JP2006200961A - エンドトキシンの測定方法及び測定用試薬キット - Google Patents
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Abstract
【解決手段】EIAを使ってETを測定する際に、ポリミキシンB等のETを特異的に吸着する能力を有する物質を担体上に固定化しておき、それをEIAの原理及び選択された酵素を用いれば検体からETを極めて容易に迅速に測定可能であることを見出した。
【選択図】なし
Description
医薬品や血液に直接接触する医療用具がETで汚染された場合、ごく微量でも重篤な結果を招くことがあり、これらのET汚染量は厳密に管理されなければならず、米国や日本の薬局方にもET試験法が収載されている。また、グラム陰性菌感染による敗血症の早期診断、グラム陰性菌感染症の治療効果及び予後の判定のため、血中のETを定量する試みも行われている。
このようにETは様々な分野で関心が持たれ種々のETを測定する手法が提案されてきた。
このリムルステストを用いたET測定法は、カブトガニの血球抽出液(ライセート)にETが加わると、C因子(ET感受性因子)が活性化され、それに続く連鎖的酵素反応がそれぞれ別の経路によって順次惹起され、最終的に活性化された凝固酵素が反応基質を加水分解することを利用した方法である。一般的には、1)ETとライセート中のC因子系反応によって最終的に活性化された凝固酵素が、そのプロテアーゼ活性により、コアグロゲンをコアグリンに変換してゲル化させる過程で生じる濁度変化を光学分析装置により測定する比濁法と、2)ETとライセート中のC因子系反応によって最終的に活性化された凝固酵素が、そのプロテアーゼ活性により、コアグロゲンをコアグリンに変換する際のコアグロゲンの水解部位のアミノ酸配列と類似の配列を持つ合成ペプチドに、発色基p-ニトロアニリン(pNA)を結合させた発色合成基質を用い、凝固酵素のアミダーゼ活性によって遊離するpNAの吸光度を測定する比色法の2種類が使用されている。
しかし、従来のリムルステストを用いたET測定は、用手法であるため、測定者により、測定値のばらつきが生じ、また、測定毎にセンサが必要になるなどの問題点があった。
1.エンドトキシン(以下ET)と特異的に結合する能力を有する物質を担体に固定化してえられる固相を検体と接触させ、検体中のETを固相に捕捉し、捕捉されたETに対して酵素標識物質を直接または間接的に結合させ、酵素活性を測定することによりETを測定することを含むETの測定方法。
2.ETと特異的に結合する能力を有する物質が、ポリミキシンB(以下PMX)又は抗ET抗体である前項1に記載のETの測定方法。
3.担体が、金薄膜である前項1又は2に記載のETの測定方法。
4.酵素が、アルカリフォスファターゼ又はペルオキシダーゼである前項1〜3のいずれか一に記載のETの測定方法。
5.基質が、発光基質であり、発光反応を導き、発光量により酵素活性を測定する前項1〜4のいずれか一に記載のETの測定方法。
6.発光基質が、1,2−ジオキセタン系化合物である前項5に記載のETの測定方法。
7.発光量が、光電子倍増管で増幅される前項5又は6に記載のETの測定方法。
8.ETが、Lipopolysaccharides、内毒素、リポ多糖、発熱物質、又はパイロジェンである前項1〜7の何れか一に記載のETの測定方法。
9.検体が、培養液、血液透析液及びその廃液、注射用水、医薬品、純水から選ばれる前項1〜8のいずれか一に記載のETの測定方法。
10.エンドトキシン(以下ET)と特異的に結合する能力を有する物質を担体に固定化してえられる固相を検体と接触させ、検体中のETを固相に捕捉し、これと測定すべきETに対して反応性をもつ酵素標識物質を接触させて反応させ、その後、酵素に対する基質を接触させて反応を導き、酵素活性を測定することによりETを測定することを含む前項1〜9に記載のETの測定方法。
11.エンドトキシン(以下ET)と特異的に結合する能力を有する物質を担体に固定化してえられる固相を検体と接触させ、検体中のETを固相に捕捉し、これと測定すべきETに対して反応性をもつ物質(第一物質)を接触させて反応させ、さらに第一物質と特異的に反応する酵素標識物質(第二物質)を接触させて反応させ、その後、酵素に対する基質を接触させて反応を導き、酵素活性を測定することによりETを測定することを含む前項1〜9に記載のETの測定方法。
