CN106525835A - 一种食品中大庆霉素的检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种食品中大庆霉素的检测试剂盒，包括酶标板、标准品溶液、大庆霉素抗体工作液、大庆霉素酶标二抗工作液、底物显色液、终止液、浓缩复溶液和浓缩洗涤液；酶标板的制备：将大庆霉素半抗原与鸡卵清白蛋白偶联得到大庆霉素包被抗原，用磷酸盐缓冲液将包被抗原稀释成1：20000比例，100μL/孔，37℃孵育2h，取出酶标板甩掉板内液体，加入稀释后的浓缩洗涤液300μL/孔，洗板2次，30s/次，然后加入封闭液，150μL/孔，37℃放置2h，弃去封闭液直接拍干，置于常温条件下晾干，抽检合格后将酶标板真空密封，于4℃条件下保存。本发明操作简便，检测灵敏、准确、快速，适用于大批量样品的快速检测。
Description
技术领域
本发明涉及食品检测技术领域，具体是一种食品中大庆霉素的检测试剂盒。
背景技术
庆大霉素（Gentamycin，GM），是氨基糖苷类抗生素的一种，庆大霉素呈碱性、易溶于水、性状稳定，与硫酸结合成临床上使用的硫酸庆大霉素。它的抗菌谱较广，对绿脓杆菌、大肠杆菌、产气杆菌、克雷白杆菌、奇异变形杆菌、某些吲哚变形杆菌、某些奈瑟菌、某些无色素雷杆菌和志贺菌等革兰氏阴性菌有抗菌作用，而且对革兰氏阳性菌中的金黄色葡萄球菌也有很强的抗菌作用；其抗菌作用机理是直接与30S核糖体亚单位16rRNA的解码区的A部位结合，从而导致菌体死亡。但是，随着庆大霉素的广泛使用，一些细菌逐渐对其产生了耐药性。虽然庆大霉素对奶牛乳房炎、子宫内膜炎等有很好的疗效，常用作兽医临床治疗及饲料药物添加剂，但不规范用药会引起畜产品，尤其是泌乳动物的乳汁中有药物残留，对人类的健康构成潜在危害，造成耳毒性和肾脏毒性。国内外相继规定了其在动物性食品中的最高残留限量。我国农业部235号公告规定，庆大霉素在肌肉、脂肪中的最高残留限量为100ppb，在肝中的最高残留限量为2000ppb，在肾中的最高残留限量为5000ppb，在牛奶中的最高残留限量为200ppb。
目前，因检测结果准确可靠，大庆霉素的测定多采用色谱法，但色谱法对仪器设备的要求较高，且样本前处理过程比较复杂，因此，急需研究一种快速高效的检测样本中的大庆霉素含量的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种低成本、快速、高效的食品中大庆霉素的检测试剂盒。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种食品中大庆霉素的检测试剂盒，包括酶标板、标准品溶液、大庆霉素抗体工作液、大庆霉素酶标二抗工作液、底物显色液、终止液、浓缩复溶液和浓缩洗涤液；所述的酶标板的制备，步骤为：将大庆霉素半抗原与鸡卵清白蛋白偶联得到大庆霉素包被抗原，用0.12～0.15mol/L的pH值7.4～7.5的磷酸盐缓冲液作为包被液，将包被抗原稀释成1：20000比例，100μL/孔，37℃孵育2h，取出酶标板甩掉板内液体，加入稀释后的浓缩洗涤液300μL/孔，洗板2次，30s/次，然后加入0.3～0.32%鸡卵清白蛋白封闭液，150μL/孔，37℃放置2h，弃去封闭液直接拍干，拍干后的酶标板置于常温条件下晾干，抽检合格后将酶标板真空密封，于4℃条件下保存。
作为本发明进一步的方案：所述的标准品的浓度分别为0ng/mL、0.5ng/mL、1.0ng/mL、2.0ng/mL、4.0ng/mL、8.0ng/mL、16.0ng/mL、32.0ng/mL、64.0ng/mL。
作为本发明进一步的方案：所述的大庆霉素抗体工作液是采用大庆霉素人工抗原免疫小鼠得到单克隆抗体，用抗体稀释液稀释成1：30000比例制备。
作为本发明进一步的方案：所述的大庆霉素酶标二抗工作液由酶标二抗加稀释液稀释成1：2000比例。
作为本发明进一步的方案：所述的底物显色液由底物显色A液和底物显色B液组成，底物显色A液为含有1.5～1.6mmol/L的过氧化氢脲的磷酸盐缓冲液，底物显色B液为四甲基联苯二胺溶液。
作为本发明进一步的方案：所述的终止液为1～1.2mol/L的硫酸溶液。
作为本发明进一步的方案：所述的浓缩复溶液为20×浓缩复溶液，具体是0.1mol/L的pH值范围在7.0～7.5之间的磷酸盐缓冲液。
