JPH06507012A - 水汚染物のアッセイ法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は、生物学的および化学的特性の観点から、発光反応を利用して測定を おこなう水汚染物のアッセイ法に関する。

２　従来技術の説明 水の汚染は世界的な問題となっている。水の汚染を検知するための多くの試験法 が知られている。一般に、汚染物資は水中での酸素の有効利用率の低下をもたら す。このような酸素消失は好ましいものではなく、水資源内における微妙な生態 系の破壊をもたらすことがある。この結果、河川、池および湖等においては、汚 染物資の濃度増加に伴って、水中の酸素濃度が低下するので、植物や野生動物が 死滅することになる。

試料水中の酸素濃度は汚染物の含有量を示す。水中の酸素濃度測定法としてはい くつかの方法が知られている。比較的正確な測定法には、酸素電極の使用法が含 まれる。汚染の監視においては、生化学的酸素要求量（ＢＯＤ）試験は広範囲に 利用されている。この試験法においては、主として生物学的作用（細菌酸化）に よってもたらされる溶存酸素濃度の低下を２０℃において５日間測定する。ＢＯ Ｄ試験にはいくつかの欠点がある。この試験過程は、水中において自然におこな われる過程に類似しない。これは、主としてこの試験法が暗闇内でおこなわれる ことによる。また、この試験法は、試料中の適当な細菌の欠乏または汚染物質の 分解を妨げる毒性化合物の存在によって複雑になる。さらに、試料中の酸素含有 量が試料の貯蔵中に変化することがある。一般に、正確な値を得るために考慮し なければならない要因が多い。得られる結果の変動率は高い。これらの方法およ びこれらに関連するその他の方法は、「水と廃水の標準測定法Ｊ（Ａ閣ｅｒ、　 Ｐｕｂ、　ＨｅａｌｔｈＡ　５ｓｏｃ発行（１９７９年、第１５版）〕において 議論されている。

最近、国立河用局（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｒｉｖｅｒｓ　Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ）は 、現行の５日間にわたるＢＯＤ試験方法は全有機炭素（ＴＯＣ）測定法によって 置き換えられるべきことを推奨している［ラボラトリ−・イクイップメント・ダ イジェスト（Ｌ　ｏｂｏｒａ　ｔｏｒｙＥｑｕｉｐｍｅｎｔ　Ｄｉｇｅｓｔ）、 １９９１年８月号、第４１頁〜第４２頁参照］。しがしながら、この方法にもい くつかの欠点がある。ＵＶ照射と濃硝酸を使用しなければならないため、特別な 実験条件を必要とする。水中に存在する無機の炭酸塩、重炭酸塩および二酸化炭 素は反応を妨げるので、これらの化合物は最初に除去されなければならないため 、最終的に得られる結果は不正確になる場合が多い。

これらの方法は限られた情報のみを提供するだけであり、また、手間がかかるだ けでなく、特殊な実験装置と専門技術者を必要とする。

従って、現場において簡単に実施できる方法であって、試料水の生物学的特性と 化学的特性を迅速に評価し得る試験法が要請されている。

さらに別の先行技術については、以下の「発明の概要」の後で言及するが、これ は、本発明と関連させないとそれらの内容が明確にならないからである。

発明の概要 試料水を化学発光反応系に添加すると、存在する抗酸化剤と汚染物質が、観測さ れる発光準位（測定される光出力）を一時的に低減させることを本発明の発明者 は究明した。短時間経過後、発光準位は幾分回復する。従って、発光の変化を伴 う発光反応を利用することによって、試料水の抗酸化能をアッセイすることが可 能となり、とれにより、試料水の生物学的特性と化学的特性の指標を得ることが できる。純水は低い抗酸化能しか有さないが、汚染物質や毒性物質の存在によっ て、試料水の抗酸化能は高くなる。

この発明は、試料水によって惹起される発光反応の変化を監視することを含む試 料水の抗酸化能のアッセイ法を提供する。

ここで用いる「アッセイ（ａｓｓａｙ）コまたは「決定（ｄｅｔｅｒａｉｎａｔ ｆｏｎ）Ｊという用語には、定性的、早足性的および定量的な表示、評価、判定 および測定等の意味が包含される。

