JP3013937B2 - 複数の磁石を含む磁性微粒子に基づいたルミネッセンス・アッセイのための方法ならびに装置 - Google Patents

複数の磁石を含む磁性微粒子に基づいたルミネッセンス・アッセイのための方法ならびに装置

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明の分野 本発明は試料、電気化学的ルミネッセンスを誘発させ
る能力があるラベルに結合した成分を含有したアッセイ
履行物質、および検体または物質と結合する能力がある
複数の磁気感応性懸濁粒子を含んだ錯体が形成されてい
る電極での電気化学的ルミネッセンスを測定することに
よって試料中に存在する対象検体の結合アッセイを行う
方法に関するものであり；錯体は南北極方向に配向した
複数の永久磁石または電磁石によって粒子上に磁場を配
置することによって電極の表面に集められ；標識は発光
を誘発し；放射されたルミネッセンスを測定する。本発
明は南北方向に配向した複数の永久磁石または電磁石を
有するかかる方法を実行するための装置にも関連したも
のである。
本発明の背景 生化学的ならびに生物学的物質中の対象検体の検出な
らびに定量方法については多くの方法ならびにシステム
が開発されている。痕跡量の微生物、医薬品、ホルモ
ン、ウイルス、抗体、核酸、ならびにその他の蛋白質を
測定することができる方法ならびにシステムは研究者お
よび臨床医にとって多大の価値を有するものである。
公知の結合反応、例えば抗原／抗体反応、核酸交雑技
術、蛋白質／配位子系、などをベースにした実効性のあ
る技術が開発されている。多くの生化学的および生物学
的結合系の優れた特異性はかかる検出方法ならびにシス
テムを研究ならびに診断の分野で価値あるものとしてい
る。結合物質の単数または複数に結合した観測可能な
「標識」の有無によって対象検体の存在が表示されるケ
ースはその代表例である。光化学的、化学的、電気化学
的方法によって発光するようになる標識は特に興味深い
ものである。「光化学ルミネッセンス」は物質が電磁放
射を吸収したときに発光が誘発されるプロセスである。
蛍光と燐光は光ルミネッセンスの一種である。「化学ル
ミネッセンス」プロセスはエネルギーの化学転移によっ
て発光種を作り出す。「電気化学的ルミネッセンス」は
電気化学的に発光種を創出する。
対象検体を含む試料が化学発光ラベルで標識された反
応物と混在している化学ルミネッセンス検出技法が開発
された。反応性混合物は培養されて標識された反応物の
一部が検体に結合している。培養後に混合物の結合およ
び未結合画分が分離されて一方または双方の画分中の標
識の濃度が化学発光技法によって測定される。一方また
は双方の画分中で測定された化学ルミネッセンスのレベ
ルが生物学的試料中の対象検体の量を表示している。
電気化学的ルミネッセンス（ECL）検出技法は化学ル
ミネッセンス技法の改良法である。この方法は対象検体
の存否または濃度の測定感度と精度を向上させる。この
技法ではルミネッセンスを誘発する目的で培養した試料
をボルタンメトリー作動電極に暴露する。通常の化学的
環境では、この様な電気化学的ルミネッセンスは特定の
時間に特定の方法で作動電極に印加された電圧によって
誘発される。標識によって誘起された光が測定されて分
析対象物の存否と量を表す。この様なECL技法の詳細を
理解するためには、PCT公開出願US85/01253（WO86/0273
4）、PCT公開出願US87/00987、PCT公開出願US88/03947
を参考にすることができる。かかる出願の開示は参考文
献の欄に記載してある。
望ましいことには、電気化学発光アッセイはその操作
に分離工程を必要とせず濃度が違っても信号の変調が最
大になるので精密で高感度の測定が行うことができる。
分離を行わないでアッセイを行う既存の技術としては検
定する試料の中に懸濁した微粒子状の物質をアッセイを
行う単数または複数の結合成分と結合させる方法を挙げ
ることができる。
合衆国特許第4,305,925号は臨床的に問題となる蛋白
やペプチドを散乱光比濁法や透過光比濁法で検出／測定
する方法に関するものである。この開示された方法は抗
原または抗体を光を散乱または吸収する機能があるラテ
ックス粒子と結合させることから構成されている。
合衆国特許第4,480,042号は殻／コア構造を持った粒
子で構成された粒子試薬を使用する方法に関するもので
ある。殻部分は生物学的に問題となる化合物が共有結合
できる官能基を含有していて、殻部分の屈折率が大きい
ために光散乱の測定に対して高感度を与える。この技法
は２原子価の抗体が問題となる多原子価の抗原と反応し
て色々な方法で検出および／または測定できる凝集物を
生成する凝集反応に基づいたものである。
合衆国特許第4,419,453号も抗体や免疫原の様な免疫
化学物質の存在を検出するのに有用な着色ラテックス凝
集試験法に関するものである。
これらの既存の技法では発光現象が認められるような
微粒子物体が使用される可能性は認められていない。遊
離の化学的発光性または電気化学的発光性部分からのル
ミネッセンスは吸収されるか、散乱されるか、或いは微
粒子物体と相互作用を起こしたものと考えられる。
この様な予想とは対照的に、合衆国出願第539,389（P
CT公開出願U.S.89/04919）では不活性の微粒子物体がア
ッセイ系の結合反応体の一つと特異的に結合する際の発
光現象に基づいた高感度の、特異的な結合アッセイ法が
提起されている。アッセイは不均一系（一段法または多
段法）アッセイ方式でも行われるが、均一系（非分離
法）アッセイ方式で行うのが最も望ましい。
U.S.89/04919は発光現象を観測するための結合反応に
基づいた組成物に関するものであって、かかる組成物と
してはアッセイ混合物の成分と結合することが出来る表
面を持った複数の懸濁粒子を挙げることが出来る。別の
観点から云うと、この出願は試料中の対象検体を検出ま
たは定量するシステムを目的としたものであって、かか
るシステムは本発明のアッセイ組成物を使用するアッセ
イ方法の遂行を可能にするものである。このシステムに
はアッセイ媒体中のラベル化合物の発光を誘発する方
法、および試料中の対象検体の存在を検出するためにル
ミネッセンスを測定する方法を含んでいる。
電気化学的発光性部分が結合しているアッセイ系の成
分が懸濁している微粒子物体に結合すると、成分に結合
した電気化学的発光性部分によって励起された発光信号
の強度が大きく変調されて、その結果アッセイ系の特異
的な結合反応をモニターできる方法が提供されることが
見出された。更に驚くべきことには、懸濁している微粒
子物体に結合しないで残っている系中の成分に結合した
電気化学的発光性部分によって励起されたルミネッセン
ス信号の強度に、懸濁粒子は殆ど影響を及ぼさないこと
が見出された。
U.S.89/04919は試料中の対象検体を検出する方法を目
的としたものであって、この方法は（１）（ａ）対象検
体を含んでいると考えられる試料、（ｂ）（ｉ）対象検
体または対象検体の類似体（ii）対象検体またはその類
似体の結合相手（iii）（ｉ）または（ii）と結合する
ことが出来る反応成分から成る群から選ばれたアッセイ
履行物質で、かかる物質の一つは発光が誘発され得る化
学的部分を持った標識に結合している、および（Ｃ）上
記（ｉ）（ii）（iii）で定義された検体および／また
は物質と特異的に結合することが出来る複数の懸濁粒子
を含む組成物を作る；（２）この組成物を培養して粒子
と標識化合物とを包含した錯体を形成させる；（３）標
識化合物の発光を誘発させる；（４）組成物から放射さ
れたルミネッセンスを測定して試料中の対象検体の存在
を検出するという各工程を含んでいる。この同じ方法は
アッセイを行う組成物のルミネッセンスを既知量の検体
を含む組成物のルミネッセンスと比較することによって
試料中の検体の量を定量するのに利用することもでき
る。
対象検体の類似体は、それが天然品の場合でも合成品
の場合でも、検体と類似した結合能を持った化合物であ
るが、結合能に差が出る場合もある。本発明に使用する
に適した結合相手は公知である。抗体、酵素、核酸、レ
クチン（糖結合性蛋白質）、補因子、受容体、等をその
例として挙げることが出来る。検体またはその類似体お
よび／またはその結合相手と結合することが出来る反応
成分は二次抗体或いはタンパクＡまたはタンパクＢのよ
うな蛋白質である場合もあるし、またアビジン、ビオチ
ン、または結合反応に関与することが公知である他の成
分である場合もある。
好都合なことには、標識化合物は、それが特異的結合
相手と結合している場合でも結合していない場合でも、
ボルタンメトリー作動電極に暴露することによって励起
された電気化学的ルミネッセンス（ECL）からルミネッ
センスが生起する。ECL反応性混合物は作動電極に発光
させる特定の時間に特定の方法で印加された電圧によっ
て制御可能な励起を受けて光を放射する。可視光が放射
されるのは非常に好ましいケースであるが、組成やシス
テムによっては赤外線、紫外線、Ｘ線、マイクロ波など
の他のタイプの電磁波が放射される場合もある。「電気
化学的ルミネッセンス」、「電気化学的発光性」、「ル
ミネッセンス」、「発光性」、「発光する」といったよ
うな用語は全て他のタイプの電磁波を包含した意味を持
っている。
U.S.89/04919に記載されている方法は研究や臨床で実
施される各種のアッセイに於いて極めて微量の検体の検
出または定量を可能にしている。しかし研究者や臨床医
の要求はこの方法で行われるアッセイの検出限界をより
小さくしてアッセイの感度を上げ実行速度を高めること
を求めている。
測定を行う前に濃縮することによって標識された部分
からの信号を強くするのは、色々な方法が既に知られて
いる。例えば合衆国特許第4,652,333号では蛍光、燐
