JPH03100466A - 化学増幅型化学発光免疫測定法 - Google Patents
化学増幅型化学発光免疫測定法Info
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- JPH03100466A JPH03100466A JP23851289A JP23851289A JPH03100466A JP H03100466 A JPH03100466 A JP H03100466A JP 23851289 A JP23851289 A JP 23851289A JP 23851289 A JP23851289 A JP 23851289A JP H03100466 A JPH03100466 A JP H03100466A
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Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、新規な化学増幅型化学発光免疫測定法に関す
る。
る。
従来の技術及びその課題
血液、尿等の臨床試料等に微量に存在する抗原、抗体等
の物質を分析定量する方法として、放射免疫測定法や酵
素免疫測定法等が開発されている。
の物質を分析定量する方法として、放射免疫測定法や酵
素免疫測定法等が開発されている。
しかし、前者には放射性化合物を使用するため保管、取
扱、廃棄処理等の管理上の問題点、短寿命の同位体を使
用するため頻繁に試薬を調製しなければならないこと、
装置、施設にコストがかかること等の問題点がある。ま
た、後者には測定できる物質が限られ又感度も不十分で
あること、高価な酵素を抗原又は抗体に標識した化合物
を合成する必要があること等の問題点がある。加えて、
両者共に不均一法が中心で煩雑な分離操作を必要とする
という問題点もある。
扱、廃棄処理等の管理上の問題点、短寿命の同位体を使
用するため頻繁に試薬を調製しなければならないこと、
装置、施設にコストがかかること等の問題点がある。ま
た、後者には測定できる物質が限られ又感度も不十分で
あること、高価な酵素を抗原又は抗体に標識した化合物
を合成する必要があること等の問題点がある。加えて、
両者共に不均一法が中心で煩雑な分離操作を必要とする
という問題点もある。
また、免疫反応に引き続いて起こる補体の活性化により
膜の破壊が起こる現象を利用して、リポソーム中にグル
コース、電極活物質、螢光色素等を包埋し、抗体量に応
じて放出された内容物を測定し、抗体量を定量するリポ
ソーム免疫測定法が知られている。しかし、この方法に
はリポソームが不安定でリークが起こり易（又リポソー
ム製造の再現性に乏しいという問題点があり、包埋量が
少ないため感度も十分でないという問題点もある。
膜の破壊が起こる現象を利用して、リポソーム中にグル
コース、電極活物質、螢光色素等を包埋し、抗体量に応
じて放出された内容物を測定し、抗体量を定量するリポ
ソーム免疫測定法が知られている。しかし、この方法に
はリポソームが不安定でリークが起こり易（又リポソー
ム製造の再現性に乏しいという問題点があり、包埋量が
少ないため感度も十分でないという問題点もある。
以上のように、抗原、抗体等の微量の被測定物質を、簡
便に且つ迅速高感度でホモジニアスに測定できる手法は
確立されておらず、かかる手法が要望されているのが現
状である。
便に且つ迅速高感度でホモジニアスに測定できる手法は
確立されておらず、かかる手法が要望されているのが現
状である。
課題を解決するための手段
本発明者は、上記要望に応えるべく鋭意研究した結果、
リポソーム免疫測定法においてリポソームに代えて特に
赤血球を用い、更に被測定物質と赤血球との補体溶血反
応に、該反応で放出されたヘモグロビンによるルミノー
ル反応を組み合わせることにより、目的を達成できるこ
とを見出し、本発明を完成するに至った。
リポソーム免疫測定法においてリポソームに代えて特に
赤血球を用い、更に被測定物質と赤血球との補体溶血反
応に、該反応で放出されたヘモグロビンによるルミノー
