JP3053112B2 - 粒子濃縮と化学発光検出を利用する改良発光検定のための方法ならびに装置 - Google Patents
粒子濃縮と化学発光検出を利用する改良発光検定のための方法ならびに装置Info
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Description
ey等の特許出願連続第07/652,427号と一部継続するもの
であり、そして後者は1990年6月18日に出願された特許
出願第07/539,389号と一部継続し、更に後者は現在では
放棄された電気化学発光検定法と題する1988年11月3日
出願の特許出願連続第07/266,882号の継続であり、更に
この特許出願は同時出願中の1990年6月18日に出願され
た特許出願連続第07/539,389号の一部継続であり、そし
て後者は現在では放棄された電気化学発光検定法と題す
る1988年11月3日出願の特許出願連続第07/266,882号の
継続である。この特許出願明細書の主題事項は参照によ
り本明細書中に取り入れられている。
装置に関し、更に詳しく言えば、検定系の一つ以上の標
識された成分により放出される発光を測定することによ
り対象とする被検物質の存在を測定する方法および装置
に関するものである。更に詳しく言えば、本発明は電気
化学発光を起こさせる前に、発光成分を検定組成物中に
濃縮し、収集するという、精密で再現性のある正確な均
質または不均質な特異的結合検定法に関する。
の検出と定量のための多数の方法ならびに装置が開発さ
れて来た。痕跡量の微生物、医薬品、ホルモン、ウイル
ス、抗体、核酸および他のタンパク質を測定することの
できる方法および装置は研究者および臨床医にとって非
常に貴重である。
ハイブリッド形成技術、およびタンパク質−配位子系に
基づいた非常に実質のある技術の実体が開発されて来
た。多くの生化学的および生物学的結合系における高度
の特異性は、研究と診断に価値の高い多くの検定法およ
び装置へと導いた。典型的な場合では、1種以上の結合
物質に付けられた観察しうる「標識」の有無により対象
となる被検物質の存在が示される。光化学的、化学的お
よび電気化学的手段により発光させることのできる標識
が特に関心をもたれている。「ホトルミネセンス」は物
質が電磁放射線を吸収するとき発光をひき起こす過程で
ある。蛍光とりん光はホトルミネセンスのタイプであ
る。「化学発光」の過程は化学的エネルギー移動により
発光種の生成を必然的に伴う。「電気化学発光」は電気
化学的に発光種を生成する必要がある。
識した反応体と混合する化学発光検定技術が開発され
た。反応性混合物をインキュベーションすると、標識さ
れた反応体の若干部分は被検物質に結合する。インキュ
ベーション後、混合物の結合部分と非結合部分とに分け
る。いずれかの部分または両方の部分の中の標識の濃度
は化学発光技術により定量できる。一方または両方のフ
ラクションに測定された化学発光の強度はその生物学的
試料中の対象とする被検物質の量を示す。
ボルタンメトリー作用電極に暴露することができる。適
切な化学的環境においては、ある特別な時間と特別な方
法で作用電極に加えられた電圧によりこのような電気化
学発光がひき起こされる。標識により発生した光を測定
すると、これは被検物質の存在あるいは量を示す。この
ような電気化学発光技術の更に詳しい説明を求めるに
は、PCT公開出願第US85/01253号(WO86/02734)明細
書、PCT公開出願第US87/00987号明細書、およびPCT公開
出願第US88/03947号明細書が参考になる。上記出願の開
示は参照により取り入れてある。
光検定を実行しうることおよび被検物質の様々な濃度に
おいて精密かつ高感度な測定をなしうるように信号変調
を最大にすることが望ましい。
7号および欧州特許出願第0,030,087号明細書に記載のよ
うな方法があり、これらは導管中で粒子を磁気的に分離
した後粒子を別個のチャンバーに移して標識の分析に共
する方法に関する。
させた微粒子状物質を用いて検定試料の1種以上の結合
性成分を捕捉する方法である。
よび比濁分析法を用いて臨床的に関係のあるタンパク質
およびペプチドを検出し定量する方法に関する。開示さ
れた方法は、光散乱または吸着の機能を果たすラテック
ス粒子に抗原あるいは抗体を固定するものである。
る粒状試薬を使用する技術に関する。その殻は生物学的
興味のある化合物を共有結合させることのできる官能基
を含み、そして核部の高い屈折率は光散乱測定に対して
高感度をもたらす。この技術は、2価抗体を対象とする
多価抗原とから集合体を生ずる反応の結果起こる凝集現
象に基づくもので、この集合体は種々の方法で検出しそ
して(または)測定することができる。
び免疫原といった免疫化学物質の存在を検知するために
役立つ着色ラテックス凝集試験法の使用に関する。
に微粒子状物質を使用することが可能であるとは思われ
ないであろう。誰もが遊離の化学発光部分から生じた発
光が吸収され、散乱され、あるいは他の仕方で微粒子状
物質による妨害を受ける筈であろうと予想する。
細書(PCT公開出願US第89/04919号明細書)は、検定系
の結合性反応体の一つに不活性な微粒子状物質を特異的
に結合させた、発光現象に基づく感度の良い特異的結合
検定法を教示している。この検定法は不均質な(一つ以
上の分離工程を含む)検定形態で実行できるが、均質な
(非分離)検定形態で用いる方が最も有利であるかも知
れない。
ための結合反応に基づく検定法に供する組成物に関し、
前記組成物は検定混合物の一成分に結合しうる表面をも
つ多数の懸濁粒子を含んでいる。別の面でこの特許願
は、試料中の対象とする被検物質を検出あるいは定量す
るための方式に向けられており、この方式はその発明に
係る検定組成物を使用して検定法を行なうことができる
ものである。この方式は検定媒質中の標識化合物に発光
を誘発させる手段およびその発光を測定して試料中の対
象とする被検物質の存在を検知する手段を含んでいる。
の対象とする被検物質の検定法に関するもので、その方
法は(1)(イ)対象とする被検物質を含むことが予想
される試料、(ロ)(i)対象とする被検物質あるいは
対象とする被検物質の類縁体、(ii)対象とする被検物
質あるいはその前記類縁体の結合相手、および(iii)
(i)または(ii)と結合することのできる反応性成分
(前記物質の一つは発光を誘発しうる化学部分を有する
標識化合物に結合される)からなる群から選ばれる検定
実行物質、および(ハ)被検物質および(または)
(ロ)の(i),(ii),または(iii)で定義された
物質と特異的に結合することのできる多数の懸濁した粒
子からなる組成物をつくり、(2)該組成物をインキュ
ベーションして粒子および前記標識化合物を含む複合体
をつくり、(3)標識化合物を発光させるよう誘発し、
そして(4)組成物により誘発された発光を測定して試
料中の対象とする被検物質の存在を検知する、という諸
工程を含む。これらの同じ方法を用いて検定組成物の発
光を、既知量の被検物質を含む組成物の発光と比較する
ことにより、試料中の被検物質の量を定量できる。
合成物質のこともあり、被検物質に匹敵する結合性を有
する化合物であるが、もっと高い結合能力あるいは低い
結合能力をもつ化合物も包含する。本発明への使用に適
した結合相手は公知である。例は抗体、酵素、核酸、レ
クチン、補因子および受容体である。被検物質またはそ
の類縁体とおよび(または)その結合相手と結合するこ
とのできる反応性成分は第二の抗体のこともあれば、あ
るいはタンパク質、例えばプロテインAまたはプロテイ
ンGのこともあり、あるいはアビジンまたはビオチンま
たは結合反応に入ることのできるこの分野で公知の他の
成分のこともある。
ようが結合していまいが)をボルタンメトリー作用電極
に暴露することによりひき起こされた電気化学発光(EC
L)から生ずるのが有利である。ECL反応混合物は、光を
発生させるために特別な時間と特別な仕方で作用電極に
加えられる電圧により、調節下に発光を誘発させる。可
視光線の放出は有利な特徴であるが、本組成物あるいは
方式は他の型の電磁放射線、例えば赤外または紫外光
線、X−線、マイクロウエーブなどを放出できる。「電
気化学発光」、「電気化学発光性の」、「発光」、「発
光性の」、および「発光する」という用語の使用は光お
よび他の形の電磁放射線の放出を包含する。
は、研究および臨床の環境の中で実行される種々の検定
において、極端に少量の被検物質の検出および定量を可
能にしている。しかし、研究者および臨床医の要求は、
これら検定法の感度を増加させるためにそして検定法を
実行しうる速さを増すために、これらの方法によって実
行される検定の検出限界を下げることを緊急の問題とし
ているのである。
に、それを濃縮することにより増強する種々の方法がこ
の分野で知られている。例えば、米国特許第4,652,333