光、原子蛍光ラベルで標識された粒子を測定の前に微細
フィルターで濾過することによって濃縮している。
標識された免疫化学部分を測定に先立って、例えば磁
気に応答性がある標識粒子を測定容器の表面に流すこと
によって濃縮する方法も公知である。例えば、合衆国特
許第4,731,337号、4,777,145号、4,115,535号ではかか
る粒子を器壁上に流してから電磁放射線を当てて蛍光を
誘発させている。
合衆国特許第4,945,045号では粒子を磁極上で濃縮し
ている。標識された化学的媒介物質によって易化された
電極上で電気化学反応が起こっている。免疫化学的結合
反応が媒介物質の効率を変化させてその結果結合が起こ
ったときに信号が変調される。
これらの先行技術は本発明の選択的表面励起プロセス
には適合しない。表面励起についての特定の機構的説
明、例えば電気化学的ルミネッセンスによっては結合さ
れていないが、個体錯体上のラベルは電極上で酸化され
るはずであると信じられている。その結果電子はラベル
から電極へ移動する。電子が或空間を（例えば溶液のよ
うなポテンシャル・エネルギーが非常に高い領域を）ポ
テンシャル・エネルギーの壁を「越える」ことなしに通
過するトンネリングという現象によって電子が「跳躍」
を起こすと信じられている。エネルギーの壁を越えてト
ンネリングが起こるのであるから、一つの分子から他の
分子へ、或いは一つの分子から電極への電子の移動が付
加的なエネルギーの供給なしに起こる。しかしこのトン
ネリング現象は非常に短い距離でのみ起こる。二つの切
片間の距離が増加するとトンネリングが起こる確立は指
数的に低下する。距離が25オングストローム（2.5ナノ
メーター）以下であれば二つの切片間でトンネリングが
起こる確立は十分に高いが距離が大きくなると急激に低
下する。25Åという距離は当業者の間で経験則となって
いるが、決して絶対的な限界ではない。
従って、電極面から25Å以内にあるECL標識のみがECL
反応に寄与することが期待される。電極面から25Å以内
である粒子の範囲は極めて小さいものである。
従って、粒子面からのECLが明確に測定できるという
ことは期待できない。更にまた、ECLプロセスで発生す
る光は粒子の間を通って光電子倍増管に到達しなければ
ならない。粒子は本質的に不透明（濃厚な懸濁液は黒
い）であるからECLで相当強い発光があっても光が粒子
の間を通過して光電子倍増管で測定できることは期待で
きない。その上、これらの先行技術は本発明の方法なら
びに装置に特異的な南北極を持った複数の磁石について
は全く言及していない。
本発明の目的 磁性微粒子状物体を含有し複数の南北極を持った磁石
を使用したアッセイ組成物から放射された電気化学的ル
ミネッセンスを測定することを基礎にした分離（非均
一）または非分離（均一）の特異性結合方法および装置
を提供することが本発明の目的である。
既に到達している感度を向上し、アッセイに要する時
間を短縮し、特異性を向上させ、検出限界を下げ、精度
を向上させた方法および装置を提供することが今後の関
連課題である。
本発明の説明 用語の定義 「ECL部分」、「金属含有ECL部分」、「標識」、「標
識化合物」、「標識物質」という各用語は相互に交換可
能である。検体またはその類似体、検体またはその類似
体の結合相手、かかる結合相手と更に結合することが出
来る結合相手、または検体、その類似体、または上述し
たような結合相手と結合することが出来る反応成分など
の分子にリンクした「ECL部分」、「金属含有ECL部
分」、「有機金属」、「金属キレート」、「遷移金属キ
レート」、「希土類金属キレート」、「標識化合物」、
「標識物質」、「標識」の用語を付した物質も本発明の
範囲に含まれている。上述した物質は単数または複数の
結合相手および／または単数または複数の反応性成分と
もリンクすることが出来る。更にまた、上述した物質は
結合相手、反応成分、或いは単数または複数の結合相手
および／または単数または複数の反応成分の組み合わせ
に結合した検体またはその類似体ともリンクすることが
出来る。複数の上述した物質が直接に、または上述した
ような分子を介して検体またはその類似体に結合したも
のも本発明の範囲に含まれている。簡単化のためにこれ
らの配位子はアッセイ履行物質と定義されている。
検出と定量という用語は「測定」を意味するものと定
義され、定量は対照組成物を調製し補正を行う必要があ
るものと理解されている。
錯体の捕集と濃縮という用語は、アッセイ組成物内の
錯体の濃縮と、錯体の例えば電極面への捕集を記述する
のに、交換可能に用いられている。
図面の簡単な説明 第１図と第２図は磁性微粒子に基づいた分離または非
分離アッセイ法を実施するための本発明のセルと複数の
磁石を示したものである；磁石システムの複数の磁石
は、その殆どが電極面に平行になっている磁力線を形成
している。
第３図は、第１図と第２図の電磁石が錯体を電極面に
集中させるように配置された沈降アッセイ・セルの図解
である。
第４図は磁場（第１図と第２図）と重力の影響をそれ
ぞれ受けている場合の微粒子錯体の相対的な沈降速度、
即ち磁場（第１図と第２図）で起こる沈降と重力で起こ
る沈降の比較を示すグラフであって、磁場による沈降に
対する値は白丸で重力による沈降に対する値は黒丸で示
されている。
第５図は第１図と第２図の永久磁石を含んだ捕集セル
の図解である。
第６図は第５図のセルを使用して行ったアッセイの時
間の関数としてのECL強度の増加、即ちECL強度に及ぼす
捕集時間の影響を示すグラフである。
第７図は電極の下方の電極面の近傍での磁力線（第１
図と第２図）の図解である。
第８図は微粒子に基づいた非分離および分離アッセイ
を行う本発明のセルの図解である。
第９図は第８図のセルに使用する電圧調整装置の略図
である。
本発明の簡単な説明 最も広範な実施例に於いて、本発明は試料中の対象検
体に対して結合アッセイを行う方法である。この方法は
次のような手順で構成されている： （ａ）下記のものを含む組成物を作る （ｉ）当該試料 （ii）電気化学的ルミネッセンスを誘起することが出
来る標識化合物に結合した成分を含有するアッセイ履行
物質；および （iii）検体および／または当該アッセイ可能物質と
特異的に結合できる複数の磁気感応性懸濁粒子； （ｂ）その組成物をインキュベートして粒子と当該標識
化合物を含有した錯体を形成させる； （ｃ）この組成物をアッセイ用セルに導入する； （ｄ）この粒子に磁場をかけて電極面に錯体を捕集す
る； （ｅ）電極に電圧を印加することによって捕集した錯体
中の標識化合物にルミネッセンスを誘起させる；および （ｆ）電極面で放射されたルミネッセンスを測定して試
料中の対象検体の存在を検出する；この際に永久磁石ま
たは電磁石で構成された複数の磁石は南北極を交互に配
置して水平に配置された電極の下方に垂直に配置してい
る。
本発明は電極面での電気化学的ルミネッセンスの測定
に基づいた試料中の対象検体の結合アッセイを行う下記
のような構成の装置をも合わせて提供するものである： （ａ）ある容積を持ったアッセイ試料を規定した導入／
排出の手段と電極を有していて該錯体を実質的に該電極
面上に分布させる手段をも合わせて有しているセル； （ｂ）該電極に電圧を印加する手段；および （ｃ）該電極上で励起された電気化学的ルミネッセンス
の測定手段；錯体の均一な分布を得るための手段は当該
磁場の磁力線が該電極面の領域で該電極の面に実質的に
平行になるように該電極に対して配置された磁場を発生
させる手段を含んでいる；また、磁場を発生させる手段
は南北極の配置を有し非磁性材料で分離された当該電極
のしたに垂直に配置された複数の磁石を含んでいる。
錯体を電極面に集めて濃縮するための上述した手段を
使うことによって結合アッセイを行う不均一ならびに均
一の複数の方式をとることが出来る。不均一結合アッセ
イではラベルからのルミネッセンスの測定を行うに先立
って錯体が組成物から分離される。均一アッセイでは、
（固相に）結合した試薬または未結合の試薬との分離は
行われない。
不均一アッセイでは、錯体が作動電極面で濃縮される
とラベルからの測定される信号は捕集ステップがない場
合に比べて遥かに強くなる。これに対して錯体を形成し
ていない標識された試薬からの信号は変化しない。従っ
て、測定セル中に錯体を形成していない標識された試薬
が存在していても補修された錯体からの信号は錯体の捕
集を行っていないアッセイの場合よりも強くなる。結合
アッセイの検出限界は捕集を行うことによって著しく向
上する。
本発明では、in−situ（本体の場所での）分離工程は
均一結合アッセイ法に包含されている。アッセイされる
組成物、即ち試料、アッセイできる物質、粒子が測定セ
ルにポンプで送られて錯体が作動電極で捕捉された後
で、第２の液がラベルまたはラベルされた試薬を含まな
いセルにポンプで送られて、その結果錯体がアッセイさ
れる組成物の未結合の成分からin−situで洗浄または分
離される。このアッセイ手順は技術的には均一結合アッ
セイに属している。しかしながら、測定セルの内部で分
離操作が行えるということは分離のための付加設備を要
しないという点で大きな利点であり、外部分離法を取る
場合に比べて一般的に迅速な操作が可能となる。
不均一結合アッセイはアッセイ組成物の成分を混合し
てから予め設定しておいた時間だけ反応させるという本
発明の方法で行われる。アッセイ組成物は次に分離操作
にかけて溶液は粒子から分離される。電気化学的ルミネ
ッセンスはこの状態で錯体または溶液から測定される。
濃縮工程を経た後に錯体からのECLを測定すると濃縮を
行わなかった場合に比べてより良好な精度とより小さい
検出限界で検体の測定を行うことが出来る。
発明の詳細な説明 本発明はそれに付随する事項を含めて以下に記述する
幾つかの実施例の説明から、より一層明瞭に理解するこ
とが出来る。