ル反応を組み合わせることにより、目的を達成できるこ
とを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち本発明は、被測定物質を赤血球と補体溶血反応せし
め、次いで赤血球より放出されたヘモグロビンによるル
ミノール反応により化学発光せしめ、その発光量を測定
することを特徴とする化学増幅型化学発光免疫測定法に
係る。
め、次いで赤血球より放出されたヘモグロビンによるル
ミノール反応により化学発光せしめ、その発光量を測定
することを特徴とする化学増幅型化学発光免疫測定法に
係る。
上記本発明によれば、補体溶血反応即ち赤血球細胞膜上
に免疫反応による抗原抗体複合物が存在すると補体の活
性化が起こり該膜上に膜障害複合体が構築され内容物で
あるヘモグロビンの放出が起こる反応により、この放出
は１つの複合体の生成によって十分に起こるとされてい
るので１つの抗原抗体複合物によってヘモグロビンの大
量放出による化学増幅効果が発揮される。更に、内容物
であるヘモグロビンがルミノール反応の触媒であるため
、この化学発光反応によっても化学増幅効果が発揮され
る。
に免疫反応による抗原抗体複合物が存在すると補体の活
性化が起こり該膜上に膜障害複合体が構築され内容物で
あるヘモグロビンの放出が起こる反応により、この放出
は１つの複合体の生成によって十分に起こるとされてい
るので１つの抗原抗体複合物によってヘモグロビンの大
量放出による化学増幅効果が発揮される。更に、内容物
であるヘモグロビンがルミノール反応の触媒であるため
、この化学発光反応によっても化学増幅効果が発揮され
る。
本発明法においては、抗原、抗体、抗原抗体複合物及び
補体が補体溶血反応に必須のものであることから、これ
らのいずれも被測定物質として定量、定性等の各種測定
をすることができる。また、本発明法は、競争反応、サ
ンドイツチ法、均一法、不均一法等の従来公知の種々の
免疫計測法にそのまま応用することができる。
補体が補体溶血反応に必須のものであることから、これ
らのいずれも被測定物質として定量、定性等の各種測定
をすることができる。また、本発明法は、競争反応、サ
ンドイツチ法、均一法、不均一法等の従来公知の種々の
免疫計測法にそのまま応用することができる。
本発明においては、大量、均質に得られしかも安定な赤
血球を用いることにより、又ルミノール反応が高感度で
あることから、安定性、再現性、感度等に優れた免疫計
測を発光量の測定により容易に行なうことができる。用
いる赤血球としては、特に限定されないが、ヒツジ、ウ
サギ、マウス、ラット、モルモット、イヌ等の赤血球を
挙げることができる。赤血球は、それ自体膜抗原を有し
ているが、更に、測定しようとする抗原、抗体又は抗原
抗体複合物をその表面に有せしめても良い。
血球を用いることにより、又ルミノール反応が高感度で
あることから、安定性、再現性、感度等に優れた免疫計
測を発光量の測定により容易に行なうことができる。用
いる赤血球としては、特に限定されないが、ヒツジ、ウ
サギ、マウス、ラット、モルモット、イヌ等の赤血球を
挙げることができる。赤血球は、それ自体膜抗原を有し
ているが、更に、測定しようとする抗原、抗体又は抗原
抗体複合物をその表面に有せしめても良い。
抗原、抗体又は抗原抗体複合物を保持した赤血球の調製
法は、特に制限されず、従来から使用されてきた各種方
法を利用できる。抗原としては、各種の低分子物質及び
高分子物質のいずれも使用できる。
法は、特に制限されず、従来から使用されてきた各種方
法を利用できる。抗原としては、各種の低分子物質及び
高分子物質のいずれも使用できる。
以下、補体の測定を例にとり、本発明の測定手順を説明
する。赤血球上に抗原抗体複合物が一定量生成している
感作赤血球に、例えば血清等の補体を含む被測定液を加
え、適宜一定温度、時間のもとに反応させる。抗原抗体
複合物の存在によって補体の活性化が起こり赤血球膜上
に膜障害複合体が構築され、内容物の放出が起こる。赤
血球中にはヘモグロビンが高濃度で含まれており、ヘモ
グロビンはルミノールの化学発光を触媒する。この後、
