CN103134930A - 一种用于农药阿特拉津的量热酶联免疫吸附(telisa)检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于检测农药阿特拉津的竞争量热酶联免疫吸附方法(TELISA)，该方法既保持了酶联免疫法(ELISA)灵敏度高的优点，又利用量热法有效排除了样品中的基质干扰，并且可作为一种广泛的方法和通用技术平台，通过改变完全抗原和抗体对多种小分子污染物进行检测，为建立复杂基质样品中小分子污染物的快速、灵敏、准确检测技术及装备奠定基础。

Description

一种用于农药阿特拉津的量热酶联免疫吸附(TELISA)检测方法

技术领域

本发明涉及一种基于酶量热法检测阿特拉津的方法，特别涉及抗体间接竞争量热酶联免疫吸附对阿特拉津的检测方法。

背景技术

阿特拉津(Atrazine，AT)又名莠去津，全称为2-氯-4-乙胺-6-异丙胺-1，3，5-三嗪，其结构式如(I)所示：

自1952年开发生产以来，作为选择性内吸传导型苗前、苗后除草剂，得到了大面积使用，主要用于玉米、高粱、甘蔗、果树、林地等旱田，可防除一年生禾本科杂草和阔叶杂草，对某些多年生杂草也有一定的抑制作用；阿特拉津具有一定残留毒性，在水中达到一定浓度时，能抑制多种藻类的光合作用及生长，并且使鱼体内的Ca2+、Mg2+等无机离子浓度显著下降，导致其重要的生理功能发生紊乱。当在水中的浓度达到3μg/L时，可致使小鼠的染色体受损，能够杀死水底节肢动物。在低浓度长期暴露下，阿特拉津会影响人体的内分泌系统及生殖系统，对人体有潜在的致癌作用，甚至引发癌症，美国环境保护局规定阿特拉津在水中的最高允许浓度为3μg/L，欧盟规定饮用水中阿特拉津含量不得超过0.1μg/L，我国国家环保部规定地表水(1-2类)中阿特拉津的最高允许浓度为3μg/L，阿特拉津引起的严重污染环境的问题已引起了人们的广泛关注。因此，建立阿特拉津残留的检测方法具有十分迫切和必要的现实意义。

阿特拉津及其降解产物准确分析的常用方法有C18小柱固相萃取、气相色谱-质谱联用或高效液相色谱-质谱联用测定以及传感器检测等。GC的检测器通常是ECD或NPD，HPLC采用紫外或可见光检测器进行检测。这些检测方法均需要昂贵的仪器设备及专业的操作人员，不适合于现场的快速检测。免疫学方法检测阿特拉津所具备的快速、简便、灵敏、便携等优点使其适合于现场的快速检测，在检测简单样品时具有良好的效果，但面对基质复杂样品时，简单样品前处理后往往带有基质的颜色，严重干扰后续的免疫显色反应，同时，许多化学残留物浓缩富集过程中应用的有机溶剂也会干扰抗原抗体的免疫反应，如果想降低这类干扰，就需要复杂的样品前处理过程，造成“快速检测方法速度不快”的尴尬，极大影响了现有小分子残留的快速检测方法的应用。量热检测法是通过量度组成生物的无机和/或有机分子相互反应时的热能交换来检测相应分子的检测方法，由于热能交换是生物反应中最常见的能量反应形式之一，因此量热检测法在生物测量法中具有广泛的适应性。量热酶联免疫吸附法(TELISA)则是利用抗原抗体的特异识别结合量热反应进行检测的实验方法，其关键步骤是酶与半抗原(阿特拉津)的偶联、抗体与表面氨基修饰的可控多孔玻璃珠(CPG)的偶联及量热法检测条件摸索与优化等。

发明内容

针对阿特拉津检测的基质干扰问题，本发明的目的是提供一种竞争量热ELISA(TELISA)法检测阿特拉津。

本发明的第二个目的提供一种β-内酰胺酶标记阿特拉津(β-AT)的合成方法。

本发明的第三个目的提供一种阿特拉津单克隆抗体与CPG的偶联方法。

本发明的技术方案概述如下：

一种β-内酰胺酶标记阿特拉津(β-AT)的制备：

(1)将羧基化阿特拉津溶于400μLN，N-二甲基亚酰胺(DMF)中，震荡使其完全溶解；

(2)将NHS加入步骤(1)的混合溶液中，溶解完全后搅拌下快速加入EDC-HCl，室温避光搅拌反应8小时，得到溶液A；

(3)称取β-内酰胺酶溶于pH＝7.4、0.01mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)中，制备B液，4℃保存；

(4)室温下500转/分钟搅拌下，将步骤(2)的A液缓慢滴加到步骤(2)的B液中，滴加完毕后置于4℃继续缓慢搅拌12小时；

(5)将步骤(4)产物用0.01mol/L、pH＝7.4磷酸盐缓冲液4℃透析3天，每天换透析液2次，得β-内酰胺酶标记的阿特拉津(β-AT)，分装于EP管中，-20℃保存备用。

