CN114878289A

CN114878289A - 一种耐低温低盐的蓝藻藻胆体样品的制备方法

Info

Publication number: CN114878289A
Application number: CN202210812369.7A
Authority: CN
Inventors: 郑正高; 王宏蕊; 董春霞; 赵进东
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University
Priority date: 2022-07-12
Filing date: 2022-07-12
Publication date: 2022-08-09
Anticipated expiration: 2042-07-12
Also published as: CN114878289B

Abstract

本发明公开了一种耐低温低盐的蓝藻藻胆体样品的制备方法。与常规的蓝藻藻胆体体外纯化方法相比，本发明包含了一特殊处理步骤：在蔗糖梯度纯化的磷酸盐缓冲液中加入终浓度为0.0075~0.015%（w/v）的1,5‑戊二醛（GA）和10~500 nM的BS3两种交联剂。所得到的藻胆体样品在4℃和10 mM磷酸盐的低温低盐条件下，可以在48 h内维持其稳定结构，而不会解聚。该耐低温低盐的藻胆体为冷冻电镜解析藻胆体结构，体外研究藻胆体与光系统复合体的相互作用以及能量传递的机制等提供了可能性。

Description

一种耐低温低盐的蓝藻藻胆体样品的制备方法

技术领域

本发明属于微生物蛋白样品制备领域，具体涉及一种耐低温低盐的蓝藻藻胆体样品的制备方法，为蓝藻藻胆体在其它生化范围的应用提供更多可能性。

背景技术

光合作用是地球上最重要的生化反应之一，而光合作用的第一步是光能的高效捕获以及传递。而蓝藻藻胆体就是这么一类大型捕光天线蛋白复合体，其位于蓝藻细胞的内囊体膜外朝向基质的一侧，可以以不低于98%的效率捕获和传递光能至光系统反应中心。蓝藻藻胆体结构上由藻胆蛋白和连接蛋白构成，藻胆蛋白以不同寡聚形式，加上连接蛋白的作用，依靠氢键和极性相互作用，自发组装为高度有序的完整藻胆体结构。

蓝细菌的藻胆体在上世纪70年代就已经可以通过体外纯化出来，至今为止经过半个多世纪，体外纯化的藻胆体只有在高磷酸盐（0.6~1.0 mol/L）且常温（16~28℃）的环境下才能稳定存在。这是由于藻胆体是极大分子量蛋白复合体结构，需要高浓度磷酸盐维持复合体的蛋白亚基之间的极性作用力，而低温条件也不利于这些极性作用力的维持。体外纯化的完整藻胆体所需要的高盐常温条件，也极大限制了对藻胆体结构解析以及藻胆体与光系统复合体相互作用和能量传递机制的研究。一方面，高磷酸盐条件使得很难用晶体学方法得到藻胆体的结晶，也就不可能利用晶体学方法解析藻胆体的三维结构；另一方面，高磷酸盐条件使得利用冷冻透射电镜去解析藻胆体的三维结构时，会造成蛋白样品衬度很差，需要通过各种其它的方案来解决衬度问题，但是对应的解析出的结构分辨率会受到很大限制；再一方面，高盐低温条件不利用光系统蛋白复合体的稳定，使得我们很难在体外研究藻胆体与光系统复合体的相互作用以及能量传递的机制。

发明内容

本发明的目的是提供一种耐低温低盐的蓝藻藻胆体样品的制备方法，克服了藻胆体体外纯化稳定存在必须要的高磷酸盐和常温条件，为利用晶体学和透射电镜解析藻胆体的三维结构，以及体外研究藻胆体和光系统复合体之间相互作用和能量传递机制提供一种可能的方案。

为实现上述目的，本发明对蔗糖梯度离心分离蓝藻藻胆体的步骤进行改进，在纯化缓冲液中添加1,5-戊二醛（GA）和BS3这两种交联剂，最终纯化得到的蓝藻藻胆体就可以在低温低盐的条件下稳定存在。具体的，本发明的技术方案如下：

