KR102127288B1 - 폴리믹신 b의 표면 고정화를 통한 그람 음성균의 신속 검출 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 그람 음성균의 신속 검출 방법에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로는, a) 그람 음성균 외벽 구성 요소 중 일부인 리포폴리사카라이드와 특이적으로 결합가능한 폴리믹신 B를 유리 기판 표면에 고정하는 단계; b) 상기 유리 기판에 그람 음성균을 가하여 상기 그람 음성균과 상기 폴리믹신 B 사이의 결합을 유도하는 단계; c) 형광 염료와 폴리믹신 B의 접합체를 제조한 후, 상기 접합체를 그람 음성균과 반응시킴으로써 상기 접합체 중 폴리믹신 B와 상기 그람 음성균 사이의 결합을 유도하는 단계; 및 d) 상기 형광 염료로부터의 형광 정도를 측정함으로써, 상기 유리 기판 표면에 고정된 폴리믹신 B에 결합된 그람 음성균을 계수하는 단계를 포함하는 그람 음성균의 신속 검출 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 종래 통상적인 군락 형성 단위 분석법에서 요구되는 배양 과정 및 별도의 희석 과정 등을 필요로 하지 않으며, 또한 그람 음성 미생물을 1시간 이내로 신속하게 검출하는 것이 가능한 바, 이는 종래 통상적으로 12 시간 정도가 소요되는 군락 형성 단위 분석법에 비해서 획기적으로 검출 시간을 단축시킨 것이다.

Description

폴리믹신 B의 표면 고정화를 통한 그람 음성균의 신속 검출 방법 {Method for aapid and sensitive detection of gram-negative bacteria using surface immobilized polymyxin B}

본 발명은 수질 내 오염물질 검출 방법에 관한 것이며, 보다 상세하게는 미생물(그람음성균)의 신속한 검출 방법에 관한 것이다.

종래 미생물을 검출하기 위한 방법으로 가장 많이 사용되어 온 방법은 군락 형성 단위 분석법 (colony forming unit (CFU) assay)이다. 군락 형성 단위 분석법은 미생물을 고형 배지 위에 도포 (spreading)하고 12시간을 인큐베이터에서 배양한 후 배지 위에 형성된 군락의 개수를 계수하여 시료 내 미생물의 농도를 측정하는 방법이다. 도 1에는 종래 군락 형성 단위 분석법에 대한 개략적인 공정도를 도시하였다. 이때, 특히, 그람 음성균만을 특이적으로 검출하기 위해서는 맥콩키 (MacConkey) 또는 에오신 메틸렌 블루 (Eosin Methylene Blue) 배지 등과 같은 선택 배지를 사용하여야 한다.

그러나, 종래 군락 형성 단위 분석법의 경우 미생물의 농도를 알기 위해서는 12시간의 배양시간이 필요하기 때문에 즉각적인 조치가 필요한 경우에도 조치를 취하기가 어렵고, 도 1에서와 같이 미생물의 농도를 정확히 알지 못하는 상황에서 희석배율을 맞추지 못할 경우 계수가 불가능하여 재실험을 수행해야 하는 등 어려움이 많이 있다. 이 외에도, 군락 형성 단위 분석법의 경우 미생물이 응집 (aggregation) 되어 있는 경우 하나의 군락으로 검출되기 때문에 실제 미생물보다 저평가 될 수 있다는 단점이 있다. 환경 내 대부분의 미생물은 응집된 형태로 존재하기 때문에, 실제 배지에 도포하기 전에 와류 혼합기 (vortex mixer)를 이용하여 최대한 단일 박테리아 형태로 플레이팅하지만 이 역시 완벽하지는 못하다. 또한, 군락 형성 단위 분석법의 가장 큰 단점은 배양법에 기초한다는 것이다. 그러나, 환경 내에 존재하는 미생물 중에 실험실에서 배양이 되는 미생물은 전체 미생물의 1% 정도밖에 되지 않기 때문에, 정확한 농도의 미생물을 검출할 수 없다.

따라서, 본 발명은 전술한 종래기술의 문제점을 해결하고자 안출된 것으로서, 종래 미생물 분석법의 단점을 개선하여 고농도의 미생물도 희석 없이 바로 측정이 가능하고, 응집된 형태의 샘플과 실험실에서 배양되지 않는 미생물들도 정확하게 검출이 가능한 그람 음성균의 신속 검출 방법을 제공하고자 한다.

