CN115096961B - 用于检测雌激素相关受体α的生物传感器及其检测方法 - Google Patents

用于检测雌激素相关受体α的生物传感器及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于检测雌激素相关受体α的生物传感器及其检测方法，包括工作电极、对电极、参比电极以及电解质溶液，所述工作电极由以下依序进行的步骤制备而成：(一)对金电极进行预处理(二)对预处理后的金电极进行修饰。该发明克服了现有雌激素相关受体α多采用ELISA法，存在重复性差、清洗过程繁琐、抗体成本高、干扰因素多、易出现假阳性等的缺点，采用经过预处理及修饰，且结合有ERRα抗体的金电极为工作电极，配合上对电极、参比电极以及电解质溶液，具有检测快捷、高稳定性、高效率、高灵敏度、低成本等优点，通过电化学发光信号的强弱变化，可检测待测样品中雌激素相关受体α的有无以及浓度。

Description

用于检测雌激素相关受体α的生物传感器及其检测方法
技术领域
本发明涉及一种用于检测雌激素相关受体α的生物传感器及其检测方法，应用在雌激素相关受体α(ERRα)的检测领域。
背景技术
雌激素相关受体α(ERRα)与雌激素依赖性肿瘤密切相关，如乳腺癌、子宫内膜癌和卵巢癌等，因此，检测ERRα的表达具有重要的意义。然而，目前ERRα主要的检测方法是ELISA法，但是ELISA法存在重复性差、清洗过程繁琐、抗体成本高、干扰因素多、易出现假阳性等缺点，且无法进行大规模的实验。因此，我们需探寻更快捷、简便、精准的ERRα检测方法。另外，虽然有检测雌激素受体的相关电化学传感器申请，如CN201910510316，但其存在亲和力不佳、电化学灵敏度较低、背景信号较高等缺点。
因此，提供一种更快捷、简便、亲和力高、检测灵敏度高、检测结果精准的用于检测雌激素相关受体α的生物传感器及其检测方法己成为当务之亟。
发明内容
为了克服现有雌激素相关受体α(ERRα)多采用ELISA法，存在重复性差、清洗过程繁琐、抗体成本高、干扰因素多、易出现假阳性等的缺点，本发明提供一种用于检测雌激素相关受体α的生物传感器及其检测方法，采用经过预处理及修饰，且结合有ERRα抗体的金电极为工作电极，配合上对电极、参比电极以及电解质溶液，利用空间位阻影响ECL信号探针在电极表面的距离实现目标物的分析，具有检测快捷、高稳定性、高效率、高灵敏度、低成本等优点，通过电化学发光信号的强弱变化，可检测待测样品中雌激素相关受体α的有无以及浓度，对雌激素依赖性肿瘤检测提供相关帮助。
本发明的技术方案如下：
一种用于检测雌激素相关受体α的生物传感器，包括工作电极、对电极、参比电极以及电解质溶液，
所述工作电极由以下依序进行的步骤制备而成：
(一)对金电极进行预处理
(二)对预处理后的金电极进行修饰
(1)将浓度180-220umol 4-巯基苯甲酸滴加在经预处理的金电极表面，温育之后用超纯水冲洗干净，并通过氮气干燥处理；
(2)将浓度45-47mg/ml N-羟基琥珀酰亚胺水溶液与浓度90-110mg/ml 1-3-二甲氨基丙基-3-乙基碳二亚胺盐酸盐水溶液按质量比例1:1-1.2混合制备而成的混合液滴加在处理后的金电极表面，温育之后用超纯水冲洗干净，并通过氮气干燥处理；
(3)将浓度0.8-1.2mg/L的ERRα抗体滴加在经步骤(二)(2)处理的金电极表面，温育之后用超纯水冲洗干净，并通过氮气干燥处理，即获得工作电极；
所述电解质溶液为含有ECL化学发光试剂的电解质溶液。
