JP2018528424A - 増強された感度を有するイムノアッセイ - Google Patents

Abstract

本発明は、イムノアッセイの感度を増大させるための方法に関する。本発明は、固相から、非特異的に結合した複合体よりも特異的に結合した免疫複合体を選択的に溶出する、酸溶出条件を利用し、そして、非特異的結合に対する特異的結合の比を改善し、それによってアッセイ感度を改善する、イムノアッセイプロトコルを設計する。当該プロトコルは、固相から溶出した標識された免疫複合体のシグナルを決定する。

Description

発明の背景
イムノアッセイ感度を改善することは、イン・ビトロ診断試験の開発における長年の目標であった。患者のトリアージにおける早期の疾病検出及び費用効果のための高感度のバイオマーカー測定の利点は、十分に文書化されている。時間の経過とともに、それぞれのその後の反復が改善された感度を特徴とする、いくつかの世代において多くの臨床アッセイが提供されている。トロポニンＩイムノアッセイは、高感度のバージョンが最先端技術を代表する、そのような例の１つである。

高感度のトロポニンＩ（ｈｓＴｎｌ）アッセイの採用を推進することには、いくつかの臨床的要因が関与している。正常な患者は、循環する、１桁のｐｇ／ｍｌの範囲で低レベルのＴｎＩを有するという認識がある。第二に、小さな心臓発作は、正常と非常に類似したＴｎＩレベルを有する。結果として、正常範囲内のＴｎＩを検出する能力が重要である。Apple(Clin. Chem.、55:1303-1306、2009)は、正常なサンプルでの性能を中心とするｈｓＴｎＩアッセイの指定を報告している。図１は、ｈｓＴｎＩアッセイが満たさなければならないパラメータを示している。正常の５０％超が検出されなければならず、正規分布の９９番目のパーセンタイルでの不正確さは、ガイドラインが許容されるための＜１０％であるか、又は臨床的に有用であるための１０〜２０％でなければならない。

図２は、捕捉抗体が固相上に固定されている、捕捉抗体及び標識抗体による典型的なサンドイッチイムノアッセイ形式を示す。標識抗体による２つの基本的な結合の種類がある。免疫特異的結合は、標識抗体が固相上の抗原と複合体を形成した場合に起こる。これは、抗原検出を可能にするので、関連性のある特異的結合である。第２の種類の結合は非特異的であり、標識抗体が特異的抗原以外の手段によって固相に結合する。全ての固相構成サンドイッチイムノアッセイは、非特異的結合に対する特異的結合のいくつかの組み合わせを有する。高感度イムノアッセイでは、非特異的結合に対する特異的結合の比が低い抗原レベルで重要となる。結果として、高感度アッセイの開発者は、非特異的結合を最小限に抑える手段を模索しつつ、特異的結合を最大限にしようと努力する。

本発明は、イムノアッセイにおけるシグナル対バックグラウンド比を増大させ、従ってアッセイ感度を増大させるための方法に関する。本発明者らは、固相から特異的免疫複合体を溶出する条件が、非特異的複合体を溶出する条件とは異なることを発見した。本発明者らは、固相から、非特異的複合体よりも特異的免疫複合体を選択的に溶出する溶出条件を発見し、次に、非特異的結合に対する特異的結合の測定比を改善し、それによってアッセイ感度を改善する、イムノアッセイプロトコルを設計した。本発明は、固相上に結合された後に、固相から溶出した標識された免疫複合体のシグナルを決定することによって、分析物を検出する。

図１は、高感度トロポニンＩ（ｈｓＴｎｌ）が正常に基づいて満たさなければならないパラメータを示す。 図２は、典型的な固相サンドイッチイムノアッセイ形式を示す。ＡＢ＝抗体、ＡＧ＝抗原。 図３は、プローブ先端上の蛍光を検出する、蛍光検出システムの一実施形態を示す。 図４は、代替蛍光検出システムを示す。広いレーザービーム及び集光レンズの開口数を有する光学系が、液相中の溶出された標識抗体を検出する。 図５は、直接抗体結合アッセイにおいて蛍光標識抗体及び酸溶出プロトコルを用いて、液体サンプル中の分析物を検出する方法を示す。溶出された物質の蛍光シグナルは、プローブ上で読み取られた第１の蛍光シグナルからプローブ上で読み取られた第２の蛍光シグナルを減算することによって計算される。Ａｂ：抗体。 図６は、増幅アッセイにおいて、複数の蛍光標識を有する結合対及び高分子量ポリマーを用いて、液体サンプル中の分析物を検出する方法を示す。Ａｇ：抗原；ＡＢ：抗体；Ｂ−ＡＢ：ビオチン−抗体；Ｃｙ５−ＳＡ：Ｃｙ５−ストレプトアビジン。 図７は、循環増幅アッセイにおける、液体サンプル中の分析物を検出する方法を示す。図７が感度を向上させるための付加的な循環増幅工程を有する点を除いて、図７は図６と同様である。

発明の詳細な説明
定義
特許請求の範囲及び明細書で使用される用語は、以下に定義するもののほか、当業者によって理解される、当該用語の通常の意味に従って解釈されるべきである。

「約」は、本明細書で使用される場合、記載された値の±１０％以内を指す。

「分析物−結合」分子は、本明細書で使用される場合、分析物分子との特異的結合反応に関与することができる任意の分子を指す。例として、限定されるものではないが、（ｉ）その抗原に対して特異的な抗体の存在を検出する際に使用するための、抗原分子；（ｉｉ）抗原の存在を検出する際に使用するための、抗体分子；（ｉｉｉ）そのタンパク質の結合パートナーの存在を検出する際に使用するための、タンパク質分子；（ｉｖ）結合パートナーの存在を検出する際に使用するための、リガンド；又は（ｖ）核酸結合分子の存在を検出するための、一本鎖核酸分子、を含む。

形状の「アスペクト比」とは、短い方の寸法に対する長い方の寸法との比を指す。

「結合分子」は、目的の別の分子に結合することができる分子を指す。

「結合対」は、本明細書で使用される場合、互いに引き付けられ、互いに特異的に結合する、２つの分子を指す。結合対の例としては、限定されるものではないが、抗原及びその抗原に対する抗体、リガンド及びその受容体、核酸の相補鎖、ビオチン及びアビジン、ビオチン及びストレプトアビジン、ビオチン及びニュートラアビジン（アビジンの脱グリコシル化型）、レクチン及び炭水化物、が挙げられる。好ましい結合対は、ビオチン及びストレプトアビジン、ビオチン及びアビジン、ビオチン及びニュートラアビジン、フルオレセイン及び抗フルオレセイン、ジゴキシゲニン／抗ジゴキシゲニン、並びに、ＤＮＰ（ジニトロフェノール）及び抗ＤＮＰである。