本発明は結合反応に参入することが出来る対象検体に
広く適用することが出来る。かかる反応には、例えば抗
原／抗体、配位子受容体、DNAとRNAの相互作用、等の既
知の反応が含まれる。本発明は多成分試料中の対象検体
の存在を定性的、定量的に検出する方法および装置に関
するものである；かかる方法および装置には南北極を持
った複数の磁石が含まれている。
試料 対象検体を含有することが出来る試料は固体、乳濁
液、懸濁液、液体、またはガス状であることが可能で、
例えば、細胞ならびに細胞誘導体、水、食品、血液、血
清、毛髪、汗、尿、糞、組織、唾液、油、有機溶媒、ま
たは空気から導かれる。試料は更にまた、例えば、水、
アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、ジメチルホル
ムアミド、ｎ−メチルピロリドンまたはアルコール、ま
たはそれらの混合物を含有することが出来る。
検体： 典型的な対象検体には全細胞または表面抗原、細胞レ
ベル以下の粒子、ウイルス、プリオン、ウイロイド、抗
体、抗原、ハプテン、脂肪酸、核酸、蛋白、リポ蛋白、
多糖類、リポ多糖類、グリコ蛋白、ペプチド、ポリペプ
チド、細胞代謝物、ホルモン、薬理試薬、合成有機分
子、有機金属分子、トランキライザー、バルビツール酸
誘導体、アルカロイド、ステロイド、ビタミン、アミノ
酸、糖、レクチン、組換えまたは誘導蛋白、ビオチン、
アビジン、ストレプトアジピン、または試料中に存在す
る無機分子がある。典型的には、対象検体はモル濃度で
10-3以下、例えば10-12という様な低濃度で存在してい
る。
アッセイ履行物質 対象検体を含有する試料と結合されるアッセイ履行物
質は（ｉ）上述の添加された検体またはその類似体、
（ii）対象検体またはその類似体の結合相手、および
（iii）（ｉ）または（ii）と結合できる上述の反応性
成分、で構成されるグループから選ばれた少なくとも一
つのを含有していて、かかる物質の中の一つは化合物ま
たは部分、例えばルミネッセンスを誘発することが出来
るECL部分と結合する。標識された物質は全細胞または
表面抗原、細胞レベル以下の粒子、ウイルス、プリオ
ン、ウイロイド、抗体、抗原、ハプテン、脂質、脂肪
酸、核酸、多糖類、蛋白、リポ蛋白、リポ多糖類、グリ
コ蛋白、ペプチド、ポリペプチド、細胞代謝物、ホルモ
ン、薬理試薬、トランキライザー、バルビツール酸誘導
体、アルカロイド、ステロイド、ビタミン、アミノ酸、
糖、非生体ポリマー（好ましくは可溶性の）、レクチ
ン、組換えまたは誘導蛋白、合成有機分子、有機金属分
子、無機分子、ビオチン、アビジンまたはストレプトア
ビジンであることが出来る。一つの実施例では、この試
薬は抗体、抗原、核酸、ハプテン、小ヌクレオチド配
列、オリゴマー、配位子、酵素、ビオチン、アビジン、
ストレプトアビジン、蛋白Ａ、蛋白Ｃ、またはそれらの
錯体と共役している電気化学的ルミネッセンス部分、ま
たはタンパク質相互作用によって一次結合相手と結合で
きる二次結合相手である。
対象検体の類似体は、天然品または合成品であって、
一般的には検体と同様の結合性を持った化合物である
が、結合性がより小さいかより大きい化合物である場合
もある。検体またはその類似体と、および／またはその
結合相手と結合できて、その結果ECL部分が検体に結合
できるようになる反応成分は、好ましくは二次抗体であ
るか、蛋白Ａか蛋白Ｂのような蛋白であるか、または結
合反応に関与することが既知であるアビジン、ビオチン
或いはその他の成分である。
標識（ラベル） ECL部分が金属キレートであると好都合である。この
様なキレートの金属は、問題となる反応系に賦課される
電気化学的条件下で金属キレートが発光するような金属
であることが望ましい。かかる金属キレートの金属は、
例えば、（ｄ−属の遷移金属のような）遷移金属または
希土類金属である。金属は好ましくはルテニウム、オス
ミウム、レニウム、イリジウム、ロジウム、白金、イン
ジウム、パラジウム、モリブデン、テクネチウム、銅、
クロムまたはタングステンである。特に好ましいのはル
テニウムとオスミウムである。
かかるキレートで金属と結合する配位子は通常は天然
の複素環式または有機化合物で、その金属キレートが水
系、有機系またはその他の非水系環境に可溶性であるか
否かを決める役割を果たしている。配位子は多座である
ことが可能で、置換基を有していても良い。多座配位子
には芳香族複素環式配位子が含まれる。好ましい芳香族
複素環式配位子は、例えばビピリジル、ビピラジル、タ
ーピリジル、フェナンスロリルのような窒素を含有して
いるものである。好ましい置換基としては、例えばアル
キル、置換アルキル、アリル、置換アリル、アラルキ
ル、置換アラルキル、カルボン酸エステル、カルボキシ
アルデヒド、カルボキシアミド、シアノ、アミノ、ヒド
ロキシ、イミノ、ヒドロキシカルボニル、アミノカルボ
ニル、アミジン、グアニジニウム、ウレイド、硫黄含有
基、燐含有基、Ｎ−ヒドロキシ琥珀酸イミドのカルボン
酸エステルを挙げることが出来る。キレートは一つまた
は複数の単座配位子を有することが出来、多数の例が公
知である。好ましい単座配位子としては、例えば、一酸
化炭素、シアニド、イソシアニド、ハライド、および脂
肪族、芳香族、複素環式ホスフィン、アミン、スチルベ
ン、アルシンを挙げることが出来る。
好ましいキレートの例としてはビス［（4,4′−カル
ボメトキシ）−2,2′−ビピリジン］ ２−［３−（４
−メチル−2,2′−ビピリジン−４−イル）プロピル］
−1,3−ジオキソラン ルテニウム（II）；ビス（2,2′
ビピリジン・）［４−（ブタン−１−アル）−４′−メ
チル−2,2′−ビピリジン］ ルテニウム（II）；ビス
（2,2′−ビピリジン） ［４−（４′−メチル−2,2′
−ビピリジン−４′−イル）−酪酸］ ルテニウム（I
I）；トリス（2,2′ビピリジン）ルテニウム（II）；
（2,2′−ビピリジン） ［ビス−ビス（1,2−ジフェニ
ルフォスフィノ）エチレン］ ２−［３−（メチル−2,
2′−ビピリジン−４′−イル）プロピル］−1,3−ジオ
キソラン オスミウム（III）；ビス（2,2′−ビピリジ
ン）［４−（４′−メチル−2,2′−ビピリジン）−ブ
チルアミン］ ルテニウム（II）；ビス（2,2′−ビピ
リジン） ［１−ブロモ−４（４′−メチル−2,2′−
ビピリジン−４−イル）ブタン］ルテニウム（II）；ビ
ス（2,2′−ビピリジン）マレイミドヘキサン酸 ４−
メチル−2,2′−ビピリジン−４′−ブチルアミド ル
テニウム（II）を挙げることが出来る。その他の部分の
例は本出願の文献欄に掲げられているPCT公開出願US87/
00987、PCT公開出願88/0394に記載されている。
ECL部分の機能は電気化学的エネルギーが反応系に取
り入れられた結果として電磁波を放射することである。
そのような機能を発揮するためには、その部分が高エネ
ルギー状態に励起されてから、励起状態から下降するこ
とによって例えば光子のような電磁波を放射することが
出来るものでなければならない。ECL部分が電気化学的
ルミネッセンス反応に関与する機能の理論的解析では結
合する希望が持てなくとも、電気化学エネルギーが反応
系に導入されることによって酸化されると、系中に存在
する還元性物質と反応して励起状態に転化するものと我
々は信じている。この状態は比較的不安定で、金属キレ
ートは速やかにもっと安定な状態に降下する。その結果
キレートは光子のような検知可能な電磁波を放出する。
本発明で使用する金属キレートまたはその他の金属含
有ECL部分の量はシステムによって異なる。一般的に、
使用されるかかる部分の量は検出可能な放射を起こすの
に有効な量であって、もし可能であれば前述したシステ
ムの組成に比例した電磁波エネルギーが得られるのが望
ましい。対象検体の検出および／または定量は通常は対
象検体とECL部分とを含有する試料からのルミネッセン
スを既知量の対象検体とECL部分とで作られた対照標準
試料から放射されるルミネッセンスと比較することによ
って行われる。これは均一法を想定した場合である。非
均一法の場合はECL分析に先立って前述したような分離
操作が行われる。
正常な知識を有する当業者が認めるように、金属含有
ECL部分の性格と量は普遍的に使用される条件に応じて
系毎に異なっている。所望の結果を得るのに適合した金
属含有ECL部分とその量は、通常の知見を有する当業者
が特に実地試験を行わなくとも経験的に決めることがで
きる。
粒子 粒子は直径が0.001から200μｍ、例えば0.05μｍから
200μｍ、好ましくは0.1μｍから100μｍ、最も好まし
くは0.5μｍから10μｍで、表面成分は検体および／ま
たは上述したその他の物質の一つまたは複数と結合でき
る微粒子であると都合がよい。微粒子物体の例としては
架橋結合した澱粉、デキストラン、繊維素、蛋白、有機
ポリマー、スチレン／ブタジエン・コポリマーのような
スチレン・コポリマー、アクリロニトリル／ブタジエン
／スチレン・コポリマー、ビニルアセチル・アクリル酸
エステル・コポリマー、塩化ビニル／アクリル酸エステ
ル・コポリマー、不活性無機粒子、二酸化クロム、鉄の
酸化物、シリカ、シリカ混合物、蛋白類似物質、または
それらの混合物を挙げることが出来る。かかる粒子はEC
Lシステム中に懸濁しているのが望ましい。しかし、か
かる粒子はそれ自体が磁気感応性であるか、磁気感応性
粒子を含んでいる必要がある。試料、検体、アッセイ履
行物質、標識、アッセイ媒体、試薬とその他のアッセイ
成分、および上述した如何なる組み合わせを含む粒子
も、上述した如何なる成分と同様に、それ自体を本発明
の範囲に含めることを意図するものではないことも合わ
せて注意する必要がある。
アッセイ媒体 電極が電気化学的エネルギーを導入するようなシステ
ムを運用するためには、その中に電極を浸漬するECL部
