JP2014509735A

JP2014509735A - 電気的化学発光免疫測定法

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Publication number: JP2014509735A
Application number: JP2013558296A
Authority: JP
Inventors: チュンチン
Original assignee: ベイジンユニジャテクノロジーインコーポレイティド
Priority date: 2011-03-16
Filing date: 2012-03-13
Publication date: 2014-04-21
Anticipated expiration: 2032-03-13
Also published as: CN102680456A; KR20130126741A; JP5753282B2; WO2012122929A1; KR101545529B1; CN102680456B; US10024861B2; US20140072963A1

Abstract

本発明は、被験Ｒｕ（ｂｐｙ）標識したタンパク質−一次抗体、ビオチン化タンパク質−二次抗体、及び被験サンプルの完全な反応；抗原、抗体、及び磁性粒子を含む複合体を形成するためのストレプトアビジンコーティングした磁性粒子の添加；磁性粒子による電極表面への吸着；ジブチルエタノールアミン溶液の添加を用いた、電気化学法により試験する電気化学発光免疫測定法を開示する。本発明は、対応する電気化学発光免疫測定検出キットも開示する。

Description

本願は、「電気化学発光免疫測定法」と題した２０１１年３月１６日に中国特許庁に出願された中国特許出願第２０１１１００６３８９３．０号に基づいて優先権を主張する。この内容は、その全体において参照により組み込まれる。

発明の分野
本発明は、免疫学の分野、特に電気化学発光免疫測定法に関する。

発明の背景
化学発光免疫測定は、トレーサーシグナルとして標識した発光体を用いることにより確立された非放射性免疫測定であり、高い感度、広い線形範囲、迅速な分析速度、簡便な操作、及び自動化が可能であるという利点を有する。

近年、臨床診療に一般に用いられている化学発光免疫試薬は、以下である。
１．アルカリホスファターゼ及びホースラディッシュペルオキシダーゼのルミノールとの反応システム。これの主に不都合な点は、アルカリホスファターゼ及びホースラディッシュペルオキシダーゼの活性が温度変化に非常に影響を受けやすく、実験結果が環境変化に非常に影響を受けやすいことである。
２．アクリジニウムエステル及びこの誘導体のアルカリ溶液中での過酸化水素との発光反応。主に不都合な点は、それが完全な自動化装置上でのみで検出することができる短い発光時間を有するフラッシュ発光であることである。結果の算出のためのモードは複雑であり、実験結果は安定しない。
３．ピリジンルテニウム及びトリプロピルアミンの電気化学発光システム。

電気化学発光（ＥＣＬ）反応は、電極の表面上での電気化学により引き起される特異的な化学発光反応である。抗原−抗体複合体及びピリジンルテニウムの結合体は、トリプロピルアミンの存在下の電気化学により励起され、還元反応が光子放出を引き起し、光電子倍増管によりこれを回収することができる。このプロセスは繰り返し行なわれ、多くの光子を産生し、これは光シグナルを増幅する。電気化学発光分析において一般に用いられる標識は、標識された抗体又は抗原を生産するために、異なる化学的構造を有する抗体又は抗原分子と結合することができるものである。

ピリジンルテニウムは、水溶性であり、高い安定性を有し、これは効率的で安定的な電気化学発光反応を確実にし、且つバックグラウンドノイズから干渉を回避する。ピリジンルテニウム対免疫グロブリンの結合の分子比が２０を超える場合、可溶性及び抗体の免疫学的活性はなおも影響を受けず、分子量は低く、立体障害も少なく、小分子核酸でさえ標識することができる。

近年、利用可能な電気化学発光法は、反応物として主にトリプロピルアミンＴＰＡを用いる。トリプロピルアミンの不都合な点は、該反応が緩徐で有り、その濃度が高く、電極材料により大きく影響を受け、発光効率に限界があり、コストも最適でないことである。

発明の概要
本発明の解決すべき技術的課題は、高い発光効率、迅速な反応、及び幅広い適用可能性を有する電気化学発光免疫測定法を提供することである。

本発明の上記の目的を達成するために、本発明は、以下の技術的解決策を提供する。

電気化学発光免疫測定法は、以下の工程を含む。

工程１：被験タンパク質に対するピリジンルテニウム標識した一次抗体、及び被験タンパク質に対するビオチン化した二次抗体を被験サンプルと十分に反応させる、あるいは被験タンパク質に対するピリジンルテニウム標識した抗体、及び被験ビオチン化タンパク質を被験サンプルと十分に反応させる工程。

工程２：ストレプトアビジンでコーティングした磁性粒子を添加し、抗原、抗体及び磁性粒子を含む複合体を形成するように反応させ、該反応液をフローセルに吸引させ、ここで前記抗原、抗体及び磁性粒子を含む複合体は、磁性粒子を介して電極の表面上に吸着される、工程。