号明細書によると、蛍光、りん光あるいは原子蛍光標識
で標識された粒子を、測定段階の実行前にミクロ濾過に
より濃縮している。
に吸い出すことにより、標識された免疫化学種を測定段
階に先立ち濃縮することもこの分野で公知である。例え
ば、米国特許第4,731,337号、第4,777,145号、および第
4,115,535号明細書によると、このような粒子を容器壁
に引き寄せ、次に照射してフルオロホア発光を励起す
る。
電極上に濃縮している。標識された化学的媒介物質によ
り促進された電極で電気化学的反応が起こる。免疫化学
的結合反応が媒介物質の効果を変化させる結果結合が起
こるときに変調信号を生ずる。
ための均質(非分離)および不均質(分離)法、試薬お
よび装置を提供することにある。
組成物から放出される電気化学発光の測定に基づく、非
分離、特異的結合検定法、試薬および装置を提供するこ
とにある。
も感度が向上し、検定時間が速く、感度が高く、検出限
界が低く、そして正確さが大きい検定法、試薬、および
装置を提供することにある。
原因となるエネルギーが、活発な化学反応から導かれる
発光反応として定義される。このように化学発光反応は
化学エネルギーから電磁放射線(紫外線、可視光線、ま
たは赤外線)への直接変換である。励起状態の分子がそ
の基底状態のエネルギー準位に戻るとき発光が起こり、
特定波長の光子を放出し、そしてこの波長はその分子お
よび基底状態と比較したその励起状態のエネルギーに特
徴的なものである。
な反応は発熱反応と呼ばれる。大抵の場合、そのエネル
ギーは熱として現われ、分子における振動、回転、およ
び並進のエネルギーを誘発する。化学発光反応におい
て、このエネルギーの少なくとも一部は高エネルギー励
起状態の生成に使われる。これは一般に2分子の極めて
活発な迅速な反応を要求し、分子の一方は光を放出する
ことができる: A+B→C*+D C*→C+Hν 量Hνは電磁放出線の光子を表わす。hはプランク定
数であり、νは放出された光の振動数である。
の電子エネルギーは別の分子に移動し、 C*+E→C+E* 次に後者は電磁放出線の光子を放出することによってそ
の基底状態まで減衰する。
疫検定は、結合する相手の一つに付いた標識として反応
体の一方を使用している。このような検定法において、
反応体は一般に標識および誘発物質と呼ばれ、次式に従
って反応する: 標識+誘発物質→標識*+副生成物 標識*→副生成物+hν 特異的結合検定法に使用されて来た化学発光標識の例
にはアクリジニウムエステル、ルミノール、イソルミナ
ール、シュウ酸エステル、ジオキセタン、およびルシフ
ェリンが含まれる。多くの場合、この誘発物質分子は過
酸化水素のような酸化剤であり、標識を高エネルギー反
応で酸化することができ、そして標識の励起状態を発生
させることができる。
促進物質分子を化学発光反応に使用する。このような分
子は一般に反応の反応速度を遅くし、光放出の量子収率
を増加させる。
のも実証されている。これらの場合、酵素は誘発物質溶
液の存在下で化学発光反応を触媒する。一例は、過酸化
水素と水酸化物イオンの存在下で、ルミノールの化学発
光反応を触媒するための酵素セイヨーワサビ ペルオキ
シダーゼの使用である。
物」、および「標識物質」は互換性をもって使用してい
る。「化学発光性部分」、「標識化合物」、「標識物
質」、および「標識」と呼ぶ化学種を、被検物質または
その類縁体、被検物質またはその類縁体の結合相手、な
らびに上記のこのような結合相手のそれ以外の結合相
手、あるいは被検物質、その類縁体あるいは上記の結合
相手と結合することのできる反応性成分といった分子に
結合させることは本発明の範囲内にある。上記化学種は
1種以上の結合相手および(または)1種以上の反応性
成分のコンビネーションにも結合させることができる。
更にまた、上記種は結合相手に固定された被検物質また
はその類縁体、反応性成分、あるいは1種以上の結合相
手および(または)1種以上の反応性成分のコンビネー
ションに結合させることもできる。多数の上記種につい
て被検物質またはその類縁体に直接、あるいは前述した
ような他の分子を介して結合させることも本発明の範囲
内にある。簡潔のため、これら配位子を検定実行物質と
呼ぶ。
は標準組成物の調整および校正を必要とすることがある
のは当然である。
の複合体の濃縮および、例えば、フローセル表面での複
合体の収集を記述するため互換性をもって使用すること
がある。
されていようがいまいが、標識が発光するように前記標
識を誘発しうる誘発物質へ暴露することにより誘導され
た化学発光から起こるのが有利である。誘発物質は標識
が酸化されて発光するように前記標識を酸化しうる酸化
剤であるのがよい。化学発光性の反応性混合物は、特別
な時間と特別な仕方で発光するよう調節下に誘発して光
を発生させる。可視光線の放出が有利な特徴であるが、
本組成物あるいは方式は他の型の電磁放射線、例えば赤
外線または紫外線、X−線、マイクロウエーブなどを発
することもある。「化学発光」および「化学発光性」と
いう用語の使用は光および他の形の電磁放射線の放出を
含む。
分離検定法を実行をするための永久磁石を含むセルの概
略図である。
およびプライマーとしてビオチン化学発光性の標識をし
たオリゴヌクレオチドを使用する直接導入PCRK形態の概
略表示である。
せるためのビオチニル化プライマーを使用する標準PCR
構成の概略表示である。
後からハイブリッド形成するための一本鎖ビオチニル化
DNAを発生させる非対称PRC検定形態の概略表示である。
石を使用する沈降検定セルの概略表示である。
域付近の力線の概略表示である。
フローセルの概略表示である。
び分離検定法を実行するための永久磁石を含むセルのも
う1つの概略図である。
置の簡略図である。
を行なうのに使用する検定セルの概略表示である。
在する対象とする被検物質の結合検定法を実行する方法
にある。以下の工程が含まれる: (イ)(i)前記試料、 (ii)誘発されたとき化学発光しうる標識化合物
に結合された成分を含む検定実行物質、および (iii)被検物質および(または)前記検定実行
物質と特異的に結合することのできる複数の粒子 を含む組成物をつくり、 (ロ)前記組成物をインキュベーションして粒子および
前記標識化合物を含む複合体をつくり、 (ハ)前記複合体を収集域に集め、 (ニ)前記標識が発光するように前記標識を誘発するこ
とのできる誘発物質を前記収集域中に導入し、そして (ホ)放出された発光を測定して試料中の対象とする被
検物質の存在を測定する。
発光するように標識を酸化しうる酸化剤であるのがよ
い。また粒子は磁気的応答性があり、復合体を磁気的に
収集域に集めるのがよい。
子は、標識を酸化しうる酸化剤に前駆物質を変換する酸
素を含み、そして誘発物質がその前駆物質である。
うる表面上に集めることにより実施されるが、本発明は
また複合体を測定域に集め、その後光を誘発しかつそれ
を測定する手段を該域に講じるかまたは他の工程を設け
る方法も包含する。
降、濾過、遠心、および複合体の一部を形成する磁気応
答性粒子の磁性吸引、により行なうことができる。幾つ
かの具体例を下に更に詳しく説明する。
続式検定法もフローセルで実行できる。フローセルにお
いては、固体相が測定セル内に留まる一方、溶液はセル
の出口を通って流れる。もし固体相(例えば、粒子)が
水より悪い、即ち水の密度より大きい密度(1.0g/mlよ
り大)をもつなら、粒子にかかる重力は粒子をセルの底
部に降下させることになる。セルは粒子が底に沈降し、
流体はセルを通って流れるように構成することができ、
あるいはセルは収集域の上の円柱形の区分のセル内に試
料の大部分が含まれるように構成することもできる。化
学発光を誘発する前に粒子を収集域に沈降させるために
は、セル内に十分な滞留時間を設けねばならない。
定組成物の残りの部分より大きい密度をもつ)を含む検
定組成物を遠心にかけて粒子を測定域に移し、ここでそ
の後粒子を例えば誘発物質と接触させて化学発光をひき
起こさせる。
速に回転させる手段を測定セルに設ける。試料中の粒子
は遠心力により試料封入容器の回転軸から外側に向かっ
て動き、試料封入容器の外面に集められる。
より除くことができる。この具体例によると、粒子は検
定組成物の粒子以外の部分より大きい密度を有する必要
がない。溶液を濾過器に通して吸引する、例えばポンプ
送りする、ことにより粒子を溶液から分離し、濾過器の
表面上に粒子を集めることにより濃縮する。
性であり、例えばそれらは常磁性あるいは強磁性であ
り、粒子に対して磁場をかけることにより測定域に集め
られる。測定セルは磁石を具えている。粒子がバッチセ
ル内に留まるとき、あるいはフローセル中を粒子が流れ
るとき、磁石の磁場で粒子に力がかかり、粒子は溶液の
大部分から分離して磁石に最も接近したセルの表面上に
行く。
より、結合検定法に対して幾つかの異なる不均質および
均質の形態を実行することができる。不均質結合検定に