12.前項1〜11の何れか一に記載のETの測定方法によるET夾雑の判定方法。
13.前項1〜11の何れか一に記載のETの測定方法に用いることができる試薬を含むETの測定用試薬測定キット。
捕捉されたETに酵素標識物質を直接結合させる場合、該物質は、前記PMX又は抗ET抗体等のETを特異的に吸着する能力を有する物質に酵素標識物質を修飾した物質が使用可能である。酵素は、EIA法で広く使用される系が利用可能であるが、特に好ましくはアルカリフォスファターゼ又はペルオキシダーゼ(POD)であり、より好ましくはアルカリフォスファターゼ(ALP)である。捕捉されたETに酵素標識物質を直接結合させる場合における該物質の添加量は、例えば、抗ET抗体を選択した場合、固相(表面積約10〜50mm2)に対して添加後の系全体の濃度が約0.01-300μg/ml、好ましくは約1-100μg/mlとなるように加えることが好ましい。
第二物質は、例えば第一物質として抗ET抗体を選択した場合、抗ET抗体に対する抗体であり、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を適宜公知の手法により調製可能であるが、これらも市販されているので容易に入手可能であり、広く市販の抗IgG抗体が利用できる。酵素標識には酵素等の抗体の標識化において繁用されている手段をそのまま利用出来る(臨床検査提要 免疫的定量法 金原出版)。該第二物質を間接的に結合させる場合における第二物質の添加量は、例えば該物質に抗IgG抗体を選択した場合、固相(表面積約10〜50mm2)に対して添加後の系全体の濃度が約0.01-300μg/ml、好ましくは約1-100μg/mlとなるように加えることが好ましい。
基質は、酵素反応によって色素、蛍光、発光等のマーカー物質を遊離させ、それを光学的、物理的、化学的に測定する。最適な方法は、化学発光反応を用いる方法である。発光法に使用する基質は、例えばALP用基質であるアダマンチル−1,2−ジオキセタン誘導体(富士レビオ:商品名ルミパルス)、アルカリ性下の酸化剤(H2O2,HClO,O2,MnO4 -,I2等)反応用基質であるルミノール(5−アミノ−2,3ジヒドロ−1,4フタラジンイオン)誘導体(オーソ:商品名ビストロECi)(Fe,Co,Mn,Cu等の金属やミクロペロオキシダーゼで発光が増強)、酸化反応基質のN-メチルアクリジニウム誘導体(カイロン:商品名ACS:180)等が例示されるが、これらに限定されるものではなく、酵素反応によって発光反応がおこる系は広く利用できる。
発光は、酵素と基質の接触によって例えば励起状態がおこり、これが基底状態に遷移する際に発光がおこる(図3下部参照)。この発光量をET量として換算するのである。発光はさらに、光電子倍増管を使うことでより高感度の測定が可能である。この系は、光を真空管内で増幅を行う。感光剤を塗布した光電面2に入斜窓1より入った光があたると電子が飛び出す。この電子が集極電極3による電場により加速して1番目の電子増倍部41に導き、衝突させる。その衝突により、電極から複数個の電子がたたき出され(二次電子放出効果)、それは2番目の電子増倍部42に加速されて衝突する。後は電子増倍部4内でこのプロセスを繰り返して、最終ダイノード6に達し、最終段階までには、各々の電極の増幅率の電極数乗倍となり、100万〜1000万倍の増倍となって効果的な測定が可能となる。測定は市販のフォトカウンター(浜松ホトニクス社製およびアイ・ティ・リサーチ社製など)によって行うことが可能である。図4に光電子増倍管の概念図を示した。
クリーンベンチ内で金薄膜を、ピランハ液を用いて洗浄した後、エタノールで超音波洗浄を行った。その後、1mMアミノエタンチオールのエタノール溶液に、金薄膜を浸し(室温、12時間)、エタノールで洗浄後、1mM ジカルボイミジルスベリン酸(以下DSS)/ジメチルスルホキシド(以下DMSO)溶液に2時間浸漬し、 DMSOにて洗浄した。次に、10〜1000μg/mLポリミキシンB(以下PMX)/DMSO溶液に2時間浸漬し、DMSOとETフリー水で洗浄をした。最後に、ブロックエース(大日本製薬)の希釈溶液を2時間浸漬後、ETフリーの0.05%ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル含有のPBS(塩化ナトリウム137mM、リン酸水素2ナトリウム12水和物8.1mM、リン酸2水素カリウム1.47mM、塩化カリウム2.68mM)(以降PBST)で洗浄を行いET反応用固相を作製した。