本申请的用于检测雌激素相关受体α的生物传感器，通过已经过预处理及修饰，且结合有ERRα抗体的金电极为工作电极，配合上对电极、参比电极以及电解质溶液，利用空间位阻影响ECL信号探针在电极表面的距离实现目标物的分析，具有检测快捷、高稳定性、高效率、高灵敏度、低成本等优点。电化学发光检测方法(Electrochemiluminescence,ECL)具有仪器简便、灵敏度高、线性范围宽、所需样本少等特点，在临床医学领域有着广泛的应用前景。申请人首次构建了基于空间位阻的电化学生物传感器用于ERRα的检测(如图1所示)，其简单快速，无需利用目标抗原及二抗将ECL信号探针标记在电极表面，而是将ERRα抗体修饰在活化的金电极表面。当不存在ERRα抗原的时候，电解质溶液中ECL化学发光试剂的电化学发光纳米颗粒(即ECL信号探针)更容易接近仅有ERRα抗体的电极表面，产生较强的电化学发光信号；当样品中存在ERRα抗原的时候，ERRα抗原会与电极表面的ERRα抗体结合，由于空间位阻的影响，其阻碍了电化学发光纳米颗粒靠近电极表面，产生较弱的电化学发光信号。根据样品中ERRα抗原浓度的不同，电化学发光信号的强弱程度不同，由此实现对样品中ERRα抗原含量的检测。这是一种检测快速、使用简便又结果相对精准的用于检测雌激素相关受体α的生物传感器及其检测方法，能用于雌激素相关肿瘤(ERRα抗原)有无以及浓度的检测，有助于评估肿瘤的发生、发展及预后转归，其具有具有高稳定性、高效率、高灵敏度、低成本等优点。雌激素相关受体α(ERRα)与雌激素依赖性肿瘤密切相关，如乳腺癌、子宫内膜癌和卵巢癌等，因此，其开发具有重要意义。能克服目前主要用ELISA法检测ERRα存在的重复性差、清洗过程繁琐、抗体成本高、干扰因素多、易出现假阳性等缺点，能进行大规模的实验。其中，循环伏安法(Cyclic voltammetry，CV)是一种常用的电化学研究方法(详见Kissinger,Peter T.,Heineman,William R.Cyclic voltammetry.Journal of ChemicalEducation,1983,60(9),702–706.)。电化学清扫使用的是电化学工作站。超纯水由超纯水系统制备而成。该用于检测雌激素相关受体α的生物传感器直接利用抗体修饰电极，亲和力更强。且ECL信号，比普通的电化学灵敏度更高，背景信号更低。与现有其他抗原抗体方法相比，本案的ECL发光试剂无需处理、修饰，直接添加使用，更加方便。
此外，本发明上述技术方案进一步改进如下：
步骤(一)包括以下依序进行的步骤：
(1)将金电极抛光打磨至镜面，之后用超纯水冲洗干净；
(2)将打磨好的金电极浸没在超纯水中以35-45KHz、180-220w的超声处理至少1min，之后氮气干燥处理；
(3)将超声处理后的金电极浸没在0.45-0.55M的硫酸溶液中，采用在-0.2至1.6V电位范围内进行电化学清扫，直至出现稳定的循环伏安曲线，即获得经预处理的金电极。
步骤(一)(1)的抛光打磨方法具体为：先用沾有粒径0.25-0.35μm的三氧化二铝悬浆的电极抛光布对金电极打磨2-3分钟，再用沾有粒径0.04-0.06μm的三氧化二铝悬浆的电极抛光布对金电极打磨至镜面。
步骤(一)(1)中的打磨采用的是“8”字法，步骤(一)(3)中电化学清扫采用的是循环伏安法。
所述步骤(二)(3)中ERRα抗体的浓度为1mg/L，用量为10ul，滴加ERRα抗体后的温育时间为2小时。
优选浓度、用量的的ERRα抗体以及温育时间能以最少的用量、温育时间达到ECL信号差稳定的效果。
ECL化学发光试剂为含有六水合三联吡啶氯化钌或硅包钌的10mM PBS缓冲液，其中六水合三联吡啶氯化钌的浓度为0.8-1.2mmol/L，硅包钌的浓度为8-12mg/ml。
优选的ECL化学发光试剂ECL信号差明显，效果好。
六水合三联吡啶氯化钌的浓度为1mmol/L。
优选浓度的六水合三联吡啶氯化钌能以最少的用量达到ECL信号差稳定的效果。
所述电解质溶液中还含有浓度0.015-0.025M/L的三正丙胺和浓度8-12mM/L的磷酸盐缓冲液，所述对电极为铂电极，参比电极为Ag/AgCl电极。
优选的三正丙胺、磷酸盐缓冲液浓度组成的电解质溶液导电性能更佳。优选的对电极、参比电极易得，且检测效果好。