工程３：ジブチルエタノールアミン溶液を添加し、電圧の印加によりＥＣＬ反応を開始し、光学検出器により走査される光シグナルを回収する工程。

工程４：濃度勾配の標準溶液を作製し、発光強度の値の変化の対数及び濃度の対数に従って用量反応曲線をプロットし、そして被験サンプル中の被験タンパク質の濃度を算出により得る工程。

ＥＣＬについての基本的な原理は、反応において発光基質及び構成成分が酸化されるために、電極の表面上で電子を失うことである。電子供与体は、Ｈ⁺を失い、強力な還元剤となり、これは発光基質を励起状態に還元し、その後発光基質は光子を放出して基底状態に戻る。このプロセスは、電極の表面上で繰り返し行なわれ、光子は、通常、基質濃度を一定に維持するために、連続的に放出される。

トリプロピルアミン（ＴＰＡ）の不都合な点は、反応が緩徐であり、濃度が高く、電極材料により大きく影響を受けることである。ジブチルエタノールアミンの発光効率は、ＴＰＡの発光効率よりも明らかに優れており、白金電極及び金電極上でのこれらの発光強度を比較するダイヤグラムを図５に示す。ジブチルエタノールアミンＤＢＡＥは、共反応物として選択され、そしてピリジンルテニウムは、免疫反応又はＥＣＬ反応による電気化学発光免疫測定のための抗原若しくは抗体、又は核酸を標識するために、本発明において標識として用いられる。

本発明のピリジンルテニウムの構造は、以下の通りである。

ジブチルエタノールアミンの構造は、以下の通りである。

本発明では、ピリジンルテニウムは、抗原又は抗体を標識するための標識として用いられ、免疫反応及びＥＣＬ反応による電気化学発光免疫測定を行なう。本発明の方法は、化学反応と電気化学反応の二つの部分に分けられる。本発明の実施形態によれば、化学反応の部分は試験管中で行なわれ、電気化学反応の部分はフローセル中で行なわれる。

電極の表面上での電気化学により引き起される特異的な化学発光反応のために、Ａｂは電気化学発光試薬であるピリジンルテニウムにより標識され、固相担体は、サンプル中の対応する抗原又は抗体と特定のモードの免疫学的反応により、複合体を形成するために抗原又は抗体でコーティングされる。標識と結合した複合体は、単離の技術により遊離の標識から分離される。被験Ａｇ又はＡｂは、電極上のピリジンルテニウムの発光強度に従って、定量的に／定性的に決定される。

本発明では、磁性粒子は固相担体として選択される。固相担体の磁性のために、結合した標識から遊離の標識を分離する際に、磁石により引きつけることのみが必要であり、簡便且つ迅速に操作することができる。本発明の特定の実施例では、該固相担体は、２．８μｍの直径を有し、磁性を有するポリスチレン粒子である。

実施例として血清サンプル中のＴＳＨを試験するために、本発明の方法において、活性化されたピリジンルテニウムと結合したＴＳＨに対する抗体、及びビオチンと結合したＴＳＨ抗体をインキュベートし、被験血清と反応させ、その後ストレプトアビジンでコーティングした磁性粒子を添加し、その結果、ビオチンとアビジンのコンジュゲーションにより、磁性粒子、被験抗原、及びＴＳＨ抗体は一緒に連結し、「サンドイッチ」を形成する。

特定の実施例では、形成されるストレプトアビジンでコーティングしたピリジンルテニウム−抗体−抗原−ビオチン化抗体−磁性粒子の複合体は、蠕動ポンプにより測定フローセルに吸引される。複合体は、作用電極の下に位置する磁石により、磁性粒子を介して電極の表面上に吸着される一方で、遊離のビオチン化抗体、及びピリジンルテニウムと結合した遊離のＴＳＨ抗体を含む遊離のＴＳＨ抗体は、測定セルの外に吐き出される。

ジブチルエタノールアミンＤＢＡＥは、蠕動ポンプにより添加され、電圧が印加され、ＥＣＬ反応が開始される。このプロセスは、電極の表面上で繰り返し行なわれ、多くの光子を産生する。光強度は、光電子倍増管を用いて検出され、これらの光強度は、ピリジンルテニウムの濃度と線形の関係性を有する。これらに基づき、被験サンプル中のＴＳＨの含有量が決定される。

特定の実施例では、本発明に用いられる固相担体は、２．８μｍの直径を有する磁性ポリスチレン粒子であり、プレート型と比べて、反応面積が、２０〜３０倍まで拡張され、吸着効率が高いという特徴を有し；さらに、液相と同様の方法で反応に関与するために液体中で均一な懸濁液が形成され、これは一般的に反応速度を著しく加速する。