「分枝ポリマー」は、本明細書で使用される場合、天然に存在する分枝ポリマー又は合成架橋ポリマーのいずれかであり得る、２次元又は３次元構造を有する非線状ポリマーを指す。

「化学発光（Chemiluminescence）」は、本明細書で使用される場合、化学反応の結果として、限定された発光の放出による、エネルギーの放出を指す。例えば、ルミノールが好適な触媒の存在下で過酸化水素と反応する場合、それは励起状態で３−アミノフタラートを生成し、これはより低いエネルギーレベルへと減衰する際に光を放出する。

「電気化学発光」（ＥＣＬ）は、本明細書で使用される場合、溶液中での電気化学反応中に生じる発光を指す。ＥＣＬでは、電気化学的に生成した中間体が、高度の発エルゴン反応を受けて、電子的に励起した状態を生じ、次いで発光する。ＥＣＬ励起は、電気発生種（electrogenerated species）のエネルギー的電子移動（レドックス（redox））反応によって引き起こされる。ＥＣＬは通常、発光種の溶液を含有する電気化学セルの電極に電位（数ボルト）を印加する際に観察される。

「固定化」は、本明細書で使用される場合、試薬が固体表面に固定されることを指す。試薬が固体表面に固定化される場合、試薬は表面に非共有的に結合されるか、又は共有的に結合される。

「モノリス担体」は、本明細書で使用される場合、１つの屈折率を有するガラス、石英、又はプラスチックなどの固体材料の単一片を指す。

「プローブ」は、本明細書で使用される場合、検知側で分析物−結合分子の薄膜層で被覆された固相基質を指す。プローブは、遠位端及び近位端を有する。近位端（本出願においてプローブ先端ともいう）は、分析物−結合分子の薄層で被覆された検知表面を有する。

蛍光検出システム
本発明は、任意の好適な発光検出システムを使用することができる。一実施形態において、本発明は、プローブ先端上の蛍光シグナルを測定するため、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第８，４９２，１３９号に記載されたものと同様の蛍光検出システムを使用する。該システムは、以下：（ａ）少なくとも５対１の長さ対幅のアスペクト比を有するプローブであって、第１の端部及び第２の端部を有し、当該第２の端部は蛍光標識に結合された検知表面を有する、プローブ；（ｂ）励起光をプローブの検知表面に直接放射するための光源；（ｃ）検知表面に向けられた集光レンズ；並びに（ｄ）発光蛍光を検出するための光検出器；を備え、ここで、前記集光レンズが発光蛍光を集光し、光検出器に導く。

プローブは、モノリス担体又は光ファイバとすることができる。プローブは、長さと幅のアスペクト比が少なくとも５：１、好ましくは１０：１である棒状、円筒状、円形、正方形、三角形などの任意の形状とすることができる。イムノアッセイの間にプローブはサンプル溶液及び１以上のアッセイ溶液に浸漬されるため、溶液中へのプローブ先端の浸漬を可能にするために、少なくとも５対１のアスペクト比を有する長いプローブを有することが望ましい。プローブの検知表面は分析物−結合分子で被覆され、蛍光標識と結合される。

蛍光標識に適切な励起光を発することができる任意の光源が、本発明に適している。好ましい光源は、蛍光標識に適した波長を有する光を発することができるレーザーである。例えば、レーザー中心波長は、Ｃｙ５蛍光色素のために６４９ｎｍであることが好ましい。
放出光を検出するのに適した光検出器は、光電子増倍管（ＰＭＴ）、電荷結合素子（ＣＣＤ）、又はフォトダイオードである。

光源、及び集光レンズを含む光検出器は、プローブ先端表面（検知表面）の同じ側に取り付けられている。検知表面が下向きの場合、両者は先端面の下に取り付けられる。検知表面が上向きの場合、両者は先端面の上に取り付けられる。それらは、プローブの他端よりも検知表面に近い。検知表面は常に集光レンズの開口数以内である。プローブは、集光レンズと中心を合わせることができるが、必ずしも合わせなくてもよい。

図３は、プローブ先端上の蛍光シグナルを測定する蛍光検出システムの一実施形態を示す。

図４は、代替光学検出構成を示す。広いレーザービーム及び集光レンズの開口数を有する光学系が、液相中の溶出された標識抗体を検出する。この設計はいくつかの利点を有する。プローブ先端での蛍光の測定は、低いバックグラウンド蛍光を有するプローブ材料の選択を必要とする。この代替構成では、蛍光は液相にある。プローブはもはや測定工程にはないので、それはプローブのための固相材料のより多い選択肢を提供する。さらに、広いビームレーザー及び広範囲の蛍光収集は、光学系の重要なアライメントをほとんど必要とせず、これはコストの低減及びより堅牢な装置をもたらす。

直接抗体結合アッセイ
第１の態様において、本発明は、発光標識抗体及び酸溶出プロトコルを用いて、液体サンプル中の分析物を検出する方法に関する。

一実施形態において、溶出された物質の発光シグナルは、プローブ上の第１の発光シグナルからプローブ上の第２の発光シグナルを減算することによって、計算される。当該方法は、以下の工程：（ａ）プローブ先端を、サンプル溶液を含むサンプル容器中に浸漬して、分析物を、存在する場合、プローブ先端上の第１の抗体に結合させ、ここで、前記プローブは、プローブの先端上に固定化された分析物に対する第１の抗体を有し；（ｂ）前記プローブ先端を、発光標識とコンジュゲートした分析物に対する第２の抗体を含有する試薬溶液を含む試薬容器中に浸漬して、プローブ先端上で前記分析物、前記第１の抗体、及び前記第２の抗体との間で免疫複合体を形成させ；（ｃ）前記プローブ先端を、洗浄溶液を含む洗浄容器中に浸漬し；（ｄ）前記プローブ先端を読み取り容器に浸漬し、そして、プローブ先端上に結合した物質の第１の発光シグナルを測定し；（ｅ）前記プローブ先端を、ｐＨ２．０〜５．０を有する溶出溶液に浸漬して、前記プローブ先端から物質を溶出させ；（ｆ）前記プローブ先端を読み取り容器に浸漬し、そして、プローブ先端上に結合した物質の第２の発光シグナルを測定し；（ｇ）前記第１の発光シグナルから前記第２の発光シグナルを減算することによって、溶出された物質の発光シグナルを計算し、そして、分析物量を決定すること、を含む。当該方法を図５に示す。