本発明の第１の態様においては、試料を発光反応の開始前に添加し、該反応開始 から予め決められた時間（好ましくは２分間）経過後、試験反応によって惹起さ れる発光単位を測定し、該測定値を、試料水を添加しない対照反応がら得られる 測定値と比較する。両方の測定準位間の差は試料水の抗酸化能の指標となる。

あるいは、発光反応の開始から発光準位測定までの時間を実質上一定の速度で測 定してもよい。

ここで用いる「抗酸化能（ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ　ｃａｐａｃｉｔｙ）Ｊは水 の生物学的特性と化学的特性の尺度に関するものであって、水の特性を評価する 場合の重要な要素と考えられているものである。この尺度はＴＯＣ値やＢＯＤ値 と良好な相関性があることが知られており、しかもこれらの値よりも迅速かつ高 感度で測定される。

第１の態様の別の観点によれば、試料水を漸進的な（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｎｇ） 発光反応系、即ち発光反応が開始した後の系に添加する。抗酸化剤や汚染物質は 観測される発光（測定される光出力）に一時的な低減効果をもたらす。観測され る発光が低減する時間は試料水の抗酸化能の指標となる。

好ましくは、発光準位が実質上一定になった時の漸進的な発光反応系に試料水を 添加する。この一定の準位は発光準位が最大準位（平坦域）に達した後の準位で あって、実質上最大の準位に維持されるか、または、適度な速度（典型的には、 ０．６％／分までの速度）で低下する。この平坦域の特性は選択される反応物質 によってかなり変化するが、当業者であれば、この種の発光反応自体は既知の反 応であるので、このような平坦域は容易に識別できる。

漸進的な発光反応系が実質上一定の準位に達する前であって、最大準位の１０％ 以内の準位のときに試料水を添加するのが好ましい。

試料水を漸進的な発光反応系に添加すると、発光準位の急落が惹起されるが、該 急落単位は実質上一定の準位に向かって回復する。試料水を添加した時と発光準 位が予め決められた準位に回復した時との間の時間間隔を測定することによって 、試料水の抗酸化能の指標が得られる。発光単位は第２の実質上一定の準位まで 回復する。この第２の準位は最初の実質上一定の準位よりも低位であってもよい 。試料を添加した時から所定の時間間隔が経過した時の発光の回復準位を測定し 、これを、試料を添加した時の発光準位と比較するか、または同じ時間における 対照の発光準位と比較する。後述するように、アッセイは、発光反応中の別の時 間間隔に基づいておこなってもよい。

場合によっては、発光反応に使用する酵素を不活性化させて発光を部分的または 完全に抑制する汚染物質が試料水中に存在していてもよい。

本発明による利点には次の（１）〜（３）の事項が含まれる；（１）アッセイは 各試料について一段階でおこなうことができる。即ち、試験結果を得るために一 連の別々の反応をおこなう必要がない。

（２）アッセイのいくつかの側面には即時的な測定が含まれ、これによって、試 料添加前に測定される発光準位と一時的に低下した後に測定される準位との比較 が可能となる。発光準位および／または準位の一時的低下を画定する曲線の形態 を比較することによって、試料中に存在する抗酸化剤の特性に関するさらに別の 情報が得られる。

（３）試験に必要な装置は比較的簡単で、その維持管理も容易であって、いくつ かのアッセイを同時におこなうことができる。

この発明は、まず第一に、酸素依存性の化学発光反応に適用されるものであって 、特に、高速かつ実質上一定の速度で光子を発生するか、または前述の光出力準 位をもたらすこの種の化学発光反応であって、ペルオキシダーゼを触媒とする化 学発光反応に適用される。このような要求を満たすためには、発光反応の増強剤 （ｅｎｈａｎｃｅｒ）がしばしば必要となる。

本発明の別の態様においては、試料中に存在することが知られているか、または 推定される特殊なまたは特定の種類の抗酸化剤の寄与を、該抗酸化剤の除去前後 における試料の抗酸化能を比較することによって決定する。さらに、発光出力の パターン自体からは、試料中に存在する汚染物質の種類に関する情報が得られる 。

本発明には、標定用の抗酸化剤と発光基質を含有するアッセイ用キットも包含さ れる。発光反応が酵素を触媒とする場合、「発光基質」という用語は、酵素基質 ではなくて、発光反応において化学変化を受ける出発化学種を示す。従って、ル ミノールと過酸化物およびペルオキシダーゼとの反応の場合、発光基質はルミノ ールであって、過酸化物ではない。発光反応にとって必要なもしくは望ましい他 の試薬はもちろん該キットに含ませることができる。

