KR102084805B1

KR102084805B1 - 순환 면역 복합체의 특성화를 위한 다중 크로마토그래피-면역분석 방법

Info

Publication number: KR102084805B1
Application number: KR1020147024884A
Authority: KR
Inventors: 우베 달; 그레고르 요르단; 롤란드 스타아크
Original assignee: 에프. 호프만-라 로슈 아게
Priority date: 2012-03-08
Filing date: 2013-03-07
Publication date: 2020-03-04
Also published as: RU2014140135A; CN104136923B; EP2823310B1; CN104136923A; HK1199103A1; RU2638812C2; US9797900B2; MX352118B; WO2013132000A1; JP2015509598A; JP6272788B2; KR20140132360A; EP2823310A1; US20150132781A1; CA2862824A1; MX2014010318A

Abstract

본원에는, 면역 복합체의 중량/크기를 측정하기 위해 1회 이상 약물이 투여된 포유동물로부터 수득된 샘플의 크기 배제 크로마토그래피, 임의적으로 제 2의 비-크기 배제 크로마토그래피, 및 하나 이상의 면역분석을 포함하는, 생체내에서 생성된 순환 면역 복합체(CIC)를 분석/특성화하기 위한 방법이 보고되어 있으며, 이때 면역 복합체는 면역 복합체 크기와 면역분석 결과/판독물의 상관화에 의해 특성화된다. 본원에는 또한 변화된 약동학에 대한 상관성을 측정하고, 효능의 손실 또는 감소를 측정하고, 약물의 천연 대응물의 중화를 측정하고, 혈청병/3형 과민반응/면역 복합체 매개 질환을 포함하여 면역 및 과민반응을 측정하기 위한, 본원에 보고된 바와 같은 방법의 용도가 보고되어 있다.

Description

순환 면역 복합체의 특성화를 위한 다중 크로마토그래피-면역분석 방법{MULTIPLEXED CHROMATOGRAPHY-IMMUNOASSAY METHOD FOR THE CHARACTERIZATION OF CIRCULATING IMMUNE COMPLEXES}

본원에는 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 및 면역분석을 포함하는 다단계 방법에 의해 생물 기질중의 순환 면역 복합체의 검출 및 특성화(크기 및 조성)를 위한 방법이 보고되어 있다.

대부분의 생체치료제는 안전성 및 효능에 대한 가능한 결과하에 원치않는 면역 반응을 유도할 수 있는데, 이때 상기 반응들은 빈도 및 중증도에 있어 다양하다[Buttel, I.C. et al., Biologicals 39, 100-109 (2011); COMMITTEE FOR MEDICINAL PRODUCTS FOR HUMAN USE (CHMP), EMEA Guideline on Immunogenicity Assessment of Biotechnology-derived Therapeutic Proteins, http://www.emea.europa.eu (2007)].

항-약물 항체(ADA)의 생성은 변화된 약동학, 효능의 손실 또는 감소, 천연 대응물들의 중화뿐 아니라, 혈청병/3형 과민반응/면역 복합체-매개 질환을 포함하여 일반적인 면역 및 과민 반응을 야기할 수 있다(Buttel, I.C. et al., Biologicals 39, 100-109 (2011); COMMITTEE FOR MEDICINAL PRODUCTS FOR HUMAN USE (CHMP), EMEA Guideline on Immunogenicity Assessment of Biotechnology-derived Therapeutic Proteins, http://www.emea.europa.eu (2007)].

ADA-D 복합체 생성의 결과로서 혈청병 유사 증후군은 잘 알려진 부작용이며 전임상 연구[Ponce, R. et al., Regul. Toxicol. Pharmacol. 54, 164-182 (2009)] 및 임상 시험[COMMITTEE FOR MEDICINAL PRODUCTS FOR HUMAN USE (CHMP), EMEA Guideline on Immunogenicity Assessment of Biotechnology-derived Therapeutic Proteins, http://www.emea.europa.eu (2007); Dreyfus, D.H. et al., Ann. Allergy Asthma Immunol. 96, 624-627 (2006); Gamarra, R.M., J. Emerg. Med. 30, 41-44 (2006); Goto, S. et al., Int. J. Hematol. 89, 305-309 (2009); Hansel, T.T. et al., Nat. Rev. Drug Discov. 9, 325-338 (2010); Pilette, C. et al., J. Allergy Clin. Immunol. 120, 972-973 (2007); Tamilvanan, S. et al., J. Drug Target 18, 489-498 (2010)]에서 다양한 생물제제에 대해 보고되었다.

시판 약물의 경우, 혈청병 또는 심각한 알레르기 반응과 같은 주요 반응들의 특징들이 임상적으로 진단된다. 연관된 mAb의 투여후 부작용이 따르는 경우, 상기 반응들은 항체 반응에 기인한다[COMMITTEE FOR MEDICINAL PRODUCTS FOR HUMAN USE (CHMP), EMEA Guideline on Immunogenicity Assessment of Biotechnology-derived Therapeutic Proteins, http://www.emea.europa.eu (2007)]. 사실상, ADA 생성이 연구되고 임상적으로 관찰된 징후들과 상관되었다는 매우 한정된 데이터만을 확일할 수 있다[Goto, S. et al., Int. J. Hematol. 89, 305-309 (2009)].

면역원성의 잠재적 심각성을 고려하여, EMEA는 ADA 생성의 확인 및 특성화의 중요성을 강조하였다[COMMITTEE FOR MEDICINAL PRODUCTS FOR HUMAN USE (CHMP), EMEA Guideline on Immunogenicity Assessment of Biotechnology-derived Therapeutic Proteins, http://www.emea.europa.eu (2007)].

면역원성의 평가는 전형적으로 ADA를 검출하기 위해 설계된 면역분석법을 이용하여 수행된다[Mire-Sluis, A.R., et al., J. Immunol. Methods 289, 1-16 (2004); Shankar, G. et al., J. Pharm. Biomed. Anal. 48, 1267-1281 (2008); Koren, E. et al., J. Immunol. Methods 333, 1-9 (2008)].

그러나, ADA 발생률에 대한 정보는 지금까지 임상 결과 및 변화된 약동학과의 완전한 상관화를 가능하게 하지 못한다.

생성된 ADA-약물 복합체의 양 및 크기는 여러 파라미터, 예를 들면, ADA 및 약물 농도/비뿐 아니라 에피토프 및 원자가에 따라 달라진다[Abbas, A.K. and Lichtman, A.H., Diseases caused by immunity responses: Hypersensitivity and Autoimmunity, Saunders (2003); Murphy, K. et al., Janeway's Immunobiology, Garland Science, Taylor & Francis Gourp, LLC (2008)].

복합체 크기 및 전하는 복합체 제거 또는 부작용 유도의 중요한 결정인자이다. 전형적으로, 보다 큰 복합체는 세망내피계에 의해 제거되고, 작은 복합체는 통상적으로 염증을 유발하지 않는 반면, 중간 크기 복합체는 보체를 고정시킬 수 있으며 조직 손상을 야기할 수 있다[Abbas, A.K. and Lichtman, A.H., Diseases caused by immunity responses: Hypersensitivity and Autoimmunity, Saunders (2003); Murphy, K. et al., Janeway's Immunobiology, Garland Science, Taylor & Francis Group, LLC (2008); Mannik, M., Serum Sickness and pathophysiology of immune complexes, Clinical Immunology: Principles and Practices, Rich R.R., Fleisher T.A.S.B.D., Shearer W.T., Strober W. (eds.) 1062-1071 (1996); Sicherer, S.H., Leung D.Y.M., Serum Sickness, Nelsons textbook of pediatrics, Kliegman R.M., Behrman R.E., Jenson H.B.J., Stanton B.F. (eds.), Saunders Elsevier, pp. 985-986 (2007)]. 또한, 복합체의 전하는 복합체의 조직 침착에 중요한 요소이다[Abbas, A.K. and Lichtman, A.H., Diseases caused by immunity responses: Hypersensitivity and Autoimmunity, Saunders (2003); Mannik, M., Serum Sickness and pathophysiology of immune complexes, Clinical Immunology: Principles and Practices, Rich R.R., Fleisher T.A.S.B.D., Shearer W.T., Strober W. (eds.) 1062-1071 (1996)].

ADA 반응의 충분한 평가를 위해, 잠재적으로 생성된 ADA-약물 복합체는 크기 및 전하와 관련하여 특성화되어야 한다. 또한, 약물의 내인성 대응물이 존재하는 경우, 생성된 ADA가 상기 분자들과 교차-반응성인지 및 내인성 대응물이 또한 복합체의 일부인지에 대한 정보가 가치있는 정보이다. 또한, 면역 복합체에서 항원/약물의 구조적 특성화는 발병에 대한 정보를 제공한다.

코일(Coyle) 등은 다발성 경화증 뇌척수액에서 면역 복합체의 검출 및 단리를 보고하고 있다[Journal of Neuroimmunology 15, 97-107 (1987)]. 면역 복합체의 분석을 위한 민감한 방법인, ELISA 기술과 병용되는 크로마토포커싱(chromatofocusing)이 문헌 [Kneba, M., et al., J. Immunol. Meth. 61, 233-243 (1983)]에 보고되어 있다. 문헌 [Matousovic, K., et al., Nephrology Dialysis Transplantation 21, 2478-2484 (2006)]은 IgA 신장병 환자의 소변에서 IgA-함유 면역 복합체를 보고하고 있다. 토끼 생존 우역(rinderpest) 바이러스 감염에서 순환 면역 복합체가 문헌 [Rattan, B., et al., Acta Vir. 38, 105-110 (1994)]에 보고되어 있다. WO 2008/031532 호에는 항-약물 항체 분석이 보고되어 있다. 문헌 [Stubenrauch, K., et al., J. Pharm. Biomed. Anal. 52, 249-254 (2010)]은 인간 항체 투여후 사이노몰구스(cynomolgus) 원숭이로부터의 혈청 샘플중 면역 복합체를 검출하기 위한 약물 내성하에서의 포괄적인 면역분석법의 평가를 보고하고 있다. WO 2011/056590 호에는 항-TNF 약물 및 자가항체의 검출을 위한 분석법이 보고되어 있다. 문헌 [Wang Shui Long et al., Am. J. Gastroent. 105, S444-S445 (Sup 1, 2010)]은 새로운 균일한 이동성 변화 분석법을 이용하여 환자 혈청에서 아달리무맙(Adalimumab)에 대한 항-약물 항체(ADA)의 분석을 보고하고 있다. EP 2 354 792 호에는 항-약물 항체를 검출하기 위한 방법이 보고되어 있다. 문헌 [Lambert, P.H., et al., J. Clin. Lab. Immunol. 1, 1-15 (1978)]은 혈청에서 면역 복합체를 검출하기 위한 18가지 방법의 평가에 대한 WHO 협력 연구를 보고하고 있다. 순환 면역 복합체를 측정하기 위한 방법이 문헌 [Levinson, S.S., et al., Clin. Immunol. Newsletter 3, 39-42 (1987)]에 보고되어 있다.