步骤(二)中4-巯基苯甲酸、N-羟基琥珀酰亚胺水溶液与1-3-二甲氨基丙基-3-乙基碳二亚胺盐酸盐水溶液的混合液、ERRα抗体的用量均为9-11ul，步骤(二)(1)-(3)中的温育温度均为36-38℃，温育时间依次为2.5-3.5小时、14-16分钟和1.5-2.5小时。
优选的各试剂、ERRα抗体的用量以及金电极修饰的优选温育温度和时间使得ERRα抗体结合在金电极表面更佳牢固。
采用所述生物传感器检测雌激素相关受体α的检测方法，主要包括以下依序进行的步骤：(1)将待测样品滴加在用于检测雌激素相关受体α的生物传感器的工作电极表面，再于36-38℃温育1.5-2.5小时，之后用超纯水冲洗干净，并通过氮气干燥处理；
(2)采用三电极体系进行检测：
将经步骤(1)处理过的工作电极以及对电极、参比电极均浸没在在电解质溶液中，进行电化学发光信号的检测，通过电化学发光信号的强弱变化判断待测样品中雌激素相关受体α的有无及浓度，电化学发光信号与待测样品中雌激素相关受体α的浓度呈负相关。
本申请用于检测雌激素相关受体α的生物传感器检测雌激素相关受体α浓度的方法具有检测快捷、高稳定性、高效率、高灵敏度、低成本等优点，可检测雌激素相关受体α的有无以及浓度。其中，电化学发光信号的检测使用的是超微弱发光分析仪。本案中所有粉末状原料使用分析天平称取，液体状原料使用精密移液器拿取。
所述步骤(1)中滴加ERRα抗原后的温育时间为2小时。
2小时为最优的ERRα抗原-ERRα抗体结合时间。
与现有技术相比，本发明申请具有以下优点：
1)本申请的用于检测雌激素相关受体α的生物传感器采用经过预处理及修饰，且结合有ERRα抗体的金电极为工作电极，配合上对电极、参比电极以及电解质溶液，利用空间位阻影响ECL信号探针在电极表面的距离实现目标物的分析，制备出的用于检测雌激素相关受体α的生物传感器具有检测快捷、高稳定性、高效率、高灵敏度、低成本等优点，可检测雌激素相关受体α的有无以及浓度；
2)优选的ERRα抗体浓度和用量、ERRα抗体温育时间、ECL化学发光试剂优选种类及浓度、ERRα抗原温育时间能提升用于检测雌激素相关受体α的生物传感器的检测效果；
3)所述用于检测雌激素相关受体α的生物传感器检测雌激素相关受体α有无及浓度的方法具有检测快捷、高稳定性、高效率、高灵敏度、低成本等优点。
附图说明
图1是本发明所述的用于检测雌激素相关受体α的生物传感器及其检测方法的原理示意图；
图2是本发明所述的用于检测雌激素相关受体α的生物传感器及其检测方法的可行性实验结果；
图3是本发明所述的用于检测雌激素相关受体α的生物传感器及其检测方法的抗干扰实验结果；
图4是本发明所述的用于检测雌激素相关受体α的生物传感器及其检测方法的抗体使用量优化实验结果；
图5是本发明所述的用于检测雌激素相关受体α的生物传感器及其检测方法的抗体结合时间优化实验结果；
图6是本发明所述的用于检测雌激素相关受体α的生物传感器及其检测方法的六水合三联吡啶氯浓度优化实验结果；
图7是本发明所述的用于检测雌激素相关受体α的生物传感器及其检测方法的抗原抗体结合时间优化实验结果；
图8是本发明所述的用于检测雌激素相关受体α的生物传感器及其检测方法的当ERRα抗原的浓度范围为1-60ng/L时，ERRα抗原浓度与ECL信号强度的关系线形图；
图9是本发明所述的用于检测雌激素相关受体α的生物传感器及其检测方法的与ELISA法比较实验结果。
具体实施方式
下面结合各实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
实施例1
如图1所示，本发明所述的一种用于检测雌激素相关受体α的生物传感器，包括工作电极、对电极、参比电极以及电解质溶液，
所述工作电极由以下依序进行的步骤制备而成：
(一)对金电极进行预处理
(二)对预处理后的金电极进行修饰
(1)将浓度200umol 4-巯基苯甲酸滴加在经预处理的金电极表面，温育之后用超纯水冲洗干净，并通过氮气干燥处理；