追加の先行技術の説明 いくつかの異なった化学発光源から観測される発光を低減させることは抗酸化剤 の既知の特徴である［ラシ（Ｒａｄｉ）ら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉ ｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ、第９９４巻、第８９頁〜第９３頁（１９８９年） 参照］。この特性は、どのラジカルがどの抗酸化剤によって好適に吸引されるか を決定するために利用されており［ラオ（Ｒａｏ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｔ　ａｎｄ 　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍａ＋ｕｎ、第１５０巻（１）、第３９頁 〜第４４頁（１９８８年）参照］、また、異なった食品用抗酸化剤の効能を比較 するためにも利用されている［カール（Ｋａｈｌ）ら、Ａｒｃｈ、Ｔｏｘｉｃｏ ｌ、第６０巻、第１５８頁〜第１６２頁（１９８７年）参照コ。超酸化物ジスム ターゼのアッセイ法も開発されている［ボポフ（Ｐｏｐｏｖ）ら、Ｂｉａｓｅｄ 、Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ａｃｔａ、第４６巻（１１）、第７７５頁〜第７７９頁参 照］。フリュー（Ｆ　ｒｅｗ）らによって、還元体のアッセイのための化学発光 遅延法が開発されている［Ａｎａｌ、Ｌｅｔｔ、第１８巻（Ｂ１３）、第１５７ ９頁〜第１５９２頁参照］、フェリヘムを触媒とするルミノールの酸化用の全成 分は、化学発光反応を開始させる過酸化水素の添加前に還元体と混合する。化学 発光が観測される前の時間の遅延は初めから添加された還元体の量の指標とされ ている。この時間の遅延と還元体の濃度との間には、還元体の限定された濃度範 囲内において、直線関係が認められている。ウオン（Ｗｏｎｇ）らは、化学発光 が観測される前の時間の遅延と還元されたピリジンヌクレオチド類（例えば、Ｎ ＡＤＨおよびＮＡＤＰＨ等）の濃度との間に直線関係があることを報告している ［Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ、　＆　Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ、　、第３３巻、第７３７頁 〜第７４０頁参照］。

彼らは、増強剤を用いないルミノール−ＨＲＰ化学発光反応を利用し、還元され たヌクレオチドは、過酸化水素による反応開始前に、反応成分と混合される。彼 らはまた、光出力の最大準位が、比較的高濃度の還元ヌクレオチドの添加によっ て低減することを見出している。光出力のこのようなりエンチングは他の還元体 、例えば、アスコルビン酸、ジチオナイト、フェロシアニドまたはシスティン等 を用いるときにも観測されている。最後に言及した２つの報文のいずれにも、観 測された現象をさらに発展させた実験や研究に関する議論はなく、また、これら の観測結果のさらに進んだ応用についての言及はない。

これらの全ての先行文献には、化学発光法を水質のアッセイに利用することを教 示する旨の記載はない。

図面の簡単な説明 図１〜図５は、異なった試料を添加した発光反応系からの発光を時間に対してプ ロットしたグラフである。図６は、エイヴオン用の模式的な地図である。図７は 、本発明とＴＯＣとの相関関係を示すグラフである。

好ましい態様の説明 発光反応に用いる酸素供与成分は分子状酸素である必要はなく、例えば、過酸化 水素や過ホウ酸塩であってもよい。

光子の放出が比較的一定におこなわれる一つの適当な化学発光反応は、増強剤の 存在下において、ペルオキシダーゼ、酸化体およびジヒドロフタルアジンジオン （Ｄ　Ｐ　Ｄ）との間でおこなわれる反応である。この種の化学発光反応は、本 件出願人によるヨーロッパ特許第８７，９５９号、同第１１６，４５４号、英国 特許第２１６２９４６号および英国特許出願第８８１４１４８．６号（公告第２ ２０５９４５Ａ号）各明細書に記載されており、これらのいずれの反応も本発明 において利用することができる。

