DE69213925T2

DE69213925T2 - Bestimmung von verunreinigungen in wasser

Info

Publication number: DE69213925T2
Application number: DE69213925T
Authority: DE
Inventors: Gary Thorpe; Thomas Whitehead
Original assignee: British Technology Group Ltd
Current assignee: BTG International Ltd
Priority date: 1991-01-29
Filing date: 1992-01-28
Publication date: 1997-03-06
Anticipated expiration: 2012-01-29
Also published as: IE65051B1; WO1992013272A1; US5580791A; DE69213925D1; DK0569402T3; GB2252408A; IE920268A1; JPH06507012A; EP0569402B1; GB2252408B; EP0569402A1; JP2873087B2; GB9201790D0

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

1. GEBIET DER ERFINDUNG

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Wasser, um unter Anwendung einer Lumineszenzreaktion einen Aspekt seiner biologischen und chemischen Qualität zu bestimmen.

2. BESCHREIBUNG DES STANDES DER TECHNIK

Verunreinigung ist ein Problem, das auf der ganzen Welt in Wasser auftritt. Es existieren viele Tests zum Nachweis von Verunreinigungen in Wasser. Im allgemeinen haben Verunreinigungen den Effekt, daß sie die Sauerstoffverfügbarkeit innerhalb des Wassers mindern. Dieser Sauerstoffentzug kann so schädlich sein, daß das empfindliche Ökosystem innerhalb der (Lebens)Queile Wasser zerstört wird. In Flüssen, Teichen, Seen und dergleichen kann dies zum Absterben sowohl der Pflanzenwelt als auch der Tierwelt führen, wenn der Gehalt an Verunreinigungen zunimmt und der Sauerstoffgehalt im Wasser entsprechend sinkt.
Der Sauerstoffgehalt in einer Wasserprobe gibt den Gehalt oder das Vorhandensein von Verunreinigungen an. Es existieren mehrere Verfahren zur Messung von Sauerstoff im Wasser Die Winkler-Titration ist ein bevorzugtes Verfahren zur Messung von gelöstem Sauerstoff Differenziertere Verfahren beziehen den Einsatz von Sauerstoffelektroden ein. Größeren Einsatz bei der Kontrolle von Verunreinigungen findet der biochemische Sauerstoffbedarfstesi (130D). Dieser mißt über einen Zeitraum von 5 Tagen bei 20ºC das Sinken der Konzentration an gelöstem Sauerstoff, das in erster Linie aus der biologischen Aktivität (bakterielle Oxidation) resultiert. Der BOD-Test weist mehrere Nachteile auf Er kann die im Wasser auftretenden natürlichen Vorgänge nicht nachahmen - dies liegt primär daran, daß der Test im Dunkeln durchgeführt wird. Er kann auch kompliziert sein, wenn geeignete Bakterien in der Probe fehlen oder toxische Bestandteile vorhanden sind, die den Abbau von Verunreinigungen verhindem. Weiterhin kann sich der Sauerstoffgehalt der Probe während der Lagerung verändern. Im allgemeinen müssen viele Überlegungen angestellt werden, um einen korrekten Wert zu erhalten. Die Ergebnisse besitzen ein hohes Maß an Variabilität. Diese und andere verwandte Verfahren werden in "Standard Methods for the Measurement of Water and Waste Water, 15. Ausgabe, Amer. Pub. Health Assoc. 1979" besprochen.
Vor kurzem wurde von der National Rivers Authority empfohlen, den derzeitigen 5-tägigen BOD-Test durch Messung des Gesamten Organischen Kohlenstoffs (Total Organic Carbon/TOC) (Laboratory Equipment Digest, August 1991, 41-42) zu ersetzen. Dieses Verfahren hat ebenfalls mehrere Nachteile. Es schließt UV-Strahlung und die Verwendung von konzentrierter Salpetersaure ein und erfordert besondere Laborbedingungen. Im Wasser vorhandene anorganische Carbonate, Bicarbonate und Kohlenstoffdioxid behindern die Reaktion und müs sen zuerst beseitigt werden - somit ist das Endergebnis häufig ungenau.
Diese Verfahren liefern nur begrenzte Informationen, sind langatmig und erfordern spezialisierte Laborgeräte und Laboranten.
Deshalb besteht ein Bedarf an einem rasch flinktionierenden Verfahren zur Bewertung der biologischen und chemischen Qualität einer Wasserprobe, die einfach und vor Ort durchgeführt werden kann.
Der weitere Stand der Technik ist im Anschluß an die "Zusammenfassung der Erfindung" erwähnt, ohne den ihr Zusammenhang nicht klar wäre.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Man hat nun festgestellt, daß, wenn eine Wasserprobe einer Chemilumineszenzreaktion hinzugesetzt wird, die vorhandenen Antioxidans-Verunreinigungen eine vorübergehende Senkung der beobachteten Lumineszenz (gemessene Lichtemission) verursachen. Nach kurzer Zeit regeneriert sich der Lumineszenzwert etwas. Somit kann der Antioxidans-Gehalt einer gegebenen Wasserprobe aus der Veränderung in der Lumineszenz unter Anwendung einer Lumineszenzreaktion bestimmt (gemessen) werden, wodurch eine Angabe bezüglich der biologischen und chemischen Qualität der Wasserprobe gemacht wird. Das Vorhandensein von Verunreinigungen, toxischen Chemikalien und dergleichen erhöht den Antioxidans-Gehalt (antioxidant capacity) der Probe, wohingegen reines Wasser einen niedrigeren Antioxidans-Gehalt besitzt.
Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Bestimmung der biologischen oder chemischen Qualität einer Wasserprobe bereit, von der bekannt ist, oder die unter dem Verdacht steht, Antioxidans-Verunreinigungen zu enthalten, welches das Überprüfen des Einflusses urnfaßt, der durch eine Probe auf eine Chemilumineszenzreaktion ausgeübt wird.
Der Begriff "Bestimmung" oder "Messung", wie er hier vorliegend verwendet wird, schließt qualitative, halbqualitative und quantitative Angaben, Beurteilungen, Schätzungen und Messungen ein.
In einer ersten Ausführungsform wird die Probe vor Reaktionsstart und zu einer vorher festgelegten Zeit nach diesem Start, vorzugsweise 2 Minuten danach, hinzugefügt, der durch die Testreaktion erzeugte Lumineszenzgehalt wird gemessen und mit einer ahnlichen bei einer Kontrollreaktion ohne hinzugesetzter Wasserprobe durchgeführten Messung verglichen Die Differenz zwischen diesen Werten liefert einen Index bezüglich des Antioxidans-Gehalts der Probe.
