CN110361533A - 一种基于原位信号放大的夹心型前列腺特异性抗原光电化学免疫分析方法 - Google Patents

一种基于原位信号放大的夹心型前列腺特异性抗原光电化学免疫分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种基于原位信号放大的夹心型前列腺特异性抗原光电化学免疫分析方法。将TiO2‑B与壳聚糖、银离子相复合形成复合物TiO2‑@CS‑Ag+，将其再与二抗结合形成标记的二抗。在H2O2存在的情况下，催化S2O3 2‑氧化生成S2‑，S2‑与探针端的Ag+结合，原位生成Ag2S。由于Ag2S的禁带宽度比TiO2‑B小，当光照射到电极表面，受到光的激发，Ag2S价带上的电子向导带转移，形成电子‑空穴对，Ag2S导带上的电子富集，转移到TiO2‑B的导带，使得光生电子‑空穴复合更慢，光电信号增强。随着待测物浓度的增加，由于免疫反应的发生，固定到电极表面的标记过的二抗浓度相应增加，在H2O2的存在情况下，S2O3 2‑发生还原反应生成S2‑与Ag+结合生成Ag2S，进一步放大光电信号。基于该现象可建立起对前列腺特异性抗原的无毒光电分析方法。

Description

一种基于原位信号放大的夹心型前列腺特异性抗原光电化学 免疫分析方法
技术领域
本发明属于新型功能材料与生物传感检测技术领域，具体涉及一种基于原位信号放大的夹心型前列腺特异性抗原光电化学免疫分析方法。
背景技术光电化学（PEC）检测，是以光作为激发信号，以光电流作为检测信号，通过采用不同形式的能量作为激发信号和检测信号，使激发和检测信号互不干扰，因而背景信号较低，可获得较高的灵敏度。在光电化学传感器的构建过程中，光敏材料的选择对于信号的响应至关重要，在众多的光敏材料中，TiO2由于其特殊的性质近年来受到越来越多科研工作者的关注。而TiO2-B纳米材料作为TiO2多晶型中的一种，由于其类似于钙钛矿的结构，拥有相对更多的空隙和连续的通道，使得其具有更高的电子转移能力，光电效应更高。但由于TiO2-B材料禁带宽度宽，需要较高的能量激发产生光生电子-空穴对，可见光区光的吸收率低。为了使光电信号增强，以便后续生物传感器更好地实现灵敏检测我们引入壳聚糖与TiO2-B形成复合物，用于增强TiO2-B的光电响应。因壳聚糖具有模拟过氧化物酶的作用，将其与TiO2-B复合，不仅可以增强TiO2-B的光电活性，还由于其独特的物理-化学性质，可以更好的与抗体结合，增强传感器的稳定性。
前列腺癌是男性高发癌症中的一种，到目前为止仍未发现有效的药物对其进行治疗。前列腺特异性抗原(Prostate Specific Antigen，PSA)，一种有效的生物标志物，不仅可以检测早期的前列腺癌，还可以检测前列腺癌治疗的效果，因此灵敏，准确地检测PSA含量对诊疗前列腺癌具有十分重要的作用。因此发展一种列腺特异性抗原灵敏检测方法已成为科研工作者们研究的方向。免疫检测分析方法具有良好的灵敏性和特异性，常用于快速定量检测目标物。该方法的核心主要是抗体以及对应的抗原，通过特异性识别位点与检测物质结合。由于TiO2-B@CS复合物具有模拟酶的作用，将其作为探针标记二抗，通过夹心免疫反应固定电极界面，在过氧化氢存在下，催化氧化S2O3 2-生成S2-，再与探针上的Ag+结合原位生成Ag2S，使光电信号增强。实验结果显示，该传感器具有较低的检测限，且对目标物的检测具有较好的选择性和稳定性，为其他肿瘤标志物的光电化学检测提供了平台。