本方法において、プローブはアッセイ前に、分析物に対する抗体で固定化される。第１の抗体を固相（プローブ先端の検知表面）に固定化する方法は、免疫化学において一般的であり、固相と抗体との間での共有結合、疎水性結合又は静電結合の形成を含む。第１の抗体は、分析物を捕捉するその能力のために捕捉抗体とも呼ばれ、当該技術分野で知られている様々な方法によって、検知表面上に直接固定化され得る。例えば、第１の抗体は、固体表面への吸着によって、又は固体表面上に被覆されたアミノプロピルシランとの共有結合によって、直接固定化され得る。あるいは、第１の抗体は、結合対を介して検知表面上に間接的に固定化され得る。例えば、第１の抗体は、既知の技術によってビオチンで標識され（Wilchek及びBayer、(1988)Anal. Biochem. 171:1-32参照）、次いでストレプトアビジンで被覆された検知表面上に間接的に固定化され得る。ビオチン及びストレプトアビジンは、その強い結合親和性のために好ましい結合対であり、本方法の再生工程中に解離しない。検知表面上に固定化された捕捉抗体は、免疫反応後に検知表面に結合した免疫複合体を除去するためにプローブ検知表面が再生される際の、変性条件を生き残ることができなければならない。検知表面上に固定化された捕捉抗体は、イムノアッセイ性能が損なわれるように、有意な量の活性を失ってはならず、又は固相から著しく解離してはならない。

一実施形態において、本方法は、分析物に結合するための小さな先端を有するプローブを使用する。当該先端は、直径が≦５ｍｍ、好ましくは≦２ｍｍ又は≦１ｍｍのより小さな表面積を有する。プローブ先端の小さな表面にはいくつかの利点がある。固相イムノアッセイでは、非特異的結合がより少なく、従ってより低いバックグラウンドシグナルを生じるため、小さい表面積を有することは有利である。さらに、先端の小さな表面積によって、プローブ先端上の試薬又はサンプルのキャリーオーバーは非常に小さい。この特徴により、プローブ先端を容易に洗浄することができ、かつ、洗浄溶液がより大きい体積を有するために、洗浄溶液中の汚染をごくわずかしか引き起こさない。

本方法の工程（ａ）では、プローブ先端をサンプル容器（又はサンプルチャンバー又はサンプルウェル）中に浸漬し、一定時間インキュベートして、分析物をプローブ先端上の第１の抗体に結合させる。インキュベーション時間は好ましくは、短時間（≦５又は１０分）であり、例えば、５秒〜５分、１０秒〜２分、３０秒〜２分、１０秒〜１分、又は３０秒〜１分である。

工程（ａ）の後に、プローブは、水性洗浄溶液を含む洗浄容器（又は洗浄チャンバー又は洗浄ウェル）中で、１〜５回、好ましくは１〜３回、場合により洗浄される。キャリーオーバー溶液が最小限である場合、この洗浄工程は必要でない場合もある。洗浄溶液は典型的には、緩衝液及び界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ ２０を含有する。

本方法の工程（ｂ）では、プローブ先端を試薬容器（又は試薬チャンバー又は試薬セル）中に浸漬して、試薬をプローブ先端上の分析物に結合させる。インキュベーション時間は好ましくは、短時間（≦５又は１０分）であり、例えば、５秒〜５分、１０秒〜２分、３０秒〜２分、１０秒〜１分、又は３０秒〜１分である。試薬溶液は、発光標識された第２の抗体（シグナル抗体）を含有する。

任意の好適な発光標識、例えば蛍光標識又は化学発光を本方法に使用することができる。本発明に有用な蛍光標識は、５，０００未満、好ましくは２，０００未満、例えば５００〜２０００又は１００〜２０００ダルトンの分子量を有する。一実施形態において、蛍光色素は、以下：シアニン、クマリン、キサンテン及びそれらの誘導体からなる群から選択される。 例えば、蛍光色素は、Ｃｙ５（分子量ＭＷ７９２）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７、ＤｙＬｉｇｈｔ ３５０（８７４）、ＤｙＬｉｇｈｔ ４０５（ＭＷ７９３）、ＤｙＬｉｇｈｔ ４８８（ＭＷ７１０１１）、ＤｙＬｉｇｈｔ ５５０（ＭＷ９８２）、ＤｙＬｉｇｈｔ ５９４（ＭＷ１０７８）、ＤｙＬｉｇｈｔ ６３３（ＭＷ１０６６）、ＤｙＬｉｇｈｔ ６５０（ＭＷ１００８）、ＤｙＬｉｇｈｔ ６８０（ＭＷ９５０）、ＤｙＬｉｇｈｔ ７５５（ＭＷ１０９２）、ＤｙＬｉｇｈｔ ８００（ＭＷ１０５０）、Ｏｙｓｔｅｒ蛍光色素、ＩＲＤｙｅ、又はランタノイド（Ｅｕ、Ｔｈ、Ｓｍ、又はＤｙ）などの希土類金属とキレート化した複数の環を含む有機化合物である。

蛍光標識の一例は、Mujumdarら(1993)Bioconjugate Chemistry、4:105-111;Southwick et al. (1990)Cytometry、11:418-430；及び米国特許第５，２６８，４８６号に記載された、アリールスルホネートシアニン（arylsulfonate cyanine）蛍光色素である。Ｃｙ５は、高い吸光係数及び良好な量子収量を有するので、好ましいアリールスルホネートシアニン蛍光色素である；Ｃｙ５はまた、ほとんどの生物学的材料及びプラスチックの自己蛍光波長の外側の範囲（５００ｎｍ〜７５０ｎｍ）の蛍光発光スペクトルを有する。さらに、Ｃｙ５は水に良好な溶解性を有し、低い非特異的結合特性を有する。

他の発光標識が蛍光標識に替えて本発明に使用されてもよい。例えば、発光標識は、化学発光マーカー、例えばルミノール（ＭＷ１７７）及びアクリジニウムエステル（９［［４−［３−［（２，５−ジオキソ−１−ピロリジニル）オキシ］−３−オキソプロピル］フェノキシ］カルボニル］−１０−メチル−アクリジニウムトリフルオロメタンスルホネート、ＭＷ６３２）であり得る。発光標識はまた、電気化学発光マーカー、例えばルテニウム（ＩＩ）トリス−ビピリジン（ＭＷ１０５７）であり得る。

発光標識は、科学及び特許文献に記載された従来の共役化学を用いて、ジスルフィド、ヒドロキシフェニル、アミノ、カルボキシル、インドール、又は他の官能基を含む様々な部分を介して、第２の抗体に共有結合することができる。アリールスルホネートシアニン蛍光色素標識を、抗体及び他のタンパク質に結合するための例示的な技術は、米国特許第５，２６８，４８６号；５，６５０，３３４号に記載されており；その内容は参照により本明細書に組み込まれる。好ましいＣｙ５蛍光標識を抗体に連結する技術は、Biological Detection Systems,Inc.（ピッツバーグ、Ｐａ）によって発行された、Cat. No.Ａ２５０００として特定される技術告示に記載されている。