하나 이상의 면역분석법과 함께 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 이용하는 다단계 방법을 포함하는, 생물 기질에서 순환 면역 복합체, 예를 들면, 주어진 약물에 대한 ADA를 함유하는 복합체의 검출 및 특성화(크기 및 조성)를 위한 방법을 사용하여, 변화된 약동학, 효능의 손실 또는 감소, 천연 대응물의 중화뿐 아니라, 혈청병/3형 과민반응/면역 복합체-매개 질환을 포함하여 일반적인 면역 및 과민 반응에 대한 상관화가 이루어질 수 있음이 밝혀졌다.

본원에 보고된 바와 같은 한 양태는 다음을 포함하는, 생체내에서 생성된 순환 면역 복합체(circulating immune complex, CIC)를 분석/특성화하기 위한 방법으로, 이때 상기 면역 복합체는 면역 복합체 크기와 면역분석 또는 질량-분광 분석 결과/판독물의 상관화에 의해 특성화된다:

a) 면역 복합체의 중량/크기를 측정하기 위한, 약물이 1회 이상 투여된 포유동물로부터 수득된 샘플의 크기 배제 크로마토그래피,

b) 임의적으로(optionally), 제 2의 비-크기 배제 크로마토그래피,

c) 하나 이상의 면역분석, 및

d) 임의적으로, 질량-분광법-기반 분석.

본원에 보고된 바와 같은 한 양태는 다음을 포함하는, (외인성) 치료용 폴리펩티드 및 생체내에서 생성된 내인성 항-약물 항체를 포함하는 순환 복합체화 항-약물 항체 면역 복합체를 분석하고 측정하기 위한 방법으로, 이때 상기 면역 복합체는 면역 복합체 크기와 면역분석 또는 질량-분광 분석 결과/판독물의 상관화에 의해 특성화되며, 상기 치료용 폴리펩티드는 합성 또는 비-천연 치료용 폴리펩티드이다:

b) 임의적으로, 제 2의 비-크기 배제 크로마토그래피,

c) 항-약물 항체를 검출하기 위한 하나 이상의 불균일 면역분석, 및

d) 임의적으로, 질량-분광법-기반 분석.

모든 양태들의 한 태양에서, 샘플은 혈청 또는 뇌척수액이다.

모든 양태들의 한 태양에서, 면역 복합체는 약물-특이적 면역 복합체이다.

약물 특이적 면역 복합체는 다른 비-약물 분자와 함께 약물을 포함한다.

모든 양태들의 한 태양에서, 상기 면역분석은 항-약물 항체 검출 분석, 약물-중화 항체 검출 분석, 약동학 분석(약물 정량화 분석), 항체 이형판별(isotyping) 분석, 내인성 약물 대응물에 대한 ADA-교차-반응성을 측정하기 위한 분석(약물이 포유동물에서 내인적으로도 또한 발생하는 부분을 포함하는 경우), 보체 결합 분석(결합된 보체 또는 보체에 대한 결합 능력), 면역 복합체에 포함된 약물의 내인성 대응물을 측정하기 위한 분석(약물이 포유동물에서 또한 내인적으로도 발생하는 부분을 포함하는 경우)을 포함하는 군에서 선택된다.

모든 양태들의 한 태양에서, 상기 면역분석은 균일 면역분석 또는 불균일 면역분석이다. 한 태양에서, 면역분석은 방사성 면역분석(radio immunoassay, RIA), 또는 효소 면역분석(EIA, ELISA, EMIT), 또는 형광 편광 면역분석(fluorescence polarization immunoassay, FPIA), 또는 발광 면역분석(luminescence immunoassay, LIA), 또는 면역 방사측정 면역분석(immuno radiometric immunoassay, IRMA), 또는 마이크로비드-효소 면역분석(microbead-enzyme immunoassay, MEIA), 또는 효소-결합 형광 분석(enzyme-linked fluorescence assay, ELFA), 또는 렉틴-효소 면역분석(lectin-enzyme immunoassay, LEIA), 또는 면역형광 분석(immunofluorescence assay, IFA), 또는 전기화학발광 분석(electrochemiluminescense assay, ECLIA), 또는 면역자기 전기화학발광 분석(immunomagnetic electrochemiluminescense assay, IMECL), 또는 화학발광 도트-면역결합 분석(chemiluminescence dot-immunobinding assay, CDIA), 또는 탁도 분석, 또는 입자-강화 면역탁도측정 분석이다. 한 태양에서, 면역분석은 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA), 또는 전기화학발광 분석(ECLIA), 또는 화학발광 도트-면역결합 분석(CDIA), 또는 형광 편광 면역분석(FPIA), 또는 탁도 분석, 또는 입자-강화 면역탁도측정 분석이다.

모든 양태들의 한 태양에서, 제 2의 비-크기 배제 크로마토그래피는 이온 교환 크로마토그래피(양이온- 또는 음이온 교환 크로마토그래피), 또는 역상 크로마토그래피, 또는 친수성 상호작용 크로마토그래피(HILIC), 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC), 또는 소수성 전하 상호작용 크로마토그래피(HCIC), 또는 제한 접근 물질 크로마토그래피(restricted access material chromatography, RAMC)이다.

모든 양태들의 한 태양에서, 크기 배제 크로마토그래피는 분획들중에 용출액을 회수하는 크기 배제 크로마토그래피이다. 한 태양에서, 분획들 각각은 면역분석으로 분석된다.

모든 양태들의 한 태양에서, 크기 배제 크로마토그래피의 분획들 중 하나 이상은 분취액으로 용출액을 회수하는 제 2의 비-크기 배제 크로마토그래피에 의해 더 분리된다. 한 태양에서, 분획들 각각은 면역분석으로 분석된다. 한 태양에서, 크기 배제 크로마토그래피의 분획들 각각은 제 2의 비-크기 배제 크로마토그래피에 의해 분석된다.

모든 양태들의 한 태양에서, 분획은 분취액이다.

모든 양태들의 한 태양에서, 면역분석은 효소 결합 면역흡착 분석이다.

모든 양태들의 한 태양에서, 하나 이상의 면역분석은 1개, 또는 2개, 또는 3개, 또는 4개, 또는 5개, 또는 6개 면역분석이다.

모든 양태들의 한 태양에서, 면역분석은 항-약물 항체 면역분석이다.

모든 양태들의 한 태양에서, 면역분석들 중 하나 이상은 가교 효소 결합 면역흡착 분석이다.

양성 가교 효소 결합 면역흡착 분석은 항-약물 항체가 ADA-D 복합체의 일부였음을 나타낸다. 보다 고분자량 분획중, 즉, 크기 배제 크로마토그래피의 보다 초기 용출 분획중 항-약물 항체의 검출은 항-약물 항체가 보다 고분자량 복합체의 일부였음을 나타낸다.

모든 양태들의 한 태양에서, 효소 결합 면역흡착 분석들 중 하나 이상은 ADA-D 복합체의 검출을 위한 복합체 분석이다. 한 태양에서, 복합체 분석은 약물 특이적 포획 항체, 및 검출 항체로서 항-종 특이적 항체를 포함한다.

모든 양태들의 한 태양에서, 면역분석들 중 하나 이상은 약물에 및/또는 약물의 내인성 대응물에 결합되는 항-약물 항체의 검출을 위한 직접 분석이다. 한 태양에서, 상기 직접 분석은 포획 분자로서 고정화된 약물 또는 약물의 내인성 대응물, 및 검출 항체로서 항-종 특이적 항체를 포함한다.

상기 직접 분석은 유리 항-약물 항체가 크기 배제 크로마토그래피에 의해 제거된 후, 샘플중 약물 및/또는 내인성 대응물에 결합하는 항-약물 항체와 고정화된 약물의 평형의 수립을 이용한다.

모든 양태들의 한 태양에서, 약물 표면 코팅은 조밀한 약물 표면 코팅이다.

조밀한 표면 코팅에 의해 표면 결합된 약물에 대한 결합쪽으로의 평형의 이동이 달성된다(항-약물 항체의 결합활성 이용).

모든 양태들의 한 태양에서, 샘플은 16 내지 32 시간의 시간동안 면역분석에서 배양된다.

본원에 보고된 바와 같은 한 양태는 후속 ADA 분석/면역분석의 약물 내성을 증가시키기 위해 ADA-D 복합체로부터 약물을 분리하기 위한 방법이다. 유사하게, 본원에 보고된 바와 같은 방법은 면역분석의 약물 내성을 증가시키기 위해 사용될 수 있다.