Alternativ kann der Zeitraum ab Reaktionsstart gemessen werden, bis der Lumineszenzwert ein im wesentlichen konstantes Niveau erreicht hat.
Der Begriff "Antioxidans-Gehalt" wird hier vorliegend verwendet, um ein Maß der biologischen und chemischen Qualität des Wassers zu bezeichnen, und wird für einen wichtigen Faktor bei der Beurteilung von Wasserqualität gehalten. Es hat sich gezeigt, daß er gut mit TOC- und BOD-Werten korreliert, jedoch eine rascher erhältliche und sensitive Messung darstellt.
Gemäß einem weiteren Aspekt der ersten Ausführungsform wird eine Wasserprobe einer ablaufenden Chemiluminenszenzreaktion hinzugesetzt, d.h. nachdem die Reaktion begonnen hat Die vorhandenen Antioxidans-Verunreinigungen verursachen eine vorübergehende Verringerung der beobachteten Lumineszenz (gemessene Lichtemission). Der Zeitraum, wahrend dessen die beobachtete Lumineszenz verringert wird, liefert einen Index für den Antioxidans- Gehalt der Testprobe.
Vorzugsweise wird die Wasserprobe dann einer ablaufenden Chemiluminenszenzreaktion hinzugesetzt, wenn das Lumineszenzniveau im wesentlichen konstant ist - das ist das Lumineszenzniveau nach Erreichen eines Höchstwertes, einem Plateau - und im wesentlichen auf dein Höchstwert verbleibt oder rnit maßiger Rate, typischerweise bis zu 0,6% pro Minute, absinkt. Es ist ersichtlich, daß die Beschaffenheit dieses Plateaus gemäß der gewählten Reaktionspartner erheblich schwanken kann, aber ein Fachmann auf diesem Gebiet wird ein Plateau ohne Schwierigkeit erkennen, da diese Lumineszenzreaktionen per se bekannt sind.
Vorzugsweise wird die Wasserprobe der ablaufenden Chemilumineszenzreaktion hinzugesetzt, bevor sie dieses im wesentlichen konstante Niveau erreicht, jedoch innerhalb 10% des Maximums liegt.
Das Hinzufügen der Wasserprobe zu der ablaufenden Lumineszenzreaktion resultiert in einem plötzlichen Abfall im Lumineszemniiveau, gefolgt von einer Regenerierung auf das im wesent lichen konstante Niveau. Der Zeitraum zwischen der Probenzugabe und einem vorbestimmten Regenerierunsgrad wird gemessen und liefert einen Index des Antioxidans-Gehalts der Probe Das Lumineszenzniveau regeneriert sich auf ein zweites im wesentlichen konstantes Niveau Dieses zweite Niveau kann niedriger als das ursprüngliche im wesentlichen konstante Niveau sein. Der Regenerierungsgrad der Lumineszenz zu einem gegebenen Zeitintervall ab dem Zeitpunkt der Probenzugabe kann gemessen werden und mit dem Lumineszenzgrad zum Zeitpunkt der Probenzugabe verglichen werden oder init dem zeitgleichen Lumineszenzgrad in der Kontrolle verglichen werden. Wie nachfolgend besprochen wird, können Bestimmungen während der Reaktion auf andere Zeitspannen bezogen werden.
Gelegentlich kann eine Verunreinigung in einer Probe vorhanden sein, die ein in der Lumineszenzreaktion verwendetes Enzym inaktiviert, was zu einer teilweisen oder vollständigen Hemmung der Lichternission führt.
Vorteile der vorliegenden Erfindung schließen folgendes ein: 1) die Bestimmung kann in einem einzigen Schritt für jede Probe durchgeführt werden, d.h. für die Erzielung des Ergebnisses ist keine ganze Reihe einzelner Reaktionen erforderlich; 2) verschiedene Aspekte der Bestimmung umfassen eine "Echtzeit-"Messung, die es ermöglicht, den Grad der beobachteten Lumineszenz vor dem Hinzufügen der Testprobe mit dem nach dem zeitweiligen Absinken beobachteten Grad zu vergleichen; der Vergleich der Lumineszenzniveaus und/oder des Verlaufs der Kurve, die das zeitweilige Absinken definiert, liefert weitere Informationen bezuglich der Beschaffenheit der in der Testprobe vorhandenen Ahtioxidantien, und 3) das erforderliche Gerät ist relativ einfach, leicht zu warten und ermöglicht die gleichzeitige Durchführung mehrerer Bestimmungen.
Die Erfindung ist in erster Linie auf sauerstoffabhängige Chemilurnineszenzreaktionen, insbesondere durch Peroxidase katalysierte, und vor allem auf solche Reaktionen anwendbar, die eine hohe und im wesentlichen konstante Rate an Photon-Erzeugung oder einen hohen Lichtemissionsgrad, wie weiter oben beschrieben, liefern. Zur Erfüllung einer solchen Anforderung ist häufig ein Verstärker der Lumineszenzreaktion erforderlich.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann der Beitrag des Antioxidans jeglicher spezieller oder besonderer Klassen von Antioxidantien, von denen bekannt ist oder die unter Verdacht stehen, daß sie in einer Probe vorhanden sind, durch Vergleichen des Antioxidans Gehalts der Probe vor und nach Beseitigung dieses speziellen Antioxidans bestimmt werden Weiterhin kann das Muster des Lumineszenz-Outputs seinerseits Informationen bezuglich der in der Probe vorhandenen Klasse von Verunreinigungen liefern.
Die Erfindung schließt auch die Verwendung in dem oben beschriebenen Verfahren eines Klts zur Durchführung der Bestimmung ein, das ein Lumineszenzsubstrat und ein Antioxidans (zur Durchführung von Standardisierungen) umfaßt. Dort, wo die Lumineszenzreaktion durch ein Enzym beschleunigt wird, wird der Begriff "Lumineszenzsubstrat" eher zur Bezeichnung des Ausgangsmaterials chemischer Art, das sich bei der Reaktion chemisch verändert, als zur Bezeichnung des Enzymsubstrats verwendet. Somit ist das Lumineszenzsubstrat im Fall einer Reaktion von Luminol mit einem Peroxid und Peroxidase Luminol, nicht Peroxid. Andere für die Lumineszenzreaktion erforderliche oder wunschenswerte Reagenzien können selbstverständlich in dieses Kit eingeschlossen werden.

