KR101644144B1 - 향상된 면역분석 센서 - Google Patents

향상된 면역분석 센서 Download PDF

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데니스 라일라트
알라스테어 하지스
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유니버셜 바이오센서스 피티와이 엘티디.
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Abstract

유체 샘플 중의 표적 피분석물의 존재의 검출장치가 본 명세서에 개시된다. 바이오센서 장치는 적어도 하나의 반응 챔버와 검출 챔버를 포함할 수 있다. 장치는 증폭 메카니즘을 포함하여, 유체 샘플 중에 존재하는 하나의 표적 피분석물 분자가 다수의 검출제 분자의 생성/활성화를 유발하고, 이에 따라 증폭된 신호를 유발할 수 있다. 이러한 바이오센서 장치의 제조 및 이용방법도 또한 개시된다.

Description

향상된 면역분석 센서{ENHANCED IMMUNOASSAY SENSOR}
관련 출원 및 참고 문헌 인용
본 출원은 미국 특허 가출원 제61/129,688호(발명의 명칭: "Enhanced Immunoassay Sensor", 출원일: 2008년 7월 11일, 대리인 관리 번호: 0089500-008PR0)에 대한 우선권을 주장한다. 본 출원은 미국 특허 출원 제11/284,097호(발명의 명칭: "BIOSENSOR APPARATUS AND METHODS OF USE", 출원일: 2005년 11월 21일, 대리인 관리 번호: 0089500-004US0)의 일부계속출원으로서 우선권을 주장하며, 이는 차례로 미국 특허 출원 제10/105,050호(발명의 명칭: "DIRECT IMMUNOSENSOR ASSAY", 출원일: 2002년 3월 21일, 대리인 관리 번호: 0089500-002US0) 및 제10/830,841호(발명의 명칭: "IMMUNOSENSOR", 출원일: 2004년 4월 22일, 대리인 관리 번호: 0089500-001US1)의 일부계속출원으로서 우선권을 주장한다. 전술한 모든 출원은 그들 각각의 전문이 본 명세서에 참고 문헌으로 인용된다.
미국 특허 출원 제11/284,097호는 미국 특허출원 공개 제2006/0134713호(공개일: 2006년 6월 22일)로 공개되었다. 미국 특허 출원 제10/105,050호는 미국 특허출원 공개 제2003/0180814호(공개일: 2003년 9월 25일)로 공개되었다. 미국 특허 출원 제10/830,841호는 미국 특허출원 공개 제2004/0203137호(공개일: 2004년 10월 14일)로 공개되었다.
하기의 참고문헌은 그 전문이 각각 참고로 포함된다: (1) 유럽 특허출원 공개 제0300628호; (2) 일본 특허 제7227298호; (3) 미국 특허 제4622294호; (4) 미국 특허출원 공개 제2006226008호; (5) 미국 특허출원 공개 제2007131549호; (6) 국제 특허공개 제02012885호; (7) 국제 특허공개 제0240058A2호; (8) 국제 특허공개 제0207635호; (9) 국제 특허공개 제02082078호; (10) 국제 특허공개 제02082078호; (11) 국제 특허공개 제03097863호; (12) 국제 특허공개 제03101427호; (13) 국제 특허공개 제04041774호; (14) 국제 특허공개 제05000902호; (15) 국제 특허공개 제05116654호; (16) 국제 특허공개 제06035431호; (17) 국제 특허공개 제1992003730호; (18) 국제 특허공개 제2000062351호; (19) 국제 특허공개 제2004046717호; (20) 국제 특허공개 제2006046524호; (21) 국제 특허공개 제2006096619호; (22) 국제 특허공개 제2006127167호; (23) 국제 특허공개 제9203730호; (24) 국제 특허공개 제9203730A1호; (25) 국제 특허공개 제9820332호; (26) 국제 특허공개 제96024062호; (27) 국제 특허공개 제98004743호; (28) 국제 특허공개 제99010743호; 및 (29) 문헌[Thomas R. DeCory, Richard A. Durst, Scott J. Zimmerman, Linda A. Garinger, Gary Paluca, Heleen H. DeCory, and Richard A. Montagna. "Development of an Immunomagnetic Bead-Immunoliposome Fluorescence Assay for Rapid Detection of Escherichia coli O157:H7 in Aqueous Samples and Comparison of the Assay with a Standard Microbiological Method." Appl . Environ Microbiol . 2005, 77:1856-1864]. 전술된 참고문헌 모두가 그들 각각의 전문이 본 명세서에 참고문헌으로 인용된다.
발명의 기술분야
본 발명은 유체 샘플 중의 표적 피분석물 검출장치 및 검출방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 향상된 면역분석 센서에 관한 것이다.
면역분석 기반의 시스템을 비롯한 통상의 생물의학용 센서가 매우 다양한 피분석물(analyte)의 존재 및/또는 농도를 보고하는 데 사용되었다. 면역분석은 일반적으로 경쟁 분석 및 샌드위치(sandwich) 분석의 2가지 범주로 분류된다. 경쟁 분석에서, 시험 샘플 중의 항원은 항원-프로브 복합체(보통 리포터(reporter) 복합체로 지칭됨)와 혼합된 다음, 혼합물은 항체에 결합하기 위해 경쟁한다. 샌드위치 면역분석에서, 시험 샘플 중의 항원이 항체에 결합한 다음 2차 항체-프로브 복합체가 항원에 결합한다. 이들 종래 기술 분석 방법에서, 보통 하나 이상의 세정 단계가 필요하다. 세정 단계는 분석 절차에 복잡성을 부가할 수 있고, 생물유해성 액체 폐기물을 생성할 수 있다.
면역분석은 통상 사용자에게 대부분 흔히 단순한 시각적 검출(예를 들어, 색상 변화)에 의해 수득되는 정성적 결과(예를 들어, "예/아니오 응답") 또는 항원의 농도와 같은 정량적 결과 중 하나를 제공한다. 대부분의 정량적 방법은 섬광계수기(방사능 모니터링용), 분광광도계, 분광형광계(참고예: 미국 특허 제5,156,972호), 표면 플라즈몬 공명 기기(참고예: 미국 특허 제5,965,456호) 등과 같은 고가의 장비를 수반한다. 따라서, 가정 또는 현장 이용에 적합하게 사용하기에 충분히 저가이면서 단순한 면역분석을 개발하는 것이 유리할 것이다. 이러한 바이오센서는 바람직하게는 원심분리, 희석, 피펫팅(pipetting), 세정 또는 타이밍 단계들을 필요로 하지 않을 것이며, 최소의 폐기물을 생성할 것이다.
본 개시내용의 몇몇 실시형태는 내부 표면, 결합제 및 프로브 제제(probe agent)를 포함하며, 여기에서 상기 프로브 제제가 결합 파트너와 비히클(vehicle)을 포함하고, 상기 결합 파트너가 상기 비히클에 결합하며, 유체 샘플 중의 표적 피분석물이 상기 결합제 또는 상기 결합 파트너와 반응할 수 있는 반응 챔버; 검출 챔버; 및 상기 반응 챔버와 상기 검출 챔버 사이의 유체 통로(passageway)를 포함하는 유체 샘플 중의 표적 피분석물 검출장치를 포함하며, 여기에서, 해당 장치는 반응된 유체 샘플이 모세관 작용을 통해 상기 유체 통로를 통과하여 상기 반응 챔버로부터 상기 검출 챔버로 이동하도록 구성되고, 유체 샘플 중의 소정의 농도의 표적 피분석물의 존재가 반응된 유체 샘플과 함께 상기 검출 챔버로 이동하는 상기 프로브 제제의 양의 변화를 야기하며, 상기 변화는 상기 검출 챔버에서 검출가능하고, 적어도 역치 농도에 따라 달라진다. 상기 장치는 내부 표면을 포함하는 충전 챔버를 추가로 포함할 수 있다. 상기 반응 챔버 및 충전 챔버의 내부 표면은 내벽 및/또는 적어도 하나의 지지 부재의 표면을 포함할 수 있다. 반응 챔버는 대기에 대한 개방부(opening)를 포함할 수 있다.
상기 반응 챔버 및/또는 충전 챔버는 반응 챔버의 내부 표면에 대한 단백질 또는 지질성 입자의 비특이적인 결합을 방지할 수 있는 블로킹제(blocking agent)를 포함할 수 있다. 상기 지질성 입자는 리포솜, 소포, 세포 기관 등을 포함할 수 있다. 상기 블로킹제는 계면활성제 및 블로킹 단백질로부터 선택되는 적어도 하나를 포함할 수 있다. 상기 블로킹 단백질은 소 혈청 알부민을 포함할 수 있다.
상기 결합제 분자 및 프로브 제제 분자는 반응 챔버의 상이한 내부 표면에 결합될 수 있다.
상기 결합제는 적어도 하나의 자성 비드(magnetic bead)를 포함할 수 있다. 상기 장치는 반응 챔버 내에서 자성 비드 상에 코팅되는 결합제를 구속하는 데 작용하는 자기장을 포함할 수 있다.
상기 프로브 제제 분자의 비히클은 적어도 하나의 카피(copy)의 활성화제를 포함할 수 있다. 상기 비히클은 약 10 내지 약 100000 카피의 활성화제를 포함할 수 있다. 상기 활성화제는 적어도 하나의 지질성 입자를 포함할 수 있는 비히클 내에 캡슐화(encapsulated)될 수 있다. 상기 지질성 입자는 리포솜, 소포, 세포 기관 등을 포함할 수 있다. 상기 활성화제는 적어도 하나의 폴리머를 포함할 수 있는 비히클에 표면 결합될 수 있다. 상기 폴리머는 덴드리머(dendrimer)를 포함할 수 있다.
상기 프로브 제제의 결합 파트너는 상기 결합제 또는 결합제에 결합된 표적 피분석물 또는 결합제에 결합되지 않은 표적 피분석물에 결합하도록 구성될 수 있다.
상기 반응 챔버는 해당 반응 챔버 내에 고정화된 불활성화제(unactivated agent)를 포함할 수 있으며, 여기에서 불활성화제는 결합되지 않거나 캡슐화되지 않은 활성화제에 결합할 수 있다. 상기 불활성화제는 적어도 하나의 자성 비드를 포함할 수 있으며, 자기장에 의해 반응 챔버 내에 구속될 수 있다.
상기 충전 챔버 및/또는 반응 챔버는 유체 샘플의 pH를 조정할 수 있는 완충액을 포함할 수 있다. 상기 완충액은 포스페이트, 시트레이트, 시트라코네이트, 멜리테이트, 트리스, PIPES, MOPS, HEPES, 프탈레이트, 이미다졸로부터 선택되는 물질을 포함할 수 있다.
상기 검출 챔버는 활성화제를 비히클로부터 유리시킬 수 있는 유리화제(liberating agent)를 포함할 수 있다. 상기 비히클에 혼입되는 유리화제는 순한 세정제(mild detergent), 용해성 펩티드, 효소, 가열, 냉각, 초음파처리 및 광화학적으로 활성화되는 용해제와 함께 광원으로부터 선택되는 적어도 하나의 제제를 포함할 수 있다. 상기 순한 세정제는 n-옥틸-B-D-글루코피라노사이드, 트윈(tween) 20, brij 35 및 트리톤 X-100으로부터 선택되는 하나의 세정제를 포함할 수 있다. 상기 용해성 펩티드는 멜리틴(mellitin) 및 보체계의 구성성분인 포스포리파제의 한 분류 중 하나로부터 선택되는 하나의 펩티드를 포함할 수 있다. 상기 효소는 프로테아제(protease) 및 트립신으로부터 선택되는 하나의 효소를 포함한다. 상기 유리화제는 예를 들어, 냉각, 가열, 초음파처리와 같은 물리적인 수단, 또는 예를 들어 센서로 지향된 광원에 의해 개시되는 광화학적 반응과 같은 물리적 및 화학적 수단의 조합을 포함할 수 있다.
상기 활성화제는 효소를 위한 보조인자를 포함할 수 있다. 상기 검출 챔버는 보조인자에 의해 활성화될 수 있는 아포-효소(apo-enzyme)를 포함할 수 있다. 상기 효소는 글루코스 산화효소를 포함할 수 있다. 상기 보조인자/아포-효소 쌍은 플라빈 아데닌 다이뉴클레오티드 및 아포-글루코스 산화효소를 포함할 수 있다. 효소는 글루코스 탈수소효소를 포함할 수 있다. 상기 보조인자/아포-효소 쌍은 피롤로퀴놀린 퀴논(PQQ) 및 아포-글루코스 탈수소효소(GDH)를 포함할 수 있다. 상기 검출 챔버는 효소 기질을 추가로 포함할 수 있다. 상기 효소 기질은 산화가능한 기질을 포함할 수 있다. 상기 산화가능한 기질은 갈락토스, 말토스, 자일로스 및 아세트산으로부터 선택되는 하나의 기질을 포함할 수 있다. 상기 효소 기질은 글루코스를 포함할 수 있다. 상기 검출 챔버는 적어도 하나의 매개체(mediator)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 매개체는 다이클로로페놀인도페놀, 페나진 에토설페이트, 페리사이아나이드, 페로센(ferrocene) 및 전이 금속과 질소-함유 헤테로원자 화학종 사이의 착물로부터 선택되는 적어도 하나의 물질을 포함할 수 있다.
상기 검출 챔버는 원위 단부(distal end)에 배출구(vent)를 포함할 수 있다. 상기 배출구는 장치의 외층을 천공시키거나 장치의 외층의 한 부분을 제거함으로써 개방될 수 있다.
상기 검출 챔버는 검출 챔버 내에서 전기화학적 반응을 검출하기 위한 적어도 2개의 전극을 포함할 수 있다. 해당 전극 중 적어도 하나는 전기 전도성 층으로부터 형성될 수 있다. 상기 검출 챔버는 해당 검출 챔버 내에서 전극의 적어도 하나의 에지(edge)를 형성하는 데 소용될 수 있는 전기 전도성 층 내의 단선부(break)를 포함할 수 있다. 상기 적어도 하나의 전극은 팔라듐, 백금, 금, 이리듐, 탄소, 결합제와 혼합된 탄소, 산화 인듐, 산화 주석 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 상기 검출 챔버 내에서의 프로브 제제의 양의 변화는 검출 챔버 내에서의 전기화학적 반응을 통해 검출될 수 있다.
