JPH0220066B2 - - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は生物学的流体又は同様物中の種々の化
合物の分析に関するものであり、そしてより詳し
くはある種の新規なラベル付けされた分析物及び
そのようなラベル付けされた分析物を用いる分析
方法に関するものである。 種々の臨床目的、例えば投薬スケジユールの監
視(モニター)、ホルモン水準の監視、最近の食
物摂取又は生物有効性のその後の薬理学的動力
学、吸収、分解又は排泄の検査のためには、種々
の薬などの濃度をナノモルもしくはピコモル水準
で測定することが非常に有利である。周知の如
く、放射線免疫検定(試験)によりこの分析を実
施できる。分析を行なうためには、認容できるキ
ツト又はシステムは抗血清、標準もしくは既知の
濃度の測定しようとする化合物(すなわち分析
物)、測定しようとする化合物の放射線ラベル付
きの誘導体及び1種もしくはそれより多い緩衝剤
を含有していなければならない。抗血清は、例え
ば測定しようとする化合物に対応するハプテン−
蛋白質接合体(インミノジエン)を接種をして、
免疫にされている動物の採血により製造される。 周知の如く、放射線免疫試験は一般に、放射能
でラベル付けされた分析物とラベルの付いてない
分析物の間の、抗血清中の抗体上の部位の結合競
争を測定する。抗血清に既知量の試験しようとす
る分析物及び放射ラベル付きの類似体を加えるこ
とにより、結合又は遊離状分析物対分析物濃度に
ついての投薬量−応答曲線が設定される。この免
疫−目盛り定めを行なつた後に、未知の濃度を次
に検定するため標準投薬量−応答曲線と比較する
ことができる。この型の検定で重要なことは非放
射性分析物と効果的に競争する放射性分析物が存
在するということである。従つて、試験の最大の
精度、正確性、感度、特異性及び再現性を得るた
めには、精製された良く特性の決められている合
成放射性の分析物が必要である。 放射線免疫試験方法ではいくつかの欠陥が確認
されている。第一に遊離状の放射ラベル付き分析
物から抗体結合された放射ラベル付き分析物を物
理的に分離することが必要である。さらに、この
方法はどちらかといえば労力がかかると考えられ
ており、そして必要な装置にも同様に比較的費用
がかかり、均質に入手できず、しかも該試験を正
確に実施するためには高度に訓練された専門技術
者の使用を必要としている。同様に、放射性同位
元素ラベル付き分析物は比較的不安定であり費用
がかかり、しかも一般に使用されている放射性同
位元素ラベルに伴なう放射線露呈の危険性に起因
する増々厳しくなる排物廃棄問題を呈する。これ
らの欠点にもかかわらず、放射線免疫試験の使用
は相当増えている。 しかしながら、臨床研究での放射線免疫試験の
使用における最近の相当な成長は、ここに記され
ているような放射線免疫試験方法の欠点を克服す
る変法の開発に刺激を与えている。これらの欠点
を克服するために開発された処理方法は、放射性
同位元素ラベルの代りに酵素又は螢光ラベルを、
好適には物理的分離のための条件を省くようなラ
ベルの付いた分析物の結合された部分及び遊離状
部分の間の化学的差違を測定できるような条件と
組み合わせて、使用することを主として包含して
いる。後者の簡単さ及び有利な特徴を有する免疫
試験は、物理的分離を必要とする不均質免疫試験
と対照的に均質免疫試験と称されている。 従つて、抗体との複合化が生じるときにラベル
の酵素活性を減じられるような酵素でラベル付け
された分析物の使用に基いている均質な免疫試験
システムが開発された。それの濃度を測定しよう
とするラベルの付いていない分析物が、抗体と結
合している酵素でラベル付けされた分析物と置換
し、その結果酵素活性の増加を生じる。増加した
酵素活性(酵素活性の結果として独特の発色団を
最終的に生成する“基質”と称されているものを
用いて分光光度計により監視されている)を増加
した分析物濃度に対してプロツトすると、標準的
置換又は投与量−応答曲線が作成される。これら
を次に未知の分析物濃度の測定用に使用する。均
質酵素免疫試験分野では下記の米国特許が発行さ
れている:3817837;3852157;3875011;
3966556;3905871;4065354;4043872;
4040907;4039385;4046636;4067774;4191613
及び4171244。これらの特許では、分析物のラベ
ルは実質的に5000より大きい分子量を有する酵素
であると記されている。この技術の商業化は、分
析物が10-10Mより大きい分析物の流体濃度にお
いて比較的小さい分子寸法であるような用途にだ
け限られている。これらの制限は、大きいポリペ
プチド分析物から誘導された普通使用されている
酵素ラベルは抗分析物抗体との結合により抑制さ
れないという事実から生じる。また、感度制限は
酵素活性から生じる螢光計によるレポーター分子
のないこと及び例えば内因性酵素の如き低濃度の
血清障害の存在から生じる。さらに、酵素ラベル
は再現性のあるようにしかも満足のいく純度で製
造することが難かしい。 上記の均質酵素免疫試験技術の制限のために、
感度のより大きな螢光を用いる均質免疫試験の開
発に向かつて相当な努力が払われてきた。それら
は主として例えば免疫グロブリンの如き比較的大
きい寸法の分子又は例えばインシユリンの如きポ
リペプチドホルモンの検定に関している。下記の
米国特許がこの型の試験用に発行されている:
3998943;3996345;4174384;4161515;4208479
及び4160016。これらの特許のほとんどのラベル
は分析物又は抗体と結合している芳香族螢光分子
を包含している。螢光消光の程度が試料中の分析
物の量に関係するように、すべてが同様に抗体又
は他の螢光消光剤による種々の螢光消光方法を含
んでいる。これらの方法に基く検定は多分、満足
のいくように精製された螢光ラベル付き抗体又は
分析物又は関連の消光剤ラベルの付いた物質種の
製造の難かしさのために商業化されていなかつ
た。また、血清中のバツクグランド螢光並びに血
清の誘導する消光が生じるかもしれない。さら
に、該方法は酵素増幅されていないため、満足の
いく感度ということには問題があるかもしれな
い。 免疫試験の型に関して容易に分類できないよう
なこの分野のさらに他の米国特許には、
3935074;4130462;4160645及び4193983が包括さ
れる。米国特許4160645中に示されている方法は
ラベルとしての電子転移触媒の使用を包含してい
る。触媒(ラベル)は抗体との結合により脱活性
化される。 抗体を製造するために使用されるハプテン接合
物の製造に関するその他の米国特許には、
3884898;3843696;4045420;3888866;
3917582;4025501;4043989;4058511;
4069105;4123431及び4186081が包括される。こ
れらの特許の全ては分析物誘導体及び対応するポ
リペプチド接合物に関しており、ここでポリペプ
チドは抗原性でありそして5000〜106の範囲内の
分子量を有する。例えばアルブミン及びグロブリ
ンの如き蛋白質が特に示されている。 また、均質酵素免疫試験用の予備処理方法も提
唱されている。この分野の米国特許には、
3856469;4056608及び4121975が含まれている。 反応物でラベル付けされた螢光免疫試験として
記されている他の型の方法は、螢光性生成物が酵
素で加水分解されているときには該生成物が放出
されるように設定されている螢光でラベル付けさ
れた分析物の使用を包含している。しかしながら
分子の分析物部分に対する抗体が酵素の加水分解
を抑制する。従つて、質量作用の法則により、置
換された螢光ラベル付き分析物の酵素的加水分解
のために増加した分析物の存在下では螢光は強化
される。例えば、ラベル付き分析物はβ−ガラク
トシル−ウンベリフエロン−シソマイシンであ
る。酵素β−ガラクトシダーゼはウンベリフエロ
ン部分から糖を分裂させ、そこでこれは螢光を発
し得ることとなる。この方法を記している刊行物
には、J.F.Burd、R.C.Wong、J.E.Feeney、R.J.
Carrico及びR.C.Boguolaski、Clin.Chem.23、
1402(1977);Burd、Carrico、M.C.Fetter等、
Anal.Biochem.、77、56(1977)及びF.Kohen、
Z.Hollander及びBoguslaski、Jour.of Steroid
Biochem.11、161(1979)が包括される。 さらに別の型の均質非同位元素免疫試験は米国
特許4213893中に開示されており、それは助因子
でラベル付けされた分析物を使用する。これは分
析物をNAD(すなわちニコチンアミド−6(2−
アミノエチルアミノ)−プリンジヌクレオチド)
の誘導体と結合させることによる分析物のラベル
付けを包含している。ラベル付けされた助因子は
分析物としてのエストリオールの環化反応におい
てデヒドロゲナーゼ(例えばアルコールデヒドロ
ゲナーゼ、マレートデヒドロゲナーゼ、すなわち
ADH、MDH)との反応性を保有している。最
終的に、これらの反応で生成したNADPHを螢
光計により監視し、そしてそれが環化速度の尺度
となる。NADPHはエストリオール抗体存在下
ではラベル付けされた助因子の複合体化により還
元する。従つて、環化速度はエストリオールの量
と直接関連があり、そしてエストリオール量の増
加につれて直線的に増加することが見出されてい
る。これはF.Kohen、Z.Hollander、F.Yeager、
R.J.Carrico及びR.C.Boguolaski、67〜79頁、
“Enzyme−labeled Immunoassay of
Hormones and Drugs”、編集S.B.Pal、Walter
de Gruiter、ベルリン及びニユーヨークによる
1978年の刊行物中に記されている。同様なシステ
ムは環化用酵素として乳酸デヒドロゲナーゼ及び
ジアホラーゼを用いるビオチン及び2,4−ジニ
トロフルオロベンゼン分析物に関して記されてい
る(R.J.Carrico、J.E.Christner、R.C.
Boguolaski及びK.K.Young、Anal.Biochem.72、
271(1967))。その方法は体液に共通の内因性助因
子及び減成用酵素により妨害を受けることが指摘
されている(M.J.O′Sullivan、J.W.Bridges及び
V.Mark、Annals of Clinical Biochemistry、
19、221(1977))。 さらに別の型の免疫試験技術はラベルとして酵
素調節剤、すなわち酵素阻害剤又はアロステリツ
ク奏効体を使用する。多数の酵素調節剤がそれら
の個別酵素と共に米国特許4134792中に挙げられ
ている。個々の抗体が酵素調節剤でラベル付けさ
れた分析物と結合するときには、酵素調節剤は培
養混合物中の酵素の活性をもはや阻害できないか
又はその他の影響を与えることができない。従つ
て、遊離状分析物による酵素調整剤ラベル付けさ
れた分析物の置換は酵素調節剤の阻害又はアロス
テリツク効果を回復させる。 ケミカル ラバー カンパニーにより1980年に
発行されたEdward T.Maggioにより編集されて
いる“Enzyme Immunoassay”という題の最近
の論文では、105〜134頁の“Principles of
Homogeneous Enzyme−Immunoassay”とい
う題の章は、ヒト免疫グロブリンG.用の酵素ラ
ベルとしてのリボヌクレアーゼAの使用を言及し
ている。詳細事項は与えられないが、著者は、リ
ボヌクレアーゼAは蛋白質均質酵素免疫試験にお
いてラベルとして使用する可能性を有すると結論
付けている。しかしながら、著者はまた、残念な
ことにリボヌクレアーゼAの偏在性が血清試験中
の内因性酵素からの重大な干渉の可能性を有しそ
して工程の実用性を限定していることも記してい
る。 さらに、リボヌクレアーゼの構造及び性質の研
究が相当行なわれている。例えばリボヌクレアー
ゼの触媒活性を監視するためにこれまでに多くの
有機化合物が使用されてきている。一般的に称さ
れているそのような有機化合物又は基質は、天然
基質により表わされるものと同一もしくは同様な
構造的拘束を示すリボ核酸自身、環式りん酸塩ジ
エステル及びモノリボヌクレオチド化合物を包括
している。 リボヌクレアーゼ活性を動力学的に監視するた
めにはさらに他の化合物も使用されている。その
ような化合物には、1−ナフトール、5−ヒドロ
キシナフトール及び1−4メトキシフエノールの
3′−ウリジル酸ホスホジエステルが含まれる、H.