본 발명은 상기 과제를 해결하기 위해서,

a) 그람 음성균 외벽 구성 요소 중 일부인 리포폴리사카라이드와 특이적으로 결합가능한 폴리믹신 B를 유리 기판 표면에 고정하는 단계;

b) 상기 유리 기판에 그람 음성균을 가하여 상기 그람 음성균과 상기 폴리믹신 B 사이의 결합을 유도하는 단계;

c) 형광 염료와 폴리믹신 B의 접합체를 제조한 후, 상기 접합체를 그람 음성균과 반응시킴으로써 상기 접합체 중 폴리믹신 B와 상기 그람 음성균 사이의 결합을 유도하는 단계; 및

d) 상기 형광 염료로부터의 형광 정도를 측정함으로써, 상기 유리 기판 표면에 고정된 폴리믹신 B에 결합된 그람 음성균을 계수하는 단계

를 포함하는 그람 음성균의 신속 검출 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 a) 단계의 상기 폴리믹신 B는 실란 커플링제를 통해서 상기 유리 기판 표면에 고정될 수 있다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 실란 커플링제는 3-아미노프로필트리에톡시실란일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 형광 염료는 녹색 형광을 발광하는 형광 염료일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 형광 염료는 플루오레세인 이소티오시아네이트 (fluorescein isothiocyanate, FITC)일 수 있다.

본 발명에 따르면, 종래 통상적인 군락 형성 단위 분석법에서 요구되는 배양 과정 및 별도의 희석 과정 등을 필요로 하지 않으며, 또한 그람 음성 미생물을 1시간 이내로 신속하게 검출하는 것이 가능한 바, 이는 종래 통상적으로 12 시간 정도가 소요되는 군락 형성 단위 분석법에 비해서 획기적으로 검출 시간을 단축시킨 것이다.

도 1은 종래 통상적인 군락 형성 단위 분석법에 대한 개략적인 공정도이다.
도 2는 본 발명의 일 구현예에 따른 방법에 있어서, 그람 음성 미생물이 폴리믹신 B를 통해서 유리 기판에 부착되고, 또한 폴리믹신 B를 통해서 형광 염료와 결합되는 모식도를 개략적으로 도시한 도면이다.
도 3은 본 발명에 있어서 폴리믹신 B와 그람 음성균이 결합하는데 소요되는 시간을 분석한 그래프이다.
도 4는 본 발명을 사용하여 검출이 가능한 미생물 농도 범위를 농도에 따른 검출 색상 및 그래프로 도시한 도면이다.
도 5a 내지 5c는 종래 플레이팅 방법, 광학 밀도 측정법 및 본 발명에 따른 방법에 있어서 분산된 미생물과 응집된 미생물의 검출 감도를 도시한 그래프이다.
도 6a는 종래 플레이팅 방법과 본 발명에 따른 방법에 있어서 난배양성 미생물의 검출가능 정도를 그래프로 도시한 것이고, 도 6b는 다양한 환경에서 배양가능한 미생물이 차지하는 비율을 도시한 것이다.
도 7a 내지 7c는 각각 청색 염료인 DAPI를 사용하여 미생물만을 염색 관찰한 사진 (7a), 본 발명에 따른 방법을 사용하여 미생물을 관찰한 사진 (7b), 및 7a와 7b의 사진을 중첩 관찰한 사진 (7c)을 도시한 것이다.

이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다.

본 발명은 종래 미생물 분석의 문제점으로 지적되는 미생물 배양 문제 및 이에 따른 장시간 소요 문제 등의 단점을 해결하고자 안출된 것으로서, 본 발명에 따른 그람 음성균의 신속 검출 방법은,

a) 그람 음성균 외벽 구성 요소 중 일부인 리포폴리사카라이드와 특이적으로 결합가능한 폴리믹신 B를 유리 기판 표면에 고정하는 단계;

b) 상기 유리 기판에 그람 음성균을 가하여 상기 그람 음성균과 상기 폴리믹신 B 사이의 결합을 유도하는 단계;

c) 형광 염료와 폴리믹신 B의 접합체를 제조한 후, 상기 접합체를 그람 음성균과 반응시킴으로써 상기 접합체 중 폴리믹신 B와 상기 그람 음성균 사이의 결합을 유도하는 단계; 및

d) 상기 형광 염료로부터의 형광 정도를 측정함으로써, 상기 유리 기판 표면에 고정된 폴리믹신 B에 결합된 그람 음성균을 계수하는 단계를 포함한다.