ストレプトアビジン及びビオチンは、検出の効果を増幅するために用いられる。１分子のストレプトアビジンは、４分子のビオチンと結合することができる。本発明の特定の実施形態では、ストレプトアビジンは、ビオチンと結合することができる一般的な固体担体を形成するために、磁性粒子上に均一に、しっかりとコーティングされる。ストレプトアビジンコーティングした磁性粒子が、ビオチン化抗原又は抗体と接触する場合、該抗原又は抗体は、磁性粒子上に直ちにコーティングされる。結合した状態における抗原又は抗体は、電磁場を用いた磁性により、遊離の状態のものと分離される。これは、簡便且つ迅速で有り、完全な自動化により正確に達成され、一方で標識の再生利用が達成される。加えて、発光時間が長く、強度は高く、発光は容易に検出される。

タンパク質及びポリペプチド抗原を検出する方法は、主に二重抗体サンドイッチ法及び競合法である。二重抗体サンドイッチ法は、タンパク質高分子抗原の決定に一般的に用いられる。しかしながら、これらが一つのエピトープのみを有する、あるいは分子が小さすぎる場合、一つの抗体と結合後に立体障害のために別の抗体と結合することができないため、一つのエピトープのみを有する小分子ホルモン、薬物等は、二重抗体サンドイッチ法を用いた決定に適さない。

本発明の方法では、競合阻害法を、小分子抗原、例えば遊離トリヨードチロニンＦＴ３を検出するためにさらに用いることができる。競合阻害法の原理は、サンプル中の抗原を、固相抗体と結合する標識した抗原の量と競合させえることである。サンプル中の抗原の含量が高い場合、固相上に結合する標識した抗体の含量は低い。

本発明の方法では、ピリジンルテニウムで標識した抗原−抗体複合体、ストレプトアビジン及びビオチンのシステム、及びジ−ｎ−ジブチルエタノールアミンが用いられ、免疫反応及び電気化学反応がタンパク質含量の検出を行なうために適用され、これは、高い感度、高い発光効率により特徴付けられ、腫瘍マーカータンパク質及びホルモン等の様々なタンパク質の検出に好適な、重要な非放射性免疫測定法である。

好ましくは、本発明の方法は、以下の種目：Ｔ３トリヨードチロニン、ＡＳＡ抗精子抗体、トロポニンＩ、Ｔ４チロキシン、ＡＣＡ抗カルジオライピン抗体、ＣＫＭＢ、ＴＳＨ、ＡＥＡ抗子宮内膜抗体、ＦＴ３遊離トリヨードチロニン、ＡＯＡ抗卵巣抗体、ＦＴ４遊離チロキシン、ＡＴＢ抗トロホブラスト抗体、抗ＴＭ甲状腺ミクロソーム抗体、ＺＰ抗透明帯抗体、抗ＴＧ抗チオグロブリン抗体、抗ＨＣＧ抗体、ヒト胎盤性ラクトゲン、抗ＴＰＯ甲状腺ペルオキシダーゼ抗体、ＨＣＧ、ＴＯＸトキソプラズマ抗体、ＦＳＨ、ＡＦＰ α胎児性タンパク質、ＣＥＡ癌胎児性抗原、ＰＳＡ前立腺特異抗原、ＦＰＳＡ遊離前立腺特異抗原、ＣＭＶサイトメガロウイルス抗体、ＬＨ黄体化ホルモン、ＨＳＶ−１単純ヘルペスウイルス抗体、ＰＲＬプロラクチン、ＨＳＶ−２単純ヘルペスウイルス抗体、ＴＥＳテストステロン、ＲＶルベラウイルス抗体、ＰＲＯプロゲステロン、フェリチン、ＴＯＸ−Ａｇトキソプラズマ循環抗原、Ｅ２エストラジオール、ＣＡ１２５、Ｅ３エストリオール、ＣＡ１５３、ＣＡ１９９、ＨＢｓＡｇ、ＮＳＥニューロン特異的エノラーゼ、ＨＢｓＡｂ、ＣＡ５０、ＨＢｅＡｇ、β２ミクロブロブリン、ＨＢｅＡｂ、コクサッキーウイルス抗体、ＨＢｃＡｂ、ＢＧＰ骨Ｇｌａタンパク質、Ｄ−Ｐｙｒデオキシピリジノリン、ビタミンＤ、インスリン、ＰＣＩＩＩＩＩＩ型プロコラーゲン、Ｃ−ペプチド、ＩＶ型コラーゲン、インスリン抗体、ＬＮラミニン、グルカゴン、ＨＡヒアルロン酸、ＧＡＤ−ＡＢグルタミン酸デカルボキシラーゼ抗体、Ｆｎフィブロネクチン、インフルエンザウイルスＢ、パラインフルエンザウイルス、ＥＢウイルス、麻疹ウイルス、肺炎マイコプラズマ、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、アスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）、ムンプスウイルス、ＨＣＶウイルス、インフルエンザウイルスＡ、ＨＩＶヒト免疫不全ウイルス、クラミジア・ニューモニエ（Chlamydia pneumoniae）、アデノウイルス、ＲＳＶ呼吸器合胞体ウイルス、エコーウイルス、及びプロガストリン放出ペプチド、ＣＹＦＲＡ２１−１、ＡＦＰ、ＡＰＴ、ＣＡ２４２、ＣＡ７２４、ＣＡ５０、ｆ−ＰＳＡ、ｔ−ＰＳＡ、遊離β−ｈＣＧ、及びＳＣＣＡを検出するために用いることができる。

