施例1。
上述参照实施例对人β-防御素3基因果蝇生殖系统特异表达载体的制备方法进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.重组载体NosP-attB的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(a)以NosP-ote载体为模板，P1、P2为特异性引物，PCR扩增Nos启动子的基因片段；所述P1、P2的基因序列如下：
P1：5’-tttcctgcagggaattcctcgagaccggtcgaccgttttaacctcgaaatatgcac-3’；下划线字母表示Sbf1酶切位点；
P2：5’-aaatctagagcggccgctggtaccggcgcgccgtaactaaactcgcttttgggttaa-3’；下划线字母表示Xba1酶切位点。
(b)将步骤(a)得到的PCR产物和pUAST-attB载体质粒用sbf1与xba1双酶切，载体加入CIAP，37℃孵育30分钟，去除DNA末端的5’磷酸根基团，然后用T4连接酶将目的片段与UAST-attB载体进行连接，经过转化、鉴定后即可得到重组载体NosP-attB。
2.一种人β-防御素3基因果蝇生殖系统特异表达载体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)采用如权利要求1所述的制备方法制备得到重组载体NosP-attB；
(2)人β-防御素3基因片段的制备与扩增；
(3)将人β-防御素3基因片段插入到pet28a载体中，制备pet28a-hBD-3重组载体；
(4)以步骤(3)得到的pet28a-hBD-3重组质粒为模板，PCR扩增His-hBD-3片段；
(5)将步骤(4)得到的His-hBD-3片段插入到NosP-attB质粒中，制备果蝇生殖系统表达载体NosP-attB-His-hBD3。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)具体包括：
将四条特异性引物P3，P4，P5和P6经PCR扩增，且在P3和P6中分别引入BamH1与Hind III两种限制性酶切位点，所述四条特异性引物如下：
P3：5’-aaaGGATCCggaatcataaacacattacagaaatattattgcCGTgtcCGTgg-3’，下划线字母表示BamH1酶切位点；
P4：5’-ctttggaaggcagctgagcacagcacaAcggccgccACGgacACGgcaataa-3’；
P5：5’-ctcagctgccttccaaaggaggaacagatcggcaagtgctcgacgcgtggcc-3’；
P6：5’-tttAAGCTTTTAtttcttACGAcggcagcatttAcggccacgcgtcgagcact-3’，下划线字母表示Hind III酶切位点。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述人β-防御素3基因片段的核苷酸序列如下：ggaatcataaacacattacagaaatattattgcCGTgtcCGTggcggccgTtgtgctgtgctcagctgccttccaaaggaggaacagatcggcaagtgctcgacgcgtggccgTaaatgctgccgTCGTaagaaaTAA。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)具体包括：用限制性内切酶BamH1和Hind III双酶切人β-防御素3基因片段和pet28a载体，将人β-防御素3基因片段插入到pet28a载体的BamH1和Hind III之间。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)还包括pet28a载体酶切后加入CIAP，37℃孵育30分钟，再用T4连接酶将人hBD-3基因插入到pet28a载体的BamH1和Hind III之间。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)具体包括：以步骤(2)得到的pet28a-hBD-3重组质粒为模板，P7，P8为特异性引物，PCR扩增His-hBD-3片段，所述P7，P8特异性引物如下：
P7：5’-AAAggtaccATGGGCAGCAGCCATC-3’，下划线字母表示Kpn1酶切位点；
P8：5’-TTTgcggccgcTTAtttcttACGAcggcagc-3’，下划线字母表示Not1酶切位点。
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)具体包括：将步骤(4)得到的His-hBD-3片段和步骤(1)构建的NosP-attB质粒用限制性内切酶Kpn1和Not1双酶切，再用T4连接酶将His-hBD-3片段与NosP-attB质粒连接。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)还包括：将连接产物导入到大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞中，在含有氨苄抗性的固体培养基上过夜培养，挑选阳性克隆，经鉴定后即可得到NosP-attB-His-hBD-3果蝇生殖系统特异性表达载体。
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