도 2에는 본 발명에 따른 방법을 사용하여 유리 기판 상에 고정되고, 형광 염료 및 폴리믹신 B의 접합체와 결합된 그람 음성 미생물을 개략적으로 나타낸 도면을 도시하였다. 도 2를 참조하면, 본 발명에 따른 방법에서는 먼저 유리 기판 상 (200)에 그람 음성균 (230)의 외벽을 구성하는 성분인 리포폴리사카라이드 (240)와 특이적으로 결합할 수 있는 폴리믹신 B (220)를 고정하게 된다. 이러한 폴리믹신 B (220)의 유리 기판 (200)에 대한 고정 단계는, 예를 들어 실란 계열의 커플링제 (210)로서, 3-아미노프로필트리에톡시실란 등을 사용하여 수행될 수 있다.

다음으로, 상기 폴리믹신 B (220)와 그람 음성균 (230)의 결합을 유도한 다음, 결합된 그람 음성균 (230)만을 선택적으로 형광 검출하기 위한 과정을 수행하게 된다. 이러한 선택적 형광 검출은 형광 염료 (250)가 부착된 폴리믹신 B-형광 염료 접합체를 사용하여 수행될 수 있는데, 이러한 접합체의 폴리믹신 B (220) 성분은 그람 음성균 (230)에 결합하고, 그람 음성균에 결합된 접합체의 형광 염료 (250) 성분으로부터 발광되는 형광 정도를 측정함으로써 유리 기판 (200) 표면에 고정된 폴리믹신 B (220)에 결합된 그람 음성균 (230)을 계수할 수 있게 된다.

본 발명에 있어서, 상기 형광 염료는 녹색 형광을 발광하는 형광 염료로서, 예를 들어 플루오레세인 이소티오시아네이트 (fluorescein isothiocyanate, FITC)일 수 있다.

이하, 실시예를 통해서 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 하되, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

미생물 검출 소요시간의 측정

도 3은 본 발명에 있어서 폴리믹신 B와 그람 음성균이 결합하는데 소요되는 시간을 분석한 그래프이다. 도 3을 참조하면, 유리 기판 상에 고정된 폴리믹신 B인 일차 폴리믹신 B (그래프에서 △로 표시)와 그람 음성균이 결합하는데 대략 20분 정도의 시간이 소요되고, 형광 염료와 결합한 폴리믹신 B인 이차 폴리믹신 B (그래프에서 □로 표시)와 그람 음성균이 결합하는데에도 대략 20분 정도의 시간이 소요되므로, 본 발명에 따른 방법을 사용하여 그람 음성균을 검출할 경우, 총합 1 시간 이내에는 그람 음성균을 검출할 수 있다는 점에서, 종래 12 시간 이상이 소요되던 CFU 분석 방법과 비교할 때, 분석 시간이 획기적으로 감소한다는 것을 알 수 있다.

검출 가능 미생물 농도 범위

도 4는 본 발명을 사용하여 검출이 가능한 미생물 농도 범위를 농도에 따른 검출 색상 및 그래프로 도시한 도면이다. 본 발명에 따른 방법은 종래 통상적인 CFU 분석 방법과 비교할 때, 많은 양의 희석이 필요치 않고, 희석배율에 큰 영향을 받지 않아서 고농도의 미생물이 함유된 시료라 하더라도 정확한 측정이 가능하다.

도 4를 참조하면, 본 발명에 따른 방법을 이용할 경우, ml 당 1 CFU ~ 1,000 CFU까지 별도의 희석 없이도 측정이 가능하였으며, 이는 미생물을 검출하는데 필요한 시간뿐만 아니라 희석과 같은 전처리에 소요되는 시간도 줄일 수 있기 때문에 매우 신속한 검출이 가능하다는 것을 의미한다. 특히, ml 당 1 CFU까지 검출이 가능한 기술은 전례없는 민감도를 보여주는 수준이다.

미생물 군집 형태에 따른 분석 차이 비교

환경에서 미생물은 각각 존재하는 것이 아니라 대부분 무리지어 응집된 형태로 존재한다. 군집 형태의 미생물과 분산된 미생물의 경우 검출방법에 따라서 차이를 보이게 되는데, CFU 분석 방법의 경우는 응집된 미생물로 인해서 저평가되는 것을 방지하고자 와류 혼합기를 이용하여 도포 전에 최대한 미생물을 분산시키는 과정을 거친다.

도 5a 내지 5c는 종래 플레이팅 방법, 광학 밀도 측정법 및 본 발명에 따른 방법에 있어서 분산된 미생물과 응집된 미생물의 검출 감도를 도시한 그래프이며, 도 5a 를 참조하면, 종래 플레이팅 방법인 CFU 분석법의 경우 분산된 미생물과 그렇지 못한 미생물의 경우 군락 형성 단위가 7,216에서 1,350,178로 약 19배 가량 차이가 나타나는 것을 알 수 있다. 그러나, 본 발명에 따른 방법 (도 5c)의 경우, 분산된 형태의 시료와 응집된 시료 사이에서 형광 세기의 차이가 크지 않고, 따라서 응집에 의해서 시료가 저평가되는 정도를 15% 이하로 줄일 수 있다.

