FR2617974A1 - Procede de dosage immunologique par bio- ou chimio- luminescence - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne un procédé pour la détermination de la présence et/ou la concentration d'une substance à analyser dans un échantillon biologique, ladite substance constituant l'un des deux membres d'une paire immunologique comprenant un ligand ayant au moins un site épitopique et un anti ligand capable de se lier spécifiquement au site épitopique du ligand caractérisé en ce que l'on conjugue l'autredes deux membres de la paire immunologique avec un premier marqueur ou antimarqueur chimio- ou bio- luminescent et en ce que l'on effectue ladite détermination dans un milieu réactionnel comportant un second marqueur ou antimarqueur chimio- ou bio-luminescent qui forme avec le premier marqueur ou antimarqueur chimio- ou bio-luminescent qui forme avec le premier marqueur ou anti-marqueur chimio- ou bio-luminescent une paire luminescente.
Description
Le domaine du diagnostic clinique a vu une expansions très large ces dernières années grâce au développement de nouvelles techniques, en particulier des techniques spectroscopiques utilisant des récep teurs- organiques capables de se lier spécifiquement à une organisation spatiale et polaire de molécules.
La mise au point d'un procédé de dosage implique la recherche d'un processus sensible à la présence de la substance à analyser et proportionnel à sa concentration.
La présente invention concerne un procédé pour la détermination de la présence et/ou la concentration d'une substance à analyser dans un échantillon biologique, ladite substance constituant l'un des deux membres d'une paire immunologique comprenant un ligand ayant au moins un site épitopique et un anti ligand capable de se lier spécifiquement au site épitopique du ligand caractérisé en ce que l'on conjugue l'autre des deux membres de la paire immunologique avec un premier marqueur ou antimarqueur chimio- ou bio-luminescent et en ce que l'on effectue ladite détermination dans un milieu réactionnel comportant un second marqueur ou antimarqueur chimio- ou bio-luninescent qui forme avec le premier marqueur ou antimarqueur chimio- ou bioluminescent une paire luminescente.
Selon la présente invention, on appelle * paire immunologique, l'ensemble de deux membres im
munologiques, à savoir un ligand et un antiligand.
munologiques, à savoir un ligand et un antiligand.
Le ligand est un composé pour lequel un
récepteur existe ou peut être préparé.
récepteur existe ou peut être préparé.
On entend par récepteur tout composé ou
toute composition capable de reconnaître une organi
sation spatiale et polaire particulière d'une molé
cule, c'est-à-dire un site épitopique. Le récepteur
peut être monovalent ou polyvalent.
toute composition capable de reconnaître une organi
sation spatiale et polaire particulière d'une molé
cule, c'est-à-dire un site épitopique. Le récepteur
peut être monovalent ou polyvalent.
Le ligand peut être mono- ou poly-épitopique,
antigénique ou hapténique.
antigénique ou hapténique.
Le ligand peut comporter un seul composé ou
plusieurs composés ayant en commun au moins un site
épitopique.
plusieurs composés ayant en commun au moins un site
épitopique.
L'anti ligand est le récepteur d'un ligand
spécifique. Il peut s'agir d'un seul composé ou de
plusieurs composés dont l'association est nécessaire
pour la liaison avec le ligand.
spécifique. Il peut s'agir d'un seul composé ou de
plusieurs composés dont l'association est nécessaire
pour la liaison avec le ligand.
* paire luminescente, l'ensemble d'un marqueur et d'un
antimarqueur bio- ou chimio-luminescents ayant une
action inverse ou complémentaire sur l'émission de
lumière.
antimarqueur bio- ou chimio-luminescents ayant une
action inverse ou complémentaire sur l'émission de
lumière.
De préférence selon l'invention; un marqueur chimio- ou bio-luminescent est une première source d'émission lumineuse. Une telle source comporte un ou plusieurs composés qui, en eux-mêmes ou sous l'influence d'autres composés, d'un milieu particulier ou de radiations, conduisent une molécule à l'état électroniquement excité qui émet de la lumière en retrouvant un état d'énergie inférieur.
Il existe de nombreuses sources de chimio- ou de bio-luminescence utilisables dans le cadre de la présente invention. De préférence, on utilise une source démission lumineuse liée à un milieu contenant au moins un oxydant tel que l'eau oxygénée en milieu basique ou telle qu'une solution d'hypochlorite en solution alcaline.
On peut aussi, dans le procédé de la présente invention, utiliser une source d'émission lumineuse liée à une substance de la famille des 2,3 dihydro-1,4phtalazine-dione telle que le luminol, ou des familles des 2 ,4,5-triphénylémidazoles, hydroperoxydes d'indolen3-yle, sels de bis-9,9'biracridinium substitués ou non, peroxyesters et hydroperoxydes d'acyle, luciférines.
La source de luminescence selon la présente invention peut aussi être liée à au moins un catalyseur enzymatique ou métallique, tel que le fer ou le zinc, se présentant éventuellement sous une. forme chelatée, telle qu'une porphyrine ou phtalocyanine.
Il est bien entendu que le marqueur chimioou bio-luminescent selon la présente invention pourra comporter plusieurs des composés mentionnés ci-dessus.
ainsi par exemple, certains membres de la famille des 2,3-dihydro-1,4-phtalazine-diones tel que le dérivé 5-amino-6,7,8-triméthoxy, induisent une luminescence mais seulement lorsqu'ils sont en présence d'eau oxygénée alcaline ou d'hypochlorite en milieu basique.
De même les sels de bis-9,9'-biacridinium, tel que la lucigéuine (ou dinitrate de X,N'-diméthyl-9,9'-biacri- dinium) présentent de la chimioluminescence lorsqu'on les combine à de l'eau oxygénée alcaline.
L'eau oxygénée alcaline permet aussi de provoquer la chimioluminescence des sels d'acridinium substitués en 9, tels que des esters carboxyliques, arylique ou acyliques.
Un autre groupe de composés préférés dans le cadre de la présente invention est celui de divers peroxy-esters et hydroxy-peroxydes d'acyles, pouvant être formés sur place et mélangés à des composés comme le 9,10-diphényl-anthracène.
Une autre source de chimioluminescence ou de bioluminescence est constituée par des hydroperoxydes, par exemple l'hydroperoxyde de tétraline, en combinaison avec des complexes de métaux, notamment des porphyrines et phtalocyanines, dans lesquels les métaux sont le fer et le zinc.
Il est bien entendu aussi que, dans le cadre de la présente invention, il peut être nécessaire de fournir en outre à certains marqueurs chimio- ou bioluminescents un catalyseur enzymatique tel que la peroxydase, la catalase ou la luciférase.
On entend par anti marqueur, dans le cadre de la présente invention, soit une seconde source d'émission lumineuse capable de subir, de la part de la première source lumineuse, un transfert d'énergie puis d'émettre une lumière facilement détectable, soit un extincteur de luminescence capable d'inhiber l'émission de la première source d'émission lumineuse.
Un agent d'extinction comporte un ou plusieurs composés capables d'inhiber l'émission de lumière lorsqu'ils sont en contact ou au voisinage immédiat de la source de lumière. Le mécanisme d'inhibition est, au moins en partie, un mécanisme collisionnel.
Des ions ou des atomes lourds tels que l'iode, le brome, le mercure ou le plomb peuvent jouer le rôle d'extincteur de luminescence. Ces ions ou atomes ont, en effet, le grand avantage de pouvoir désactiver la fluorescence de divers composés sans en absorber la moindre quantité.
Il existe de très nombreux anti marqueurs utilisables dans le cadre de la présente invention. Le mécanisme impliqué dans le procédé de l'invention comportant un transfert d'énergie du marqueur vers l'antimarqueur, la seule condition impérative que doit remplir un composé pour jouer le rôle d'anti marqueur selon l'invention est de posséder un niveau d'énergie inférieur à celui du marqueur.
Ainsi selon la présente invention, la chimioluminescence ou la bioluminescence sert à l'émission d'un signal lié à la présence et proportionnel à la quantité de substance à analyser dans un milieu de dosage. La substance à analyser fait partie d'une paire immunologique comportant un ligand et un anti ligand.
Lorsque par exemple on conjugue la source de chinioluminescence ou de bioluminescence ou, le cas échéant, un constituant de la source, avec un membre de la paire immunologique, la présence et la concentration de la substance à analyser influent sur les processus de transport à l'échelle moléculaire de l'agent d'extinction présent dans le milieu de dosage et, par suite, modifie l'extinction de la fluorescence émise.
Il est bien entendu qu'une modification de l'extinction peut aussi être obtenue dans le cas où la source de luminescence est présente dans le milieu de dosage et où l'agent d'extinction est conjugué avec un membre de la paire immunologique.
De préférence selon l'invention, le second marqueur ou anti marqueur chimio- ou bio-luminescent est conjugué à une quantité connue de substance analogue à celle que l'on veut analyser. On effectue alors la détermination voulue par-liaison compétitive
Ainsi, par exemple, dans l'hypothèse où on veut effectuer le dosage d'un ligand, on introduit dans le milieu réactionnel un analogue marqué dudit ligand. Un analogue de ligand est, selon la présente invention, un ligand modifié pouvant entrer en compétition avec le ligand pour la liaison avec le récepteur ou antiligand;la modification est effectuée pour permettre la fixation d'un marqueur ou antimarqueur chimio- ou bio luminescent.
Ainsi, par exemple, dans l'hypothèse où on veut effectuer le dosage d'un ligand, on introduit dans le milieu réactionnel un analogue marqué dudit ligand. Un analogue de ligand est, selon la présente invention, un ligand modifié pouvant entrer en compétition avec le ligand pour la liaison avec le récepteur ou antiligand;la modification est effectuée pour permettre la fixation d'un marqueur ou antimarqueur chimio- ou bio luminescent.
De préférence selon la présente invention, la substance a' analyser est une substance biologique endogène telle qu'une protéine ou une vitamine.
Le plus souvent, le procédé de la présente invention permet d'effectuer le dosage d'un antigène, l'anticorps correspondant étant alors conjugué au premier marqueur ou anti marqueur chimio- ou bio-luminescent.
De préférence on utilise alors des anticorps monoclonaux.
le dosaqe selon l'invention est effectué de préférence dans un milieu horlogtne sans séparation de réactifs. Le milieu utilisé est de préférence aqueux mais peut aussi comporter d'autres solvants polaires tels que des solvants organiques oxygénés en C1 à C6, de pré- férence en Ci à C4 zon utilise de préférence de l'alcool ou de l'éther. On travaille à un pH voisin de la sensibilité optimale du dosage. Le pH du milieu se situe de préférence entre environ 5 et 12 et notamment entre environ 7 et 10; lorsqu'on utilise des enzymes faisant partie de la source de chimioluminescence ou de bioluminescence, le pH varie entre 7 et 9. On peut utiliser divers tampons pour obtenir le pH voulu et en maintenir la valeur pendant la détermination.Des exemples de tampons sont du borate, du phosphate, du carbonate, du "tris", du barbital, etc. La nature particulière du tampon que l'on utilise n'est pas fondamentale pour la présente invention mais dans les dosages individuels, un tampon peut être préférable à un autre.
On utilise de préférence des températures modérées pour effectuer le dosage et ces températures sont de préférence constantes au cours du dosage et sont notamment comprisea entre environ 700 et 600C et de préférence entre environ 150 et 4000.
L'ordre d'addition des divers réactifs peut largement varier, selon qu'il s'agit d'une mesure l'équilibre ou d'une mesure de vitesse de réaction, selon la nature des réactifs, selon la vitesse à laquelle l'équilibre est atteint entre le ligand et l'antiligand et selon la nature de la source de chimioluminescence ou de bioluminescence. Lorsque cette source de chimioluminescence ou de bioluminescence comporte plusieurs constituants dont l'un est un marqueur, la chimioluminescence ou la bioluminescence peut être amorcée à n'importe quel moment par l'addition des autres constituants de la source de chimioluminescence ou de bioluminescence.Lorsque la source de chimioluminescence ou de bioluminescence implique plus d'un constituant, le réactif marqué et la substance inconnue à doser peuvent être combinés simultanément, puis l'on ajoute les autres constituants de la source de chimioluminescence ou de bioluminescence avec l'agent d'extinction.
Il peut également être nécessaire d'utiliser pour le dosage une ou plusieurs périodes d'incubation.
La mesure effectuée pour l'essai ou le dosage dépend du comptage des quantas de lumière énis par le milieu de dosage. On peut utiliser pour effectuer cette mesure divers instruments, comme des détecteurs à scintillation, les cellules photoélectriques, des photonultiplicateurs ou autres systèmes compteurs de photons, capables de mesurer la lumière correspondant à une seule longueur d'onde ou à une gamme de longueurs d'onde.
La présente invention est illustrée, par les exemples suivants, nullement limitatifs.
Exemple n - Dosage de la progestérone par liaison
compétitive
Par des techniques connues de l'homme du mé- tier, on effectue une conjugaison entre une quantité connue de progestérone et l'ABEI (aminobutyléthyl isoluminol) qui est un composé chimioluminescent.
compétitive
Par des techniques connues de l'homme du mé- tier, on effectue une conjugaison entre une quantité connue de progestérone et l'ABEI (aminobutyléthyl isoluminol) qui est un composé chimioluminescent.
Les molécules de progestérone ainsi marquées sont ajoutées à l'échantillon biologique à analyser.
Par ailleurs, on marque une quantité connue d'anticorps anti-progestérone avec de la fluorescéine.
La fluorescéine émet dans le vert (525 nm); L'ABER émet dans le bleu (460 nm).
La liaison entre les antigènes marqués et les anticorps marqués conduit à un transfert d'énergie de l'ABEI vers la fluorescéine. Ce transfert d'énergie 460 traduit par un déplacement du signal 460 nm se traduit par un déplacement du signal 525 nm
La présence de progestérone non marquée dans le milieu de dosage inhibe proportionnellement à sa concentration ce déplacement du signal.
La présence de progestérone non marquée dans le milieu de dosage inhibe proportionnellement à sa concentration ce déplacement du signal.
Exemple 2 - Dosage du oLMP par liaison compétitive.
On reproduit l'exemple 1 pour le dosage du cAMP.
On laisse incuber pendant environ 2 heures le tube à essai comportant l'échantillon biologique, une quantité connue de cAMP marqué par l'ABEI ainsi que des immunoglobulines anti-cAMP marquées par la fluorescéine.
On additionne ensuite de la peroxydase et de l'eau oxygénée. On effectue une lecture simultanée à 460 nm et à 525 nm.
Exemple 3 - Dosage de la morphine par liaison compéti
tive.
tive.
On conjugue une quantité connue de morphine et de fluorescéine. La morphine ainsi marquée est ajoutée à l'échantillon biologique. On marque des anticorps anti-morphine avec un agent d'extinction la rhodamine.
On effectue le dosage par compétition entre la morphine froide présente dans l'échantillon biologique et la morphine marquée.
L'absence de morphine froide se traduit par une inhibition totale de la luminescence (phénomène de "quenching").
Plus la concentration en morphine froide est importante dans le milieu, moins le "quenching" est important.
Exemple 4 - Dosage de cG}S
On additionne une quantité connue d'anticorps anti-cGMP marqués par un agent fluorescent dans un échantillon biologique comportant un inhibiteur de fluorescence.
On additionne une quantité connue d'anticorps anti-cGMP marqués par un agent fluorescent dans un échantillon biologique comportant un inhibiteur de fluorescence.
On rince immédiatement.
Liaison antigène-anticorps, du fait qu'elle limite l'inhibition partielle de la fluorescence se traduit relativement à un système non couplé par une exaltation de fluorescence dans le milieu de dosage. En effectuant les dosages avec des quantités connues de substances à analyser, on peut mettre au point une relation quantitative entre la quantité de la substance à analyser présente dans le milieu de dosage et la quantité de rayonnement émis par ce milieu de dosage.
Claims (20)
1 - Procédé pour la détermination de la présence et/ou la concentration d'une substance à analyser dans un échantillon biologique, ladite substance constituant l'un des deux membres d'une paire immunologique comprenant un ligand ayant au moins un site épitopique et un anti ligand capable de se lier spécifiquement au site épitopique du ligand caractérisé en ce que l'on conjugue l'autre des deux membres de la paire immunologique avec un premier marqueur ou antimarqueur chimio- ou bio-luminescent et en ce que l'on effectue ladite détermination dans un milieu réactionnel comportant un second marqueur ou antimarqueur chimio- ou bioluminescent qui forme avec le premier marqueur ou antimaroueur chimio- ou bio-luminescent une paire luminescente.
2 - Procédé selon la revendication 1, caracté- risé en ce que le second marqueur ou anti marqueur chimio- ou bio-luminescent est conjugué à une quantité connue de substance à analyser et en ce qu'on effectue la détermination par un mécanisme de compétition.
3 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le second marqueur ou anti marqueur chimio- ou bio-luminescent se trouve à l'état libre dans le milieu réactionnel.
4 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le premier et/ou le second marqueur chimio- ou bio-luninescent est une première source d'émission lumineuse.
5 - Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que la source d'émission lumineuse est liée à un milieu contenant au moins un oxydant tel que l'eau oxygénée en milieu basique ou telle qu'une solution d'hypochlorite en solution alcaline.
6 - Procédé selon la revendication 4 caractérisé en ce que la source d'émission lumineuse est liée a' une substance de la famille des 2,3 dihydro-1,4- phtalazine-dione telle que le luninol, ou des familles des 2,4,5-triphénylémidazoles, hydroperoxydes. d' indolen- 3-yle, sels de bis-9,9'biracridinium substitués ou non, peroxyesters et hydroperoxydes d'acyle, luciférines.
7 - Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que la source d'émission lumineuse est liée à au moins un catalyseur enzymatique ou métallique, tel que le fer ou le zinc, se présentant éventuellement sous une forme chelatée, telle qu'une porphyrine ou phtalocyanine.
8 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 7, caractérisé en ce cue le premier ou le second antimarqueur chimio- ou bio-luminescent est une seconde source d'émission lumineuse capable de subir de la part de la première source d'émission lumineuse un transfert d'énergie puis d'émettre une luminescence facilement détectable.
9 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 7,caractérisé en ce que le premier ou le second antimarqueur est un extincteur de luminescence capable d'inhiber l'émission de la première source d'émission lumineuse.
10 - Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'extincteur de luminescence est choisi parmi les ions ou des atomes lourds tels que l'iode, le brome, le mercure ou le plomb.
Il - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que la substance à analyser est une substance biologique endogène telle qu'une protéine ou une vitamine.
12 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que le membre de la paire immunologique conjugué avec le premier marqueur ou anti marqueur chimio- ou bio-luminescent est un anticorps.
13 - Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que l'anticorps est un anticorps monoclonal.
14 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 13, caractérisé en ce que la détermination est effectuée dans un milieu homogène sans séparation de réactifs.
15 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que le milieu réactionnel comporte un solvant aqueux.
16 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que le milieu réactionnel comporte un solvant à base d'alcool ou d'éther.
17 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 16, caractérisé en ce que le pH du milieu réactionnel est compris entre 5 et 12.
18 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 17, caractérisé en ce que la température du milieu réactionnel est comprise entre 15 et 40 C .
19 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 18, caractérisé en ce que la détermination est effectuée à l'aide de détecteurs ou de systèmes compteurs de photon tels que les photomultipli cateurs ou les cellules photoélectriques.
20 - Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que les détecteurs mesurant la lumière émise à une longueur d'onde déterminée.
21 - Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que les détecteurs mesurent la lumière émise dans une gamme déterminée de longueurs d'onde.
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2617974B1 (fr) | 1992-11-13 |
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