ここで、ＡＦＰ、ＡＰＴは、原発性肝細胞癌及び胚細胞腫瘍に対するマーカーであり、これは、胚細胞癌、卵巣奇形腫、胃癌、胆道癌、膵臓癌等の他の関連する腫瘍においても見られる。

ＣＥＡは、消化管腫瘍に対する幅広いスペクトルを有するマーカーであり、肺癌、乳癌、甲状腺髄様癌等の他の関連する腫瘍においても見られる。

ＣＡ２４２は、膵臓癌、胃癌、結腸癌に対するマーカーであり、他の関連する腫瘍：肝臓癌、食道癌、及び肺癌においても見られる。

ＣＡ１２５は、卵巣癌に対するマーカーであり、肺癌、膵臓癌、乳癌、肝臓癌、消化管悪性腫瘍、子宮癌等の他の関連する腫瘍においても見られる。

ＣＡ１９９は、膵臓癌、胆管癌、結腸直腸癌に対するマーカーであり、肝臓癌、胆嚢癌、胆管癌等の他の関連する腫瘍においても見られる。

ＣＡ１５３は、乳癌に対する好ましいマーカーであり、肺癌、卵巣癌、肺癌、結腸直腸癌等の他の関連する腫瘍においても見られる。

ＣＡ７２４は、胃癌に対する最適な腫瘍マーカーであり、様々な検出率で、消化管癌、乳癌、肺癌、卵巣癌等の他の関連する腫瘍においても検出することができる。

ＣＡ５０は、膵臓癌及び結腸直腸癌に対するマーカーであり、胃癌、胆嚢癌、肝臓癌、肺癌、及び乳癌等の他の関連する腫瘍においても見られる。

ＮＳＥ及びプロガストリン放出ペプチドに主に関連する腫瘍は、小細胞肺癌であり、これらは、他の関連する腫瘍：肺腺癌及び肺大細胞癌においても見られる。

ＣＹＦＲＡ２１−１に主に関連する腫瘍は、肺扁平上皮細胞癌、子宮頸癌、食道癌であり、これは、膀胱癌、鼻咽喉癌、卵巣癌、及び消化管癌等の他の関連する腫瘍においても見られる。

ｆ−ＰＳＡ及びｔ−ＰＳＡに主に関連する腫瘍は、前立腺癌であり、これらは、特定の婦人科腫瘍及び乳癌等の他の関連する腫瘍においても見られる。

遊離β−ｈＣＧに主に関連する腫瘍は、婦人科腫瘍及び非精原精巣癌であり、これらは、乳房の腫瘍、精原精巣癌、肺癌、肝臓癌等の他の関連する腫瘍においても見られる。

ＳＣＣＡに主に関連する腫瘍は、頸部の扁平上皮細胞癌であり、これは、肺扁平上皮細胞癌、頭頸部扁平上皮細胞癌、食道癌、及び生殖器扁平上皮細胞癌等の他の関連する腫瘍においても見られる。

β２−ＭＧは、悪性腫瘍に対する補助的なマーカーであり、慢性リンパ球性白血病、リンパ肉腫、多発性骨髄腫等において特に見られ、肺癌、乳癌、消化管癌及び子宮頸癌においても増加が見られる。

本発明はさらに、以下の構成要素：被験タンパク質に対するピリジンルテニウム標識した一次抗体、被験タンパク質に対するビオチン化した二次抗体、ストレプトアビジンコーティングした磁性粒子、及びジ−ｎ−ジブチルエタノールアミン溶液を含む電気化学発光免疫測定のためのキットを提供する。

好ましくは、本発明のキットは、さらに洗浄溶液を含む。

より好ましくは、該洗浄溶液は、０．０５ｍｏｌ／Ｌリン酸バッファ（ｐＨ７．４）中０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０である。ｐＨ値が高い場合、光化学反応の発光効率は高い一方で、ｐＨ値が低い場合、検出結果は安定する。本発明の発明者らは、洗浄溶液のｐＨ値が７．４である場合、発光が効率的かつ安定的であり、臨床サンプルの決定のための要求を満たすことを見出している。