난배양성 미생물의 검출가능 정도

환경 내에 존재하는 다양한 미생물 중에서 실제로 실험실 환경에서 배양이 가능한 미생물은 총 미생물의 1%에도 미치지 못한다. 실제로, 도 6b에는 다양한 환경에서 배양가능한 미생물이 차지하는 비율을 도표로 도시하였으며, 이를 참조하면, 활성 슬러지의 경우에도 배양가능한 미생물이 차지하는 비중은 1 내지 15% 정도에 불과하다.

따라서, 배양법에 의지하는 기존의 분석 방법들의 경우, 환경시료에 존재하는 미생물을 정확하게 측정했다고 보기 어려우며, 존재하는 대부분의 미생물을 검출하지 못한 결과라 하여도 과언이 아니다. 그러나, 본 발명에 따른 방법은 배양법에 기초한 방법이 아니기 때문에 시료 내에 존재하는 미생물을 직접 검출이 가능하다는 장점을 갖는다. 실제, 도 6a에는 토양 2 mg을 증류수 50 ml에서 넣고 충분히 교반한 다음, 상등액을 CFU 분석법과 본 발명에 따른 방법으로 그람 음성균을 측정한 결과를 도시하였으며, 도 6a를 참조하면, CFU 분석법에서는 120 CFU 정도의 미생물이 검출된 반면, 본 발명에 따른 방법에 의해서는 1,400 CFU에 해당하는 미생물을 검출할 수 있었다는 사실을 알 수 있다.

형광 발광 실험

도 7a 내지 7c는 각각 청색 염료인 DAPI를 사용하여 미생물만을 염색 관찰한 사진 (7a), 본 발명에 따른 방법을 사용하여 미생물을 관찰한 사진 (7b), 및 7a와 7b의 사진을 중첩 관찰한 사진 (7c)을 도시한 것이다. 도 7a 내지 7c를 참조하면, 청색 염료를 사용하여 미생물을 염색 관찰한 도 7a의 사진과, 본 발명에 다른 방법을 사용하여 미생물을 관찰한 도 7b의 사진은, 도 7c에서 관찰할 수 있는 바와 같이, 미생물 존재 위치에서 일치하는 것을 확인할 수 있다.

200: 유리 기판 210: 실란 계열의 커플링제
220: 폴리믹신 B 230: 그람 음성균
240: 리포폴리사카라이드 250: 형광 염료

Claims (5)

1. a) 리포폴리사카라이드와 특이적으로 결합가능한 제1 폴리믹신 B를 유리 기판 표면에 고정하는 단계;
   b) 다수의 상기 리포폴리사카라이드가 외벽을 구성하는 그람 음성균을 상기 유리 기판에 가함으로써, 다수의 상기 리포폴리사카라이드 중 일부와 상기 제1 폴리믹신 B 사이의 결합을 유도하여, 상기 그람 음성균을 상기 유리 기판에 고정하는 단계;
   c) 형광 염료와 제2 폴리믹신 B의 접합체를, 상기 유리 기판에 고정된 상기 그람 음성균과 반응시킴으로써, 다수의 상기 리포폴리사카라이드 중 다른 일부와 상기 제2 폴리믹신 B 사이의 결합을 유도하여, 상기 그람 음성균과 상기 접합체를 결합시키는 단계; 및
   d) 상기 형광 염료로부터의 형광 정도를 측정함으로써, 상기 유리 기판에 고정된 그람 음성균을 계수하는 단계;
   를 포함하는 그람 음성균의 신속 검출 방법.
2. 제1항에 있어서,
   상기 a) 단계의 상기 제1 폴리믹신 B는 실란 커플링제를 통해서 상기 유리 기판 표면에 고정되는 것을 특징으로 하는 그람 음성균의 신속 검출 방법.
3. 제2항에 있어서, 상기 실란 커플링제는 3-아미노프로필트리에톡시실란인 것을 특징으로 하는 그람 음성균의 신속 검출 방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 형광 염료는 녹색 형광을 발광하는 형광 염료인 것을 특징으로 하는 그람 음성균의 신속 검출 방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 형광 염료는 플루오레세인 이소티오시아네이트 (fluorescein isothiocyanate, FITC)인 것을 특징으로 하는 그람 음성균의 신속 검출 방법.

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