在本实验中，我们将TiO2-B与壳聚糖、银离子相复合形成复合物TiO2-@CS-Ag+，将其再与二抗结合形成标记的二抗。在H2O2存在的情况下，催化S2O3 2-氧化生成S2-，S2-与探针端的Ag+结合，原位生成Ag2S。由于Ag2S的禁带宽度比TiO2-B小，当光照射到电极表面，受到光的激发，Ag2S价带上的电子向导带转移，形成电子-空穴对，Ag2S导带上的电子富集，转移到TiO2-B的导带，使得光生电子-空穴复合更慢，光电信号增强。随着待测物浓度的增加，由于免疫反应的发生，固定到电极表面的标记过的二抗浓度相应增加，在H2O2的存在情况下，S2O3 2-发生还原反应生成S2-与Ag+结合生成Ag2S，增大光电流，光电流信号与前列腺特异性抗原浓度在一定范围内呈线性变化，根据这一现象可以实现对前列腺抗原的灵敏检测，为临床检测提供了平台。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于原位信号放大的夹心型前列腺特异性抗原光电化学免疫分析方法。
为实现发明目的，本发明采用如下技术方案：
（1）玻碳电极（GCE）的预处理：GCE首先在铺有氧化铝粉末的麂皮上机械打磨抛光，用二次水洗去表面残留粉末，再移入超声水浴中清洗，直至清洗干净，最后依序用乙醇，稀酸和水彻底洗涤；
（2）GCE/Au/Ab1/PSA修饰电极的制备： 滴加3μL金锥 （Au NCs）溶液于干净的玻碳电极表面，在红外灯下烘干，冷却至室温；将3μL 0.2 mg/mL巯基苯硼酸溶液滴涂到修饰电极表面，在4°C下孵育50min， 用二次水清洗，去除多余的溶液；将此修饰电极浸泡于浓度为1mg/mL 的前列腺特异性抗原一抗（Ab1）溶液中4°C下孵育50 min，随后使用pH 7.4的PBS去除多余的前列腺特异性抗原一抗（Ab1）;再将此修饰电极浸入浓度为1.0 wt.%的BSA 40min，以封闭电极表面非特异性活性位点，用二次水冲去表面残余液后将电极浸入不同浓度的前列腺特异性抗原（PSA）溶液中于4°C下孵育50min；用Ph=7.4的PBS冲洗电极表面冲去表面残余液后在室温条件下自然晾干，即得到GCE/Au/Ab1/PSA修饰电极;
（3）GCE/Au/Ab1/PSA/Ab2-TiO2-B@CS-Ag2S修饰电极的制备：将100 μL 3 mg/mL的TiO2-B悬浮液与200 μL 1 mg/mL壳聚糖溶液混合，摇匀30min，反应好的溶液5000r/min转速下离心10min，去除多余的壳聚糖溶液，再加入200 μL的二次水分散，形成TiO2@CS溶液；将上述混合溶液与200 μL 0.1 M AgNO3溶液混合，摇匀反应30min，使Ag+充分吸附到TiO2-B表面，通过离心去除多余的Ag+用400 μL二次水再次分散均匀得到TiO2-B@CS-Ag+溶液；将200 μLTiO2-B@CS-Ag+溶液与600 μL 1 mg/mL的前列腺特异性抗原二抗（Ab2）混合，在4°C下反应2h，离心去除未吸附的前列腺特异性抗原二抗（Ab2），用600 μL pH=7.4的PBS再分散，再加入50 μL1.0 wt.%的BSA溶液封闭非活性位点，得到标记的二抗Ab2-TiO2-B@CS-Ag+；将步骤（2）制得的GCE /Au / Ab1/PSA修饰电极浸入不同浓度的前列腺特异性抗原（PSA）标准溶液与标记的二抗Ab2-TiO2-B@CS-Ag+混合溶液中于4°C下孵育50min，利用竞争反应结合固定在电极表面并用pH=7.4的PBS冲洗电极表面，在室温条件下自然晾干得到GCE/Au/Ab1/PSA/Ab2-TiO2-B@CS-Ag+修饰电极; 在室温下，将5μL 0.26M的H2O2与5μL 0.18M的S2O3 2-溶液一起滴涂到修饰的GCE/Au/Ab1/PSA/Ab2-TiO2-B@CS-Ag+电极表面，反应15min，在H2O2与TiO2-B@CS的催化作用下，原位生成Ag2S即可得到GCE/Au/Ab1/PSA/Ab2-TiO2-B@CS-Ag2S修饰电极；