Rubsmen、R.Khandler及びH.Witzel(Hoppe−
SaylerのZ.Physiol.Chem.355、687(1974))。しか
しながら、加水分解生成物は紫外線範囲内で直接
監視され、これはノナモル又はピコモル範囲での
分析に対して十分感受性でなく、そして臨床試料
に由来する干渉が起きるかもしれない。さらに、
これらの基質の製造は長いクロマトグラフイ工程
を含む多数の段階を必要とするため製造が困難で
ある。 また、リボヌクレアーゼのポリペプチド断片へ
の分裂も研究されている。例えば牛の膵臓のリボ
ヌクレアーゼ(リボヌクレアーゼA)に対するバ
クテリア性プロテアーゼであるスブチリシンの活
性が知られている。短かい20残基ポリペプチド及
び長い104残基ポリペプチドがリボヌクレアーゼ
Aの20番目のペプチド結合(アミノ末端から数え
て)における分裂の結果として生じることが見出
されている。前者はS−ペプチドと称されてお
り、一方後者はS−蛋白質と称されている(F.
M.Richards、Proc.Nat′L.Acad.Sci.U.S.44、162
(1958);F.M.Richard及びP.J.Vithayahil、J.
Biol.Chem.234、1459(1959))。この2種のポリ
ペプチドが容易に結合して非共有複合体(K=
10-8M)を形成し、それは種々の基質例えばRNA
又はシチジン2′,3′−りん酸ジエステルに対して
元の酵素であるリボヌクレアーゼAと同じ触媒活
性を保有することも同様に知られている。しかし
ながら、わかつている限りでは、この知識は免疫
試験技術の開発においては利用されていない。 均質免疫検定の分野に於けるちかごろの活動が
かなりあるということにもかかわらず、現在使用
されている技術の種々の欠点を克服できる別の開
発に対しての要望が残つている。このことは多
分、明らかに広い可能性があるにもかかわらず非
同位元素免疫検定技術が比較的商業的使用に制限
されていることから明白であろう。従つて、それ
らの良く認識された欠点にもかかわらず、単に満
足のいく代りの技術が商業的に入手できないため
に、放射線免疫試験技術が広く用いられ続けてい
る。 従つて、本発明の一目的は広範囲の分析物に広
く適用できる均質免疫試験技術を提供することで
ある。関連するもつと特定の目的は、比較的小さ
い分子量の分析物分子を用いる使用だけに限らな
い均質免疫試験技術を提供することである。 別の目的は比較的高分子量のラベルの使用を必
要としない均質免疫試験方法の提供である。関連
目的は、容易に製造でき、容易に精製されそして
比較的安定であるラベル付けされた分析物を提供
することである。 本発明の他の目的は、分光光度計又は螢光計検
出方式において、希望によりいずれの方式にも共
通する基質を用いて、操作できる均質免疫試験方
法を提供することである。 本発明のさらに別の目的は、優れた感度を得る
ことのできる均質免疫試験方法を提供することで
ある。関連するさらに特定の目的は、基質の触媒
による転換により増幅される螢光計検出方式を用
いる検定を包含している。 さらに別の目的は、商業的に入手できる自動的
分析器、例えば“遠心急速分析器”と一般に称さ
れているもの、の中で使用するのに容易に適して
いる均質免疫試験方法の提供である。 本発明の他の目的は、自動的データ類別に容易
に適応可能な均質免疫試験技術を提供することで
ある。関連するさらに特定の目的は、自動的デー
タ類別用の満足のいく投薬量応答曲線が得られる
ような免疫試験技術を提供することである。 本発明の他の目的はその方法が例えば起り得る
妨害などの如き問題を最少限にするのに充分なほ
ど柔軟性であるような均質免疫試験技術の提供で
ある。 本発明の他の目的及び利点は下記の詳細な説明
及び図面から明白となるであろう。 本発明は種々変更、別の形態にすることができ
るが、ここでは好適態様を詳細に記載する。しか
しながら、本発明を開示されている特定形に限定
しようとするものではないことは理解すべきであ
る。反対に、特許請求の範囲に記されている如き
本発明の精神及び範囲内にはいる全ての改変形を
包括しようと意図するものである。例えば、本発
明のラベル付けされた分析物は主として均質免疫
試験技術と関連して記されているが、本発明は抗
体結合された及び遊離状のポリペプチドでラベル
付けされた分析物の部分を分光光度計又は螢光計
による測定の前に分離するような不均質免疫試験
における使用にも同様に適用できることを認識す
べきである。 一般に、本発明は一方が分析物用のラベルとし
て作用しそして他方が混合物中に存在しているよ
うなポリペプチド対を使用することにより感度の
高い免疫試験方法が提供できるという発見に基い
ている。これのポリペプチドパートナーと組み合
わされたときにラベル付けされた分析物は、特定
の発色団又は螢光団基質に対する触媒活性を有す
る複合体を生成する。さらにそして重要なこと
に、そのようなラベル付けされた分析物の触媒活
性は、分析物に対する抗体の存在下で大きく阻害
される。この阻害は、増加する濃度の分析物を混
合物に加えるときに除かれる。従つて、置換曲線
を作成でき、それは触媒活性又は触媒活性の函数
を分析物濃度に関係づけ、そしてこの参照用又は
標準曲線は未知の分析物濃度の測定を可能にす
る。 満足のいく感度の良い免疫試験方法の提供能力
は以下に記載されているように、適当なポリペプ
チド対、並びに分析物と抗体との反応及びラベル
付けされた分析物とそれのポリペプチドパートナ
ーとの反応の平衡定数を含むある種の媒介変数、
並びに抗体、ラベル付けされた分析物及びポリペ
プチドパートナーの相対的濃度の選択に依存して
いる。 検定案 多種の案が本発明に関連して使用できる。一般
に、本発明の均質免疫試験方法は、(a)媒体中で(1)
分析物を含有している試料、(2)ポリペプチドでラ
ベル付けされた分析物、(3)分析物に特異的な抗
体、(4)ラベル付けされた分析物のポリペプチドと
非共有結合できて触媒活性を有する複合体を形成
するポリペプチドパートナー、(5)及び複合体の触
媒活性によりレポーター分子に転化可能な基質を
一緒にし、(b)基質からレポーター分子への転化速
度又は転化程度を測定し、そして(c)該転化速度又
は転化程度を既知量の分析物を含有する媒体中で
得られたものと比較することからなつている。物
質の添加順序は希望により変化させることがで
き、そしてある場合には培養段階を供することが
望ましい。 試験は多種の商業的に入手できる装置のいずれ
かを使用することにより有利に実施できる。例え
ば、分光光度計技術を用いて分析を行なうために
は、ユニオン・カーバイド・コーポレーシヨン製
のCentrifi ChemR400及び500急速分析器を使用
することが適していると見出されている。一般
に、この型の分析器はNorman G.Anderson、
“Analytical Jechniques for Cell Jractions
XII、A Multiple−Cuvet Rotor for a New
Microanalytical System”、Analytical
Biochemistry、28、545〜562(1969)中に記され
ている。適当な螢光計装置も同様にして商業的に
入手できる。 例に挙げた急速分析器の使用の際には、一案で
は、濃度を測定しようとする分析物、抗体、及び
ポリペプチドでラベル付けされた分析物を含有し
ている試料を分析器の転移デイスクの試料井戸中
にピペツトで加え、ポリペプチドパートナー及び
基質を転移デイスクの試薬井戸中にピペツトで加
え、必要なら混合物を試料井戸中で培養し、そし
て転移デイスクを回転させながら例えば分光光度
計技術の如き適当な手段により基質からレポータ
ー分子への転移速度を監視することによりラベル
付けされた分析物錯体の触媒活性の回復を分析す
ることを包括している。 試薬の添加順序は通常臨界的でないことに注目
すべきである。従つて、希望により、遠心急速分
析器の案に関する添加順序は変更できる。例え
ば、パートナーポリペプチド及びラベル付けされ
た分析物の添加は相互転換でき、そしてこれは検
定感度を強化させることのできるラベル付けされ
た分析物の遅れた添加に相当する。これによりピ
ペツト効率を増加させることができ、その理由は
単独試薬成分でなく混合溶液をピペツトで加える
ことができるからである。この場合、3種のピペ
ツト操作が包含される:(1)分析物試料、(2)抗体及
びポリペプチドパートナー並びに(3)ラベル付けさ
れた分析物及び基質。従つて、前記の市販の急速
分析器を用いると、一つのサイクル中で上記の3
種の操作を実施するために充分な自動的ピペツタ
ーを利用できる。 使用するなら培養段階の時間は主として分析物
の性質に依存して変化するであろう。培養する
と、分析物濃度に関係する、抗体で結合された、
及び遊離状の、ラベル付けされた分析物の平衡又
は動力学的分布をもたらす。抗体との複合体化速
度が拡散支配であるために、例えば薬又は薬代謝
物の如き小さい分析物は短かい培養時間を必要と
するが、例えばポリペプチドホルモンの如き比較
的大きい分子量の分析物は実質的に比較的長い培
養時間を必要とする。従つて、培養時間は約1分
間から約24時間程度までに変化できる。さらに、
分析物、ラベル付けされた分析物及び抗体の培養
混合物が平衡に達することは必要ない。全ての培
養混合物に対する培養時間及び対応するレポータ
ー分子生成物の生成速度の測定値が一定に保たれ
ておりそして同一であるなら、運動論的(カイネ
テイツクな)免疫検定が可能である。運動論的検
定は分析用に必要な全時間を短縮させ、そして上
記のラベル付けされた分析物及びパートナーポリ
ペプチドの相互転化を可能にする。 生成物の出現速度、すなわちレポーター分子生
成速度は、分析物の性質に依存しての分光光度計
又は螢光計により監視できる。約10-9Mより大き
い濃度で存在している分析物に対しては分光光度
計による検出が好適であり、一方低濃度水準で存
在している分析物に関しては、螢光計方法の比較
的大きい固有感度のために螢光計による検出が好
適である。逆に、比較的長い時間が許容できる場
合には例えば35分以上の比較的長時間にわたつて
速度を監視することにより、10-9M以下の濃度の
分析物に対して分光光度計による検出を利用でき