본원에 보고된 바와 같은 한 양태는, a) ADA-D 복합체의 중량/크기를 측정하기 위한, 약물이 1회 이상 투여된 포유동물로부터 수득된 샘플의 크기 배제 크로마토그래피, 및 b) 항-약물 항체의 검출을 위한 하나 이상의 효소 결합 면역흡착 분석을 포함하는, 생체내에서 생성된 항-약물 항체-약물(ADA-D) 복합체의 특성화를 위한 방법으로서, 상기 면역 복합체는 양성 효소 결합 면역흡착 분석 및 약 150 내지 약 400 kDa의 분자량에 의해 저분자량 복합체, 양성 효소 결합 면역흡착 분석 및 약 400 내지 약 1,500 kDa의 분자량에 의해 중간 분자량 복합체, 또는 양성 효소 결합 면역흡착 분석 및 약 1,500 내지 약 7,000 kDa의 분자량에 의해 고분자량 복합체인 것으로 특성화된다.

본원에 보고된 바와 같은 한 양태는 변화된 약동학에 대한 면역 복합체 특성들의 상관화를 위한 본원에 보고된 바와 같은 방법의 용도이다.

본원에 보고된 바와 같은 한 양태는 약물의 효능 감소를 측정하기 위한 본원에 보고된 바와 같은 방법의 용도이다.

본원에 보고된 바와 같은 한 양태는 약물의 천연 대응물의 중화를 측정하기 위한 본원에 보고된 바와 같은 방법의 용도이다.

본원에 보고된 바와 같은 한 양태는 약물에 대한 면역 및 과민 반응을 측정하기 위한 본원에 보고된 바와 같은 방법의 용도이다.

본원에 보고된 바와 같은 한 양태는 IgG 사구체 침착을 측정하기 위한 본원에 보고된 바와 같은 방법의 용도이다.

모든 양태들의 한 태양에서, 상기 면역 및 과민 반응은 혈청병/3형 과민 반응/면역 복합체-매개 질환이다.

본원에 보고된 바와 같은 한 양태는 면역 복합체를 포함하는 자가면역 항체의 존재를 측정하기 위한 본원에 보고된 바와 같은 방법의 용도이다.

본원에 보고된 바와 같은 한 양태는 변형된/복합체화된 약물의 존재를 측정하기 위한 본원에 보고된 바와 같은 방법의 용도이다.

모든 양태들의 한 태양에서, 약물은 인간 또는 인간화된 항체이다.

도 1은 약물 ADA-D 복합체 생성(1 mg 약물 및 1 mg ADA)의 역학을 나타낸 것이다.
도 2는 ADA의 추가 첨가에 따른 도 1에 나타낸 바와 같은 역학을 나타낸 것이다.
도 3은 본원에 보고된 바와 같은 방법에 의해 수득된 바와 같은 예시적인 재구성된 SEC 다이어그램 및 ELISA 결과이다.
도 4는 도 3에 나타낸 바와 같은 재구성된 SEC의 확대영상이다.
도 5는 5마리 원숭이의 혈장에서 적용된 약물의 농도 추이(용량 = 100 mg/kg, 반복 적용, 연구 제 17 일에 적용)이다.
도 6은 IgG 침착 양성 동물을 나타낸 것이다(반정량적 평가).

정의

용어 "항-약물 항체"는 약물의 항원성 영역에 대해 유도되는 항체를 의미한다. 상기 항원성 영역은 약물의 항원성 아미노산 서열 또는 약물의 당구조(glycostructure)일 수 있다. 한 태양에서, 항-약물 항체는 비-인간 세포, 예를 들면, CHO 세포, HEK 세포 또는 BHK 세포에서 상기 약물 항체의 재조합 생성으로부터 비롯된 약물의 2차 변형에 대해 유도된다. 일반적으로, 항-약물 항체는 약물이 투여되는 동물의 면역계에 의해 인식되는 약물의 항원성 영역에 대해 유도된다. 상기 항-약물 항체는 "특이적 항-약물 항체"이다. 약물은 가능한 한 적은 항원성 영역을 포함하도록 설계된다. 예를 들면, 인간에서 사용하기 위한 약물은 약물에 대한 면역 반응의 발생을 최소화하기 위해 인간 환자에게 적용전에 인간화될 수 있다. 상기 면역 반응은 상기 인간화된 약물의 비-인간 부분에 대해 유도된 항-약물 항체의 형태일 것이다(예를 들면, 문헌 [Pan, Y., et al., FASEB J. 9, 43-49 (1995)].

용어 "색원체"는 형광 또는 발광성 기 및 염료를 의미한다.

용어 "검출가능한 표지"는 효소, NMR-활성기 또는 금속 입자, 합텐, 예를 들면, 디곡시제닌을 의미한다. 검출가능한 표지는 또한 광활성화가능한 가교결합기, 예를 들면, 아지도 또는 아지린기일 수 있다. 전기화학발광에 의해 검출될 수 있는 금속 킬레이트가 또한 바람직한 신호-발생기이며, 루테늄 킬레이트, 예를 들면, 루테늄 (비스피리딜)₃ ²⁺ 킬레이트가 특히 바람직하다. 적합한 루테늄 표지기는, 예를 들면, EP 0 580 979 호, WO 90/05301 호, WO 90/11511 호 및 WO 92/14138 호에 기술되어 있다.

용어 "약물"은 질환의 치료를 위해 개체에 투여될 수 있는 폴리펩티드, 상기 항체 또는 비-항체 분자를 의미한다. 약물(예를 들면, 치료용 폴리펩티드 또는 치료용 단클론성 항체)은 종양학적 질환(예를 들면, 비-호지킨 림프종, 유방암 및 대장암을 포함하여 혈액학적 및 고형 악성종양), 면역학적 질환, 중추신경 질환, 혈관 질환 또는 감염성 질환과 같은 다양한 질환의 치료에 광범위하게 사용되고 있다. 상기 약물들은, 예를 들면, 문헌 [Levine, A.P., et al., Journal of the Royal Society of Medicine 98, 145-152 (2005)]에 기술되어 있다. 상기 약물은, 예를 들면, CD20, CD22, HLA-DR, CD33, CD52, EGFR, G250, GD3, HER2, PSMA, CD56, VEGF, VEGF2, CEA, 레비스(Levis) Y 항원, IL-6 수용체 또는 IGF-1 수용체에 대한 항체이다. 치료용 항체들은 또한 문헌 [Groner, B., et al., Curr. Mol. Meth. 4, 539-547 (2004)] 및 [Harris, M., Lancet Oncol. 5, 292-302 (2004)]에 기술되어 있다.

용어 "포유동물"은 척추 동물 강에 속하는 생물체를 의미한다. 용어 포유동물은, 한 태양에서, 영장류, 고양이, 개, 양, 래트, 마우스 및 토끼를 의미한다. 한 태양에서, 용어 포유동물은 대략 마모셋(marmoset) 및 타마린(tamarin)(비단원숭이과(Callitrichidae)), 뉴월드 원숭이(new world monkey)(꼬리감는원숭이과(Cebidae)), 긴꼬리 원숭이(old world monkey)(긴꼬리원숭이과(Cercopithecidae)), 난쟁이(dwarf) 및 쥐 여우원숭이(mouse lemur)(난쟁이여우원숭이과(Cheirogaleidae)), 아이아이 원숭이(aye-aye)(아이아이원숭이과(Daubentoniidae)), 부시베이비(bushbaby) 및 갈라고(galago)(갈라고원숭이과(Galagonidae)), 긴팔원숭이(gibbon) 및 소형 유인원(긴팔원숭이과(Hylobatidae)), 인드리원숭이(indri), 시파카원숭이(sifaka) 및 동류(인드리과(Indridae)), 참여우원숭이(true lemur)(여우원숭이과(Lemuridae)), 로리스원숭이(loris)(늘보원숭이과(Loridae)), 족제비 여우원숭이(sportive lemur)(메갈라다피스과(Megaladapidae)), 안경원숭이(tarsier)(안경원숭이과(Tarsiidae)), 및 이들의 교잡체를 포함하는 영장류 과들의 구성원을 의미한다. 한 태양에서, 포유동물은 마모셋 및 타마린, 긴꼬리원숭이, 난쟁이 및 쥐 여우원숭이, 긴팔원숭이 및 소형 유인원, 참여우원숭이 및 이들의 교잡체들의 과의 구성원들을 포함하는 군에서 선택된다. 상기 특정 태양에서, 인류에 가장 가까운 동류인 대형 유인원, 특히 침팬지, 보노보, 고릴라 및 오랑우탄의 군은 제외된다.

용어 "샘플"은 약물이 투여된 포유동물로부터의 임의량의 물질을 의미한다. 상기 물질로는 전임상 과정에서 가장 널리 사용되는 샘플 공급원인, 상기 포유동물로부터의 전혈, 혈청 또는 혈장이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다. 한 태양에서, 샘플은 타액, 소변, 활액, 전혈, 혈장 또는 혈청과 같은 액체 샘플이다. 한 태양에서, 샘플은 전혈, 혈장 또는 혈청이다.

용어 "고체상"은 비-유체 물질을 의미하며, 중합체, 금속(상자성체, 강자성체 입자), 유리 및 세라믹과 같은 물질로부터 제조된 입자(미립자 및 비드 포함); 실리카, 알루미나 및 중합체 겔과 같은 겔 물질; 중합체, 금속, 유리 및/또는 세라믹으로 제조될 수 있는 모세관; 제올라이트 및 다른 다공성 물질; 전극; 미세적정 플레이트; 고체 스트립; 및 큐벳, 튜브 또는 기타 분광계 샘플 용기를 포함한다. 분석의 고체상 성분은, "고체상"이 그 표면 상에 포획 항체와 상호작용하기 위한 하나 이상의 잔기를 함유한다는 점에서 분석물이 접촉할 수 있는 불활성 고체 표면과 구별된다. 고체상은 튜브, 스트립, 큐벳 또는 미세적정 플레이트와 같이 고정 성분일 수 있거나, 또는 비드 및 미립자와 같이 비-고정 성분일 수 있다. 미립자는 또한 균일 분석 포맷을 위한 고체상으로 사용될 수 있다. 폴리펩티드 및 다른 물질들의 비-공유 또는 공유 결합을 허용하는 다양한 미립자를 사용할 수 있다. 상기 입자로는 폴리스티렌 및 폴리(메틸메타크릴레이트)와 같은 중합체 입자; 금 나노입자 및 금 콜로이드와 같은 금 입자; 및 실리카, 유리 및 산화 금속 입자와 같은 세라믹 입자가 포함된다(예를 들면, 본원에 참고로 인용된 문헌 [Martin, C.R., et al., Analytical Chemistry-News & Features, May 1, 1998, 322A-327A] 참조).