（4）前列腺特异性抗原的检测：采用三电极体系进行测定，以GCE/Au/Ab1/PSA/Ab2-TiO2-B@CS-Ag2S修饰电极为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂丝电极为辅助电极，利用光电化学工作站进行检测，设置电压为-0.1，每隔10s进行开关灯，氙灯发射的单色光激发光源使用前由单色仪过滤；在pH=7.4的 PBS中，通过光电化学工作站进行检测10-6 ng/mL–50ng/mL之间的一系列不同浓度的前列腺特异性抗原标准溶液，通过记录开关灯前后产生的不同电流信号，绘制工作曲线；待测样品溶液代替前列腺特异性抗原标准溶液进行检测，检测的结果通过工作曲线查得。
上述TiO2-B纳米棒材料的制备：
将1g TiO2 分散到75mL15M的KOH溶液中，摇匀10min得到的悬浮液转移到100mL的反应釜中，并在170°C下反应72h，冷却至室温；得到的沉积物用0.5M醋酸溶液清洗直到pH为7.0，通过离心收集产物并在60°C的鼓风烘箱中干燥12h即可得到TiO2纳米线前驱体；将300mgTiO2纳米线前驱体分散在50mL浓度为8M的醋酸溶液中，接着将溶液转移到反应釜，加热到180°C反应24h；通过离心收集得到最终产物，并用二次水和乙醇清洗在60°C下干燥一夜即可制得TiO2-B纳米棒固体。将制得的固体溶解于二次水中，在超声下分散，配制成3 mg/mL的TiO2-B悬浮液。
上述金锥(Au NCs)的制备：
将250 μL 0 .01M氯金酸（HAuCl4）溶液和250 μL0 .01M氯铂酸（H2PtCl6）溶液依次加入20mL 0 .1M的十六烷基三甲基溴化铵 (CTAB) 溶液中，然后加入2000 μL新配置0 .01M的硼氢化钠（NaBH4）冰水溶液，摇匀后将溶液放置在35℃的烘箱中5h得到种子溶液A；取80mL0.1M十六烷基三甲基溴化铵 (CTAB)溶液于烧杯中，依次加入3.5mL0 .01M氯金酸（HAuCl4）溶液、150 μL0 .01M氯铂酸（H2PtCl6）溶液、800μL0 .01MAgNO3水溶液和1600 μL1M的HCl溶液，在搅拌下加入460 μL0 .1M的抗坏血酸（AA）溶液，待混合液变无色后立即加入200 μL上述种子溶液A并混合均匀，放入35℃的烘箱中12h, 离心分离收集上清液即可得到金纳米锥（Au NCs）溶液。
本发明所述的一种基于原位信号放大的夹心型前列腺特异性抗原光电化学免疫传感器，包括工作电极、铂丝电极为对电极和Ag/ AgCl为参比电极，其特征在于，所述的工作电极采用GCE/Au/Ab1/Ag修饰电极，其由下述步骤的方法制备而成的1）玻碳电极的抛光：玻碳电极首先在铺有氧化铝粉末的麂皮上机械打磨抛光，用二次水洗去表面残留粉末，再移入超声水浴中清洗，直至清洗干净，最后依序用乙醇，稀酸和水彻底洗涤；2）GCE/Au/Ab1/PSA/Ab2-TiO2-B@CS-Ag2S修饰电极的制备：滴加3μL金锥 （Au NCs）溶液于干净的玻碳电极表面，在红外灯下烘干，冷却至室温；将3μL 0.2 mg/mL巯基苯硼酸溶液滴涂到修饰电极表面，在4°C下孵育50min， 用二次水清洗，去除多余的溶液；将此修饰电极浸泡于浓度为1mg/mL 的前列腺特异性抗原一抗（Ab1）溶液中4°C下孵育50 min，随后使用pH=7.4的PBS去除多余的前列腺特异性抗原一抗（Ab1）;再将此修饰电极浸入浓度为1.0 wt.