본 개시 내용의 몇몇 실시형태는 유체 샘플을 장치에 운반하는 단계로서, 상기 장치가 반응 챔버 및 검출 챔버를 포함하며, 상기 반응 챔버가 결합제 및 프로브 제제를 포함하고, 상기 프로브 제제가 결합 파트너 및 비히클을 포함하는 것인 단계; 상기 결합제와 상기 프로브 제제 사이의 반응을 상기 반응 챔버 내에서 진행시키는 단계로서, 소정의 농도의 유체 샘플 중의 표적 피분석물의 존재가 상기 반응 챔버 내에 결합된 프로브 제제의 양과 미결합 프로브 제제의 양의 변화를 야기하며, 상기 변화가 표적 피분석물의 농도에 따라 달라지는 것인 단계; 반응된 샘플 유체를 모세관 작용에 의해 상기 반응 챔버로부터 상기 검출 챔버로 이동시켜, 미결합 프로브 제제를 상기 검출 챔버로 이동시키는 단계; 및 검출제를 사용하여 상기 검출 챔버 내에서 프로브 제제의 존재를 검출하는 단계를 포함하는, 유체 샘플 중의 표적 피분석물의 검출방법을 포함한다. 상기 샘플은 모세관 작용을 통해 장치의 충전 챔버를 통과하여 장치로 이송될 수 있다. 상기 검출제는 아포-효소를 포함할 수 있다. 상기 비히클은 적어도 하나의 카피의 활성화제를 포함할 수 있으며, 여기에서 하나의 카피의 활성화제는 적어도 하나의 카피의 검출제를 활성화시킬 수 있다. 샘플을 반응 챔버로부터 검출 챔버로 이동시키는 단계는 배출구를 개방하는 것을 포함할 수 있다. 상기 검출하는 단계는 검출 챔버로부터 수신되는 전기적 신호를 정량화하는 것을 포함할 수 있으며, 여기에서 전기적 신호의 크기는 샘플 유체 중의 표적 피분석물의 농도에 따라 달라질 수 있다.
도 1a는 예시적인 U자 형상 바이오센서를 도시한 도면으로, 부분(8)은 반응 및 검출이 발생할 수 있는 부분임;
도 1b는 예시적인 나무 형상 바이오센서를 도시한 도면으로, 부분(8)은 반응 및 검출이 발생할 수 있는 부분임;
도 2는 본 명세서에 개시된 바이오센서의 일 실시형태의 평면도;
도 3은 도 2의 2-2 선을 따른 바이오센서의 단면도;
도 4는 본 명세서에 개시된 바이오센서의 또 다른 실시형태의 평면도;
도 5a는 도 4의 4A-4A 선을 따른 바이오센서의 단면도;
도 5b는 도 4의 4B-4B 선을 따른 바이오센서의 단면도;
도 5c는 도 4의 4C-4C 선을 따른 바이오센서의 단면도;
도 5d는 도 4의 4D-4D 선을 따른 바이오센서의 단면도;
도 6은 본 명세서에 개시된 바이오센서의 또 다른 실시형태의 평면도;
도 7은 화학물질의 위치를 나타내는 도 4 또는 도 6의 바이오센서의 단면도.
바람직한 실시형태를 포함하는 다양한 예시적인 실시형태가 하기에 상세히 논의된다. 특정 구현예가 논의되나, 이는 단지 설명의 목적으로 행해지는 것으로 이해되어야 한다. 관련 기술의 숙련자는 본 명세서에서 제공되는 시스템, 방법 및 특징부가 본 발명의 목적과 범주를 벗어나지 않고 사용될 수 있음을 인식할 수 있다. 또한, 본 명세서에 기재된 임의의 및 모든 참고문헌은 본 명세서에 참고로 인용될 것이다.
글루코스 탈수소효소(GDH)는 피롤로퀴놀린 퀴논(PQQ)이며, 이는 이의 PQQ 보조인자와 함께 또는 이것 없이 재조합 형태로 구입할 수 있는 박테리아 효소를 포함할 수 있다.
예시적인 실시형태에 있어서, 바이오센서는 분당 1 마이크로암페어의 변화를 측정할 수 있는 포텐시오스탯(potentiostat)을 사용하는 전기화학적 전지를 포함할 수 있으며, 전혈에 첨가되는 1 ㎍/㎖의 GDH가 미리 챔버 내에 건조시킨 페리시안화 칼륨을 함유하는 글루코스 용액을 사용하여 전기화학적으로 검출될 수 있는 것으로 추산될 수 있다. 페리시안화 칼륨은 전자의 기질로부터 전극으로의 수송을 위한 매개체로 활동할 수 있다. 또한, 이러한 이송 과정을 더욱 효율적으로 만들 수 있는 페나진 에토설페이트(PES)와 같은 제2매개체가 바이오센서의 챔버에 건조될 수 있다면, 50ng/nl만큼 적은 GDH가 동일한 포텐시오스탯을 사용하여 신뢰성 있게 검출될 수 있다.
예시적인 실시형태에 있어서, GDH가 항체의 결합 활성과 GDH 활성 둘 모두를 유지하는 방식으로 항체에 커플링(coupled)될 수 있다면, 전술한 전기화학적 검출 시스템을 사용하여, GDH와 동일한 크기의 항원에 대하여 50 ng/㎖, 또는 몰 단위로 500 pM이 검출될 수 있다. 많은 항원, 예를 들어, C 반응성 단백질 및 D 다이머에 대하여, 이는 예시적인 환자 집단에서 관찰되는 전체 농도 범위의 측정을 허용하기에 충분할 수 있다.
그러나 유용한 임상적 범위가 전술된 것보다 더 낮을 수 있는 많은 항원이 있을 수 있다. 이들에는 예를 들어, 많은 사이토카인, 갑상선 자극 호르몬(TSH)과 같은 호르몬, 및 트로포닌 I과 Pro BNP와 같은 심근경색증 마커가 포함된다. 예시적인 실시형태에 있어서, 이들은 훨씬 더 낮은 농도, 예를 들어 1-1OpM 또는 서브(sub) pM 범위로 존재할 수 있다.
예시적인 실시형태에 있어서, 이들 더 낮은 수준의 항원의 신속한 검출을 허용할 수 있는 방법이 제공될 수 있다. 이 방법은 미국 특허 출원 제11/284,097호와 유사한 형식을 사용할 수 있으나, 이를 박테리아 GDH 효소의 2가지 부가 특성과 결합시킬 수 있다. 예시적인 실시형태에 있어서, 첫번째로 보조인자 PQQ에 대한 활성이 필요할 수 있으며, 두번째로 비활성 아포-효소와 PQQ는 정상 pH 조건 하에서 재결합하여, 안정한 활성 효소를 형성할 수 있다.
메카니즘
전술한 바와 같이, 본 실시형태는 예를 들어 결합 반응을 통하여 매우 다양한 피분석물의 존재 및/또는 농도를 보고하는 데 사용될 수 있는 일회용 또는 비-일회용 생의학 스트립(strip) 또는 감지 장치에 적용가능할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 결합 반응은 함께 결합하는 적어도 2개의 화학종을 수반하는 임의의 반응을 지칭할 수 있다. 이는 경쟁적 결합 분석, 대체 결합 분석, 이중-항체 샌드위치 분석 등을 포함할 수 있다.
단지 편의의 목적으로, 이러한 바이오센서가 작동할 수 있는 메카니즘은 유체 샘플 중의 표적 항원의 존재 및/또는 농도를 시험하는 데 사용될 수 있는 반응 챔버 및 검출 챔버의 2개의 챔버를 갖는 바이오센서에 관하여 기재된다. 이것이 단지 예시의 목적으로 행해지며, 본 개시물의 범주를 제한하려는 의도가 아님이 이해된다.
바이오센서의 반응 챔버는 표적 항원에 대한 항체를 포함할 수 있다. 항체는 반응 챔버 내에 고정화될 수 있다. 반응 챔버는 고정화된 항체 및/또는 표적 항원에 결합할 수 있는 프로브 제제 분자를 포함할 수 있다. 유체 샘플 중의 표적 항원의 존재로 인해 고정화된 항체에 결합하지 않는 프로브 제제 분자는 유체 샘플과 함께 검출 챔버로 이동할 수 있다. 프로브 제제 분자는 각각 다수의 카피의 활성화제를 포함할 수 있다. 검출 챔버는 활성화제에 의해 활성화될 수 있는 검출제 분자를 포함할 수 있다. 활성화된 검출제는 검출 챔버 내에서 측정될 수 있는 신호를 생성할 수 있으며, 결과는 유체 샘플 중의 표적 항원의 존재 및/또는 농도를 정성적으로 및/또는 정량적으로 지시할 수 있다. 반응 챔버 및 검출 챔버는 유체 샘플이 제어된 방식으로 반응 챔버로부터 검출 챔버로 유동할 수 있도록 배열될 수 있다.
유체 샘플은 반응 챔버에 유입될 수 있으며, 여기에서 유체 샘플의 구성성분은 면역 반응을 겪을 수 있다. 예를 들어, 하나의 표적 항원은 하나의 고정화된 항체 및/또는 하나의 프로브 제제 분자에 결합할 수 있다. 면역 반응이 반응 챔버 내에서 발생한 후에, 적어도 일부의 프로브 제제 분자는 반응된 유체 샘플과 함께 검출 챔버로 이송될 수 있다. 검출 챔버로 유동하는 프로브 제제 분자의 수는 유체 샘플 중의 표적 항원의 존재 및/또는 농도에 따라 달라질 수 있다. 하나의 프로브 제제 분자는 다수의 카피의 활성화제를 포함할 수 있다. 하나의 활성화제 분자가 하나의 검출제 분자를 활성화시키고, 하나의 신호 유닛을 생성시킬 수 있다면, 검출 챔버로 유동하는 하나의 프로브 제제 분자는 다수의 신호 유닛을 생성할 수 있다. 이는 시험의 민감성 및/또는 정확성 및/또는 속도를 증가시킬 수 있다. 신호는 측정되고 처리되어, 표적 항원의 존재 및/또는 농도를 지시하는 결과를 생성할 수 있다.
예시적인 실시형태에 있어서, 결합 반응은 서로 결합하는 임의의 두 화학종 사이에 있을 수 있다. 프로브 제제는 검출 챔버 내에서 검출가능한 신호의 생성을 이끌 수 있는 임의의 제제일 수 있다.
특정 예시적인 실시형태의 이해를 용이하게 하기 위하여, 항체를 포함하는 결합제, 결합제에 결합할 수 있는 항원을 포함하는 표적 피분석물 및 결합제에 결합할 수 있으나 표적 피분석물에 비해 더 낮은 결합 친화도를 갖는 항원을 포함하는 프로브 제제의 한 예가 사용될 수 있다. 항체는 자기장에 의해 반응 챔버 내에 구속되는 자성 비드 상에 코팅됨으로서 고정화될 수 있다. 프로브 제제는 피롤로퀴놀린 퀴논(PQQ) 글루코스 탈수소효소(GDH)에 대한 캡슐화된 효소 보조인자를 포함할 수 있다. 보조인자는 검출 챔버 내에서 아포 GDH 효소와 결합할 수 있으며, 전기적 신호의 생성을 이끌 수 있다. 캡슐화된 입자가 예를 들어, 100개 이상의 PQQ 분자를 포함하고 이들이 각각 하나의 아포-GDH 분자에 결합하여 이를 활성화시킬 수 있다면, 자성 비드에 대한 단일의 항체-PQQ-리포솜 결합의 억제는 100개 이상의 GDH 분자의 활성화를 이끌 수 있다. 이러한 방식으로, 예를 들어, 각 리포솜이 100개의 PQQ를 함유한다면 예를 들어 5pM, 또는 각 리포솜이 1000개의 PQQ를 함유한다면, 500fM만큼 적은 항원이 검출될 수 있다.
그러나, (1) 결합제 및/또는 표적 피분석물 및/또는 프로브 제제는 예를 들어, 서로 결합할 수 있는 임의의 화학종일 수 있고, (2) 프로브 제제는 들어, 검출 챔버 내에서 검출가능한 신호를 이끌 수 있는 임의의 제제일 수 있으며, 여기에서 프로브 제제는 검출 챔버 내에서 다수의 신호 생성제 분자를 활성화시킬 수 있고, (3) 신호 검출 방법은 전기화학 및/또는 광흡수 및/또는 형광과 같은 임의의 적합한 방법일 수 있음이 명백하게 이해되어야 한다.
바이오센서
상기 장치는 반응 및 검출이 동일한 챔버 내에서 발생할 수 있는 하나의 챔버를 포함할 수 있다. 장치는 반응 챔버 및 검출 챔버의 2개의 챔버를 포함할 수 있다. 장치는 2개 초과의 챔버를 포함할 수 있다. 단지 예시로서, 장치는 반응 챔버 및 검출 챔버 외에 충전 챔버를 포함할 수 있다. 장치는 하나의 시험에서 동일하거나 상이한 검출 메카니즘에 기초하여 1개 초과의 신호가 검출될 수 있도록 1개의 반응 챔버와 2개의 검출 챔버를 포함할 수 있다. 신호는 결과의 정확성을 향상시키기 위하여 예를 들어 평균화의 방법으로 처리될 수 있다. 상이한 파라미터를 지시하는 신호가 하나의 시험에서 검출될 수 있다. 단지 예시로서, 심혈관 질환과 관련된 상이한 염증 사이토카인이 하나의 시험에서 동일한 시간에 측정될 수 있으며, 이는 질환의 상태의 더욱 정확한 예측 및/또는 모니터링을 제공할 수 있다. 장치가 2개 이상의 챔버를 갖는다면, 이들 챔버의 임의의 쌍은 서로 직접적인 유체 커뮤니케이션 상태에 있을 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "직접적인"은 챔버의 쌍이 직렬 연결 상태에 있을 수 있고/있거나 제3챔버를 통하지 않고, 직접적으로 유체를 교환할 수 있음을 지시한다. 일부 챔버는 병렬 연결 상태에 있을 수 있고/있거나 제3챔버를 통하여 유체를 교환할 수 있다. 유체 샘플이 하나의 챔버로부터 다른 챔버로 유동할 수 있는 유체 통로가 챔버의 한 쌍 사이에 있을 수 있다. 유체 통로를 통한 유동은 예를 들어, 모세관 작용, 공기압, 외력 등, 또는 이들의 임의의 조합을 통한 힘 밸런스에 의하여 제어될 수 있다.
바이오센서는 예를 들어, 일반적으로 도 1a에 나타낸 바와 같은 "V" 형상, 도 1b에 나타낸 바와 같은 "나무" 형상, 도 2-7에 나타낸 바와 같은 직사각형 형상 등과 같은 형상을 가질 수 있다. 도 1a 및 도 1b에서, 부분(8)은 반응 챔버 및/또는 검출 챔버가 위치한 곳일 수 있다.
도 2는 바이오센서의 예시적인 실례이다. 센서(20)는 반응 챔버(22), 검출 챔버(28), 챔버(22 및 28) 사이의 샘플 통로(38)를 포함할 수 있다. 배출구(30)는 검출 챔버(28)의 원위 단부에 위치할 수 있다. 반응 챔버(22)는 센서(20)의 에지(37)에서 반응 챔버(22)의 근위 단부(24)에 입구(25)를 포함할 수 있다. 접촉 영역(66)은 센서(20)의 단부에 위치할 수 있으며, 센서를 측정기(meter)(도시 생략)와 전기적으로 연결할 수 있다. 반응 챔버(22)는 대기에 대해 개방되어, 유체 샘플로 대체된 공기가 벗어날 수 있게 하는 배출구(26)를 포함할 수 있다. 유체 샘플은 이것이 챔버 배출구(26)까지 채워져, 충전이 중지될 수 있을 때까지 반응 챔버(22)로 유출될 수 있다. 반응 챔버(22)의 부피는 검출 챔버(28)의 부피와 적어도 동일하고, 바람직하게는 그보다 더 크도록 선택된다.