本発明の目的にとって、好ましいＤＰＤはルミノールまたはイソルミノールであ り、好ましい酸化体は過酸化水素または過ホウ酸ナトリウムであり、また、好ま しい増強剤はｐ−ヨードフェノール、ｐ−ヒドロキシケイ皮酸またはｐ−イミダ ゾール−１−イルフェノール（最も好ましくは、ｐ−ヨードフェノール）である 。

使用する増強剤や他の試薬の特性にかかわらず、これらの増強剤は長時間にわた って比較的一定で高速度の発光をもたらすので、本発明で用いるための高出力の 好ましい最大準位の「ベンチマーク（ｂｅｎｃｈｍａｒｋ）Ｊとして利用しても よい。本発明において使用される他の増強剤としては、２−シアノ−６−ヒドキ ロンベンゾチアゾール、１−ブロモ−２−ナフトール、ｐ−フェニルフェノール およびＮ、　Ｎ、　Ｎ’　。

Ｎ゛−テトラメチルベンジジン等が例示される。好ましいペルオキシダーゼ酵素 は西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）である。

前記の化学発光反応は、当業者に既知の多くの適当な発光反応のうちの代表例と して挙げたに過ぎない。多くの他の既知の化学発光反応またはそれらの変形反応 は本発明において利用可能なものであって、簡単な実験によって検討することが できる。

発光の変化は、レコーダーを備えた常套の光電子増倍管ルミノメータ−を用いて 監視してもよい。簡単な定性的な試験の場合には、写真フィルムを利用するか、 または目視観測をおこなうのが適当である。この発明の別の利点は、発光強度が 比較的高いため、光子の出力を３０秒またはそれ以下の時間ごとに読み取れる携 帯型の電池式ルミノメータ−を用いてアッセイを監視できることである。

本発明によるアッセイ法は多くの異なった種類の試料水に利用できるものであっ て、処理済または未処理の下水、河川水、海水、貯水、水道水、工場廃水、サイ レージ（ｓｉｌａｇｅ）、家畜スラリー（ｃａｔｔｌｅ　５ｌｕｒｒｙ）および 酪農洗液（ｄａｉｒｙ　ｗａｓｈｉｎｇＳ）等のアッセイに適用できる。

本発明の別の態様においては、試料水中に存在することが知られているか、また は推定される特殊なまたは特定の種類の抗酸化剤の寄与を、該抗酸化剤の除去ま たは抽出の前後における抗酸化能を本発明によって測定して比較することによっ て決定することができる。

試料水中に含まれる蛋白質等の物質の抗酸化剤としての寄与は、該蛋白質の除去 前後の試料の抗酸化能を比較することによって決定してもよい。蛋白質の除去は 、当該分野で周知の方法、例えば、沈殿法または分子フィルターを用いる濾過法 （遠心分離処理を併用しても併用しなくてもよい）等によっておこなえばよい。

同様に、他の抗酸化剤の抗酸化剤としての寄与は、当該分野の既知の方法によっ てこれらの抗酸化剤を試料から除去することによって決定すればよい。例えば、 重金属類やアニオンもしくはカチオンはイオン交換濾過によって除去すればよ（ 、また、フェノール類は沸騰によって除去すればよい。本発明の別の応用例は、 河川や貯水等の汚染源の同定である。このような応用例については実施例２にお いて具体的に示す。実施例２においては、汚染地の上流にさかのぼりながら採取 した試料の抗酸化能を漸進的に測定することによって、汚染源を正確に同定した 。

上記アッセイ法によれば、一般的な濃度で存在する汚染物質を高感度で検出する ことができる。検出感度は試料中に存在する抗酸化剤の濃度によって左右される 。汚染物質の濃度が低い場合（例えば、河川水や水道水等の場合）、多量の試料 が必要となる。例えば河川水や水道水等の場合には、未処理下水よりも約２０〜 ５０倍量の試料が必要となる。高濃度に汚染した試料、例えば家畜スラリーやサ イレージ等の場合、試料は１００００倍〜２００００倍に希釈しなければならな い場合がある。発光信号をもたらす試薬の希釈に用いる蒸留水の代りに水道水を 用いるのが便利である。海水を試験する場合には、人造海水または塩水を対照反 応において使用することが重要である。