%的BSA 40min，以封闭电极表面非特异性活性位点，用二次水冲去表面残余液后将电极浸入不同浓度的前列腺特异性抗原（PSA）溶液中于4°C下孵育50min；用pH=7.4的PBS冲洗电极表面冲去表面残余液后在室温条件下自然晾干，即得到GCE/Au/Ab1/PSA修饰电极;将100 μL 3 mg/mL的TiO2-B悬浮液与200 μL 1 mg/mL壳聚糖溶液混合，摇匀30min，反应好的溶液5000r/min转速下离心10min，去除多余的壳聚糖溶液，再加入200 μL的二次水分散，形成TiO2@CS溶液；将上述混合溶液与200 μL 0.1 M AgNO3溶液混合，摇匀反应30min，使Ag+充分吸附到TiO2-B表面，通过离心去除多余的Ag+用400 μL二次水再次分散均匀得到TiO2-B@CS-Ag+溶液；将200 μL TiO2-B@CS-Ag+溶液与600 μL 1 mg/mL的前列腺特异性抗原二抗（Ab2）混合，在4°C下反应2h，离心去除未吸附的前列腺特异性抗原二抗（Ab2），用600 μL pH=7.4的PBS再分散，再加入50 μL1.0 wt.%的BSA溶液封闭非活性位点，得到标记的二抗Ab2-TiO2-B@CS-Ag+；将步骤（2）制得的GCE /Au / Ab1/PSA修饰电极浸入不同浓度的前列腺特异性抗原（PSA）标准溶液与标记的二抗Ab2-TiO2-B@CS-Ag+混合溶液中于4°C下孵育50min，利用竞争反应结合固定在电极表面并用pH=7.4的PBS冲洗电极表面，在室温条件下自然晾干得到GCE/Au/Ab1/PSA/Ab2-TiO2-B@CS-Ag+修饰电极; 在室温下，将5μL 0.26M的H2O2与5μL 0.18M的S2O3 2-溶液一起滴涂到修饰的GCE/Au/Ab1/PSA/Ab2-TiO2-B@CS-Ag+电极表面，反应15min，在H2O2与TiO2-B@CS的催化作用下，原位生成Ag2S即可得到GCE/Au/Ab1/PSA/Ab2-TiO2-B@CS-Ag2S修饰电极；
本发明所述的一种基于原位信号放大的夹心型前列腺特异性抗原光电化学免疫传感器用于前列腺特异性抗原的检测方法，其特征在于，步骤如下： 1）采用三电极体系进行测定，以GCE/Au/Ab1/PSA/Ab2-TiO2-B@CS-Ag2S修饰电极为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂丝电极为辅助电极，利用光电化学工作站进行检测，设置电压为-0.1，每隔10s进行开关灯，氙灯发射的单色光激发光源使用前由单色仪过滤；2）在pH 7.4的 PBS中，通过光电化学工作站进行检测10-6 ng/mL–50 ng/mL之间的一系列不同浓度的前列腺特异性抗原标准溶液，通过记录开关灯前后产生的不同电流信号，绘制工作曲线；待测样品溶液代替前列腺特异性抗原标准溶液进行检测，检测的结果通过工作曲线查得。
本发明的显著优点为：
(1)TiO2-B纳米材料相比与其他TiO2多晶具有更多的空隙和连续的通道，使得其具有更高的电子转移能力和光电效应。
(2)TiO2-B@CS复合物具有模拟酶的作用，将壳聚糖与TiO2-B形成复合物不仅可以增强TiO2-B的光电活性，还由于其独特的物理-化学性质，可以更好的与抗体结合，增强传感器的稳定性。
(3)通过竞争夹心免疫反应将Ab2-TiO2-B@CS-Ag+探针固定在电极界面，在过氧化氢存在下，催化氧化S2O3 2-生成S2-，再与探针上的Ag+结合原位生成Ag2S，使光电信号进一步增强为前列腺特异性抗原的超灵敏检测提供了平台。
附图说明
图1为本发明所述的前列腺特异性抗原的signal-on型光电化学传感器的制备过程示意图。
图2 A为不同浓度10-6 ng/mL–50 ng/mL（a-i）前列腺特异性抗原标准溶液，传感电极的光电流响应图。
图2 B为传感电极的光电流响应与前列腺特异性抗原标准溶液浓度的线性关系图。
具体实施方式
本发明用下列实施例来进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不限于下列实施例。
实施例1
一种基于原位信号放大的夹心型前列腺特异性抗原光电化学免疫分析方法(如图1所示)：
（1）玻碳电极的预处理：玻碳电极首先在铺有氧化铝粉末的麂皮上机械打磨抛光，用二次水洗去表面残留粉末，再移入超声水浴中清洗，直至清洗干净，最后依序用乙醇，稀酸和水彻底洗涤；
（2）滴加3μL金锥 （Au NCs）溶液于干净的玻碳电极表面，红外灯下烘干，冷却至室温；
（3）将3μL 0.2 mg/mL巯基苯硼酸溶液滴涂到修饰电极表面，在4°C下孵育50min， 用二次水清洗，去除多余的溶液；
（4）将修饰电极浸泡于浓度为1 mg/mL 的前列腺特异性抗原一抗（Ab1）溶液中4°C下孵育50 min，随后使用pH=7.4的PBS去除多余的前列腺特异性抗原一抗（Ab1）；
（5）再将电极浸入浓度为1.0 wt.%的BSA 40 min，封闭电极表面非特异性活性位点，用二次水冲去表面残余液后将电极浸入不同浓度的前列腺特异性抗原（PSA）溶液中于4°C下孵育50min；用pH=7.4的PBS冲洗电极表面冲去表面残余液后在室温条件下自然晾干，即得到GCE/Au/Ab1/PSA修饰电极;
（6）GCE/Au/Ab1/PSA/Ab2-TiO2-B@CS-Ag2S修饰电极的制备：将100 μL 3 mg/mL的TiO2-B悬浮液与200 μL 1 mg/mL壳聚糖溶液混合，摇匀30min，反应好的溶液5000r/min转速下离心10min，去除多余的壳聚糖溶液，再加入200 μL的二次水分散，形成TiO2@CS溶液；将上述混合溶液与200 μL 0.1 M AgNO3溶液混合，摇匀反应30min，使Ag+充分吸附到TiO2-B表面，通过离心去除多余的Ag+用400 μL二次水再次分散均匀得到TiO2-B@CS-Ag+溶液；将200 μLTiO2-B@CS-Ag+溶液与600 μL 1 mg/mL的前列腺特异性抗原二抗（Ab2）混合，在4°C下反应2h，离心去除未吸附的前列腺特异性抗原二抗（Ab2），用600 μL pH=7.4的PBS再分散，再加入50 μL1.0 wt.%的BSA溶液封闭非活性位点，得到标记的二抗Ab2-TiO2-B@CS-Ag+；将步骤（2）制得的GCE /Au / Ab1/PSA修饰电极浸入不同浓度的前列腺特异性抗原（PSA）标准溶液与标记的二抗Ab2-TiO2-B@CS-Ag+混合溶液中于4°C下孵育50min，利用竞争反应结合固定在电极表面并用pH=7.4的PBS冲洗电极表面，在室温条件下自然晾干得到GCE/Au/Ab1/PSA/Ab2-TiO2-B@CS-Ag+修饰电极; 在室温下，将5μL 0.26M的H2O2与5μL 0.18M的S2O3 2-溶液一起滴涂到修饰的GCE/Au/Ab1/PSA/Ab2-TiO2-B@CS-Ag+电极表面，反应15min，在H2O2与TiO2-B@CS的催化作用下，原位生成Ag2S即可得到GCE/Au/Ab1/PSA/Ab2-TiO2-B@CS-Ag2S修饰电极；
上述TiO2-B纳米棒材料的制备：
将1g TiO2 分散到75mL15M的KOH溶液中，摇匀10min得到的悬浮液转移到100mL的反应釜中，并在170°C下反应72h，冷却至室温；得到的沉积物用0.5M醋酸溶液清洗直到pH为7.0，通过离心收集产物并在60°C的鼓风烘箱中干燥12h即可得到TiO2纳米线前驱体；将300mg制得的TiO2纳米线前驱体分散在50mL浓度为8M的醋酸溶液中，接着将溶液转移到反应釜，加热到180°C反应24h；通过离心收集得到最终产物，并用二次水和乙醇清洗在60°C下干燥一夜即可制得TiO2-B纳米棒固体。将制得的固体溶解于二次水中，在超声下分散，配制成3mg/mL的TiO2-B悬浮液。
上述金锥(Au NCs)的制备：
将250 μL 0 .01M氯金酸（HAuCl4）溶液和250 μL0 .01M氯铂酸（H2PtCl6）溶液依次加入20mL 0 .1M的十六烷基三甲基溴化铵 (CTAB) 溶液中，然后加入2000 μL新配置0 .01M的硼氢化钠（NaBH4）冰水溶液，摇匀后将溶液放置在35℃的烘箱中5h得到种子溶液A；取80mL0.1M十六烷基三甲基溴化铵 (CTAB)溶液于烧杯中，依次加入3.5mL0 .01M氯金酸（HAuCl4）溶液、150 μL0 .01M氯铂酸（H2PtCl6）溶液、800μL0 .01MAgNO3水溶液和1600 μL1M的HCl溶液，在搅拌下加入460 μL0 .1M的抗坏血酸（AA）溶液，待混合液变无色后立即加入200 μL上述种子溶液A并混合均匀，放入35℃的烘箱中12h, 离心分离收集上清液即可得到金纳米锥（Au NCs）溶液。
实施例2
一种基于原位信号放大的夹心型前列腺特异性抗原光电化学免疫分析方法，步骤如下：
（1）采用三电极体系进行测定，以实施例1制得的GCE/Au/Ab1/PSA/Ab2-TiO2-B@CS-Ag2S修饰电极为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂丝电极为辅助电极，利用光电化学工作站进行检测，设置电压为-0.1，每隔10s进行开关灯，氙灯发射的单色光激发光源使用前由单色仪过滤；
（2）在pH 7.4的 PBS中，通过光电化学工作站进行检测10-6 ng/mL–50 ng/mL一系列不同浓度的前列腺特异性抗原标准溶液，通过记录开关灯前后产生的不同电流信号，绘制工作曲线。图2 A为不同浓度10-6 ng/mL–50 ng/mL（a-i）前列腺特异性抗原标准溶液，传感电极的光电流响应。图2 B为传感电极的光电流响应与前列腺特异性抗原标准溶液浓度的线性关系图。
将待测样品溶液代替列腺特异性抗原标准溶液进行检测，检测的结果可通过工作曲线查得。

Claims (4)

1.一种基于原位信号放大的夹心型前列腺特异性抗原光电化学免疫分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）玻碳电极（GCE）的预处理：GCE首先在铺有氧化铝粉末的麂皮上机械打磨抛光，用二次水洗去表面残留粉末，再移入超声水浴中清洗，直至清洗干净，最后依序用乙醇，稀酸和水彻底洗涤；
（2）GCE/Au/Ab1/PSA修饰电极的制备： 滴加3μL金锥 （Au NCs）溶液于干净的玻碳电极表面，在红外灯下烘干，冷却至室温；将3μL 0.2 mg/mL巯基苯硼酸溶液滴涂到修饰电极表面，在4°C下孵育50min， 用二次水清洗，去除多余的溶液；将此修饰电极浸泡于浓度为1mg/mL 的前列腺特异性抗原一抗（Ab1）溶液中4°C下孵育50 min，随后使用pH 7.4的PBS去除多余的前列腺特异性抗原一抗（Ab1）;再将此修饰电极浸入浓度为1.0 wt.%的BSA 40min，以封闭电极表面非特异性活性位点，用二次水冲去表面残余液后将电极浸入不同浓度的前列腺特异性抗原（PSA）溶液中于4°C下孵育50min；用Ph=7.4的PBS冲洗电极表面冲去表面残余液后在室温条件下自然晾干，即得到GCE/Au/Ab1/PSA修饰电极;
（3）GCE/Au/Ab1/PSA/Ab2-TiO2-B@CS-Ag2S修饰电极的制备：将100 μL 3 mg/mL的TiO2-B悬浮液与200 μL 1 mg/mL壳聚糖溶液混合，摇匀30min，反应好的溶液5000r/min转速下离心10min，去除多余的壳聚糖溶液，再加入200 μL的二次水分散，形成TiO2@CS溶液；将上述混合溶液与200 μL 0.1 M AgNO3溶液混合，摇匀反应30min，使Ag+充分吸附到TiO2-B表面，通过离心去除多余的Ag+用400 μL二次水再次分散均匀得到TiO2-B@CS-Ag+溶液；将200 μLTiO2-B@CS-Ag+溶液与600 μL 1 mg/mL的前列腺特异性抗原二抗（Ab2）混合，在4°C下反应2h，离心去除未吸附的前列腺特异性抗原二抗（Ab2），用600 μL pH=7.4的PBS再分散，再加入50 μL1.0 wt.%的BSA溶液封闭非活性位点，得到标记的二抗Ab2-TiO2-B@CS-Ag+；将步骤（2）制得的GCE /Au / Ab1/PSA修饰电极浸入不同浓度的前列腺特异性抗原（PSA）标准溶液与标记的二抗Ab2-TiO2-B@CS-Ag+混合溶液中于4°C下孵育50min，利用竞争反应结合固定在电极表面并用pH=7.4的PBS冲洗电极表面，在室温条件下自然晾干得到GCE/Au/Ab1/PSA/Ab2-TiO2-B@CS-Ag+修饰电极; 在室温下，将5μL 0.26M的H2O2与5μL 0.18M的S2O3 2-溶液一起滴涂到修饰的GCE/Au/Ab1/PSA/Ab2-TiO2-B@CS-Ag+电极表面，反应15min，在H2O2与TiO2-B@CS的催化作用下，原位生成Ag2S即可得到GCE/Au/Ab1/PSA/Ab2-TiO2-B@CS-Ag2S修饰电极；
（4）前列腺特异性抗原的检测：采用三电极体系进行测定，以GCE/Au/Ab1/PSA/Ab2-TiO2-B@CS-Ag2S修饰电极为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂丝电极为辅助电极，利用光电化学工作站进行检测，设置电压为-0.1，每隔10s进行开关灯，氙灯发射的单色光激发光源使用前由单色仪过滤；在pH=7.4的 PBS中，通过光电化学工作站进行检测10-6 ng/mL–50ng/mL之间的一系列不同浓度的前列腺特异性抗原标准溶液，通过记录开关灯前后产生的不同电流信号，绘制工作曲线；待测样品溶液代替前列腺特异性抗原标准溶液进行检测，检测的结果通过工作曲线查得。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的TiO2-B纳米棒材料由下述方法制备的：将1g TiO2 分散到75mL15M的KOH溶液中，摇匀10min得到的悬浮液转移到100mL的反应釜中，并在170°C下反应72h，冷却至室温；得到的沉积物用0.5M醋酸溶液清洗直到pH为7.0，通过离心收集产物并在60°C的鼓风烘箱中干燥12h即可得到TiO2纳米线前驱体；将300mgTiO2纳米线前驱体分散在50mL浓度为8M的醋酸溶液中，接着将溶液转移到反应釜，加热到180°C反应24h；通过离心收集得到最终产物，并用二次水和乙醇清洗在60°C下干燥一夜即可制得TiO2-B纳米棒固体；将制得的固体溶解于二次水中，在超声下分散，配制成3 mg/mL的TiO2-B悬浮液。
3.一种基于原位信号放大的夹心型前列腺特异性抗原光电化学免疫传感器，包括工作电极、铂丝电极为对电极和Ag/ AgCl为参比电极，其特征在于，所述的工作电极采用GCE/Au/Ab1/PSA/Ab2-TiO2-B@CS-Ag2S修饰电极，所述的GCE/Au/Ab1/PSA/Ab2-TiO2-B@CS-Ag2S修饰电极由下述方法制备而成的：1）玻碳电极的抛光：玻碳电极首先在铺有氧化铝粉末的麂皮上机械打磨抛光，用二次水洗去表面残留粉末，再移入超声水浴中清洗，直至清洗干净，最后依序用乙醇，稀酸和水彻底洗涤；2）GCE/Au/Ab1/PSA/Ab2-TiO2-B@CS-Ag2S修饰电极的制备：滴加3μL金锥 （Au NCs）溶液于干净的玻碳电极表面，在红外灯下烘干，冷却至室温；将3μL 0.2 mg/mL巯基苯硼酸溶液滴涂到修饰电极表面，在4°C下孵育50min， 用二次水清洗，去除多余的溶液；将此修饰电极浸泡于浓度为1 mg/mL 的前列腺特异性抗原一抗（Ab1）溶液中4°C下孵育50 min，随后使用pH=7.4的PBS去除多余的前列腺特异性抗原一抗（Ab1）;再将此修饰电极浸入浓度为1.0 wt.%的BSA 40 min，以封闭电极表面非特异性活性位点，用二次水冲去表面残余液后将电极浸入不同浓度的前列腺特异性抗原（PSA）溶液中于4°C下孵育50min；用pH=7.4的PBS冲洗电极表面冲去表面残余液后在室温条件下自然晾干，即得到GCE/Au/Ab1/PSA修饰电极;将100 μL 3 mg/mL的TiO2-B悬浮液与200 μL 1 mg/mL壳聚糖溶液混合，摇匀30min，反应好的溶液5000r/min转速下离心10min，去除多余的壳聚糖溶液，再加入200 μL的二次水分散，形成TiO2@CS溶液；将上述混合溶液与200 μL 0.1 M AgNO3溶液混合，摇匀反应30min，使Ag+充分吸附到TiO2-B表面，通过离心去除多余的Ag+，用400 μL二次水再次分散均匀得到TiO2-B@CS-Ag+溶液；将200 μL TiO2-B@CS-Ag+溶液与600 μL 1mg/mL的前列腺特异性抗原二抗（Ab2）混合，在4°C下反应2h，离心去除未吸附的前列腺特异性抗原二抗（Ab2），用600 μL pH=7.4的PBS再分散，再加入50 μL1.0 wt.%的BSA溶液封闭非活性位点，得到标记的二抗Ab2-TiO2-B@CS-Ag+；将步骤（2）制得的GCE /Au / Ab1/PSA修饰电极浸入不同浓度的前列腺特异性抗原（PSA）标准溶液与标记的二抗Ab2-TiO2-B@CS-Ag+混合溶液中于4°C下孵育50min，利用竞争反应结合固定在电极表面并用pH=7.4的PBS冲洗电极表面，在室温条件下自然晾干得到GCE/Au/Ab1/PSA/Ab2-TiO2-B@CS-Ag+修饰电极; 在室温下，将5μL 0.26M的H2O2与5μL 0.18M的S2O3 2-溶液一起滴涂到修饰的GCE/Au/Ab1/PSA/Ab2-TiO2-B@CS-Ag+电极表面，反应15min，在H2O2与TiO2-B@CS的催化作用下，原位生成Ag2S即可得到GCE/Au/Ab1/PSA/Ab2-TiO2-B@CS-Ag2S修饰电极。
4.权利要求3所述的一种基于原位信号放大的夹心型前列腺特异性抗原光电化学免疫传感器用于列腺特异性抗原的检测方法，其特征在于，步骤如下：1）采用三电极体系进行测定，以GCE/Au/Ab1/Ag/Ab2-TiO2-B@CS-Ag2S修饰电极为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂丝电极为辅助电极，利用光电化学工作站进行检测，设置电压为-0.1，每隔10s进行开关灯，氙灯发射的单色光激发光源使用前由单色仪过滤；2）在pH=7.4的 PBS中，通过光电化学工作站进行检测10-6 ng/mL–50 ng/mL之间的一系列不同浓度的前列腺特异性抗原标准溶液，通过记录开关灯前后产生的不同电流信号，绘制工作曲线；待测样品溶液代替前列腺特异性抗原标准溶液进行检测，检测的结果通过工作曲线查得。
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