工程（ｃ）では、プローブは、洗浄溶液を含む第１の洗浄容器中で、１〜５回、好ましくは１〜３回洗浄される。洗浄溶液は典型的には、緩衝液及び界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ ２０を含有する。

工程（ｄ）では、プローブを読み取り容器に移動させ、プローブ先端上に結合した免疫複合体の発光シグナルを上述の発光検出システムによって検出する（例えば、図３参照）。ここで、光源及び検出器はプローブの検知表面の同じ側（近位側）に取り付けられる。あるいは、発光シグナルは、他の好適な発光検出システムによって検出することができる。読み取り容器は水溶液、例えば水を含む。サンプルのインキュベーション後にプローブを洗浄するために使用される洗浄容器は、読み取り容器として使用することもできる。

工程（ｅ）では、プローブ上に結合した免疫複合体が、プローブに結合した免疫複合体などの物質を解離させる変性条件を用いることによって、溶出される。一般に、ｐＨ約１．５〜約５．５又は約２．０〜５．５を有する酸又は酸性緩衝液が、プローブ上に結合した免疫複合体を溶出させるのに有効である。例えば、塩酸、硫酸、硝酸、酢酸又は酸性緩衝液を溶出に使用することができる。分析物及びアッセイに応じて、至適ｐＨは、約ｐＨ２．０〜３．０、３．０〜４．０、３．５〜４．５、又は４．０〜５．０であり得る。

溶出工程（ｅ）の後に、プローブ先端を読み取り容器に浸漬し、その発光シグナル（第２の発光シグナル）を工程（ｆ）で測定する。

工程（ｇ）では、溶出された物質の発光シグナルが、前記第１の発光シグナルから前記第２の発光シグナルを減算することによって計算され、そして、検量線（標準曲線）に対して溶出された物質の発光シグナルを定量することによって、分析物量が決定される。検量線は典型的には、サンプルをアッセイする前に予め設定される。

工程（ａ）におけるサンプル結合に先立って、プローブ先端の発光シグナルは、場合により、読み取り容器中の同じ発光検出システムによって予め読み取られる。読み取り容器は水溶液、例えば水又は緩衝液を含む。事前読み取りは、プローブ先端の任意の潜在的バックグラウンド発光のベースラインを確立する。

上記工程において、容器中の溶液を攪拌又は混合することによって、反応を促進することができる。例えば、プローブ先端を横切る溶液の側方流動又は環状流動（orbital flow）などの流動を、結合反応、解離を促進するために、サンプル容器、試薬容器、洗浄容器、及び／又は溶出容器を含む、１又は複数の反応容器内で誘導することができる。例えば、反応容器はオービタルシェーカー上に取り付けることができ、このオービタルシェーカーを少なくとも５０ｒｐｍ、好ましくは少なくとも２００ｒｐｍ又は少なくとも５００ｒｐｍ、例えば５０〜２００又は５００〜１，５００ｒｐｍの速度で回転させる。さらに、プローブ先端の上下で溶液のさらなる混合を誘導するために、プローブ先端を０．０１〜１０ｍｍ／秒の速度で環状流動の面に対して垂直に上下に動かすことができる。

直接抗体結合アッセイの代替実施形態では、分析物量は、異なる光学系を用いて、液相中の溶出された物質の発光シグナルから直接決定される。当該方法は、以下の工程：（ａ）プローブ先端を、サンプル溶液を含むサンプル容器中に浸漬して、分析物を、存在する場合、プローブ先端上の第１の抗体に結合させ、ここで、前記プローブは、プローブの先端上に固定化された分析物に対する第１の抗体を有し；（ｂ）前記プローブ先端を、発光標識とコンジュゲートした分析物に対する第２の抗体を含有する試薬溶液を含む試薬容器中に浸漬して、プローブ先端上で前記分析物、前記第１の抗体、及び前記第２の抗体との間で免疫複合体を形成させ；（ｃ）前記プローブ先端を、洗浄溶液を含む洗浄容器中に浸漬し；（ｄ）前記プローブ先端を、ｐＨ２．０〜５．０を有する溶出溶液を含む溶出容器中に浸漬して、前記プローブ先端から物質を溶出させ；（ｅ）前記溶出容器から前記プローブ先端を取り出し；（ｆ）前記溶出容器中の溶出された物質の発光シグナルを測定し；そして、分析物量を決定すること、を含む。

この代替実施形態では、工程（ａ）〜（ｅ）は、第１の実施形態で上述した工程と同じである。工程（ｅ）の後に、プローブは取り出され、プローブはもはや測定工程にはない。溶出された物質の発光シグナルは、上述の発光検出システムを用いて、溶出容器内の液相から直接測定される（例えば、図４参照）。

増幅アッセイ
第２の態様では、本発明は、複数の発光標識を有する結合対及び高分子量ポリマーを用いて、液体サンプル中の分析物を検出する方法に関する。

第１の実施形態において、溶出された物質の発光シグナルは、プローブ上で読み取られた第１の発光シグナルからプローブ上で読み取られた第２の発光シグナルを減算することによって計算される。当該方法は、以下の順で以下の工程：（ａ）プローブ先端を、サンプル溶液を含むサンプル容器中に浸漬して、分析物を、存在する場合、プローブ先端上の第１の抗体に結合させ、ここで、前記プローブは、プローブの先端に固定化された分析物に対する第１の抗体を有し；（ｂ）前記プローブ先端を、結合対の第１のメンバーとコンジュゲートした分析物に対する第２の抗体の試薬を含有する試薬溶液を含む試薬容器中に浸漬して、前記試薬を前記分析物に結合させ；（ｃ）前記プローブ先端を、第１の洗浄溶液を含む第１の洗浄容器中に浸漬して、前記プローブ先端を洗浄し；（ｄ）前記プローブ先端を、少なくとも１００万ダルトンの分子量を有し、かつ結合対の第２のメンバーの少なくとも５分子及び少なくとも２５個の発光標識とコンジュゲートした、架橋多糖を含有する増幅溶液を含む増幅容器中に浸漬して、プローブ先端上で前記分析物、前記第１の抗体、前記第２の抗体、並びに前記結合対の第１及び第２のメンバーの免疫複合体を形成させ；（ｅ）前記プローブ先端を、第２の洗浄溶液を含む第２の洗浄容器中に浸漬し；（ｆ）前記プローブ先端を読み取り容器に浸漬し、そして、プローブ先端上に結合した物質の第１の発光シグナルを測定し；（ｇ）前記プローブ先端を、ｐＨ２．０〜５．０を有する溶出溶液に浸漬して、前記プローブ先端から物質を溶出させ；（ｈ）前記プローブ先端を読み取り容器に浸漬し、そして、プローブ先端上に結合した物質の第２の発光シグナルを測定し；（ｉ）前記第１の発光シグナルから前記第２の発光シグナルを減算することによって、溶出された物質の発光シグナルを計算し、そして、分析物量を決定すること、を含む。このアッセイプロトコルを、図６に示す。