도 3은 도 2의 2-2 선을 따른 바이오센서의 단면도이다. 센서(20)의 중간 시트(36)는 반응 챔버(22) 및 검출 챔버(28)의 측벽을 형성하는 개구부(aperture)를 갖는다. 중간 시트(36)는 하나 이상의 부가층(32, 34) 사이에 개재되며, 부가층(32 및 34)은 반응 챔버(22)에만 해당하는 개구부를 갖는다. 검출 챔버(28)에 관하여, 층(32 및 34)은 챔버의 단부벽(60, 62)(즉, 상면 및 바닥면)을 형성할 수 있다. 검출 챔버의 단부벽(60, 62)은 연결 수단을 통해 측정 회로에 전기적으로 연결가능한 전극(54, 52)을 포함한다. 반응 챔버(22)는 하나의 내부 표면 상에 고정화된 결합제 분자(44) 및 반대편 내부 표면에 프로브 제제 분자(50)를 포함할 수 있다. 검출 챔버(28)는 전극(54, 52), 적어도 하나의 내부 표면 상에 코팅된 시약, 이를 테면 효소 기질(64) 및 챔버의 원위 단부에 배출구(30)를 포함할 수 있다. 외층(42, 46)은 센서(20)를 통해 길이 방향으로 연장되며, 처음에는 천공되지 않는다. 층(46)의 한 부분이 (56)에서 제거되어 배출구(30)가 개방될 수 있다. 배출구(56)는 예를 들어, 장치 외층의 천공, 장치 외층의 한 부분 제거 및/또는 장치 한 부분의 절취를 비롯한 다양한 방식으로 개방될 수 있다.
도 4는 바이오센서(120)의 또 다른 실시형태의 평면도이다. 센서(120)는 충전 챔버(107), 반응 챔버(122) 및 검출 챔버(128)를 포함할 수 있다. 3개의 챔버는 유체 커뮤니케이션의 면에서 직렬 연결 상태에 있다. 스크래치(106)는 검출 챔버(128)의 근위 단부 근처에 위치될 수 있다. 배출구(130)는 검출 챔버(128)의 원위 단부에 위치될 수 있다. 전기적 접촉 영역(101, 102 및 103)은 센서를 측정기에 전기적으로 연결할 수 있다.
도 5a는 도 4의 4A-4A선을 따른 바이오센서의 단면도이다. 충전 챔버(107)는 하층(134)과 스페이서층(136)의 섹션을 제거하나, 상층(132)과 실링층(sealing layer)(142)을 그대로 남겨둠으로써 형성될 수 있다. 실링층(142)은 층(134)의 외면에 접착될 수 있고, 층(134 및 136) 및 층(132)에 절단면을 제공하여, 모세관 작용에 의해 샘플을 유출시킬 수 있는 모세관 채널을 형성할 수 있다.
도 5b는 도 4의 4B-4B선을 따른 바이오센서의 단면도이다. 배출구 홀(130)은 상층(132)(또는 하층(134))의 섹션을 제거하거나 이를 천공시킴으로써, 검출 챔버(128)로 도입될 수 있다. 층(146)은 스트립의 상면에 적층되어, 개방부를 밀폐시킬 수 있다. 대안적으로, 하층(134)의 섹션이 제거된다면, 실링층(142)이 천공/제거되어, 배출구 홀(130)이 개방될 수 있다.
도 5c는 도 4의 4C-4C선을 따른 바이오센서의 단면도이다. 상층 및 하층(132, 134) 상의 전기 전도성 필름의 부분은 전기화학적 반응을 수행하기 위한 전극(152, 154)을 제공한다. 실링층(142)은 층(134)의 외면에 접착될 수 있다. 층(142)으로 덮이지 않은 층(134)의 바닥면의 부분은 센서를 측정기에 전기적으로 연결시킬 수 있는 전기적 접촉 영역을 제공할 수 있다. 반응 챔버(122) 및 검출 챔버(128)는 스페이서층(136)의 섹션을 제거하나, 상층(132) 및 하층(134)을 그대로 남겨둠으로써 형성될 수 있다.
도 5d는 도 4의 4D-4D선을 따른 바이오센서의 단면도이다. 충전 챔버(107)는 하층(134)과 스페이서층(136)의 섹션을 제거하나, 상층(132)과 실링층(142)을 그대로 남겨둠으로써 형성될 수 있다. 실링층(142)은 층(134)의 외면에 접착될 수 있다. 반응 챔버(122)는 스페이서층(136)의 한 섹션을 제거하나, 상층(132)과 하층(134)을 그대로 남겨둠으로써 형성될 수 있다. 접촉 영역(103)은 상층(132)의 전기 전도성 표면이 노출되도록, 하층(134)과 스페이서층(136)의 한 섹션을 제거함으로써 형성될 수 있다.
도 6은 바이오센서의 예시적인 실시형태이다. 바이오센서는 충전 챔버(1), 반응 챔버(2) 및 검출 챔버(3)를 포함할 수 있다. 3개의 챔버는 유체 커뮤니케이션의 면에서 직렬의 연결 상태에 있다. 스크래치(4)는 검출 챔버(3)의 근위 단부 근처에 위치될 수 있다. 배출구 홀(5)은 검출 챔버(3)의 원위 단부에 위치될 수 있다. 바이오센서는 대향 전극(6)을 포함할 수 있다.
도 7은 화학물질의 위치를 나타낸 도 4 또는 도 6의 바이오센서의 단면도이다. 반응 챔버는 상부 내면 상의 고정화된 결합제 분자 및 바닥 내면 상의 프로브 제제 분자를 포함할 수 있다. 상부 내면은 검출 챔버로 연장될 수 있는 상부 전극(1)일 수 있다. 바닥 내면은 검출 챔버로 연장될 수 있는 바닥 전극(4)을 포함할 수 있다. 결합제는 자성 비드(2) 상에 코팅될 수 있는 항원을 포함할 수 있다. 자성 비드는 센서 바닥의 자석(3)에 의해 반응 챔버 내에 구속될 수 있다. 프로브 제제는 리포솜(5) 내에 캡슐화된 PQQ 분자와 결합 파트너를 포함할 수 있다. 검출 챔버는 상부 내부 표면 상에 아포-GDH(6)와 바닥 내부 표면 상에 다른 검출 화학물질 시약(7)을 포함할 수 있다.
바이오센서를 사용하는 시험은 약 100 ㎖ 미만, 또는 약 50 ㎖ 미만, 또는 약 20 ㎖ 미만, 또는 약 10 ㎖ 미만, 또는 약 5 ㎖ 미만, 또는 약 3 ㎖ 미만, 또는 약 2 ㎖ 미만, 또는 약 1 ㎖ 미만, 또는 500 ㎕ 미만, 또는 약 200 ㎕ 미만, 또는 약 100 ㎕ 미만, 또는 약 50 ㎕ 미만, 또는 약 10 ㎕ 미만, 또는 약 1 ㎕ 미만, 또는 약 0.5 ㎕ 미만, 또는 약 0.3 ㎕ 미만, 또는 약 0.1 ㎕ 미만의 유체 샘플을 사용할 수 있다.
바이오센서는 적어도 하나의 반응 챔버를 포함할 수 있다. 반응 챔버는 근위 단부와 원위 단부를 가질 수 있다. 유체 샘플은 근위 단부로부터 반응 챔버로 유입될 수 있으며, 원위 단부로부터 유체 통로를 통해 반응 챔버를 빠져나오고/빠져나오거나 검출 챔버로 유동할 수 있다.
반응 챔버는 반응 챔버의 외부 및/또는 내부를 형성할 수 있는 적어도 하나의 벽을 포함할 수 있다. 반응 챔버의 적어도 하나의 벽은 예를 들어 폴리에스터, 폴리스타이렌, 폴리카보네이트, 폴리올레핀, 폴리에틸렌, 테레프탈레이트 또는 이들의 혼합물과 같은 재료를 포함할 수 있다. 반응 챔버의 적어도 하나의 벽은 예를 들어, 이산화 타이타늄, 탄소, 실리카, 유리 및 이들의 혼합물과 같은 충전재(filler)를 포함할 수 있다.
반응 챔버는 적어도 일부가 유체 샘플에 접근가능할 수 있는 소정의 부피를 갖는 내부를 포함할 수 있다. 상기 부피는 약 100 ㎖ 미만, 또는 약 50 ㎖ 미만, 또는 약 20 ㎖ 미만, 또는 약 10 ㎖ 미만, 또는 약 5 ㎖ 미만, 또는 약 3 ㎖ 미만, 또는 약 2 ㎖ 미만, 또는 약 1 ㎖ 미만, 또는 500 ㎕ 미만, 또는 약 200 ㎕ 미만, 또는 약 100 ㎕ 미만, 또는 약 50 ㎕ 미만, 또는 약 10 ㎕ 미만, 또는 약 1 ㎕ 미만, 또는 약 0.5 ㎕ 미만, 또는 약 0.3 ㎕ 미만, 또는 약 0.1 ㎕ 미만일 수 있다. 반응 챔버의 내부는 정사각형, 직사각형, 원형, 타원형, 삼각형, 장사방형, 사다리꼴(trapezoidal) 등의 단면 형상을 포함할 수 있다. 단면은 반응 챔버 내에서 유체 샘플의 대량 유동 방향에 수직일 수 있다. 단면은 대량 유동의 방향에 따라 크기 및/또는 형상이 균일할 수 있다. 단면은 대량 유동의 방향에 따라 가변적일 수 있다. 단지 예시로서, 단면은 대량 유동의 방향을 따라 점점 가늘어질 수 있다.
반응 챔버는 모세관 거리(h1)를 포함할 수 있다. 모세관 거리는 유체 샘플에 대한 모세관력의 크기를 결정하는 반응 챔버의 직경 및/또는 이의 단면을 지칭할 수 있다. 모세관 거리는 반응 챔버 내부의 가장 작은 직경일 수 있다. 모세관력의 크기는 모세관 거리와 역으로 관계될 수 있다. 모세관 거리는 약 1 ㎝ 미만, 또는 약 5 ㎜ 미만, 또는 약 2 ㎜ 미만, 또는 약 1 ㎜ 미만, 또는 약 500 ㎛ 미만, 또는 약 200 ㎛ 미만 및 약 100 ㎛ 미만, 또는 약 50 ㎛ 미만일 수 있다. 바이오센서가 유체 샘플을 장치의 상이한 챔버 사이에 또는 중간에 이송시키는 외력을 생성할 수 있는 사용자 및/또는 이러한 장치를 갖는 사용자에 의해 사용되는 경우, 장치 및/또는 이의 챔버는 더 큰 직경을 포함할 수 있다. 단지 예시로서, 바이오센서는 약 100 ㎝ 미만, 또는 약 50 ㎝ 미만, 또는 약 20 ㎝ 미만, 또는 약 10 ㎝ 미만, 또는 약 5 ㎝ 미만, 또는 약 1 ㎝ 미만의 특징적인 길이를 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 특징적인 길이는 반응 챔버의 전체 단면을 둘러싸는 가장 작은 원의 직경을 지칭한다.
반응 챔버의 내부는 적어도 하나의 내부 표면을 포함할 수 있다. 내부 표면(들)은 반응 챔버의 내부의 단면 형상 및/또는 부피를 형성할 수 있는 내벽(들)을 포함할 수 있다. 내벽(들)은 고체 재료, 섬유질 재료, 세공(macroporous) 재료, 분말형 재료 등, 또는 이들의 임의의 조합물을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 내부 표면(들)은 반응 챔버 내에서 적어도 하나의 독립적인 지지 부재의 내부 표면(들)을 포함할 수 있다. 적합한 지지 부재는 고체 재료, 망상(mesh) 재료, 섬유질 재료, 다공성 재료, 분말형 재료 또는 소정의 재료의 비드, 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 망상 재료는 예를 들어, 폴리올레핀, 폴리에스터, 나일론, 셀룰로스, 폴리스타이렌, 폴리카보네이트, 폴리설폰 또는 이들의 혼합물과 같은 폴리머를 포함할 수 있다. 섬유질 재료는 예를 들어, 폴리올레핀, 폴리에스터, 나일론, 셀룰로스, 폴리스타이렌, 폴리카보네이트, 폴리설폰 또는 이들의 혼합물과 같은 폴리머를 포함할 수 있다. 다공성 재료는 예를 들어, 소결 분말 또는 대공극 막을 포함할 수 있다. 대공극 막은 예를 들어, 폴리설폰, 폴리바이닐리덴 다이플루오라이드, 나일론, 셀룰로스 아세테이트, 폴리메타크릴레이트, 폴리아크릴레이트, 또는 이들의 혼합물과 같은 폴리머 재료를 포함할 수 있다. 비드 재료는 적합한 지지 부재가 예를 들어 결합제와 같은 시약에 대해 제공될 수 있도록 선택될 수 있다. 적합한 비드는 노르웨이 오슬로의 다이날 바이오테크(Dynal Biotech)에 의해 상표명 DYNABEADS.RTM으로 판매되는 것들을 포함할 수 있다. 비드는 예를 들어 자성 비드를 포함할 수 있다. 지지 부재는 적어도 하나의 다음의 이점을 가질 수 있다. 첫번째로, 이는 예를 들어, 결합제, 프로브 제제와 같은 시약이 부착될 수 있고/있거나 반응 챔버 내에서 결합 반응이 발생할 수 있는 표면 면적을 증가시킬 수 있다. 이는 반응 시간 및/또는 바람직하지 않은 과정(예를 들어, 오염, 응고 등)이 발생할 기회를 감소시킬 수 있다. 두번째로, 이는 반응 챔버의 모세관 거리를 줄임으로써 유체 샘플에 대한 모세관력을 증가시킬 수 있다. 반응 챔버는 대기에 대해 개방되는 배출구를 포함하여, 샘플로 대체된 공기가 벗어나도록 할 수 있다. 유체 샘플은 반응 챔버가 반응 챔버 배출구까지 채워져, 충전이 중지될 수 있을 때까지, 반응 챔버로 유출될 수 있다. 검출 챔버의 부피는 반응 챔버의 부피와 대략 동일하고, 바람직하게는 이보다 더 작도록 선택될 수 있다. 검출 챔버의 부피는 반응 챔버 부피의 약 100%, 또는 약 95%, 또는 약 90%, 또는 약 85%, 또는 약 80%, 또는 약 75%, 또는 약 70%, 또는 약 60%, 또는 약 50% 미만일 수 있다.