氷温にする、ＥＤＴＡ等を加える等の補体結合反応の停
止操作を行なう。ルミノール反応は、常法により行なう
ことができる。即ち、通常上記停止操作をした反応液に
、暗所一定温度のもとルミノール及び過酸化水素を一定
量加え化学発光させる。化学発光の発光量の測定も常法
例えば光子計数法等により行なうことができる。発光量
は反応後一定時間の総合（積分値）又は最大値のいずれ
の値を用いても良（、濃度が既知の標準サンプルを用い
て検量線を作成し、未知試料の定量等の測定を行なう。
する。赤血球上に抗原抗体複合物が一定量生成している
感作赤血球に、例えば血清等の補体を含む被測定液を加
え、適宜一定温度、時間のもとに反応させる。抗原抗体
複合物の存在によって補体の活性化が起こり赤血球膜上
に膜障害複合体が構築され、内容物の放出が起こる。赤
血球中にはヘモグロビンが高濃度で含まれており、ヘモ
グロビンはルミノールの化学発光を触媒する。この後、
氷温にする、ＥＤＴＡ等を加える等の補体結合反応の停
止操作を行なう。ルミノール反応は、常法により行なう
ことができる。即ち、通常上記停止操作をした反応液に
、暗所一定温度のもとルミノール及び過酸化水素を一定
量加え化学発光させる。化学発光の発光量の測定も常法
例えば光子計数法等により行なうことができる。発光量
は反応後一定時間の総合（積分値）又は最大値のいずれ
の値を用いても良（、濃度が既知の標準サンプルを用い
て検量線を作成し、未知試料の定量等の測定を行なう。
リークしていないヘモグロビンにはルミノール発光反応
の触媒作用はなく、又非溶血赤血球には該反応の妨害作
用もない。従って、本発明法においては、非溶血赤血球
を分離することなく、そのままのホモジニアスな測定系
で測定を行なうことができる。
の触媒作用はなく、又非溶血赤血球には該反応の妨害作
用もない。従って、本発明法においては、非溶血赤血球
を分離することなく、そのままのホモジニアスな測定系
で測定を行なうことができる。
発明の効果
以上のように、本発明方法によれば、特別な標識化合物
を用いることなく、原理的には赤血球上で免疫反応が１
分子でも生ずれば、血球の分離も必要なく均一系で、著
しく増幅されしかも安定性や再現性にも優れた免疫測定
を行なうことができる。
を用いることなく、原理的には赤血球上で免疫反応が１
分子でも生ずれば、血球の分離も必要なく均一系で、著
しく増幅されしかも安定性や再現性にも優れた免疫測定
を行なうことができる。
従って、本発明によれば、抗原、抗体、補体等の微量の
被測定物質を、簡便に且つ迅速高感度で測定できる新規
な化学増幅型化学発光免疫測定法が提供されるという格
別な効果が奏される。
被測定物質を、簡便に且つ迅速高感度で測定できる新規
な化学増幅型化学発光免疫測定法が提供されるという格
別な効果が奏される。
実施例
以下実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、
本発明は以下の実施例により何等限定されるものではな
い。
本発明は以下の実施例により何等限定されるものではな
い。
実施例 １
抗ヒツジ赤血球抗体の計測を行なった。
ヒツジ赤血球を、Ｃａ とＭｇ を含有するｐＨ７
，４のゼラチンベロナールバッファー（以下、ＧＶＢ”
＋という）に、Ｉ Ｘ １０９ｃｅｌｌｓ／ｍｌの割合
で懸濁した。この懸濁液に、上記抗体を含むウサギ血清
試料を等量論えた液より５μｍ取り、これを３７℃で１
０分免疫反応させ、次いでモルモット血清をＧＶＢ”＋
で５００倍に希釈した補体溶液１２．５μｌとＧｖＢ＋
＋２０μｍとを加え、３７℃で６０分補体結合反応させ
た後水冷し反応を停止させた。反応後の反応液にＧＶＢ
３７．５μｍを加え、更に１ｍＭのルミノール溶液
５０μｍを加え、サンプルカップを暗箱に入れ、５ｍＭ
過酸化水素溶液５０μｍを加え、２５℃で化学発光反応
を起こさせた。化学発光測定は光子計数法（浜松ホトニ
クス・ユニバーサルホトンヵウンティングシステムを使
用）により行なった。第１図は、上記血清試料（抗体）
の希釈倍率を変化させたときの光子計数の最大カウント