(2)将浓度46mg/ml N-羟基琥珀酰亚胺水溶液与浓度100mg/ml 1-3-二甲氨基丙基-3-乙基碳二亚胺盐酸盐水溶液按质量比例1:1混合制备而成的混合液滴加在处理后的金电极表面，温育之后用超纯水冲洗干净，并通过氮气干燥处理；
(3)将浓度1mg/L的ERRα抗体滴加在经步骤(二)(2)处理的金电极表面，温育之后用超纯水冲洗干净，并通过氮气干燥处理，即获得工作电极；
所述电解质溶液为含有ECL化学发光试剂的电解质溶液。
步骤(一)包括以下依序进行的步骤：
(1)将金电极抛光打磨至镜面，之后用超纯水冲洗干净；
(2)将打磨好的金电极浸没在超纯水中以40KHz、200w的超声处理1min，之后氮气干燥处理；
(3)将超声处理后的金电极浸没在0.5M的硫酸溶液中，采用在-0.2至1.6V电位范围内进行电化学清扫，直至出现稳定的循环伏安曲线，即获得经预处理的金电极。
步骤(一)(1)的抛光打磨方法具体为：先用沾有粒径0.3μm的三氧化二铝悬浆的电极抛光布对金电极打磨2.5分钟，再用沾有粒径0.05μm的三氧化二铝悬浆的电极抛光布对金电极打磨至镜面。
所述步骤(二)(3)中ERRα抗体的用量为10ul，滴加ERRα抗体后的温育时间为2小时。
ECL化学发光试剂为含有六水合三联吡啶氯化钌的10mM PBS缓冲液，其中六水合三联吡啶氯化钌的浓度为1mmol/L
所述电解质溶液中还含有浓度0.02M/L的三正丙胺和浓度10mM/L的磷酸盐缓冲液，所述对电极为铂电极，参比电极为Ag/AgCl电极。
步骤(二)中4-巯基苯甲酸、N-羟基琥珀酰亚胺水溶液与1-3-二甲氨基丙基-3-乙基碳二亚胺盐酸盐水溶液的混合液、ERRα抗体的用量均为10ul，步骤(二)(1)-(3)中的温育温度均为37℃，温育时间依次为3小时、15分钟和2小时。
采用所述的生物传感器检测雌激素相关受体α的检测方法，主要包括以下依序进行的步骤：
(1)将待测样品滴加在用于检测雌激素相关受体α的生物传感器的工作电极表面，再于37℃温育2小时，之后用超纯水冲洗干净，并通过氮气干燥处理；
(2)采用三电极体系进行检测：
将经步骤(1)处理过的工作电极以及对电极、参比电极均浸没在在电解质溶液中，进行电化学发光信号的检测，通过电化学发光信号的强弱变化判断待测样品中雌激素相关受体α的有无及浓度。
实施例2
如图1所示，本发明所述的一种用于检测雌激素相关受体α的生物传感器，包括工作电极、对电极、参比电极以及电解质溶液，
所述工作电极由以下依序进行的步骤制备而成：
(一)对金电极进行预处理
(二)对预处理后的金电极进行修饰
(1)将浓度180umol 4-巯基苯甲酸滴加在经预处理的金电极表面，温育之后用超纯水冲洗干净，并通过氮气干燥处理；
(2)将浓度47mg/ml N-羟基琥珀酰亚胺水溶液与浓度90mg/ml 1-3-二甲氨基丙基-3-乙基碳二亚胺盐酸盐水溶液按质量比例1:1.1混合制备而成的混合液滴加在处理后的金电极表面，温育之后用超纯水冲洗干净，并通过氮气干燥处理；
(3)将浓度1.2mg/L的ERRα抗体滴加在经步骤(二)(2)处理的金电极表面，温育之后用超纯水冲洗干净，并通过氮气干燥处理，即获得工作电极；
所述电解质溶液为含有ECL化学发光试剂的电解质溶液。
步骤(一)包括以下依序进行的步骤：
(1)将金电极抛光打磨至镜面，之后用超纯水冲洗干净；
(2)将打磨好的金电极浸没在超纯水中以35KHz、220w的超声处理1.5min，之后氮气干燥处理；
(3)将超声处理后的金电极浸没在0.45M的硫酸溶液中，采用在-0.2至1.6V电位范围内进行电化学清扫，直至出现稳定的循环伏安曲线，即获得经预处理的金电极。
步骤(一)(1)的抛光打磨方法具体为：先用沾有粒径0.35μm的三氧化二铝悬浆的电极抛光布对金电极打磨2分钟，再用沾有粒径0.04μm的三氧化二铝悬浆的电极抛光布对金电极打磨至镜面。
所述步骤(二)(3)中ERRα抗体用量为10ul，滴加ERRα抗体后的温育时间为2小时。
ECL化学发光试剂为含有六水合三联吡啶氯化钌的10mM PBS缓冲液，其中六水合三联吡啶氯化钌的浓度为0.8mmol/L。