分を含んだ電解質を用意する必要がある。電解質とは電
荷がイオンによって運ばれる相である。一般的に、電解
質は液相にあって、一種類または複数種類の塩またはそ
の他の部分が、水、有機液体または有機液体の混合物、
または水と一種類または複数種類の有機液体との混合物
に溶解した形になっている。しかしながら、本発明の幾
つかの実施例では他の形態の電解質も有用である。例え
ば、電解質が一つまたは複数の流体−−例えば液体、蒸
気、または超臨界流体−−中への一種類または複数種類
の物質の分散体である場合もあるし、固体、蒸気、また
は超臨界流体中への一種類または複数種類の物質の溶液
である場合もある。
電解質は塩の水溶液であるのが望ましい。好ましい塩
としてはナトリウム塩またはカリウム塩を挙げることが
出来るが、陽イオンが電気化学的ルミネッセンス相互作
用の流れを阻害することはないので幾つかの実施例では
他の陽イオンの共存も許容されている。塩の陰イオンと
しては例えば燐酸イオンを挙げることが出来るが、再度
繰り返すことになるが選ばれた陰イオンが電気化学的ル
ミネッセンス相互作用の流れを阻害することはないので
幾つかの実施例では他の陰イオンの使用も許容されてい
る。
組成物は非水系であっても良い。場合によっては超臨
界流体が望ましい場合もあるが、非水系組成物中の有機
液体を構成する電解質がより一般的に使用される。水系
電解質の場合と同様に、非水系電解質も電荷がイオンに
よって運ばれる相である。このことは通常は塩が有機液
体媒体に溶解していることを意味している。適切な有機
液体の例としては、アセトニトリル、ジメチルスルホキ
シド（DMSO）、ジメチルホルムアミド（DMF）、メタノ
ール、エタノール、およびそれらの二種またはそれ以上
の混合物を挙げることが出来る。実例としては例えばテ
トラフルオロ硼酸テトラブチルアンモニウムのような有
機液体に可溶性のテトラアルキルアンモニウム塩が非水
系電解質を作るのに使用されている。
本発明のある実施例では電解質は緩衝系である。燐酸
緩衝液が望ましい場合が多い。例としては燐酸ナトリウ
ム／塩化ナトリウム水溶液、燐酸ナトリウム／弗化ナト
リウム水溶液を挙げることが出来る。
その他のアッセイ成分 文献欄に開示されている「アミン誘導還元体を使用し
た電気化学的発光反応」という表題のPCT公開出願US89/
04859に記載されているように、アミンまたは（もっと
大きい分子の）アミン部分に代表されるような、酸化さ
れて自発的に分解して高度に還元性の部分に変化する還
元体が含まれているのが望ましい。アミンまたはアミン
部分も反応系に導入された電気化学的エネルギーによっ
て酸化されると信じられている。アミンまたはアミン部
分は電子１個を失い、次に脱プロトンするか、それ自体
が転移して還元性の強い試薬となる。この試薬が酸化さ
れた金属含有ECL部分と反応して先に述べたような励起
状態になるものと考えられている。この様な役割を果た
すためには、アミンまたはアミン部分はその炭素から供
与された電子と、還元体を作るための脱プロトン中にプ
ロトン供与体として働くことが出来るα−炭素とを持っ
た炭素を中心とした基であることが望ましい。アミン誘
導還元体は金属含有ECL部分が励起状態に転化するのに
必要な刺激を与え、その結果検知可能な電磁波が放射さ
れる。
広範囲のアミンおよび対応するアミン部分が本発明を
実行するのに利用されている。一般的にアミンまたはア
ミン部分は電気化学的ルミネッセンスを利用して分析を
行うシステムのpHに適合するように選ばれる。今一つの
関連した要因はアミンまたはアミン部分が分析を実行す
る環境に適応性がなければならない、即ち水系が非水系
かに適合していなければならないということである。更
に今一つ考慮すべきことは選ばれたアミンまたはアミン
部分がシステム中の酸化された金属含有ECL部分を還元
するに足るだけの強力なアミン誘導還元体を通常の条件
下で形成しなければならないということである。
本発明で使用されるアミン（およびそれから誘導され
る対応する部分）で好ましいものには、一級、二級、三
級のアルキルアミンのような脂肪族アミンで、その各ア
ルキル基が１個から３個の炭素原子で構成されたもの、
および置換脂肪族アミンを挙げることができる。トリプ
ロピルアミンは特に好ましいアミンであって、比較して
云うと特に高強度の電磁波を放射して、その結果それを
利用した実施例では検出と定量の感度と精度が確保され
ている。ヒドラジンのようなジアミンおよびポリ（エチ
レンイミン）のようなポリミンも本発明に使用するのに
適合している。他のアミン類で本発明に使用するのに好
ましいものの例にはトリエタノールアミン、トリエチル
アミン、1,4−ジアザビシクロ−（2,2,2）−オクタン、
１−ピペリジンエタノール、1,4−ジピペラジン−ビス
−（エタンスルホン酸）、トリイソプロピルアミン、ポ
リ（エチレンイミン）がある。
本発明で使用される金属含有ECL部分は反応を限定す
る構成要素であることがその特徴である。従ってアミン
またはアミン部分も化学量論的に過剰に使用されること
が特長となる。例証的に云うと、アミンまたはアミン部
分は50から150mMの濃度で使用される。使用の際のpHが
７、濃度が100mMというのが屡々推奨される。ある実施
例ではアミンまたはアミン部分の濃度の上限はそれを使
用する環境、例えば水に対するアミンまたはアミン部分
の溶解度で決定されている。一般的に、使用されるアミ
ンまたはアミン部分の量は酸化された金属含有ECL部分
がルミネッセンスを起こす励起状態に遷移するのに十分
な量である。通常の知見を有する当業者は、分析を行う
特定のシステムに対して使用するべきアミンまたはアミ
ン部分の量を特に実地試験を行わなくとも経験的に決め
ることができる。
文献欄に開示されている「増強された電気化学的ルミ
ネッセンス」という表題のPCT公開出願US89/04915に記
載されているように、本発明のアッセイは次式で代表さ
れるような増強剤の存在下で遂行されるのが望ましい： 式中Ｒは水素またはCnH2n+1、Ｒ′はCnH2n、ｘは０〜7
0、ｎは１〜20である。ｎは１から４であることが望ま
しい。その代表的な例はトリトン100の商品名で市販さ
れている次式の化合物である： 式中ｘは９〜10であって、トリトンＮ−401（NPE−40）
の商品名で市販されている物質は次式で示されるｘが40
の化合物である： 増強剤は通常それが存在すると電磁波の放射が所望の増
強を起こすのに十分な量が使用される。例示するとその
量は容積／容積で0.1％から5.0％、好ましくは0.1％か
ら1.0％である 本発明で使用されるECL部分は刺激されて励起状態に
なることによって電磁波の放射を誘発する。このことは
ECL部分に関与しているシステムを電気化学的エネルギ
ーに暴露することによって実行される。ECL部分の酸化
が起こって強い還元体を形成する切片が出来るポテンシ
ャルはその化学物質の化学構造とシステムのpHなどの諸
要因および電気化学エネルギーを導入するのに使用され
る電極の性質に支配される。適正なポテンシャルと電磁
波の放射波長を決める方法は通常の知見を有する当業者
には公知である。ECLシステムを遂行するのに好ましい
幾つかの方法が文献欄に掲げられているPCT公開出願US8
9/01814に開示されている。
電気化学的ルミネッセンスを観測するためのセル 本発明のアッセイを行うための装置が第１、２、３、
５、７、８、９図に示されている。第８図は使い易いEC
L装置を示したものである。本方法はECL部分を電気化学
的ルミネッセンスへ導く引き金になる電気化学的エネル
ギーを供給する作動電極またはトリガー面と南北極を持
った複数の磁石を備えた違ったタイプのECL装置でも実
施することができる。本発明の方法は静的方法でも流動
通過法でも行うことができるが、装置10は結合アッセイ
試料を含む色々な形式の試料の場合に利点が多い流動通
過型のセルで構成されている。ECLアッセイを遂行する
装置のもっと詳細についてはPCT公開出願US89/04854お
よびUS90/01370に開示されている。
装置10は電気化学的セル12、望ましくは光電子倍増管
（PMT）、光ダイオード、電荷結合素子、写真フィル
ム、乳剤またはそれに類するもので構成された光の検出
／測定機構14、セル12に液を供給したり排出したりする
ための望ましくは蠕動ポンプであるポンプ16で構成され
ている。定容積式ポンプも使用することが出来る。シャ
ッター機構18はセル12とPMT14との間にあってECL測定を
行っている間だけ開いてPMT14がセル12に露出されるよ
うになっている。シャッター機構は例えば保全の場合な
どには閉じられる。第８図には記載されていないが各種
の構成要素を取り付けてECL測定中に外部の光からPMT14
を遮断するための光の洩れない外装も装置10には含まれ
ている。
セル12それ自体には第一取り付けブロック20があっ
て、その内部を望ましくはステンレス鋼でできた入り口
管22と出口管24が貫通している。取り付けブロック20に
は第一、外側面26とセル12の試料保持空間30の一面を構
成している第二、内側面28とがあって、セル12には装置
10の操作段階に応じて洗浄液および／または調整液およ
び／または測定液が入っている。入り口管と出口管22、
24は取り付けブロック20を外側面26から内側面28へと貫
通していて試料保持空間30に開口している。望ましくは
ステンレス鋼で出来た第二取り付けブロック32にも第
一、外側面34と第二、内側面36がある。第二取り付けブ
ロック32は望ましくはテフロンまたはその他の非汚染性
金属で出来た環状スペーサー38で第一取り付けブロック
20と隔てられている。取り付けブロック34の外側面は試
料保持空間30の第二の側面を形成している。スペーサー
38には外側部40とその内縁44が試料保持空間30の側面を