第２の実施形態は、感度を改善するための付加的な循環増幅工程を有する点を除いて、第１の実施形態と同様である。第２の実施形態の方法は、工程（ｆ）の後で、かつ（ｇ）の前に、工程（ｆ’）をさらに含む。工程（ｆ’）は、工程（ｂ）〜（ｅ）を１〜１０回繰り返すことである。このアッセイプロトコルを、図７に示す。

増幅アッセイの各工程の詳細は、結合対及び増幅ポリマーを用いる工程（ｂ）及び（ｄ）を除いて、直接抗体結合アッセイについて上述したものと同様である。

結合対は典型的には、ハプテン及びその抗体、リガンド及びその受容体、核酸の相補鎖、又はレクチン及び炭水化物である。例えば、結合対は、ビオチン及びストレプトアビジン、ビオチン及びアビジン、ビオチン及びニュートラアビジン、フルオレセイン及び抗フルオレセイン、ジゴキシゲニン及び抗ジゴキシゲニン、並びに、ＤＮＰ（ジニトロフェノール）及び抗ＤＮＰである。例えば、結合対の第１のメンバーはビオチンであり、かつ結合対の第２のメンバーはストレプトアビジンである。

増幅溶液は、結合対の第２のメンバーの少なくとも５分子及び少なくとも２５個の発光標識とコンジュゲートしたポリマーを含む。ポリマーは、少なくとも５００，０００、好ましくは１００万ダルトンの分子量を有する。ポリマーは、多糖（例えばＦＩＣＯＬＬ（登録商標）又はデキストラン）、ポリヌクレオチド、デンドリマー、ポリオール、又はポリエチレングリコールであり得る。ポリマーは好ましくは、２次元又は３次元構造を有するように分枝している。ポリマーは好ましくは、５〜５０又は５〜１００個の結合分子及び２５〜１００又は２５〜５００個の発光分子を含む。

結合分子がポリペプチド又はタンパク質である場合、発光標識は、科学及び特許文献に記載された従来の共役化学を用いて、ジスルフィド、ヒドロキシフェニル、アミノ、カルボキシル、インドール、又は他の官能基を含む様々な部分を介して、その結合分子に共有結合することができる。

工程（ｆ’）は、工程（ｃ）〜（ｆ）を１〜１０回、好ましくは１〜５回又は２〜３回繰り返すことによる、循環増幅である。各サイクルは、プローブを、同じ試薬容器、同じ第１の洗浄容器、同じ増幅容器、及び同じ第２の洗浄容器に戻すことから構成される。

循環増幅のために、小さな表面積を有するプローブは、小さな結合能を有するので、好ましい。結果として、プローブ先端が試薬溶液に浸漬される際に、試薬の結合は有意な量の試薬を消費しない。試薬濃度は事実上変わらない。洗浄溶液のごくわずかな汚染及び試薬の少量の消費は、試薬及び洗浄溶液が何度も、例えば、３〜１０回、再利用されることを可能にする。

増幅アッセイの代替実施形態では、分析物量は、異なる光学系を用いて液相中の溶出された物質の発光シグナルを読み取ることから直接決定される。

当該代替方法は、以下の順で以下の工程：（ａ）プローブ先端を、サンプル溶液を含むサンプル容器中に浸漬して、分析物を、存在する場合、プローブ先端上の第１の抗体に結合させ、ここで、前記プローブは、プローブの先端上に固定化された分析物に対する第１の抗体を有し；（ｂ）前記プローブ先端を、結合対の第１のメンバーとコンジュゲートした分析物に対する第２の抗体の試薬を含有する試薬溶液を含む試薬容器中に浸漬して、前記試薬を前記分析物に結合させ；（ｃ）前記プローブ先端を、第１の洗浄溶液を含む第１の洗浄容器に浸漬して、前記プローブ先端を洗浄し；（ｄ）前記プローブ先端を、少なくとも１００万ダルトンの分子量を有し、かつ結合対の第２のメンバーの少なくとも５分子及び少なくとも２５個の発光標識とコンジュゲートした、架橋多糖を含有する増幅溶液を含む増幅容器中に浸漬して、プローブ先端上で前記分析物、前記第１の抗体、前記第２の抗体、並びに前記結合対の第１及び第２のメンバーの免疫複合体を形成させ；（ｅ）前記プローブ先端を、第２の洗浄溶液を含む第２の洗浄容器に浸漬し；（ｆ）前記プローブ先端を、ｐＨ２．０〜５．０を有する溶出溶液を含む溶出容器中に浸漬して、前記プローブ先端から物質を溶出させ；（ｇ）前記溶出容器から前記プローブ先端を取り出し；（ｈ）前記溶出容器中の溶出された物質の発光シグナルを測定し；そして、分析物量を決定すること、を含む。

この代替実施形態では、工程（ａ）〜（ｆ）は、第１の実施形態で上述した工程と同じである。工程（ｆ）の後に、プローブは取り出され、プローブはもはや測定工程にはない。溶出された物質の発光シグナルは、上述の発光検出システムを用いて、溶出容器内の液相から直接測定される（例えば、図４参照）。

感度を改善するために、上記方法は、工程（ｅ）の後で、かつ工程（ｆ）の前に、工程（ｅ’）をさらに含む。循環増幅工程（ｅ’）は、工程（ｂ）〜（ｅ）を１〜１０回繰り返す。

本発明は以下の実施例によってさらに説明されるが、これらの実施例は、本発明をそれらに記載された特定の手順の範囲内に限定するものとして解釈されるべきではない。

実施例
実施例１〜１２は、本発明の一実施形態、すなわち、蛍光色素で高度に標識された結合対及び架橋ポリマーを用いる循環増幅による溶出アッセイを説明する。実施例１３は、本発明の別の実施形態、すなわち、蛍光色素で直接標識した抗体を用いる溶出アッセイを説明する。