반응 챔버는 결합제 및 프로브 제제를 포함할 수 있다. 결합제 및 프로브 제제의 상대량은 프로브 제제에 대하여 약간 과량의 결합제가 있도록 선택될 수 있다. 이러한 문맥에서, 약간 과량은 과량이 유체 샘플 내에서 검출될 표적 피분석물의 양에 비해 작은 것으로 정의될 수 있다. 예를 들어, 과량은 유체 샘플 중에 예상되는 표적 피분석물의 평균량의 약 40% 미만, 또는 약 30% 미만, 또는 약 25% 미만, 또는 약 20% 미만, 또는 약 15% 미만, 또는 약 10% 미만, 또는 약 5% 미만, 또는 약 3% 미만, 또는 약 2% 미만, 또는 약 1% 미만을 포함할 수 있다. 표적 피분석물의 평균량은 예를 들어, 표적 병리학적 증상이 있는 및/또는 증상이 없는 대상 집단에 대해 추산될 수 있다.
결합제는 반응 도중에 결합제와 이들에 결합되는 화학종이 시험 내내 반응 챔버 내에 남아있을 수 있도록, 반응 챔버 내의 적어도 하나의 내부 표면 상에 고정화될 수 있다. 프로브 제제는 반응 챔버 내에서 적어도 하나의 내부 표면 상에 지지될 수 있다. 고정화된 결합제 분자에 직접적으로 또는 간접적으로 결합되지 않은 프로브 제제 분자는 유체 샘플과 함께 검출 챔버로 이동할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "직접적으로"는 프로브 제제 분자의 일부가 결합제 분자의 일부, 예를 들어 결합 부위에 결합하는 것을 의미하며; "간접적으로"는 프로브 제제가 또 다른 제제, 예를 들어 표적 피분석물에 결합하며, 이것이 고정화된 결합제에 직접적으로 또는 간접적으로 결합하는 것을 의미한다.
결합제는 화학적 결합을 통해 반응 챔버의 적어도 하나의 내부 표면에 흡수되거나 다르게는 고정화될 수 있다. 결합제는 시험 내내 반응 챔버 내에 구속될 수 있는 비드에 코팅될 수 있다. 단지 예시로서, 비드는 자성 비드일 수 있고, 바이오센서는 반응 챔버 내에서 결합제의 코팅을 갖는 자성 비드를 구속하기 위한 자기장을 포함할 수 있다. 예를 들어, 반응 챔버 아래의 자석은 자성 비드와, 비드 상에 코팅된 결합제 및 결합제 분자에 결합된 프로브 제제 분자와 같이 비드에 직접적으로 또는 간접적으로 결합될 수 있는 임의의 화학종의 이송을 방지할 수 있다. 결과적으로, 예시적인 실시 형태에 있어서, 자성 비드에 결합되지 않은 프로브 제제 분자가 검출 챔버 내에서 측정될 수 있다. 유체 샘플 중의 표적 피분석물의 양 및/또는 농도는 예를 들어, 검출 챔버로 방출될 수 있는 프로브 제제의 양/농도와 관련될 수 있다.
프로브 제제는 결합 파트너와 비히클을 포함할 수 있다. 결합 파트너는 비히클의 표면에 결합될 수 있다. 비히클은 적어도 하나의 카피의 활성화제를 포함할 수 있다. 결합 파트너는 프로브 제제 분자가 고정화된 결합제 분자, 또는 고정화된 결합제 분자에 결합하지 않은 유리 표적 피분석물, 또는 고정화된 결합제 분자에 결합된 표적 피분석물에 결합하는 것을 촉진시킬 수 있다. 적어도 하나의 카피의 활성화제는 비히클 상에 표면 코팅되거나, 비히클 내에 캡슐화될 수 있다.
프로브 제제 분자는 반응 챔버의 적어도 하나의 내부 표면 상에 지지될 수 있다. 반응 챔버의 내부 표면 및 프로브 제제 분자의 코팅 방법은 프로브 제제 분자와 내부 표면 사이에 오직 약한 결합만이 존재할 수 있도록 선택될 수 있다. 이러한 방식으로, 내부 표면이 샘플에 의해 적셔지는 경우, 프로브 제제 분자가 샘플로 유리될 수 있다. 프로브 제제 분자의 내부 표면으로부터의 용해 속도는 샘플을 반응 챔버에 채우는 데 걸리는 시간 동안에 용해가 거의 발생하지 않도록 선택될 수 있다. 이러한 방식으로, 프로브 제제 분자는 충전 후에 반응 챔버의 영역 도처에 고르게 분포될 수 있다. 프로브 제제 분자가 지지되는 내부 표면(들)은 결합제 분자가 고정화되는 내부 표면(들)과 동일하거나 상이할 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 유체 샘플을 반응 챔버에 채우고 프로브 제제 분자가 용해되기 전에 프로브 제제 분자는 결합제 분자로부터 분리되고/되거나 이에 결합되지 않을 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 프로브 제제 분자는 반응 챔버 내에서 유체 샘플에 의해 용해된 후에, 고정화된 제제 분자에 표적 피분석물에 비해 더 낮은 결합 친화도로 결합하여, 경쟁 분석을 형성할 수 있다. 이의 결합 파트너를 통한 고정화된 결합제 분자에 대한 프로브 제제 분자의 더 낮은 결합 친화도는 하기의 이유 중 적어도 하나 때문일 수 있다. 첫번째로, 프로브 제제 분자는 프로브 제제 분자의 결합 파트너에 연결된 비히클 및/또는 결합 파트너 그 자체의 표적 피분석물보다 더 큰 크기 때문에, 표적 피분석물에 비해 더 큰 크기를 포함할 수 있다. 두번째로, 프로브 제제 분자의 결합 파트너는 프로브 제제 분자가 결합 파트너를 통해, 감소된 결합 친화도로 고정화된 결합제 분자에 결합할 수 있도록 화학적으로 또는 다르게 변형된 버전의 표적 피분석물일 수 있다. 프로브 제제 분자의 내부 결합 반응속도론은 또한 프로브 제제 분자가 고정화된 결합제 분자에 도달하는 데 유체 샘플 중의 표적 피분석물보다 더 오래 걸릴 수 있는 것으로부터 야기될 수 있으며, 이는 프로브 제제 분자가 먼저 유체 샘플에 의해 용해되어야 하기 때문이고/때문이거나 프로브 제제 분자가 표적 피분석물보다 더 큰 크기 때문에 유체 샘플 중에서 더 천천히 이동할 수 있기 때문이다. 이러한 방식에서, 유체 샘플 중의 표적 피분석물의 양/농도는 프로브 제제가 정성적으로 및/또는 정량적으로 측정될 수 있는 검출 챔버에 방출되는 프로브 제제의 양/농도와 긍정적으로 관련될 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 프로브 제제 분자는 반응 챔버 내에서 유체 샘플에 의해 용해된 후에, 표적 피분석물에 결합할 수 있으며, 샌드위치 분석 또는 경쟁적 결합 분석을 형성한다. 샌드위치 분석은 표적 피분석물이 고정화된 결합제 분자에 결합된 후에, 프로브 제제 분자가 표적 피분석물에 결합할 수 있는 경우 형성될 수 있다. 이러한 방식에서, 유체 샘플 중의 표적 피분석물의 양/농도는 프로브 제제 분자가 정성적으로 및/또는 정량적으로 측정될 수 있는 검출 챔버에 방출되는 프로브 제제 분자의 양/농도와 역으로 관련될 수 있다. 프로브 제제 분자는 반응 챔버 내에서 유체 샘플에 의해 용해되는 때 프로브 제제 분자가 고정화된 결합제 분자에 결합하는 것보다 더 높은 결합 친화도로 유리 표적 피분석물에 결합할 수 있다면 경쟁적 결합 분석이 형성될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 유리 표적 피분석물은 고정화된 결합제 분자에 결합되지 않은 표적 피분석물을 지칭한다. 이러한 방식에서, 유체 샘플 중의 표적 피분석물의 양/농도는 프로브 제제 분자가 정성적으로 및/또는 정량적으로 측정될 수 있는 검출 챔버로 방출되는 프로브 제제의 양/농도와 긍정적으로 관련될 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 프로브 제제 분자는 바이오센서가 제작되는 때 및/또는 이러한 바이오센서를 사용하는 유체 샘플의 시험 전에 고정화된 결합제 분자에 결합될 수 있다. 이러한 프로브 제제 분자의 결합 파트너는 슈도(pseudo)-피분석물, 변형된 피분석물 등을 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 슈도 피분석물은 고정화된 결합제 분자에 결합할 수 있으나, 표적 피분석물만큼 강하지는 않은 것을 포함할 수 있다. 단지 예시로서, 표적 피분석물이 인간 단백질이라면, 적합한 슈도-피분석물은 개 단백질 또는 돼지 단백질과 같은 동물 버전의 동일한 단백질을 포함할 수 있다. 변형된 피분석물은 결합제 분자에 대한 결합 친화도가 감소되도록 화학적으로 또는 다르게 변형된 것을 포함할 수 있다. 결합 파트너를 통한 고정화된 결합제 분자에 대한 프로브 제제 분자의 결합 친화도는 표적 피분석물의 결합 친화도보다 더 낮을 수 있다. 그의 결합 파트너를 통한 고정화된 결합제 분자에 대한 프로브 제제 분자의 더 낮은 결합 친화도는 다음의 이유 중 적어도 하나 때문일 수 있다. 첫번째로, 프로브 제제는 프로브 분자의 결합 파트너에 연결된 비히클 및/또는 결합 파트너 그 자체의 더 큰 크기 때문에, 표적 피분석물에 비해 더 큰 크기를 포함할 수 있다. 두번째로, 프로브 제제 분자의 결합 파트너는 프로브 분자가 결합 파트너를 통해 고정화된 결합제 분자에 감소된 결합 친화도로 결합될 수 있도록 화학적으로 또는 다르게 변형된 버전 또는 상이한 버전(예를 들어, 인간 피분석물의 동물 버전)의 표적 피분석물일 수 있다. 프로브 제제 분자가 반응 챔버 내에서 유체 샘플에 용해된 후에, 이는 더 낮은 결합 친화도 때문에, 결합제 분자로부터 표적 피분석물에 의해 대체될 수 있다. 이러한 방식에서, 유체 샘플 중의 표적 피분석물의 양/농도는 대체되어, 프로브 제제 분자가 정성적으로 및/또는 정량적으로 측정될 수 있는 검출 챔버로 방출되는 프로브 제제 분자의 양/농도와 긍정적으로 관련될 수 있다.
프로브 제제 분자는 비히클을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 비히클은 예를 들어, 방사성 동위원소, 발색단, 또는 형광단과 같은 적어도 하나의 표지 분자를 포함할 수 있다. 비히클은 적어도 약 10개의 표지 분자, 또는 적어도 약 50개의 표지 분자, 또는 적어도 약 100개의 표지 분자, 또는 적어도 약 200개의 표지 분자, 또는 적어도 약 500개의 표지 분자, 또는 적어도 약 1,000개의 표지 분자, 또는 적어도 약 5,000개의 표지 분자, 또는 적어도 약 10,000개의 표지 분자, 또는 적어도 약 50,000개의 표지 분자, 또는 적어도 약 100,000개의 표지 분자를 포함할 수 있다. 표지 분자(들)는 비히클의 표면 상에 코팅되거나 비히클 내에 캡슐화될 수 있다. 비히클은 지질성 입자를 포함할 수 있다. 표지 분자(들)는 지질성 입자 내에 캡슐화될 수 있다. 지질성 입자는 리포솜, 소포, 세포 소기관 등으로부터 선택되는 하나의 입자를 포함할 수 있다. 비히클은 폴리머를 포함할 수 있다. 활성화제 분자는 폴리머의 표면에 결합될 수 있다. 폴리머는 덴드리머 등을 포함할 수 있다.
다른 실시형태에 있어서, 비히클은 적어도 하나의 카피의 활성화제를 포함할 수 있다. 비히클은 다수의 카피의 활성화제를 포함할 수 있다. 비히클은 적어도 약 5 카피, 또는 적어도 약 10 카피, 또는 적어도 약 50 카피, 또는 적어도 약 100 카피, 또는 적어도 약 200 카피, 또는 적어도 약 500 카피, 또는 적어도 약 1,000 카피, 또는 적어도 약 5,000 카피, 또는 적어도 약 10,000 카피, 또는 적어도 약 50,000 카피, 또는 적어도 약 100,000 카피의 활성화제를 포함할 수 있다. 활성화제 분자는 비히클의 표면 상에 코팅되거나 비히클 내에 캡슐화될 수 있다. 비히클은 지질성 분자를 포함할 수 있다. 활성화제 분자는 지질성 입자 내에 캡슐화될 수 있다. 지질성 입자는 리포솜, 소포, 세포 소기관 등으로부터 선택되는 하나의 입자를 포함할 수 있다. 비히클은 폴리머를 포함할 수 있다. 활성화제 분자는 폴리머의 표면에 결합될 수 있다. 폴리머는 덴드리머 등을 포함할 수 있다.
활성화제 분자는 신호가 생성되고 검출될 수 있도록 검출 챔버 내에서 검출제 분자를 활성화시킬 수 있다. 단지 예시로서, 검출제는 효소를 포함할 수 있으며, 활성화제는 효소를 활성화시킬 수 있는 보조인자를 포함할 수 있다. 더욱 구체적인 예로서, 검출제는 아포-효소를 포함할 수 있으며, 활성화제는 상응하는 보조인자를 포함할 수 있다. 아포-효소 및 보조인자 쌍은 아포-글루코스 산화효소 및 플라빈 아데닌 다이뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 아포-효소 및 보조인자 쌍은 아포-글루코스 탈수소효소 및 PQQ를 포함할 수 있다.
반응 챔버는 결합제 및 프로브 제제 외에, 예를 들어, 블로킹제, 불활성화제 또는 이들의 임의의 조합물과 같은 다른 제제를 포함할 수 있다.
블로킹제는 반응 챔버 내에서 고정화된 결합제, 프로브 제제 및/또는 내부 표면(들)에 대한 제제의 비-특이적인 결합을 차단할 수 있다. 제제는 예를 들어, 단백질 또는 지질성 입자와 같이 시험할 유체 샘플 중에 존재하는 적어도 하나를 포함할 수 있다. 지질성 입자는 리포솜, 소포, 세포 소기관 등으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 블로킹제는 블로킹 단백질 및 계면활성제로부터 선택되는 적어도 하나의 제제를 포함할 수 있다. 블로킹 단백질은 예를 들어, 소 혈청 단백질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 미국 펜실베이니아 주 필라델피아 소재의 롬앤하스사(Rohm & Haas)에 의해 제조되는 TRITON X100, 또는 미국 델라웨어 주 윌밍턴 소재의 아이씨아이 아메리카즈사(ICI Americas)에 의해 제조되는 TWEEN과 같은 비이온성 계면활성제가 또한 이러한 제제로서 사용될 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 선택되는 비이온성 계면활성제는 단백질을 변성시키지 않는다. 블로킹제는 결합제 분자가 고정화되고/되거나 프로브 제제 분자가 지지되고/되거나 결합제 분자도 프로브 제제 분자도 코팅되지 않은 것을 포함하는 반응 챔버의 임의의 내부 표면(들)에 코팅될 수 있다. 블로킹제 및 이들에 결합하는 제제는 시험 중에 반응 챔버 내에 구속될 수 있다. 이는 결합제 분자를 반응 챔버 내에 고정화시킬 수 있는 임의의 방법에 의해 달성될 수 있다. 단지 예시로서, 결합제는 반응 챔버의 다공성 내부 표면에 흡수될 수 있다.