形成している中心開口42とがある。外側部40は第一取り
付けブロック20の内側面28と第二取り付けブロック32の
外側面34とを仕切っていて両方の面28と34の間の試料保
持空間30から溶液が洩れるのを防いでいる。取り付けブ
ロック32には更に中心開口46があってその窓48は試料保
持空間30の第二の側面が外側面34に繋がるように気密に
取り付けられている。窓48はECL部分によって放射され
るフルオレッセンス光の波長に対して実質的に透明であ
るような材料で作られている。従って窓48は硝子、プラ
スチック、石英等で作られているのが望ましい。
入り口管22は試料保持空間30のスペーサー38に隣接し
た一端50と交差し、出口管24は試料保持空間30のスペー
サー38の隣接した他端52と交差している。入り口管22、
試料保持空間30、出口管24の組み合わせはこの様にして
セル12を通過する溶液に対して狭い、実質的に層流とな
る連続した流路を形成している。矢印ＡとＢは入り口管
22と出口管24を流入、流出する流れを示したものであ
る。
第一取り付けブロック20の内側面28には作動電極シス
テム54が取り付けられているが、図に示した実施例では
この電極システムは第一と第二の作動電極56と58で形成
されている。他の実施例では単一の作動電極が使用され
る場合や、電極56のみが作動電極を形成している場合も
ある。作動電極56、58は問題となる電気化学的ECL反応
が起こる場所である。作動電極56、58は固体ボルタンメ
トリー電極であって、白金、金、炭素またはその目的に
適合した他の材料で作られているのが望ましい。作動電
極56、58に繋がれた導線60、62は第一取り付けブロック
20を貫通している。水平に配置された電極56または電極
群56、58の下方には第１、２図に示したような南北極の
配置を有する複数の磁石27/37が垂直に配置されてい
る；第３、５、７図および以下の記述も併せて参照され
たい。
導線60、62は両方とも第９図に示した電圧調整器66の
「作動電極」端子64に接続されている。電圧調整器66は
定電位電解装置のような方式で作動電極56、58に電圧信
号を供給するとともに、必要であればECL測定中に作動
電極に流れる電流値を測定することも出来る。また、導
線60、62は電圧調整器66の別の端子に接続して別の目的
に使用することもできる。
電圧調整器66のポテンショスタット操作は対電極68お
よび任意ではあるがあることが望ましい照合電極70によ
りさらに行われる。図解に示した実施例では取り付けブ
ロック32はステンレス鋼で作られていて対電極68は取り
付けブロック32の露出面72、74で構成されている。対電
極72、74と作動電極56、58とは試料保持空間30内にある
溶液に電圧を印加する働きをして、化学反応にエネルギ
ーを供給して試料の電気化学的ルミネッセンスの引き金
となる作用および／またはセル12の表面の洗浄と調整の
ためのエネルギーの供給を行う。対電極72、74は導線76
で電圧調整器66の第二「対電極」端子78に繋がれてい
る。
照合電極には作動電極56、58にかかっている電圧を参
考にした電圧、例えば照合値に対して＋1.2ボルトが印
加される。照合電極はセル12から離れた出口管24の80の
位置にあるのが望ましく、導線82を通じて電圧調整器の
第三の“照合電極”端子84に繋がれている。照合電極70
は３電極操作法に平衡した、既知で安定した電圧を供給
するのに使用されるので、銀／塩化銀（Ag/AgCl）で出
来ているか飽和甘汞電極（SCE）であるのが望ましい。
電圧調整器66は作動電極56と計測／照合電極としての電
極58のみを使用した２電極操作法で使用することが出来
る。この２電極操作法では計測／照合電極58は電圧調整
器66の電圧調整端子78と84に電気的に接続される。この
場合には電圧調整器66は実質的に電池として使用されて
いる。電圧調整器66は作動電極と対電極56と58に電圧信
号を供給し、必要があればそれぞれの電極を流れる電流
値の測定も行っている。照合電極70は白金、金、ステン
レス鋼で出来たいわゆる「偽照合電極」として使用する
ことも可能で、この場合にはより不安定ではあるが接触
している溶液に対して計測可能な電圧を提供している。
２電極法、３電極法何れの場合にも、照合電極70または
58は作動電極56に供給される電圧に対して照合が行われ
る。平衡電圧照合は好ましい方法であると考えられてい
る。定電流電解法で使用される電圧調整器66は作動電極
56、58と対電極72、74の間に流れる電流値を測定してい
る間、作動電極56、58には照合電極70に対して既知の電
圧を提供している。この目的での定電流電解法は公知の
ものであって、電圧調整器の内部構造は上述した機能が
達成できれば在来の、市販のものでよく、本発明それ自
体の一部を構成しているものではない。実際に、装置10
は電圧調整器66を内部に備えたものにはしないで、外部
にある定電圧電解装置を電極56、58、72、74および70に
所望の電圧を供給できるように使用することも可能であ
る。かかる電圧信号は以下に述べるようなそれぞれの方
法で提供され、作動電極56、58の表面に、そして望むら
くはセル12全体に再現性のある初期電圧が提供されて、
かかる諸機能がECL測定の良好な精度を達成するのに寄
与するのである。
ポンプ16は出口管24側にあって試料空間から入り口管
22の方へ矢印Ａの方向に溶液を「吸引」するのが望まし
い。溶液は入り口管22、試料保持空間30から照合電極70
を経て出口管24へ矢印Ｂの方向に流れ出る。ポンプ16は
入り口管22の方に取り付けて装置10へ溶液を「圧入」す
ることも出来る。入り口管22から試料保持空間30、出口
管24という流動方向はセル12に流す全ての溶液や液体に
適用されるが、何れの流体でもセル12に始めに強制流入
する際には流体力学的洗浄作用を示す。ポンプ16は特定
の溶液をセル12に所望の時間だけ保持しておくために使
用されている。
装置10の流路構造は一種類または複数種類の溶液を連
続して流した際にも作動電極56、58（または対電極と照
合電極72、74、70）を空気に触れさせることなしに作動
電極に可変電圧を印加したり操作前の電位に連続して保
持することを可能にしている。空気に触れると照合電極
70の回路が開かれ作動電極56、58の表面状態の再現性が
破壊されて、未知の、乱調な電圧変動が起こる。この流
路構造は、電極系54の洗浄と調整を行う開始段階から単
数または複数の測定波形または掃引でECLを開始させる
測定段階への速やかな遷移を可能にしている。
本発明の方法を実行し装置を使用するに際しては試薬
組成物が使用される。試薬組成物は本発明のアッセイ系
の成分、即ち（ａ）電解質、（ｂ）ECL部分を含む標識
化合物、（ｃ）磁気感応性粒子を含む粒子、（ｄ）対照
検体または対照検体の類似体、（ｃ）対照検体またはそ
の類似体の結合相手、（ｆ）（ｄ）または（ｅ）と反応
できる反応成分、（ｇ）還元性物質、または（ｈ）電気
化学的ルミネッセンス反応増進剤で構成されている。試
薬は使用に便利なように相互に組み合わせたものにする
ことが出来る；即ち、混合した成分が目的とするアッセ
イの機能を阻害するような反応を貯蔵中に相互に起こさ
ないような、２成分、３成分または多成分を混合する。
試薬は粒子と一種類または複数種類のその他の成分とを
含む２成分または多成分混合物であるのが望ましい。
本発明の好ましい態様の説明 本発明の粒子に基づいたアッセイには広範囲の粒子が
使用できるが、通常は磁気感応性であるか磁気感応性粒
子を含む密度が1.0から5.0g/m、好ましくは1.1から2g
/mの粒子が使用される。重力を利用したアッセイでは
沈降速度はアッセイの速さと電極面に錯体の均一な層を
作ることとの兼ね合いであって、最適密度の選定には高
度の知見が必要である。
平均直径の範囲が広い粒子も使用することが出来る。
平均直径が0.001から200μｍ、例えば0.05から200μｍ
の粒子が使用できるが、好ましいのは平均直径が0.01か
ら10μｍのものである。
アッセイ組成物中の粒子の濃度も広範囲のものが使用
できる。例えば、１から10,000μg/m、好ましくは５
から1000μg/mのものが使用される。粒子の密度、大
きさ、濃度は、かかる粒子の沈降速度が少なくとも0.5m
m/分、出来ることならばもっと速くなるように選ばれる
のが望ましい。
本発明のアッセイに利用できる磁性粒子については多
数の記載がある。例えば、合衆国特許第4,628,037号、
4,695,392号、4,695,393号、4,698,302号、4,554,088
号、英国特許出願GB2,005,019AおよびEP0,180,384号、
等は何れの本明細書の文献欄に掲げられているが、有効
に使用できる各種の磁性粒子について記載している。粒
子は常磁性または強磁性のものであって、磁性粒子が免
疫アッセイに使用できるように結合性組成物をコートす
ることも出来る。本発明に使用される磁性粒子は少なく
とも0.001cgs単位の磁化率、出来れば少なくとも0.01cg
s単位の磁化率を有しているのが望ましい。磁性粒子は
広範囲の密度、即ち水よりも遥かに小さい0.01から5g/m
、望ましくは0.5から2g/mのものである。粒子の大
きさは0.001から200、例えば0.001から100または0.05か
ら200μｍ、望ましくは0.01から10μｍのものである。
粒子の濃度は１から10,000μg/m、好ましくは５から1
000μg/mの広範囲のものが使用できる。
使用される磁性粒子は、例えばEP0,180,384号にも記
載されているように、電極面から磁場を除去すると粒子
は磁性を失って容易にアッセイ・セルから除き去ること
が出来るために、磁気共鳴が小さいことが望ましい。磁
性粒子の密度、濃度、粒子径は沈降時間が少なくとも0.