本発明のキットは、抗原及び抗体の量を著しく節約することができる。ジブチルエタノールアミンとピリジンルテニウムとの光化学反応の発光強度は、トリプロピルアミンを用いて生成される発光強度と比べて６倍であり、従って、より多くの光子が光電子倍増管により回収され、その結果キットの感度は高くなる。ごく少量の抗原及び抗体を用いた場合であっても値を検出することができ、その結果、抗体の量を効率的に減少させることができ、そしてキットのコストを１０％〜３０％減少させることできる。

先行技術と比べて、本発明の電気化学発光免疫測定法及びキットは、以下の利点を有する。
１．ストレプトアビジン及びビオチンの適用は、感度を増加させ、ｐｇ／ｍｌ又はｐｍｏｌのレベルに達し得る。
２．高い特異性、優れた再現性、ＣＶ＜５％。
３．７桁の程度に達する幅広い測定範囲。
４．毒性のない安定な試薬。
５．反応時間が短く、且つ測定を２０分以内に完了させることができる。

図１は、本発明の電気化学発光免疫測定法の原理の概要図である。図２は、本発明の電気化学発光免疫測定法により行なわれる電気化学的検出の概要図である。図３は、サンドイッチ法の用量反応曲線である。図４は、競合法の用量反応曲線である。図５は、白金電極及び金電極上でのジブチルエタノールアミン及びトリプロピルアミンの発光強度が比較されるダイヤグラムである。

詳細な実施形態
本発明は、電気化学発光免疫測定法を開示する。当業者は、参考のために本明細書の内容を用い、技術的パラメータを適切に改良することにより、達成することができる。具体的には、全ての同様の置換及び修正は、当業者に明らかであり、これらは、全て本発明に含まれるものと見なされる。本発明の方法及び適用は、好ましい実施例により記載され、そして本明細書に記載される本発明及び適用は、本発明の内容、趣旨及び範囲内から逸脱することなく、本発明の技術を達成及び適用するために、関係者により修正され、適切に変更され、あるいは組み合わせることができる。

当業者による本発明の技術的解決策の優れた理解のために、更に詳細な実施例と併せて本発明を下記に記載する。

実施例１：本発明によるキットの構成要素
本発明によるキットは、以下の構成要素：
試薬Ａ．電気化学発光試薬であるピリジンルテニウムにより標識した、被験タンパク質に対する一次抗体
試薬Ｂ．被験タンパク質に対するビオチン化した二次抗体
試薬Ｃ．ストレプトアビジンでコーティングした磁性粒子であって、前記磁性粒子は２．８μｍの直径を有するポリスチレン粒子である、磁性粒子
試薬Ｄ．ジブチルエタノールアミン溶液
を含む。

好ましくは洗浄溶液、より好ましくは０．０５ｍｏｌ／Ｌリン酸バッファ（ｐＨ７．４）及び０．０５％ＴＷＥＥＮ−２０も含まれ得る。該洗浄溶液は、当業者により作製することができる。

使用する場合、本発明のキット中のピリジンルテニウムと結合した抗体、及びビオチンと結合した抗体を、被験サンプルとインキュベートし、反応させた。その後、ストレプトアビジンでコーティングした磁性粒子を添加した。磁性粒子、抗原、及び被験抗体は、ストレプトアビジンとビオチンとの結合を介して一緒に連結し、「サンドイッチ」複合体を形成した。

該複合体を、作用電極の下に位置する磁石により、磁性粒子を介して、電極の表面上に引きつけた。標識と結合した複合体を、酸化鉄の磁性による電磁場分離を用いて遊離の標識から分離した。その後、ジブチルエタノールアミンＤＢＡＥを添加し、電圧を印加し、ＥＣＬ反応を開始させた。反応構成要素としての、発光基質であるピリジンルテニウム及びジブチルエタノールアミンは、電極の表面上で電子を喪失し、酸化された。電子供与体としてジブチルエタノールアミンは、一つのＨ⁺を喪失し、強力な還元剤となり、これは、酸化された形態の三価のルテニウムを励起された二価のルテニウムに還元し、後者は従って、光子を放出し、基底状態の発光基質に戻る。このプロセスは、電極の表面上で繰り返し行なわれ、多くの光子を産生する。光強度を、光電子倍増管を用いて検出した。これらの光強度は、ピリジンルテニウムの濃度と線形の関係を有する。被験Ａｇ又はＡｂは、電極上のピリジンルテニウムにより発光される光強度に基づいて、定量的／定性的に検出された。上記の反応原理の概要図を図１に示す。