おいては、標識からの発光の測定前に複合体を組成物か
ら分離する。均質検定においては、結合(固体相へ)お
よび非結合標識試薬の分離を行なわない。
合、標識からの測定される信号は、濃縮工程が存在しな
い場合よりはるかに大きい。複合体を形成していない標
識された試薬からの信号は反対に変化しない。このた
め、測定セル中に複合体未形成の標識された試薬が存在
するにも拘らず、収集された複合体からの信号は複合体
を収集しない検定法におけるよりも強い。この収集手順
の結果として、結合検定法に対する検出限界がはるかに
改善される。
順の中に原位置分離工程が含まれる。検定組成物、即ち
試料、検定実行物質および粒子を測定セル中にポンプ送
りし、複合体を収集域に集めた後、標識あるいは標識さ
れた試薬を含まない第二の液体をセル中にポンプ送りす
ることによって、検定組成物の未結合成分から複合体を
原位置洗浄あるいは分離することができる。この検定手
順は技術的には不均質結合検定法である。しかし、測定
セル内での分離実行能力は、追加分離装置を必要とせ
ず、かつこの手順の方が一般に外部分離法よりもはるか
に早いという点で有利である。
検定組成物の成分を混合し、それらを所定の時間反応さ
せることにより行なわれる。次に検定組成物を粒子に暴
露する。次に複合体または溶液いずれかからの化学発光
を測定する。濃縮工程後の複合体からの化学発光を測定
すると、濃縮せずに可能とされるよりも高い正確さと低
検出限界をもって被検物質を測定できる。
する対象とする被検物質の結合検定を実行する方法にあ
る。それには次の工程が含まれる: (イ)(i)前記試料、 (ii)誘発されたとき化学発光しうる標識化合物
に結合された成分を含む検定実行物質、および (iii)被検物質および(または)前記検定実行
物質と特異的に結合することのできる複数の粒子 を含む組成物をつくり、 (ロ)前記組成物をインキュベーションして粒子および
前記の標識された成分を含む複合体を形成せしめ、 (ハ)前記複合体を電極表面に集め、 (ニ)標識化合物を誘発物質と接触させることによりそ
の発光を誘発し、前記誘発物質は電気化学エネルギーの
導入時に、例えば電極に電圧を印加することにより、前
駆物質分子を変換させることにより原位置で形成させ、
そして (ホ)放出された発光を測定して試料中の対象とする被
検物質の存在を測定する。
ば標識が酸化されて化学発光するように標識を酸化する
ことのできる酸化剤を収集域中に導入することにより、
励起させ、化学発光を誘発することができる。本発明に
よると、この酸化剤は前駆物質分子の変換によりその場
で形成される。試料を含む組成物は前駆物質分子を含む
こともでき、あるいは前駆物質分子を、インキュベーシ
ョンの前後いずれかで、しかし磁気的収集の前に、ある
いはインキュベーションした複合体を磁気的に集めた後
で、導入することができる。
物質の結合検定を実行する方法に関し、そして本法は、 (イ)(i)前記試料、 (ii)酸化時に化学発光しうる標識化合物へ結合
された成分を含む検定実行物質、 (iii)被検物質および(または)前記検定物質
と特異的に結合することのできる複数の被覆磁性粒子、
および (iv)前記標識を酸化しうる酸化剤へ電気化学的
に変換されうる分子 を含む組成物をつくり、 (ロ)前記組成物をインキュベーションして粒子と前記
標識化合物を含む複合体をつくり、 (ハ)前記複合体を電極表面に磁気的に集め、 (ニ)前記標識が酸化され、発光するように前記電極に
電圧を加えることにより前記分子を前記酸化剤に変換
し、そして (ホ)放出された発光を測定して試料中の対象被検物質
の存在を測定する という諸工程を含む。
定法を実行する方法に関するものであり、そして本法
は、 (イ)(i)前記試料、 (ii)酸化時に化学発光しうる標識化合物へ結合
された成分を含む検定実行物質、および (iii)被検物質および(または)前記検定実行
物質と特異的に結合することのできる複数の被覆磁性粒
子 を含む組成物をつくり、 (ロ)前記組成物へ、前記標識を酸化しうる酸化剤に電
気化学的に変換されうる分子を導入し、 (ハ)前記組成物をインキュベーションして粒子と前期
標識化合物を含む複合体をつくり、 (ニ)前記複合体を電極表面に磁気的に収集し、 (ホ)前記標識が酸化されて発光するように、前期電極
に電圧を加えることにより前期分子を前記酸化剤に変換
し、そして (ヘ)放出された発光を測定して試料中の対象とする被
検物質の存在を測定する という諸工程を含む。
定法を実行する方法に関するものであり、そして本法
は、 (イ)(i)前記試料、 (ii)酸化時に化学発光しうる標識化合物へ結合
された成分を含む検定実行物質、および (iii)被検物質および(または)前記検定実行
物質と特異的に結合することのできる複数の被覆磁性粒
子 を含む組成物をつくり、 (ロ)前記組成物をインキュベーションして粒子と前期
標識化合物を含む複数体をつくり、 (ハ)前記組成物へ、前記標識を酸化しうる酸化剤に電
気化学的に変換されうる分子を導入し、 (ニ)前記複合体を電極表面に磁気的に集め、 (ホ)前記標識が酸化されて発光するように、前記電極
に電圧を加えることにより前記分子を前記酸化剤へ変換
し、そして (へ)放出された発光を測定して試料中の対象とする被
検物質の存在を測定する という諸工程を含む。
合検定法を実行する方法にも関するものであり、そして
本法は (イ)(i)前記試料、 (ii)酸化時に化学発光しうる標識化合物に結合
された成分を含む検定実行物質、および (iii)被検物質および(または)前記検定実行
物質と特異的に結合することのできる複数被覆の磁性粒
子 を含む組成物をつくり、 (ロ)前記組成物をインキュベーションして粒子と前記
標識化合物を含む複合体をつくり、 (ハ)前記複合体を電極表面に磁気的に集め、 (ニ)前記組成物へ、前記標識を酸化しうる酸化剤へ電
気化学的に変換されうる分子を導入し、 (ホ)前記標識が酸化されて発光するように、前記電極
に電圧を加えることにより前記分子を前記酸化剤へ変換
し、そして (ヘ)放出された発光を測定して試料中の対象とする被
検物質の存在を測定する という諸工程を含む。
性であり、例えばそれらが常磁性のこともあれば強磁性
のこともあり、そして測定域に、あるいはなるべくは直
接電極表面に、粒子に対して磁場をかけることによって
収集する。測定セルは磁石を具えている。粒子がバッチ
セル中に留まっているとき、あるいはそれらがフローセ
ル中を流れているとき、磁石の磁場から粒子に力がかか
ると、粒子は溶液の大部分から分離して磁石に最も接近
したセルの表面に行く。もし磁石が適当な配向で、化学
発光検出系の作用電極に接近して置かれると、粒子は作
用電極の表面に集中するであろう。
特に適当な具体例についての次の説明から一層明瞭に詳
しく理解されるであろう。
用しうる。これらの反応は、例えば抗原−抗体、配位子
受容体、DNAとRNAの相互作用、および他の公知の反応を
包含する。本発明は多成分試料中の対象とするこのよう
な被検物質の存在を定性的および定量的に検出するため
の種々の方法および検定法に関する。
懸濁系、液体あるいは気体の形にあるかもしれず、例え
ば細胞および細胞由来の生成物、水、食品、血液、血
清、毛髪、汗、尿、便、組織、唾液、油類、有機溶媒あ
るいは空気から誘導されることもある。試料は、更に例
えれば、水、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、
ジメチルホルムアミド、N−メチル−ピロリドンまたは
アルコール類またはその混合物を含むこともある。
原、細胞下粒子、ウイルス、プリオン、ウイロイド、抗
体、抗原、ハプテン、脂肪酸、核酸、タンパク質、リポ
タンパク質、多糖類、リポ多糖類、糖タンパク質、ペプ
チド、ポリペプチド、細胞代謝物、ホルモン、薬理作用
物質、合成有機分子、有機金属分子、トランキライザ
ー、バルビツール酸塩、アルカロイド、ステロイド、ビ
タミン、アミノ酸、糖、レクチン、組み換えあるいは誘
導タンパク質、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジ
ン、あるいは試料中に存在する無機分子である。典型的
には、対象とする被検物質は10-3モル以下、例えば10
-12モル以下といった少量で存在する。
質は(i)前に定義された対象とする添加された被検物
質またはその類縁体、(ii)対象とする被検物質または
その前記類縁体の結合相手、および(iii)(i)また
は(ii)と結合することのできる、前に定義された反応
性成分(前記物質の一つは化合物あるいは部分、例えば
発光するように誘発されうる化学発光性部分、に結合さ
れる)からなる群から選ばれる少なくとも1種の物質を
含む。標識された物質は全細胞または表面抗原、細胞下
粒子、ウイルス、プリオン、ウイロイド、抗体、抗原、
ハプテン、脂質、脂肪酸、核酸、多糖類、タンパク質、