数をプロットしたものであり、これにより目的抗体が精
度良く測定できることが明らかである。
，４のゼラチンベロナールバッファー（以下、ＧＶＢ”
＋という）に、Ｉ Ｘ １０９ｃｅｌｌｓ／ｍｌの割合
で懸濁した。この懸濁液に、上記抗体を含むウサギ血清
試料を等量論えた液より５μｍ取り、これを３７℃で１
０分免疫反応させ、次いでモルモット血清をＧＶＢ”＋
で５００倍に希釈した補体溶液１２．５μｌとＧｖＢ＋
＋２０μｍとを加え、３７℃で６０分補体結合反応させ
た後水冷し反応を停止させた。反応後の反応液にＧＶＢ
３７．５μｍを加え、更に１ｍＭのルミノール溶液
５０μｍを加え、サンプルカップを暗箱に入れ、５ｍＭ
過酸化水素溶液５０μｍを加え、２５℃で化学発光反応
を起こさせた。化学発光測定は光子計数法（浜松ホトニ
クス・ユニバーサルホトンヵウンティングシステムを使
用）により行なった。第１図は、上記血清試料（抗体）
の希釈倍率を変化させたときの光子計数の最大カウント
数をプロットしたものであり、これにより目的抗体が精
度良く測定できることが明らかである。
実施例 ２
ヒト補体の計測を行なった。
低温下、正常ヒト血清の１６２〜６０８倍のＧＶＢ
希釈溶液に、５ Ｘ １０８ｅｅｌ Ｉｓ／ｍｌの割合
で市販（君津製薬味製）のヒツジ感作赤血球（抗原抗体
複合物が生成している）を懸濁した懸濁液を２６＝４の
比で混合し、３７℃で２時間振盪インキュベートし、そ
の後氷冷しＥＤＴＡ−ＧＶＢを加え補体結合反応を停止
させた。この反応液６０μｍに、１ｍＭのルミノール溶
液５０μｍを加え、サンプルカップを暗箱に入れ、５ｍ
Ｍ過酸化水素溶液５０μｍを加え、３７℃で化学発光反
応を起こさせた。化学発光測定は光子計数法（浜松ホト
ニクス争ユニバーサルホトンカウンティングシステムを
使用）により行なった。第２図は、補体の希釈倍率に対
して光子計数の最大カウント数をプロットしたものであ
り、これにより目的補体が精度良く測定できることが明
らかである。
希釈溶液に、５ Ｘ １０８ｅｅｌ Ｉｓ／ｍｌの割合
で市販（君津製薬味製）のヒツジ感作赤血球（抗原抗体
複合物が生成している）を懸濁した懸濁液を２６＝４の
比で混合し、３７℃で２時間振盪インキュベートし、そ
の後氷冷しＥＤＴＡ−ＧＶＢを加え補体結合反応を停止
させた。この反応液６０μｍに、１ｍＭのルミノール溶
液５０μｍを加え、サンプルカップを暗箱に入れ、５ｍ
Ｍ過酸化水素溶液５０μｍを加え、３７℃で化学発光反
応を起こさせた。化学発光測定は光子計数法（浜松ホト
ニクス争ユニバーサルホトンカウンティングシステムを
使用）により行なった。第２図は、補体の希釈倍率に対
して光子計数の最大カウント数をプロットしたものであ
り、これにより目的補体が精度良く測定できることが明
らかである。
一方、比較のため、上記反応停止後の反応液を２．８ｍ
ｌ取り、３０００ｒｐｍで５分遠心分離して得た上清を
用い、従来法である吸光度測定法に従って、光路長１ｃ
ｍ１波長５４１ｎｍで吸光度を測定した（日立５５７型
二波長分光光度計使用）。
ｌ取り、３０００ｒｐｍで５分遠心分離して得た上清を
用い、従来法である吸光度測定法に従って、光路長１ｃ
ｍ１波長５４１ｎｍで吸光度を測定した（日立５５７型
二波長分光光度計使用）。
第３図は、本発明法により測定した光子計数の最大カウ
ント数及び測定時間内の総カウント数に対して、同じサ
ンプルにつき従来法により測定した吸光度をプロットし
たものである。吸光度と発光量との相関係数は、０．９
９であり、本発明法によれば低補体化サンプルでも血球
分離をすることなく少量のサンプルで且つ高感度で測定
ができることが判る。
ント数及び測定時間内の総カウント数に対して、同じサ
ンプルにつき従来法により測定した吸光度をプロットし
たものである。吸光度と発光量との相関係数は、０．９
９であり、本発明法によれば低補体化サンプルでも血球
分離をすることなく少量のサンプルで且つ高感度で測定
ができることが判る。
実施例 ３
ジニトロフェニル化したウシγ−グロブリン（以下、Ｄ
ＮＰ−ＧＧＢという）を抗原としてその測定を行なった
。