作为本发明进一步的方案：所述的浓缩洗涤液为20×浓缩洗涤液，具体是含0.8～1.0%吐温-20、0.05～0.06mol/L的pH值范围在7.0～7.5之间的磷酸盐缓冲液。
利用所述的食品中大庆霉素的检测试剂盒进行检测的方法，具体步骤为：
（1）预处理待测样品：准确称取2g样品于离心管中，先加入2mL双蒸水充分混匀再加入4mL乙酸，涡旋混匀后离心，取上层有机相2mL于42～45℃水浴氮气吹干，加入1mL丙三醇溶解残留物，并加入1mL浓缩复溶液，充分振荡混匀后离心，取上层溶液，待测；
（2）检测：取包被有大庆霉素抗原的酶标板，依次加入标准品/样本、大庆霉素抗体工作液各50μL/孔到对应的微孔中，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温避光环境中反应40～50min，将孔内液体甩干，用去离子水将浓缩洗涤液按1：19的体积比进行稀释得到的洗涤工作液充分洗涤2～3次，每次间隔20s，拍干后加入大庆霉素酶标二抗工作液100μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温避光环境中反应40～50min，将孔内液体甩干，用去离子水将浓缩洗涤液按1：19的体积比进行稀释得到的洗涤工作液充分洗涤2～3次，每次间隔20s，拍干后加入底物显色A液50μL/孔，底物显色B液50μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温避光环境中反应20～25min，加入终止液50μL/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于350nm处或双波长350/625nm检测，测定每孔吸光度值，以标准品浓度的对数为横坐标，标准品百分吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线；
（3）检测结果分析：对照标准曲线，计算样品中大庆霉素的含量。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明样品中的大庆霉素与酶标板上固定的抗原特异性竞争抗体，加入酶标二抗，与抗体反应，通过酶催化显色剂显色，根据显色的深浅来判断样品中大庆霉素的含量。如果样品中的大庆霉素含量少，显色深；反之，则显色浅。本发明操作简便，检测灵敏、准确、快速，适用于大批量样品的快速检测。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本发明实施例中，一种食品中大庆霉素的检测试剂盒，包括酶标板、标准品溶液、大庆霉素抗体工作液、大庆霉素酶标二抗工作液、底物显色液、终止液、浓缩复溶液和浓缩洗涤液；酶标板的制备步骤为：将大庆霉素半抗原与鸡卵清白蛋白偶联得到大庆霉素包被抗原，用0.14mol/L的pH值7.4的磷酸盐缓冲液作为包被液，将包被抗原稀释成1：20000比例，100μL/孔，37℃孵育2h，取出酶标板甩掉板内液体，加入稀释后的浓缩洗涤液300μL/孔，洗板2次，30s/次，然后加入0.3%鸡卵清白蛋白封闭，150μL/孔，37℃放置2h，弃去封闭液直接拍干，拍干后的酶标板置于常温条件下晾干，抽检合格后将酶标板真空密封，于4℃条件下保存；标准品的浓度分别为0ng/mL、0.5ng/mL、1.0ng/mL、2.0ng/mL、4.0ng/mL、8.0ng/mL、16.0ng/mL、32.0ng/mL、64.0ng/mL；大庆霉素抗体工作液是采用大庆霉素人工抗原免疫小鼠得到单克隆抗体，用抗体稀释液稀释成1：30000比例制备；大庆霉素酶标二抗工作液由酶标二抗加稀释液稀释成1：2000比例；底物显色液由底物显色A液和底物显色B液组成，底物显色A液为含有1.5mmol/L的过氧化氢脲的磷酸盐缓冲液，底物显色B液为四甲基联苯二胺溶液；终止液为1.1mol/L的硫酸溶液；浓缩复溶液为20×浓缩复溶液，具体是0.1mol/L的pH值7.2的磷酸盐缓冲液；浓缩洗涤液为20×浓缩洗涤液，具体是含0.9%吐温-20、0.055mol/L的pH值7.4的磷酸盐缓冲液。
利用所述的食品中大庆霉素的检测试剂盒进行检测的方法，具体步骤为：
（1）预处理待测样品：准确称取2g样品于离心管中，先加入2mL双蒸水充分混匀再加入4mL乙酸，涡旋混匀后离心，取上层有机相2mL于44℃水浴氮气吹干，加入1mL丙三醇溶解残留物，并加入1mL浓缩复溶液，充分振荡混匀后离心，取上层溶液，待测；