実施例２：本発明の方法を用いて行われるヒト甲状腺刺激ホルモンＴＳＨの検出

該キットは、以下の構成要素：
試薬Ａ．ピリジンルテニウムにより標識したＴＳＨ抗体
試薬Ｂ．ＴＳＨに対するビオチン化した二次抗体
試薬Ｃ．ストレプトアビジンでコーティングした磁性粒子
試薬Ｄ．ジブチルエタノールアミン溶液
試薬Ｅ．洗浄溶液
を含む。

検出のための工程：
（１）試薬Ａ及びＢ、並びに被験サンプル血清を試験管に添加し、３７℃で８分間、液相条件下で反応させた。
（２）試薬Ｃを上記の反応液に添加し、３７℃で８分間、液相条件に近い条件下で反応させた。
（３）二つの工程の反応の完了後、試験管中の反応液をフローセルに導入した。

該フローセルは、電気化学発光のプロセスの間、全ての電気化学発光反応のための場所である。一つの励起電極はフローセルの下部に位置し、二つの検出電極は電極の両側の上部に取り付けられ、光シグナルの回収及び分析を容易にするために、光電子倍増管のための回収ポートが存在する。移動可能な磁石は、磁性粒子の引きつけのためにフローセルの下に取り付けられる。反応液は、蠕動ポンプによりフローセルに送り込まれる。磁性粒子は、磁石の引力により電極上に引きつけられ、他の反応物は、フローセルから流れ出、結合し、標識された抗体から遊離の標識された抗体の分離を達成する。

（４）試薬Ｄ（ジブチルエタノールアミン溶液）をフローセルに導入し、フローセルを充填した。

（５）磁石を取り除き、電極に電気を流した。ピリジンルテニウムとジブチルエタノールアミンの電気化学反応を行い、放出された光を光電子倍増管により回収し、光強度を決定した。

フローセル中の反応の概要図を図２に示す。

（６）濃度勾配の標準溶液を作製し、図３に示すように発光強度の値の変化の対数及び濃度の対数に従って用量反応曲線をプロットし、そして被験サンプル中の被験タンパク質の濃度を計算により得た。

（７）電圧を打ち切り、磁性粒子を除去した。試薬Ｅ（洗浄溶液）を添加し、測定フローチャンバーをリンスし、その後次のサンプルを測定した。

用量反応曲線を発光強度の値の変化の対数及び濃度の対数に従ってプロットし、これらは優れた線形の関係であることが見出された。サンプル中のＴＳＨの濃度を、用量反応曲線により推測した。

実施例３：本発明の方法を用いることにより行われるα胎児性タンパク質の検出
ヒト血清、アビジンと結合した磁性粒子、ビオチンと結合した抗体１、及びピリジンルテニウムと結合した抗体２を、反応ベッセルに添加した。ベッセルを３７℃で９〜１７分間インキュベートした。磁性による分離を行い、即ち未結合の材料は、洗い流され、そして上述の磁性粒子を含む抗原−抗体複合体を含む残った液体を、フローセルに導入した。ジプロピルエタノールアミンを添加し、還元反応が電極の存在下で行った。このプロセスの間、光は放出された。光子を、光電子倍増管により捕捉し、コンピューターにより分析及び増幅した。濃度勾配の標準溶液を作製し、発光強度の値の変化の対数及び濃度の対数に従って用量反応曲線をプロットした。結果を算出した。従って、被験血清中のα胎児性タンパク質の含量が決定した。

実施例４：本発明の方法を用いることにより行われる癌胎児性抗原の検出
該キットは、以下の構成要素：
試薬Ａ．癌胎児性抗原に対するピリジンルテニウム標識した抗体
試薬Ｂ．癌胎児性抗原に対するビオチン化した二次抗体
試薬Ｃ．ＳＡでコーティングした磁性粒子
試薬Ｄ．ジブチルエタノールアミン溶液
試薬Ｅ．洗浄溶液：０．０５Ｍリン酸バッファ（ｐＨ７．４）及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０
を含む。

検出のための工程：
（１）試薬Ａ及びＢ、並びに被験サンプル血清を試験管に添加し、３７℃で８分間、液相条件下で反応させた。
（２）試薬Ｃを上記の反応液に添加し、３７℃で８分間、液相条件に近い条件下で反応させた。
（３）二つの工程の反応の完了後、試験管中の反応液をフローセルに導入した。
（４）ジブチルエタノールアミン溶液をフローセルに導入し、フローセルを充填した。
（５）磁石を取り除き、電極に電気を流した。ピリジンルテニウムとジブチルエタノールアミンの電気化学反応を行い、放出された光を光電子倍増管により回収し、光強度を決定した。
（６）濃度勾配の標準溶液を作製し、発光強度の値の変化の対数及び濃度の対数に従って用量反応曲線をプロットし、そして被験サンプル中の被験タンパク質の濃度を計算により得た。
（７）反応物を完全にリンスするために洗浄溶液をフローセルに導入し、その後次のサンプルを測定した。