다중 면역 복합체 분석 방법

면역분석과 함께 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 사용하는 다단계 방법을 포함하는, 생물 기질에서 투여된 약물에 대해 유도된 면역 복합체의 검출 및 특성화(크기 및 조성)를 위한 방법을 사용하여, 변화된 약동학, 효능의 손실 또는 감소, 천연 대응물의 중화뿐 아니라, 혈청병/3형 과민 반응/면역 복합체-매개 질환을 포함하여 일반적인 면역 및 과민 반응에 대한 상관화가 이루어질 수 있음이 밝혀졌다.

따라서, 본원에는 한 양태로서, 면역 복합체의 중량/크기를 측정하기 위한, 약물이 1회 이상 투여된 포유동물로부터 수득된 샘플의 크기 배제 크로마토그래피, 임의적으로 제 2의 비-크기 배제 크로마토그래피, 및 하나 이상의 면역분석을 포함하는, 생체내에서 생성된 순환 면역 복합체(CIC)를 분석/특성화하기 위한 방법이 보고되며, 이때 상기 면역 복합체는 면역 복합체 크기와 면역분석 결과/판독물의 상관화에 의해 특성화된다.

본원에는 또한, 한 양태로서, 항-약물 항체-약물(ADA-D) 복합체의 중량/크기를 측정하기 위한, 약물이 1회 이상 투여된 포유동물로부터 수득된 샘플의 크기 배제 크로마토그래피, 및 항-약물 항체의 검출을 위한 하나 이상의 효소 결합 면역흡착 분석을 포함하는, 생체내에서 생성된 ADA-D 복합체의 특성화를 위한 방법이 보고되며, 이때 상기 면역 복합체는 양성 효소 결합 면역흡착 분석 및 약 150 내지 약 400 kDa의 분자량에 의해 저분자량 복합체, 양성 효소 결합 면역흡착 분석 및 약 400 내지 약 1,500 kDa의 분자량에 의해 중간 분자량 복합체, 또는 양성 효소 결합 면역흡착 분석 및 약 1,500 내지 약 7,000 kDa의 분자량에 의해 고분자량 복합체인 것으로 특성화된다.

또한, 본원에서는 변화된 약동학에 대한 상관성을 측정하고, 효능의 손실 또는 감소를 측정하고, 약물의 천연 대응물의 중화를 측정하고, 혈청병/3형 과민 반응/면역 복합체-매개 질환을 포함하여 면역 및 과민 반응을 측정하기 위한, 본원에 보고된 바와 같은 방법의 용도가 보고된다.

예를 들면, 포유동물에게 약물을 투여한 후, 포유동물의 면역계는 투여된 약물을 외부 물질로 인식하고 투여된 외부 물질을 중화시키기 위해 항-약물 항체를 생성할 수 있다. 약물이 포유동물에 내인성인 요소를 포함하는 경우, 항-약물 항체는 또한 약물의 상기 요소에 대해 유도될 수 있으며, 유사하게 또한 포유동물에서 내인성 대응물을 표적화할 수 있다.

투여된 치료 약물에 대한 면역 반응/ADA 생성/보체 활성화는 면역 복합체의 생성을 유도할 수 있다. 면역 복합체(ADA-D 복합체)의 생성은 변화된 약동학 성질 또는 임상 후유증, 예를 들면, 혈청병 유사 증후군을 야기할 수 있다.

면역 복합체 특성은 유도된 후속 결과의 중요한 결정인자일 수 있다:

- 복합체 크기

크기가 큰 복합체의 생성은 RES 시스템에 의한 증대된 제거를 야기할 수 있다.

중간 크기 복합체의 생성은 복합체 고정에 이어, 조직 침착 및 "혈청병"을 야기할 수 있다.

작은 크기 복합체의 생성은 심각한 영향을 미치지 "않을" 수 있다.

- 복합체 전하

양이온성 면역 복합체는 침착/세포/조직 막(음이온성 세포 표면)과 결합될 수 있다.

- 복합체 극성

- C1q - 결합 또는 결합 능력.

따라서, 철저한 면역 복합체 특성화는 생체내 영향(약동학 변화 및/또는 독성학적 영향)과의 상관화에 전제조건이다.

그러나, 예를 들어, 항-약물 항체(ADA) 발생의 유일한 정보는 임상 결과와 변화된 약동학과의 충분한 상관화를 가능하게 하지 못한다.

생성된 면역 복합체, 예를 들면, 항-약물 항체-약물 복합체(ADA-D 복합체)의 양 및 크기는 여러 파라미터, 예를 들면, 농도/비 뿐 아니라, 에피토프 및 원자가에 따라 달라진다.

복합체 크기는 복합체 제거 또는 부작용 유도의 중요한 결정인자이다. 전형적으로, 더 큰 복합체는 세망내피계에 의해 제거되고, 작은 복합체는 통상적으로 염증을 유발하지 않는 반면, 중간 크기 복합체는 보체를 고정시킬 수 있으며 조직 손상을 야기할 수 있다.

면역 반응의 충분한 평가를 위해, 잠재적으로 생성된 면역 복합체는 크기에 관해 특성화되어야 한다. 또한, 약물의 내인성 대응물이 존재하는 경우, 생성된 ADA가 상기 분자들과 교차-반응성인지 및 내인성 대응물이 또한 면역 복합체의 일부인지에 대한 정보가 가치있는 정보이다.

정보는 면역 생성으로 인한 변화된 약동학 또는 부작용과 같은 결과와 상관될 수 있으며, 예를 들면, 어떤 영향도 갖지 않는 면역 복합체 양성 대상과 일부 면역 복합체 양성 대상에서만 변화된 약동학 또는 임상 후유증 또는 혈청병을 갖는 면역 복합체 양성 대상 사이에서의 차이를 설명하기 위한 추가의 정보를 제공할 수 있다.

약물이 투여된 포유동물에서 면역 복합체의 생성을 측정하기 위해서 및 생성된 면역 복합체를 특성화하기 위해서 2-단계 방법이 필요하다.

본원에 보고된 바와 같은 방법은 임의의 면역 복합체, 예를 들면, ADA-D 복합체 및 자가면역 복합체(류마티스성 관절염, 루푸스 등과 같은 자가면역 질환)의 특성화에 사용될 수 있다.

크기 배제 크로마토그래피

제 1 단계에서, 생성된 면역 복합체를 복합체중 성분들의 분명한 수를 측정하기 위해 그의 크기와 관련하여 분리한다. 이것은 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 및 용출액의 분획화(한 태양에서 분취화)에 의해 수행될 수 있다.

항-약물 항체가 IgG 부류인 것으로 가정하면, 상기 항체는 약 150 kDa의 분자량을 가지며, 치료용 폴리펩티드의 분자량이 약 2.5 kDa(폴리펩티드 약물; 20개 아미노산 잔기로 이루어지는 폴리펩티드) 내지 약 250 kDa(약물 항체; 또 다른 융합된 작동인자 폴리펩티드 또는 다중특이성 항체를 포함하는 IgG 부류의 전장 치료 항체)의 범위라고 가정하면, 항-약물 항체와 약물의 1:1 화학량론적 복합체는 소형 폴리펩티드 약물의 경우 약 150 kDa 이상의 분자량 및 복합체 약물 항체의 경우 약 400 kDa 이하의 분자량을 갖는다.

분획화 시간의 선택은 크기 정보에 대한 분해능을 결정한다.

혈청 혈장(예를 들면, 항-약물 항체 검출의 경우) 또는 활액(류마티스성 질환에서와 같이)일 수 있는 샘플(생체-기질)은 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 분획화된다. 크기 배제 크로마토그래피는 첫번째 정보: 분석물(복합체) 크기를 제공한다.

크기 배제 크로마토그래피의 개개 분획물들은 2차원 크로마토그래피, 예를 들면, 복합체의 전하를 측정하기 위한 IEC 분리, 또는 복합체의 극성을 측정하기 위한 역상(RP) 크로마토그래피 또는 HILIC 분리를 이용하여 분석할 수 있다.

또한, 크기 배제 크로마토그래피의 개개 분획물들은 보체 결합 활성에 대해 분석될 수 있다.

또한, 크기 배제 크로마토그래피의 개개 분획물들은 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA)을 이용하여 분석될 수 있다.

효소 결합 면역흡착 분석

크기 배제 크로마토그래피 용출액의 분획화는, 상이한 복합체들을 측정하기 위해 상이한 면역분석들을 수행할 수 있기 때문에, 다음과 같이, SEC 분석의 다중화를 가능하게 한다:

- 가교-유형 ELISA("전통적 ADA 스크리닝 분석); 보다 고분자량 분획에서 ADA의 검출은 ADA가 보다 고분자량 분획의 일부였음을 시사한다

- 복합체-유형 분석: 약물 특이적 포획 및 항-종 검출을 이용한 ADA-D 복합체의 검출은 전임상 연구에서 mAb에 대한 일반적인 접근방법이다(예를 들면, 본원에 참고로 인용된 WO 2006/066912 호, WO 2008/031532 호 참조)

- 직접-유형 분석: 고정화 약물 및 항-종 특이적 검출을 이용함으로써 약물에 및/또는 내인성 대응물에 결합된 ADA의 검출.

한 태양에서, 각 분석에 대해, 특정 컷 포인트(cut point)는 블랭크 또는 이상적으로는 투약전(pre-dose) 샘플의 분석에 의해 평가된다.