上記のアッセイ法は広範囲の汚染物質に対して高濃度で適用でき、例えば、次の 化合物が光出力準位に影響を及ぼすことが判明しているニレゾルシノール、カテ キン、カプトプリル、Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラメチルベンジジン、バニリン 酸、０−フェニレンジアミン、ｐ−フェニレンジアミン、塩化クロム、フエロン アン化カリウム、チオ硫酸ナトリウム、ジメチルスルホキシド、４−メトキンビ フェニル、カタラーゼ、ジピリダモル、フェノール、−一クロロフェノール、エ タノール、ジエチルチオカルバミン酸、ブチル化ヒドロキシトルエン、没食子酸 、Ｎ−２−メルカプトプロピオニルグリシン、還元グルタチオン、アルブミン、 ビリルビンおよびシスティン。

これらの化合物のうちのいずれもが、図２〜図５に示すグラフと類似の挙動によ って光出力に影響を及ぼすことが認められた。

上記の化合物のリストは決して網羅的なものではない。上記のリストから明らか なように、ポリフェノール類、置換アミン類およびスルフヒドリル基含有化合物 は全て、光出力に影響を及ぼす。これらの種類の化合物は、水中にしばしば含ま れる汚染物質の好適な例である。

抗酸化能の定量的な値を得るためには、測定されるパラメーターを標準値と比較 する。適当な標準物質は上記のリストから選択してもよいが、トロロックス（Ｔ ｒｏｌｏｘ）　（６−ヒドロキシ−２，５゜７，８−テトラメチルクロマン−２ −カルボン酸）または０−フェニレンジアミンが好ましい。

図１は、時間ゼロのときの反応開始の前に発光反応系に試料水を添加したときの 光強度（太線で表示する）が、試料水を添加しない対照発光反応の光強度（長点 線で表示する）に比べて大きく変化することを示す（光強度は時間に対してプロ ットしたものである）。図１において、符号ａ、　ｂ、　ｃおよびｄで示す間隔 は次の意義を有する・ ａ発光反応の開始時と発光準位が実質上一定になった時との時間間隔を示す。

ｂ試料試験反応と対照反応における、発光反応開始後の特定の時点での発光準位 の差を示す。

Ｃ：試験反応において観測された実質上一定の発光準位と対照反応における発光 準位との差を示す。

ｄ：光強度の低下を示すが、これは増強反応におけるＨＲＰ不活性等に起因する 自然減衰による。この光強度の低下は、１分間にわずかに２％、好ましくは１％ 、最も好ましくは０．６％に過ぎない。

あるいは、比較的一定な発光準位に回復するまでの時間間隔を測定する代わりに 、予め決められた準位、例えば、最初の準位または最終準位の１０〜７０％にな るまでの時間を測定してもよい。別の態様においては、試料添加時から所定の時 間が経過した後の回復発光準位を測定し、これを、試料添加時の発光準位と比較 する。

本発明の第１態様のさらに別の観点によれば、観測される発光準位のパターンを 利用することによって、抗酸化能に関する別の情報を得てもよい。従って、試料 の添加から実質上一定の第２の発光準位が観測されるまでの時間遅延の場合のよ うに、試料添加前の発光の初期準位と試料添加後の発光準位との差を利用しても よい。試料水を系に添加しない対照反応を同時に実施する場合には、対照準位と 試験準位を利用することもできる。

本発明によるアッセイ用の特に好ましいキットはＤＰＤ（例えばルミノールまた はイソルミノール）、増強剤（例えば、ヨードフェノール）、触媒（例えば、ペ ルオキシダーゼ）および抗酸化剤（例えば、トロロックスまたは０−フェニレン ジアミン）を含有する。キットにはさらに酸化体（例えば、過酸化水素）および 緩衝剤を含有させるのが好ましい。

本発明を以下の実施例によって説明する。

実施例で使用した「アメルライト（Ａｍｅｒｌｉｔｅ）Ｊはアメルシャム・イン ターナショナル社（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　ＰＬＣ） の登録商標である。

実施例１ 異なった試料水についての抗酸化能アッセイ法の利用「アメルライト」信号試薬 を使用説明書に従って調製し、該試薬を１０倍希釈（該試薬１００μｍを蒸留水 ９００μｍと混合して用いた（以下、信号試薬という）。