ＮＰ−ＧＧＢという）を抗原としてその測定を行なった
。
ジニトロフルオロベンゼンにより膜表面にジニトロフェ
ニル（以下、ＤＮＰという）基を保持させたヒツジ赤血
球懸濁液（Ｉ Ｘ １０９ｃｅｌｌｓ／ｍ１ＧＶＢ”）
２． ５μｍ １．１：、種々ノ濃度でＤＮＰ−ＧＧ
ＢをＧＶＢ”＋に溶解した試料液１．２５μｌ及び抗Ｄ
ＮＰ抗体を含むウサギ血清１．２５μｍを加え、３７℃
で１０分競争免疫反応させ、次いでモルモット血清をＧ
ＶＢ”＋で１０倍に希釈した補体溶液１２．５μｍ及び
ＧＶＢ ２０μｍを加え、３７℃で６０分補体結合反
応させた後水冷し反応を停止させた。この反応液を２倍
希釈し、１ｍＭのルミノール溶液５０μｍを加え、サン
プルカップを暗箱に入れ、５ｍＭ過酸化水素溶液５０μ
ｍを加え、２５℃で化学発光反応を起こさせた。化学発
光測定は光子計数法（浜松ホトニクス・ユニバーサルホ
トンカウンティングシステムを使用）により行なった。
ニル（以下、ＤＮＰという）基を保持させたヒツジ赤血
球懸濁液（Ｉ Ｘ １０９ｃｅｌｌｓ／ｍ１ＧＶＢ”）
２． ５μｍ １．１：、種々ノ濃度でＤＮＰ−ＧＧ
ＢをＧＶＢ”＋に溶解した試料液１．２５μｌ及び抗Ｄ
ＮＰ抗体を含むウサギ血清１．２５μｍを加え、３７℃
で１０分競争免疫反応させ、次いでモルモット血清をＧ
ＶＢ”＋で１０倍に希釈した補体溶液１２．５μｍ及び
ＧＶＢ ２０μｍを加え、３７℃で６０分補体結合反
応させた後水冷し反応を停止させた。この反応液を２倍
希釈し、１ｍＭのルミノール溶液５０μｍを加え、サン
プルカップを暗箱に入れ、５ｍＭ過酸化水素溶液５０μ
ｍを加え、２５℃で化学発光反応を起こさせた。化学発
光測定は光子計数法（浜松ホトニクス・ユニバーサルホ
トンカウンティングシステムを使用）により行なった。
第４図は、上記試料液中のＤＮＰ−ＧＧＢの量に対して
光子計数の最大カウント数をプロットしたものであり、
ＤＮＰ−ＧＧＢの曾が多いほど上記競争免疫反応におい
て反応にあずかる赤血球が少なくなりその結果最大カウ
ント数が少なくなることを示している。これにより目的
抗原が精度良く測定できることが明らかである。
光子計数の最大カウント数をプロットしたものであり、
ＤＮＰ−ＧＧＢの曾が多いほど上記競争免疫反応におい
て反応にあずかる赤血球が少なくなりその結果最大カウ
ント数が少なくなることを示している。これにより目的
抗原が精度良く測定できることが明らかである。
第１図は実施例１の結果を示すグラフである。
第２図及び第３図は実施例２の結果を示すグラフである
。第４図は実施例３の結果を示すグラフである。 （以 上）
。第４図は実施例３の結果を示すグラフである。 （以 上）
Claims (3)
- （１）被測定物質を赤血球と補体溶血反応せしめ、次い
で赤血球より放出されたヘモグロビンによるルミノール
反応により化学発光せしめ、その発光量を測定すること
を特徴とする化学増幅型化学発光免疫測定法。 - （２）赤血球が、抗原、抗体又は抗原抗体複合物を表面
に有している請求項１に記載の測定法。 - （３）被測定物質が、抗原、抗体、抗原抗体複合物又は
補体である請求項１に記載の測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1238512A JPH0711522B2 (ja) | 1989-09-13 | 1989-09-13 | 化学増幅型化学発光免疫測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1238512A JPH0711522B2 (ja) | 1989-09-13 | 1989-09-13 | 化学増幅型化学発光免疫測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03100466A true JPH03100466A (ja) | 1991-04-25 |
| JPH0711522B2 JPH0711522B2 (ja) | 1995-02-08 |
Family
ID=17031354