一种耐低温低盐的蓝藻藻胆体样品的制备方法，包括以下步骤：

1、预先配置缓冲液A和缓冲液B，使用时将缓冲液A和缓冲液B等体积混合，并添加终浓度为0.0075%~0.015%（w/v，g/mL）的1,5-戊二醛（GA）和10~500 nM的BS3两种交联剂，得到缓冲液D，其中：缓冲液A为0.9 M磷酸钠缓冲液，pH 7.0~8.0；缓冲液B为0.75 M磷酸钾缓冲液，pH 7.0~8.0；

2、将固体蔗糖灭菌，使用缓冲液 D配制15%（w/v，g/mL）和45%（w/v，g/mL）的蔗糖溶液；

3、液氮研磨破碎蓝藻，得到蓝藻粉末，避光保存；

4、在缓冲液D中加入终浓度为0.1 mM的苯甲基磺酰氟（PMSF）、0.1 mM的苄脒和0.1mM的6-氨基己酸，用其悬浮蓝藻粉末，避光条件下4℃离心取上清；

5、在上清中加入Triton X-100 至终浓度为2%（v/v），在摇床轻轻震荡30~60 min，离心取中层红色液体，得到藻胆体粗提物；

6、用步骤2配制的蔗糖溶液制备15%~45%的连续蔗糖梯度，加入离心管总体积5%~10%的步骤5制备的紫色藻胆体粗提物，35000 rpm超速离心6~12小时，吸取35%蔗糖浓度界面处的紫色色条带即为完整的可以耐低温低盐藻胆体样品。

上述步骤1中，每升所述缓冲液A含300.41 g Na₂HPO₄•12H₂O，9.55 g NaH₂PO₄•2H₂O和10 mM EDTA，每升所述缓冲液B含160.9 g K₂HPO₄，6.12 g KH₂PO₄和10 mM EDTA。

在本发明的实施例中，用上述方法制备如无类囊体膜蓝藻Gloeobacter violaceus的藻胆体，获得了完整的可以耐低温低盐藻胆体样品。

与常规的蓝藻藻胆体体外纯化方法相比，本发明包含了下面的特殊处理步骤：在蔗糖梯度纯化的磷酸盐缓冲液中加入终浓度为0.0075~0.015%（w/v）的1,5-戊二醛（GA）和10~500 nM的BS3两种交联剂。

经过蔗糖梯度离心6~12个小时后，吸取梯度离心后得到的藻胆体条带，那么得到的藻胆体样品就可以耐低盐低温。经过实验证明：同时处于4℃和10 mM磷酸盐（低温低盐）的条件下，本发明得到的藻胆体可以在48 h内维持其稳定的结构，而不会解聚。该耐低温低盐的藻胆体可以应用于以下方面：1、冷冻电镜解析藻胆体（常温高盐）结构时存在解聚和衬度不好的问题，本发明耐低温低盐的藻胆体为解决这个问题提供了一种可能；2、高盐低温条件不利于光系统蛋白复合体的稳定，使得我们很难在体外研究藻胆体与光系统复合体的相互作用以及能量传递的机制，而耐低温低盐的藻胆体为解决这个问题提供了一种可能。

附图说明

图1. 本发明耐低温低盐的藻胆体样品蔗糖梯度离心纯化示意图。

图2. 本发明耐低温低盐藻胆体样品（A）和常规藻胆体样品（B），经过低温低盐处理后的颜色，可见A还维持完整藻胆体的紫色，而B已经变成了藻胆体解聚时的粉色。

图3. 本发明耐低温低盐藻胆体样品（A）和常规藻胆体样品（B）经过低温低盐处理后的荧光激发光谱，可见A还维持完整藻胆体的荧光光谱，而B已经变成了藻胆体解聚时的荧光光谱。

图4. 本发明耐低温低盐藻胆体样品（A）和常规藻胆体样品（B）经过低温低盐处理后，通过透射电镜观察到的负染样品，可知A还保持完整形态，而B已经解聚。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的%，如无特殊说明，均为质量百分含量。

无类囊体膜蓝细菌灰胞藻Gloeobacter violaceus PCC 7421，生长于BG11液体培养基中，以照明日光灯光源，光强为10 uE/m²·s，温度25℃，并通以含1％ CO₂（v/v）的空气。

每升BG11培养基含：1.5 g NaNO₃，0.075 g MgSO₄·7H₂O，0.036 g CaCl₂·2H₂O，0.040 g K₂HPO₄·3H₂O，0.006 g柠檬酸（Citric acid），0.006 g 柠檬酸铁铵（Ferricammonium citrate），0.001 g EDTA·Na₂，0.020 g Na₂CO₃，10 mL 0.5M的Hepes-NaOH(pH7.5)，10 g蔗糖b，1.0 mL 微量金属混合物（Trace metal mix）。其中微量金属混合物（Trace metal mix）含有：2.860 mg/L H₃BO₃，1.810 mg/L MnCl₂·4H₂O，0.222 mg/LZnSO₄·7H₂O，0.390 mg/L Na₂MoO₄·2H₂O，0.079 mg/L CuSO₄·5H₂O，0.0494 mg/L Co(NO₃)₂·6H₂O。

实施例1、耐低盐低温蓝藻藻胆体样品的制备

1、配置缓冲液 A（0.9 M磷酸钠缓冲液pH 8.0，1升含300.41 g Na₂HPO₄•12H₂O，9.55 g NaH₂PO₄•2H₂O和10 mM EDTA）和缓冲液 B（0.75 M磷酸钾缓冲液 pH 8.0，1升含160.9 g K₂HPO₄，6.12 g KH₂PO₄和10 mM EDTA），缓冲液 A和缓冲液 B为缓冲液 C的贮存液，使用时将缓冲液 A和缓冲液 B等体积混合即为缓冲液 C；

2、在缓冲液 C中加入终浓度为0.0075%（w/v，g/mL）的1,5-戊二醛（GA）和10 nM的BS3两种交联剂，制成缓冲液 D；

3、固体蔗糖灭菌，使用缓冲液 D配制好15%（w/v，g/mL）和45%（w/v，g/mL）的蔗糖溶液；

4、取1 g无类囊体膜蓝细菌灰胞藻Gloeobacter violaceus PCC 7421，液氮研磨破碎，后面的步骤尽量避光；

5、用8 mL 缓冲液 D（提前加入终浓度为0.1 mM的苯甲基磺酰氟（PMSF）、0.1 mM的苄脒和0.1 mM的6-氨基己酸）悬浮研磨好的蓝藻粉末，4℃ 3000 rpm离心10 min取上清；

6、加入Triton X-100 至终浓度为2%（v/v），在摇床轻轻震荡30 min，20000 rpm离心30 min，取中层红色液体，注意不要取到上层和下层的杂质；

7、用缓冲液 D制备15%~45%的连续蔗糖梯度，加入离心管总体积10%的步骤6制备的紫色藻胆体粗提物，35000 rpm超速离心6~12小时；

8、用带弯钩的针头吸取35%蔗糖浓度界面处的紫色色条带即为完整的可以耐低温低盐藻胆体样品（图1）。

实施例2、耐低盐低温蓝藻藻胆体样品的制备

制备步骤同实施例1，只是在步骤2加入0.015%（w/v）的1,5-戊二醛（GA）和500 nM的BS3两种交联剂，同样得到完整的可以耐低温低盐的藻胆体样品。

对比例1、常规蓝藻藻胆体样品的制备

1、同实施例1一样配置缓冲液 A和缓冲液 B，缓冲液 A和缓冲液 B为缓冲液 C的贮存液，使用时将缓冲液 A和缓冲液 B等体积混合即为缓冲液 C；

2、固体蔗糖灭菌，使用缓冲液 C配制好15%（w/v）和45%（w/v）的蔗糖溶液；

3、取1 g无类囊体膜蓝细菌灰胞藻Gloeobacter violaceus PCC 7421，液氮研磨破碎，后面的步骤尽量避光；

4、用8 mL 缓冲液 C（提前加入终浓度为0.1 mM的苯甲基磺酰氟（PMSF）、0.1 mM的苄脒和0.1 mM的6-氨基己酸）悬浮研磨好的蓝藻粉末，4℃ 3000 rpm离心10 min取上清；

5、加入Triton X-100 至终浓度为2%（v/v），在摇床轻轻震荡30 min，20000 rpm离心30 min，取中层红色液体，注意不要取到上层和下层的杂质；

6、用缓冲液 C制备15%~45%的连续蔗糖梯度，加入离心管总体积10%的步骤5制备的紫色藻胆体粗提物，35000 rpm超速离心6~12小时；

7、用带弯钩的针头吸取35%蔗糖浓度界面处的紫色色条带即为藻胆体样品。

实施例2、验证实施例1中样品可在低温低盐条件下稳定存在

将实施例1中纯化得到的藻胆体样品A和目前常规纯化（对比例1）得到的藻胆体样品B，分别在10 mM，pH8.0的磷酸盐缓冲液中，4℃透析过夜，然后检测这两种藻胆体样品经过低温低盐处理后的完整性。经过外观颜色观察（图2）、荧光光谱（图3）和透射电镜负染检测（图4），证明了实施例1中的藻胆体样品A经过低温低盐处理后，依然是完整的。而常规方法纯化的藻胆体样品B，经过低温低盐处理后已经解聚。从而证明，本发明的这种藻胆体样品制备方法，可以使得藻胆体在低温低盐的条件下稳定存在。

Claims

1.一种耐低温低盐的蓝藻藻胆体样品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）预先配置缓冲液A和缓冲液B，使用时将缓冲液A和缓冲液B等体积混合，并添加终浓度为0.0075%~0.015% w/v的1,5-戊二醛和10~500 nM的BS3两种交联剂，得到缓冲液D，其中：缓冲液A为0.9 M磷酸钠缓冲液，pH 7.0~8.0；缓冲液B为0.75 M磷酸钾缓冲液，pH 7.0~8.0；

2）将固体蔗糖灭菌，使用缓冲液 D配制15% w/v和45% w/v的蔗糖溶液；

3）液氮研磨破碎蓝藻，得到蓝藻粉末，避光保存；

4）在缓冲液D中加入终浓度为0.1 mM的苯甲基磺酰氟、0.1 mM的苄脒和0.1 mM的6-氨基己酸，用其悬浮蓝藻粉末，避光条件下4℃离心取上清；

5）在上清中加入终浓度为2% v/v的Triton X-100，在摇床轻轻震荡30~60 min，离心取中层红色液体，得到藻胆体粗提物；

6）用步骤2）配制的蔗糖溶液制备15%~45%的连续蔗糖梯度，加入离心管总体积5%~10%的步骤5）制备的藻胆体粗提物，35000 rpm超速离心6~12小时，吸取35%蔗糖浓度界面处的紫色色条带即为完整的耐低温低盐的藻胆体样品。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1）中，每升所述缓冲液A含300.41 gNa₂HPO₄•12H₂O，9.55 g NaH₂PO₄•2H₂O和10 mM EDTA，每升所述缓冲液B含160.9 g K₂HPO₄，6.12 g KH₂PO₄和10 mM EDTA。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述蓝藻为无类囊体膜蓝藻Gloeobacter violaceus。

4.根据权利要求1~3任意一项所述的制备方法制备得到的耐低温低盐的蓝藻藻胆体样品。