る。 本発明の代表的な検定案に従うことによりそし
て増加する既知の分析物濃度を使用することによ
り、触媒活性(例えばレポーター分子の生成速
度)の標準的すなわち参照曲線、又は分析物濃度
に対する触媒活性の函数、を作成できる。この標
準的すなわち参照曲線を次に、標準的曲線を作成
するために使用されたものと同一の条件において
レポーター分子の生成速度を測定した後に未知の
分析物濃度を測定するために使用できる。 ラベル付けされた分析物、パートナーポリペプ
チド及び抗体が試料中に一緒に存在しているとき
には、ポリペプチドでラベル付けされた分析物は
抗体又はポリペプチドパートナーのいずれかと競
争して結合できる。ポリペプチドでラベル付けさ
れた分析物がそれのポリペプチドパートナーと結
合するときには触媒活性が与えられるが、ポリペ
プチドでラベル付けされた分析物が抗体と結合す
るときには触媒活性は阻害される(すなわち現わ
れないか又は与えられない)。該システムの平衡
反応のためにそして質量作用の法則により、分析
物は抗体と結合されているポリペプチドでラベル
付けされた分析物と置換し、そしてその結果、試
料中に、それのポリペプチドパートナーと結合可
能な未結合のラベル付けされた分析物が得られ
る。従つて、分析物の不存在下では、減じられた
触媒活性が現われる。しかしながら、分析物が試
料中に存在しているなら、増加した触媒活性が生
じそれは監視できる。ラベル付けされた分析物が
抗体と結合しているときには触媒活性は減じられ
るか又は抑制されるが分析物の存在下では回復す
るため、溶液の触媒活性は試料中に存在している
分析物の濃度に直接関連するであろう。 本発明の方法は基本的には6種の反応式の考察
を包含している。どんな免疫試験技術を用いる場
合もそうである様に該方法の基礎は、ラベル付け
された及びラベル付けされていない分析物に対す
る抗体の反応(又は平衡化)速度が一般に同一で
あることである。これらの2種の反応を以下に示
す: A+AbA・Ab (1) A−PP1+AbA−PP1・Ab (2) 〔式中、Aは分析物であり、Abは分析物に対し
て特異的な抗体又はレポーター蛋白質であり、
A・Abは分析物及び抗体の反応により生成した
複合体であり、A−PP1はポリペプチドでラベル
付けされた分析物であり、そしてA−PP1・Ab
はラベル付けされた分析物及び抗体の反応により
生成した複合体である〕。 明らかに、反応(1)及び(2)の速度が一般に同一で
ないなら、競争による結合は生じないであろう。 上記の如く、試料中の分析物の存在は抗体と結
合しているポリペプチドでラベル付けされた分析
物と置換し、その結果未結合のラベル付けされた
分析物は次にそれのポリペプチドパートナーと結
合できる。後者の反応を以下に記す: A−PP1+PP2A−PP1・PP2 (3) 〔式中、A−PP1は前記の如きラベル付けされた
分析物であり、PP2はポリペプチドパートナーで
あり、そしてA−PP1・PP2は非共有触媒複合体
である〕。 非共有触媒複合体は、以下に記されている如
き、基質からレポーター分子への転化に触媒作用
を与える: SA・PP1・PP2 ―――――――――→ P (4) 〔式中、Sは基質であり、そしてPはSから触媒
により誘導されたレポーター分子である〕。 概念的に、考慮すべき他の二反応を以下に記
す: A−PP1・Ab+PP2A−PP1・Ab・PP2 (5) SA・PP1・Ab・PP2 ――――――――――――→ P (6) 〔式中、A−PP1・Abは結合されたラベル付け
された分析物であり、PP2はポリペプチドパート
ナーであり、A−PP1・Ab・PP2はラベル付けさ
れた分析物、抗体及びポリペプチドパートナーの
反応により生成した理論的な三元複合体であり、
Sは基質であり、そしてPはレポーター分子であ
る〕。 満足のいく感度を与えるためには、反応(5)にお
ける三元複合体の生成を最少にするか、又は反応
(6)に従つて三元複合体が基質を生成物に相当程度
まで触媒により転化させてはならない。換言する
と、いずれかの量の三元複合体が反応(5)で生成す
ると、相当量のレポーター分子Pが反応(6)により
生成し、反応(4)で生成したPの量は存在する分析
物の種々の量に適切に関連しないであろう。 これらの6種の反応の効果の考察においては、
抗体、ポリペプチドパートナー及びラベル付けさ
れた分析物の濃度は特定の試験では、基質からの
レポーター分子への転化において異なる量の分析
物が反映されるように選択すべきである。反応(1)
〜(3)に対する平衡定数も考慮にいれるべきであ
る。 特定の試験を計画する指針として望ましい関係
は下記の不等式により説明され、それはある種の
簡単にするための仮定を加えてある式の数学的分
析から誘導される: K3〔Ab〕/K1〔PP2〕〔A−PP1〕+K3 〔式中、K1及びK3は反応(1)及び(3)に対する平衡
定数であり、〔Ab〕は抗体の濃度であり、〔PP2〕
はポリペプチドパートナーの濃度であり、そして
〔A−PP1〕はラベル付けされた分析物の濃度で
ある〕。 この数学的分析は、K1及びK2〔反応(2)に対する
平衡定数)は同一であり、そして反応(5)及び(6)は
全く進行しないと仮定している。 K3〔Ab〕/K1という表現に関しては、〔PP2〕
より小さい1の係数よりはるかに小さい全体値
は、抗体との結合がほとんど生じないという結果
のために、分析物濃度の変化量に関してほんの最
少の応答しか与えない。換言すると、反応(3)で生
成した触媒種は分析物濃度とは独立して生成し、
その結果よくても分析物濃度にかかわりなく存在
する分析物の変化量を区別することは難かしいで
あろう。これは、反応(2)の生成物は最少量しか生
成しないからであろう。一方、抗体の濃度が高す
ぎるか又は平衡定数が上記の表現の全体値が
〔PP2〕の1000倍過剰量となるようなものである
なら、反応(3)における触媒活性種は、変化する分
析物濃度に応答するのに満足のいく量では生成さ
れないであろう。従つて、表現K3〔Ab〕/K1が
〔PP2〕の約2〜100倍、好適には約5〜25倍、で
あるように試験を計画することが一般に望まし
い。 さらに、ラベル付けされた分析物とそれのポリ
ペプチドパートナーとの反応、すなわち反応(3)、
はそれの抗体との反応、すなわち反応(2)と比べて
あまりに大程度まで進められるであろうために、
PP2の濃度が表現K3〔Ab〕/K1に関して高すぎ
るときには感度はほとんどなくなるであろう。そ
の結果、この場合も分析物濃度の変化量は満足の
いくように区別できないであろう。ポリペプチド
パートナーの濃度が表現K3〔Ab〕/K1に関して
低すぎるなら、逆の状況が起きる。分析物濃度に
関係なく、反応(3)において不適当な量の生成物が
生じるであろう。従つて、ポリペプチドパートナ
ーの濃度を、表現K3〔Ab〕/K1の値より約2〜
100倍低い、好適には約5〜25倍低い、範囲内に
保つことが一般に望ましい。 同様に、ラベル付けされた分析物の濃度及び
K3に関しては、ラベル付けされた分析物の濃度
が予期される分析物濃度のものの約10〜100倍以
内であるべきである。 本発明に従う検定の計画は一般に、典型的な免
疫試験の計画に含まれるものと同様である。本発
明に従う試験の計画例として記すと、準備出発点
は(1)包含される分析物用の適当な抗血清又は抗
体、(2)ラベル付けされた分析物A−PP1及び(3)ポ
リペプチドパートナーPP2の入手である。 A−PP1の濃度を最初に、予測される分析物濃
度のものと一般に同一に定める。次に、PP2の濃
度をK3と同一もしくはそれよりわずかに高く設
定する。ほとんどの場合、ラベル付けされたS−
ペプチド及びS−蛋白質からなるポリペプチド対
に対してはこれは約10-8Mであろう。基質Sの量
は、検出用に分光光度計方式を用いるなら毎分少
なくとも約10ミリ吸収単位の線状速度を与えるの
に充分なほど高く選択すべきである。 次に、適当にラベル付けされた分析物及び上記
で測定されたPP2濃度を用いて抗体希釈に対する
抑制率を測定して、抗体に関する一般的滴定曲線
を作成する。典型的には、抗体の濃度は約50%
(±20もしくは30%)の抑制率を与えるように選
択されるが、10%程度の低い抑制率も使用でき
る。 分析物に対する予測濃度範囲を模する標準的濃
度の分析物を製造し、そして次にあらかじめ定め
られている媒介変数と共に使用して、参照用置換
曲線を与える。この曲線は、予測濃度範囲にわた
つて適当な感度が与えられているかどうかを決め
るため試験されなければならない。 濃度範囲の比較的高い部分において比較的大き
い感度を希望するなら、これは一般に、抗体濃度
を増すことにより与えられる。以上で指針として
記されている定性的不等式を用いてどんな増加選
択量でも決めるべきである。 濃度範囲の比較的低い部分において比較的高い
感度を希望するときには、抗体濃度の減少は役立
つべきである。さらに、そして再び指針としての
定性的不等式を用いると、PP2及びラベル付けさ
れた分析物の濃度を減少させることも有用であ
る。 希望するなら、分析物(及びラベル付けされた
分析物)に対する抗体の結合及び/又はポリペプ
チドパートナーに対するラベル付けされた分析物
の非共有結合を増加もしくは減少させるように平
衡定数K1、K2及びK3を改変させることにより、
さらに細かい調整が得られる。本発明により加え
られる別の媒介変数、すなわちPP2の濃度及びA
−PP1及びPP2の反応は別の追加手段、多分全部
に対してではないかもしれないが、本発明の多用
性に寄与する細かい調整のための追加手段を、先
行の免疫検定技術の多くを越えるものとして与え
るものである。 ここで論議されている媒介変数に適切に注目す
ることにより、特定の試験が分析物濃度の変化量
に対して希望する感度を確実に得ることができ
る。 分析物 本発明の免疫試験方法は、多種の分析物の量的
存在量を測定する際に利用出来る。本発明の方法
により測定するために適している可能な分析物に
は一般に、水性媒体中に少なくとも約10-12Mの
濃度水準で存在しているか又はその中に抽出可能
である複雑な有機分子が包含される。螢光性レポ
ーター分子の存在する実際的検出限度及び抗分析
物抗体どん欲さ即ち結合力定数から濃度限界が生
じる。 実際に、本発明は今までの免疫試験を利用でき