アメルライトＨＲＰ抗−ＴｇＧ接合体（ＨＲＰ源）６０μｍをアッセイ用蒸留水 ２０１１に添加した。信号試薬水溶液ｌｌ１ｌを、ルミノメータ−内で使用する キュベツト内に入れ、使用可能なＨＲＰ接合体２０μｌを添加し、これをルミノ メータ−内に２分間、または光子出力準位が実質上一定になるまで置いた。一定 の準位に達したならば、被験試料を添加し、この時点をゼロ時間とした。反応は 約８分間続行した。測定は、光電子増倍管を備えた卓上型ルミノメータ−を用い ておこなった。

下記の試料水を表示量添加した。試料９００μｌを添加し、これを蒸留水９００ μｍの代わりに使用した。

（ｉ）砂濾過前の下水（４０μｍ） （ｎ）砂濾過後の下水（４０μｍ） （ｆｆｉＸａ）化学的に処理された後の下水（４０μ１）（ｂ）緩慢な砂濾過後 の下水（４０μｍ）（ｃ）ロンドン市内の水道水の下水（４０μｍ）（ｔｖ　） 　（ａ）未処理下水（４０μｍ）（ｂ）　１　：　１００に希釈した未処理下水 （９００μ１）（ｃ）　１　：　１０００に希釈した未処理下水（９００μｍ） （ｄ）蒸留水（９００μｌ） 上記の試料（ｉ）〜（汁）を用いて得られた結果を図２〜図５にそれぞれ示す。

これらの図は、化学発光反応の光出力を縦軸（ｙ軸）にとり、時間を横軸（Ｘ軸 ）にとったグラフである。

これらの図から明らかなように、下水の希釈度が大きいほど、発光準位は、急激 に増大し、飲料水の発光準位に接近する。図５において、（ａ）は試料体積が４ ０μｌの場合であり、（ｂ）は試料体積が９００μｌの場合であるので、両者は 厳密には比較できないが、アッセイの感度は比較することができる。

上記の基礎的なアッセイ試験を海水、サイレージ、家畜スラリーおよび酪農洗液 についておこなった。最後の３種の試料はＢＯＤ値が非常に高いため、本発明に よって有意な結果を得るためには、希釈倍率を非常に高くしなければならなかっ た（１：１００００または１・２００００）。

この実施例は、湖水の汚染源を本発明によってつきとめる方法を例示する。この 実施例においては、携帯用ルミノメータ−を使用した。使用した試薬と使用量は 実施例１の場合と同様である。化学発光反応は、試料水を添加後、１分間おこな った。蒸留水を用いて得られた１分間の値から試料水を用いて得られた１分間の 値を差し引き、その差を、蒸留水の場合の１分間の準位の低下率（％）として表 示する。即ち、該低下率（％）Ｔ１は次式で表わされる：従って、Ｔ、値が小さ いほど汚染は少ないことになる。

試験は、バーミンガム市のエンジニャリング局の管轄下にあるヴエイル（Ｖａｌ ｅ）湖でおこなった。過去において、この湖では、これを支えていた野生生物の 衰退がみられた。本発明によってこの湖の水質を評価したところ、ＴＩは５７％ であった。野生生物が繁栄する類似の湖の水のＴＩは１１％であった。試料はヴ エイル湖に注ぐ川から採取した。試料を１：１０に希釈してＴ１をめたところ、 ７５％であった。この川には２つの小川が流れ込んでおり、両方の小川からも試 料を採取してＴ１をめたところ、一方は１０％よりも低（、他方は７０％であっ た。

汚染された小川には、市の地表下水道からの下水が流れ込んでいた。これらの小 川は地上水のみを含むものであるから、低いＴ、値を示すべきものであったが、 得られた値は全て８０〜１００％の間であった。地元の地区評議会の技師の協力 を得て、汚染された小川まで延びた下水道が配設された街路にある５個のマンホ ールのカバーを持ち上げ、該小川に注いでいる下水を採取して検査した。最初の ４つのマンホールから採取した試料のＴ１値はいずれも７０％よりも高かったが 、５番目のマンホールから採取した試料のＴ、値急に４０％以下に低下した。第 ４のマンホールと第５のマンホールとの間の流路を調べたところ、下水ではなく て、地上水のみを流すべき排水道にトイレットと下水だめを連結させた家屋が発 見された。

このように、本発明方法は、水質の評価と水の汚染源の位置探査を迅速におこな う方法として利用できる。欠陥の発見された排水道を修理したところ、ヴエイル 湖の野生生物は徐々に再出現するようになった。