BESCHREIBUNG VON ZUSÄTZLICHEM STAND DER TECHNIK

Ein bekanntes Merkmal von Antioxidantien besteht im Absenken von Lumineszenz, die bei einer Reihe verschiedener Chemilumineszenzquellen beobachtet wurden (Radi et al Biochimica et Biophysica Acta (1989), , 89-93). Diese Eigenschaft ist in einem Versuch genutzt worden, zu bestimmen, welche Radikalen vorzugsweise von welchen Antioxidantien "aufgesogen" werden (Rao et al Biochem. and Biophys. Res. Commun. (1988), , (1), 39- 44) als auch die Wirksamkeit verschiedener Lebensmittelantioxidantien zu vergleichen (Kahl et al. Arch. Toxicol. (1987), , 158-162) Ferner ist es zur Bestimmung von Superoxiddismutase entwickelt worden (siehe Popov et al Biomed. Biochim. Acta (1987), , (11) 775-9) Frew et al. (Anal. Lett. (1985) (B 13) 1579-1592) haben zur Bestimmung von Reduktionsmitteln eine Chemilumineszenzverzögerungstechnik entwickelt. Sämtliche Bestandteile für die durch Eisen(III)-häm katalysierte Oxidation von Luminol wurden vor dem Hinzufügen von Wasserstoffperoxid, das die Chemilumineszenzreaktion ausgelöst hat, mit dem Reduktionsmittel vermischt. Die Zeitverzögerung vor der Wahrnehmung jeglicher Chemilumineszenz wurde als Index der ursprünglich hinzugesetzten Reduktionsmittelmenge genommen. Diese Bezie hung zwischen der Zeitverzögerung und Konzentration von Reduktionsmittel war über eine begrenzten Bereich von Reduktionsmittelkonzentrationen linear. Wong et al. (Photochem. & Photobiol. (1981) 737-740) stellten eine lineare Beziehung zwischen der Zeitverzögerung vor Wahrnehmung von Chemilumineszenz und Konzentration reduzierter Pyridinnukleotide zum Beispiel NADH und NADPH, fest. Sie verwendeten eine Luminol-MEERRETTICH- POD-unverstärkte Chemilumineszenzreaktion und vermischten die reduzierten Nukleotide vor Reaktionsstart durch Wasserstofiperoxid mit den Reaktionsmitteln. Ferner beobachteten sie daß der maximale Lichtemissionswert verringert wurde, wenn höhere Konzentrationen reduzierter Nukleotide hinzugesetzt wurden Dieses Dämpfen bzw. Quenchen der Lichtemission wurde bei der Verwendung anderer Reduktionsmittel wie Ascorbinsäure, Dithionit, Ferrocyanid und Cystein ebenfalls beobachtet. In keiner der beiden letztgenannten Arbeiten wird eine Durchführung weiterer Versuche oder Untersuchung der beobachteten pHänomene besprochen, und es wurden keine weiteren Anwendungsvorschläge für diese Beobachtungen gemacht.
In sämtlichen vorangehend zitierten Literaturquellen wurden keine Vorschläge bezüglich der Verwendung eines Chemilumineszenzverfahrens zur Bestimmung von Wasserqualität gemacht.
Unsere vorherige europaische Patentanmeldung 91911019.7 auf der Basis von PCT/GB91/- 0031 (WO 91/19979) und zitiert unter Artikel 54 (3) EPÜ betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des Antioxidans-Gehalts einer Probe, insbesondere einer biologischen Flüssigkeit, eines Nahrungsmittels oder eines Öls, das das Überprüfen des Einflusses umfaßt, der durch die Probe auf eine ablaufende Lumineszenzreaktion ausgeübt wird. Es wird keine Bestimmung von Wasserproben beschrieben. (Proben biologischer Flüssigkeiten sind keine Wasserproben). Somit enthält die ältere Anmeldung keinen Vorschlag zur Bestimmung der Wasserqualität.
Ein Vorschlag zur Prüfling von Wasser auf seinen Ozonbedarfist in der GB-A1 542 155 veröffentlicht worden. Eine Wasserprobe, die beliebige von bestimmten definierten chemischen Verunreinigungen enthält, laßt man im Dunkeln mit Ozon zum Aussenden von Licht reagieren Allerdings betrifft der Vorschlag nur solche Verunreinigungen, die in Wasser durch Ozon oxidationsfahig sind, und liefert keine Lumineszenz, wenn die festgelegten Chemikalien nicht im Wasser vorhanden sind, d.h. keinen "Blindwert".

KURZE BESCHREIBUNG DER BEGLEITENDEN ZEICHUUNGEN

Die Figuren 1-5 sind Graphen der Lichtemission aus einer Lumineszenzreaktion, der verschiedene Proben hinzugesetzt worden sind, geplottet gegen den Faktor Zeit. Die Figur 6 ist eine schematische Karte des Flusses Avon. Die Figur 7 ist eine Korrelation zwischen der vorliegenden Erfindung und TOC.

BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Der Sauerstoffliefernde Bestandteil der Lumineszenzreaktion braucht kein molekularer Sauerstoff zu sein, sondern kann Wasserstofiperoxid oder zum Beispiel ein Perborat sein. Eine geeignete Chemilumineszenzreaktion, die eine relativ konstante Photonenemission aufweist, ist die, bei der die Reaktion zwischen einer Peroxidase, einem Oxidans und einem Dihydrophthalazindion (DPD) in Gegenwart eines Verstärkers stattfindet. Diese Chemilumineszenzreaktionen werden in unseren Europäischen Patenten Nr.87.959 und 116.454 sowie im GB- Patent 2162946 und der GB-Patentanmeldung Nr. 8814148.6 (Veröffentlichungs-Nr. 2205945A) beschrieben und können alle im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung angewandt werden.
Ein bevorzugtes DPD für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ist Luminol oder Isoluminol, ein bevorzugtes Oxidans ist Wasserstoffperoxid oder Natriumperborat, und bevorzugte Verstärker sind para-Iodphenol, para-Hydroxyzimtsäure oder para-Imidazol-1-yl-phenol, am stärksten bevorzugt para-Iodphenol. Diese Verstärker weisen über einen längeren Zeitraum eine hohe und relativ konstante Lichtemissionsrate auf und können als "Vergleichswert" bevorzugter Höchstwerte von hohem Output zur Verwendung im Zusammenhang mit der Erfindung genommen werden, ungeachtet der Beschaffenheit des Verstärkers oder anderer eingesetzter Reagenzien. Andere Verstärker, die in der vorliegenden Erfindung brauchbar sind, umfassen 2- Cyan-6-hydroxybenzothiazol, 1-Brom-2-naphthol, para-Phenylphenol und N,N,N',N'-Tetramethylbenzidin. Ein bevorzugtes Peroxidaseenzym ist Meerrettichperoxidase (MEERRETTICHPOD).
Die oben beschriebenen Chemilumineszenzreaktionen sollen nur für die vielen geeigneten Lumineszenzreaktionen repräsentativ sein, die den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt sein könnten. Viele andere bekannte Chemilumineszenzreaktionen oder Variationen davon werden für die vorliegenden Zwecke wahrscheinlich als geeignet angesehen und können durch einfache Versuchsdurchführung untersucht werden.
Die Veränderungen in der Lichtemission können unter Verwendung eines herkömmlichen Photomultiplier-Luminometers mit einem Rekorder überprüft werden. Für einfache qualitative Untersuchungen kann ein photographischer Film oder sogar eine Betrachtung mit bloßem Auge geeignet sein. Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß die Bestimmung wegen der relativ hohen Intensität der Lichtemission unter Verwendung eines batteriebetriebenen "Hand-"Luminometers, bei dem Meßwerte des Photonenoutputs alle 30 Sekunden oder noch häufiger abgelesen werden können, überprüft werden kann.
Die in der vorliegenden Erfindung angewandte Bestimmung ist bei vielen verschiedenen Arten von Wasser anwendbar. Sie ist damit auf Abwasser (behandelt oder unbehandelt), Flußwasser, Meerwasser, Reservoirwasser, Leitungswasser, industrielles Abwasser, Silage-Abwasser, Viehschlamm und Molkereiabwasser anwendbar.
In einer weiteren Ausführungsform kann die Erfindung dazu verwendet werden, um den Beitrag spezifischer oder besonderer Klassen von Antioxidantien zu bestimmen, von denen bekannt ist oder die unter dem Verdacht stehen, in einer Wasserprobe vorhanden zu sein, indem der Antioxidans-Gehalt, bestimmt mit dem Verfahren der Erfindung, vor und nachdem das spezifische Antioxidans oder die besonderen Klassen an Antioxidantien entfernt oder extrahiert worden sind, verglichen wird.
Somit kann der Beitrag des Antioxidans von Substanzen, wie Proteinen, die in einer Wasserprobe enthalten sind, durch Vergleichen des Antioxidans-Gehalts der Probe vor und nach Entfernen der Proteine bestimmt werden. Die Proteinentfernung kann durch Verfahren erfolgen, die im Fachbereich bestens bekannt sind, einschließlich Fällung oder Filtrieren mit oder ohne Zentrifligierung durch einen Molekularfilter.
Ähnlich kann der Beitrag des Antioxidans anderer Antioxidantien unter Anwendung von im Fachbereich bekannten Verfahren für die Entfernung aus der Probe bestimmt werden, zum Beispiel unter Anwendung der Ionenaustauschfiltrierung zur Entfernung von Schwermetallen Anionen oder Kationen und Phenole können durch Kochen entfernt werden. Eine weitere Anwendung der Erfindung liegt in der Identifikation der Verunreinigungsquelle in einem Fluß oder Reservoir und dergleichen. Ein Beispiel für eine solche Anwendung wird in Beispiel 2 gegeben, in dem der Ursprung der Verunreinigungen korrekt identifiziert wurde, indem def Antioxidans-Gehalt der Proben, die oberhalb eines verschmutzten Teiches entnommen wurden, fortlaufend gemessen wurde.