リポタンパク質、リポ多糖類、糖タンパク質、ペプチ
ド、ポリペプチド、細胞代謝物、ホルモン、薬理作用物
質、トランキライザー、バルビツール酸塩、アルカロイ
ド、ステロイド、ビタミン、アミノ酸、糖、非生物学的
重合体(なるべくは可溶性)、レクチン、組み換えまた
は誘導タンパク質、合成有機分子、有機金属分子、無機
分子、ビオチン、アビジンまたはストレプトアビジンの
いずれでもよい。一具体例をあげると、試薬は抗体、抗
原、核酸、ハプテン、小ヌクレオチド連続体、オリゴマ
ー、配位子、酵素、またはビオチン、アビジン、ストレ
プトアビジン、プロテインA、プロテインG、あるいは
その複合体、あるいはタンパク質相互作用を通して主要
結合相手に結合しうる他の二次的結合相手に接合した化
学発光性部分である。
よく、典型的には被検物質に匹敵する結合性をもつ化合
物であるが、これらはまたもっと高い、あるいはもっと
低い結合能力をもつ化合物のこともありうる。被検物質
またはその類縁体と、および(または)その結合相手と
結合することのできる、そして化学発光性部分を被検物
質につなぐことのできる反応性成分は第二の抗体または
タンパク質、例えばプロテインAまたはプロテインG、
あるいはアビジンまたはビオチン、あるいはこの分野で
結合反応に入ることが判っている他の成分が適当であ
る。
わけ酸化剤を導入する結果として電磁放射線を発するこ
とである。これを行なうためには、これらは励起された
エネルギー状態まで誘発されることができなければなら
ず、そしてまたこの励起状態から下降するときに光の光
子のような電磁放射線を放出することができなければな
らない。
ば電極に電圧波形を印加することにより、前駆物質、例
えば水、を酸化剤、例えば過酸化あるいは超酸化水素、
に変換することによりその場で形成される。第二の例と
して、前駆物質としての酸素分子は電気化学的に還元さ
れて過酸化水素、即ち誘発物質、を生ずる。
ごとに変化するであろう。一般に、利用されるこのよう
な部分の量は、上記組成物あるいは系から検出可能な、
また望むならば定量可能な電磁エネルギーの放出を起こ
すのに有効な量である。対象とする被検物質の検出およ
び(または)定量は、典型的には対象とする被検物質と
化学発光性部分とを含む試料から生じた発光を、既知量
の対象とする被検物質と化学発光性部分とを用いてつく
り出された校正標準により放出された発光と比較するこ
とによりなされる。これは均質形態をとることになる。
不均質様式においては、化学発光分析の前に前記のよう
な分離を行なう。
体と量は一般に行なわれる条件によって系毎に変化する
であろう。適切な化学発光性部分、および望む結果を得
るための十分な量は、一旦本発明の教示を授けられたな
らば、不当な実験を実施しなくとも当業者により実験的
に決定できる。
100μm、最も好ましくは0.5μmから10μmの直径と、
被検物質および(または)前記の小パラグラフ(ロ)
(i)、(ロ)(ii)、あるいは(ロ)(iii)に定義
された他の物質の1種以上に結合することのできる表面
成分とを有する微粒子状物質からなるのが有利である。
例えば、この微粒子状物質は架橋されたデンプン、デキ
ストラン、セルロース、タンパク質、有機重合体、スチ
レン共重合体、例えばスチレン/ブタジエン共重合体、
アクリロニトリル/ブタジエン/スチレン共重合体、ビ
ニルアセチルアクリレート共重合体、あるいは塩化ビニ
ル/アクリレート共重合体、不活性無機粒子、二酸化ク
ロム、鉄の酸化物、シリカ、シリカ混合物、およびタン
パク質性物質、あるいはこれらの混合物でよい。望まし
くは、これら粒子を化学発光性の系に懸濁させるのがよ
い。
明する。図1は有利な化学発光装置を開示しているが、
本発明方法は装置10による適用に限らず、むしろ標識さ
れた成分を収集するための手段を含む他の型の化学発光
装置でも使用できる。本発明方法は静的様式またはフロ
ースルー様式のいずれかで実施できるが、装置10はフロ
ースルーセルを含む。これは結合検定試料を含めて多く
の型の試料に対し明確な利点を具えている。本発明化学
発光検定法を実施するための装置についてこれ以上の詳
細は、一般に譲渡された公開PCT米国特許出願第89/0485
4号および第90/01370号明細書に開示されている。
電子増倍管(PMT)であるのが有利である)、光ダイオ
ード、電荷転送素子、写真フィルムあるいは乳剤など、
およびポンプ16を含み、後者のポンプはセル12へ、セル
12を経て、またセル12からの流体輸送に備えて蠕動ポン
プが有利である。他方、容量形ポンプも使用できる。シ
ャッター機構18がセル12とPMT14との間に設けられ、化
学発光測定期の間にPMT14をセル12に露出する時におい
てのみ調節下に開くよう操作される。例えば、このシャ
ッター機構は保守点検中は閉ざすことがある。また図1
には示されていないが、種々の成分を装着するため、そ
して化学発光測定中に外部の光からPMT14をしゃへいす
るために意図された遮光ハウジングが装置10に含まれ
る。
み、これを送入管22と排出管24(プレキシグラスから構
成するのが有利)とが貫通している。マウンティング
ブロック20はセル12の試料保持容積30の一側面を決める
第一の外面26と第二の内面28を有し、セル12はこの容積
30に清掃および(または)整調および(または)測定用
の溶液を、装置10のそれぞれ対応する操作の間に保持し
ている。送入管および排出管22,24は、外面26から内面2
8へとマウンティング ブロック20を通り抜け、試料保
持容積30の中に開口する。第二のマウンティング ブロ
ック32は化学発光部分により放出された化学発光性の光
の波長において実質的に透明である材料から構成するの
が有利である。それ故、マウンティング ブロック32は
ガラス、プラスチック、石英などから形づくるのが有利
であり、第一の外面34と第二の内面36を有する。第二の
マウンティング ブロック32は第一のマウンティング
ブロックから、なるべくはテフロンまたは他の非汚染性
材料から、つくられた環状スペーサー38により隔てられ
ている。このように、マウンティング ブロック30の外
面34は試料保持容積30の第二の側面を決めることにな
る。スペーサー38は外側の部分40と中央の開き42をも
ち、その内部のヘリ44は試料保持容積30の側壁を決め
る。外側の部分40は、第一のマウンティング ブロック
20の内面28を第二のマウンティング ブロック32の外面
34に対して密閉しており、二つの面28,34の間の試料保
持容積30からいかなる溶液も出て行かないように防いで
いる。
のところで、試料保持容積30と交差し、排出管24は、ス
ペーサー38に隣接するその二番目の端52のところで、試
料保持容積30と交差する。送入管22、試料保持容積30、
および排出管24は一緒になってセル12への、セル12中
の、そしてセル12からの溶液の流れがせまい実質的に層
流となるための途切れない流路を与えている。
管22の中へ「引き入れる」よう排出管24のところに配置
するのが有利である。溶液は送入管22、試料保持容積3
0、そして排出管24を通って流れ、矢印Bの方向で出て
行く。他方、ポンプ16を送入管22に配置して溶液を装置
10を通って「押し出す」こともできる。送入管22、試料
保持容積30、および排出管24を通るこの同じ流路を、セ
ル12を通過するあらゆる溶液および流体に対して使用す
ることにより、各流体がその前の流体をセル12から押し
出すように流体力学的清掃作用を果すと有利である。ポ
ンプ16はセル12に特定の溶液をある時間保持するためそ
の動作を停止するよう制御できる。
と図9で説明する。図8は有利な化学発光装置を開示し
ているが、本発明方法は、装置10での適用に限らず、む
しろ前駆物質を誘発物質へと変換する電気化学的エネル
ギーを得るための作用電極あるいは他の誘発作用をする
面と、標識された成分を収集するための手段を含む、他
の型の化学発光装置で用いることもできる。本発明方法
は静的様式でもフロースルー様式でも実施できるが、装
置10はフロースルーセルを含み、そしてこのものは結合
検定試料を含めて多くの型の試料に対し明確な利点を与
える。本発明に係る化学発光検定法を実施するための装
置のこれ以上の詳細は、一般に譲渡された公開PCT特許
出願US89/04854号および米国特許出願第90/01370号明細
書に開示されている。
れは光電子増倍管(PTM)であるのが有利である)、光
ダイオード、電荷転送素子、写真フイルムあるいは乳剤
などおよびポンプ16を含む。ポンプ16は流体をセル12
へ、セル12中を、そしてセル12から輸送するために蠕動
ポンプであるのが有利である。別法として容量形ポンプ
も使用できる。シャッター機構18がセル12とPMT14との
間に設けられ、化学発光測定期の間PMT14をセル12に露
出する場合にのみ、開くよう調節下に操作される。この