数カ月後、ヴエイル湖に注ぎ込む川のＴ１を調べたところ、２５％であった。

湖の水際には非常に多くのガンが飛来したので、そこでのＴ１値は５０〜７０％ になった。このような局部的に高いＴ１値は、湖水に流出したガンの排泄物に起 因するものである。

この実施例においては、本発明方法によって河川を解剖学的に評価した事例につ いて説明する。「解剖学的評価」とは、河川に注ぎ込む支流やその他の可能な汚 染源との関連において河川の汚染の分布状態を評価することである。

アッセイの実施条件は前述の通りである、Ｔ、値は前述の方法によって算出し、 その値は以下においては括弧内に示す。

セヴアーンーレトント治水局（Ｓｅｖｅｒｎ　Ｔｒｅｎｔ　Ｗａｔｅｒ　Ａｕｔ ｈｏｒｉｔｙ）と協力して、エイヴオン用について調査した。エイヴオン用はコ ンヴエントリー市近くに源を発し、ウエルフオードーオンーエイヴオンにあるス トラトフオードーアボンーエイヴオンの南西約５マイルまで達する。図６は調査 したエイヴオン用の区域を示す模式的な地図である。

エイヴオン用は大きな工業都市であるラグビー市の近くを流れ、広々とした郊外 を通り、コンヴエントリー市と境を接する。試料は、国立農業センター（ＮＡＣ ）に近接したステア橋（４３）とクラウド橋（４０）で採取した。この地点で、 コンヴエントリー市を流れるソーヴ工用と合流する。この川の源の試料は／くギ ントン村（５７）で採取した。バギントン村は、処理した下水をソーヴ工用へ排 出しているフィンハム下水処理工場よりも用土に位置する。該下水処理場からの 排水に起因して、ストンレイ村（９７）での汚染がもたらされる。汚染されたソ ーヴ工用とエイヴオン用との合流点から約１／２マイル下流のアッシュダウン村 の汚染度は依然として高かった（９１）。

レミントンスパーとウォリック城の間に位置するサクソンミル橋とポートベロ橋 でのＴ１値はそれぞれ８４および７２であった。二の地点において、エイヴオン 用はリーム川（４６）と合流し、該合流点の近（の下流に位置するウォリック城 橋における値は３７であった。

エイヴオン用は都市の汚染の影響をさらに受けることなく、広々とした郊外を流 れるので、これらの結果は、フィンハムの汚染の自然酸化に起因するかも知れな い。

ウォリンク城（２５）の下流においては、ウォリック地区のロングブリッジ下水 処理場からの処理下水力慴１へ排出されるので、バーフォード橋での値は６３と なった。この値は約数マイル下流のハンブトンルーン橋においては５２に減少し た。

エイヴオン用はチャールコートパークを通るジーン川（６６）と合流する。この 地点でのジーン川は小さな下水プラントの下流にあり、その流れはエイヴオン用 の流れよりも小さい。エイヴオン用がストラトフォードーアボンーエイヴオンに 達する頃には、それ以上の汚染はなかつた（４６）。これよりわずかに下流にお いては、グランドユニオン運河がエイヴオン用を横切っており、該運河の水は汚 染されていなかった（２５）。

別の支流であるストウ用はクリフトンチャンバーズ（５５）において、汚染の一 般的な情況に変化をもたらすことはなく、エイヴオン用はウエルフオードーオン ーエイヴオンに達したときの値（４６）は、フィンハム汚染の上流の値に近くな った。

従って、本発明方法を利用することによって、河川源または水源のプロフィール を容易に得ることができ、これによって汚染源を容易に特定することが可能とな る。

実施例４ 抗酸化能アッセイと全有機炭素アッセイ（ＴＯＣ）との比較この比較は、本発明 のアッセイ法およびセヴアーンートレント試験所（バーミンガム試験所）の試験 法便覧に記載のＴＯＣに従って、セヴアーンートレント治水局によっておこなわ れた。

抗酸化能アッセイは、ＨＲＰ（２０μｍ）の添加による反応開始前に、試料水（ ２００μｍ）をアメルライト信号試薬（８００μＪ）に添加することによってお こなった。対照反応は、試料水の代わりに脱イオン水を用いることによっておこ なった。