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1238512A Expired - Lifetime JPH0711522B2 (ja) | 1989-09-13 | 1989-09-13 | 化学増幅型化学発光免疫測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0711522B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH052017A (ja) * | 1991-06-24 | 1993-01-08 | Inax Corp | 潜血の定量分析方法 |
| JPH05312801A (ja) * | 1992-05-13 | 1993-11-26 | Inax Corp | ゲル濾過法を用いた生体成分の測定方法 |
| WO1998008097A1 (en) * | 1996-08-22 | 1998-02-26 | Biovation Limited | Signal amplification method |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5696249A (en) * | 1979-10-17 | 1981-08-04 | Fisher Scientific Co | Chemecal luminescence immunological calibration |
| JPS60364A (ja) * | 1983-05-31 | 1985-01-05 | Denka Seiken Co Ltd | 新規な抗原定量法 |
| JPS60363A (ja) * | 1983-05-31 | 1985-01-05 | Denka Seiken Co Ltd | 新規な抗原定量法 |
| JPS6029665A (ja) * | 1983-07-29 | 1985-02-15 | Denka Seiken Co Ltd | 抗原定量方法 |
-
1989
- 1989-09-13 JP JP1238512A patent/JPH0711522B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5696249A (en) * | 1979-10-17 | 1981-08-04 | Fisher Scientific Co | Chemecal luminescence immunological calibration |
| JPS60364A (ja) * | 1983-05-31 | 1985-01-05 | Denka Seiken Co Ltd | 新規な抗原定量法 |
| JPS60363A (ja) * | 1983-05-31 | 1985-01-05 | Denka Seiken Co Ltd | 新規な抗原定量法 |
| JPS6029665A (ja) * | 1983-07-29 | 1985-02-15 | Denka Seiken Co Ltd | 抗原定量方法 |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH052017A (ja) * | 1991-06-24 | 1993-01-08 | Inax Corp | 潜血の定量分析方法 |
| JPH05312801A (ja) * | 1992-05-13 | 1993-11-26 | Inax Corp | ゲル濾過法を用いた生体成分の測定方法 |
| WO1998008097A1 (en) * | 1996-08-22 | 1998-02-26 | Biovation Limited | Signal amplification method |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0711522B2 (ja) | 1995-02-08 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |