CN105154474B - 红色纳米硒的生物制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明就是要提供一种红色纳米硒的生物制备方法，以小球藻为生物材料，以含硒无机盐为硒的来源，其包括将小球藻接种于含硒盐的培养基中，在光照条件下进行培养，控制培养温度为22‑28℃，制备红色纳米硒。其针对现有技术的不足，采用以小球藻为培养材料，将其培养在含硒盐的BG‑11培养基中，在一定的光温条件下进行红色纳米硒的制备，不仅能够降低纳米硒的生产成本，还为蛋白核小球藻开辟了新的药用价值和保健用途；且在生产过程中对环境友好，不会造成环境污染。

Description

红色纳米硒的生物制备方法

技术领域：

本发明涉及一种纳米硒的制备方法，特别是一种红色纳米硒的生物制备方法。

技术背景：

硒是一种对人体具有重要生物学效应的微量元素。硒以硒代半胱氨酸的形式存在于多种硒蛋白中，硒不仅参与白内障、克山病和大骨节病等地方性疾病的生理、病理过程，还与多种肿瘤的发生密切相关。

人体对不同硒源的吸收和利用效率差别很大。无机硒源吸收快，半数至死量低，安全范围窄；有机硒源相对安全但吸收缓慢，机体利用率低；一般的单质硒不能被生命体吸收。红色纳米硒是一种特殊的单质硒，有研究表明，纳米硒吸收快、半衰期长、使用安全。因此纳米硒兼有无机硒和有机硒的优点，是预防和治疗硒缺乏疾病的理想硒源。

人们在研究生物对硒盐和碲盐的降解作用时发现，细菌可以还原某些硒化合物而出现红色，而某些碲化合物被还原则产生深灰色物质。到2002年，已经有很多有关细菌、真菌和酵母还原无机态硒的文献报道。比如自养的红核红螺菌(Rhodospirillum rubrum)在缺氧并且向光生长的条件下，可以将亚硒酸钠为还原单质硒。Simona报道了在黄芪属豆类根系统中获得了一种菌株，能将四价的硒还原为零价的硒，在液体培养基中，硒浓度为0.5mmol/L的亚硒酸钠在52h内被完全还原为单质硒；当再次添加亚硒酸钠到这一培养基内，浓度为2.0mmol/L的亚硒酸钠在120h后，经测定有87％的亚硒酸钠被还原；TEM和EDX分析结果表明，该菌的胞外和胞内均出现颗粒状的单质硒。

当前有关微生物还原硒化物的报道多数还停留在实验研究上，在实际生产和应用中普遍采用化学法制备纳米硒。化学法制备纳米硒时，还原剂和硒存在当量关系，工艺复杂，成本较高。

我们发现小球藻能将无机态的硒(如亚硒酸钠等)转化为红色单质硒，而采用小球藻还原无机态硒即制备纳米硒，特别是红色纳米硒或纳米硒还未见报道。利用小球藻(Chlorella pyrenoidosa)作为制备纳米硒的生物材料，不仅能够降低纳米硒的生产成本，还为蛋白核小球藻开辟了新的药用和保健价值。

发明内容：

本发明就是要提供一种红色纳米硒的生物制备方法，其针对现有技术的不足，采用以小球藻为培养材料，将其培养在含硒盐的BG-11培养基中，在一定的光温条件下进行红色纳米硒的制备，不仅能够降低纳米硒的生产成本，还为蛋白核小球藻开辟了新的药用价值和保健用途；且在生产过程中对环境友好，不会造成环境污染。

本发明提供一种红色纳米硒的生物制备方法，以小球藻为生物材料，以含硒无机盐为硒的来源，其包括将小球藻接种于含硒盐的培养基中，在光照条件下进行培养，控制培养温度为22-28℃，制备红色纳米硒。

本发明所述的一种红色纳米硒的生物制备方法，其是将小球藻接种于含硒盐的培养基中，控制培养基中的硒浓度为80-120mg/L，含小球藻的培养液的pH为6-7.2，蛋白核小球藻液浓度A₆₈₅为0.8-3.0。

本发明所述的一种红色纳米硒的生物制备方法，优选是处于对数生长期过渡到稳定期生长期(即对数-稳定期)的小球藻藻细胞；将处于对数-稳定期的小球藻液，接种于含亚硒酸钠的培养基中，控制所述对数-稳定期的小球藻液的浓度A₆₈₅值在2.2-2.6，培养基中硒的浓度为90-110mg/L，培养基中小球藻液的pH为6.7-7.1，于光照培养箱中培养，控制培养时温度为23-27℃，培养时间2-23天，控制光照强度为0-7200Lx，并在培养时每日摇动若干次。

本发明所述小球藻为蛋白核小球藻，所述蛋白核小球藻为完整细胞和/或破碎细胞，优选是完整细胞的蛋白核小球藻。

本发明所述光照条件是控制光照强度为1440-6000Lx；优选光照条件是光照强度为4320Lx。

本发明提供一种红色纳米硒的制备方法，以小球藻为生物材料，培养在含硒盐的培养基中在光照存在的条件下进行纳米硒的制备，不仅能够降低纳米硒的生产成本，还为蛋白核小球藻开辟了新的药用和保健价值；且在生产过程中对环境友好，不会造成环境污染。生产制造成本低，在最适培养条件下生成红色纳米硒的硒元素的转化率平均达到68％以上，生产工艺简单。

附图说明：

图1，利用本发明方法制备的比例尺为500nm时蛋白核小球藻液中的单质硒；

图2，为比例尺为1μm时蛋白核小球藻液中的单质硒。

具体实施方式：

通过下述实施例对本发明作进一步的详细说明，其将有助于进一步理解本发明技术方案，但不限制本发明的内容。

实施例：本发明实施例中所述各材料均可通过市售方法获得；

本发明所用材料与方法：

本发明所用藻种为蛋白核小球藻购于中科院水生生物研究所，编号为FACHB-9；

所用器材：高速冷冻离心机、pH计、紫外可见分光光度计、生物洁净工作台、高压灭菌锅、光照培养箱、透射电子显微镜均为市售实验室常用仪器；

使用原料：亚硒酸钠、钼酸钠、浓硫酸、高氯酸、浓盐酸、抗坏血酸、溴化氢、苯酚、DAB(3,3’-二氨基联苯胺)、甲苯等均使用分析纯；

实验用原料配置：2.19mg/mL的亚硒酸钠溶液即每1ml溶液含有Se1mg，其配置方法是准确称量2.19g亚硒酸钠溶于200ml去离子水后定容至1L；其他浓度的亚硒酸钠溶液通过按比例稀释1g Se/L的亚硒酸钠溶液获得；还可采用现有方法进行配置；

消化液：称量10g钼酸钠，溶于150ml浓硫酸，待溶液冷却至室温后，加入200ml高氯酸后定容至1L；

HBr-Br2溶液：30ml Br2溶于100mlHBr，避光储存；

5％苯酚溶液：称量5g苯酚，在60℃水浴中溶于100ml去离子水，避光储存；

DAB-HCl溶液：准确称量0.3gDAB，溶于10ml去离子水后，加入2ml浓度为1M的HCl，现配现用并在避光处放置。

本发明实施方式中的样品预处理采用下述方法：为了测定单质硒的含量，首先测量单质硒和有机硒的总含量，样品处理方法是取小球藻液于4000rpm离心5min，弃去上清液，取沉淀；再测量有机硒的含量，样品处理方法是取小球藻液在4000rpm离心5min，弃去上清液，加蒸馏水后反复冻融三次，再以4000rpm离心5min，弃沉淀，取上清；最后是测量未转化的残留硒，样品处理方法是取小球藻液在4000rpm离心5min，弃去沉淀，取上清。

将以上沉淀或上清分别转移到50ml圆底烧瓶中，加入适量消化液(每2g湿小球藻对应10ml消化液)和沸石，在电炉上加热5min至溶液清亮后，关闭电炉静置20分钟。溶液完全冷却后转移至250ml烧杯中，分别加入5ml浓盐酸和2g抗坏血酸，静置1h使硒单质完全沉淀，过滤并收集沉淀，然后用1mlHBr-Br2溶解，加蒸馏水至20-25ml，再加几滴5％苯酚溶液去除溶液里剩余的Br2，用DAB法测定硒的含量。

细胞破碎和光照强度的设定：本发明采用蛋白核小球藻的细胞破碎采用“纤维素酶+超声法”；分别将破碎细胞和完整细胞接种在硒浓度为150mg/L的BG-11培养基中，控制培养基的pH为7，蛋白核小球藻液浓度A₆₈₅为0.90，培养温度为25℃；光照强度为0-7200Lx，每组间梯度为1440Lx，共分为6组；

培养时每日手摇三次，记录溶液变红所经历时间以及单质硒含量。硒转化率按如下公式计算：硒转化率＝单质硒含量/总硒含量×100％。

小球藻或称蛋白核小球藻的生长状态的划分：分别取处于不同生长期的蛋白核小球藻，迟缓期、迟缓-对数期、对数期、对数期-稳定期和稳定期，接种在硒浓度为150mg/L的BG-11培养基中，培养基pH为7，在光照培养箱中培养，温度为25℃，光照强度为4320Lx。每日手摇三次。记录溶液变红所经历时间，计算单质硒含量和硒转化率。

硒浓度和pH的梯度：取处于对数-稳定期的蛋白核小球藻藻液，所取藻液浓度A685为2.491，接种在硒浓度分别为50、100、200mg/L的BG-11培养基中，培养基pH值分别调为5、6、7、8、9、10、11，在光照培养箱中培养，温度为25℃，光照强度为4320Lx。其中pH每天需重新调节一次，记录溶液变红所经历时间，计算单质硒含量和硒转化率。

结果与分析：

在固体和液体培养基中红色纳米硒的形成，蛋白核小球藻可在含硒的培养基中生长，当硒浓度高于100mg/L时，固体培养基表面的小球藻变成红色；改为液体培养基培养时，藻液颜色随培养时间延长而逐渐变红，取红色藻液4000rpm离心1min，红色物质全部能沉淀，上清液无色。分析表明，红色物质是一种单质硒即红色纳米硒，其粒径尺寸小于200nm，具有潜在的药用价值。

光照强度和细胞完整程度制备红色单质硒的情况，在无光条件下，藻液变红所需的时间破碎细胞比完整细胞要短得多，但完整细胞的单质硒的转化率更高；破碎细胞培养5d后变红，有6.7％的硒转化为单质硒；在同样条件下，完整细胞培养23d后才变红，但有14.6％的硒转化为单质硒。

在有光照条件下，随着光照强度的增加，破碎细胞藻液变红所需的时间变短，当光照强度为1440Lx时，4d后变红，当光照强度为2880Lx时，3d后变红，当光照强度为4320-7200Lx时，2d后就变红；单质硒即红色纳米硒的转化率为6.9-8.0％，且随着光照强度的增加变化不明显。

在有光照条件下，完整细胞藻液变红所需的时间较无光条件下显著缩短，随着光照强度的增加，变红所需的时间变短，当光照强度为1440Lx时，7d后变红，当光照强度为2880Lx时，5d后变红，当光照强度为4320-7200Lx时，3d后就变红；在同样条件下，完整细胞单质硒的转化率比破碎细胞高得多，达25.4-43.6％，且单质硒的转化率随着光照强度的增加显著提高。

为了比较不同生长状态的小球藻对硒的转化效率，分别取处于迟缓期、对数期和稳定期的小球藻细胞进行试验，结果表明：在相同的培养条件下，处于迟缓期的小球藻需要1个月的时间，藻液才会出现肉眼能观察到的红色；处于对数期的藻细胞在10d内都可以产生单质硒，转化率从4.6％到40.0％不等；对数-稳定期和稳定期的藻细胞，其藻液能够在1d内观察到红色，且转化率也比迟缓期和对数期都高。因此对数-稳定期和稳定期的蛋白核小球藻更适合用于转化硒；

比较藻液浓度和硒的转化率，发现稳定期的藻液浓度最高是迟缓期藻液浓度的10.4倍，但稳定期的硒的转化率却是迟缓期的161.7倍，这就说明，稳定期的小球藻转化硒的优势不仅是因为稳定期的藻细胞浓度大，更主要的是处于稳定期的藻细胞转化活性更高，转化速度也快得多。综合考虑培养时间和转化率的关系，以对数生长期过渡到稳定期生长期(即对数-稳定期，培养19d左右)为生成红色单质的最适期。

硒浓度和pH对生成红色单质的影响：

培养基的pH对小球藻的生长发育及其生理生化我均会产生重要影响。研究表明，在三种不同硒浓度的培养基中，pH为7时，转化速度最快，藻液变红的天数分别为2、2和1.5天(d)；在三种硒浓度下，转化率随pH增大过程中先升高后降低，最高点在pH6-7范围内，对于50mg/L、100mg/L的总硒量，最高点在pH为6处，对于200mg/L的总硒水平则是pH为7处。由于适宜小球藻生长的环境为碱性(pH9-10)，在酸性和中性环境中小球藻的生长将受到抑制，而转化硒的最适pH为6-7。

表1，本发明方法在不同pH下蛋白核小球藻产生红色单质硒的速度和效率

利用本发明方法制备红色单质硒：

利用本发明方法取对数-稳定期的小球藻液，控制其浓度A₆₈₅值为2.5左右，亚硒酸浓度为100mg/L，蛋白核不球藻液的pH控制在7，于光照培养箱中培养，控制培养温度25℃，平均光照强度为4320Lx，并每日手摇4次，培养3天后，用DAB-紫外法测定硒元素的转化率；结果表明，本发明方法硒元素的转化率平均可达68.0％；

为了验证通过本发明方法蛋白核小球藻制备的单质硒处于纳米级别，采用TEM检测，可用现有方法进行检测，也可按如下方法进行，即在以上最佳培养条件下培养蛋白核小球藻3天(d)后，吸取上层悬浊液1ml，用JEM-100SX透射电子显微镜进行检测；透射电镜图显示，通过小球藻制备的单质硒微量为均匀的球形，这与Oremland的报道相吻合，说明本发明方法所得的单质硒是通过生物方法转化得来，而不是亚硒酸钠与培养基或小球藻生长过程中释放的某些物质通过简单的化学方法得到的。藻液中的单质硒的粒径范围在100-200nm内，符合纳米级别要求。

说明：采用单因素实验看影响蛋白核小球藻转化单质硒效率的因素，结果表明：完整的细胞结构有利于蛋白核小球藻转化单质硒；最佳光照强度为平均4320Lx；处于对数-稳定期的蛋白核小球藻的转化速度更快；最佳藻液pH为7，并且需要在处理过程中全程保持；当藻液的A685为2.4-2.6时，最佳的硒浓度为100mg/L。将所有条件换成单因素实验所确定的条件后，制得的单质硒经过透射电子显微镜检测，结果显示，制得的单质硒呈球形，粒径在100-200nm范围内。

Claims (4)

1.一种红色纳米硒的生物制备方法，以小球藻为生物材料，以含硒无机盐为硒的来源，其包括将小球藻接种于含硒盐的培养基中，在光照存在条件下进行培养，控制培养温度为22-28℃，制备红色纳米硒；

将小球藻接种于含硒盐培养基中，控制培养基中的硒浓度为80-120mg/L，含小球藻的培养液的pH为6-7.2，小球藻液浓度A₆₈₅为 0.8-3.0；控制光照强度为1440-7200 Lx；所述小球藻为蛋白核小球藻，所述蛋白核小球藻为完整细胞壁结构。

2.依据权利要求1所述的一种红色纳米硒的生物制备方法，其特征是将对数-稳定期的小球藻液，接种于含亚硒酸钠的培养基中，控制所述对数-稳定期的小球藻液的浓度A₆₈₅值在2.2-2.6，培养基中硒的浓度为90-110 mg/L，培养基中小球藻液的pH为6.7-7.1，于光照培养箱中培养，控制培养时温度为23-27℃，培养时间2-23天，并在培养时每日摇动若干次。

3.依据权利要求1所述的一种红色纳米硒的生物制备方法，其特征是所述光照条件是控制光照强度为1440-6000 Lx。

4.依据权利要求1所述的一种红色纳米硒的生物制备方法，其特征是所述光照条件是控制光照强度为4320Lx。