5mm/分、出来ればこれより大きい値になるように選ばれ
るのが望ましい。磁気セルを使用するに際しては光電子
倍増管の機能を阻害しないために電気化学的ルミネッセ
ンスを開始するに先立って電極面から磁石手段を取り除
くことが望ましい場合が屡々ある。
アッセイ 本発明の方法を使用して種々のアッセイを行うことが
出来る。それについては以下の実施例で更に詳しく述べ
ることとする。
以下に記載する一般的な実施例は単なる説明のための
ものであって本発明を限定するものではなく、色々な改
変がが本発明の精神から外れることなしに可能である。
例 装置化、材料、および方法 （１）装置化 装置の流路系統は一般的には第１、２、３、５、７、
８、９図に示してあるが、第８図と９図は３つの電極を
使用したものであり、第１図と２図には南北極を有する
複数の磁石を使用したものを特に例示している。
作動電極−−金製円盤、直径3mm 対電極 −−金製円盤、直径3mm 照合電極−−Ag/AgCl テフロン製ガスケット（厚さ0.15インチ） 有機硝子製窓板 入り口管＝内径0.42インチ、ポリプロピレン 吸引速度:0.01から5m／分の範囲で可変 定電流電解装置：マイクロコンピューター制御 ハママツR34 PMT（赤色感光性低利得光電子倍増管）
を使用した発光 光度計；光電子倍増管の電圧は０〜1400V可変 （２）材料 （ａ）ECL標識： Ru（bpy）3 2+ （ｂ）ECL緩衝液:112mM KH2PO4、88mM K2HPO4・3H2
O、50μＭ NaCl、6.5mM NaN3、0.8μＭトリトン Ｘ
−100 0.4mM トイーン20、100mM トリプロピルアミ
ン水溶液、 （ｃ）ECL希釈剤:37.5mM KH2PO4、109.2mM K2PO4・
3H2O、151.7mM NaCl、0.65mM NaN3、0.43mM ウシ血
清アルブミン水溶液 （ｄ）Ru（bpy）3 2+−NHS:Ru（2,2′−ビピリジル）
２（４−［３−（1,3−ジオキソラン−２−イル）プロ
ピル］−４′−メチル−2,2′−ビピリジン）2+ （ｅ）ダイナール粒子： （ｉ）ダイナール Ｍ−450 ダイナビーズ、直
径が4.5μｍの超磁性粒子、30mg/m、ダイナール社、1
1021ニューヨーク州グレートネック市北停車場広場45番
地より購入 （iii）ダイナール Ｍ−280 ダイナビーズ、直
径が2.8μｍの超磁性粒子、10mg/m、ダイナール社、1
1021ニューヨーク州グレートネック市北停車場広場45番
地より購入 （３）ECL測定サイクル（３電極セル法） ECL測定サイクルは３段階で構成されている：（１）
予備調整、（２）測定、（３）洗浄。予備調整は0.0V→
＋2.2V→−1.0V→＋0.6Vの三角波電圧を2.0V/秒でかけ
る工程である。測定は＋0.6V→＋2.8V→＋2.0Vの三角波
形を1.0V/秒でかける工程である。洗浄工程では＋0.0V
→＋3.0V→−0.5V→0.0Vの順序で電圧をかけていく。電
圧値は全てAg/AgCl参照電極に対する値である。
実施例１ ECL装置と微粒子を沈積させる方法 沈降セルを使用した磁気集積 微粒子を沈降させるために第１図、第２図の南北極を
持った複数個の磁石によって励起された磁力線を使用し
てアッセイを行う沈降セルのようなセルを第３図に示し
た。参照番号48は透明窓を、参照番号122はガスケット
を、参照番号22はセル・ブロックへの入り口を、参照番
号56、58は作動電極を、参照番号24は試料の出口を、参
照番号20はセル・ブロック自体を、参照番号27は第１
図、第２図に示したような複数の電磁石を示している。
セル・ブロックの平面は水平に配置されている；複数
の電磁石27は磁石の下に垂直に配置されている。ECL緩
衝液の標識された微粒子（ダイナール）は蠕動ポンプに
よってセルに送り込まれる。微粒子がセルに到達したら
ポンプは停止する。第１図、第２図のような南北極を第
３図の番号27のように配置して例えば12ボルト、1.5ア
ンペアで励磁した複数の電磁石を使用して励起させた磁
場によってセル・チャンバーの中の微粒子は作動電極に
引き付けられる。電磁石を使用すると重力のみで微粒子
を沈降させる場合に観測される沈降速度に比べて微粒子
の沈降速度は著しく増大する。その状態を第４図に示し
てある。
実施例２ ECL装置と微粒子を沈積させ方法 集積セルを使用した磁気集積 第５図に示した集積セルのようなセルでアッセイが行
われる。第５図で参照番号48は透明窓を、参照番号132
はガスケットを、参照番号22はセル・ブロックへの入り
口を、参照番号56、58は作動電極を、参照番号20はセル
・ブロック自体を、参照番号24は試料の出口を、参照番
号37は第１図と第２図に示したような複数の磁石を示し
ている。
セル・ブロックの平面は水平に配置されている；複数
の磁石は磁石の下に垂直に配置されている。ECL緩衝液
中で標識された微粒子（ダイナール）は蠕動ポンプで電
気化学セルへ送り込まれる。試料を導入するに先立っ
て、永久磁石37を作動電極／溶液境界の直下に0.035イ
ンチの距離になるように置く。試料をセルに送り込むと
微粒子は磁石の面積によって規定された作動電極の上面
に沈降する。試料の沈降が完了したらポンプを停止して
磁石を取り除く。集積時間が長いほど粒子は多量に沈降
する。作動電極上の粒子の濃度が高くなると第６図に示
したようにECL強度が増大する。
実施例３ 微粒子を沈降させるための磁石の使用 磁場の配置 それが永久磁石であるか電磁石であるかを問わず、磁
場98に面して配置された第１図、第２図に示した磁石27
/37によって引き付けられた微粒子96は、第７図に示し
たような磁場98に沈着し、その結果生成した粒子の配置
96は作動電極56/58の表面の近傍に電極面に対して平行
になる。
第１図と第２図は第３、５、７、８、９図の磁石シス
テムに磁力線が電極56、58の面に概ね平行になるように
取り付けられた磁石27/37を図解したものである。磁石
システムは複数の永久磁石または電磁石を磁石群27/37
の個々の磁石の南極と北極が交互になるように集積した
もので構成されている。磁石27/37の個々の磁石は空気
または何らかの磁気に感応しない材料で隔てられてい
る。第１図、第２図に示した配置は作動電極に作用する
磁力線が電極面に対して殆ど水平になるのが望ましい。
その結果電極の面上にある磁気感応性粒子の配向が形成
され、電極に供給された電気化学的エネルギーに容易に
アクセスできるようになる；第７図を参照されたい。
第１図、第２図に示した磁石システム27/37は磁力線
が磁石の構造体から余り離れた処までは広がらないとい
う点でも優れている；第７図を参照されたい。その結果
この様な磁石システムからの磁場は電極装置の近くにあ
る常磁性材料に永久磁性を誘発させる恐れはなく、流動
セル装置の近くにある光電子倍増管の機能に悪影響を及
ぼすこともない。
実施例４ 標識した非特異性蛋白による中程度の表面濃度での粒子
のコート 4.5μｍの非コート磁気感応性ポリスチレン Ｍ−450
ダイナビーズ（ダイナール社、ノルウエイのオスロ）
30mg（1m）をpH7.5の150mM 燐酸緩衝液を洗浄１回当
たり2mを使用し磁気分離して洗浄する。Ru（bpy）3 2+
で標識したマウスIgG（ジャクソン免疫試薬）を0.05％
のチメラゾールと一緒に燐酸塩緩衝塩水1mに溶かした
ものを粒子に加える。この混合物を室温で回転させなが
ら一夜インキュベートする。次に溶液を磁気で粒子から
分離して取り除く。未反応の位置をブロックするため
に、0.05％のアジ化ナトリウムを添加した３％BSA/PBS1
mを粒子に加え、得られた液を室温で２時間インキュ
ベートする。粒子を５回洗浄し（洗浄１回当たり2m
）、最後に同じ緩衝液6mに再懸濁させて保存する。
実施例５ 磁気感応性粒子を使用した電気化学的ルミネッセンス
（ECL）の測定 均一および不均一の、ポリマー性および非ポリマー性
の磁気感応性粒子（ダイナール社、ノルウエイのオス
ロ；ポリサイエンス社、1896 ペンシルバニア州ワリン
トン市；コルテックス・バイオケム社、9457カリフォル
ニア州サンレアンドロ；アルドリッヒ社、53201 ウィ
スコンシン州ミルウォーキー）は実施例４に記載したよ
うにして蛋白でコートされる。コートした粒子はECL緩
衝液で３回洗浄してから300μg/mの分散液2mにす
る。蠕動ポンプを使用して粒子の分散液500μを流動
セルに送り込む（実施例２）。粒子は作動電極に流れ着
いたら磁石に引き付けられて作動電極面に濃縮される。
粒子が作動電極面に濃縮されている流動セル上に中心を
置いたハママツ R374 光電子倍増管を使用して磁気粒
子を使用した電気化学的ルミネッセンスを計測する。標
識蛋白でコートした磁気感応性粒子から得られたECL光
の放射レベルを第Ｉ表に示５した。
実施例６ 物理的に吸着されたヒツジ抗甲状腺刺激ホルモン（TS
H）をコートしたダイナール粒子（試薬Ｉ）の調製 表面に−OH残基を有する未コートの磁性ポリスチレン
粒子（ダイナール社、ダイナビーズ Ｍ−450、ダイナ
ールAS、ノルウエイのオスロ）をpH9.6の炭酸ソーダ／
重炭酸ソーダの150mM溶液を１回洗浄毎に2mを使用し
て磁気分離洗浄する。親和性精製したヒツジ抗TSH、HCG
洗浄抗体（CIBA）0.5mgを炭酸塩／重炭酸塩溶液1mに
溶かしたものを粒子に加える。この混合物を混合しなが
ら室温で一夜培養する。次に溶液を磁気的に分離して除
去する。３％BSA/PBSにアジ化ナトリウム0.05重量％を
溶かした溶液1mを加え、撹拌しながら２時間インキュ
ベートして未反応の位置をブロックする。粒子を５回洗
浄し（１回洗浄毎に2m）最後に同じ緩衝液1mに懸濁
させて保存する。ビーズ試薬Ｉの最終濃度は３重量％で
ある。
実施例７ ウワバイン−BSA抱合体（試薬IIの調製） ウワバイン８水和物（アルドリッヒ・カタログ＃ 1
4,193−３）60.4mgを脱イオン水6mに溶かしたもの
（金属箔で包装）をメタ過沃素酸ナトリウム（マリンク
ロット・カタログ番号 1139）87mgと混合し、混合物を
室温で回転しながら２時間培養する。反応混合物を水と
一緒にドウェックス1X8−50イオン交換樹脂（アルドリ
ッヒ・カタログ＃ 21,740−９）を通して反応を終結さ
せる。pH7.2の1M燐酸ナトリウム200μを加えて溶液の
pHを7.0に調整する。
活性化したウワバインのBSA抱合： 活性化したウワバイン50mg（4.6m）をウシ血清アル
ブミンBSA（マイルス分画Ｖ）108mgをpH7.8の0.15M PB
S 5mに溶かしたものに滴下する。この比率は40:1
（ウワバイン:BSA）である。反応物を２時間室温で培養