Die Bestimmung ist sensitiv genug, um in typischen Konzentrationen vorhandene Verunreinigungen nachzuweisen. Die Sensitivität hängt von der in der Probe vorhandenen Konzentration des Antioxidans ab. So werden in weniger konzentrierten Proben, z. B. in Flußwasser oder Leitungswasser, wesentlich größere Mengen, vielleicht 20-50 mal so viel wie für Rohabwasser, benötigt. In stark verunreinigten Proben wie Viehschlamm oder Silage-Abwasser, kann eine bis zu 10.000 bis 20.000-fache Verdünnung der Proben nötig sein. Günstigerweise ersetzt eine Leitungswasserprobe lediglich das destillierte Wasser, das zur Verdünnung der Reagenzien verwendet wurde, die zum Lumineszenzsignal führen. Bei der Prütung von Meerwasser ist es wesentlich, daß in der "Kontroll-"Reaktion künstliches Meerwasser oder eine Saline verwendet wird.
Die Bestimmung ist für eine großen Bereich von Verunreinigungen sensitiv; so hat sich gezeigt, daß die folgenden Verbindungen eine Wirkung auf das Maß der Lichtemission haben..
Resorcinol, Catechin, Captopril, N,N,N',N'-Tetrametylbenzidin, Vanillinsäure, o-Phenylendiamin, p-Phenylendiamin, Chromchlorid, Kaliumferrocyanid, Natriumthiosulfat, Dimethylsulphoxid, 4-Methoxybiphenyl, Catalase, Dipyridamol, Phenol, m-Chlorphenol, Ethanol, Die thylthiocarbaminsäure, butyliertes Hydroxytoluol, Gallussäure, N-2-Mercaptopropionylglycin, reduziertes Gluthation, Albumin, Bilirubin und Cystein.
Es hat sich gezeigt, daß jede dieser Verbindungen auf eine Weise Licht aussendet, die ähnlich den in den Figuren 2-5 gezeigten Graphen ist.
Diese Auflistung ist keinesfalls vollständig. Wie man sehen kann, beeinflussen alle Polyphenole, substituierte Amine und Sulfhydryl, die Verbindungen enthalten, die Lichtausssendung. Diese Klassen von Verbindungen sind gute Beispiele für den Typ von Verunreinigungen, der häufig in Wasser vorgefünden wird.
Zur Erzielung eines quantitativen Wertes bezüglich des Antioxidans-Gehalts kann der gemessene Parameter mit einem "Standard"-Wert verglichen werden. Ein geeigneter Standard kann aus obiger Auflistung gewählt werden, ist aber vorzugsweise Trolox (6-Hydroxy-2,5,7,8- Tetramethylchroman-2-carbonsäure) oder o-Phenylendianun.
Die Figur 1 der Zeichnungen veranschaulicht, wie die Lichtintensität der Lumineszenzreaktion durch Probenzugabe vor Reaktionsstart zum Zeitpunkt Null (fettgedruckte Linie) beeinflußt werden kann, im Vergleich zu einer Kontroll-Lumineszenzreaktion ohne Wasserprobe (gestrichelte Linie), wobei die Lichtintensität graphisch gegen die Zeit dargestellt ist. Mit Bezug auf die Figur 1 haben die gekennzeichneten Abstände folgende Bedeutung:
(a) ist die Zeit zwischen dem Start der Lumineszenzreaktion und Beobachtung eines im wesentlichen konstanten Lumineszenzniveaus,
(b) ist die Differenz im Luminenszenzgrad an einem festen Punkt nach dem Start der Lumineszenzreaktion zwischen einer Testprobenreaktion und einer Kontrollreaktion,
(c) ist die Differenz zwischen dem in der Testreaktion beobachteten im wesentlichen konstanten Lumineszenzniveau und dem der Kontrolle.
Das Absinken der Lichtintensität (d) ist der natürliche Abfall der verstärkten Reaktion aufgrund der MEERRETTICH-POD-Inaktivierung etc. Dies ist typischerweise eine Abnahme von nicht mehr als 2%, vorzugsweise nicht mehr als 1% und am stärksten bevorzugt nicht mehr als 0,6% in der Minute.
Alternativ kann ein Zeitintervall, anstatt es auf das Wiedererreichen eines relativ konstanten Lumineszenzniveaus hin zu messen, aufirgendein vorbestimmtes Niveau, wie 10%-70% entweder des Anfangswertes oder des endgültigen Wertes, gemessen werden. In einer anderen Ausführungsform wird der Lumineszenz-Regenerierungsgrad bei einem gegebenen Zeitinter. vall ab dem Zeitpunkt der Probenzugabe gemessen und mit dem Lumineszenzgrad zum Zeitpunkt der Probenzugabe verglichen.
Im weiteren Aspekt der ersten Ausführungsform der Erfindung können zum Erzielen weiterer Informationen bezüglich des Antioxidans-Gehalts weitere Parameter in den Mustern beobachteter Luniineszenzniveaus angewandt werden. So kann der Unterschied zwischen dem anfanglichen Luminszenzniveau vor der Probenzugabe und dem Niveau nach der Probenzugabe verwendet werden, wie auch die Zeitverzögerung aus der Probenzugabe bis zur Beobachtung eines zweiten im wesentlichen konstanten Lumineszenzniveaus. Wenn zur gleichen Zeit eine Kontrolle ohne Testwasserprobe durchgeführt wird, ist der Unterschied zwischen Kontrollund Testniveau ebenfalls brauchbar.
Ein besonders bevorzugtes Kit für die Bestimmung der Erfindung umfaßt ein DPD (z.B. Luminol oder Isoluminol), einen Verstärker (z.B. Iodphenol), einen Beschleuniger (z.B. Peroxidase) und ein Antioxidans (z. B. Trolox oder o-Phenylendiamin). Vorzugsweise enthält das Kit ferner ein Oxidans (z.B. Wasserstofiperoxid) und einen Puffer.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung.
"Amerlite" und "Trolox" sind eingetragene Warenzeichen.