た分析物に対して使用できる。さらに、概念的に
は、本発明はそれに対して特定のレセプターもし
くは結合用蛋白質が入手できるような分析物の濃
度を測定するために使用できる。そのようなレセ
プター又は結合用蛋白質を得ることは、例えば約
100以下の如き極端に低い分子量の分析物を用い
ると非常に難かしくなりはじめる。一方、例えば
106の如き比較的大きい分子量の分析物を用いる
と、本発明に従う分析物のラベル付けの際には触
媒活性の満足のいく抑制が確実に与えられるよう
に注意を払うべきである。 本発明の方法を利用できしかもそれ用の特定の
レセプター又は結合用蛋白質が入手できるような
分析物には例えば、薬及び薬代謝物、鎮静剤、麻
酔物、ステロイド、ビタミン、ポリペプチドホル
モンを含むホルモン、抗原を伴なう腫瘍、免疫グ
ロブリン、酵素、工業的汚染物質、農薬及びそれ
らの代謝物、食品添加物、除草剤及びそれらの代
謝物、香味剤及び食品有毒物が包括される。より
詳しくは、本発明の免疫試験方法はそれぞれの濃
度の下記の分析物の全範囲を試験するために使用
できる;約10-6M〜約10-8Mの濃度範囲(ヒト血
清中)、のジランチン、カンナビノイド、ゲンタ
マイシン、トブラマイシン、メトトレキセート、
ジジトキシン、チロキシン、テストステロン、コ
ルチソル及び免疫グロブリン;約10-8M〜約
10-9Mの濃度範囲(ヒト血清中)のトリヨードチ
ロニン、ジゴキシン、葉酸、アンジオテンシン
、プロゲステロン及びプロスタグランジン
F2;約10-9M〜約10-10Mの濃度範囲(ヒト血清
中)のエストラジオール、ビタミンB12及び成長
ホルモン;約10-10M〜約10-11Mの濃度範囲(ヒ
ト血清中)のインシユリン、パラチロイドホルモ
ン、チロイド刺激ホルモン、カルシトニン、ガス
トリン、黄体ホルモン、卵胞刺激ホルモン、グル
カゴン、ヒト絨毛膜ゴナドトロピン、及びアルド
ステロン;並びに約10-11M〜約10-12Mの濃度
(ヒト血清中)の胎生期癌抗原。 現在では、上記の分析物の大部分は不均質工程
を用いる臨床的放射線免疫試験により一般に測定
されている。本発明の免疫試験方法は前記の分析
物の全範囲を、費用がかかり、有害なそして不安
定な放射性核種ラベルの使用を必要とせずに検定
することが出来る可能性を有する。複雑なガンマ
又はシンチレーシヨン計数器の使用も同様に省略
できる。 ポリペプチドパートナー 適切なポリペプチド対は下記の機能的特徴に合
致しなければならない:(1)少なくとも一員は分析
物又は分析物類似体と共有結合できてポリペプチ
ドでラベル付けされた分析物を形成しなければな
らない、(2)ラベル付けされた分析物は抗体につき
分析物と競争するものでなければならない、(3)ラ
ベル付けされた分析物は、ポリペプチドパートナ
ーと組み合わされたときに、基質をレポーター分
子に適当な検出可能量で転化させるのに充分な触
媒活性を与える、及び(4)均質免疫試験用には、ラ
ベル付けされた分析物とそれのポリペプチドパー
トナーとの組み合わせ物により付与される触媒活
性の回復がラベル付けされた分析物の抗体との複
合体化により阻害される。 概念的には、上記の条件(3)に記されている組み
合わせ現象には酵素性蛋白質内の複数の鎖内相互
作用が伴なわれ、それは安定な三次元構造及び特
別な活性場所の生成をもたらす。大部分非共有性
であるそのような複数の鎖内相互作用は、好適に
は骨組のペプチド鎖に沿つての共有結合の不存在
下においてすら活性場所の再構成を可能にするの
に充分な一体化結合強度を有するものである。 本発明の一面に従う適当なポリペプチド対は、
種々の酵素を分裂させて2個の部分を与えること
により得られる。例えば、ブドウ球菌ヌクレアー
ゼの酵素による分裂並びにウシ、ネズミ、ヒトコ
ブラクダ及びカンガルーの膵臓リボヌクレアーゼ
の例えばスブチリシン、ペプシン及びカルボキシ
ペプチダーゼの如き種々の酵素を用いる酵素によ
る分裂により生成物が生成される。 一方、大腸菌(Escherichia coli)からのZ−
削除突然変異体菌株からのM15蛋白質の場合の如
く、適当なポリペプチド対の一方のパートナーは
突然変異体細菌株から遺伝学的に得られる。この
蛋白質はβ−ガラクトシダーゼ(CB2と称されて
いる)の小さい熱による又は臭化シアン発生部分
の存在下でβ−ガラクトシダーゼ活性を回復す
る。この現象は試験管内補足と称される。 (ウシの)リボヌクレアーゼAのスチリシン誘
導分裂から誘導されたポリペプチド対はS−ペプ
チドすなわち20アミノ酸部分、及びそれによりさ
らに複雑な104アミノ酸残基からなるS−蛋白質
からなつている。これらの部分は、リボヌクレア
ーゼのアミノ末端から数えて20番目のペプチド結
合のところのリボヌクレアーゼAの分裂から生じ
る。S−ペプチドは下記の構造を有する(F.M.
Richards及びH.M.Wyckoff、The Enzymes、
Boyer、P.D.編、3版、4巻、647〜806頁、
Academic Pressロンドン及びニユーヨーク
市): 【表】 S−ペプチド1−20、 同様に周知であるS−蛋白質は下記の構造を有
する: 【表】 S−蛋白質(21−124)。 上記のS−ペプチド及びS−蛋白質の記載で
は、簡単な略語を使用した。 種間ハイブリツドも適しており、例えばPP1は
PP2用のものとは同一でない動物種からの酵素か
ら誘導される。例えば、ヒトコブラクダ、カンガ
ルー及びネズミから誘導されるS−ペプチドもS
−蛋白質、特にウシのS−蛋白質又はヒトコブラ
クダのS−蛋白質の存在下で触媒活性を有するこ
とが見出されている。(J.A.Lenstra、J.J.
Beintema、FEBS Letters、63 89 1976;G.W.
Welling、G.Groen、D.Gakel、W.Gaastra、及
びJ.J.Beintema、FEBS Letters、40 134
1974)。これらの種のポリアミノ酸を以下に示
す: ヒトコブラクダのS−ペプチド 【表】 カンガルーのS−ペプチド 【表】 ネズミの13残基 【表】 ネズミの17残基 H Gly Gln Ser Arg Gln Ser Ser Ala Asp
Lys Phe Lys Asp Gln His Met Asp OH 前記の文献中で論じられている如く、これらの
種からのリボヌクレアーゼから誘導されたS−ペ
プチド又はS−蛋白質が本発明に従う触媒性ポリ
ペプチド対の成分として使用できるようにするの
に充分な相似性が種の間に存在している。 さらに、前記の如く、スブチリシン以外の酵素
からのリボヌクレアーゼA分裂生成物をポリペプ
チド対源として使用できる。リボヌクレアーゼA
の連続的なペプシン及びカルボキシペプチダーゼ
処理が6個のアミノ酸だけ短縮されたポリペプチ
ド鎖を与えることは周知である(RNase 1−
118)。(M.C.Lin、J.Biol.Chem.245 6726、
1970)。このポリペプチドを元のRNaseの残基
111〜124に相当する合成テトラデカペプチドと組
み合わせたときには、本質的にRNaseの完全な
触媒活性が回復される。(M.C.Lin、B.Gutte、S.
Moore及びR.B.Merrifield、J.Biol.Chem.245、
5169、1970;M.C.Lin、B.Guth、D.G.Caldi、S.
Moore及びR.B.Merrifield、J.Biol.Chem.247、
4648、1972)。 また、上記の如く、リボヌクレアーゼA以外の
酵素は酵素により分裂してポリペプチド部分を与
え、それは非共有的に再び組み合わされると触媒
活性を再取得する。ブドウ球菌ヌクレアーゼがそ
のような酵素の一例である。このポリペプチド対
は、ヌクレアーゼT−P(6-48)と称されている42ア
ミノ酸ポリペプチド及びヌクレアーゼT−
P(49,50-149)と称されている100アミノ酸残基であ
る。(H.Jamiuchi及びC.B.Anfinsen、J.Biol.
Chem.244、3864、1969)。 適当なポリペプチド対を得るための別の方法は
突然変異体微生物によるものである。例えば、上
記の如く、大腸菌のZ−削除突然変異体は、酵素
β−ガラクトシダーゼのアミノ酸残基11〜41が欠
落しているM15蛋白質と命名される蛋白を生じ
る。K.E.Langley、M.R.Villarego、A.V.
Fowler、P.J.Zamenhof及びI.Zabin
Proceedings National Academy of Science
72 1254(1975)。M15蛋白質は、正常なβ−ガラ
クトシダーゼの臭化シアン誘導分裂から誘導され
た小さいポリペプチド部分(CB2と称されてい
る)と組み合わされたときには、本質的に完全な
β−ガラクトシダーゼ活性を回復する(K.E.
Langley及びI.Zabin Biochem.15 4866(1976);
S.Lin、M.Villarego、I.Zabin Biochem.
Biophys.Research Commun.40、249(1970)。ま
たD.V.Marinkovic、J.N.Marinkovic、
Biochem.J.155、209(1976)参照)。同様に、
7400の分子量を有するオートクレーブにかけられ
たβ−ガラクトシダーゼからの小さい部分も、
M15蛋白質と混合したときにはβ−ガラクトシダ
ーゼ活性の回復をもたらす(S.L.Morrson及びD.
Zipser J.Mol.Biol.50、359頁(1970)。他の大腸
菌突然変異体蛋白質も、正常酵素の化学的に誘導
されたポリペプチド部分の存在下でβ−ガラクト
シダーゼ活性の回復の同一現象を示す。例えば大
腸菌のlacZX90突然変異体は、CNBr24と称され
ている32個のアミノ酸ポリペプチドの存在下でβ
−ガラクトシダーゼ活性を回復する蛋白質を与え
る。後者はβ−ガラクトシダーゼの臭化シアン分
裂から得られる(J.V.Welply、W.Mandeclic、
A.V.Fowler、I.Zabin、Biochem.Biophys.Res.
Commum.93、223(1980)。 CB2及びM15蛋白質の再組み合わせ用の会合定
数は1−2×109M-1であると評価されること及
びCB2に対する抗体がM15蛋白質を用いる活性の
回復を抑制することに注目すべきである。F.