所述羧基化阿特拉津、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC-HCl)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的摩尔比优选为1∶1-3∶1-3。

所述羧基化阿特拉津与β-内酰胺酶摩尔比优选为：20-40∶1。

一种阿特拉津抗体与CPG的偶联方法：

(1)称取0.1-0.5g CPG玻璃珠，加入8.5mL 0.01mol/L pH＝7.4磷酸盐缓冲液(PBS)稀释的2.5％戊二醛溶液，置于真空干燥箱，负压(0.04mPa)放置30分钟后室温放置30分钟；

(2)待步骤(1)产物变为砖红色后负压抽吸，用100mL PBS充分洗去未结合戊二醛；

(3)加入3.5mg阿特拉津抗体于步骤(2)产物的8.5mL PBS中，20℃下固定化反应2小时，4℃过夜，负压抽滤除去未结合抗体；

(4)步骤(3)产物加入乙醇胺封闭，负压抽滤去除多余乙醇胺，再用8.5mL 1％OVA封闭2小时，4℃保存待用。

所述CPG、戊二醛质量、阿特拉津抗体质量比优选为：1-5∶2∶1-3。

所述封闭液乙醇胺用量及浓度优选为：5-10mL、0.1-1.0mol/L。

竞争量热法检测阿特拉津：

(1)将偶联了阿特拉津单克隆抗体的CPG装入酶柱置于热调节器中，通入含DMSO的PBS载液平衡流动体系；

(2)加入0.15-40μg/mL梯度浓度阿特拉津与优化浓度的β-内酰胺酶标阿特拉津混合液，二者在酶柱内竞争结合抗体上的特异识别位点；

(3)加入底物优化的青霉素钠溶液，经酶催化产生热信号，并被惠斯通电桥收集、转化后在酶热工作站上以峰信号显示；

(4)加入优化后的再生液，再生10-25分钟，进行另一个阿特拉津浓度的测试；

(5)将测得的信号值整理并绘制检测方法标准曲线，对水样、中药材板蓝根进行样品加标测试，最终确定方法线性范围：0.509-4.510μg/mL，灵敏度(IC₅₀)＝1.516μg/mL，最低检测限：0.354μg/mL。

所述竞争混合液中β-内酰胺酶标阿特拉津浓度优选为：0.01-1.0mg/mL。

所述底物青霉素钠溶液浓度优选为：1.0-10.0mg/mL。

所述再生液优选为：0.1mol/L HCl、0.1mol/L HCl(0.2％SDS)、0.1mol/L glycine/HCl(pH2.0)、0.1mol/LNaOH(0.1％SDS)或0.1mol/LNaOH/CH₃CN(1/4，v/v)。

附图说明

图1为β-内酰胺酶标记阿特拉津(β-AT)的制备过程图。

图中首先利用NHS/EDC方法活化羧基化阿特拉津的羧基，活化后的中间体在PBS溶液中与β-内酰胺酶通过酰胺键进行偶联，再经透析等纯化步骤得β-内酰胺酶标记的阿特拉津(β-AT)。

图2为β-内酰胺酶标阿特拉津与阿特拉津小分子的竞争抑制曲线图。

图3为β-内酰胺酶标阿特拉津与阿特拉津小分子竞争回归曲线(标准曲线)图。

图4为自来水样中阿特拉津检测的加标酶热信号图。

此图为利用间接竞争法检测不同浓度阿特拉津的连续酶热信号图，每个样品的检测过程包括酶热信号峰及再生信号峰，每个样品检测时间小于10min。

具体实施方式

实施例一水样加标回收实验

酶热系统中加入8mmol/L底物青霉素钠溶液测得系统本底信号值，加入2％DMSO PBS的β-AT溶液与加标浓度1.25μg/mL的自来水混合液500μL(v/v＝1/1)进行竞争，5min后加入8mmol/L底物青霉素钠并记录酶热信号，pH2.3的HCl溶液再生15min。重复两次并记录相应信号值。同法检测阿特拉津加标浓度为0、5.0和10.0μg/mL的水样，每个样品重复3次，记录酶热信号。将所得酶热信号值利用标准曲线计算出相应浓度及加标回收率，方法回收率在80-110％内，相对标准偏差小于5％。

实例二中药材板蓝根加标回收实验

称取0.75g预先粉碎的板蓝根样品4份，先分别加入1.0mL H₂O，震荡5min后分别加入0、10、20、40μL 10mg/mL的阿特拉津DMSO溶液，震荡5min后静置30min，加入5mL丙酮，震荡至溶解，再加入0.5g A1₂O₃，震荡后超声5-10min，4000rpm离心10min，取2mL上清液，N₂吹干，样品用4mL 2％DMSO PBS溶液溶解，得终浓度为0、1.25、5.0和10μg/mL的加标样品溶液，过滤后分别加入酶热系统并记录抑制信号，每个样品重复3次，根据标准曲线计算出相应浓度及加标回收率，方法回收率在80-110％内，相对标准偏差小于5％。