（2）检测：取包被有大庆霉素抗原的酶标板，依次加入标准品/样本、大庆霉素抗体工作液各50μL/孔到对应的微孔中，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温避光环境中反应45min，将孔内液体甩干，用去离子水将浓缩洗涤液按1：19的体积比进行稀释得到的洗涤工作液充分洗涤3次，每次间隔20s，拍干后加入大庆霉素酶标二抗工作液100μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温避光环境中反应45min，将孔内液体甩干，用去离子水将浓缩洗涤液按1：19的体积比进行稀释得到的洗涤工作液充分洗涤3次，每次间隔20s，拍干后加入底物显色A液50μL/孔，底物显色B液50μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温避光环境中反应25min，加入终止液50μL/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于350nm处或双波长350/625nm检测，测定每孔吸光度值（请在3min内读完数据），以标准品浓度的对数为横坐标，标准品百分吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线；
（3）检测结果分析：对照标准曲线，计算样品中大庆霉素的含量。
本发明样品中的大庆霉素与酶标板上固定的抗原特异性竞争抗体，加入酶标二抗，与抗体反应，通过酶催化显色剂显色，根据显色的深浅来判断样品中大庆霉素的含量。如果样品中的大庆霉素含量少，显色深；反之，则显色浅。本发明操作简便，检测灵敏、准确、快速，适用于大批量样品的快速检测。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (8)
1.一种食品中大庆霉素的检测试剂盒，其特征在于，包括酶标板、标准品溶液、大庆霉素抗体工作液、大庆霉素酶标二抗工作液、底物显色液、终止液、浓缩复溶液和浓缩洗涤液；所述的酶标板的制备，步骤为：将大庆霉素半抗原与鸡卵清白蛋白偶联得到大庆霉素包被抗原，用0.12～0.15mol/L的pH值7.4～7.5的磷酸盐缓冲液作为包被液，将包被抗原稀释成1：20000比例，100μL/孔，37℃孵育2h，取出酶标板甩掉板内液体，加入稀释后的浓缩洗涤液300μL/孔，洗板2次，30s/次，然后加入0.3～0.32%鸡卵清白蛋白封闭液，150μL/孔，37℃放置2h，弃去封闭液直接拍干，拍干后的酶标板置于常温条件下晾干，抽检合格后将酶标板真空密封，于4℃条件下保存。
2.根据权利要求1所述的食品中大庆霉素的检测试剂盒，其特征在于，所述的标准品的浓度分别为0ng/mL、0.5ng/mL、1.0ng/mL、2.0ng/mL、4.0ng/mL、8.0ng/mL、16.0ng/mL、32.0ng/mL、64.0ng/mL。
3.根据权利要求1所述的食品中大庆霉素的检测试剂盒，其特征在于，所述的大庆霉素抗体工作液是采用大庆霉素人工抗原免疫小鼠得到单克隆抗体，用抗体稀释液稀释成1：30000比例制备。
4.根据权利要求1所述的食品中大庆霉素的检测试剂盒，其特征在于，所述的大庆霉素酶标二抗工作液由酶标二抗加稀释液稀释成1：2000比例。
5.根据权利要求1所述的食品中大庆霉素的检测试剂盒，其特征在于，所述的底物显色液由底物显色A液和底物显色B液组成，底物显色A液为含有1.5～1.6mmol/L的过氧化氢脲的磷酸盐缓冲液，底物显色B液为四甲基联苯二胺溶液。
6.根据权利要求1所述的食品中大庆霉素的检测试剂盒，其特征在于，所述的终止液为1～1.2mol/L的硫酸溶液。
7.根据权利要求1所述的食品中大庆霉素的检测试剂盒，其特征在于，所述的浓缩复溶液是0.1mol/L的pH值范围在7.0～7.5之间的磷酸盐缓冲液。
8.根据权利要求1所述的食品中大庆霉素的检测试剂盒，其特征在于，所述的浓缩洗涤液是含0.8～1.0%吐温-20、0.05～0.06mol/L的pH值范围在7.0～7.5之间的磷酸盐缓冲液。
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