Celade、I.Zabin、Biochem.18、404(1979)。従
つて、この及び関連するポリペプチド対はここに
記されている免疫試験方法で使用しようとする目
的に特に適している候補である。 好適なポリペプチド対はリボヌクレアーゼAの
スチブリシン誘導分裂から誘導され、そしてS−
ペプチド及びS−蛋白質からなつている。S−ペ
プチド及びS−蛋白質の構造はこれまでに記され
ている。S−蛋白質では、残基26−84、40−95、
58−110及び65−72の間に、ジスルフイド結合が
存在しており、それらがポリペプチドの相当なコ
イル化を生じている。これらのジスルフイド結合
が分裂されるなら、触媒活性も同様に損失される
であろう。これらの結合は従つて元の酵素のもの
に相当するS−蛋白質に対する三次元構造を与え
るのを助けている。この構造は実際に、活性場所
の回復をもたらす会合するS−ペプチド用の鋳型
を提供する。 分裂した酵素は、非共有的に再び組み合わされ
ると、元の酵素の触媒活性の本質的に全てを望ま
しくは回復すべきである。最少でも、基質な検出
可能量のレポーター分子に、媒体又は他の非特定
媒体で誘導される方法の速度より実質的に大きい
速度で転化させて、希望する感度及び正確さを与
えるのに充分な活性が回復されなければならな
い。多分10又は5%以下の如き低い触媒回復率で
も満足である。また、解離用の平衡定数は一般に
少なくとも約105そして約1011M-1より小さいも
のであるべきである。S−ペプチド、S−蛋白ポ
リペプチド対の望ましい性質の一つは、該対がほ
とんどの分析物と、再び組み合わされた改質S−
ペプチド、S−蛋白質対の触媒活性を実質的に感
じることなく、結合する多種の結合部位にある。
対中の多くのリジン残基中のエプシロンアミノ基
は、分析物又は分析物類似体のS−ペプチド又は
S−蛋白質と都合よく共有カツプリングさせるた
めの多数の部位を与える。リジン残基はS−ペプ
チド中の位置1及び7にあり、そしてS−蛋白質
中の位置31,37,41,61,66,91,
98及び104にある。さらに、各ポリペプチド
における骨組に由来する単一アルフアーアミノ基
が分析物へのカツプリング用に利用できる。さら
に、これらのポリペプチドパートナーには、結合
用場所として利用できる下記の基が含まれてい
る:カルボキシル、グルタメート、アスパルテー
ト、ヒスチジン及びチロシン。 しかしながら、S−ペプチド又はS−蛋白質構
造を例えば分析物のラベル付けの如き目的用に改
変するときには、触媒回復に対する効果を考慮に
いれるべきである。例えばアミノ基を考えると、
S−ペプチドのエプシロン−アミノ基の全部又は
一部のグアニジノ化又はアセチル化は触媒活性の
回復を相当遅延させないはずである。さらに、S
−蛋白質のリシン残基41の保護は触媒活性の保有
に関して重大であろう。例えばグアニジノ、アセ
チル、トリフルオロアセチル、ジニトロフエニル
及び種々のポリアミノ酸鎖の如き基の、種々のリ
ジン残基に対する結合は、リジン41上のエプシロ
ン−アミノ基が改変されているとき以外は、S−
ペプチド、S−蛋白質再組み合わせ対の触媒活性
を相当遅らせるものでないはずである
(Richards及びWyckoffの前記引用文献、678
頁)。従つて、エプシロン−アミノリジン基の結
合による有用なラベル付けされた分析物の生成用
にS−蛋白質を使用することは、位置41におけ
るリジン基が未修飾のままであるなら、有効であ
るはずである。 S−ペプチドの位置2及び9におけるグルタメ
ート残基又は位置14におけるアスパルテート残
基でのメチルエステル生成は、触媒活性を相当保
有する生成物を与えるはずである。しかしなが
ら、全てのカルボキシル基の完全な誘導化は、そ
れが触媒活性を完全に減じるため、避けなければ
ならない。S−蛋白質では、位置53におけるア
スパルテート残基に相当する1個のカルボキシル
基の改変は多分触媒活性を減じないであろう。 S−ペプチドの位置12及びS−蛋白質の位置
119におけるヒスチジン基は触媒活性の保有に
関して臨界的であろう。これらのヒスチジン基
は、ここで論じようとしている天然基質(RNA)
又は種々の合成ヌクレオチド基質の加水分解によ
るりん酸エステル結合分裂を促進する求核種とし
て触媒位置内で良く関与していると信じられてい
る。ポリペプチド部分中のヒスチジン基の改変は
触媒活性の完全損失を生じるであろう。従つて、
アルキル化又はジアゾニウム塩反応によるヒスチ
ジン残基の改変は多分避けなければならない。 分析物との結合がポリペプチドラベル上の官能
基の一部の改変又は誘導化のための主な理由であ
るが、これは他の理由のためにも望ましいという
ことは認識すべきである。例えば、生成したラベ
ル付けされた分析物の負荷に影響を与えるためポ
リペプチドラベルを修飾することが有用であり得
る。従つて、一例として、S−ペプチドのエプシ
ロン−アミノ基の全て又は一部のグアニジノ化は
酸性のより少ないラベル化された分析物を与える
であろう。このことは検定感度を強めるための抗
体及びS−蛋白質の間の競争平衡を変化させる一
方法を提供する際の助けになる。 リボヌクレアーゼAの分裂から誘導されるS−
ペプチド、S−蛋白質ポリペプチド対以外のポリ
ペプチド対も、本発明で使用するために適してい
る。そのような対は望ましい接触活性を与えるよ
うな方法で再び組み合わせられるであろう。特
に、ある種のポリペプチドはS−蛋白質とそのよ
うに再組み合わせすることが見出されている。そ
のような対には例えば、S−ペプチドの残基1〜
13及び2〜13からなるポリペプチドが含まれる。
また、下記のポリアミノ酸がS−蛋白質用の有用
なポリペプチドパートナーであるはずである:1
又は2〜14;1又は2〜15;1又は2〜16;1又
は2〜17;1又は2〜18;1又は2〜19、及び1
又は2〜20(F.M.Finn及びK.Hotmann、
Accounts of Chem.Research、6、170(1973))。 さらに、ラベル付けされた分析物の生成用に使
用できる広い範囲の合成S−ペプチド類似体があ
る。そのような類似体はS−蛋白質の存在下で触
媒活性を示しそして分析物に対するカツプリング
用に適する官能基を与えるべきである。従つて、
文献に鑑みて、S−ペプチド沿いのある種の残基
が他のアミノ酸と置換でき、そしてS−蛋白質の
存在下で依然として望ましい触媒活性を与えるで
あろう。例えば、リジン又はオルニチン残基は位
置10においてアルギニンと置換できなくてはな
らない(A.Rochi、F.Marchiori、L.Maroder、
A.Fontana及びE.Scoffone、Gazz Chim.Ital.96、
1537、1966)。10−オルニチン置換されたペプチ
ドは位置4及び5において、これらの位置におけ
るアラニン残基の代りにセリン残基により置換さ
れていることもできるはずである。(L.Maroder、
A.Rochi、F.Marchiori、A.Fontana及びE.
Scoffone、J.Amer.Chem.Soc.91、3921、1961)。
同様に、チロシン残基は同じオルニチン置換され
たポリアミノ酸中で8位置におけるフエニルアラ
ニンと置換されていることもできるはずである。
(R.Rochi、L.Meroder、F.Marchiori、E.
Ferrarese、及びE.Scoffone、J.Amer.CHem.
Soc.90、5885、1968;F.Marchiori、R.Rochi、
L.Maroder、及びE.Scoffone、Gazz.Chim.
Ital.96、1549、1966)。 好適なポリペプチドパートナー(すなわちS−
ペプチド及びS−蛋白質)に関しては、等モル量
混合物の培養が、例えばリボ核酸(RNA)及び
シチジン2′,3′−りん酸ジエステルの如き種々の
物質に対する天然蛋白質であるリボヌクレアーゼ
Aの酵素活性の本質的に完全な回復をもたらすこ
とが見出されている。さらに、S−ペプチドでラ
ベル付けされた分析物とそれのポリペプチドパー
トナーであるS−蛋白質との再組み合わせから生
成したラベル付けされた分析物複合体が、基質で
あるモノヌクレオチド3′−ホスホジエステルに対
するS−ペプチド、S−蛋白質複合体の触媒活性
を回復することが見出されている。 ラベル付けされた分析物 機能的には、本発明で使用するために適するラ
ベル付けされた分析物は、ポリペプチドパートナ
ーに露呈されたときの触媒活性を与えるそれらの
能力により、そして結合時の触媒活性の随伴損失
を伴なう分析物に対して特定な抗体又は特定なレ
セプター蛋白質と組み合わされるそれらの能力に
より特徴づけられている。また、そのようなラベ
ル付けされた分析物が例えば製造及び使用時に遭
遇するような種々の反応条件下で種々の試薬に対
して良好な安定性を示し、そして容易に精製され
ることが望ましい。 化学的には、本発明のラベル付けされた分析物
は一般にポリペプチドパートナーの一方と化学的
に結合している分析物からなつている。ある場合
には、分析物もしくはポリペプチドパートナー又
は両者が結合を実施するために適している官能基
を含有している。分析物に対してより典型的な他
の状態では、1種以上の官能基を分子中に加える
ことにより類似体を生成することが望ましいか又
は必要である。実際に、ラベル付けされた分析物
の生成を促進するため又は望ましい触媒活性を確
実に保有させるためには、官能基が存在していて
もなお結合を実施する類似体を生成することが望
ましいか又は必須である。さらに、ある状況下で
は分析物とポリペプチドパートナーを空間的に分
離しまた結合させるための結合のための基を利用
することが適している。本発明で使用されるポリ
ペプチドラベル、例えばS−ペプチド、が酵素ラ
ベルより小さい分子である傾向がありその結果特
性の決定及び正確な構造決定が促進されるという
ことも注目すべきである。最後に、ある種の検定
では1個より多い分析物分子を単独のポリペプチ
ドラベル分子に結合させることが望ましいが、他
の試験では1個より多いポリペプチドラベル分子
を単独の分析物分子に結合させることが好まし
い。 一般に、本発明のポリペプチドでラベル付けさ
れた分析物は式 An−Xo−Zp−Yo−〔PP1〕p 〔式中、Aは分析物であり、 XはA及びZ又はYと結合している成分であ
り、Zは存在しているならX及びYと結合してい
る架橋基であり、 YはPP1及びZ又はXと結合している成分であ
り、 PP1はポリペプチドパートナーであり、 m、n及びpは1〜約8の整数であり、そして
oは0又は1〜約8の整数でありそれは通常の場
合nと同じ値を有する〕 により表わされる。 1個より多い分析物分子が単独のポリペプチド
分子と結合しているときには、ラベル付けされた
分析物は式 〔A−X−(Z)p−Y〕o−PP1 〔式中、A、X、Z、Y及びPP1は前の式中と同
じ意味を有し、oは0又は1であり、そしてnは