試験反応と対照反応はいずれも２分間おこなった。試験反応と対照反応の場合の ２分後の発光準位の差を試料水の抗酸化能の指標とし、これを△２値として表示 する。

ウィンラップ川からいくつかの試料を所定時間にわたって採取した。個々の試料 のＴＯＣと抗酸化能については測定を２回おこなった。図７は、抗酸化能（△。

＝ｙ軸）とＴＯＣ（ｕ／１　炭素：Ｘ軸）との相関関係を示す。各々の点は２種 の試料の平均を示す。図７から明らかなように、２種の試験は良好な相関関係を 示しており、この相関関係は別の観点からの試験によって確認された。

時間　→　時間　１ 試料添加 フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

（７２）発明者　ホワイトヘッド、トーマス・パダーリンイギリス国つォリック シャー、シーヴイ−３２・６エイチビー、レミントン・スパー、ノーサンバーラ ンド・ロード７０番

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. １．試料水によって引き起こされる発光反応の変化を監視することを含む。試料 水の抗酸化能のアッセイ法。
2. ２．発光反応の開始によって、観測される発光準位が短時間に低下した後、実質 上一定の準位まで回復するように、該発光反応の開始前に試料水を添加する請求 項１記載の方法。
3. ３．反応の開始から予め設定された時間を経過した後、発光準位を測定し、次い で、試料水を添加しない場合の対照反応における発光準位を測定し、両者の差を 試料水の抗酸化能の指標とする請求項２記載の方法。
4. ４．反応の開始から実質上一定の発光準位が観測されるまでの時間のずれを測定 し、これを試料水の抗酸化能の指標とする請求項２記載の方法。
5. ５．試料水を漸進的発光反応系に添加する請求項１記載の方法。
6. ６．発光準位が実質上一定になる平坦域まで上昇するように発光反応をおこない 、次いで、発光準位の急落を引き起こすのに十分な量の試料水を添加した後、発 光準位を先の実質上一定の準位まで回復させる請求項５記載の方法。
7. ７．発光準位が実質上一定の準位の１０％以内に達した時に、試料を漸進的発光 反応系に添加する第５項記載の方法。
8. ８．試料を添加した時と予め決められた準位に回復した時の間の時間間隔を測定 する請求項６または７記載の方法。
9. ９．試料を添加した時からの所定の時間間隔における発光の回復準位を測定し、 これを試料添加時の発光準位と比較する請求項８記載の方法。
10. １０．試料添加時からの時間間隔後、回復準位を測定し、これを、試料無添加の 場合の対照反応についての同じ測定値と比較する請求項９記載の方法。
11. １１．特殊または特定の抗酸化剤の除去または抽出の前後において、請求項１か ら１０いずれかに記載の方法によって測定する抗酸化能を比較することによる、 試料中の抗酸化剤の寄与測定法。
12. １２．試料が下水、川水、海水、貯水、水道水または工場廃水である請求項１か ら１１いずれかに記載の方法。
13. １３．発光反応が酸素依存性の化学発光反応である請求項１から１２いずれかに 記載の方法。
14. １４．化学発光反応が増強化学発光反応である請求項１３記載の方法。
15. １５．化学発光反応が、ジヒドロフタルアジンジオン（ＤＰＤ）基質の反応を含 む請求項１３または１４記載の方法。
16. １６．増強剤がｐ−ヨードフェノールである請求項１４または１５記載の方法。
17. １７．試料によって引き起こされる漸進的発光反応の変化を監視することによる 試料水の抗酸化能のアッセイ用キットであって、発光性基質および標定用抗酸化 剤を含有するアッセイ用キット。
18. １８．基質がジヒドロフタルアジンジオン（ＤＰＤ）である請求項１７記載のキ ット。
19. １９．抗酸化剤がトロロックスまたはｏ−フェニレンジアミンである請求項１７ または１８記載のキット。
20. ２０．増強剤をさらに含有する請求項１８または１９記載のキット。
21. ２１．増強剤がｐ−ヨードフェノールである請求項２０記載のキット。
22. ２２．酸化体をさらに含有する請求項１７、１９、２０または２１記載のキット 。
23. ２３．ペルオキシダーゼをさらに含有する請求項２０、２１または２２記載のキ ット。
24. ２４．ペルオキシダーゼが共役または非共役の西洋ワサビペルオキシダーゼであ る請求項２３記載のキット。