実施例１：固定化された第１の抗体（抗トロポニン）を有するプローブの調製
直径１ｍｍ、長さ２ｃｍの石英プローブを、製造業者のプロトコルに従って化学気相成長法（Yield Engineering Systems、1224P）を用いて、アミノプロピルシランで被覆した。次にプローブ先端を、ネズミモノクローナル抗フルオレセイン（Biospacific）、１０μｇ／ｍｌのｐＨ７．４のＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）中溶液中に浸漬した。抗体をプローブに２０分間吸着させた後、プローブ先端をＰＢＳ中で洗浄した。これらの抗体被覆プローブを実施例１〜１２に使用した。

トロポニンＩ（ＴｎＩ）、ＩＬ−６（Biospacificから得られた）、及びプロカルシトニン（Hytest）に対する捕捉抗体を、標準的方法によってフルオレセインで標識した。典型的には、抗体当たり約４個のフルオレセイン置換があった。抗フルオレセイン被覆プローブを、フルオレセイン標識捕捉抗体溶液、５μｇ／ｍｌに、５分間浸漬し、続いてＰＢＳで洗浄した。

実施例２．架橋ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）４００−ＳＰＤＰの調製
ＰＢＳ中に２０ｍｇ／ｍｌでのＦｉｃｏｌｌ ４００ ｋＤ（Skold Technology）当たり８８個のアミンを含むようにアミノ化された、ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）４００（Sigma/Aldrich）の２ｍｌに、ＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）中に５０ｍｇ／ｍｌでのＳＰＤＰ（スクシンイミジル６−［３−［２−ピリジルジチオ］−プロピオンアミド（proprionamido）］ヘキサノエート、Invitrogen）の１０μＬを添加した。ＳＰＤＰ対Ｆｉｃｏｌｌ分子カップリング比（molecular coupling ratio）（ＭＣＲ）は、１５であった。混合物を１時間室温で反応させ、続いて透析した。チオールの取り込みは、標準的方法によってＦｉｃｏｌｌ ４００ ｋＤ当たり５．５と推定された。

実施例３．Ｃｙ５−ストレプトアビジンの調製
ＤＭＦ中の５ｍｇ／ｍｌでのＣｙ５−ＮＨＳ（GE Healthcare）の３２μＬを、０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５）中の２．４ｍｇ／ｍｌでのストレプトアビジン（Scripps Labs）の１ｍｌと、４０分間３０℃で反応させた。混合物をＰＤ １０カラム（Pharmacia）に適用して、非結合Ｃｙ５を除去した。スペクトル解析は、ストレプトアビジン１分子当たり２．８のＣｙ５が連結されることを示した。

実施例４．Ｃｙ５−ストレプトアビジン架橋ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）の調製
ＤＭＦ中１０ｍｇ／ｍｌでのＳＭＣＣ（スクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル（malemidomethyl）］シクロヘキサン−１−カルボキシレート）（Pierce Chemical）の５．８μＬを、１ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の２ｍｇのＣｙ５−ストレプトアビジン（実施例２）と、１時間室温で反応させた。混合物をＰＤ １０カラムに適用して、非結合ＳＭＣＣを除去した。

３８ｍｇ／ｍｌでの３０μＬのＤＴＴを、１ｍｌのＰＢＳ中の１ｍｇの架橋ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）４００−ＳＰＤＰに添加し、１時間室温で反応させることによって、架橋ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）４００−ＳＰＤＰ（実施例１）上のチオールを脱保護し、続いてＰＤ １０カラムで架橋ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）４００−ＳＨを精製した。

Ｃｙ５−ストレプトアビジン−ＳＭＣＣを架橋ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）４００−ＳＨと混合し、室温で一晩反応させた。次に、１２．５ｍｇ／ｍｌでの１０μＬのＮＥＭ（Aldrich）を添加し、１／２時間室温で反応させた。次に、コンジュゲートをＳｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ ＣＬカラム上で精製した。コンジュゲートは、ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）（２００万ダルトン）当たり約２０〜３０個のストレプトアビジン、及びストレプトアビジン当たり２〜３個のＣｙ５を有すると推定された。

実施例５：循環増幅溶出アッセイプロトコル及び試薬
本実施例は、図７に示した一般的な循環増幅プロトコルに従う。表１は、トロポニン（ＴｎＩ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）及びプロカルシトニン（ＰＣＴ）について用いられたアッセイを示す。サンプルの２０μＬを、アッセイ緩衝液（１００μＬのＰＢＳ、５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０、ｐＨ７．４）と混合し、プローブを浸漬した。洗浄緩衝液は、２００μＬのＰＢＳ、０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０であった。ＴｎＩ（Hytest）、ＩＬ−６（Biospacific）、及びＰＣＴ（Hytest）のための抗体を、標準的方法でビオチン化し（Ｂ−ａｂ）、１２０μＬ中の約５μｇ／ｍｌでアッセイに使用した。Ｃｙ５−ストレプトアビジン−ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）を、１２０μＬ中の約１０μｇ／ｍｌで使用した。

実施例６：溶出ｐＨ２．０〜４．０の影響
実施例６は、実施例５のプロトコルに従って、溶出に対する酸性緩衝液の影響を示す。異なる酸性緩衝液は以下の通りであった：１０ｍＭのグリシン／ＨＣｌ、ｐＨ２．０；１０ｍＭグリシン／ＨＣｌ、ｐＨ３．０；１００ｍＭの酢酸ナトリウム／酢酸、ｐＨ４．０。

結果を表２〜４に要約する。リード１は、酸溶出後の蛍光読み取りである。「溶出」は、プローブから溶出した蛍光物質の量を間接的に推定するための、リード１から減算されたリード２の蛍光読み取りである。Ｓ＝蛍光シグナル、Ｂ＝バックグラウンド蛍光シグナル。Ｓ／Ｂは、非特異的バックグラウンドシグナルに対する特異的シグナルの比を表す。特に低い分析物レベルでの、Ｓ／Ｂの改善は、検出レベルを向上させる。

表２〜４の結果は、ｐＨが４から２に下がるにつれて、溶出量が増加することを示している。ＴｎＩシグナルを取得し、ネガティブ（０）シグナルで割ることによって、シグナル対バックグラウンド比を決定する（Ｓ／Ｂ）。結果は、ｐＨ４．０溶出での１０ｐｇ／ｍｌレベルにおいて、溶出のＳ／Ｂ（６．０）が、リード１のＳ／Ｂ（１．８）よりも約３倍優れていたことを示している。また、１０ｐｇ／ｍｌレベルにおいて、ｐＨ４での溶出のＳ／Ｂ（６．０）は、ｐＨ２でのＳ／Ｂ（２．４）よりも優れていた。

実施例７
実施例７は、実施例５のプロトコルに従って、ｐＨ４〜５．５からの溶出に対する酸性緩衝液の影響を示す。異なる酸緩衝液は以下の通りであった：１００ｍＭの酢酸ナトリウム／酢酸、ｐＨ４．０；１００ｍＭの酢酸ナトリウム／酢酸、ｐＨ５．０；１００ｍＭの酢酸ナトリウム／酢酸、ｐＨ５．５。