所述电解质溶液中还含有浓度0.025M/L的三正丙胺和浓度8mM/L的磷酸盐缓冲液，所述对电极为铂电极，参比电极为Ag/AgCl电极。
步骤(二)中4-巯基苯甲酸、N-羟基琥珀酰亚胺水溶液与1-3-二甲氨基丙基-3-乙基碳二亚胺盐酸盐水溶液的混合液、ERRα抗体的用量均为11ul，步骤(二)(1)-(3)中的温育温度均为36℃，温育时间依次为3.5小时、14分钟和2.5小时。
采用所述的生物传感器检测雌激素相关受体α的检测方法，主要包括以下依序进行的步骤：
(1)将待测样品滴加在用于检测雌激素相关受体α的生物传感器的工作电极表面，再于36℃温育2.5小时，之后用超纯水冲洗干净，并通过氮气干燥处理；
(2)采用三电极体系进行检测：
将经步骤(1)处理过的工作电极以及对电极、参比电极均浸没在在电解质溶液中，进行电化学发光信号的检测，通过电化学发光信号的强弱变化判断待测样品中雌激素相关受体α的有无及浓度。
实施例3
如图1所示，本发明所述的一种用于检测雌激素相关受体α的生物传感器，包括工作电极、对电极、参比电极以及电解质溶液，
所述工作电极由以下依序进行的步骤制备而成：
(一)对金电极进行预处理
(二)对预处理后的金电极进行修饰
(1)将浓度220umol 4-巯基苯甲酸滴加在经预处理的金电极表面，温育之后用超纯水冲洗干净，并通过氮气干燥处理；
(2)将浓度45mg/ml N-羟基琥珀酰亚胺水溶液与浓度110mg/ml 1-3-二甲氨基丙基-3-乙基碳二亚胺盐酸盐水溶液按质量比例1:1.2混合制备而成的混合液滴加在处理后的金电极表面，温育之后用超纯水冲洗干净，并通过氮气干燥处理；
(3)将浓度0.8mg/L的ERRα抗体滴加在经步骤(二)(2)处理的金电极表面，温育之后用超纯水冲洗干净，并通过氮气干燥处理，即获得工作电极；
所述电解质溶液为含有ECL化学发光试剂的电解质溶液。
步骤(一)包括以下依序进行的步骤：
(1)将金电极抛光打磨至镜面，之后用超纯水冲洗干净；
(2)将打磨好的金电极浸没在超纯水中以45KHz、180w的超声处理2min，之后氮气干燥处理；
(3)将超声处理后的金电极浸没在0.55M的硫酸溶液中，采用在-0.2至1.6V电位范围内进行电化学清扫，直至出现稳定的循环伏安曲线，即获得经预处理的金电极。
步骤(一)(1)的抛光打磨方法具体为：先用沾有粒径0.25μm的三氧化二铝悬浆的电极抛光布对金电极打磨3分钟，再用沾有粒径0.06μm的三氧化二铝悬浆的电极抛光布对金电极打磨至镜面。
所述步骤(二)(3)中ERRα抗体用量为10ul，滴加ERRα抗体后的温育时间为2小时。
ECL化学发光试剂为含有六水合三联吡啶氯化钌的10mM PBS缓冲液，其中六水合三联吡啶氯化钌的浓度为1.2mmol/L。
所述电解质溶液中还含有浓度0.015M/L的三正丙胺和浓度12mM/L的磷酸盐缓冲液，所述对电极为铂电极，参比电极为Ag/AgCl电极。
步骤(二)中4-巯基苯甲酸、N-羟基琥珀酰亚胺水溶液与1-3-二甲氨基丙基-3-乙基碳二亚胺盐酸盐水溶液的混合液、ERRα抗体的用量均为9ul，步骤(二)(1)-(3)中的温育温度均为38℃，温育时间依次为2.5小时、16分钟和1.5小时。
采用所述的生物传感器检测雌激素相关受体α的检测方法，主要包括以下依序进行的步骤：
(1)将待测样品滴加在用于检测雌激素相关受体α的生物传感器的工作电极表面，再于38℃温育1.5小时，之后用超纯水冲洗干净，并通过氮气干燥处理；
(2)采用三电极体系进行检测：
将经步骤(1)处理过的工作电极以及对电极、参比电极均浸没在在电解质溶液中，进行电化学发光信号的检测，通过电化学发光信号的强弱变化判断待测样品中雌激素相关受体α的有无及浓度。
以上各实施例中温育时均使用超级恒温混匀仪。
各实施例中涉及原料、设备的信息：
Figure BDA0003715484070000091
Figure BDA0003715484070000101
实验数据：