Claims (10)

1.权利要求一种β-内酰胺酶标记阿特拉津(β-AT)的制备方法，其特征是由以下步骤组成：

(1)将羧基化阿特拉津溶于400μLN，N-二甲基亚酰胺(DMF)中，震荡使其完全溶解；

(2)将NHS加入步骤(1)的混合溶液中，溶解完全后搅拌下快速加入EDC-HCl，室温避光搅拌反应8小时，得到溶液A；

(3)称取β-内酰胺酶溶于pH＝7.4、0.01mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)中，制备B液，4℃保存；

(4)室温下500转/分钟搅拌下，将步骤(2)的A液缓慢滴加到步骤(2)的B液中，滴加完毕后置于4℃继续缓慢搅拌12小时；

(5)将步骤(4)产物用0.01mol/L、pH＝7.4磷酸盐缓冲液4℃透析3天，每天换透析液2次，得β-内酰胺酶标记的阿特拉津(β-AT)，分装于EP管中，-20℃保存备用。

2.根据权利要求1所述的β-内酰胺酶标记阿特拉津(β-AT)的制备方法，其特征是所述羧基化阿特拉津、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC-HCl)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的摩尔比为1∶1-3∶1-3。

3.根据权利要求1或2所述的β-内酰胺酶标记阿特拉津(β-AT)的制备方法，其特征是所述羧基化阿特拉津与β-内酰胺酶的摩尔比为：20-40∶1。

4.权利要求一种阿特拉津抗体与CPG的偶联方法，其特征是由如下步骤组成：

(1)称取0.1-0.5g CPG玻璃珠，加入8.5mL 0.01mol/L pH＝7.4磷酸盐缓冲液(PBS)稀释的2.5％戊二醛溶液，置于真空干燥箱，负压(0.04mPa)放置30分钟后室温放置30分钟；

(2)待步骤(1)产物变为砖红色后负压抽吸，用100mL PBS充分洗去未结合戊二醛；

(3)加入3.5mg阿特拉津抗体于步骤(2)产物的8.5mL PBS中，20℃下固定化反应2小时，4℃过夜，负压抽滤除去未结合抗体；

(4)步骤(3)产物加入乙醇胺封闭，负压抽滤去除多余乙醇胺，再用8.5mL 1％OVA封闭2小时，4℃保存待用。

5.根据权利要求4所述的一种阿特拉津抗体与CPG的偶联方法，其特征是所述CPG、戊二醛质量、阿特拉津抗体质量比为：1-5∶2∶1-3。

6.根据权利要求4或5所述的一种阿特拉津抗体与CPG的偶联方法，其特征是所述封闭液乙醇胺用量及浓度为：5-10mL、0.1-1.0mol/L。

7.权利要求一种竞争量热法检测阿特拉津的方法，其特征是有以下步骤组成：

(1)将偶联了阿特拉津单克隆抗体的CPG装入酶柱置于热调节器中，通入含DMSO的PBS载液平衡流动体系；

(2)加入0.15-40μg/mL梯度浓度阿特拉津与优化浓度的β-内酰胺酶标阿特拉津混合液，二者在酶柱内竞争结合抗体上的特异识别位点；

(3)加入底物优化的青霉素钠溶液，经酶催化产生热信号，并被惠斯通电桥收集、转化后在酶热工作站上以峰信号显示；

(4)加入优化后的再生液，再生10-25分钟，进行另一个阿特拉津浓度的测试；

(5)将测得的信号值整理并绘制检测方法标准曲线，对水样、中药材板蓝根进行样品加标测试，最终确定方法线性范围：0.509-4.510μg/mL，灵敏度(IC₅₀)＝1.516μg/mL，最低检测限：0.354μg/mL。

8.根据权利要求7所述的一种竞争量热法检测阿特拉津的方法，其特征是所述竞争混合液中β-内酰胺酶标阿特拉津浓度为：0.01-1.0mg/mL。

9.根据权利要求7或8所述的一种竞争量热法检测阿特拉津的方法，其特征是所述底物青霉素钠溶液浓度为：1.0-10.0mg/mL。

10.根据权利要求7、8或9所述的一种竞争量热法检测阿特拉津的方法，其特征是所述再生液为：0.1mol/L HCl、0.1mol/L HCl(0.2％SDS)、0.1mol/L glycine/HCl(pH 2.0)、0.1mol/LNaOH(0.1％SDS)或0.1mol/LNaOH/CH₃CN(1/4，v/v)。

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