してから混合し、シアノ硼酸水素ナトリウム30mgを撹拌
しながら速やかに加える。遊離のウワバインと過剰のシ
アノ硼酸水素ナトリウムを0.15MPBSの0.05重量％アジ化
ナトリウム溶液pH7.8で４℃で透析して除去する。ウワ
バイン−BSA抱合体試薬IIは４℃で保存する。
実施例８ 物理的に吸着したウアバイン−BSAをコートしたダイナ
ール粒子（試薬III）の調製 表面に−OH残基を有する未コートの磁性ポリスチレン
粒子（ダイナール社、ダイナビーズ Ｍ−450、ダイナ
ールAS、ノルウエイのオスロ）をpH9.6の炭酸ソーダ／
重炭酸ソーダの150mM溶液を１回洗浄毎に10mを使用し
て磁気分離洗浄する。ウアバイン−BSA抱合体（抱合体
試薬II）3mgを炭酸塩／重炭酸塩溶液5mに溶かしたも
のを粒子に加える。この混合物を室温で回転させながら
一夜インキュベートする。次に溶液を粒子から磁気的に
分離して除去する。３％BSA/PBSの0.05重量％アジ化ナ
トリウム溶液5mを加えて室温で回転させながら２時間
インキュベートして未反応の位置をブロックする。粒子
を５回洗浄し（洗浄毎に10m）最後に同じ緩衝液1m
に懸濁させて保存する。ビーズ試薬IIIの最終的な濃度
は３重量％である。
実施例９ Ru（bpy）3 2+−標識マウス抗ジゴキシン（試薬IV）の調
製 マウス抗ジゴキシン（カンブリッジ・メディカル・テ
クノロジー社カタログ番号200−014、ロット番号A357
5）をRu（bpy）3 2+で標識した。モノクローナル抗体（M
Ab）抗ジゴキシン抗体はセントリコン30型ミクロ濃縮器
（アミコン）を使用して0.15M 燐酸カリウム緩衝液、
0.15M NaClpH 7.8に緩衝液交換を行って・最終容積を
0.5mにした。Ru（bpy）3 2+−NHS 0.5mgを使用する直
前に無水ジメチルスルフォキシド（アルドリッヒ社）12
5μに溶かした。Ru（bpy）3 2+の蛋白に対するモル比
をそれぞれの分子量を1057と150,000として25:1になる
ように、Ru（bpy）3 2+−NHS 0.18mg（45μ）を蛋白
溶液に振盪しながら加える。反応管を暗所で室温で30分
間、振盪しながらインキュベートする。1Mグリシン25μ
を加えて反応を終結させ10分間培養する。反応混合物
はセファデックスＧ−25のカラム（1x20cm、0.05％のア
ジ化ナトリウムを含む0.15M燐酸カリウム、0.15M NaCl
pH7.2中）を通して精製する。Ru（bpy）3 2+で標識し
たマウス抗ジゴキシン画分を集めて保存する。標識され
た蛋白（試薬IV）は蛋白１分子当たり12の標識が付いて
いることが確認されている。
実施例10 Ru（bpy）3 2+−標識マウス抗甲状腺刺激ホルモン（TS
H）（試薬Ｖ）の調製 マウス抗TSH（CIBA）0.5mgをRu（bpy）3 2+で標識し
た。MAb抗TSH抗体をセントリコン30型ミクロ濃縮器（ア
ミコン）を使用して0.15M 燐酸カリウム緩衝液、0.15M
NaCl pH7.8に緩衝液交換を行い、最終容積を0.35m
にした。Ru（bpy）3 2+0.5mgを使用の直前に無水ジメチ
ルスルフォキシド（アルドリッヒ）75μに溶かした。
Ru（bpy）3 2+の蛋白に対するモル比をそれぞれの分子量
を1057と150,000として50:1になるように、Ru（bpy）3
2+−NHS0.176mg（26.4μ）を蛋白溶液に振盪しながら
加える。反応管を暗所で室温で30分間、振盪しながらイ
ンキュベートする。1Mグリシン25μを加えて反応を終
結させ10分間培養する。反応混合物はセファデックスＧ
−25のカラム（1x20cm、0.05％のアジ化ナトリウムを含
む0.15M燐酸カリウム、0.15MNaCl pH7.2中）を通して
精製する。Ru（bpy）3 2+で標識したマウス抗TSH画分を
集めて保存する。標識された蛋白（試薬Ｖ）は蛋白１分
子当たり14の標識が付いていることが確認されている。
実施例11 甲状腺刺激ホルモン（TSH）の一段階分離サンドイッチ
・アッセイ 血清カリブレーター（London Diagnostics TSH Lumi
TAGキット）100μ、Ru（bpy）3 2+標識マウス抗TSH
（試薬Ｖ）のECL緩衝液溶液25μ、ヒツジ抗TSHダイナ
ール粒子（試薬Ｉ）のECL緩衝液溶液25μを一緒にし
てポリプロピレン管中で15分間、室温で混合しながらイ
ンキュベートする。粒子を磁気分離して洗浄し、この粒
子をECL緩衝液500μに再度懸濁させる。この洗浄操作
を更に２回繰り返す。最後に粒子をECL緩衝液1mに再
懸濁させる。各試料に対する電気化学的ルミネッセンス
（ECL）を実施例２に記述したようにして読み取る。ECL
の読み取り値は試料中に存在する検体の濃度に正比例し
ている（検体の濃度が増大すると読み取り値が増大す
る）。第II表は代表的なアッセイ曲線を示したものであ
る。
実施例12 甲状腺刺激ホルモン（TSH）の一段回非分離サンドイッ
チ・アッセイ 血清カリブレーター（London Diagnostics TSH Lum
iTAGキット）100μ、Ru（bpy）3 2+標識マウス抗TSH
（試薬Ｖ）のECL緩衝液溶液25μヒツジ抗TSHダイナー
ル粒子（試薬Ｉ）のECL緩衝液溶液25μを一緒にして
ポロプロピレン管中で15分間、室温で混合しながらイン
キュベートする。結果を読み取るに先立ってECL緩衝液1
mを加える。各試料に対する電気化学的ルミネッセン
ス（ECL）を実施例２に記述したようにして読み取る。E
CLの読み取り値が試料中に存在する検体の濃度に正比例
している（検体の濃度が増大すると読み取り値が増大す
る）。第III表は代表的なアッセイ曲線を示したもので
ある。
実施例13 ジゴキシンの二段階分離競合アッセイ 血清カリブレーター（TDx Assay、Abbott Labs、シカ
ゴ、IL）50μとRu（bpy）3 2+−標識マウス抗ジゴキシ
ン（試薬IV）のECL緩衝液溶液25μを一緒にして室温
で20分間混合しながらインキュベートする。ウアバイン
−BSA−ダイナール粒子（試薬III）のECL緩衝液分散液2
5μを加えて更に20分間室温で混合しながらインキュ
ベートする。粒子は磁気分離して洗浄してから粒子をEC
L緩衝液500μに再分散させる。この洗浄操作を更に２
回繰り返す。最後に粒子をECL緩衝液1mに再分散させ
る。各試料に対ルミネッセンス（ECL）を実施例２に記
述したようにして読み取る。ECLの読み取り値が試料中
に存在する検体の濃度に反比例している（検体の濃度が
増大すると読み取り値が減少する）。第IV表は代表的な
アッセイ曲線を示したものである。
実施例14 ジゴキシンの二段階非分離競合アッセイ 血清カリブレーター（TDx Assay、Abbott Labs、シカ
ゴ、IL）50μとRu（bpy）3 2+−標識マウス抗ジゴキシ
ン（試薬IV）NECL緩衝液溶液25μを一緒にして室温で
20分間混合しながらインキュベートする。ウアバイン−
BSA−ダイナール粒子（試薬III）のECL緩衝液分散液25
μを加えて更に20分間室温で混合しながらインキュベ
ートする。読み取りに先立って粒子をECL緩衝液1mに
再分散させる。各試料に対する電気化学的ルミネッセン
ス（ECL）を実施例２に記述したようにして読み取る。E
CLの読み取り値が試料中に存在する検体の濃度に反比例
している（検体の濃度が増大すると読み取り値が減少す
る）。第Ｖ表は代表的なアッセイ曲線を示したものであ
る。
実施例15 電極上での反応試料の追加洗浄を伴う読み取りサイクル
を利用したジゴキシンの二段階非分離競合アッセイ 血清カリブレーター（TDx Assay、Abbott Labs、シカ
ゴ、IL）50μとRu（bpy）3 2+−標識マウス抗ジゴキシ
ン（試薬IV）のECL緩衝液溶液25μを一緒にして室温
で20分間混合しながらインキュベートする。ウアバイン
−BSA−ダイナール粒子（試薬III）のECL緩衝液分散液2
5μを加えて更に20分間室温で混合しながらインキュ
ベートする。読み取りに先立って粒子をECL緩衝液1m
に再分散させる。各試料に対する電気化学的ルミネッセ
ンス（ECL）を実施例２に記述したようにして読み取
る。ECLの読み取り値が試料中に存在する検体の濃度に
反比例している（検体の濃度が増大すると読み取り値が
減少する）。第VI表は代表的なアッセイ曲線を示したも
のである。
実施例16 核酸磁性粒子の調製とECLへの応用 ダイナールM450粒子を２−フルオロ−１−メチルピリ
ジニウム−４−スルフォン酸塩を使って標準手順（６）
で活性化した。活性化された粒子は次にオリゴヌクレオ
チドJK8およびJK8Cと反応させた。活性化したダイナー
ル粒子 100mgにオリゴヌクレオチド33mgを0.1M NaHCO3溶液650
μに溶かしたものを加え、３時間撹拌しながらインキ
ュベートする。粒子にはエタノールアミン（4m、0.1
M）を加えてブロックする。結合させた粒子を、単一サ
ケ精子DNAのECL緩衝液に分散液・0.5mg/mをECL緩衝液
で４〜５回洗浄し、10mg/mでECL緩衝液に再分散させ
た単一サケ精子DNA100μg/mを含むものと混合する。
粒子に交雑させた後でのECL検出の可能性はJK8および
JK8Cに結合させた粒子をRu（bpy）3 2+−標識オリゴヌク
レオチドJK7と交雑させると判る;JK7はJK8シーケンスに
対して相補性であるがJK8Cシーケンスに対しては相補性
でない。粒子（300μｇ）のECL緩衝液懸濁液の異なるロ
ットを標識したJK7の12.5、6.3、3.01、1.5fmoleを含む
ECL緩衝液50μと混合する。これらの混合物を52℃で
４時間交雑させ、次にECL緩衝液1mで洗浄してECL緩衝
液830μに再分散させる。この試料を実施例２の記載
のようにして分析する。12.5fmoleではJK8はHK8C粒子に
比べると1000倍以上も強いECL計数値を示した;6.3fmole
ではJK8粒子はJK8C粒子に比べて約1000倍であった。3.0
2と1.5fmoleではJK8粒子はJK8C粒子に比べてそれぞれ約
５倍と約３倍であった。このことは粒子の表面をECLで
直接固定化した特異性シーケンスの存在を特異性交雑に
よって検出できることを示している。
実施例17 ストレプタビジン磁性粒子Ｉの調製 ダイナールM450粒子を２−フルオロ−１−メチルピリ
ジニウム−４−スルフォン酸塩を使って標準手順（６）
で活性化した。活性化された粒子は次にストレプタビジ
ン（Sigma Ltd）と反応させた。活性化した粒子（50m
g）を0.1M NaHCO3で洗浄し、次にストレプタビジン（1.