一、可行性实验
实验方法：
(一)对照样：
(1)将浓度10mM的10ul磷酸盐缓冲液滴加在工作电极(表面不存在ERRα抗原)表面，再于37℃温育2小时，之后用超纯水冲洗干净，并通过氮气干燥处理；
(2)采用三电极体系进行检测：
将经步骤(1)处理过的工作电极以及对电极、参比电极均浸没在含有ECL化学发光试剂的电解质溶液中，进行电化学发光信号的检测，通过电化学发光信号的强弱变化判断待测样品中雌激素相关受体α的有无及浓度。
(二)采用本案的生物传感器检测雌激素相关受体α的检测方法(实施例1)，其中用10ul1-60ng/L(9个样品的浓度分别为1ng/L、3ng/L、5ng/L、10ng/L、20ng/L、30ng/L、40ng/L、50ng/L、60ng/L)ERRα抗原代替待测样品滴加在用于检测雌激素相关受体α的生物传感器的工作电极表面。
实验结果：
由于对照样的电极表面不存在ERRα抗体，电化学发光颗粒靠近电极表面，产生较强的电化学发光信号；而本案加入ERRα抗原时，ERRα抗原会与电极表面的ERRα抗体结合，由于空间位阻影响，阻碍电化学发光颗粒靠近电极表面，从而使其远离电极表面，产生较弱的电化学发光信号。如图2所示，本案的电化学发光信号冥想弱于对照样，说明该设计方案可行。
二、抗干扰性实验
实验方法：
(一)对照样：
(1)将10ul浓度30ng/L的样品(PBS缓冲液或干扰物)滴加在工作电极(表面不存在ERRα抗原)表面，再于37℃温育2小时，之后用超纯水冲洗干净，并通过氮气干燥处理；
(2)采用三电极体系进行检测：
将经步骤(1)处理过的工作电极以及对电极、参比电极均浸没在含有ECL化学发光试剂的电解质溶液中，进行电化学发光信号的检测，通过电化学发光信号的强弱变化判断待测样品中雌激素相关受体α的有无及浓度。
其中，对照样1(空白组)的样品添加的是PBS缓冲液，对照样2-9(干扰样组)的样品均添加的是干扰物，干扰物分别是氯化钾、氯化钠、牛血清蛋白、葡萄糖、透明质酸酶、谷胱甘肽、胆固醇、抗坏血酸。
(二)采用本案的生物传感器检测雌激素相关受体α的检测方法(实施例1)，其中用10ul1-60ng/L(9个样品的浓度分别为1ng/L、3ng/L、5ng/L、10ng/L、20ng/L、30ng/L、40ng/L、50ng/L、60ng/L)ERRα抗原代替待测样品滴加在用于检测雌激素相关受体α的生物传感器的工作电极表面。
实验结果：
结果如图3所示，与本案添加ERRα抗原相比，所有空白组或干扰样组产生的ECL信号差(ECL信号即电化学发光信号，ECL信号差为加入对照样后与加入对照样前的ECL信号差)比本案的ECL信号差低很多，两者强度差异明显。这表明这些干扰物质对于所述用于检测雌激素相关受体α的生物传感器的影响都很小，进一步证明本案用于检测雌激素相关受体α的生物传感器具有很高的选择性，抗干扰能力强。
三、条件优化实验(1)——ERRα抗体的浓度为1mg/L时的ERRα抗体优选用量
检测方法：采用本案的生物传感器检测雌激素相关受体α的检测方法(实施例1)，保持其他参数一致，设置ERRα抗体(浓度为1mg/L)的用量梯度，进行ERRα抗体用量的优化实验。
实验结果：
结果如图4所示，随着加入的ERRα抗体(浓度为1mg/L)体积量的不断增加，ECL信号不断增强，但当体积达到10ul时，ECL信号值不再增加，因此，ERRα抗体的浓度为1mg/L时用量为10ul为最佳反应体积。
四、条件优化实验(2)——最优ERRα抗体与金电极的结合时间(ERRα抗体温育时间)
检测方法：采用本案的生物传感器检测雌激素相关受体α的检测方法(实施例1)，保持其他参数一致，设置ERRα抗体温育时间梯度，进行ERRα抗体与金电极的结合时间的优化实验。
实验结果：
结果如图5所示，当ERRα抗体温育时间达到2小时的时候，ECL信号趋于稳定，该温育时间为最优ERRα抗体与金电极的结合时间。
五、条件优化实验(3)——ECL化学发光试剂为六水合三联吡啶氯化钌时的优选浓度
检测方法：采用本案的生物传感器检测雌激素相关受体α的检测方法(实施例1)，保持其他参数一致，设置ECL化学发光试剂中的六水合三联吡啶氯化钌体积梯度进行六水合三联吡啶氯化钌浓度体积的优化实验。
实验结果：
结果如图6所示，随着加入的六水合三联吡啶氯化钌的浓度不断加大，当六水合三联吡啶氯化钌的添加体积为70μl(浓度达到1mmol/L)以后，ECL信号差不发生变化，说明该体积的六水合三联吡啶氯化钌为最优值。
六、条件优化实验(4)——最优的ERRα抗原-ERRα抗体结合时间(ERRα抗原温育时间)
检测方法：采用本案的生物传感器检测雌激素相关受体α的检测方法(实施例1)，保持其他参数一致，设置ERRα抗原温育时间梯度，进行ERRα抗原-ERRα抗体结合时间的优化实验。
实验结果：
结果如图7所示，当温育时间达到2小时，ECL信号趋于稳定，因此，2小时为最优的ERRα抗原-ERRα抗体结合时间。
七、灵敏度测试
检测方法：进行ERRα抗原-ERRα抗体结合时间的优化实验。
(1)本案：采用本案的生物传感器检测雌激素相关受体α的检测方法(实施例1)，保持其他参数一致，设置ERR抗原浓度梯度，以探讨ECL信号强度与ERR抗原浓度之间的关系；
(2)ELISA法：使用商业化酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒，参照说明书进行操作。
结果如图8所示，本案ERRα抗原的浓度范围为1-60ng/L时，ECL信号强度随着ERRα抗原浓度的增加而减弱，且ECL信号强度与ERRα抗原浓度呈良好的线性关系。
线性方程为：
IECL/counts＝-275.94CERRα/(ng/L)+18809.94
R＝0.9955；
其中，IECL是生物传感器在一定ERRα抗原浓度下检测到的ECL信号强度，CERRα为ERRα抗原的浓度，R为相关系数(R接近1说明线性相关性强)。
本案用于检测雌激素相关受体α的生物传感器检测雌激素相关受体α浓度的方法检出限(LOD)为1.0ng/L，与ELISA方法相比，ELISA的检出限为1.6ng/L，因此，本案具有更高的灵敏度。
八、本案与ELISA法效果比较实验
待测样品：包括血清样本4个、子宫内膜癌细胞株裂解液2个
(1)血清样本4个(Serum1-Serum4)：分别取4位内膜癌病人的清晨空腹血3-5ml，于2200rpm离心10分钟，取上层血清，之后直接检测或者于-40℃冰箱中保存取用，取材的整个过程不超过2小时；
(2)子宫内膜癌细胞株裂解液2个(KLE和RL-952细胞株)：将子宫内膜癌细胞株(KLE和RL-952细胞株)进行复苏传代后，取对数生长期生长良好的贴壁细胞，以1000g离心5min后取细胞沉淀加入适量裂解液裂解细胞；以12000g离心10min后取上清液(细胞蛋白质)。
检测方法：
(1)本案：取各血清样本和子宫内膜癌细胞株裂解液的取用量均为10ul，使用本案生物传感器检测雌激素相关受体α的检测方法操作(实施例1)；
(2)ELISA法：取各血清样本和子宫内膜癌细胞株裂解液的取用量均为10ul，使用商业化酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒，参照说明书进行操作。
检测结果：
结果如图9所示，分别用本案的用于检测雌激素相关受体α的生物传感器和ELISA方法分别进行检测，发现两者的检测结果没有显著差异。其中，血清样品的两检测方法的差异＜5.14％，子宫内膜癌细胞株裂解液的两检测方法差异＜6.61％。可见，本案用于检测雌激素相关受体α的生物传感器用于待测样品中ERRα抗原有无以及浓度检测的可靠性高。
本发明所述的用于检测雌激素相关受体α的生物传感器及其检测方法并不只仅仅局限于上述实施例，凡是依据本发明原理的任何改进或替换，均应在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于检测雌激素相关受体α的生物传感器，包括工作电极、对电极、参比电极以及电解质溶液，其特征在于：