컷 포인트 규정 및 상이한 플레이트들 간의 반정량적 결과 비교를 위해, ELISA 신호는 규정된 시간 이후에 판독해야 한다(한 태양에서, MTP에 대한 양성 대조군을 사용하여 모니터링한다).

면역분석은 숙련된 전문가에게 공지되어 있다. 상기 분석을 수행하기 위한 방법뿐 아니라, 실제적인 용도 및 절차가 관련 교재들에 요약되어 있다. 관련 교재의 예는 문헌 [Tijssen, P., Preparation of enzyme-antibody or other enzyme-macromolecule conjugates, "Practice and theory of enzyme immunoassays", Burdon, R.H. and v. Knippenberg, P.H.(eds.), Elsevier, Amsterdam, pp. 221-278 (1990)] 및 문헌 ["Methods in Enzymology", Colowick, S.P. and Caplan, N.O.(eds.), Academic Press, dealing with immunological detection methods]의 여러 권, 특히 70, 73, 74, 84, 92 및 121 권이다.

상이한 면역분석법들의 원리는, 예를 들면, 문헌 [Hage, D.S., Anal. Chem. 71, 294R-304R (1999)]에 기술되어 있다. 문헌 [Lu, B., et al., Analyst, 121, 29R-32R (1996)]은 면역분석에서 사용하기 위한 항체의 배향된 고정화를 보고하고 있다. 아비딘-비오틴-매개 면역분석은, 예를 들면, 문헌 [Wilchek M. and Bayer, E.A., Methods Enzymol. 184, 467-469 (1990)]에 기술되어 있다.

제 2 단계에서, 크기 분리된 복합체들은 그의 조성을 기준으로 특성화된다, 예를 들면, 항-약물 항체의 존재를 확인하고 항-약물 항체의 특이성을 측정한다. 한 태양에서, 제 2 단계는 하나 이상의 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA)을 포함한다.

일반적으로, ELISA는 포획 분자 및 추적 분자를 포함한다. 포획 분자는 일반적으로 고체상에 고정화/결합된다. 추적 분자는 일반적으로 검출가능한 표지에 접합되며, 이때 상기 검출가능한 표지는 직접적 검출가능 표지 또는 간접적 검출가능 표지일 수 있다.

항-약물 항체의 존재를 측정하기 위해, 상이한 ELISA 포맷을 사용할 수 있다:

- 샌드위치-ELISA:

한 태양에서, 고체상에 접합된 약물은 포획 분자로 사용되고, 검출가능한 표지에 접합된 약물은 추적 분자로 사용된다.

샌드위치-ELISA에서, 항-약물 항체는 그의 2가 구조로 인해 포획 분자와 추적 분자 사이에 가교를 형성한다. 상기 분석 포맷은 또한 가교-ELISA로 지칭될 수 있다.

샌드위치-/가교-ELISA를 이용하여 항-약물 항체를 검출할 수 있다. 그 분자 질량과 상이한(예를 들면, IgG-IgG 복합체에 대한 약 300 kDa와 상이한) 질량 범위를 포함하는 SEC 분획에서 ADA의 검출은 ADA가 더 고분자량 복합체의 일부였음을 시사한다.

- 복합체-유형 ELISA:

한 태양에서, 약물 특이적 항체는 포획 분자로 사용되고, 검출가능한 표지에 접합된 항-종 특이적 항체는 추적 분자로 사용된다.

한 태양에서, 고체상에 접합된 약물은 포획 분자로 사용되고, 검출가능한 표지에 접합된 항-종 특이적 항체는 추적 분자로 사용된다.

한 태양에서, 고체상에 접합된 항-종 특이적 항체는 포획 분자로 사용되고, 검출가능한 표지에 접합된 약물은 추적 분자로 사용된다.

한 태양에서, 고체상에 접합된 항-종 특이적 항체는 포획 분자로 사용되고, 검출가능한 표지에 접합된 약물 특이적 항체는 추적 분자로 사용된다.

복합체-유형 ELISA에서 항-약물 항체-약물 복합체를 검출할 수 있다.

전임상 샘플 분석에서, 약물 특이적 포획 분자 및 항-종 특이적 검출 항체를 사용할 수 있다.

임상 샘플 분석에서, 약물 특이적 포획 분자, 예를 들면, 항-이디오타입(anti-idiotype) 항체 및 항-종 특이적 검출 항체를 사용할 수 있다.

상기 분석은 ADA가 약물에 결합되는지 그렇지 않은지에 대한 정보를 제공한다. 이것은 복합체의 포획(약물 또는 항-약물 항체와의 상호작용을 통해) 및 포획된 복합체의 검출(약물과의 상호작용이 복합체의 포획을 위해 사용된 경우 항-약물 항체와의 특이적 상호작용을 통해, 또는 항-약물 항체가 복합체의 포획을 위해 사용된 경우 약물과의 특이적 상호작용을 통해)을 위해 ADA-D 복합체의 상이한 성분들을 이용함으로써 달성된다.

항-약물 항체는 일반적으로 약물이 투여된 포유동물에 의해 생성된 전장 항체이기 때문에, 항-약물 항체는 포유동물에 특이적인 불변 영역을 포함한다. 그러므로, 종 특이적 항체는 종 특이적 불변 영역의 존재를 이용하는 항-약물 항체의 결합 특이성과 무관하게 항-약물 항체의 특이적 결합(포획 또는 검출)에 사용될 수 있다.

- 직접-유형 ELISA:

한 태양에서, 고체상에 접합된 약물의 내인성 대응물은 포획 분자로 사용되고, 검출가능한 표지에 접합된 항-종 특이적 항체는 추적 분자로 사용된다.

검출을 위해 약물의 고정화된 내인성 대응물 및 항-종 항체를 포함하는 직접-유형 ELISA를 이용하여, 항-약물 항체를 검출할 수 있고, ADA가 약물에 결합하는지 아니면 내인성 대응물에 결합하는지를 규정할 수 있다. 또한, 종 및 아형(subtype) 특이적 항체를 이용하여 항-약물 항체의 항체 이소타입을 결정하는 것이 가능하다.

결과의 평가는 신호 대 크기 매트릭스에 의해 수행된다.

한 태양에서, 샘플은 16 내지 32 시간의 시간동안 포획 분자 및/또는 추적 분자와 함께 배양된다.

가교-유형 ELISA는, 이중 항원 가교 면역분석을 이용하여, 포유동물의 샘플에서 약물(D)과 약물에 대한 항체(항-약물 항체, ADA)의 면역 복합체의 면역학적 측정을 위한 방법이다.

면역 복합체는 또한 ADA-D 복합체로 약칭된다.

한 태양에서, 샘플중 ADA-D 복합체의 면역학적 측정은, 항체들중 하나가 포유동물의 Ig에 특이적으로 결합하는 항체이고 다른 항체가 약물에 특이적으로 결합하는 항체인 것을 특징으로 하는, 포획 항체 및 추적 항체를 포함하는 이중 항원 가교 면역분석을 이용한다.

측정 과정에서, 복합체는 항-포유동물 Ig 항체, ADA-D 복합체 및 항-약물 항체 사이에 생성되고, 생성되는 복합체의 양은 ADA-D 복합체, 약물 및/또는 ADA의 농도와 상관된다.

한 태양에서, 생성된 ADA-D 복합체의 검출을 위한 직접 샘플 분석을 수행할 수 있다. 상기 분석에서, 양성 신호는 샘플이 약물 및 항-약물 항체를 둘 다 함유하는 경우에만 확인된다.

한 태양에서, 샘플 분석은 사전결정된 양의 약물 항체와 함께 샘플을 예비-배양한 후에 수행된다. 상기 분석에서, 양성 신호는 샘플이 샘플중 약물의 존재/부재와 무관하게 항-약물 항체를 함유하는 경우에만 확인된다.

한 태양에서, 그의 접합 상대에 대한 약물의 접합은 N-말단 및/또는 ε-아미노기(라이신), 상이한 라이신들의 ε-아미노기, 약물의 아미노산 주쇄의 카복시-, 설프하이드릴-, 하이드록실- 및/또는 페놀 작용기, 및/또는 약물의 탄수화물 구조의 당 알콜기를 통해 화학적으로 결합함으로써 수행된다.

한 태양에서, 포획 항체 또는 약물은 수동적 흡착에 의해 고체상에 접합되므로, 2개 이상의 상이한 항체 부위에서 고체상에 접합된다. 수동적 흡착은, 예를 들면, 문헌 [Butler, J.E., "Solid Phases in Immunoassay", page 205-225; Diamandis, E.P. and Christopoulos, T.K.(Editors): Immunoassays (1996) Academic Press San Diego]에 기술되어 있다.

한 태양에서, 포획 항체 또는 약물은 특이적 결합 쌍에 의해 고정화된다. 상기 결합 쌍(제 1 성분/제 2 성분)은, 예를 들면, 스트렙타비딘 또는 아비딘/비오틴, 항체/항원(예를 들면, 문헌 [Hermanson, G.T., et al., Bioconjugate Techniques, Academic Press, 1996] 참조), 렉틴/폴리사카라이드, 스테로이드/스테로이드 결합 단백질, 호르몬/호르몬 수용체, 효소/기질, IgG/단백질 A 및/또는 G 등이다. 한 태양에서, 포획 항체 또는 약물은 비오틴에 접합되고, 고정화는 고정화된 아비딘 또는 스트렙타비딘에 의해 수행된다.