表５〜７は、溶出のＳ／Ｂが全てリード１のＳ／Ｂよりも改善されたことを示している。ｐＨ４．０付近が、トロポニンに対する循環増幅アッセイのためのＳ／Ｂに至適であると思われる。

実施例８：トロポニンアッセイの検出限界
ブランクの限界（ＬＯＢ）は、平均ブランク＋１．６４５ｘ（ＳＤブランク）として定義され、
検出限界（ＬＯＤ）は、ＬＯＢ＋１．６４５ｘ（ＳＤブランク）として定義される、
ＳＤは標準偏差である。
（Davidら、Clin. Biochem. Rev. 29:S49~52）

実施例５のｐＨ４．０酸処理によるトロポニンの溶出プロトコルに従って、ＬＯＤを、リード１（１度の読み取りのみ、酸溶出なし）及びリード２（酸溶出による溶出アッセイ）によって決定した。ＬＯＤはリード１により２．９ｐｇ／ｍＬであり、溶出アッセイによって１．３ｐｇ／ｍＬに改善された。

実施例９：正常サンプルにおける検出トロポニン
実施例５のｐＨ４でのトロポニンの溶出プロトコルに従って、３９体の明らかに正常な個体からの３９個のヘパリン血漿サンプルを、直接アッセイ（リード１、酸溶出なし）及び溶出アッセイ（リード２、酸溶出あり）により、トロポニンレベルについて測定した。３９個の正常サンプルの１００％のトロポニンレベルを、溶出アッセイで検出したが、リード１では４６％しか検出されなかった。結果は、本発明の溶出アッセイの利点が正常範囲内のＴｎＩを検出することに適用されることを示している。

実施例１０：ＨｓＴｎＩ指定
実施例８のトロポニンの溶出プロトコルに従って、６１１個の正常血清サンプルをトロポニンレベルについて検出した。

溶出プロトコルは、試験された６１１個の正常血清サンプルにおいて９１％を検出し、これは、第２世代ｈｓＴｎＩ指定の範囲内である。９９番目のパーセンタイルは３６ｐｇ／ｍＬ、分析間（between run）ＣＶは１０％であり、これは、Ｔｎｌ指定ガイドラインに従って許容される（図１参照）。

実施例１１：ＩＬ−６アッセイ
ＩＬ−６は、高感度測定を必要とする別の分析物である。表８は、ｐＨ４．０酸溶出を用いて、実施例６のプロトコルに従う、ＩＬ−６についてのデータを示している。

表８における結果は、溶出プロトコルが、溶出なしと比較してＳ／Ｂ比の約２倍の改善を生じ、かつその溶出プロトコルがＩＬ−６アッセイにおける２５ｐｇ／ｍＬレベルを検出したことを示している。

実施例１２：プロカルシトニンアッセイ、代替光学検出構成
表９は、ｐＨ４．０酸溶出を用いるＰＣＴアッセイのプロトコルを示す。蛍光シグナルを、代替光学検出構成を用いて測定した。広いレーザービーム及び集光レンズの開口数を有する光学系は、液相中に溶出された標識抗体を直接検出する。

表１０は、ＰＣＴアッセイの用量応答結果を示す。

実施例１３．Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）の直接抗体アッセイ
実施例１３は、本発明の別の実施形態、すなわち、蛍光色素で直接標識された抗体を用いて、かつ循環増幅しない溶出アッセイを示す。このアッセイは、図５に示された一般的プロトコルに従う。

固定化された第１の抗体（抗ＣＲＰ）を有するプローブの調製
直径１ｍｍ、長さ２ｃｍの石英プローブを、製造業者のプロトコルに従って化学気相成長法（Yield Engineering Systems、1224P）を用いて、アミノプロピルシランで被覆した。次に、プローブ先端を、リン酸緩衝食塩水ｐＨ７．４（ＰＢＳ）中の１０μｇ／ｍＬでのストレプトアビジン（Sigma-Aldrich）の溶液に浸漬した。タンパク質をプローブに５分間吸着させた後、プローブ先端をＰＢＳ中で洗浄した。次にプローブ先端を、ＰＢＳ中の１０μｇ／ｍＬでのビオチン標識抗ＣＲＰ（Hytest）を含有する溶液に浸漬した。１０分後、プローブ先端をＰＢＳ中で洗浄した。抗体を標準的方法によってビオチン化した。ビオチン化された抗体を「捕捉抗体」として指定した。

ＣＹ５標識抗体の調製
１ｍｌの０．１Ｍ炭酸ナトリウム（ｐＨ９．５）中の３．２ｍｇ／ｍＬでの抗ＣＲＰ（Hytest）を、ＤＭＦ中１０ｍｇ／ｍｌでのＣｙ５−ＮＨＳ（GE Healthcare）の１０．６μＬと混合し、１／２時間３０℃で反応させた。次に混合物をＰＤ １０カラム（GE Healthcare）上で精製した。Ｃｙ５標識抗体を「シグナル抗体」として指定した。

ＣＲＰアッセイプロトコルを表１１に示す。

ＣＲＰ結果を表１２に示す。

結果は、溶出プロトコルが、１ｍｇ／ＬのＣＲＰレベルで、シグナル対バックグラウンド比を６から７０に改善することを示している。

本発明、並びにそれを作製及び使用する方法及びプロセスを、本発明の関連する分野の当業者がこれを作製し、使用することが可能となるように、完全、明確、簡潔かつ正確な文言で記載する。上記は本発明の好ましい実施形態を記載すること、並びに、特許請求の範囲に記載された本発明の範囲から逸脱することなく変更が成され得ることが理解されるべきである。本発明とみなされる主題を特に指摘し、明確に請求するために、以下の特許請求の範囲は本明細書を結論付ける。

Claims (13)