불활성화제는 미결합 또는 미캡슐화된 활성화제에 결합할 수 있다. 이는 시험의 정확성 및/또는 타당성을 저하시킬 수 있는, 미결합 또는 미캡슐화된 활성화제가 검출 챔버로 이동하고, 유체 샘플 중의 표적 피분석물의 존재와 독립적인 방식으로 검출제를 활성화시키는 것을 방지할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "미결합" 또는 "미캡슐화"는 비히클(및 프로브 제제)이 반응 챔버 내에 있을 때 및/또는 비히클(및 프로브 제제)이 반응된 유체 샘플과 함께 검출 챔버로 이동하기 전에, 비히클에 결합되지 않는, 비히클 내에 캡슐화되지 않는, 다르게는 비히클에 통합되지 않는 것을 의미한다. 이는 pH, 온도 등과 같은 특정 조건 하에서의 제조, 보관, 또는 시험 중에, 활성화제 분자가 누설, 또는 파열, 또는 이탈되게 할 수 있는 프로브 제제의 비히클로부터 야기될 수 있다. 불활성화제는 미결합 또는 미캡슐화된 활성화제에 결합할 수 있는 임의의 제제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 활성화제가 아포-효소에 결합할 수 있는 보조인자를 포함한다면, 불활성화제는 아포-효소를 포함할 수 있다. 불활성화제 분자는 반응 챔버의 내부 표면 상에 고정화될 수 있다. 그러므로, 그들에 결합된 활성화제 분자는 시험 중에 반응 챔버 내에 구속될 수 있다. 이는 유체 샘플 중의 표적 피분석물의 존재 및/또는 양과 독립적인 방식으로 검출 챔버로 이동할 수 있는 미결합 또는 미캡슐화 활성화제 분자의 양을 감소시킬 수 있다. 불활성화제 분자는 결합제 분자를 반응 챔버 내에 고정화시킬 수 있는 임의의 방법에 의해 고정화될 수 있다. 단지 예시로서, 불활성화제 분자는 이들을 자성 비드에 결합시킴으로써 반응 챔버 내에 고정화될 수 있고, 자성 비드는 자기장에 의해 반응 챔버 내에 구속될 수 있다.
반응 챔버는 예를 들어, 해당 반응 챔버 내에서 유체 샘플의 pH를 조정할 수 있는 완충액을 포함할 수 있다. 완충액은 제조 및/또는 보관 중에 반응 챔버 내에서 시약 중 적어도 하나를 안정화시킬 수 있다. 완충액은 포스페이트, 시트레이트, 시트라코네이트, 멜리테이트, 트리스, PIPES, MOPS, HEPES, 프탈레이트, 이미다졸로부터 선택되는 물질을 포함할 수 있다
반응 챔버 내에서의 반응은 약 0.1초 내지 약 60분, 또는 약 1초 내지 약 30분, 또는 약 10초 내지 약 25분, 또는 약 20초 내지 약 20분, 또는 약 30초 내지 약 15분, 또는 약 1분 내지 약 10분, 또는 약 2분 내지 약 8분, 또는 약 3분 내지 약 5분이 걸릴 수 있다.
장치는 적어도 하나의 검출 챔버를 포함할 수 있다. 검출 챔버는 근위 단부와 원위 단부를 가질 수 있다. 유체 샘플이 반응 챔버 내에서 반응을 완료한 후에, 반응 챔버의 원위 단부로부터 반응 챔버를 빠져나오는 반응된 유체 샘플은 샘플 통로를 통해 검출 챔버의 근위 단부로부터 검출 챔버에 유입될 수 있다. 검출 챔버는 이것이 검출 챔버로 이송되는 프로브 제제 분자의 존재 및/또는 양에 의존적인 방식으로 검출 챔버 내에 생성되는 신호를 검출할 수 있도록 구성될 수 있다.
검출 챔버는 검출 챔버의 외부 및/또는 내부를 형성할 수 있는 적어도 하나의 벽을 포함할 수 있다. 검출 챔버의 적어도 하나의 벽은 충전재를 포함할 수 있다. 검출 챔버의 적어도 하나의 벽 및 충전재의 설계는 반응 챔버의 벽 및 충전재와 유사할 수 있다.
검출 챔버는 소정의 부피를 갖는 내부를 포함할 수 있으며, 이의 적어도 일부는 유체 샘플에 접근가능할 수 있다. 상기 부피는 약 100 ㎖ 미만, 또는 약 50 ㎖ 미만, 또는 약 20 ㎖ 미만, 또는 약 10 ㎖ 미만, 또는 약 5 ㎖ 미만, 또는 약 3 ㎖ 미만, 또는 약 2 ㎖ 미만, 또는 약 1 ㎖ 미만, 또는 500 ㎕ 미만, 또는 약 200 ㎕ 미만, 또는 약 100 ㎕ 미만, 또는 약 50 ㎕ 미만, 또는 약 10 ㎕ 미만, 또는 약 1 ㎕ 미만, 또는 약 0.5 ㎕ 미만, 또는 약 0.3 ㎕ 미만, 또는 약 0.1 ㎕ 미만일 수 있다. 검출 챔버의 내부는 정사각형, 직사각형, 원형, 타원형, 삼각형, 장사방형, 사다리꼴 등의 단면 형상을 포함할 수 있다. 단면은 검출 챔버 내에서 유체 샘플의 대량 유동 방향에 수직일 수 있다. 단면은 대량 유동의 방향에 따라 크기 및/또는 형상이 균일할 수 있다. 단면은 대량 유동의 방향에 따라 가변적일 수 있다. 단지 예시로서, 단면은 대량 유동의 방향을 따라 점점 가늘어질 수 있다.
검출 챔버는 모세관 거리(h2)를 포함할 수 있다. 모세관력의 크기는 모세관 거리와 역으로 관계될 수 있다. 모세관 거리는 약 1 ㎝ 미만, 또는 약 5 ㎜ 미만, 또는 약 2 ㎜ 미만, 또는 약 1 ㎜ 미만, 또는 약 500 ㎛ 미만, 또는 약 200 ㎛ 미만 및 약 100 ㎛ 미만, 또는 약 50 ㎛ 미만일 수 있다. 검출 챔버의 모세관 거리(h2)는 반응 챔버의 모세관 거리(h1)보다 더 작을 수 있다. 바이오센서가 유체 샘플을 장치의 상이한 챔버 사이에 또는 그 중간에 이송하는 외력을 생성할 수 있는 사용자 및/또는 이러한 장치를 갖는 사용자에 의해 사용되는 경우, 장치 및/또는 이의 챔버는 더 큰 직경을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 외력은 검출 챔버 내에서 배출구를 개방하기 위해 사용자에 의해 생성되는 힘을 포함하지 않는다. 단지 예시로서, 장치는 약 100 ㎝ 미만, 또는 약 50 ㎝ 미만, 또는 약 20 ㎝ 미만, 또는 약 10 ㎝ 미만, 또는 약 5 ㎝ 미만, 또는 약 1 ㎝ 미만의 특징적인 길이를 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 특징적인 길이는 검출 챔버의 전체 단면을 둘러싸는 가장 작은 원의 직경을 지칭한다.
검출 챔버의 내부는 적어도 하나의 내부 표면을 포함할 수 있다. 내부 표면(들)은 검출 챔버의 내부의 단면 형상 및/또는 부피를 형성할 수 있는 내벽(들)을 포함할 수 있다. 내부 표면(들)은 검출 챔버 내에서 적어도 하나의 독립적인 지지 부재의 내부 표면(들)을 포함할 수 있다. 검출 챔버의 내벽(들) 및/또는 독립적인 지지 부재는 반응 챔버의 것(들)과 유사할 수 있다.
검출 챔버는 대기에 대해 개방될 수 있는 배출구를 포함할 수 있다. 배출구는 검출 챔버의 원위 단부에 존재할 수 있다. 예시적인 구성은 도 2에서 배출구(30) 및 도 4에서 배출구(130)로 나타내었다. 배출구는 처음에는 폐쇄될 수 있다. 이러한 방식에서, 반응 챔버가 유체 샘플로 채워질 때 검출 챔버에 대한 샘플 통로는 검출 챔버 내에 트랩핑된 공기에 의해 생성된 공기압에 의해 차단될 수 있다. 이러한 공기압은 실질적으로 유체 샘플이 검출 챔버에 충전되는 것을 막을 수 있다. 샘플이 검출 챔버에 대한 샘플 통로와 처음 접촉하는 시간과 샘플이 샘플 통로의 먼 쪽과 접촉하는 시간 사이의 시간 중에 소량의 샘플이 검출 챔버에 유입될 수 있다. 샘플이 검출 챔버에 대한 샘플 통로 도처를 아주 적실 때, 검출 챔버의 충전은 중지될 수 있다. 반응 챔버의 부피는 검출 챔버의 부피와 적어도 동일하고 바람직하게는 이보다 더 크도록 선택될 수 있다. 검출 챔버 내의 배출구를 대기에 개방함으로써, 샘플이 이송되어, 검출 챔버를 채울 수 있다. 배출구는 예를 들어, 장치 천공, 외층 제거 및/또는 장치 일부분 절취(즉, 절취선을 따른 절취)에 의해서와 같이 개방될 수 있다. 단지 예시로서, 배출구는 장치에 연결된 측정기에서 사용자 또는 솔레노이드(solenoid)에 의해 제어되는 바늘을 사용하여 개방될 수 있다. 배출구의 개방은 샘플에 의해 대체되고, 검출 챔버 내에 트랩핑된 공기가 벗어나도록 할 수 있으며, 이에 따라 유체 샘플을 검출 챔버에 충전하는 것을 방지할 수 있는 공기압을 감소시킬 수 있다. 장치는 검출 챔버 내에서의 유체 샘플에 대한 모세관력이 반응 챔버에 존재하는 것보다 더 높도록 구성될 수 있다. 증가된 모세관력은 반응 챔버 및 검출 챔버의 내부 표면의 적합한 코팅에 의해 및/또는 검출 챔버에 대한 모세관 거리(h2)가 반응 챔버의 모세관 거리(h1)보다 더 작도록 선택함으로써 제공될 수 있다. 이 방식으로, 유체 샘플은 사용자에 의해, 또는 예를 들어 펌프 또는 주사기와 같은 외부 장치에 의해 생성되는 임의의 다른 외력의 필요 없이, 배출구를 개방함으로써 검출 챔버로 간단히 유출시킬 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, (반응된) 유체 샘플에 의한 검출 챔버의 충전은 사용자, 또는 펌프, 주사기 또는 이들의 임의의 조합과 같은 외부 장치에 의해 생성되는 외력에 의해 제어될 수 있다. 외력은 또한 모세관력 외에 반응 챔버로부터 검출 챔버로 유체 샘플을 이동시키는 보충력으로서 공급될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 외력은 예를 들어 천공에 의해 검출 챔버 내에 배출구를 개방하기 위해 사용자에 의해 생성되는 힘을 포함하지 않는다.
프로브 제제 분자는 반응된 유체 샘플과 함께 검출 챔버로 이송될 수 있다. 검출 챔버 내에서 프로브 제제 분자의 존재는 예를 들어, 방사성 동위원소, 발색단, 또는 형광단과 같은 표지 분자에 의해 생성되는 신호에 의해 정성적으로 및/또는 정량적으로 검출될 수 있다. 검출 챔버의 적어도 하나의 벽은 이러한 표지 분자에 의해 생성된 신호에 투과가능할 수 있다. 단지 예시로서, 적어도 하나의 검출 챔버 벽은 방사성 동위원소에 의해 방출되거나 흡수되는 방사선을 통과할 수 있고, 방사성은 검출 챔버 내의 프로브 제제 분자의 존재 또는 부재를 가리킬 수 있다.
검출 챔버 내의 프로브 제제 분자의 존재는 전기화학적 반응에 의해 정성적으로 및/또는 정량적으로 검출될 수 있다. 이러한 실시형태에 있어서, 검출 챔버는 적어도 2개의 대향하는 전극, 적어도 1개의 감지(sensing)/작동 전극 및 적어도 1개의 상대(counter)/기준 전극을 포함할 수 있는 전기화학적 전지를 포함할 수 있다. 반응된 유체 샘플 중의 프로브 제제 분자의 존재를 결정하는 단계는 전기화학적 전지에서 감지/작동 전극과 상대/기준 전극 사이에 전위를 인가하는 단계; 및 검출 챔버 내의 반응된 유체 샘플 중의 프로브 제제의 정성적 및/또는 정량적 지표일 수 있는 전류를 측정하는 단계를 포함할 수 있으며, 이는 유체 샘플 중의 표적 피분석물의 정성적 및/또는 정량적 지표일 수 있다.
감지 전극은 산화방지제 경우에는 환원된 산화환원제, 또는 산화제 경우에는 산화된 산화환원제의 양에 민감성일 수 있다. 감지 전극의 전위가 존재하는 피분석물의 수준을 가리키는 전위측정식(potentiometric) 센서의 경우에, 적어도 하나의 다른 전극이 기준 전극으로서 작동하여, 기준 전위를 제공할 수 있다. 감지 전극 전류가 샘플 중의 피분석물의 수준을 가리키는 전류측정식(amperometric) 센서의 경우에, 적어도 하나의 다른 전극이 상대 전극으로 작동하여, 전기 회로 및/또는 기준 전극을 완성할 수 있다. 대안적으로, 상대 전극과 기준 전극은 2개의 별개의 전극일 수 있다.
전극 중 적어도 하나는 예를 들어, 알루미늄, 구리, 니켈, 크롬, 강철, 스테인리스강, 팔라듐, 백금, 금, 이리듐, 탄소, 결합제와 혼합된 탄소, 산화 인듐, 산화 주석, 전도성 폴리머, 또는 이들의 혼합물과 같은 전기 전도성 재료를 포함할 수 있다. 전기화학 전지에서 캐소드(cathod)는 예를 들어, 알루미늄, 구리, 니켈, 크롬, 강철, 스테인리스강, 백금, 팔라듐, 탄소, 결합제와 혼합된 탄소, 산화 인듐, 산화 주석, 혼합형 산화 인듐/산화 주석, 금, 은, 이리듐, 전도성 폴리머 등, 또는 이들의 혼합물과 같은 전기 전도성 재료를 포함할 수 있다. 전도성 폴리머는 예를 들어, 폴리피롤 또는 폴리아세틸렌 등, 또는 이들의 조합물을 포함할 수 있다. 장치 제조 또는 보관 중에 산화 물질과 접촉 상태가 될 수 있는 전기화학 전지 및/또는 전극(들)에서의 애노드(anode)는 적어도 하나의 전기 전도성 재료, 예를 들어, 백금, 팔라듐, 탄소, 결합제와 혼합된 탄소, 산화 인듐, 산화 주석, 혼합형 산화 인듐/산화 주석, 금, 은, 이리듐, 전도성 폴리머 등, 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 전도성 폴리머는 예를 들어, 폴리피롤 또는 폴리아세틸렌 등, 또는 이들의 조합물을 포함할 수 있다. 전극으로서 사용하기에 적합한 재료는 장치에 존재하는 시약과 호환성일 수 있으며, 다시 말해서, 이들은 선택 전위에서 및/또는 센서 제작 및/또는 보관 및/또는 사용 중에 시약과 화학적으로 반응하지 않는다. 대향 전극은 동일한 전도성 재료 또는 상이한 재료를 포함할 수 있다.