BEISPIEL 1

ANWENDUNG EINER ANTIOXIDANS-BESTIMMUNG BEI VERSCHIEDENEN WASSERPROBEN

Das "Amerlite" Signalreagens wurde nach den Herstelleranweisungen hergestellt, und es wurde eine Verdünnung von 1:10 davon verwendet (100 µl "Amerlite" Signalreagens auf 900 µl destilliertes Wasser), nachfolgend als das Signalreagens bezeichnet. 60 µl Amerlite MEERRETTICH-POD-anti- IGG-Konjugat (als MEERRETTICH-POD-Quelle) wurden zur Verwendung in der Bestimmung zu 20 ml destilliertem Wasser hinzugefügt. 1 ml Signalreagens in Wasser wurde für die Verwendung im Luminometer in eine Küvette eingebracht. 20 µl Arbeitslösung des MEERRETTICH-POD-Konjugats wurden hinzugefügt. Dies wurde 2 Minuten lang oder so lange in das Luminometer eingebracht, bis ein im wesentlichen konstantes Niveau an Photonenoutput beobachtet wurde. Als ein konstantes Niveau erreicht war, wurde die Testprobe hinzugefügt und dieser Moment als Nullzeit genommen. Die Reaktion konnte etwa 8 Minuten lang weiter ablaufen. Messungen wurden auf einem Tisch-Luminometer (mit einem Photomultiplier) durchgeführt.
Die folgenden Wasserproben wurden in den angegebenen Mengen hinzugefügt. Wenn eine 900 µl-Probe hinzugefügt wurde, wurde sie anstelle des 900 µl destillierten Wassers verwendet.
i) Abwasser vor Sandfiltration, (40 µl);
ii) Abwasser nach Sandfiltration, (40 µl);
.iii) Abwasser (a) nach chemischer Behandlung, (40 µl);
(b) nach einer langsamen Sandfiltration, (40 µl);
(c) Londoner Leitungswasser, (40 µl);
iv) (a) unbehandeltes Abwasser, (40 µl);
(b) dto., 1:100 verdünnt, (900 µl);
(c) dto., 1:1000 verdünnt, (900 µl);
(d) destilliertes Wasser, (900 µl).
Die aus (i)-(iv) erhaltenen Plots sind in den Figuren 2-5 entsprechend dargestellt. Jede Figur zeigt den Plot der Lichtemission aus einer Chemilumineszenzreaktion auf der Ordinate (y- Achse) gegenüber der Zeit auf der Abszisse (x-Achse).
Man kann feststellen, daß, je verdünnter das Abwasser ist, desto steiler ist der Lumineszenzanstieg auf ein Niveau, das dem von Trinkwasser nahekommt. In der Fig. 5 sind (a) und (b) nicht direkt vergleichbar, da (a) eine 40 µl-Probenmenge und (b) eine 900 µl-Probenmenge betriffi, wodurch jedoch die Sensitivität der Bestimmung veranschaulicht wird.
Dieses Beispiel der Basis-Bestimmung wurde für Meerwasser, Silage-Abwasser, Viehschlamm und Molkereiabwasser wiederholt. Die letzten drei Substanzen verfügen über sehr hohe BOD- Werte und mußten in sehr starkem Maß verdünnt werden (1:10.000 oder 1 zu 20.000), um bei Anwendung der vorliegenden Erfindung ein brauchbares Ergebnis zu erzielen.

BEISPIEL 2

ANWENDUNG DER BESTIMMUNG BEI LOKALISATION EINER VERUNREINIGUNGSQUELLE

Dieses Beispiel beschreibt, wie unter Anwendung des Verfahrens der Erfindung der Ursprung einer Verunreinigung eines Sees identifiziert wurde. Während dieses gesamten Beispiels wurde ein Hand-Luminometer verwendet. Reagenzien und Mengen wurden wie in Beispiel 1 beschrieben angewandt. Die Chemilumineszenzreaktion konnte eine Minute lang nach der Wasserprobenzugabe weiter ablaufen. Der Einminutenwert für eine Wasserprobe wurde von deni Wert substrahiert, der sich durch die Verwendung von destilliertem Wasser ergab, und die Differenz wurde als eine Verringerung in % des 1-minütigen Niveaus des destillierten Wassers ausgedrückt d.h. C1-Niveau nach 1 Minute (Kontrolle) (Probe)
Ein geringer T&sub1;-Wert weist deshalb auf eine geringe Verunreinigung hin.
Bei dem untersuchten See handelte es sich um den Vale Lake innerhalb des Zustandigkeitsbereichs des Birmingham City Engineering Departments. Wahrend des vergangenen Jahres hatte der See einen Rückgang seines Tierbestandes, den er unterhält, zu verzeichnen. Als eine Probe seines Wassers gemaß der Erfindung untersucht wurde, zeigte sie einen T&sub1; von 57%. Ein ähnlicher See mit einem gedeihenden Tierbestand wies einen T&sub1; von 11% auf Die Proben wurden an der Quelle entnommen, die den Vale Lake speisen. Dies ergab einen T&sub1; von 75% unter Verwendung einer 1:10-Verdünnung der Probe. Diese Quelle wurde von zwei Wasserläufen gespeist. Es wurden Proben von beiden genommen. Eine zeigte einen T&sub1; < 10% und die andere einen T&sub1; von 70%. In den verunreinigten Wasserlauf mündeten kommunale Abwasserkanäle Diese Abwasserkanäle durften nur Oberflächenwasser enthalten und weisen von daher einen niedrigen T&sub1;-Wert auf Die erhaltenen Werte lagen alle zwischen 80 und 100%. Unter Mithilfe von Ingenieuren des Örtlichen Bezirksamts wurden 5 Deckel von Einsteigschächten in Abwas serkanäle, die in den verunreinigten Flußlauf mündeten, gehoben und die den Wasserlauf speisenden Abwässer getestet. An den ersten 4 Einsteigschächten wurden gleichmäßig "hohe" Ablesewerte gewonnen (T&sub1; )70%), bis der Wert am fünften plötzlich auf unter 40% zurückging Eine Untersuchung der Abwasserkanalverbindungen zwischen dem vierten und fünften Einsteigschacht ergab Räumlichkeiten, bei denen Toiletten und Ausgußbecken an Abwasserkanäle angeschlossen worden waren, die nur Oberflächenwasser und kein Abwasser aufliehmen sollten.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung diente somit als ein rasches Verfahren zur Wasserbeurteilung und Lokalisation des Ursprungs von Wasserverunreinigungen. Die defekten Abwasserkanalverbindungen wurden repariert, und allmählich kehrt die Tierwelt des Vale Lake wieder zurück.
Bei einer Uberprüfüng mehrere Monate später hatte die den Vale Lake speisende Quelle eineij T&sub1; von 25%. Der See selbst zieht an seinem Ufer so viele Gänse an, daß T&sub1;-Werte von 50-70% dort verzeichnet werden. Diese lokal hohen T&sub1;-Werte sind auf Abfallprodukte der Gänse zurückzuführen, die in das Wasser sickern.