1. 液体サンプル中の分析物を検出する方法であって、以下の工程：
   （ａ）プローブ先端を、サンプル溶液を含むサンプル容器中に浸漬して、分析物を、存在する場合、プローブ先端上の第１の抗体に結合させ、ここで、前記プローブは、プローブの先端に固定化された分析物に対する第１の抗体を有し；
   （ｂ）前記プローブ先端を、発光標識とコンジュゲートした分析物に対する第２の抗体を含有する試薬溶液を含む試薬容器中に浸漬して、プローブ先端上で前記分析物、前記第１の抗体、及び前記第２の抗体との間で免疫複合体を形成させ；
   （ｃ）前記プローブ先端を、洗浄溶液を含む洗浄容器中に浸漬し；
   （ｄ）前記プローブ先端を読み取り容器に浸漬し、そして、プローブ先端上に結合した物質の第１の発光シグナルを測定し；
   （ｅ）前記プローブ先端を、ｐＨ２．０〜５．０を有する溶出溶液中に浸漬して、前記プローブ先端から物質を溶出させ；
   （ｆ）前記プローブ先端を読み取り容器に浸漬し、そして、プローブ先端上に結合した物質の第２の発光シグナルを測定し；
   （ｇ）前記第１の発光シグナルから前記第２の発光シグナルを減算することによって、溶出された物質の発光シグナルを計算し、そして、分析物量を決定すること、
   を含む、方法。
2. 液体サンプル中の分析物を検出する方法であって、以下の工程：
   （ａ）プローブ先端を、サンプル溶液を含むサンプル容器中に浸漬して、分析物を、存在する場合、プローブ先端上の第１の抗体に結合させ、ここで、前記プローブは、プローブの先端に固定化された分析物に対する第１の抗体を有し；
   （ｂ）前記プローブ先端を、発光標識とコンジュゲートした分析物に対する第２の抗体を含有する試薬溶液を含む試薬容器中に浸漬して、プローブ先端上で前記分析物、前記第１の抗体、及び前記第２の抗体との間で免疫複合体を形成させ；
   （ｃ）前記プローブ先端を、洗浄溶液を含む洗浄容器中に浸漬し；
   （ｄ）前記プローブ先端を、ｐＨ２．０〜５．０を有する溶出溶液を含む溶出容器中に浸漬して、前記プローブ先端から物質を溶出させ；
   （ｅ）前記溶出容器から前記プローブ先端を取り出し；
   （ｆ）前記溶出容器中の溶出された物質の発光シグナルを測定し、そして、分析物量を決定すること、
   を含む、方法。
3. 液体サンプル中の分析物を検出する方法であって、以下の順で以下の工程：
   （ａ）プローブ先端を、サンプル溶液を含むサンプル容器中に浸漬して、分析物を、存在する場合、プローブ先端上の第１の抗体に結合させ、ここで、前記プローブは、プローブの先端に固定化された分析物に対する第１の抗体を有し；
   （ｂ）前記プローブ先端を、結合対の第１のメンバーとコンジュゲートした分析物に対する第２の抗体の試薬を含有する試薬溶液を含む試薬容器中に浸漬して、前記試薬を前記分析物に結合させ；
   （ｃ）前記プローブ先端を、第１の洗浄溶液を含む第１の洗浄容器中に浸漬して、前記プローブ先端を洗浄し；
   （ｄ）前記プローブ先端を、少なくとも１００万ダルトンの分子量を有し、かつ結合対の第２のメンバーの少なくとも５分子及び少なくとも２５個の発光標識とコンジュゲートした、架橋多糖を含有する増幅溶液を含む増幅容器中に浸漬して、プローブ先端上で前記分析物、前記第１の抗体、前記第２の抗体、並びに前記結合対の第１及び第２のメンバーの免疫複合体を形成させ；
   （ｅ）前記プローブ先端を、第２の洗浄溶液を含む第２の洗浄容器中に浸漬し；
   （ｆ）前記プローブ先端を読み取り容器に浸漬し、そして、プローブ先端上に結合した物質の第１の発光シグナルを測定し；
   （ｇ）前記プローブ先端を、ｐＨ２．０〜５．０を有する溶出溶液に浸漬して、前記プローブ先端から物質を溶出させ；
   （ｈ）前記プローブ先端を読み取り容器に浸漬し、そして、プローブ先端上に結合した物質の第２の発光シグナルを測定し；
   （ｉ）前記第１の発光シグナルから前記第２の発光シグナルを減算することによって、溶出された物質の発光シグナルを計算し、そして、分析物量を決定すること、
   を含む、方法。
4. 工程（ｆ）の後で、かつ（ｇ）の前に、以下の工程（ｆ’）：
   （ｆ’）工程（ｂ）〜（ｅ）を１〜１０回繰り返すこと、
   をさらに含む、請求項３に記載の方法。
5. 液体サンプル中の分析物を検出する方法であって、以下の順で以下の工程：
   （ａ）プローブ先端を、サンプル溶液を含むサンプル容器中に浸漬して、分析物を、存在する場合、プローブ先端上の第１の抗体に結合させ、ここで、前記プローブは、プローブの先端に固定化された分析物に対する第１の抗体を有し；
   （ｂ）前記プローブ先端を、結合対の第１のメンバーとコンジュゲートした分析物に対する第２の抗体の試薬を含有する試薬溶液を含む試薬容器中に浸漬して、前記試薬を前記分析物に結合させ；
   （ｃ）前記プローブ先端を、第１の洗浄溶液を含む第１の洗浄容器中に浸漬して、前記プローブ先端を洗浄し；
   （ｄ）前記プローブ先端を、少なくとも１００万ダルトンの分子量を有し、かつ結合対の第２のメンバーの少なくとも５分子及び少なくとも２５個の発光標識とコンジュゲートした、架橋多糖を含有する増幅溶液を含む増幅容器中に浸漬して、プローブ先端上で前記分析物、前記第１の抗体、前記第２の抗体、並びに前記結合対の第１及び第２のメンバーの免疫複合体を形成させ；
   （ｅ）前記プローブ先端を、第２の洗浄溶液を含む第２の洗浄容器中に浸漬し；
   （ｆ）前記プローブ先端を、ｐＨ２．０〜５．０を有する溶出溶液を含む溶出容器中に浸漬して、前記プローブ先端から物質を溶出させ；
   （ｇ）前記溶出容器から前記プローブ先端を取り出し；
   （ｈ）前記溶出容器中の溶出された物質の発光シグナルを測定し、そして、分析物量を決定すること、
   を含む、方法。
6. 工程（ｅ）の後で、かつ工程（ｆ）の前に、以下の工程（ｅ’）：
   （ｅ’）工程（ｂ）〜（ｅ）を１〜１０回繰り返すこと、
   をさらに含む、請求項５に記載の方法。
7. 前記先端表面が≦約５ｍｍである、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記発光標識が蛍光標識である、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記蛍光標識がアリールスルホネートシアニン（arylsulfonate cyanine）である、請求項８に記載の方法。
10. 前記発光標識が、以下：ルテニウム（ＩＩ）トリス−ビピリジン、ルミノール、及びアクリジニウムエステル、からなる群から選択される分子である、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記結合対の第１のメンバーがビオチンであり、かつ前記結合対の第２のメンバーがストレプトアビジンである、請求項３から６のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記多糖が、スクロース及びエピクロロヒドリンのコポリマーである、請求項３から６のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記分析物がトロポニンである、請求項３から６のいずれか一項に記載の方法。

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