シャッター機構は、例えば保守作業中は閉ざすことがあ
る。図1には示していないが、装置10にはまたそれに種
々な成分を装着し、また化学発光の測定中にPMT14を外
部の光からしゃへいするために意図された遮光ハウジン
グも含まれている。
を含み、これを送入管22と排出管24とが通り抜けてい
る。これらの管はプレキシグラスから構成するのが有利
である。マウンティング ブロック20はセル12の試料保
持容積30の一方の側面を決める第一の外面26と第二の内
面28を有し、そしてセル12はこの容積30に清掃および
(または)整調および(または)測定用の溶液を、装置
10のそれぞれの対応する操作中保持する。送中管および
排出管22,24は外面26から内面28へとマウンティング
ブロック20を貫通していて、試料保持容積30の中に開口
する。第二のマウンティング ブロック32は、化学発光
部分により放出された化学発光性の光の波長において実
質的に透明な材料から構成するのが有利である。それ故
に、マウンティング ブロック32はガラス、プラスチッ
ク、石英などから形づくるのが有利であり、そして第一
の外面34と第二の内面36を有する。第二のマウンティン
グ ブロック32は第一のマウンティング ブロック20か
ら、なるべくはテフロンまたは他の非汚染性材料からつ
くられた環状スペーサー38により隔てられている。この
ように、マウンティング ブロック30の外面34は試料保
持容積30の第二の側面を決めることになる。スペーサー
38は外側の部分40と中央の開き42を有し、その内部のヘ
リ44は試料保持容積30の側壁を決める。外側の部分40
は、第一のマウンティング ブロック20の内面28を第二
のマウンティング ブロック32の外面34に対して密閉し
ており、これら二つの面28,34の間の試料保持容積30か
ら如何なる溶液も通り抜けられないよう防いでいる。
のところで試料保持容積30と交差し、排出管24はスペー
サー38に隣接するその二番目の端52のところで試料保持
容積30と交差する。送入管22、試料保持容積30、および
排出管24は一緒になってセル12中への、セル12中の、そ
してセル12からの溶液の流れが、せまい実質的に層流と
なるための連続した流路を与えている。
極系54が装着され、ここに例示された具体例において
は、作用電極58を含む。他の具体例においては、2個以
上の作用電極が有利に設けられている。作用電極58は対
象とする電気化学的反応と化学発光反応が起こりうる場
所である。作用電極58は中空でないボルタンメトリー電
極であり、それ故に白金、金、炭素またはこの目的に対
して効果的な他の材料から有利に構成することができ
る。作用電極58につなげられた針金のコネクター62は第
一のマウンティング ブロック20を通って出て行く。
「作用電極」端子64に接続されている。電圧制御器66は
ポテンショスタットのように都合よく働いて作用電極58
へ電圧信号を供給し、また任意に化学発光の測定中はそ
こからの電流を測るよう働く。
および、これは任意ではあるが有利な、参照電極70を通
して更に行なわれる。対電極56および作用電極58は試料
保持容積30内の溶液に対して電位を印加する界面を与
え、そしてこの容積30は化学反応にエネルギーを与え、
かつ試料中の前駆物質から誘発物質への電気化学的変換
をひき起こし、そして(または)セル12の表面を清掃し
整調するためのエネルギーを提供する。対電極56は電圧
制御器66の第二の「対電極」端子78に針金コネクター60
によりつなげられる。
示する標準電圧を与える(例えば、基準に対して+1.2
ボルト)。参照電極70はセル12から間隔をとった位置80
のところで排出管24に置くのが有利であり、そして針金
コネクター82を経て電圧制御器66の第三の「参照電極」
端子84に接続される。この三つの電極方式においては、
参照電極70を通って電流が流れない。参照電極70は三電
極動作方式で使用することにより均衡のとれた既知の安
定した電圧が得られ、それ故に銀/塩化銀(Ag/AgCl)
から有利に構成されるが、あるいは飽和カロメル電極
(SCE)である。電圧制御器66は、対/参照電極として
作用電極58および電極56だけを使用する二電極動作方式
で操作できる。この二電極動作方式においては、対/参
照電極56は電圧制御器66の電圧制御端子78と84に電気的
に接続される。この場合、電圧制御器66は本質的に電池
として働く。電圧制御器66は電圧信号を作用電極および
対電極58と56に供給し、そしてそれぞれの電極を通って
流れる電流を任意に測定する。参照電極70は白金、金、
ステンレス鋼または他の材料からつくられた別称いわゆ
る「準参照」電極でもあり、そしてこの電極は比較的不
安定な電圧を供給するが、それでもなお接触している溶
液に関しては測定可能なものである。二電極方式と三電
極方式の両方とも参照電極70または56は、作用電極58に
かけられたどちらの電圧を測るのかに対して標準を与え
るという目的を果す。均衡をとった電圧標準は現在一層
有利と考えられている。電圧制御器66はそのポテンシオ
スタット動作中、参照電極70に関して作用電極58に既知
電圧を供給すると同時に作用電極58と対電極56との間の
電流を測ることによって種々な電極を制御する。この目
的に対するポテンシオスタットは公知であり、それ故に
電圧制御器66の内部構造は、上記の機能をもたらす従来
からの市販ポテンショスタットのいずれかに相当するの
で、それ自身本発明の一部をなさない。事実、装置10
は、別法として、内部電圧制御器66を含まずに組立てる
ことができ、そして電極56、58、72、74および70へ必要
な電圧信号を供給するために別個に制御される外部ポテ
ンショスタットへ接続するように適合させることができ
る。下記の特別な仕方で適用されるこれら電圧信号は、
作用電極58の表面に対して、また有利には全体としてセ
ル12の表面に対して反復しうる初期条件を提供する。こ
れは化学発光測定における精度の向上に有意に貢献する
特徴である。
22中に「引き入れる」ように排出管24に配置するのが有
利である。溶液は送入管22、試料保持容積30および排出
管24を通って流れ、参照電極70を通過し、そして矢印B
の方向に出て行く。別法として、ポンプ16は装置10を通
って溶液を「押し出す」ように送入管22に配置すること
もできる。送入管22、試料保持容積30および排出管24を
通るこの同じ流路を、セル12を通過するあらゆる溶液お
よび流体に対して使用することにより、各流体がその前
の流体をセル12から押し出すように流体力学的清掃作用
を果たすと有利である。ポンプ16はある特定の溶液をセ
ル12内にある時間保つためその動作を中止するよう制御
できる。
が印加されるように、あるいは動作前の電位に連続的に
保持されるようにできる一方、作用電極58(あるいは対
電極および参照電極56、70)を空気にさらすことなく1
種以上の溶液に連続的に暴露することができる。空気に
対する露出は、回路を参照電極70に開放することであ
り、不明の乱雑な電圧変動を許し、これが作用電極58に
対する表面状態の再現性を破壊する。このフロースルー
構成は、電極系54を清掃し、調子を整える開始段階と一
つ以上の測定波形あるいは掃引が化学発光を誘発する測
定段階との間の迅速な交替を可能にする。
を酸化剤へ変換するために、電極が電気化学的エネルギ
ーを導入するという方式を働かせるには、電極を浸しか
つ前駆物質分子を含む電解液を供給する必要がある。こ
の電解液は電荷がイオンにより運ばれる相である。一般
に、電解液は液相の状態にあり、水、有機液体または有
機液体混合物、あるいは水と1種以上の有機液体との混
合物の中に1種以上の塩あるいは他の化学種を含む溶液
である。しかし、本発明の幾つかの具体例においては、
他の形式の電解相も有用である。例えば、電解相は流
体、例えば液体、蒸気、超臨界液体、中の1種以上の物
質の分散系のこともあり、あるいは固体、蒸気または超
臨界流体中に1種以上の物質を含む溶液のこともある。
ナトリウム塩かカリウム塩がよいが、ある具体例におい
ては、陽イオンが化学発光性相互作用の進行を妨害しな
い限り、他の陽イオンの添加も適している。塩の陰イオ
ンは例えばリン酸塩でよいが、本発明の幾つかの具体例
においては他の陰イオンの使用も許される。繰り返し述
べるが、これは選ばれた陰イオンが化学発光性相互作用
の進行を妨害しない限りにおいてである。
体を有利に使用できるが、非水性組成物中に有機液体を
含む電解液を利用するのがより一般的である。水性電解
液と同様、非水性電解液も電荷がイオンにより運ばれる
相である。通常、これは塩を有機液体媒質に溶かすこと
を意味する。適当な有機液体の例は、アセトニトリル、
ジメチルスルホキシド(DMSO)、ジメチルホルムアミド
(DMF)、メタノール、エタノール、および上記化合物
の1種以上の混合物である。有機液体中に可溶なテトラ