감지/작동 전극 및 상대/기준 전극은 검출 챔버의 적어도 하나의 내부 표면 상에 존재할 수 있다. 대향 전극은 검출 챔버가 유체 샘플로 채워지기 전에 서로 전기적으로 절연될 수 있다. 절연은 2개의 대향 전극을 전기적 절연 재료로 분리함으로써, 또는 전기 전도성 층 또는 필름 상에 단선부를 생성함으로써 달성될 수 있다. 대향 전극은 검출 챔버의 동일한 내부 표면 또는 상이한 내부 표면 상에 존재한다. 대향 전극은 약 5 ㎛, 또는 약 10 ㎛, 또는 약 15 ㎛, 또는 약 20 ㎛, 또는 약 25 ㎛, 또는 약 30 ㎛, 또는 약 35 ㎛, 또는 약 40 ㎛, 또는 약 45 ㎛, 또는 약 50 ㎛, 또는 약 75 ㎛, 또는 약 100 ㎛, 또는 약 125 ㎛, 또는 약 150 ㎛, 또는 약 175 ㎛, 또는 약 200 ㎛, 또는 약 250 ㎛, 또는 약 300 ㎛, 또는 약 350 ㎛, 또는 약 400 ㎛, 또는 약 450 ㎛, 또는 약 500 ㎛, 또는 약 600 ㎛, 또는 약 700 ㎛, 또는 약 800 ㎛, 또는 약 900 ㎛, 또는 약 1 ㎜, 또는 약 2 ㎜ 초과, 또는 약 3 ㎜ 초과, 또는 약 4 ㎜ 초과, 또는 약 5 ㎜ 초과로 이격될 수 있다. 상대적인 위치의 면에서, 대향 전극은 평행의 대향 관계, 또는 나란한 관계, 또는 평행하지만 편위된 관계 또는 동일 평면상의 관계에 있을 수 있다. 대향 전극은 크기가 동일하거나 실질적으로 유사하거나, 또는 상이한 크기 및/또는 상이한 형상일 수 있다.
장치는 2개 초과의 전극을 포함할 수 있다. 단지 예시로서, 장치는 상대/기준 전극일 수 있는 제3전극을 포함할 수 있다. 2개의 상대/기준 전극이 전기적으로 연결될 수 있다. 제3전극은 반응 챔버 및/또는 검출 챔버의 충전을 검출할 수 있는 감지/작동 전극과 회로를 형성할 수 있다. 단지 예시로서, 이 방식으로 검출되는 반응 챔버의 충전은 반응 시간이 제어될 수 있고/있거나 예를 들어, 반응된 유체 샘플을 검출 챔버로 이동하는 것과 같은 시험의 다음 단계가 미리 결정된 시간 후에 촉발될 수 있도록 타이밍 장치를 작동시키기 위한 신호로서 사용될 수 있다. 또 다른 예로서, 장치가 2개의 검출 챔버를 포함한다면, 각 검출 챔버는 하나의 상대/기준 전극을 포함할 수 있고, 2개의 검출 챔버는 두 검출 챔버로 연장된 하나의 감지/작동 전극을 공유할 수 있다. 이러한 실시형태에 있어서, 2개의 전기 신호가 하나의 시험에서 수득될 수 있다.
전극 배치, 간격 및 구성 또는 제작에서의 다른 변이가 본 개시물의 범주 내에 있을 것이다.
검출 챔버의 내부 표면 중 하나의 적어도 한 부분은 전기적으로 연결될 수 있으나 전극을 넘어서 연장될 수 있는 전도성 층 또는 필름을 포함할 수 있다. 연장된 전도성 층 또는 필름은 장치가 예를 들어, 측정기와 같은 또 다른 장치에 전기적으로 연결되는 접촉 영역으로 사용될 수 있다. 특정 실시형태에 있어서, 검출 챔버는 전도성 필름을 포함하고/포함하거나 대향 전극에 전기적으로 연결되나 서로 전기적으로 절연되는 2개의 내부 표면을 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용되는 "실질적으로"는 2개의 내부 표면 중 어느 하나의 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%가 전기 전도성 재료로 코팅되는 것을 의미한다. 각각의 전기 전도성 필름은 연속형 또는 패턴형(patterned)일 수 있다. 예를 들어, 패턴형 전도성 필름은 서로 전도성인 2개의 전극; 또는 전극 및 전극을 예를 들어, 측정기와 같은 외부 장치에 전기적으로 연결할 수 있는 접촉 영역을 형성할 수 있다.
검출 챔버의 적어도 하나의 내부 표면 상에 스크래치가 있을 수 있다. 예시적인 설명은 도 4의 스크래치(106)일 수 있다. 스크래치는 검출 챔버 내에서 전기 전도성 필름에 단선부를 생성할 수 있다. 단선부는 전도성 필름이 놓여질 때 이를 패턴화함으로써 또는 제조 중에 단선부를 생성함으로써 구성될 수 있다. 스크래치(106)는 필름을 긁거나, 필름의 일부를 스크랩핑(scraping)하거나, 전도성 층 또는 필름을 화학적으로 에칭(etching)하거나, 전도성 층 또는 필름을 레이저로 제거하거나 또는 기타 방법에 의해 구성될 수 있다. 전도성 층 또는 필름에서의 스크래치(106)는 부분적으로, 검출 챔버 내의 전도성 코팅을 반응 챔버 내의 전도성 코팅으로부터 전기적으로 분리시킴으로써 검출 챔버의 활성이 있는 전극 영역을 형성하는 데 소용될 수 있다. 이는 반응 챔버 내의 전도성 층 또는 필름에서 다르게 흐를 수 있는 임의의 전기적 신호가 시험 결과에 영향을 미치는 것을 방지할 수 있기 때문에 유익할 수 있다. 스크래치는 스크래치가 존재하는 층의 전기 전도성을 신뢰성 있게 깨기에 충분하게 넓을 수 있으나, 예를 들어, 모세관 작용 하에서와 같이 유체가 이를 가로지르는 것을 방해할 만큼 넓지는 않을 수 있다. 스크래치는 약 1 ㎛ 내지 10 ㎜, 바람직하게는 약 10 ㎛ 내지 약 1 ㎜, 가장 바람직하게는 약 20 ㎛ 내지 약 200 ㎛일 수 있다. 스크래치와 검출 챔버의 근위 단부 사이의 거리는 검출 챔버의 근위 단부와 원위 단부 사이의 거리의 약 1 %, 또는 약 5%, 또는 약 10%, 또는 약 15%, 또는 약 20%, 또는 약 25%, 또는 약 30%, 또는 약 35%, 또는 약 40%, 또는 약 45%, 또는 약 50%, 또는 55% 초과일 수 있다.
검출 챔버의 적어도 하나의 내부 표면은 검출제로 코팅될 수 있다. 검출제는 검출 챔버 내에서의 유체 샘플에 의해 용해되고/되거나 이 중에 확산될 수 있으며, 검출 챔버의 임의의 내부 표면 상에 코팅될 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 검출제는 유체 샘플에 의해 용해될 수 없거나, 확산될 수 없을 수 있다. 이러한 검출제는 검출이 이루어질 수 있는 곳 근처에 코팅될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "근처"는 검출제 또는 이들의 유도체가 예를 들어, 전극에 의해서 검출될 수 있는 거리 이내를 의미한다. 검출제의 유도체는 검출제와 프로브 제제, 예를 들어 활성화제에 의해 검출 챔버로 운반되는 화학종과의 반응에 의해 생성되고/되거나 활성화되는 화학종을 의미한다. 검출제는 예를 들어, 글루코스 산화효소, 글루코스 탈수소효소와 같은 효소를 포함할 수 있다. 검출제는 유체 샘플에 의해 검출 챔버로 운반되는 프로브 제제 분자에 표면 결합되거나 그 중에 캡슐화되는 활성화제에 의해 활성화될 수 있는 화학종을 포함할 수 있다. 검출제 및 활성화제 쌍은 아포-효소 및 이의 보조인자를 포함할 수 있다. 단지 예시로서, 검출제와 활성화제 쌍은 아포-글루코스 산화효소와 플라빈 아데닌 다이뉴클레오티드를 포함할 수 있으며; 검출제와 활성화제 쌍은 아포-글루코스 탈수소효소와 PQQ를 포함할 수 있다. 유체 샘플 내에 존재하는 하나의 카피의 표적 피분석물이 검출 챔버로 이송되는 다수의 카피의 활성화제를 포함하는 하나의 프로브 제제 분자에 상응하고, 하나의 카피의 활성화제가 하나의 검출제 분자를 활성화시켜, 하나의 신호 유닛을 생성할 수 있다면, 하나의 카피의 표적 피분석물이 다수의 신호 유닛에 상응할 수 있다. 이는 시험의 민감성 및/또는 정확성 및/또는 속도를 증가시킬 수 있다.
검출 챔버는 활성화제 분자를 프로브 제제 분자의 비히클로부터 유리시킬 수 있는 유리화제를 포함하여, 활성화제 분자가 검출제 분자와 반응하여 이를 활성화시킬 수 있게 할 수 있다. 유리화제는 순한 세정제, 용해성 펩티드, 효소, 가열, 냉각, 초음파처리, 광화학적으로 활성화되는 용해제와 함께 광원 등, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함할 수 있다. 순한 세정제는 n-옥틸-B-D-글루코피라노사이드, 트윈 20, brij 35 및 트리톤 X-100으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함한다. 펩티드는 멜리틴, 및 보체계(complement system)의 구성성분인 포스포리파제 분류 중 하나로부터 선택되는 적어도 하나를 포함할 수 있다. 효소는 프로테아제 및 트립신으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함할 수 있다. 유리화제는 비히클로부터 활성화제 분자를 방출하는 물리적 수단을 포함할 수 있다. 여기에는 가열 또는 냉각, 초음파처리, 또는 예를 들어 센서로 지향된 광원에 의해 개시되는 광화학 반응과 같은 물리적 및 화학적 수단의 조합이 포함될 수 있다. 유리화제는 검출 챔버 내에서 유체 샘플에 의해 용해되고/되거나 그 중에 확산될 수 있으며, 검출 챔버의 임의의 내부 표면 상에 코팅될 수 있다.
검출제 또는 이의 유도체가 효소라면, 검출 챔버는 검출제 또는 이의 유도체와 반응하여, 검출가능한 신호를 생성할 수 있는 효소 기질을 포함할 수 있다. 예시적인 설명은 도 3에서의 효소 기질(64)이다. 효소 기질은 존재하는 검출제 또는 이의 유도체와 효소 기질과의 반응 속도가 검출 챔버 내에 존재하는 검출제 또는 이의 유도체에 의해 결정되도록 충분한 양일 수 있다. 효소 기질은 산화가능한 기질을 포함할 수 있다. 산화가능한 기질은 갈락토스, 말토스, 자일로스 및 아세트산으로부터 선택되는 하나의 기질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 검출제 또는 이의 유도체가 글루코스 산화효소 또는 글루코스 탈수소효소라면, 효소 기질은 글루코스를 포함할 수 있다.
검출 챔버는 검출제 또는 이의 유도체와 반응하여, 검출가능한 신호를 생성할 수 있는 적어도 하나의 매개체를 포함할 수 있다. 매개체는 존재하는 검출제 또는 이의 유도체와 효소 기질의 반응 속도가 검출 챔버 내에 존재하는 검출제 또는 이의 유도체의 양에 의해 결정되도록 충분한 양일 수 있다. 전기화학적 검출 시스템이 사용되는 실시형태에 있어서, 페리사이아나이드가 적합한 매개체일 수 있다. 다른 적합한 매개체는 다이클로로페놀인도페놀 및 전이 금속과 질소-함유 헤테로원자 화학종 사이의 착물로부터 선택되는 하나를 포함할 수 있다. 검출 챔버는 특정 실시형태에서 검출 반응의 속도를 증가시킬 수 있는 둘 이상의 매개체를 포함할 수 있다.
검출 챔버는 예를 들어 검출 챔버 내에서 유체 샘플의 pH를 조정할 수 있는 완충액을 포함할 수 있다. 완충액은 제조 및/또는 보관 중에 검출 챔버 내에서 적어도 하나의 시약을 안정화시킬 수 있다. 완충액은 포스페이트, 시트레이트, 시트라코네이트, 멜리테이트, 트리스, PIPES, MOPS, HEPES, 프탈레이트, 이미다졸로부터 선택되는 물질을 포함할 수 있다.
효소 기질 및/또는 매개체 및/또는 완충액 시약은 검출제 또는 이의 유도체와 효소 기질의 반응 속도가 검출 챔버 내에 존재하는 검출제 또는 이의 유도체의 양에 의해 제한되도록 충분한 양(들)으로 존재할 수 있다.
한 쌍의 챔버 사이에 샘플 통로가 있을 수 있으며, 이를 통하여 유체 샘플이 하나의 챔버로부터 다른 챔버로 유동할 수 있다. 예를 들어, 도 2에 나타낸 바와 같이 반응 챔버와 검출 챔버 사이에 샘플 통로(38)가 있을 수 있다. 유체 통로를 통한 유동은 예를 들어, 모세관 작용, 공기압, 외력 등, 또는 이들의 임의의 조합을 통한 힘 밸런스에 의해 제어될 수 있다. 유체 통로는 개방형 통로를 포함할 수 있다. 유체 통로는 엔티티(entity)를 포함할 수 있다. 엔티티는 반투과성일 수 있고/있거나 특정 화학종이 통과되게 할 수 있고, 예를 들어, 크기, 전하, 몰삼투압농도(osmolarity) 등, 또는 이들의 임의의 조합에 기초하여, 다른 것들을 차단할 수 있다. 단지 예시로서, 이러한 엔티티는 반응 챔버 내에서 특정 화학종을 구속하기 위한 메카니즘을 제공할 수 있다. 샘플 통로는 정사각형, 직사각형, 원형, 타원형, 삼각형, 장사방형, 사다리꼴 등의 단면 형상을 포함할 수 있다. 단면은 반응 챔버로부터 충전 챔버로의 유체 샘플의 대량 유동 방향에 수직일 수 있다. 단면은 대량 유동의 방향에 따라 크기 및/또는 형상이 균일할 수 있다. 단면은 대량 유동의 방향에 따라 가변적일 수 있다. 단지 예시로서, 단면은 대량 유동의 방향을 따라 점점 가늘어질 수 있다. 유체 통로는 모세관 거리를 포함할 수 있다. 모세관 거리는 이것이 연결된 두 챔버의 모세관 거리 사이일 수 있다. 이는 유체 샘플이 단독의 모세관 작용을 통해, 즉 외력의 부재 하에 유체 통로를 통해 하나의 챔버로부터 다른 챔버로 유동하게 할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 외력은 검출 챔버 내에서 예를 들어 천공에 의해 배출구를 개방하기 위해 사용자에 의해 생성되는 힘을 포함하지 않는다. 예를 들어, 몇몇 실시형태에 있어서, 예를 들어 천공에 의하여 검출 챔버의 원위 단부에 배출구를 개방함에 따라 유체 샘플이 하나의 챔버로부터 다른 챔버로 이송될 수 있다. 모세관력은 예를 들어, 충전 챔버의 적어도 하나의 내부 표면 상의 코팅에 의해 조작될 수 있다. 바이오센서가 사용자 또는 예를 들어 펌프, 주사기 등과 같은 장치에 의해 생성된 외력을 사용하도록 구성된다면, 유체 통로의 모세관 거리는 이것이 연결된 챔버의 모세관 거리 중 하나보다 더 크거나 더 작을 수 있다.