한 태양에서, 추적 항체는 검출가능한 표지에 접합된다. 한 태양에서, 추적 항체는 특이적 결합 쌍에 의해 접합된다. 상기 결합 쌍(제 1 성분/제 2 성분)은, 예를 들면, 스트렙타비딘 또는 아비딘/비오틴, 항체/항원(예를 들면, 문헌 [Hermanson, G.T., et al., Bioconjugate Techniques, Academic Press, 1996] 참조), 렉틴/폴리사카라이드, 스테로이드/스테로이드 결합 단백질, 호르몬/호르몬 수용체, 효소/기질, IgG/단백질 A 및/또는 G 등이다. 한 태양에서, 추적 항체는 디곡시제닌 및 디곡시제닌에 대한 항체를 통해 검출가능한 표지에 접합된다. 또는, 추적 항체는 루테늄 비스피리딜 복합체와 같은 전기화학발광 표지에 접합된다.

한 태양에서, 상기 방법은 이중 항원 가교 면역분석을 이용하여 원숭이 종의 샘플에서 약물에 대한 항체(항-약물 항체, ADA)의 면역학적 측정을 위한 것이다.

한 태양에서, 상기 방법은, 포획 분자 또는 추적 분자가 포유동물의 IgG에 특이적으로 결합하는 항체이고 각각의 다른 분자가 약물인 것을 특징으로 하는, 포획 분자 및 추적 분자를 포함하는 이중 항원 가교 면역분석을 이용한 포유동물의 샘플중 ADA의 면역학적 측정을 위한 것이다.

ADA의 면역학적 측정의 한 태양에서, 포획 분자는 약물이고, 추적 분자는 그로부터 샘플이 유도/수득되는 포유동물의 IgG에 특이적으로 결합하는 항-포유동물 IgG 항체이다. ADA의 면역학적 측정의 한 태양에서, 포획 분자는 그로부터 샘플이 유도/수득되는 포유동물의 IgG에 특이적으로 결합하는 항-포유동물 IgG 항체이고, 추적 분자는 약물이다. 측정 과정에서, 약물, ADA 및 항-포유동물 IgG 항체 사이에 복합체가 생성되고, 생성되는 복합체의 양은 ADA의 농도와 상관된다. ADA의 면역학적 측정의 한 태양에서, 항-포유동물 IgG 항체는 단클론성 항체(항-포유동물 IgG mAb)이다.

폴리펩티드, 예를 들면, 약물 폴리펩티드 또는 약물 항체는 많은 반응성 잔기, 예를 들면, 아미노기(라이신, 알파-아미노기), 티올기(시스틴, 시스테인 및 메티오닌), 카복실산기(아스파트산, 글루탐산) 및 당-알콜기를 함유한다. 이들은 표면, 단백질, 중합체(예를 들면, PEG, 셀룰로스 또는 폴리스티롤), 효소 또는 결합쌍의 구성원(예를 들면, 문헌 [Aslam M., and Dent, A., Bioconjuation MacMillan Ref. Ltd., 50-100 (1999)] 참조)과 같은 결합 상대에 대한 커플링에 사용될 수 있다.

폴리펩티드의 가장 통상적인 반응기들 중 하나는 아미노산 라이신의 지방족 ε-아민이다. 일반적으로, 거의 모든 폴리펩티드가 풍부한 라이신을 함유한다. 라이신 아민은 pH 8.0(pKa = 9.18) 이상의 상당히 우수한 친핵체이므로, 다양한 시약들과 용이하고 완전하게 반응하여 안정한 결합을 형성한다. 폴리펩티드중 또 다른 통상적인 반응기는 황-함유 아미노산 시스틴 및 그의 환원 생성물 시스테인(또는 하프 시스틴(half cystine))으로부터의 티올 잔기이다. 시스테인은, 아민보다 더 친핵성이고 일반적으로 단백질에서 가장 반응성인 작용기인 유리 티올기를 함유한다. 티올은 일반적으로 중성 pH에서 반응성이므로, 아민의 존재하에서 다른 분자들에 선택적으로(selectively) 커플링될 수 있다. 유리 설프하이드릴기가 비교적 반응성이므로, 이들 기를 갖는 폴리펩티드는 종종 그 산화된 형태의 상기 기들과 함께 다이설파이드기 또는 다이설파이드 결합으로서 존재한다. 시스틴 및 시스테인 이외에, 일부 폴리펩티드는 또한 티오에터 결합에 황을 함유하는 아미노산 메티오닌을 갖는다. 문헌은 반응성 아미노기를 통해 다중 설프하이드릴기를 도입하는 효율적인 방법을 제공하기 위해 여러 티올화 가교결합 시약, 예를 들면, 트라우트(Traut) 시약(2-이미노티올란), 숙신이미딜(아세틸티오) 아세테이트(SATA) 또는 설포숙신이미딜 6-[3-(2-피리딜다이티오)프로피온아미도] 헥사노에이트(설포-LC-SPDP)의 사용을 보고하고 있다. 반응성 에스터, 특히 N-하이드록시숙신이미드(NHS) 에스터가 아민기의 변형을 위해 가장 보편적으로 사용되는 시약들에 포함된다. 수성 환경에서의 반응에 대한 최적 pH는 pH 8.0 내지 9.0이다. 이소티오시아네이트는 아민-변형 시약이며, 단백질과 티오우레아 결합을 형성한다. 이들은 수용액 중에서(최적으로 pH 9.0 내지 9.5에서) 폴리펩티드 아민과 반응한다. 알데하이드는 약한 수성 조건하에서 지방족 및 방향족 아민, 하이드라진 및 하이드라지드와 반응하여 이민 중간체(쉬프(Schiff) 염기)를 형성한다. 쉬프 염기는 약하거나 강한 환원제(예를 들면, 나트륨 보로하이드라이드 또는 나트륨 시아노보로하이드라이드)에 의해 선택적으로 환원되어 안정한 알킬 아민 결합을 유도할 수 있다. 아민을 변형하기 위해 사용된 다른 시약은 산 무수물이다. 예를 들면, 다이에틸렌트라이아민펜타아세트산 무수물(DTPA)은 2개의 아민-반응성 무수물기를 함유하는 이작용성 킬레이트화제이다. 상기 무수물은 단백질의 N-말단 및 ε-아민기와 반응하여 아미드 결합을 형성할 수 있다. 무수물 고리는 개방되어 배위 착체중의 금속에 강하게 결합할 수 있는 다가, 금속-킬레이트화 팔(arm)을 형성한다.

폴리펩티드중 또 다른 통상적인 반응기는 카복실산(아스파트산, 글루탐산)이다. 폴리펩티드는 C-말단 위치에 및 아스파트산 및 글루탐산의 측쇄내에 카복실산기를 함유한다. 접합을 위해 수용성 카보다이이미드를 사용하여 카복실산기는 통상적으로 반응성 에스터로 전환되고 아민, 하이드라지드 또는 하이드라진과 같은 친핵성 시약과 반응한다. 아민-함유 시약은 폴리펩티드 상의 다른 아민의 존재하에 활성화된 카복실산과 선택적으로 반응하기 위해 약하게 염기성이어야 한다. 폴리펩티드 가교결합은 pH가 8.0 이상으로 상승할 때 발생할 수 있다.

나트륨 퍼요오데이트를 사용하여 탄수화물 잔기내 당의 알콜 부분을 알데하이드로 산화시킬 수 있다. 각각의 알데하이드기는 카복실산에 대해 기술한 바와 같이 아민, 하이드라지드 또는 하이드라진과 반응할 수 있다.

티올-반응 시약은 폴리펩티드 상의 티올기에 커플링되어 티오에터-커플링된 생성물을 생성하는 것들이다. 이들 시약은 약간 산성 내지 중성 pH에서 신속하게 반응하므로, 아민기의 존재하에서 선택적으로 반응할 수 있다. 할로아세틸 유도체, 예를 들면, 요오도아세트아미드는 티오에터 결합을 형성하며, 티올 변형을 위한 시약이다. 반응은 본질적으로 존재하거나 또는 폴리펩티드의 다양한 위치에서 시스틴의 다이설파이드의 환원으로부터 생성되는 시스테인기에서 일어난다. 다른 유용한 시약은 말레이미드이다. 말레이미드와 티올-반응성 시약의 반응은 근본적으로 요오도아세트아미드와 동일하다. 말레이미드는 약간 산성 내지 중성 pH에서 신속하게 반응한다.

아민, 하이드라지드 및 하이드라진은 알데하이드 및 카복실산-반응성 시약이다(아미드, 하이드라존 또는 알킬 아민 결합의 형성). 아민, 하이드라지드 및 하이드라진은 수용성 카보다이이미드에 의한 카복실기의 활성화 후에 폴리펩티드의 카복실산에 커플링될 수 있다. 아민-함유 시약은, 라이신의 보다 더 강한 염기성 ε-아민의 존재하에 카보다이이미드-활성화된 폴리펩티드와 선택적으로 반응하여 안정한 아미드 결합을 형성하도록 약하게 염기성이어야 한다. 폴리펩티드 상의 탄수화물 잔기의 퍼요오데이트 산화에 의해 폴리펩티드 상에서 생성될 수 있는 알데하이드기와의 반응에서, 쉬프 염기 중간체가 생성되고, 상기 중간체는 나트륨 시아노보로하이드라이드(약하고 선택적인) 또는 나트륨 보로하이드라이드(강한) 수용성 환원제에 의한 중간체의 환원을 통해 알킬 아민으로 환원될 수 있다.

도 1에는 약물 ADA-D 복합체 생성에 대한 동역학을 나타내었다(1 mg 약물 및 1 mg ADA). 시간이 증가함에 따라 더 높은 차수의 복합체, 예를 들면, 1:1 약물:ADA-복합체로부터 출발하여 1:2 약물:ADA 복합체를 거쳐 1:3 약물:ADA 복합체(0 분, 50 분, 100 분, 160 분, 200 분 시점)가 생성되는 것을 볼 수 있다. 추가 ADA의 첨가에 의해, 샘플의 조성은 보다 고분자량 복합체로 더 변화되어 단량체 약물 피크를 감소시킬 수 있다(도 2).