BEISPIEL 3

VERWENDUNG DER BESTIMMUNG BEI DER BEWERTUNG DER "ANATOMIE" EINES FLUSSES

Dieses Beispiel beschreibt, wie die "Anatomie" eines Flusses unter Verwendung des Verfahrens der Erfindung untersucht werden kann. Unter "Anatomie" verstehen wir einen Hinweis auf sein Verunreinigungsprofil, das ihn mit zuströmenden Nebenflüssen und anderen möglichen Verunreinigungsquellen in Zusammenhang bringt.
Die Bedingungen für die Durchführung der Bestimmungen entsprachen den oben beschriebenen. Die T&sub1;-Werte wurden auf ahnliche Weise ermittelt und in Klammern angegeben.
In Zusammenarbeit mit der Severn Trent Wasserbehörde wurde der Fluß Avon untersucht. wobei in unmittelbarer Nähe der City von Coventry begonnen und etwa fünf Meilen südwestlich von Stratford-upon-Avon bei Welford-on-Avon geangelt wurde. Die Figur 6 zeigt eine schematische Landkarte vom untersuchten Bereich des Flusses Avon.
Der Fluß Avon fließt in der Nähe der großen Industriestadt Rugby vorbei und zieht sich östlich von Coventry durch freies Land. Proben wurden bei Cloud Bridge (40) und Stare Bridge (43) nahe des Nationalen Landwirtschaftszentrums (National Agricultural Centre/NAC) genommen. An dieser Stelle mündet der Fluß Sowe, der durch Coventry fließt, in den Fluß Avon Der Flußquelle wurde bei Baginton (57) eine Probe entnommen, bevor er durch die Kläranlage von Finham fließt, die behandeltes Abwasser in den Sowe abläßt, was zur Verunreinigung führt, wie die Messung bei Stoneleigh Village (97) gezeigt hat. Bei Ashdown, etwa 1/2 Meile südlich vom Zusammenfluß des verunreinigten Sowe und des Avon, gibt es eine starke Hemmung (91).
Es wurden Meßwerte von der Saxon Mill Brücke und der Portabelb Brücke zwischen Leamington Spa und Warwick erhalten, von Saxon Mill (84) und Portabeib (72). An dieser Stelle fließt der Fluß Leam (46) in den Fluß Avon, und ganz in der Nähe wurde stromabwärts ein Meßwert bei Warwick Castle Bridge (37) genommen.
Diese Ergebnisse können auf die natürliche Oxidation der Verunreinigung von Finham zurückzuführen sein, da der Avon durch freies Land ohne weitere städtische Verunreinigung fließt.
Stromabwärts von Warwick Castle (25) wird behandeltes Abwasser aus der Longbridge- Kläranlage des Warwick-Bezirks in den Fluß abgelassen, was in einem Ablesewert von 63 bei Barford Bridge resultiert. Diese Hemmung wird einige Meilen weiter bei Hampton Lucy Bridge noch weiter auf 52 verringert.
Anschließend fließt bei Charlecote Park der Fluß Dene (66) in den Avon. Diese Stelle des Dene befindet sich stromabwärts von einer kleinen Kläranlage, die Strömung ist viel geringer als die des Avon. Bis der Avon Stratford-upon-Avon erreicht, kommt es zu keiner weiteren Verunreinigung mehr (46). Der Grand Union Canal überquert den Avon etwas weiter stromabwärts, wobei das Kanalwasser sauber (25) ist.
Ein weiterer Nebenfluß, der Fluß Stow, bei Clifton Chambers (55) scheint das allgemeine Bild nicht zu verändern, und bei Welford-on-Avon (46) weist der Avon Werte auf, die denen oberhalb der Verunreinigung von Finham nahekommen.
So ist unter Verwendung der vorliegenden Erfindung ein Profil eines Flusses oder einer Wasserquelle leicht zu erhalten, und mögliche Verunreinigungsquellen sind ohne weiteres identifizierbar.

BEISPIEL 4

VERGLEICH EINER ANTIOXIDANS-BESTIMMUNG UND EINER BESTIMMUNG DES GESAMTEN ORGANISCHEN KOHLENSTOFFS (TOC)

Dieser Vergleich wurde von der Severn Trent Wasserbehörde unter Anwendung der Bestimmung der vorliegenden Erfindung und der TOC vorgenommen, wie sie im Laborverfahrenshandbuch der Severn Trent Laboratorien des Birmingham Labors beschrieben ist.
Die Antioxidans-Bestimmung wurde durch Hinzufügen einer 200 µl-Wasserprobe zum Amerlite Signalreagens (800 µl) vor Reaktionsstart durch Hinzufügen von MEERRETTICH-POD (20 µl) durchgeführt. Es wurden Kontrollreaktionen durchgeführt, indem die Testprobe durch entionisiertes Wasser ersetzt wurde. Sowohl die Test- als auch die Kontrollreaktionen konnten 2 Minuten lang weiter ablaufen. Der Unterschied im Lumineszenzniveau bei zwei Minuten zwjschen Test- und Kontrollreaktionen wurde als Index des Antioxidans-Gehalts der Probe genommen und wird als der Δ&sub2;-Wert bezeichnet.
Eine Reihe von Proben wurde eine Zeitlang aus dem Fluß Winlap entnommen. Von jeder Probe wurden zweifache Messungen des TOC und des Antioxidans-Gehalts durchgeführt. Die Figur 7 zeigt die Korrelation zwischen dem Ahtioxidans-Gehalt (Δ2 auf der y-Achse) und dem TOC (mg/l Kohlenstoff auf der x-Achse). Jeder Punkt ist der Durchschnittswert von zwei Proben. Wie aus der Figur hervorgeht, korrelierten die beiden Tests gut miteinander, und diese Korrelation wurde durch Tests an anderen Orten bestätigt.