장치는 충전 챔버를 포함할 수 있다. 예시적인 설명은 도 4에서의 충전 챔버(107)일 수 있다. 충전 챔버는 적어도 하나의 내부 표면을 포함할 수 있다. 충전 챔버는 반응 챔버의 외부 및/또는 내부를 형성할 수 있는 적어도 하나의 벽을 포함할 수 있다. 충전 챔버는 적어도 일부가 유체 샘플에 접근가능할 수 있는 소정의 부피를 갖는 내부를 포함할 수 있다. 상기 부피는 약 100 ㎖ 미만, 또는 약 50 ㎖ 미만, 또는 약 20 ㎖ 미만, 또는 약 10 ㎖ 미만, 또는 약 5 ㎖ 미만, 또는 약 3 ㎖ 미만, 또는 약 2 ㎖ 미만, 또는 약 1 ㎖ 미만, 또는 500 ㎕ 미만, 또는 약 200 ㎕ 미만, 또는 약 100 ㎕ 미만, 또는 약 50 ㎕ 미만, 또는 약 10 ㎕ 미만, 또는 약 1 ㎕ 미만, 또는 약 0.5 ㎕ 미만, 또는 약 0.3 ㎕ 미만, 또는 약 0.1 ㎕ 미만일 수 있다.
충전 챔버의 내부는 정사각형, 직사각형, 원형, 타원형, 삼각형, 장사방형, 사다리꼴 등의 단면 형상을 포함할 수 있다. 단면은 충전 챔버 내에서 유체 샘플의 대량 유동 방향에 수직일 수 있다. 단면은 대량 유동의 방향에 따라 크기 및/또는 형상이 균일할 수 있다. 단면은 대량 유동의 방향에 따라 가변적일 수 있다. 단지 예시로서, 단면은 대량 유동의 방향을 따라 점점 가늘어질 수 있다.
상기 충전 챔버는 모세관 거리를 포함할 수 있다. 유체 샘플은 충전 챔버로 유출될 수 있다. 상기 모세관 거리는 반응 챔버의 모세관 거리보다 더 클 수 있다. 이는 유체 샘플이 단독의 모세관력을 통하여, 즉 외력의 부재 하에 충전 챔버로부터 반응 챔버로 유동하게 할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 외력은 예를 들어 천공에 의해 검출 챔버 내의 배출구를 개방하기 위해 사용자에 의해 생성되는 힘을 포함하지 않는다. 예를 들어, 몇몇 실시형태에 있어서, 예를 들어, 천공에 의해 검출 챔버의 원위 단부에 배출구를 개방함에 따라 유체 샘플이 하나의 챔버로부터 다른 챔버로 이송될 수 있다. 모세관력은 예를 들어, 충전 챔버의 적어도 하나의 내부 표면 상의 코팅에 의해 조작될 수 있다. 바이오센서가 사용자 또는 예를 들어 펌프, 주사기 등과 같은 장치에 의해 생성된 외력을 사용하도록 구성된다면, 충전 챔버의 모세관 거리는 반응 챔버의 모세관 거리보다 더 작을 수 있다.
충전 챔버의 적어도 하나의 내부 표면은 블로킹제로 코팅될 수 있다. 충전 챔버에서의 블로킹제는 반응 챔버에서의 블로킹제와 유사할 수 있다. 충전 챔버의 적어도 하나의 내부 표면은 완충액으로 코팅될 수 있다. 완충액은 반응 챔버 및/또는 검출 챔버에서의 완충액과 유사할 수 있다.
바이오센서는 유체 및/또는 전기적 신호의 누출을 방지할 수 있는 적어도 하나의 실링층을 포함할 수 있다. 실링층에 대한 예시적인 재료는 예를 들어, 플라스틱(예를 들어, PET, PETG, 폴리이미드, 폴리카보네이트 및/또는 폴리스타이렌), 실리콘, 세라믹, 유리 및 이들의 임의의 조합물을 포함할 수 있다. 실링층은 접착제를 포함하거나 실질적으로 이로 형성될 수 있다. 검출 챔버가 전기화학적 전지를 포함한다면, 실링층은 전극 중 적어도 하나 및/또는 전기 전도성 층 또는 필름에 인접하여 배치된다. 실링층은 제1 및 제2 전기 전도성 층 또는 필름 중 적어도 하나에 인접하여 배치될 수 있다. 실링층은 검출 챔버의 원위 단부에 배출구 홀 위에 배치되어, 미리형성된 배출구 홀에 대한 덮개를 제공할 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 실링층의 일부가 예를 들어 천공에 의해 제거되어, 트랩핑된 공기가 바이오센서의 챔버로부터 벗어날 수 있는 배출구 홀을 생성할 수 있다. 실링층은 전도성 층 또는 필름의 일부가 노출되어, 바이오센서가 측정기에 전기적으로 연결될 수 있는 접촉 영역을 형성할 수 있도록 구성될 수 있다. 이러한 구성은 실링층이 전도성 층 또는 필름의 것보다 더 작은 영역을 가질 수 있고/있거나 실링층이 전체 전도성 층 또는 필름을 덮지 않도록 배치될 수 있는 것을 포함할 수 있다.
제조방법
단지 편의의 목적으로, 본 명세서에 기재되는 바이오센서의 제조방법은 몇몇 예시적인 실시형태의 면에서 기재된다. 그러나, 이는 설명의 목적만을 위한 것이며 본 개시물의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않음이 이해된다.
도 2 및 도 3에 나타낸 바이오센서(20)는 전기화학적 전지를 포함하는 검출 챔버(28) 및 고정화된 결합제 분자 및 프로브 제제 분자를 포함하는 반응 챔버(22)를 포함한다. 검출 챔버(28) 및 반응 챔버(22)는 전기 저항성 스페이서 재료(36)의 시트를 통해 확장된 개구부를 형성함으로써 제조될 수 있다. 개구부는 이것이 반응 챔버(22)와 검출 챔버(28) 둘 모두의 측벽뿐 아니라 챔버(22, 28) 사이의 샘플 통로(38)를 형성하도록 구현될 수 있다. 개구부를 반응 챔버(22)의 근위 단부(24)로부터 센서(20)의 에지(37)까지 연장함으로써, 샘플 입구(25)가 형성될 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 시트(36)의 두께는 반응 챔버(22) 및 검출 챔버(28)의 높이를 형성할 수 있으며, 챔버는 동일한 높이를 가질 수 있다. 이러한 실시형태에 따라, 검출 챔버에서의 모세관력은 반응 챔버에서의 모세관력보다 더 클 수 있다. 이는 반응 챔버 및/또는 검출 챔버의 표면을 변형하거나 본 명세서에 개시된 것과 같은 충전 재료를 검출 챔버에 첨가함으로써 달성될 수 있다.
또 다른 실시형태에 있어서, 반응 챔버(22)의 높이는 검출 챔버(28)의 높이보다 더 높을 수 있다. 검출 챔버(28)보다 더 높은 높이의 반응 챔버(22)는 예를 들어, 다수의 내부 시트(32, 34, 36) 및/또는 외부 실링 시트(42, 46)를 함께 쌓음으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, 도 3에서, 센서(20)의 중간 시트(36)는 전술한 바와 같이 반응 챔버(22) 및 검출 챔버(28)의 측벽을 형성하는 개구부를 갖는다. 그 다음, 중간 시트(36)는 반응 챔버(22)에만 상응하는 개구부를 갖는 하나 이상의 부가층(32, 34) 사이에 개재될 수 있다. 검출 챔버(28)에 관하여, 층(32 및 34)은 챔버의 단부벽(60, 62)(즉 상면 및 바닥면)을 형성한다. 이러한 실시형태에 있어서, 검출 챔버의 단부벽(60 및 62)은 연결 수단을 통해 측정 회로에 전기적으로 연결가능한 전극(54 및 52)을 포함한다. 전극은 하기에서 더욱 상세히 기재된다.
일 측면에서, 전극(52 및 54)은 연결 단부(66)을 통해 측정기(도시 생략)와의 전기적 연결 상태로 장착될 수 있다. 연결 단부은 측정기(도시 생략)가 전기 전도성 트랙(track)(도시 생략)을 통해 검출 챔버(28) 내의 전극(52 및 54)과 전기적으로 커뮤니케이션하도록 할 수 있다. 연결 영역(66)과 연결 상태에 있는 측정기는 검출 챔버(28)에서 전극(52 및 54) 사이에 전위를 인가할 수 있으며, 전기화학적 반응 중에 생성된 전기적 신호를 검출한다.
도 4, 도 5 및 도 7에 나타낸 바이오센서(120) 또는 도 6에 나타낸 바이오센서는 3개의 챔버를 포함한다. 센서는 반응 챔버(122) 및 검출 챔버(128) 외에, 충전 챔버(107)를 포함할 수 있다. 센서(120)는 예를 들어 실링층(142), 하층(134), 스페이서층(136) 및 상층(132)을 포함하는 전술한 바와 같은 다수의 층으로부터 형성될 수 있다. 일면에서, 각 층은 절연 재료를 포함할 수 있으며, 한편 상층 및 하층(132, 134)은 추가로 하기에 더욱 상세히 기재되는 바와 같은 전기 전도성 필름을 포함한다. 센서의 상이한 지점에서 층의 일부를 제거함으로써, 충전 챔버(107), 반응 챔버(122) 및 검출 챔버(128)가 형성된다. 또한, 상층 및 하층(132, 134) 상에 전기 전도성 필름의 일부를 노출시키는 것은 전기화학적 반응을 수행하기 위한 전극(152, 154)을 제공하며, 센서를 측정기에 전기적으로 연결하기 위한 전기적 접촉 영역(101, 102, 103)을 제공한다.
하부 전도성 필름을 운반하는 하부 층(134)을 전기적으로 접촉시키기 위한 접촉 영역(101)은 하층(134)을 스페이서층(136)과 상층(132)의 단부를 넘어 벗어나게 연장시킴으로써 형성될 수 있다. 접촉 영역(102)은 층(134 및 136)의 섹션을 제거하여, 상층(132)의 섹션을 노출시킴으로써 형성될 수 있다. 접촉 영역(103)은 도 5d(도 4에서 단면 D-D')에 나타낸 바와 같이 하층(134) 및 스페이서층(136)의 섹션을 제거함으로써 유사하게 형성될 수 있다.
충전 챔버(107)는 하층(134)과 스페이서층(136)의 섹션을 제거하나, 상층(132)과 실링층(142)을 그대로 남겨둠으로써 형성될 수 있다. 실링층(142)은 층(134)의 외면에 접착될 수 있으며, 층(134 및 136) 및 층(132)에서 절단면을 제공하여, 모세관 작용에 의해 샘플을 유출시킬 수 있는 모세관 채널을 형성할 수 있다. 이 채널은 도 5a에 나타내었다(도 4에서 단면 A-A').
반응 챔버(122)는 스페이서층(136)의 섹션을 제거하나, 층(134 및 132)을 그대로 남겨둠으로써 형성될 수 있다. 이는 모세관 공간을 형성할 수 있으며, 여기에서 모세관 공간의 높이는 충전 챔버(122)의 높이보다 더 낮다. 이는 액체를 모세관 작용에 의해 충전 챔버(122)로부터 반응 챔버(128)로 유출되게 할 수 있다. 반응 챔버의 낮은 높이는 반응 챔버 내에서 상대적으로 신속하게 구성성분이 혼합되게 할 수 있고, 일 측면에서, 반응 챔버(122)는 스트립의 측부 에지(들)에서 개방되어, 공기를 배출구로 배기시키고, 액체를 반응 챔버에 채울 수 있다.
검출 챔버(128)는 스페이서층(136)의 섹션을 제거하나, 층(134, 132)을 그대로 남겨둠으로써 반응 챔버(122)와 유사한 방식으로 형성될 수 있다. 먼저, 검출 챔버(128)는 다른 개방부를 갖지 않고, 일단에서 반응 챔버(122)에 개방될 수 있다.
상층(132)(또는 하층(134))의 섹션을 제거하거나, 이를 천공시킴으로써 배출구 홀(130)이 검출 챔버(128)에 통합될 수 있다. 도 5b(도 4의 단면 B-B')에 나타낸 층(146)은 개구부를 밀봉하기 위하여 스트립의 상면에 적층될 수 있다. 대안적으로, 하층(134)의 일부가 제거된다면, 실링층(142)이 천공/제거되어, 배출구 홀(130)을 개방시킬 수 있다.
일 측면에서, 전극(52, 152, 54, 154)을 형성하는 전기 전도성 필름은 접착제의 수단에 의해 면역센서의 표면에 접착될 수 있다. 적합한 접착제는 예를 들어, 열 활성화 접착제, 감압성 접착제, 열 경화성 접착제, 화학적 경화성 접착제, 핫 멜트(hot melt) 접착제, 핫 플로우(hot flow) 접착제 등을 포함할 수 있다. 대안적인 면에서, 전기 전도성 필름은 전기 저항성 재료의 시트를 접합한 전기 전도성 재료, 예를 들어 백금, 팔라듐, 탄소, 산화 인듐, 산화 주석; 혼합형 산화 인듐/산화 주석, 금, 은, 이리듐, 이들의 혼합물 등으로 코팅시킴으로써(예를 들어, 스퍼터(sputter) 코팅 또는 스크린 인쇄에 의해) 제조될 수 있다. 전극으로서 사용하기에 적합한 재료는 센서(20, 120)에 존재하는 시약과 호환가능할 수 있다. 적합한 전기 저항성 재료는 예를 들어, 폴리에스터, 폴리스타이렌, 폴리카보네이트, 폴리올레핀, 이들의 혼합물 등을 포함한다.
도 4에서의 스크래치(106)는 상층(132) 상의 전기 상부 전극(154)을 형성하는 전도성 필름에서의 단선부를 표시한다. 단선부는 이것이 놓여질 때 전도성 필름을 패턴화하거나 제조 중에 단선부를 생성함으로써 구성될 수 있다. 스크래치(106)는 필름을 긁거나, 필름의 일부를 스크랩핑하거나, 필름을 화학적으로 에칭하거나, 필름을 레이저로 제거하거나 또는 통상적으로 알려진 바와 같은 기타 방법에 의해 구성될 수 있다.