도 3에는 본원에 보고된 바와 같은 방법에 의해 수득된 바와 같은 예시적 재구성된 SEC 다이어그램(y-축은 ELISA의 OD이다) 및 ELISA 결과를 나타내었다. 도 4에는 샘플 201의 재구성된 SEC의 확대영상이 나타나 있으며, 여기서 Y-축은 일정하게 유지된다. 이에 의해 샘플 조성에서의 차이를 볼 수 있다.

하기의 약칭들이 본원에서 사용된다:

ABTS 2,2'-아지노-다이-[3-에틸벤즈티아졸린 설포네이트(6)] 다이-암모늄

Ab 항체

ADA 항-약물 항체

Bi 비오틴

CoA 분석 인증서

Conc. 농도

CPP 사이노몰구스 원숭이의 취합 블랭크 혈장

Dil. 희석

ELISA 효소 결합 면역흡착 분석

HRP 고추냉이 퍼옥시다제

mAb 단클론성 항체

MTP 미세적정 플레이트

OD 광학 밀도

PBS 포스페이트 완충 식염수

rpm 분당 회전수

RT 실온(+15 내지 +25 ℃)

RTU 사용 준비

SA 스트렙타비딘

SEC 크기 배제 크로마토그래피

하기의 실시예는 그 진정한 범위를 첨부된 특허청구범위에 나타낸 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공된다. 본 발명의 진의로부터 벗어나지 않고 나타낸 절차들에 수정이 이루어질 수 있는 것으로 이해된다.

실시예 1

사이노몰구스 원숭이 연구 샘플의 분석

사이노몰구스 원숭이 연구로부터 수득된 27개 혈장 샘플을 투여된 약물에 대한 항-약물 항체(ADA)를 함유하는 복합체의 검출을 위해 분석하였다. 또한, 복합체 크기에 대한 평가도 수행하였다.

분석은 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 및 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA)을 포함하는 2-단계 방법을 이용하여 수행하였다.

잠재적 복합체의 크기-의존성 분리는 SEC에 이어 SEC 유출물(1분 분획)의 분획화에 의해 달성되었으며, 이에 의해, 각 분획이 상이한 ELISA에 의해 분석될 수 있으므로 SEC 분석의 다중화가 가능하게 된다. 투여된 약물에 대한 ADA의 검출 및 회수된 분획들중 ADA-D 복합체의 존재에 대한 검출은 2개의 상이한 ELISA에 의해 달성되었다. 하나는 포획을 위한 비오티닐화된 약물 및 항-사이노몰구스 IgG 특이적 검출 항체를 사용함으로써 ADA를 검출하도록 설계되었으며(ADA 분석), 두번째 분석은 약물 특이적 포획 분자 및 항-사이노몰구스 IgG 특이적 검출 항체를 사용함으로써 ADA-D 복합체를 검출하도록 설계되었다.

사이노몰구스 혈장 샘플은 주요 군 및 회수 군 동물로부터 수거하였다. 군 1: 플라시보 군(샘플 01, 02, 03, 04, 05, 06), 군 2: 기본 용량(샘플 07, 08, 09, 10, 11, 12), 군 3: 기본 용량의 2배(샘플 13, 14, 15, 16, 17, 18), 군 4: 기본 용량의 4배(샘플 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27).

분획화 시간의 선택은 크기 정보에 대한 분해능을 결정한다. 분획 크기는 1분이었다. 여러 분획들의 ELISA 결과를 조합하여 정보를 "고, 중간 및 저분자량 분획"으로 압축시켰다.

SEC :

사이노몰구스 혈장 샘플을 약 20,000 내지 약 7,000,000 Da 범위의 분자량을 갖는 바이오스위트(BioSuite) 450, 13 ㎛ SEC 컬럼 상에서 분리하였다. 컬럼의 상부에서 단백질의 바람직하지 않은 침전을 피하기 위해, 사이노몰구스 혈장을 에탄올(이동상의 에탄올 조성에 필적)과 혼합한 후 1분간 원심분리(약 16:1의 사이노몰구스 원숭이 혈장:에탄올(95 중량%) 비, 20,800 rcf에서 1분 원심분리)하였다. 20 ㎕의 샘플을 HPLC 시스템(에이질런트(Agilent) 1100) 내에 주입하였다. UV 흔적은 280 nm의 파장에서 모니터링하였다. 등용매 분리는 이동상으로서 포스페이트-완충 식염수(PBS) 중의 5% 에탄올을 사용하여 수행하였다(25 분동안 0.5 ml/분의 유량 및 그 후에 13 분동안 0.75 ml/분 및 최종 2 분동안 0.5 ml/분).

ELISA에 의한 검출을 가능하게 하기 위해 SEC 분리의 유출물을 분획화하였다. 한 태양에서, 1 분의 분획-시간을 갖는, 9 분(공극 부피)으로부터 21 분까지의 용출 시간을 포함하는 12개의 연속 분획물들을 회수하였다.

각각의 분획에 상응하는 계산된 분자량을 하기 표 1에 나타내었다.

[표 1]

ADA -분석:

보다 고분자량 SEC 분획(IgG/ADA 단량체의 질량과 대등한 150 kDa보다 큰) 중 ADA의 검출은 ADA가 보다 고분자량 복합체의 일부였음을 나타낸다. ADA 검출은 ADA 분석을 이용한 회수된 분획의 분석에 의해 수행된다. 복합체 크기 특성화는 SEC 체류 시간을 근거로 한다. 복합체 조성 특성화는 각각의 분획들중 ADA-D 복합체(ADA-약물 복합체)의 존재에 대한 분석에 의해 달성된다.

ADA 및 ADA-D 복합체의 검출을 위해, 2개의 순차적 ELISA 방법을 수립하였다.

ADA 검출을 위해, SA-MTP의 웰을 1 시간동안 비오티닐화된 약물(D-Bi; c = 1 ㎍/ml)로 코팅하였다. 코팅 용액을 제거한 후, 웰을 0.05% 트윈 20을 함유한 1xPBS로 3회 세척하고, SEC-분획 분취량을 첨가하고 MTP에서 밤새 교반(shaking)하에 배양하였다. 웰을 0.05% 트윈 20을 함유한 1xPBS로 3회 세척한 후, 디곡시제닐화된 항-사이노몰구스 Fc 항체(<Cyno Fc>-Dig, c = 0.1 ㎍/ml)를 첨가하고 교반하에 1 시간동안 배양하였다. 웰을 0.05% 트윈 20을 함유한 1xPBS로 3회 세척한 후, HRP (폴리) Fab 단편(5 mU)에 접합된 항-디곡시제닌 항체를 첨가하고 교반하에 1 시간동안 배양하였다. 웰을 0.05% 트윈 20을 함유한 1xPBS로 3회 세척한 후, ABTS 용액을 첨가하고 발색을 모니터링하였다(측정 파장 405 nm; 기준 파장 490 nm).

ADA-D 복합체 검출을 위해, SA-MTP의 웰을 1 시간동안 교반하에 비오티닐화된 항-약물 항체(<약물>-Bi; c = 2 ㎍/ml)로 코팅하였다. 코팅 용액을 제거한 후, 웰을 0.05% 트윈 20을 함유한 1xPBS로 3회 세척하고, SEC-분획 분취량을 첨가하고 복합체 검출을 위해 MTP에서 1 시간동안 교반하에 배양하였다. 용액을 제거한 후, 웰을 0.05% 트윈 20을 함유한 1xPBS로 3회 세척하고, 디곡시제닐화된 항-사이노몰구스 Fc 항체(<Cyno-Fc>-Dig) 용액을 첨가하고(c = 0.1 ㎍/ml) 교반하에 1 시간동안 배양하였다. 용액을 제거한 후, 웰을 0.05% 트윈 20을 함유한 1xPBS로 3회 세척하고 항-디곡시제닌 항체-HRP 접합체 (폴리) Fab 단편 용액(5 mU)을 첨가하고 교반하에 배양하였다. 웰을 0.05% 트윈 20을 함유한 1xPBS로 3회 세척한 후, ABTS 용액을 첨가하고 발색을 모니터링하였다(측정 파장 405 nm; 기준 파장 490 nm).

그 이상에서 SEC 분획 결과가 ADA(ADA 분석) 또는 ADA-D 복합체(ADA-D 분석)의 존재에 대해 양성으로 규정되는 OD 신호-기준 컷-오프 값을 연구 플라시보 샘플의 분석에 근거하여 규정하였다.

ADA 분석 및 ADA-D 분석에 대한 결과는 하기 표 2에 나타내었다(ELISA 결과는 플라시보 샘플의 분획들에 대한 분석의 OD 값으로서 나열되었다(윗부분: ADA 분석; 아랫부분: ADA-D 분석)).

[표 2]

ADA 분석

ADA -D 분석

상기 데이터를 기준으로, OD≥0.20의 컷-오프 값은 ADA 분석에 대한 것으로, 및 OD≥0.10의 컷-오프 값은 ADA-D 분석에 대한 것으로 규정되며, 이것은 분석된 분획들에서 대략 2배의 평균 블랭크 신호를 나타낸다.

다른 반-정량적 평가의 경우, 하기 표 3에 나타낸 값들이 규정되었다(ADA-분석(좌) 및 ADA-D 분석(우)에 대한 컷-오프 값(OD)).

[표 3]

연구로부터 수득된 27개의 사이노몰구스 원숭이 혈장 샘플들을 투여된 약물에 대한 항-약물 항체(ADA)를 함유하는 복합체의 검출을 위해 분석하였다. 또한, 복합체 크기에 대한 평가도 수행하였다.

분획 1 내지 3의 결과를 조합하고, 고분자량 복합체 분획으로, 분획 4 내지 6은 중간 분자량 복합체 분획으로, 및 분획 7 및 8은 저분자량 복합체 분획으로 나타내었다. 연구 샘플들의 분획들에 대한 분석의 ELISA 결과의 개요를 하기 표에 나타내었다(좌: ADA 분석; 우: ADA-D 분석; 군 1은 플라시보 군이고; 군 2는 기본 용량이고; 군 3은 기본 용량의 2배이고; 군 4는 기본 용량의 4배이다).

[표 4]

[표 5]

상기 표에 나타낸 바와 같은 연구 샘플의 분획들에 대한 분석의 상세한 ELISA 결과를 다음 표에 나타내었다(윗부분: ADA 분석; 아랫부분: ADA-D 분석; 군 1은 플라시보군이고; 군 2는 기본 용량이고; 군 3은 기본 용량의 2배이고; 군 4는 기본 용량의 4배이다).

[표 6]

[표 7]

약물에 대한 ADA는 처리된 동물(군 2 내지 4)의 모든 분석된 샘플에서 검출할 수 있었다. 샘플들 사이의 차이는 신호 강도와 관련해서뿐 아니라 고분자량 분획중 양성과 관련해서 관찰된다. 음성 결과는 하기 샘플들의 특정 분획들에서 관찰되었다: 샘플 7/분획 1; 샘플 23/본획 1-2, 샘플 24/분획 1-4; 샘플 26/분획 1; 샘플 27/분획 1-3.

ADA-D 복합체는 처리된 동물중 2개 샘플(샘플 10, 24)을 제외한 전부에서 검출할 수 있었다. 샘플들 사이의 차이는 신호 강도와 관련해서 관찰된다. 샘플 19 및 샘플 20을 제외하고, 모든 샘플이 고분자량 분획(분획 1 내지 3)에서 음성 결과를 나타내었다.

실시예 2

SEC - ELISA 분석과 약동학의 상관화

5개의 사이노몰구스 혈장 샘플을 투약전 및 하기 시점, 9일, 13일, 21일, 23일(모든 샘플) 및 63일(동물 2004, 2005, 3002, 3105)에 회수하고, 투여된 약물에 대한 항-약물 항체(ADA)를 함유하는 복합체 검출에 대해 분석하였다. 또한, 투여된 약물의 관찰된 약동학과 함께 복합체 크기에 대한 평가를 수행하였다.

분석은 실시예 1에서 보고된 바와 같이 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 및 효소 결합 면역흡착 분석을 포함하는 2-단계 방법(ADA-D 분석 및 ADA 분석)을 이용하여 수행하였다. 투여된 약물의 약동학과의 상관화를 위해, ADA-D 분석의 결과만을 이용하였다.

사이노몰구스 혈장 샘플을 100 mg/kg의 약물을 투약받은 5마리 사이노몰구스로부터 회수하였다.

혈장 분석으로부터, 사이노몰구스 번호 2001, 2002 및 2004에서 사이노몰구스 번호 2003 및 2005에 비해 더 신속한 혈청 제거를 관찰할 수 있었음을 볼 수 있다(도 5 참조).

SEC 분리의 유출물을 9분(공극 부피)에서 21분까지의 용출 시간을 포함하는, 1분의 분획-시간하에 분획화시켰다. 각각의 분획에 상응하는 계산된 분자량은 상기 실시예 1에 기술된 바와 같이 이용된다.

그 이상에서 SEC 분획 결과가 ADA(ADA 분석) 또는 ADA-D 복합체(ADA-D 분석)의 존재에 대해 양성으로 규정되는 OD 신호-기준 컷-오프 값을 연구 동물들의 투약전 샘플의 분석에 근거하여 규정하였다.

ADA 분석 및 ADA-D 분석에 대한 결과는 하기 표에 나타내었다(ELISA 결과는 플라시보 샘플의 분획들에 대한 분석의 OD 값으로서 나열되었다(윗부분: ADA 분석; 아랫부분: ADA-D 분석)). 하기 표에서, d는 "일"(day)을 나타낸다.

[표 8]

[표 9]

도 5로부터, 동물 2001, 2002 및 2004의 경우에 증가된 제거율이 관찰됨을 볼 수 있다. 이들 동물들의 경우, ADA-D 분석의 수득된 OD 합(사전투약 없는 모든 날 및 제 63 일) 신호는 11.9(동물 2001), 8.7(동물 2002) 및 10.3(동물 2004)이었다. 이들 신호는 증가된 제거율을 나타내지 않은 6.7(동물 2003) 및 5.9(동물 2004)의 신호 이상임이 분명하다. 따라서, ADA-약물 복합체의 양의 증가는 더 빠른 혈장 제거를 시사한다.

실시예 3

SEC - ELISA 분석과 IgG 사구체 침착 결과의 상관화

21일(t=21d) 및 23일(t=23d) 및 각각의 투약 군(군 A 및 군 B)에서의 각각의 분석(ADA-분석 및 ADA-D-분석)의 경우, 체류 시간 블록 9분에서 12분까지(블록 1), 12분에서 15분까지(블록 2) 및 15분에서 17분까지(블록 3)의 분획들의 신호를 요약하였다(ADA-D-분석 및 ADA-분석에 대한 하기 표 참조).

[표 10]

[표 11]

시점 t=23d에서 수득된 합산된 신호를 t=23d에서의 신호의 손실 또는 상승을 나타내기 위해 시점 t=21d에서 수득된 신호로 나눈다("지수 1").

[표 12]

ADA-D-분석의 "지수 1" 값을 ADA-분석의 "지수 1" 값으로 나누어서 "지수 2" 값을 수득한다. 블록 1에서 높은 "지수 2" 값(예를 들면, 2 또는 3 이상)은 동물에서 사구체 침착을 나타낸다.

[표 13]

또한, 각 투약군 및 블록의 "지수 2" 값은 F-검정 및 T-검정(알파 5%)으로 통계학적으로 검정하여 군들의 블록 1 내지 블록 3의 값/평균이 다른지 아닌지를 구분하였다.

[표 14]

지수 2의 평균

사구체 침착 데이터는, 동물에서 확인된 사구체 침착물의 반-정량적 구별하에 약간 가시적인 사구체 침착에 대한 "(+)" 내지 양성 샘플에 대한 "+" 및 "++"까지에 비해 침착이 없는 경우에 대해 "-"로 등급을 평가하였다.

[표 15]

사구체 침착

상기 표에 열거된 결과는 동물의 사구체 침착에 대한 SEC 분리된 면역 복합체의 상관성을 보여준다. 블록 1에서의 높은 값은 동물에서의 사구체 침착을 나타낸다. 군 A의 모든 동물은 "-" 및 "(+)"로 평가되었고, 군 B의 모든 동물은 "+" 및 "++"로 평가되었다. 상기 군들의 평균 값은 통계학적으로 상이하였다.

"사구체 침착" 표에서 보이는 바와 같이, IgG 사구체 침착 결과 사이에 반-정량적 구별이 보다 현저한 침착을 나타내는 동물 3003 및 3004에서 관찰되었다.

ADA-약물 분석 및 ADA-분석에 대한 표에서 보이듯이, 블록 1에서 신호의 합은 사구체 침착 결과와 반비례한다(또한 도 6 참조).

Claims

a) 면역 복합체의 중량/크기를 측정하기 위해, 약물이 1회 이상 투여된 포유동물로부터 수득된 샘플의 크기 배제 크로마토그래피를 수행하여 용출액을 분획들로 회수하는 단계, 및
c) 상기 분획들 각각을, 항-약물 항체를 검출하기 위한 하나 이상의 불균일 면역분석에서 분석하는 단계
를 포함하는, (외인성) 치료용 폴리펩티드 및 생체내에서 생성된 내인성 항-약물 항체를 포함하는 순환 복합체화 항-약물 항체를 측정하는 방법으로서,
상기 면역 복합체가 면역 복합체 크기와 면역분석 판독물/결과의 상관화에 의해 특성화되고, 상기 치료용 폴리펩티드가 합성 또는 비-천연 치료용 폴리펩티드인, 방법.
제 1 항에 있어서,
샘플이 혈청 또는 뇌척수액인 것을 특징으로 하는 방법.
삭제
제 1 항에 있어서,
크기 배제 크로마토그래피의 분획들중 하나 이상이 용출액을 분획들로 회수하는 제 2의 비-크기 배제 크로마토그래피에 의해 추가로 분리되는 것을 특징으로 하는 방법.
삭제
제 1 항에 있어서,
면역분석이 항-약물 항체 면역분석인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서,
면역분석들 중 하나 이상이 가교 효소 결합 면역흡착 분석인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서,
면역분석들 중 하나 이상이 ADA-D 복합체의 검출을 위한 복합체 분석인 것을 특징으로 하는 방법.
제 8 항에 있어서,
복합체 분석이 약물 특이적 포획 항체, 및 검출 항체로서 항-종 특이적 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서,
면역분석들 중 하나 이상이 약물에 및/또는 약물의 내인성 대응물에 결합되는 항-약물 항체의 검출을 위한 직접 분석인 것을 특징으로 하는 방법.
제 10 항에 있어서,
직접 분석이 포획 분자로서 고정화 약물 또는 약물의 내인성 대응물, 및 검출 항체로서 항-종 특이적 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항, 제 2 항, 제 4 항 및 제 6 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 기재된 순환 복합체화 항-약물 항체의 측정 방법을 사용함으로써, 변화된 약동학에 대한 면역 복합체 특성을 상관화하는 방법.
제 1 항, 제 2 항, 제 4 항 및 제 6 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 기재된 순환 복합체화 항-약물 항체의 측정 방법을 사용함으로써, 약물의 효능 감소를 측정하는 방법.
제 1 항, 제 2 항, 제 4 항 및 제 6 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 기재된 순환 복합체화 항-약물 항체의 측정 방법을 사용함으로써, 약물의 천연 대응물의 중화를 측정하는 방법.
제 1 항, 제 2 항, 제 4 항 및 제 6 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 기재된 순환 복합체화 항-약물 항체의 측정 방법을 사용함으로써, 약물에 대한 면역 및 과민 반응을 측정하는 방법.
제 15 항에 있어서,
면역 및 과민 반응이 혈청병/3형 과민 반응/면역 복합체-매개 질환인 것을 특징으로 하는 방법.