5mg）を加えて一夜反応させる。エタノールアミン（4m
、0.1M）を加えて粒子をブロックする。結合させた粒
子を、単一サケ精子DNAのECL緩衝液分散液0.5mg/mをE
CL緩衝液で４〜５回洗浄し、10mg/mでECL緩衝液に再
分散させた単一サケ精子DNA100μg/mを含むものと混
合する。ダイナールから得られたストレプタビジン粒子
も有効であることが立証されたが今回のアッセイ・シー
ケンスでは弱い信号しか得られなかった。免疫アッセイ
に利用するためには、粒子は受動的コートに使用される
緩衝液を使用して抗原または抗体と結合させた後でBSA
でブロックする必要がある。
実施例18 ストレプタビジン磁性粒子IIの調製 BSA（PBS ２〜3m中）15mgにビオチン−ｘ−NHS
（クロンテック社、5002−１ カリフォルニア・州サン
ディエゴ）50mg/mを含むジメチルスルフォキシド105
μを加え、混合してから室温で30分間インキュベート
する。1Mグリシンを30μ加えて反応を停止させてから
室温で10分間インキュベートする。反応混合物はゲル濾
過クロマトグラフィー（Biorad社、バイオゲル P6）で
精製する。このビオチン−BSAを0.2μｍ注射器を使用し
て濾過する。ビオチン−BSA5mgをpH9.6の0.2M炭酸ナト
リウム／重炭酸ナトリウム（炭酸塩／重炭酸塩）緩衝液
に溶かして炭酸塩／重炭酸塩で洗浄したダイナビーズ
（ダイナール14002）300mgに加える。この混合物に渦巻
をかけ、混合しながら室温で一夜インキュベートする。
この粒子を磁気的に分離してからECL希釈剤10mとtRNA
100μ（10mg/m）を加える。この混合物を混合しな
がら室温で３〜４時間培養する。この粒子をECL希釈剤1
0mで一回洗浄してECL希釈剤10mとtRNA（10mg/m）
100μに再分散させる。この混合物を撹拌しながら２
〜６℃で一夜培養して粒子上の蛋白を安定させる。粒子
を磁気的に分離してストレプタビジン（Scripps S121
4）15mgを含有するPBS10mに分散させて１時間混合を
続ける。粒子をECL希釈剤10mを使用して４回洗浄する
が、何れの洗浄に際しても混合を５分間行う。粒子はEC
L希釈剤29.7mとtRNA（10mg/m）に最終的に再分散さ
せて最終濃度を「粒子100μg/m＋tRNA 100μg/m」
とする。
実施例19 特異性ゲノムDNAシーケンスのアッセイ 此処に記述するアッセイ・フォーマットは２種類のオ
リゴヌクレオチドを利用しているが、その両者は互いに
隣接している同一のDNA螺旋に交雑して、一方はプロー
ブで捕捉が可能、他方は錯体を標識している（サンドイ
ッチ交雑）。このアッセイは大腸菌DNAとtrp E/D遺伝
子領域に対して特異性のあるプローブを使用して行われ
る。大腸菌DNAは次のような標準手順（１）で調製され
る。サケ精子対照DNAはシグマ社から提供されている。D
NAの試料に交雑緩衝液（10XPBS、10mMEDTA、0.7％SDS）
14μ、ビオチン標識TRP.CO4 2ng、Ru（bpy）3 2+−標
識TRP.CO3 5ngを加える。この試料を水で100μに調
整する。この試料を97℃に加熱して、97℃で10分間培養
し、50℃に冷却して２時間交雑させる。この試料にスト
レプタビジンをコートした磁性粒子IIを20μ加えて室
温で２時間混合する。この粒子をECL緩衝液で４回洗浄
し、ECL緩衝液500μに再分散させて実施例２の記載の
ようにして分析を行う。大腸菌は陽性のDNAでサケ精子
は陰性DNAである。得られた結果を第VII表に示した。 第７表 DNA 量 平均ECL計数 陽性 10 184 25 257 50 266.5 陰性 10 87 25 70 50 75 この結果は増幅していないDNAにサンドイッチ交雑ア
ッセイ法を使うことによってECLアッセイ・システムが
大腸菌のゲノム遺伝子検出に機能する可能性があること
を示している。ストレプタビジンをコートした磁性粒子
Ｉも、ストレプタビジンをコートした磁性粒子IIを本実
施例で使用したのと同じ方式で使用することが出来る。
以上本発明の好ましい実施例によって詳細に説明した
が、かかる実施例は本発明の精神を変更することなしに
多様の変更が可能であるから、以下に記載する特許請求
の範囲は上記の説明の特定の詳細事項によって如何なる
限定も受けるものではないものと理解されるべきであ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 レランド，ジョン，ケイ. アメリカ合衆国20707 メリーランド州 ローレル，チェスナット コート 14002 (72)発明者 シャー，ハレシュ，ピー. アメリカ合衆国20878 メリーランド州 ゲイサースバーグ，ノーウィッチ コー ト 21 (72)発明者 ケンテン，ジョン，エィチ. アメリカ合衆国20879 メリーランド州 ゲイサースバーグ，ウインドジャマー ウエイ 1921 (72)発明者 グッドマン，ジャック，イー. アメリカ合衆国22201 バージニア州ア ーリントン，サード ストリート ノー ス 3011 (72)発明者 ロウク，ジョージ，イー. アメリカ合衆国20882 メリーランド州 レイトンズビル，モブリィ ファーム ドライブ 21706 (72)発明者 難波 祐三郎 茨城県筑波市小自硲672−250 (72)発明者 ブラックバーン，ゲイリー，エフ. アメリカ合衆国20882 メリーランド州 ゲイサースバーグ，ローリング フォー ク ウエイ 23627 (72)発明者 マッセイ，リチャード，ジェイ. アメリカ合衆国20852 メリーランド州 ロックビル，バレリアン コート ５ (56)参考文献 特表 昭64−500059（ＪＰ，Ａ) 特表 昭62−500663（ＪＰ，Ａ) 特表 昭64−500146（ＪＰ，Ａ) 国際公開90／5301（ＷＯ，Ａ１)

Claims (7)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】下記の工程を含む試料中の対象検体に対す
    る結合アッセイを遂行する方法： （ａ）下記の組成物の調製： （ｉ）当該試料 （ii）電気化学的ルミネッセンスが誘発され得る標識化
    合物と結合した成分を含有するアッセイ履行物質、およ
    び （iii）検体および／または上記アッセイ履行物質と特
    異的に結合し得る複数の磁気感応性懸濁粒子； （ｂ）かかる組成物をインキュベートして粒子と上記標
    識化合物を含有する複合体を形成させる； （ｃ）上記組成物をアッセイ用セルに導入する； （ｄ）かかる粒子に磁場を作用させて電極面に上記複合
    体を捕集する； （ｅ）該捕集の間に、または該捕集の後に、上記電極に
    電圧を印加して、集められた上記複合体中の標識化合物
    にルミネッセンスを誘起させる；および （ｆ）電極面で放射されるルミネッセンスを計測して試
    料中の対象検体の存在を計測する；但し、 南北極を交互配向した複数の磁石を水平に配向した電極
    面の下方に垂直に配置する。
  2. 【請求項２】アッセイが均一アッセイである請求項１記
    載の方法。
  3. 【請求項３】アッセイが不均一アッセイである請求項１
    記載の方法。
  4. 【請求項４】アッセイが、インキュベーション工程
    （ｂ）の後、測定工程（ｆ）の前に、組成物の未結合成
    分を錯体から分離することをさらに含むことにより、不
    均一である請求項３記載の方法。
  5. 【請求項５】分離工程が誘起工程（ｅ）の前に行われる
    請求項４記載の方法。
  6. 【請求項６】分離工程が導入工程（ｅ）の前に行われる
    請求項４記載の方法。
  7. 【請求項７】分離工程が、捕集工程（ｄ）の後で流体を
    アッセイ用セルにポンプで送り、上記流体は標識または
    標識試薬を実質的に含まず、それにより複合体から組成
    物の結合していない成分を洗い出すことを含む請求項５
    記載の方法。
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