アルキルアンモニウム塩、例えばテトラブチルアンモニ
ウム テトラフルオロボレートを上記有機液体と併用し
て非水性電解液をつくるのが代表的な例である。
る。リン酸塩緩衝剤がしばしば有利である。例はリン酸
ナトリウム/塩化ナトリウム水溶液、およびリン酸ナト
リウム/フッ化ナトリウム水溶液である。
って、試薬組成物は本発明検定法の成分、即ち(イ)電
解液、(ロ)化学発光性部分を含む標識化合物、(ハ)
磁気応答性粒子を含めて粒子、(ニ)対象とする被険物
質あるいは対象とする被険物質の類縁体、(ホ)対象と
する被険物質またはその類縁体の結合相手、(ヘ)
(ニ)または(ホ)と反応することのできる反応性成
分、(ト)誘発物質の前駆体分子、または(チ)化学発
光反応促進物質のいずれかである。これら試薬は使用の
便利さから相互に合わせることができる。即ち、2成
分、3成分、およびもっと多成分の混合物を調製できる
が、ただし意図した検定法におけるそれらの機能をそこ
なう程に貯蔵中互に反応しない限りにおいてである。望
ましくは、これら試薬は粒子ならびに1種以上の他の成
分を含む2成分あるいは他成分混合物とする。
は前述した成分(イ)から(チ)の1種以上を含む容器
を包含するか、あるいはこのキットは本発明に係る検定
法ならびに装置にすべて使用するための成分の混合物か
らなる前記の1種以上試薬組成物を含有する容器を含み
うる。
子を使用できるが、一般にこれら粒子は1.0から5.0g/ml
の密度をもち、そしてなるべくは1.1から2g/mlの密度を
もつことが好ましい。最適密度の選択は技術の熟練にか
かっているが、重力で働く検定法においては沈降速度が
検定の速さと収集域における複合体の均一層をつくり出
す願望との間の交換条件となる。
から100μmの平均直径を有する粒子を使用でき、そし
てなるべく粒子は0.01から10μmの平均直径をもつこと
が好ましい。
ば、この濃度は1〜10,000μg/mlから、なるべくは5〜
1000μg/mlまでにわたりうる。粒子の密度、それらの粒
径および濃度は、粒子が少なくとも0.5mm/分の速度で、
なるべくはもっと早い速度で沈降するように選ぶことが
望ましい。
置は、平均直径として測定したとき、粒子の平均直径の
概して0.01〜90%から、なるべくはこの直径の10%〜90
%の細孔寸法を有することが望ましい。
性粒子を記述している。例えば、米国特許第4,628,037
号、第4,695,392号、第4,695,393号、第4,698,302号、
第4,554,088号明細書、英国特許出願GB第2,005,019A号
明細書および欧州特許第0,180,384号明細書は順調に使
用できる種々の磁性粒子を記載している。これら粒子は
常磁性のこともあるいは強磁性のこともあり、そしてこ
れら磁性粒子を免疫検定に使用できるように、結合性化
合物をカップリングする種々の材料で被覆することもあ
る。本発明方法に使用する磁性粒子は少なくとも0.01cg
s単位の磁化率を有することが望ましく、そして磁化率
が少なくとも0.01cgs単位であるのが望ましい。磁性粒
子は広範囲の密度、即ち水の密度よりかなり低い密度、
0.01から5g/mlまで、そしてなるべくは0.5から2g/ml、
を有しうる。粒径は0.001から100μmに及び、なるべく
は0.01から10μmがよい。粒子濃度は概して1から10,0
00μg/mlにわたりうるが、なるべくは5から1000μg/ml
がよい。
粒子が消磁し、検定セルから一掃できるように、例えば
欧州特許第0,180,384号明細書に記載の通り、低い残留
磁気を有することが望ましい。磁性粒子の密度、濃度お
よび粒径は、沈降時間が少なくとも0.5mm/分、望ましく
はこの速度以上となるように選ぶことが望ましい。
きる。
生物をビオチンおよび化学発光性標識で標識した。スト
レプトアビジンビーズはビオチンストレプトアビジン結
合を経て二官能基化されたNDAをとらえ、これに続いて
洗浄をした。次にビーズに結合された生成物を、化学発
光性標識を検出する分析に付した。
れたPCR生成物をストレプトアビジンビーズ上にとら
え、未ビオチニル化鎖を除去した。次に、ビーズに固定
されたPCR生成物を化学発光性標識化オリゴヌクレオチ
ドでハイブリッド形成させた。これに続いて化学発光分
析を行ない標識を検出した。
ストレプトアビジンビーズ上にとらえた。これに続い
て、洗浄することなく化学発光分析に付した。
したルミノメーター;PMT電圧、0−1400V可変 例 1 化学発光装置および微粒子沈着法 沈降セルを使用する磁気収集 磁力を用いて微粒子を沈降させる検定法を行なうため
のセルを図5に示す。参照番号21は透明な窓を示し、参
照番号22はガスケットを、参照番号23はセルブロックの
入口を、参照番号25は試料出口を、参照番号26はセルブ
ロック自身を、そして参照番号27は電磁石を示す。セル
ブロックの面は水平に向いている。緩衝液中に入れた標
識化微粒子(Dynal)を蠕動ポンプによりセルへ引い
た。微粒子がセルに達した後ポンプを止めた。セルチャ
ンバー中の微粒子を、12ボルト1.5アンペアで働かせた
電磁石27を用いて発生させた磁場を用いて収集域へ吸引
した。電磁石の適用により、微粒子の沈着速度は、微粒
子がもっぱら重力によって沈降するときに観察された速
度よりも著しく増加した。
て、参照番号32は透明な窓を示し、参照番号38はガスケ
ットを示し、参照番号22はセルブロック入口を示し、参
照番号20はセルブロック自身を示し、参照番号24は試料
出口を示し、そして参照番号37は永久磁石を示す。
た標識化微粒子(Dynal)を蠕動ポンプ11によりセルへ
吸引する。試料導入に先立ち、永久磁石37を収集域のす
ぐ下の0.035インチの距離に配置した。試料をセルに吸
引しつつあるとき、微粒子は磁石の領域によって限定さ
れる収集域に集まる。ポンプを止める。収集時間が長い
程、より多くの粒子が集められる。
れる微粒子は磁場の方向に整列する。図6は磁場および
生じた粒子の配列を描いたもので、セルブロック8およ
び4の頂部表面に対し該面と接近してそれぞれ平行
(A)および垂直(B)の配列を示す。当業者は収集域
における粒子の配向がその後の誘発物質との接触の効率
に影響を及ぼすことを認識するであろう。
粒子は膜フィルターの表面に濾集するのが有利である。
本発明の一具体例においては、粒子を濾過膜の部分に通
してポンプ送りする。前記膜は粒子直径より小さいが、
なるべくは粒子直径より実質的に小さい細孔寸法をも
ち、そして粒子の収集によって細孔の目詰りを起こさな
いよう十分に高い表面密度でポンプ送りする。次に集め
られた粒子は、粒子からの化学発光を誘発しそしてこの
発光を測定して粒子上の化学発光標識の量を測るという
目的のため、濾過器を通して誘発物質溶液をポンプ送り
することにより誘発物質に暴露される。
膜フィルターを吸収材料の表面に付けるか置いて、毛細
管作用あるいは「吸上作用」が微粒子を含む流体をフイ
ルターを通して自然に吸引するようにする。このように
すると濾過器を通して流体の流れを起こさせる装置を必
要としない。
有する膜フィルターを金属あるいは他の電気伝導性材料
の薄膜で被覆し、膜面が化学発光装置における作用電極
として働きうるようにする。この伝導性フィルムは、超
小型電子装置の加工に常用される方法、例えば熱蒸発あ
るいはスパッタリング、により膜の表面に容易に適用さ
れる。
ターを通るようにフローセルに容易に装着される。流れ
の中の粒子はフィルターによって捕足されその、場で容
易に洗浄されるので、外部の洗浄装置を必要とすること
なく不均質検定法を実行するための迅速かつ簡単な手段
が提供される。
めに複合体を収集するもう一つの手段を提供する。セル
に回転運動を与えながら、回転シール63を通して検定溶
液61をセル62にポンプ送りする。複合体のより重い粒子
は収集域に濃縮される。セルがなお回転しつつあるうち
に溶液はセルから出て行く。セル窓67を通過する光の出
力を光電子増倍管65により測定する。この光の出力は収
集域から注がれ、セル中心に位置した曲面鏡66で反射し
去る。次にセルを洗浄し、きれいにして次の測定サイク
ルに備える。これはセルを停止させてもあるいは回転さ
せながらでも成し遂げられる。
ク質による粒子の被覆 30mg(1ml)の4.5μm未被覆磁気応答性ポリスチレン
M−450DYNABEADS(DYNAL、オスロ、ノルウェー)を、1
50mMのリン酸塩緩衝溶液(pH7.5)を用いて磁気分離に
より洗浄する(2ml/洗浄を使用)。この粒子へ0.05%の
チメラゾールを含む1mlのリン酸塩緩衝食塩水(PBS)中
アクリジニウムエステル−標識抗体(London Diagnosti
cs LumaTag TSH標識抗体)150μgを加える。この混合
物を室温でかきまぜながら一晩インキュベーションす
る。溶液を次に粒子から磁気的に分離し、流体を除く。
未反応部位を封鎖するため、粒子ヘアジ化ナトリウム0.