상이한 기능성 및 소분자 함유물을 갖는 많은 유형의 리포솜을 제조하는 방법은 문헌에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Liposomes: A Practical Approach (Second Edition, Editors: VA Torchilin and V Weissig, Oxford University 2003)]을 참고한다. 대안적인 항체는 간접적으로 첨가될 수 있다. 예를 들어, 비오틴(Biotin) DHPE(N-(비오티노일)-1,2-다이헥사데카노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민)과 같은 비오티닐화 지질은 리포솜으로 통합된 다음, 스트렙트아비딘 또는 아비딘이 첨가된 후, 마지막으로 비오티닐화 항체가 첨가될 수 있다. 또한, 소분자 부착을 갖는 폴리머의 구성방법이 공지이다. 예를 들어, 토마스(Thomas) 등에 의한 문헌["In Vitro Targeting of Synthesized Antibody-Conjugated Dendrimer Nanoparticles" (Biomacromolecules, 5(6): 2269-2274, November 8, 2004)]을 참고한다.
예를 들어, 고정화된 항체/항원, 프로브-연결형 항원/항체, 완충액, 매개체, 효소 기질 등과 같은 바이오센서에 사용하기 위한 시약은 매트릭스 내에서 반응 챔버(22, 122) 상에 또는 챔버 내에 함유되는 독립적인 지지 부재 상에 지지되거나 자가 지지될 수 있다. 시약이 챔버 내벽 또는 전극 상에 지지된다면, 화학물질은 예를 들어, 잉크젯 인쇄, 스크린 인쇄, 리소그래피(lithography) 등과 같은 인쇄 기법의 사용에 의해 도포될 수 있다. 대안적인 실시형태에 있어서, 시약을 함유하는 용액은 챔버 내의 내부 표면에 도포되고 건조되도록 할 수 있다. 예를 들어, 고정화된 결합제 및/또는 프로브 제제와 같은 시약이 독립적인 지지 부재 상에 건조된 다음, 이는 반응 챔버에 배치될 수 있다. 대안적으로, 고정화된 결합제 또는 프로브 제제 중 하나가 독립적인 지지 부재에 통합될 수 있으며, 다른 구성성분이 반응 챔버 내의 하나의 내벽 상에 지지될 수 있다. 반응 챔버의 내벽은 다공성일 수 있으며, 거기에 고정화된 결합제 및/또는 프로브 제제가 통합된다. 이는 예를 들어, 세공막을 사용하여 반응 챔버의 내벽(들)을 형성하고, 반응 챔버 주위의 막을 압착하여 샘플이 목적하는 영역 밖으로 누출되는 것을 방지함으로써 달성될 수 있다. 고정화된 결합제 및/또는 프로브 제제는 비드 상에 지지될 수 있다. 이러한 비드는 임의로 자성 재료(예를 들어, 감마 Fe2O3 및 Fe3O4)를 둘러싸는 폴리머 재료, 예를 들어, 아가로스, 폴리스타이렌, 폴리메타크릴레이트, 폴리메틸메타크릴레이트를 포함할 수 있다. 비드 재료는 적합한 지지 부재가 부착되는 화학종에 대하여 제공될 수 있도록 선택될 수 있다. 자기장은 자성 비드를 반응 챔버 내에 유지시키고, 자성 비드가 검출 챔버로 이동하는 것을 막기 위하여 이러한 바이오센서 내에 포함될 수 있다. 예를 들어, 고정화된 결합 부위는 반응 챔버 내에서 자성 비드 상에 배치될 수 있다.
이용방법
단지 편의의 목적을 위해, 본 명세서에 기재된 바이오센서의 사용방법은 도 4-7에 나타낸 실시형태의 면에서 기재된다. 이것이 설명의 목적만을 위한 것이며, 본 개시물의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않음이 이해된다.
사용에 있어서, 사용자는 먼저 유체 샘플을 충전 챔버 및/또는 반응 챔버에 도입할 수 있다. 샘플은 모세관 또는 위킹(wicking) 활동의 영향 하에서 충전 챔버 및/또는 반응 챔버로 빼낼 수 있다. 샘플은 예를 들어, 주사기 및/또는 펌프와 같은 장치 및/또는 사용자에 의해 생성되는 외력으로 충전 챔버 및/또는 반응 챔버로 빼낼 수 있다. 반응 챔버는 대기에 대해 개방되는 배출구를 포함하여, 샘플에 의해 대체되는 공기가 빠져나가게 할 수 있다. 또는 유체 샘플에 의한 충전 챔버 및/또는 반응 챔버의 충전은 공기를 검출 챔버로 이동시킬 수 있다. 반응 챔버(122)의 부피는 검출 챔버(128)의 부피와 적어도 동일하고, 바람직하게는 그보다 더 크도록 선택될 수 있다.
표적 피분석물, 예를 들어 항원을 함유하는 전혈과 같은 생물학적 샘플의 반응 챔버로의 유입은 자성 비드를 하나의 내부 표면으로부터 그리고 프로브 제제 분자를 다른 내부 표면으로부터 분산시킬 수 있다. 자성 비드는 결합제 분자로 코팅될 수 있다. 결합제는 항원을 포함할 수 있다. 프로브 제제는 결합 파트너와 비히클을 포함할 수 있다. 결합 파트너는 혈액 중의 표적 항원에 결합할 수 있고, 고정화된 결합제에 더 낮은 결합 친화도로 결합할 수 있는 항체일 수 있다. 비히클은 예를 들어, 리포솜 내에 캡슐화된 PQQ, 또는 폴리머에 결합된 PQQ 표면, 이를 테면 덴드리머를 포함할 수 있다. 각각의 리포솜은 다수의 카피의 PQQ를 캡슐화시킬 수 있다. 샘플 중의 표적 피분석물의 존재는 용량 의존적인 방식으로 자성 비드 상에 코팅된 결합제 분자에 대한 프로브 제제 분자의 결합을 간섭할 수 있다.
주어진 시간, 예를 들어 약 2분 후에, 반응된 유체 샘플이 모세관 작용에 의해 검출 챔버로 이동될 수 있게 하는 배출구 홀이 타공될 수 있다. 검출 챔버는 효소 활성의 전기화학적 측정을 위한 시약을 포함할 수 있다. 검출 챔버는 충분히 채워질 수 있으며, 즉 충분한 샘플이 검출 챔버로 이동하여, 프로브 제제의 존재가 사용되는 검출 방법에 의해 검출되고 분석될 수 있도록 한다.
반응 챔버 아래의 자석은 자성 비드와, 결합제 분자를 통해 비드에 결합된 프로브 제제 분자의 전달을 방지할 수 있다. 결과적으로, 이러한 예시적인 실시형태에 있어서, 유체 샘플 중에 표적 피분석물이 더 많으면, 더 적은 프로브 제제 분자가 고정화된 결합제 분자에 결합할 수 있고, 더 많은 프로브 제제 분자가 검출 챔버로 이동하여 검출 챔버 내에서 검출될 수 있다.
검출 챔버는 아포-GDH 및 PQQ를 비히클로부터 방출시키고, 아포-GDH와 상호작용되도록 할 수 있는 유리화제를 포함할 수 있다. 하나의 비히클이 예를 들어, 100개 이상의 PQQ 분자를 함유하고, 이들이 각각 하나의 아포-GDH와 결합하여 활성화시킬 수 있다면, 자성 비드에 대한 단일 항체-PQQ-리포솜 프로브 제제 결합의 억제가 100개 이상의 GDH 분자의 활성화를 야기할 수 있다. 이러한 방식으로, 예를 들어, 각 리포솜이 100개의 PQQ 분자를 함유한다면 5pM만큼 적은 항원이 검출되거나, 또는 각 리포솜이 1000개의 PQQ 분자를 함유한다면, 500fM이 검출될 수 있다.
숙련자는 본 명세서에 기재된 상이한 실시형태로부터 다양한 구성 및 특징부의 적용가능성을 인식할 것이다. 유사하게, 전술한 다양한 구성 및 특징부뿐 아니라 각 구성 또는 특징부에 대한 기타 공지의 등가물이 해당 분야의 숙련자에 의해 혼합되고 매치되어, 본 명세서에 기재된 원리에 따른 방법을 수행할 수 있다. 기재된 예는 단지 설명의 목적일 뿐이며, 본 발명의 범주를 제한하지 않음이 이해되어야 한다.
본 명세서에서 참고되는 모든 특허, 특허 출원, 특허 출원 공개 및 물품, 서적, 설명서, 공개물, 문서, 물품과 같은 다른 자료는 모든 목적으로 본 명세서에 그 전문이 참고로 여기에 포함되는데, 이들 중, 본 명세서와 불일치하는 또는 모순하는 임의의 것 또는 본 명세서와 현재 또는 차후에 관련되는 청구범위의 가장 넓은 범위에 관하여 이들을 제한하는 영향을 미칠 수 있는 임의의 것과 관련된 임의의 출원 이력(prosecution file history)은 제외된다. 예로서, 포함된 임의의 자료와 관계된 용어의 설명, 정의 및/또는 사용과 본원과 관련된 것들 사이에 불일치 또는 모순이 있다면, 본 명세서에서의 용어의 설명, 정의 및/또는 사용이 우선되어야 한다.

Claims (60)

  1. 유체 샘플 중의 표적 피분석물 검출장치로서,
    내부 표면, 결합제 및 프로브 제제(probe agent)를 포함하는 반응 챔버로서, 상기 프로브 제제가 결합 파트너와 비히클(vehicle)을 포함하고, 상기 결합 파트너가 상기 비히클에 결합하며, 유체 샘플 중의 표적 피분석물(analyte)이 상기 결합제 또는 상기 결합 파트너와 반응할 수 있고, 상기 비히클이 복수의 카피의 활성화제를 포함하는 것인, 상기 반응 챔버;
    검출제를 구비하고, 상기 활성화제는 상기 검출제를 활성화시킬 수 있는 검출 챔버; 및
    상기 반응 챔버와 상기 검출 챔버 사이의 유체 통로(passageway)를 포함하되,
    상기 검출장치는, 반응된 유체 샘플이 모세관 작용을 통해 상기 유체 통로를 통과하여 상기 반응 챔버로부터 상기 검출 챔버로 이동하도록 구성되고,
    상기 유체 샘플 중의 소정의 농도의 표적 피분석물의 존재가 반응된 유체 샘플과 함께 상기 검출 챔버로 이동하는 상기 프로브 제제의 양의 변화를 야기하며, 상기 변화가 상기 검출 챔버에서 검출가능하고, 적어도 역치 농도에 따라 달라지는 것인 유체 샘플 중의 표적 피분석물 검출장치.
  2. 제1항에 있어서, 상기 결합제 및 상기 프로브 제제는 상기 반응 챔버의 상이한 내부 표면에 결합되는 것인 유체 샘플 중의 표적 피분석물 검출장치.
  3. 제1항에 있어서, 상기 결합제는 적어도 하나의 자성 비드(magnetic bead)를 포함하는 것인 유체 샘플 중의 표적 피분석물 검출장치.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 활성화제는 상기 비히클 내에 캡슐화되고(encapsulated), 상기 비히클은 적어도 하나의 지질성 입자를 포함하는 것인 유체 샘플 중의 표적 피분석물 검출장치.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 활성화제는 상기 비히클에 결합되고, 상기 비히클은 적어도 하나의 폴리머를 포함하는 것인 유체 샘플 중의 표적 피분석물 검출장치.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반응 챔버 내에 불활성화제(unactivated agent)가 고정화되되, 상기 불활성화제는 미결합 또는 미캡슐화된 활성화제에 결합할 수 있는 것인 유체 샘플 중의 표적 피분석물 검출장치.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 검출 챔버는 유리화제(liberating agent)를 포함하되, 상기 유리화제는 상기 활성화제를 상기 비히클로부터 유리시킬 수 있는 것인 유체 샘플 중의 표적 피분석물 검출장치.
  8. 제7항에 있어서, 상기 유리화제는 순한 세정제(mild detergent), 용해성 펩티드, 효소, 가열, 냉각, 초음파처리 및 광화학적으로 활성화되는 용해제와 함께 광원으로부터 선택되는 적어도 하나의 제제를 포함하는 것인 유체 샘플 중의 표적 피분석물 검출장치.
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 활성화제는 아포효소에 대한 보조인자를 포함하고, 상기 검출제는 상기 보조 인자에 의해 활성화될 수 있는 아포효소(apoenzyme)를 포함하는 것인 유체 샘플 중의 표적 피분석물 검출장치.
  10. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 검출 챔버의 원위 단부(distal end)에 개방가능한 배출구(openable vent)가 있는 것인 유체 샘플 중의 표적 피분석물 검출장치.
  11. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 검출 챔버는 상기 검출 챔버 내의 전기화학적 반응을 검출하기 위한 적어도 2개의 전극을 포함하는 것인 유체 샘플 중의 표적 피분석물 검출장치.
  12. 제11항에 있어서, 상기 전극들 중 적어도 하나가 전기 전도성 층으로부터 형성되며, 또한 상기 검출 챔버 내에서 상기 전극의 적어도 하나의 에지(edge)를 형성하는 데 소용되는 상기 전기 전도성 층의 단선부(break)가 있는 것인 유체 샘플 중의 표적 피분석물 검출장치.
  13. 유체 샘플 중의 표적 피분석물을 검출하는 방법으로서,
    상기 유체 샘플을 제1항의 장치로 운반하는, 유체 샘플의 운반단계;
    반응 챔버 내에서 결합제와 프로브 제제 사이의 반응을 진행시키는 단계로서, 상기 유체 샘플 중의 소정의 농도의 표적 피분석물의 존재가 상기 반응 챔버 내에 결합되는 프로브 제제의 양과 미결합되는 프로브 제제의 양의 변화를 야기하며, 상기 변화가 표적 피분석물의 농도에 따라 달라지는 것인, 상기 반응을 진행시키는 단계;
    반응된 샘플 유체를 모세관 작용에 의해 상기 반응 챔버로부터 상기 검출 챔버로 이동시켜, 미결합된 프로브 제제를 상기 검출 챔버로 이동시키는 단계; 및
    검출제를 통하여 상기 검출 챔버 내의 상기 프로브 제제의 존재를 검출하는 단계;를 포함하되,
    활성화제의 하나의 카피가 상기 검출제의 적어도 하나의 카피를 활성화시킬 수 있고,
    상기 검출 챔버 내의 상기 프로브 제제의 존재는 상기 유체 샘플에서 상기 표적 피분석물의 농도의 측정(measure)인 것인, 유체 샘플 중의 표적 피분석물의 검출방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 검출 챔버로 이동시키는 단계는 배출구를 개방하는 단계를 포함하는 것인 유체 샘플 중의 표적 피분석물의 검출방법.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 검출 챔버로부터 수신되는 전기적 신호를 정량화하는 단계를 추가로 포함하되, 상기 전기적 신호의 크기가 상기 샘플 유체 중의 상기 표적 피분석물의 농도에 따라 달라지는 것인 유체 샘플 중의 표적 피분석물의 검출방법.
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