実施例５：競合法を用いた遊離トリヨードチロニンＦＴ３の検出
タンパク質及びポリペプチド抗原を検出する方法は、主に二重抗体サンドイッチ法及び競合法である。二重抗体サンドイッチ法は、タンパク質高分子抗原の決定に一般的に用いられる。しかしながら、これらが一つのエピトープのみを有する、あるいは分子が小さすぎる場合、一つの抗体と結合後に立体障害のために別の抗体と結合することができないため、一つのエピトープのみを有する小分子ホルモン、薬物等は、二重抗体サンドイッチ法を用いた決定に適さない。

本発明の方法では、競合阻害法を、小分子抗原、例えば遊離トリヨードチロニンＦＴ３を検出するためにさらに用いることができる。競合阻害法の原理は、サンプル中の抗原を、固相抗体と結合する標識した抗原の量と競合させることである。サンプル中の抗原の含量が多い場合、固相上に結合した標識した抗体の含量は少ない。

該キットは以下の構成要素：
試薬Ａ．ピリジンルテニウムで標識したＦＴ３抗原
試薬Ｂ．ＦＴ３抗原に対するビオチン化抗体
試薬Ｃ．ＳＡでコーティングした磁性粒子
試薬Ｄ．ジブチルエタノールアミン溶液
試薬Ｅ．洗浄溶液：０．０５Ｍリン酸バッファ（ｐＨ７．４）及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０
を含む。

検出のための工程
（１）試薬Ａ及びＢ、並びに被験サンプル血清を試験管に添加し、３７℃で８分間、液相条件下で反応させた。
（２）試薬Ｃを上記の反応液に添加し、３７℃で８分間、液相条件に近い条件下で反応させた。
（３）二つの工程の反応の完了後、試験管中の反応液をフローセルに導入した。
（４）ジブチルエタノールアミン溶液をフローセルに導入し、フローセルを充填した。
（５）磁石を取り除き、電極に電気を流した。ピリジンルテニウムとジブチルエタノールアミンの電気化学反応を行い、放出された光を光電子倍増管により回収し、光強度を決定した。
（６）濃度勾配の標準溶液を作製し、図４に示すように発光強度の値の変化の対数及び濃度の対数に従って用量反応曲線をプロットし、そして被験サンプル中の被験タンパク質の濃度を計算により得た。
（７）反応物を完全にリンスするために洗浄溶液をフローセルに導入し、その後次のサンプルを測定した。

実施例６：本発明による方法の感度及び検出限界の決定
ＵＤＥＣＬ電気化学発光分析装置を用いた。光電子倍増管の高電圧を９００ｖ、走査電圧を０．２〜１．６ｖ、走査速度を１５０ｍＶ／秒となるように設定し、作用電極にＰｔ電極を用いた。バッファは、０．０５Ｍリン酸バッファ（ｐＨ７．４）及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０であった。溶液の発光シグナルを検出し、本方法による方法の検出限界を決定した。

濃度勾配の標準溶液を作製し、用量反応曲線を発光強度の値の変化の対数及び濃度の対数に従ってプロットし、これらは、優れた線形の関係性を有することが見出された。

アルカリホスファターゼ及びホースラディッシュペルオキシダーゼのルミノールとの反応システム等の化学発光免疫測定法の酵素的検出法の感度は、一般的に０．１２ｍＩＵ／Ｌであり；従来の電気化学法の感度の検出範囲は、０．００５〜１００μＩＵ／ｍｌであり、そして本発明による方法の検出範囲は０．００１〜１００μＩＵ／ｍｌである。電気化学発光法の電気化学発光免疫測定法の検出範囲は、ＥＬＩＳＡの検出範囲よりも広い。

本発明により提案される電気化学発光免疫測定法は、実施例に記載され、そして修正、又は適切な改変及び組み合わせは、本発明において開示された技術を達成するために、本発明の内容、趣旨及び範囲内から逸脱することなく、当業者により本発明の電気化学発光免疫測定法がなされることは明らかである。具体的には、全ての同様の置換及び改変は、当業者に明らかであり、これらは、全て本発明の趣旨、範囲及び内容に含まれるものと見なされることは指摘されるべきである。

Claims

以下の工程、
工程１：被験タンパク質に対するピリジンルテニウム標識した一次抗体、及び被験タンパク質に対するビオチン化した二次抗体を被験サンプルと十分に反応させること、あるいは被験タンパク質に対するピリジンルテニウム標識した抗体、及び被験ビオチン化タンパク質を被験サンプルと十分に反応させる工程、
工程２：ストレプトアビジンでコーティングした磁性粒子を添加し、抗原、抗体及び磁性粒子を含む複合体を形成するように反応させ、該反応液をフローセルに吸引させ、ここで前記抗原、抗体及び磁性粒子を含む複合体は、磁性粒子を介して電極の表面上に吸着される、工程、
工程３：ジブチルエタノールアミン溶液を添加し、電圧の印加によりＥＣＬ反応を開始させ、光学検出器により走査した光シグナルを回収する工程、
工程４：濃度勾配の標準溶液を作製し、発光強度の値の変化の対数及び濃度の対数に従って用量反応曲線をプロットし、そして被験サンプル中の被験タンパク質の濃度を計算により得る工程
を含む、電気化学発光免疫測定法。
被験サンプルが、血清、尿、及び組織液であることを特徴とする、請求項１に記載の電気化学発光免疫測定法。
被験タンパク質が、腫瘍マーカータンパク質であることを特徴とする、請求項１に記載の電気化学発光免疫測定法。
被験タンパク質が、Ｔ３トリヨードチロニン、ＡＳＡ抗精子抗体、トロポニンＩ、Ｔ４チロキシン、ＡＣＡ抗カルジオライピン抗体、ＣＫＭＢ、ＴＳＨ、ＡＥＡ抗子宮内膜抗体、ＦＴ３遊離トリヨードチロニン、ＡＯＡ抗卵巣抗体、ＦＴ４遊離チロキシン、ＡＴＢ抗トロホブラスト抗体、抗ＴＭ甲状腺ミクロソーム抗体、ＺＰ抗透明帯抗体、抗ＴＧ抗チオグロブリン抗体、抗ＨＣＧ抗体、ヒト胎盤性ラクトゲン、抗ＴＰＯ甲状腺ペルオキシダーゼ抗体、ＨＣＧ、ＴＯＸトキソプラズマ抗体、ＦＳＨ、ＡＦＰ α胎児性タンパク質、ＣＥＡ癌胎児性抗原、ＰＳＡ前立腺特異抗原、ＦＰＳＡ遊離前立腺特異抗原、ＣＭＶサイトメガロウイルス抗体、ＬＨ黄体化ホルモン、ＨＳＶ−１単純ヘルペスウイルス抗体、ＰＲＬプロラクチン、ＨＳＶ−２単純ヘルペスウイルス抗体、ＴＥＳテストステロン、ＲＶルベラウイルス抗体、ＰＲＯプロゲステロン、フェリチン、ＴＯＸ−Ａｇトキソプラズマ循環抗原、Ｅ２エストラジオール、ＣＡ１２５、Ｅ３エストリオール、ＣＡ１５３、ＣＡ１９９、ＨＢｓＡｇ、ＮＳＥニューロン特異的エノラーゼ、ＨＢｓＡｂ、ＣＡ５０、ＨＢｅＡｇ、β２ミクロブロブリン、ＨＢｅＡｂ、コクサッキーウイルス抗体、ＨＢｃＡｂ、ＢＧＰ骨Ｇｌａタンパク質、Ｄ−Ｐｙｒデオキシピリジノリン、ビタミンＤ、インスリン、ＰＣＩＩＩＩＩＩ型プロコラーゲン、Ｃ−ペプチド、ＩＶ型コラーゲン、インスリン抗体、ＬＮラミニン、グルカゴン、ＨＡヒアルロン酸、ＧＡＤ−ＡＢグルタミン酸デカルボキシラーゼ抗体、Ｆｎフィブロネクチン、インフルエンザウイルスＢ、パラインフルエンザウイルス、ＥＢウイルス、麻疹ウイルス、肺炎マイコプラズマ、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、アスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）、ムンプスウイルス、ＨＣＶウイルス、インフルエンザウイルスＡ、ヒト免疫不全ウイルス、クラミジア・ニューモニエ（Chlamydia pneumoniae）、アデノウイルス、ＲＳＶ呼吸器合胞体ウイルス、エコーウイルス、及びプロガストリン放出ペプチド、ＣＹＦＲＡ２１−１、ＡＦＰ、ＡＰＴ、ＣＡ２４２、ＣＡ７２４、ＣＡ５０、ｆ−ＰＳＡ、ｔ−ＰＳＡ、遊離β−ｈＣＧ、及びＳＣＣＡを含むことを特徴とする、請求項１に記載の電気化学発光免疫測定法。
被験タンパク質に対するピリジンルテニウム標識した一次抗体、被験タンパク質に対するビオチン化した二次抗体、ストレプトアビジンコーティングした磁性粒子、及びジ−ｎ−ブチルエタノールアミン溶液を含む、電気化学発光免疫測定のためのキット。
前記キットが、洗浄溶液をさらに含むことを特徴とする、請求項５に記載のキット。
前記洗浄溶液が、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含む０．０５ｍｏｌ／Ｌリン酸バッファ（ｐＨ７．４）であることを特徴とする、請求項６に記載のキット。