1より大きい整数である〕 により表わされる。一般に、nは約8より大きい
値を越えずそしてより一般的には3より大きくな
いであろう。 1個より多いポリペプチド分子が単独の分析物
分子と結合しているなら、式は A〔X−(Zp)−Y−PP1〕o 〔式中、A、X、Z、Y、PP1、n及びoはすぐ
前の式中に記されている意味を有する(すなわ
ち、1個より多い分析物分子が単独のポリペプチ
ド分子と結合している)〕 となる。 本発明のラベル付けされた分析物の製造におい
ては、m、n及びpのうちの最も小さい値が、分
析物及びラベルの両者の相当する構造決定物の破
壊を最少にするために、免疫反応性及び触媒活性
回復の両者の保持を一般的に与えている。一方、
免疫反応性又は触媒回復の抗体に基く抑制が強化
されるなら、比較的高い値が有利となり得る。最
適値は、包含される特定の試験に対して実験によ
り容易に決定できる。 多くの分析物は分子中の適当な位置に、結合可
能な1個以上の官能基を含有している。しかしな
がら、ある分析物に対しては、分析物分子に例え
ばアミノ、カルボキシル、ヒドロキシル及びチオ
ールの如き官能基を加えることが必要である。同
様に、ポリペプチドラベルは一般に、一例とし
て、部分Yを与える結合に適している多くの遊離
アミノ基を含んでいるであろう。従つて、S−ペ
プチドをラベルとして使用するときには、3個の
アミノ基が存在しており、そしてこれらのうちの
1個もしくは全てを、S−蛋白質の存在下で接触
活性の損失を伴なわずに結合に使用できる。しか
しながら、ある場合には、しばしば遭遇するカル
ボキシル、ヒドロキシル及びチオール官能基を包
含するような他のポリペプチド官能基を使用する
ことが有用である。例えば、そのような他の官能
基は、種々の反応平衡、例えばK2及びK3、が関
与している限りにおいては、望ましく使用されて
有利な結果が生じる。 分析物及びポリペプチドラベル用に使用される
官能基の性質に従つて好適であり、そして同一で
あつてもよい部分X及びYを以下に示す。 【表】 【表】 最後に示されている例では、ジアゾニウム塩
は、アミノ基と酸性亜硝酸ナトリウム又は他の適
当な試薬との反応及びその後の例えばチロシルな
どの如きヒドロキシルフエニル成分との反応によ
り生成できる。ヒドロキシル基は示されているパ
ラ位置及びオルト位置に置かれ、そして残りの結
合(パラ位置に示されている)は環上の他の位置
に置かれている。 基Zは結合基X及びYを架橋している。それは
全ての場合に必ずしも必要ではなく、その理由は
分析物及びポリペプチドラベル用の特定の官能基
はある場合には架橋基の介入の必要なしに適当に
一緒に結合できるからである。一般に、架橋基Z
は、存在しているときには、炭素数が1〜10のア
ルキレン基、炭素数が1〜約10のアルケニレン
基、炭素数が約4〜約10のシクロアルキレン基、
炭素数が約2〜約10のオキソアルキレン基及び炭
素数が6〜約10のアリーレン基である。 架橋基Zの機能は、それにより免疫反応性、触
媒活性の回復及び抗−分析物抗体による触媒活性
の抑制が最適にされるような他の構造的パラメー
ターを与えることである。従つて、架橋基は、官
能基的な意味では、分析物及びラベルを分離する
ための化学的に不活性な空間的腕を供する。さら
に、以下で論じられている如く、これは2官能性
試薬の使用時には製造を助ける。例えば、炭素数
が50の如き比較的長い鎖の架橋基の使用は最初の
二つの官能基条件を満たすが、ラベルが抗体から
はるかに遠ざけられているため第三の条件は満た
さない。一方、ある場合には極端に短かい鎖長の
架橋基は免疫反応性及び多分触媒活性の損失をも
たらすであろう。 本発明の一面に従うと、分析物及びポリペプチ
ドラベルは、分析物及びポリペプチドラベル分子
の両者と両立し得る反応性を有する官能基を含ん
でいるある種の二官能性分子を使用することによ
り、一緒に結合できる。多くのそのような二官能
性分子が知られており、そして適当な例にはグル
タルアルデヒド、ビスイソチオシアネート、ビス
イソシアネート、イソチオシアナト−イソシアネ
ート、ハロゲン−イソシアネート及びイソチオシ
アネート、トリメチルシリルで封鎖したヒドロキ
シイソシアネートなどが含まれる。特に有用な二
官能性分子は、米国特許4064151に示されている
方法に従つて製造される6−イソチオシアナト−
カプロイルクロライドである(H.K.
Kricheldorf、Angew.Chem.87、515(1975)も参
照せよ)。この化合物の酸塩化物基はイソチオシ
アナト基より反応性であり、そして好適には分析
物分子上のアミノ又はヒドロキシル官能基と反応
する。生成したイソチオシアナト誘導化された分
析物類似体を次にポリペプチドの遊離アミノ基と
反応させてポリペプチドでラベル付けされた分析
物を生成できる。このようにして生成されたラベ
ル付けされた分析物において、 Xは−O−C(=O)−又は−NH−C(=O)−
であり、 Zは−(CH2)5であり、そして Yは−NH−C(=S)−HN−である。 ラベル付けされた分析物を生成するための他の
一般的方法は、分析物又はポリペプチドラベル上
の残存官能基の活性化及びその後の生成した生成
物と他の成分との反応を包括している。一例とし
て、ポリペプチドラベル上のカルボキシル基はゲ
ンタマイシン分子上の官能基とより反応性である
誘導体に転化でき、そして生成した生成物を次に
ゲンタマイシンと縮合させてラベル付けされた分
析物を生成できる。一方、ジランチンにラベル付
けするためには、ジランチン分子に加えられてい
るカルボキシル基を誘導体化でき、そして生成し
た生成物を次にポリペプチドラベルと反応させ
る。誘導体化を実施するための適当な物質の例に
は、イソブチリルクロライド、N−ヒドロキシこ
はく酸イミド又は水溶性カルボジイミドが包括さ
れる。 種々の分析物のラベル付け案を以下に示す。 鎮痙剤 ジランチン、フエノバルビタール、プリミドン
及びエトサクシミドからなる鎮痙剤群用の好適な
ラベル付けされた分析物はバルビツール酸構造を
反映しており、そして以下に一般的に示されてい
る如く6又は5員環内に環式アミド又は環式ラク
タム官能基を含んでいる: 種々の分析物に対するR基を以下に示す: 【表】 【表】 特に、ジランチン用の好適なラベル付けされた
分析物は下記のものである: 〔ここで、XはN−CH2であり、Yは−CO−
NHであり、そしてZは(CH2)3である〕。 ある種の免疫試験では、ラベル付けされた分析
物中に遊離NH−基を保有することが有利であ
る。そのような場合、ジランチンの誘導体はラベ
ル付けされた分析物として使用できる。従つて、
例えば、そのようなラベル付けされた分析物は、
アミノ基をフエニル環にそれのニトロ化及び還元
により加え、6−イソチオシアナトカプロイルク
ロライドと反応させ、そして最後にジランチンイ
ソチオシアナト誘導体をポリペプチドラベルの遊
離アミノ基と反応させることにより供給される。
生成したラベル付けされた分析物を以下に示す: この場合、Xは−NH−CO−であり、Yは−
NH−CS−NH−であり、そしてZは−(CH2)5
−である。 チロキシン及びトリアイオドチロニン チロキシン用の好適なラベル付けされた分析物
を以下に示す: これは6−イソチオシアナトカプロイルクロラ
イドを使用することにより製造でき、そしてX、
Y及びZはこの二官能性試薬を用いてラベル付け
されたジランチン生成物に関して記されているも
のと同じである。 チロキシンでラベル付けされた分析物は、アミ
ノ基が例えばトリフルオロアセチルの如き容易に
除去される封鎖基により保護されているようなチ
ロキシンをS−ペプチド又は他のポリペプチドラ
ベルと縮合させることによつても直接得られる。
下記のチロキシンでラベル付けされた分析物が最
終的に得られる: この場合、架橋基はなく、そしてX及びYは−
CO−NHである。 トリヨードチロニンでラベル付けされた分析物
も同様にして製造できる。 リドケイン リドケインの免疫試験用に適しているラベル付
けされた分析物は、p−アミノリドケインと6−
イソチオシアナトカプロイルクロライドの反応及
びその後のポリペプチドラベルとの反応から製造
できる。生じた生成物の構造を以下に示す: テオフイリン テオフイリン並びにそれの異性体であるカフエ
イン及びテオブロミンは、それらの構造が似てい
るため並びに紅茶及びコーヒー中のカフエインの
存在のために、妨害問題が生じる。特定のテオフ
イリン抗体との反応性を確実にするために、テオ
フイリンでラベル付けされたポリペプチドは、5
及び7位置が置換されていないようなテオフイリ
ン中に存在しているメチル置換様式を保有すべき
である。テオフイリン、カフエイン及びテオブロ
ミンに対するの構造を以下に示す: 【式】 【式】 【式】 従つて、テオフイリンに対する位置1のメチル
基のところにおけるポリペプチドラベルの結合
は、適当なテオフイリンでラベル付けされたポリ
ペプチドを与えるはずである。これは位置5及び
7における区別された未置換窒素原子が、ラベル
付けされた分析物中に保持されるという事実から
生じる。この状況下で検定に使用される抗体はハ
プテンのテオフイリン基が位置5及び7に未置換
窒素原子を保有している免疫原からも誘導される
はずである。この構造を以下に示す: 同様に、3−メチル位置及び多分6位置におけ
るテオフイリンの誘導体も上記と同じ理由のため
に使用できる。 アンフエタミン アンフエタミンでラベル付けされた分析物は例
えば6−イソチオシアナトカプロイルクロライド
の如き二官能性カツプリング剤の使用により直接
誘導できる。生成した構造を以下に示す: 麻酔剤アルカロイド モルフイネ、ヘロイン及びコデインからなる群
の麻酔剤アルカロイドは以下に示されている如き
関連構造を有する: 【式】 【式】 【式】 適当なモルフイネ及びコデインでラベル付けさ
れたポリペプチドはモルフイネ又はコデインと二
官能性試薬との反応により供されるべきである。
例えば、モルフイネ又はコデインと6−イソチオ
シアナトカプロイルクロライドの反応は、生じる
遊離イソチオシアナト官能性によりポリペプチド
ラベルと結合可能な誘導体を与える。さらに、モ
ルフイネ及びコデインの誘導体はポリペプチドで
ラベル付けするための分析物類似体として適当に
使用できる。例えば、モルフイネ及びコデインは
p−アミノ安息香酸からのジアゾニウム塩と結合
でき、そして生成した生成物を次にポリペプチド
ラベルと縮合させる。同様に、この方法はヘロイ
ンは遊離ヒドロキシル基を有していないためにヘ
ロイン用にも提案される。 抗生物質アミノグルコシド 抗生物質であるアミノグルコシド、ゲンタマイ
シン、シソマイシン及びトブラマイシンにポリペ
プチドを、二官能性試薬の使用によりラベル付け
できる。ゲンタマイシン、シソマイシン及びトブ
ラマイシンは全て、例えば6−イソチオシアナト
カプロイルクロライドの如き二官能性試薬を用い
てポリペプチドラベルと直接カツプリングさせる