Claims

1. Ein Verfahren zur Bestimmung der biologischen oder chemischen Qualität einer Wasserprobe, von der bekannt ist, oder die unter dem Verdacht steht, Antioxidans-Verunreinigungen zu enthalten, hinsichtlich des Antioxidans-Gehalts, welches das Überprüfen des Eirtlusses umfaßt, der durch eine Probe auf eine Chemilumineszenzreaktion ausgeübt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, in dem die Probe vor dem Start der Reaktion hinzugesetzt wird so daß nach dem Start der festgestellte Grad der Lumineszenz für einen kurzen Zeitraum verringert ist und sich dann auf ein im wesentlichen konstantes Niveau regeneriert.

3. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem der Lumineszenzwert gemessen wird, nachdem eine vorbestimmte Zeitspanne seit dem Zeitpunkt des Reaktionsstarts verstrichen ist, und mit einer ähnlichen bei einer Kontrollreaktion ohne hinzugesetzter Probe durchgeführten ähnlichen Messung verglichen wird, wobei der Unterschied zwischen den beiden ein Index des Antioxidans-Gehalts der Probe ist.

4. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem die Zeitspanne zwischen dem Start bis zum Erreichen eines im wesentlichen konstanten Lumineszenzniveaus gemessen wird und als ein Index des Antioxidans-Gehalts der Probe angesehen wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Probe einer ablaufenden Chemilumineszenzreaktion hinzugesetzt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, bei dem die Chemilumineszenzreaktion so durchgeführt wird, daß das Lumineszenzniveau sich auf ein Plateau erhöht, bei dem es im wesentlichen konstant bleibt, und die Probe bei diesem Niveau hinzugegeben wird, und wobei die Probe in einer wirksamen Menge hinzugesetzt wird, um einen plötzlichen Abfall im Lumineszenzniveau zu verursachen, gefolgt von einer Regenerierung auf das vorher vorhandene im wesentliche konstante Niveau.

7. Verfahren nach Anspruch 5, bei dem die Probe einer ablaufenden Chemilumineszenzreaktion zu einem Zeitpunkt hinzugegeben wird, wo das Lumineszenzniveau ansteigt und innerhalb 10 % vor dem Erreichen des im wesentlichen konstanten Niveaus liegt.

8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, bei dem der Zeitraum zwischen der Zeit, wenn die Probe hinzugesetzt wird, und einem vorbestimmten Regenerierungsgrad gemessen wird.

9. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, bei dem der Regenerierungsgrad der Lumineszenz zu einem gegebenen Zeitraum seit dem Zeitpunkt der Probenzugabe gemessen wird und mit dem Lumineszenzgrad zum Zeitpunkt der Probenzugabe verglichen wird.

10. Verfahren nach Anspruch 9, bei dem der Regenerierungsgrad nach einem Zeitintervall nach dem Zeitpunkt der Probenzugabe bestimmt wird und mit der gleichen Messung, die bei einer Kontrollreaktion ohne Probenzugabe vorgenommen wurde, verglichen wird.

11. Bestimmungsverfahren der biologischen oder chemischen Qualität einer Wasserprobe hinsichtlich des Antioxidans-Gehalts, bei dem der Antioxidans-Gehalt der Probe, bestimmt mit einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 10, vor und nachdem das spezifische Antioxidans oder die besondere Klassen an Antioxidantien entfernt oder extrahiert worden sind, verglichen wird.

12. Verfahren nach Anspruch 1, 5 oder 6, bei dem die Probe Abwasser, Flußwasser, Reservoirwasser, Leitungswasser oder industrielles Abwasser ist.

13. Verfahren nach Anspruch 7, 8 oder 9, bei dem die Probe Abwasser, Flußwasser, Reservoirwasser, Leitungswasser oder industrielles Abwasser ist.

14. Verfahren nach Anspruch 2, 3 oder 4, bei dem die Probe Abwasser, Flußwasser, Reservoirwasser, Leitungswasser oder industrielles Abwasser ist.

15. Verfahren nach Anspruch 1, 5 oder 6, bei dem die Chemilumineszenzreaktion sauerstoffabhängig ist.

16. Verfahren nach Anspruch 7, 8 oder 9, bei dem die Chemilumineszenzreaktion sauerstoff abhängig ist.

17. Verfahren nach Anspruch 2, 3 oder 4, bei dem die Chemilumineszenzreaktion sauerstoffabhängig ist.

18. Verfahren gemaß Anspruch 15, bei dem die Chemilumineszenzreaktion die Reaktion einer Peroxidase, eines Oxidants und eines Dihydrophthalazindions in Gegenwart eines Verstärkers umfaßt.

19. Verfahren nach Anspruch 16, bei dem die Chemilumineszenzreaktion die Reaktion einer Peroxidase, eines Oxidants und eines Dihydrophthalazindions in Gegenwart eines Verstärkers umfaßt.

20. Verfahren nach Anspruch 17, bei dem die Chemilumineszenzreaktion die Reaktion einer Peroxidase, eines Oxidants und eines Dihydrophthalazindions in Gegenwart eines Verstärkers umfaßt.

21. Verfahren nach Anspruch 18, bei dem der Verstärker para-Iodphenol- oder para- Hydroxyzimtsäure ist.

22. Verfahren nach Anspruch 19, bei dem der Verstärker para-Iodphenol- oder para- Hydroxyzimtsäure ist.

23. Verfahren nach Anspruch 20, bei dem der Verstärker para-Iodphenol- oder para- Hydroxyzimtsäure ist.