05%を含む3%BSA/PBS1mlを加え、得られた溶液を室温
で2時間インキュベーションする。粒子を5回洗浄し
(2ml/洗浄)、次に保存のため同じ緩衝液6mlに最終的
に再浮遊させる。
スロ、ノルウェー)を標識化タンパク質で被覆する。被
覆粒子をリン酸塩緩衝液で3回洗浄した後、0.1N HNO3
および0.5%過酸化水素中30μg/mlの懸濁液2mlとする。
蠕動ポンプを用いて、この粒子懸濁液500μlをフロー
セル中に吸引する。(例2)。粒子がセル中を流れると
き、これらは磁石により吸引され、収集域中に濃縮され
る。粒子を磁気的に集めた後、0.25N NaOH、0.5%過酸
化水素中の溶液をセル中に吸引する一方、粒子が収集域
に濃縮されたフロセル上に中心をもつハママツR374光電
子増倍管を使用して化学発光を測定する。
覆Dynal粒子の調製 表面に−OH残基を有する4.5μm未被覆磁性ポリスチ
レン粒子(DYNAL,DYNABEADK M−450,DYNAL A.S.オス
ロム ノルウェー)1mlを、150mM炭酸ナトリウム/重炭
酸ナトリウム溶液(pH9.6)を用いて磁気分離により洗
浄する(2ml/洗浄を使用)。炭酸塩/重炭酸溶液1ml中
0.5mgの精製モノクローン抗TSH抗体(カタログNO.50640
31,Ventrex Laboratories,Inc.,ポーランド、メイン
州)を粒子へ加える。この混合物をかきまぜながら室温
で一晩インキュベーションする。次に溶液を粒子から磁
気的に分離し、除去する。アジ化ナトリウム0.05%を含
む3%BSA/PBS 1mlを加え、室温でかきまぜながら2時
間インキュベーションして未反応部位を封鎖する。粒子
を5回(2ml/回)洗浄し、次に最終的に貯蔵のため同じ
緩衝液1ml中に懸濁させる。最終濃度は3重量%であ
る。
イッチ検定法 血清キャリブレーター(London Diagnostios TSH Lum
i TAG Kit)100μ、リン酸塩緩衝液中Luma TagTSH ア
クリジニウムエステル−標準抗体(London Diagnostic
s)25μおよびリン塩酸緩衝液中抗−TSH−DYNAL粒子
(例8)25μを合わせ、ポリプロピレン管中で混合し
つつ室温で15分間インキュベーションする。次に粒子を
磁気分離により洗浄し、次にpH4,10mM炭酸塩/重炭酸塩
緩衝液500μ中に再懸濁させる。この洗浄手順を更に
2回繰り返した。粒子をフローセル中に吸引し(例
2)、磁気的に収集し、化学発光反応を誘発する溶液
(0.5%過酸化水素、0.25N NaOH)をフローセルを通し
て流す。各試料に対する化学発光を例2記載のように測
定する。化学発光の強さは試料中に存在する被検物質の
濃度に直接比例する(被検物質の濃度が増加するにつれ
て強度を増す。) 例10 甲状腺刺激ホルモン(TSH)に対する一段階非分離サン
ドイッチ検定法 血清キャリブレーター(London Diagnostics TSH Lum
i TAG Kit)100μ、リン酸塩緩衝液中Luma TagTSH ア
クリジニウムエステル−標識抗体(London Diagnositio
s)25μおよびリン酸塩緩衝液中抗−TSH−DYNAL粒子
(例*)25μlを合わせ、ポリプロピレン管の中で混合
しつつ室温で15分間インキュベーションする。結果を読
む前に、pH4、100mM炭酸塩/重酸塩緩衝液1mlを加え
る。粒子をフローセル中に吸引し(例2)、磁気的に収
集し、化学発光反応を誘発する溶液(0.5%過酸化水
素、0.25N NaOH)をフローセル中に通す。例2に記載の
ように各試料に対する化学発光を読む。化学発光の強さ
は試料中に存在する被検物質の濃度に直接比例する(被
検物質濃度が増加するにつれて強度を増す。) 例11 誘発物質を発生する酵素を使用する化学発光TSH免疫検
定 固体相として磁気応答性微粒子を、また標識としてア
クリジニウムエステルを使用することにより、例2に記
載の装置を用いてTSH免疫検定を実行することができ
る。酵素、グルコースオキシダーゼを用いて誘発物質の
前駆物質(グルコース)を誘発物質(過酸化水素)に変
換する。酵素グルコースオキシダーゼはグルコースから
グルコン酸と過酸化水素への酸化を触媒する。アクリジ
ニウムエステルは過酸化水素の存在下で励起状態に酸化
される。酸化された励起生成物がその後基底状態に戻る
と、その結果光が放出され、これが定量される。特異的
抗体と酵素グルコースオキシダーゼの両方で被覆された
磁性微粒子を使用することができる。この粒子は例8と
同様に、ただし抗体と酵素(Sigma Chemical)の両方を
0.5mgずつ被覆のための粒子へ加える。別法として、各
試薬(抗体あるいは酵素)で被覆された別々の粒子を混
合して検定に使用することもできる(例8記載のように
して別々に調製する)。
検定法に基づいている。例8記載のようにして、モノク
ローン抗−TSH抗体を被覆した微粒子を調製する。酵素
グルコースオキシダーゼを被覆した磁性微粒子は、抗体
被覆磁性微粒子と同じ方法により調製する。アクリジニ
ウムエステルで標識されたポリクローン抗TSH抗体およ
びTSH標準はLondon Diagnosticsから得られる。酵素基
質溶液はD−グルコース(100mg/ml)を含む100mMリン
酸カリウム緩衝液からなる。試験系列(12×7mmポリプ
ロピレン)を据え付け、標準および検定すべき試料に従
って標識する。各試験管へ標準あるいは試料あるいは対
照100μ、アクリジニウムエステル−標識抗体100μ
および抗TSH抗体と酵素被覆微粒子との混合物100μを
加える。管を混合しつつ室温で15分インキュベーション
する。インキュベーション後、pH4、100mM炭酸塩/重炭
酸塩緩衝液1mlを加える。粒子をフローセル(例2)中
に吸引し、磁気的に収集し、グルコース基質溶液をフロ
セール中に通す。例2に記載のように各試料に対する化
学発光を読む。化学発光の強度は試料中に存在する被検
物質の濃度に直接比例する(被検物質の濃度が増加する
につれて強度を増す)。
スルー装置を使用する。
性管);PMT電圧0−1400V可変 例12 重力による微小粒子の収集装置および方法 この測定法は図10に示したセルで行なう。図10を参照
すると、本図は重力を用いて検定を行なう装置を描いた
ものである。装置の成分は参照番号11により示される透
明な窓、参照番号12により示されるガスケット、入口1
3、作用電極14、対電極15および出口16を含むブロック
を包含する。セルブロックの面は水平である。即ち、地
球の重力の場の方向に対して垂直である。緩衝液中の標
識化された微粒子(Dynal)を蠕動ポンプを用いてセル
へ引き入れる。粒子がセルに達した後にポンプを止め
る。セルチャンバー内の微粒子は作用電極面上に降下す
る。微粒子の降下速度は10mmの距離にわたり0.5mm/分で
ほぼ一定であることが測定された。沈降する粒子の数は
時間と降下速度の関数である。化学発光の強度は作用電
極上に沈降する粒子の数に比例する。面に達する粒子の
数、従って化学発光の強度、は作用電極上の流体試料の
高さにより制限される。
と、参照番号32は透明な窓を示し、参照番号38はガスケ
ットを、参照番号22はセルブロックへの入口を、参照番
号58は作用電極を、参照番号35はセルブロック自身を、
参照番号24は試料出口を、そして参照番号37は永久磁石
を指す。
中の標識された微粒子(Dynal)は蠕動ポンプにより電
気化学的セルへ引かれる。試料の導入に先立ち、永久磁
石34を作用電極/溶液界面の直下に0.035インチの距離
で配置する。試料がセルへ引かれるにつれて、微粒子は
磁石の領域によって決まる収集域に集まる、例えば作用
電極上の領域に沈着する。全試料が沈着した後に、ポン
プを止め、磁石を取り去る。収集時間が長い程より多く
の粒子が沈着する。作用電極上の粒子濃度を増加させる
と化学発光強度が増す。
ロ、ノルウェー)を標識したタンパク質で被覆する。被
覆粒子をリン酸塩緩衝液で3回洗浄後、pH4の100mM炭酸
塩/重炭酸塩緩衝液中30μg/mlの懸濁液2mlをつくる。
蠕動ポンプを使用してこの粒子懸濁液500μをフロー
セル中に引き入れる。粒子が作用電極へ流れるにつれて
それらは磁石により作用電極上に吸引され、濃縮され
る。粒子が磁気で集められた後、0.25N NaOHの溶液を
セルに通す。次の三つの方法のうちのいずれかによって
前駆物質分子から誘発物質分子への変換により化学発光
が発生する: (1) 作用電極で水(前駆物質)が酸化されて過酸化
水素および他の酸化性化学種(誘発物質)を生成するよ
うに、電位波形を電気化学的電極にかける。過酸化水素
または他の酸化性化学種がアクリジニウムエステル標識
の化学発光反応をひき起こす。
次式: O2+2H2O+2e→H2O2+2OH に従って過酸化水素(誘発物質)を生成するように電位
波形を電気化学的電極にかける。この電気化学的反応は
飽和カロメル電極に関しておよそ−0.4Vを作用電極にか
けたとき起こる。過酸化水素はアクリジニウムエステル
標識の化学発光反応をひき起こす。
成するように電位波形を電気化学的電極にかける。次に
水の電気分解により生じた酸素が(前駆物質)が還元さ
れて過酸化水素(誘発物質)を生ずるように電気化学的
電極へ波形をかける。過酸化水素はアクリジニウムエス
テル標識の化学発光反応をひき起こす。
中心を置くハママツR374光電子増倍管を使用して化学発
光を測定する。
Claims (8)
- 【請求項1】試料中に存在する可能性のある対象被検物
質の結合検定を実行する方法において、 (イ)(i) 前記試料、 (ii) 誘発時に化学発光することのできる標識化合物
に結合した成分を含む検定実行物質、および (iii) 被検物質および(または)前記検定実行物質
と特異的に結合することのできる複数の粒子 を含む組成物をつくり、 (ロ) 前記組生物をインキュベーションして前記複数
の粒子の一つおよび前記標識成分を含む複合体を形成せ
しめ、 (ハ) 前記複合体を収集域に集め、 (ニ) その後に、標識が発光するように前記標識を誘
発することのできる誘発物質を前記収集域中に導入し、
ここで、誘発された発光は該結合検定の過程で生じた最
初の発光であり、そして (ホ) 放出された発光を検出して試料中に対象被検物
質が存在するか否かを決定する諸工程からなる上記方
法。 - 【請求項2】請求の範囲1記載の方法を実行するための
装置において、 (イ) 垂直な円柱形の域を有し、そして入口および出
口を有し、セルおよび前記円柱形の域の大体の体積より
下に位置した磁場を発生させるための手段を更に含む試
料含有体積を限定するセル、および (ロ) 収集域で発生した化学発光を定量する手段から
なる上記装置。 - 【請求項3】試料中に存在する可能性のある対象被検物
質の結合検定を実行する方法において、 (イ)(i) 前記試料、 (ii) 誘発時に化学発光しうる標識化合物に結合した
成分を含む検定実行物質、および (iii) 被検物質および(または)前記検定実行物質
と特異的に結合することのできる複数の粒子 を含む組成物をつくり、 (ロ) 前記組成物をインキュベーションして前記複数
の粒子の一つおよび標識成分を含む複合体をつくり、 (ハ) 前記複合体を電極表面に集め、 (ニ) その後に、標識を誘発物質と接触させることに
よりその発光を誘発し、前記誘発物質は電気化学的エネ
ルギーの導入時に前駆物質分子の変換によりその場で形
成されるようにし、ここで、誘発された発光は該結合検
定の過程で生じた最初の発光であり、そして (ホ) 放出された発光を検出して試料中に対象被検物
質が存在するか否かを決定する諸工程からなる上記方
法。 - 【請求項4】試料中に存在する可能性のある対象被検物
質の結合検定を実行する方法において、 (イ)(i) 前記試料、 (ii) 酸化時に化学発光しうる標識化合物に結合した
成分を含む検定実行物質、 (iii) 被検物質および(または)前記検定実行物質
と特異的に結合することのできる複数の被覆された磁性
粒子、および (iv) 標識を酸化しうる酸化剤へ電気化学的に変換さ
れうる分子 を含む組成物をつくり、 (ロ) 前記組成物をインキュベーションして前記複数
の被覆された磁性粒子の一つおよび前記標識化合物を含
む複合体をつくり、 (ハ) 前記複合体を電極表面に磁気的に集め、 (ニ) その後に、前記標識が酸化されて発光するよう
に、前記電極に電圧をかけることにより前記分子を前記
酸化剤へ変換し、ここで、発光は該結合検定の過程で生
じた最初の発光であり、そして (ホ) 放出された発光を検出して試料中に対象被検物
質が存在するか否かを決定する諸工程からなる上記方
法。 - 【請求項5】試料中に存在する可能性のある対象被検物
質の結合検定を実行する方法において、 (イ)(i) 前記試料、 (ii) 酸化時に化学発光しうる標識化合物に結合した
成分を含む検定実行物質、および (iii) 被検物質および(または)前記検定実行物質
と特異的に結合することのできる複数の被覆された磁性
粒子 を含む組成物をつくり、 (ロ) 前記組成物へ、前記標識を酸化することのでき
る酸化剤に電気化学的に変換されうる分子を導入し、 (ハ) 前記組成物をインキュベーションして前記複数
の被覆された磁性粒子の一つと前記標識化合物を含む複
合体をつくり、 (ニ) 前記複合体を電極表面に磁気的に集め、 (ホ) その後に、前記標識が酸化されて発光するよう
に、前記電極に電圧をかけることにより前記分子を前記
酸化剤に変換し、ここで、発光は該結合検定の過程で生
じた最初の発光であり、そして (ヘ) 放出された発光を検出して試料中に対象被検物
質が存在するか否かを決定する諸工程からなる上記方
法。 - 【請求項6】試料中に存在する可能性のある対象被検物
質の結合検定を実行する方法において、 (イ)(i) 前記試料、 (ii) 酸化時に化学発光しうる標識化合物に結合した
成分を含む検定実行物質、および (iii) 被検物質および(または)前記検定実行物質
と特異的に結合しうる複数の被覆された磁性粒子 を含む組成物をつくり、 (ロ) 前記組成物をインキュベーションして前記複数
の被覆された磁性粒子の一つと前記標識化合物を含む複
合体をつくり、 (ハ) 前記組成物へ、前記標識を酸化しうる酸化剤へ
電気化学的に変化することのできる分子を導入し、 (ニ) 前記複合体を電極表面に磁気的に集め、 (ホ) その後に、前記標識が酸化されて発光するよう
に、前記電極に電圧をかけることにより前記分子を前記
酸化剤へ変換し、ここで、発光は該結合検定の過程で生
じた最初の発光であり、そして、 (ヘ) 放出された発光を検出して試料中に対象被検物
質が存在するか否かを決定する諸工程からなる上記方
法。 - 【請求項7】試料中に存在する可能性のある対象被検物
質の結合検定を実行する方法において、 (イ)(i) 前記試料、 (ii) 酸化時に化学発光しうる標識化合物に結合した
成分を含む検定実行物質、および (iii) 被検物質および(または)前記検定実行物質
と特異的に結合することのできる複数の被覆された磁性
粒子 を含む組成物をつくり、 (ロ) 前記組成物をインキュベーションして前記複数
の被覆された磁性粒子の一つと前記標識化合物を含む複
合体をつくり、 (ハ) 前記複合体を電極表面に磁気的に集め、 (ニ) その後に、前記組成物へ、前記標識を酸化しう
る酸化剤に電気化学的に変換することのできる分子を導
入し、 (ホ) 前記標識が酸化されて発光するように、前記電
極に電圧をかけることにより前記分子を前記酸化剤に変
換し、ここで、発光は該結合検定の過程で生じた最初の
発光であり、そして (ヘ) 放出された発光を検出して試料中に対象被検物
質が存在するか否かを決定する諸工程からなる上記方
法。 - 【請求項8】請求の範囲3−7のいずれか一項に記載の
方法を実行するための装置において、 (イ) 入口および出口を具えた垂直な円柱形の域を有
し、そして磁場を発生させるための手段およびセルと円
柱形の域の大体の体積より下に位置した電極を更に含む
試料含有体積を限定するセル、および (ロ) 前記電極に電圧を印加するための手段、および (ハ) 収集域で発生した化学発光を定量するための手
段からなる上記装置。
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