予備的準備として、測定に用いるフォトンカウンター(アイ・ティ・リサーチ社製)は暗室内に設置し、フォトンカウンターを囲うシールドボックスをさらに暗幕で覆い、計測用のパソコン等光を発するものはすべて暗室外に配置した。
次にクリーンベンチ内で実施例1で作製した反応用固相に、測定用検体3mLを室温で30分接触させた後、PBSTで洗浄し、その後1μg/mLのanti-ET IgG抗体溶液1mLを30分間接触させ、PBSTで洗浄した。次に、anti-Mouse IgG アルカリホスファターゼコンジュゲート(シグマ社製)の100倍希釈溶液1mLを30分間接触させた後、PBSTで十分洗浄を行い、3-(2'-スピロアダマンチル)-4-メトキシ-4-(m-ホスホリルオキシフェニル)-1,2ジオキセタン(和光純薬社製、以下、AMPPD)50μLと接触させた後、暗室に配置したフォトンカウンターで測定した。試料はフォトンカウンターの受光面から約2cm離して配置し、金基板とAMPPDを接触させてから80秒後に測定を開始した。
計測結果は、図1及び図2に検量線として示した。ここで、検量線における0秒は、AMPPDを接触させてから80秒後を意味する。この結果、直線の有用な検量線が達成できた。なお、測定法及び発光反応の概念図は、図3に示した。図中PMBはPMXを、anti-ETはanti-ET IgG抗体を、二次抗体・逆Y-ALPはanti-Mouse IgG アルカリホスファターゼコンジュゲートを、ALPはアルカリフォスファターゼを、発光基質の具体例は3-(2'-スピロアダマンチル)-4-メトキシ-4-(m-ホスホリルオキシフェニル)-1,2ジオキセタンを、Lightは酵素基質の反応によって生じる発光を意味する。
2 … 光電面
3 … 集束電極
4 … 電子増倍部
41 … 第一の電子増倍部
42 … 第二の電子増倍部
5 … 陽極
6 … 最終ダイノード
Claims (13)
- エンドトキシン(以下ET)と特異的に結合する能力を有する物質を担体に固定化してえられる固相を検体と接触させ、検体中のETを固相に捕捉し、捕捉されたETに対して酵素標識物質を直接または間接的に結合させ、酵素活性を測定することによりETを測定することを含むETの測定方法。
- ETと特異的に結合する能力を有する物質が、ポリミキシンB(以下PMX)又は抗ET抗体である請求項1に記載のETの測定方法。
- 担体が、金薄膜である請求項1又は2に記載のETの測定方法。
- 酵素が、アルカリフォスファターゼ又はペルオキシダーゼである請求項1〜3のいずれか一に記載のETの測定方法。
- 基質が、発光基質であり、発光反応を導き、発光量により酵素活性を測定する請求項1〜4のいずれか一に記載のETの測定方法。
- 発光基質が、1,2−ジオキセタン系化合物である請求項5に記載のETの測定方法。
- 発光量が、光電子倍増管で増幅される請求項5又は6に記載のETの測定方法。
- ETが、Lipopolysaccharides、内毒素、リポ多糖、発熱物質、又はパイロジェンである請求項1〜7の何れか一に記載のETの測定方法。
- 検体が、培養液、血液透析液及びその廃液、注射用水、医薬品、純水から選ばれる請求項1〜8のいずれか一に記載のETの測定方法。
- エンドトキシン(以下ET)と特異的に結合する能力を有する物質を担体に固定化してえられる固相を検体と接触させ、検体中のETを固相に捕捉し、これと測定すべきETに対して反応性をもつ酵素標識物質を接触させて反応させ、その後、酵素に対する基質を接触させて反応を導き、酵素活性を測定することによりETを測定することを含む請求項1〜9に記載のETの測定方法。
- エンドトキシン(以下ET)と特異的に結合する能力を有する物質を担体に固定化してえられる固相を検体と接触させ、検体中のETを固相に捕捉し、これと測定すべきETに対して反応性をもつ物質(第一物質)を接触させて反応させ、さらに第一物質と特異的に反応する酵素標識物質(第二物質)を接触させて反応させ、その後、酵素に対する基質を接触させて反応を導き、酵素活性を測定することによりETを測定することを含む請求項1〜9に記載のETの測定方法。
- 請求項1〜11の何れか一に記載のETの測定方法によるET夾雑の判定方法。
- 請求項1〜11の何れか一に記載のETの測定方法に用いることができる試薬を含むETの測定用試薬測定キット。
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