ための結合場所を与える多数の遊離アミノ基を有
している。ゲンタマイシンは、ポリペプチド上の
遊離カルボキシル基をN−ヒドロキシこはく酸イ
ミド又は水溶性カルボジイミドとの反応により活
性化しそして次にゲンタマイシンと縮合させてラ
ベル付けされた分析物を生成することによつても
ラベル付けされる。 心臓薬グリコシド 心臓薬グリコシドジゴキシン及びジジトキシン
用のラベル付けされた分析物は二官能性試薬の使
用により製造できる。ジゴキシン及びジジトキシ
ンの両者は多数の遊離ヒドロキシル基を有し、そ
れは二官能性試薬である6−イソチオシアナトカ
プロイルクロライドと反応すると、イソチオシア
ナト誘導体を与え、それはポリペプチドの遊離ア
ミノ基と反応してラベル付けされた分析物を生成
する。提唱される構造を以下に示す: コルチゾル ジゴキシン及びジジトキシンに関する上記の方
法をコルチゾルにも同様に適用出来るべきであ
る。コルチゾルの適当な構造を以下に示す: テストステロン ポリペプチドでラベル付けされたテストステロ
ンに提唱される組成物はコルチゾル用に示されて
いるのと同じ型の合成により得られる。この組成
物を以下に示す。 一方、活性化された6−カルボキシメチルオキ
シム誘導体はテストステロンをポリペプチドラベ
ルにカツプリングさせるために使用できる。 プロゲステロン プロゲステロンでラベル付けされた分析物は、
ポリペプチドラベルを用いて、プロゲステロンの
活性化された6−カルボキシルメチルオキシム誘
導体とポリペプチドとの反応により供されて下記
の組成を与える: ポリアミノ酸分析物 ラベル付けされたポリアミノ酸分析物、例えば
インシユリン、パラチロイドホルモン、チロイド
刺激ホルモン、黄体刺激ホルモン、アンジオテン
シン、成長ホルモン、免疫グロブリン及び酵
素、は数種の方法により供される。 一方法は分析物のアミノ基をポリペプチドラベ
ルと結合させるための例えばグルタルアルデヒド
の如き二官能性剤の使用を包含している。生成す
る一般的構造を以下に示す: 〔ポリアミノ酸分析物〕−〔N=CH−(CH2)2 −CN=N〕o−PP1 他の方法は例えばイソブチリルクロライド又は
N−ヒドロキシこはく酸イミド/カルボジイミド
の如き試薬を用いる遊離カルボキシル基の活性化
を包括している。分析物又はポリペプチドラベル
のカルボキシル基は活性化されそしてその後第二
成分(すなわちいずれも誘導化されていない分析
物又はラベル)とカツプリング反応させる。二種
の生成物の構造はこのようにして得られる: 〔ポリアミノ酸分析物〕−C(=O)−NH −〔PP1〕o 〔ポリアミノ酸分析物〕o−NH−C(=O) −〔PP1〕 後者の構造は、特に例えば活性化出来る3個だ
けのアミノ基があるようなS−ペプチドの如き比
較的小さいポリペプチドラベルを用いると、ラベ
ル化された分析物の性質のより多くの調節を行な
うべきである。 第三の方法はマレイミド基を有する二官能性基
を用いるポリペプチドラベルの改変を包含してい
る。これらの基は次にポリアミノ酸分析物のSH
基と反応することができる。下記の型の組成物が
このようにして得られる: 基 質 前記の如く基質は、ポリペプチド対又はより正
確にはラベル付けされた分析物複合体により作用
を受けるため、その後必然的に基質の実際の性質
はポリペプチド対の触媒性質に依存する。機能的
には、基質は発色団及び/又は螢光発生団生成物
をポリペプチド対で誘導される触媒放出を受け、
該生成物は対応する分光光度計又は螢光計により
特に検出できる。さらに、基質からの生成物(す
なわちレポーター分子)への触媒による転化が例
えば1時間以下の如き比較的短時間にわたつて生
成物の出現を運動論的に監視できるほど充分急速
であることが望ましい。これには一般に、発色団
基質は10-9Mより大きい濃度で存在している分析
物用に使用され、一方螢光発生基質は10-9M以下
の分析物濃度に利用することが望ましい。 レポーター分子の出現速度が、測定期間にわた
る時間の線状もしくはほゞ線状の函数であること
が望ましい。基質が容易に製造できること及び緩
衝液媒体中又は凍結乾燥形で最低1週間、そして
好適には少なくとも3ケ月間にわたつて貯蔵でき
るのに充分な安定性を有することもさらに望まし
い。 試験では、基質濃度は試験工程中に基質の枯渇
が生じないほど充分高くなければならない。換言
すると、基質の転換速度は試験期間中に基質濃度
と独立してなければならない。一般に、10-4M〜
10-2Mの間の基質の濃度が認容できるはずであ
る。 好適なポリペプチド対と共に用いるためには、
リボヌクレアーゼAによりレポーター分子へ酵素
的に転化される基質を使用することが好適であ
る。酵素ブドウ球菌ヌクレアーゼから誘導される
ポリペプチド対には、適当な基質は天然酵素によ
りレポーター分子に転化されるものである。例え
ば、デオキシチミジン5′−りん酸のパラニトロフ
エニルエステル誘導体を利用できる。P.
Cuatrecasas、M Wilchek及びC.B.Anfinsen、
“The Action of Staphyloccal Nuclease on
Synthetic Substrates”、Synthetic Substrate
of Staphyloccas Nuclease、8巻、No.6、2277
−83頁、1969年6月。β−ガラクトシドに関する
ポリペプチド対用には、適当な基質は商業的に入
手できるo−ニトロフエニルβ−ガラクトシドで
ある。 しかしながら、S−ペプチド及びS−蛋白質ポ
リペプチド用には、基質として一般的に好適な構
造は以下の如くである。 〔式中:Bはヌクレオチドベース、例えばピリミ
ジン類似体、例えばウラシルであり、それは3′位
置におけるりん酸エステルの触媒もしくは酵素に
よる加水分解を助けることができる〕。 Rはウンベリフエロニル、4−メチルウンベリ
フエロニル、3−フラボニル、o−ニトロフエニ
ル、m−ニトロフエニル、p−ニトロフエニル、
ジニトロフエニル、シアノフエニル、アシルフエ
ニル、カルボキシフエニル、フエニルスルホネー
ト、フエニルスルホニル及びフエニルスルホキシ
ドからなる群から選択される部分であり、 R′は水素、アルキル、アルケニル、シクロアル
キル、アリール、アラアルキル、アシル、オキサ
アルキル、チオアルキル、オキサシクロアルキル
及びチオシクロアルキルからなる群から選択され
た成分であり、 R″は水素又はカルシウム、バリウム、リチウ
ム、ナトリウム、アンモニウム、置換されたアン
モニウム及びピリジニウムからなる群から選択さ
れたカチオンである。 一般に、好適な基質の製造方法は数種ある。一
方法は中間生成物としての2′−O−テトラヒドロ
ピラニル−5′−O−アセチル−ウリジリン酸の合
成を包括しており、それを次に遊離アルコール性
螢光団又は発色団と縮合させ、一方第二の方法は
t−ブチルジメチルシリル封鎖基の使用を包含し
ており、そしてウリジンを直接シリル化して2′,
5′−封鎖されたウリジンを生成することに基いて
いる。好適な基質及びそれらの製造方法は、これ
と同一日付で出願されたすでに確認された共に出
願中の出願においてより完全に記されている。 また、適当な基質はさらに、Rがナフチルであ
る上記の構造からなつている。この場合、基質の
触媒による加水分解で得られる遊離ナフチルはジ
アゾニウム塩との反応により検出され、該塩はス
ルフアニル酸から誘導される。最終的生成物は
500ナノメートルにおける可視範囲内の強い吸収
を有するアゾ染料である。この基質はチロキシン
の比色計試験用に有用であることが見出されてい
る。 プリンベース、例えばアデノシン及びグアニジ
ン、は(上記の構造においてピリミジンベース用
に置換されているときには)リボヌクレアーゼA
又は関連ポリペプチド対の触媒活性を監視するた
めに適当な基質を与えないであろうが、プリンベ
ースを含有している基質は、他のポリペプチド対
の使用時には有用であるべきである。例えば、後
者は微生物で誘導されたリボヌクレアーゼT2の
活性を監視するためには有用であろうし、T2は
プリンベース又はT2から誘導されたポリペプチ
ドパートナーに対する活性を有する。 他のポリペプチド対により供される特定の触媒
活性のために有用である基質は周知である。さら
に、現存の文献の鑑み、特定のポリペプチド対に
より発現される酵素活性に対する適当な基質が設
計される。 ここに記載の好適な基質はある種の環境下では
媒体誘導加水分解をうけ得るものであり、そして
これは基質のレポーター分子への望ましくないバ
ツクグランドとしての変換を与える。この媒体誘
導加水分解反応はある基質中では高いPHすなわち
約8以上では急速に起きるが、それより低いPHで
は非常にゆつくりしか起きない。これらの基質の
長期貯蔵(すなわち1日以上)をしようとすると
きには、このことは関心事となる。低いPH及び比
較的低い温度における貯蔵は加水分解を最少とす
るであろう。 しかしながら、2′置換基を容易に除去できる封
鎖基で誘導することにより媒体誘導加水分解が本
質的に防がれるということが見出された。従つ
て、長期貯蔵をしようとするときの、好適な組成
は下記の式 R′又は【式】 〔式中、Rは封鎖基であり、そしてR、R′、
R″及びBは基質に関する前記の式に関連して記
されているのと同じ部分である〕 により表わされる。 適当な2′−封鎖基は下記の基準に合致しなけれ
ばならない;(1)他の重要な官能基に影響を与える
ことなく容易に加えられ、(2)その後の合成段階と
適合性があり、そしてより特定すると該段階にお
ける望ましくない副反応を最少にするかもしくは
無しにすべきであり、(3)悪い有害な影響を与えず
に長期貯蔵できるほど充分に安定であり、そして
(4)ホスホジエステル結合を分裂させずに容易に除
去される。これらの基準、特に最後のもの、は酸
触媒反応により加えられそして除去できる封鎖基
の使用により最も容易に満たされる。 従つて、適当な封鎖基Rはシリル、オキサア
ルキル、チオアルキル、オキサシクロアルキル及
びチオアルキルが含まれる。より特定すると、テ
トラヒドロピラニル、4−メトキシテトラヒドロ
ピラニル、1−エトキシエチル、t−ブチルジメ
トシリル、が使用できる。最初の3個の遮蔽基、
すなわちテトラヒドロピラニル、4−メトキシテ
トラヒドロピラニル及び1−エトキシエチル、を
使用するとケタール構造を与える。これらの封鎖
基は、弱酸、例えば希塩酸もしくは希酢酸、によ
り、基質分子中の他の重要な官能基を分裂させる
ことなく、容易に除去される。同様に、シリル封
鎖基は例えばテトラブチルアンモニウムフルオラ
イドの如き試薬により容易に除去される。 R封鎖基は基質目身の合成工程中にフラノサ
イド環の2′位置に挿入できる。しかしながら、満
足のいく長期貯蔵特性用に必須であることは信じ
られていないが、5′−位置における封鎖は合成中
に必要である。合成中の2′−及び5′−位置におけ
る封鎖はこのようにして合成中間生成物の早すぎ
る加水分解並びに2′−及び5′−位置における望ま