所述工作电极由以下依序进行的步骤制备而成：
（一）对金电极进行预处理
（二）对预处理后的金电极进行修饰
（1）将浓度180-220 umol 4-巯基苯甲酸滴加在经预处理的金电极表面，温育之后用超纯水冲洗干净，并通过氮气干燥处理；
（2）将浓度45-47mg/ml N-羟基琥珀酰亚胺水溶液与浓度90-110mg/ml 1-3-二甲氨基丙基-3-乙基碳二亚胺盐酸盐水溶液按质量比例1:1-1.2混合制备而成的混合液滴加在处理后的金电极表面，温育之后用超纯水冲洗干净，并通过氮气干燥处理；
（3）将浓度0.8-1.2mg/L的ERRα抗体滴加在经步骤（二）（2）处理的金电极表面，温育之后用超纯水冲洗干净，并通过氮气干燥处理，即获得工作电极；
所述电解质溶液为含有ECL化学发光试剂的电解质溶液。
2.根据权利要求1所述的用于检测雌激素相关受体α的生物传感器，其特征在于：步骤（一）包括以下依序进行的步骤：
（1）将金电极抛光打磨至镜面，之后用超纯水冲洗干净；
（2）将打磨好的金电极浸没在超纯水中以35-45KHz、180-220w的超声处理至少1 min，之后氮气干燥处理；
（3）将超声处理后的金电极浸没在0.45-0.55 M的硫酸溶液中，采用在-0.2至1.6V电位范围内进行电化学清扫，直至出现稳定的循环伏安曲线，即获得经预处理的金电极。
3.根据权利要求2所述的用于检测雌激素相关受体α的生物传感器，其特征在于：步骤（一）（1）的抛光打磨方法具体为：先用沾有粒径0.25-0.35μm的三氧化二铝悬浆的电极抛光布对金电极打磨2-3分钟，再用沾有粒径0.04-0.06μm的三氧化二铝悬浆的电极抛光布对金电极打磨至镜面。
4.根据权利要求1所述的用于检测雌激素相关受体α的生物传感器，其特征在于：所述步骤（二）（3）中ERRα抗体的浓度为1mg/L，用量为10ul，滴加ERRα抗体后的温育时间为2小时。
5.根据权利要求1所述的用于检测雌激素相关受体α的生物传感器的制备方法，其特征在于：ECL化学发光试剂为含有六水合三联吡啶氯化钌的10mM PBS缓冲液，其中六水合三联吡啶氯化钌的浓度为0.8-1.2 mmol/L。
6.根据权利要求5所述的用于检测雌激素相关受体α的生物传感器，其特征在于：所述六水合三联吡啶氯化钌的浓度为1mmol/L。
7.根据权利要求4所述的用于检测雌激素相关受体α的生物传感器，其特征在于：所述电解质溶液中还含有浓度0.015-0.025M/L的三正丙胺和浓度8-12mM/L的磷酸盐缓冲液，所述对电极为铂电极，参比电极为Ag/AgCl电极。
8.根据权利要求1所述的用于检测雌激素相关受体α的生物传感器，其特征在于：步骤（二）中4-巯基苯甲酸、 N-羟基琥珀酰亚胺水溶液与1-3-二甲氨基丙基-3-乙基碳二亚胺盐酸盐水溶液的混合液、ERRα抗体的用量均为9-11ul，步骤（二）（1）-（3）中的温育温度均为36-38℃，温育时间依次为2.5-3.5小时、14-16分钟和1.5-2.5小时。
9.采用权利要求1-8任一项所述的生物传感器检测雌激素相关受体α的检测方法，所述方法用于非疾病诊断目的，其特征在于：主要包括以下依序进行的步骤：
（1）将待测样品滴加在用于检测雌激素相关受体α的生物传感器的工作电极表面，再于36-38℃温育1.5-2.5小时，之后用超纯水冲洗干净，并通过氮气干燥处理；
（2）采用三电极体系进行检测：
将经步骤（1）处理过的工作电极以及对电极、参比电极均浸没在电解质溶液中，进行电化学发光信号的检测，通过电化学发光信号的强弱变化判断待测样品中雌激素相关受体α的有无及浓度。
10.根据权利要求9所述的生物传感器检测雌激素相关受体α的检测方法，其特征在于：所述步骤（1）中滴加ERRα抗原后的温育时间为2小时。
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