しくない反応の発生を防ぐ。5′−位置の封鎖基は
基質の使用前に除去する必要はなく、そのため
2′−位置の封鎖の場合のように容易に除去できる
ことという条件は存在しない。 他の成分 試験の実施においては、種々の理由のために他
の成分を加えることが有用である。多くのそのよ
うな添加物が知られている。これらの中で下記の
ものが挙げられる:試薬の貯蔵性を改良するため
の静菌剤;例えば免疫反応性を改良するためもし
くは触媒活性を変化させるための緩衝液;免疫反
応性を強化するための例えばNaclの如きイオン
性強化剤;例えば内因性の酵素活性を減じるか又
は除去するための阻害剤の如き試薬;触媒活性強
化剤、及び内因性蛋白質用の封鎖剤。 今までの免疫試験方法で使用されている数種の
添加物を希望により本発明と共に使用することも
できる。しかしながら、そのような追加成分が本
発明に従う検定を実施するためにここで示されて
いる基準に悪影響を与えない点を確認するために
注意を払うべきである。例えば、いくらか阻害も
同様に生じるので使用されるポリペプチド対が
RNase活性を示すようなりん酸緩衝液を使用す
ることは普通は望ましくない。 他の一般的考察 ある場合又は全ての場合には、使用する試薬を
精製することが有用であり、そして実際に必要で
ある。例えば、内因性酵素活性を除くための、例
えばS−蛋白質の如き市販級ポリペプチドパート
ナーPP2の精製が一般に必要である。ペプチドラ
ベルPP1の精製は実施できるが、単に生成したラ
ベル付けされた分析物を精製することが一般に満
足である。精製技術は良く知られており、そして
クロマトグラフイ技術が適している。基質も精製
できるが、ここに記されている好適な基質ではこ
れは必要ないことが見出されている。 改良された貯蔵条件が必要なら、試験試薬の一
部の凍結乾燥化が必要である。適当な技術は周知
である。 本発明に従う検定を室温条件下で行なうことが
一般に望ましい。しかしながら、反応平衡K1、
K2及びK3の強化又は遅延は、温度を変化させる
と生じる。これは、本発明の方法用に融通性を付
与するためには考慮にいれられるであろう他のパ
ラメーターである。 試験に対するPHの効果も同様に考慮すべきであ
る。例えば、チロキシンの試験では、PHが5から
約7に高まるにつれて免疫反応性が減じられるこ
とが見出されている。ここに記されているりん酸
ナフチル基質は5のPHにおいて適当に使用できる
が、好適なウンベリフエロン型基質は、比色計方
式での有用な操作用には、約6〜約8の範囲内の
PHを必要とする。PHに関する感度は、分析物分子
により塩基性の大きい基を加えながら、ラベル付
けされた分析物の負荷特性を変化させることによ
り多分克服できるであろう。またチロキシン用の
さらに強い抗血清の使用は助けとなるはずであ
る。結合化学性(例えば結合基の場所、型)を改
変することも助けとなる。 主な試薬(すなわち抗体、基質、ラベル付けさ
れた分析物及びポリペプチドパートナー)は、例
えば特定の分析物用の予期される濃度範囲を模す
るか又は包括する一連の標準的分析物溶液の如き
必要なもしくは望ましい追加成分と一緒になつて
特定の試験用のキツトの形に典型的に包装される
であろう。さらに、そして使用する特定の基質の
条件により、下記のものが包含される:(1)封鎖形
で輸送するために包装する場合には基質用の封鎖
解除試薬、(2)戻した試薬の希釈用又はPH調節用の
緩衝液、及び(3)必要なら、染料生成剤(例えばこ
こに記されているりん酸ナフチル基質を使用する
ならジアゾニウム塩)。さらに、例えば内因性の
分析物結合用蛋白質の如き可能な干渉を最少化も
しくは除去するために必要なら、予備処理溶液が
供される。 種々の成分を、安定性、輸送及び他の条件によ
り、溶液又は凍結乾燥形でキツト中に包装でき
る。各成分又は試薬を別個に包装できる。一方、
(1)試験の正確性が相当悪影響されず(例えばラベ
ル付けされた分析物及びポリペプチドパートナー
を触媒活性種の早過ぎる生成をもたらすであろう
環境下で一緒にするときには生じるであろう)、
そして(2)成分がなんらかの方法で分解されない
(例えば過度の媒体誘導加水分解による基質の転
化)限り、2種以上の成分を1個の包装物中で一
緒にすることができる。 一緒にする包装の一形式は、ラベル付けされた
分析物及び基質を一緒に包装しそして抗体及びポ
リペプチドパートナーを第二の包装物中で一緒に
することを包含している。典型的にはウンベリフ
エロン型の好適な基質を使用するときの如く、こ
の方式における基質は過度の媒体誘導加水分解を
防止するための適当に緩衝された封鎖解除形であ
ることもできる。6以下のPHを使用すべきであ
り、約5の値が満足のいくものである。比色計検
出方式用には、試験で6以上のPHを与えるために
適する緩衝液の別個の包装物がこの場合必要であ
る。 別の一緒にする方装方式は、ラベル付けされた
分析物及び基質を別個に包装しながら抗体及びポ
リペプチドパートナーを一緒にすることを包含し
ている。これは、前記の急速分析器で使用できる
よう案に融通性を与えるため又は基質を封鎖形で
包装することにより基質の媒体誘導加水分解を最
少化するために有用である。後者の場合、別個に
包装された封鎖解除剤が必要であろう。また、適
当な試験PHを与えるための緩衝液包装物も必要で
ある。 他の一緒にする包装様式は、抗体及び基質を一
緒にすることを包含している。ラベル付けされた
分析物及びポリペプチドパートナーは、他の追加
成分もそうであるように別個に包装される。 種々の成分をキツト中に別個に包装するか又は
ある様式で一緒にするかどうかにかかわらず、こ
こに記されている補助成分(例えば静菌剤)を適
当な成分包装物に加えることができる。 ここで記されている技術の評論は均質免疫試験
用の方法の提供時に向けられているが、A−
PP1/PP2免疫試験ラベル系用に不均質方式も使
用できることに注目すべきである。これは融通
性、製造の容易さ、安定性及び例えばS−ペプチ
ドから誘導されたものの如きA−PP1でラベル付
けされた分析物の検出能力のために現在の不均質
酵素免疫試験と比べて有利である。さらに、不均
質方式が均質方式より好適であるなら特別な状況
が生じるかもしれない。例えば、不均質方式は例
えば内因性酵素活性の如き血清に基く妨害を除く
ために他の選択を行なうこともできる。また、不
均質免疫試験用に独自の自動化装置を利用でき、
そしてA−PP1/PP2免疫試験ラベル系はその系
のより完全な有用性の表現を可能にできる。 不均質免疫試験案は下記の段階を包含してい
る: (1) 適当な緩衝液媒体中での分析物、ポリペプチ
ドでラベル付けされた分析物及び抗−分析物抗
血清の培養; (2) 抗体結合された及び遊離状のポリペプチドで
ラベル付けされた分析物の物理的分離;及び (3) 対応するPP2及び基質を加えそして基質から
のレポーター分子への転化を測定することによ
る、抗体結合されたラベル付けされた分析物及
び/又は遊離状のラベル付けされた分析物の測
定。 段階(2)は、分析物抗体に対する固有第二抗体の
使用、例えばポリエチレングリコールの如き試薬
を用いてのAb゜A−PP1複合体の沈殿、又はおそ
らくクロマトグラフイにより、容易に達成され
る。 遊離状A−PP1部分の測定は均質方式で実施さ
れるが、結合された部分の測定は固相抗体複合体
からのラベル付けされた分析物のストリツピング
を必要とする(なぜならA−PP1は通常結合され
ているときには触媒活性を回復しないからであ
る)。これは過剰のPP2の添加により又は尿素の
如き他の試薬の使用により達成され、それらは抗
体複合体の解離用に普通使用されている。一方、
A−PP1は、抗体を複合体化することにより、抑
制されないように計画できる。これは実際にPP1
ラベルを抗体との分析物の複合体化の影響から絶
縁するような非常に大きいZ基を用いることによ
り行なわれる。比色計及び螢光計検出方式の両者
が、均質免疫試験を用いるときの如く、可能であ
る。 下記の実施例は本発明を単に説明するためのも
のであり、そしてそれの範囲を限定しようとする
ものではない。簡単に云うと、実施例〜は一
般にチロキシン、S−ペプチドでラベル付けされ
た分析物の製造及び特性決定に関している。実施
例〜は一般に5,5−ジフエニルヒダントイ
ン−(ジランチン)−S−ペプチドでラベル付けさ
れた分析物の製造及び特性決定に関している。実
施例〜はコルチゾル−S−ペプチドでラベル
付けされた分析物の製造及び特性決定に関してい
る。実施例XIはS−蛋白質の存在下でのチロキシ
ン−S−ペプチドでラベル付けされた分析物の触
媒活性を説明する。実施例XII〜は抗体の存在
により生じる触媒回復の抑制を説明する。実施例
〜は一般に、標準的又は参照用曲線の製
造に関している。実施例XIは対照用及び臨床用
試験の免疫試験に関している。実施例XIIは不均
質方式免疫試験に関している。断わらない限り温
度は摂氏温度である。 実施例では、下記の略語が使用されている。 a.u.=吸収単位 g=グラム ml=ミリリツトル mg=ミリグラム m moles=ミリモル μ=マイクロリツトル min=分 nm=ナノメートル %=パーセント M=モル cm=センチメートル na=ナノアンプ ma=ミリアンプ m.a.u.=ミリ吸収単位 T.=温度 ABS.=吸光度 N=規定 ng=ナノグラム MV=ミリボルト μg=マイクログラム TIC=薄層クロマトグラフイー u.v.=紫外線 i.r.=赤外線 n.m.r.=核磁気共鳴 実施例 この実施例は、ラベル付けされた分析物の製造
において結合基として使用するための二官能性試
薬である6−イソチオシアナトカプロイルクロラ
イドの製造を説明する。 二官能性化合物は二官能性イソシアネートが得
られている米国特許4130526中に示されている方
法と同様な方法に従つて製造された。下記の反応
が使われた: オーブン乾燥されそして窒素冷却された2丸
底フラスコは窒素入口、圧力均等化滴下ろうと及
び機械的スタラーが備えられていた。500mlのテ
トラヒドロフラン(リンデ4A分子ふるい上で乾
燥)中の6−アミノカプロン酸(66.02g、0.5モ
ル)の混合物をフラスコに加えた。混合物を窒素
下で20分間撹拌した後に、240mlのトリエチルア
ミン(1.7モル、リンデ4A分子ふるい上で乾燥)
を撹拌しながら加えた。20分間撹拌した後に、36
mlの二硫化炭素(0.6モル)を45分間にわたつて
滴々添加した。反応混合物を一夜撹拌し、そして
250mlのテトラヒドロフランで希釈した。次に225
mlのトリメチルシリルクロライドを2.5時間にわ
たつて滴々添加した。白色沈殿が生成した。反応
混合物を7時間にわたつて撹拌しながら静かに還
流させた。冷却後に、反応混合物を空気の不存在
下で過した。沈殿を乾燥テトラヒドロフランで
洗浄し、そして赤金色の液を集めた、このテト
ラヒドロフラン溶液を真空中で室温において濃縮
して、溶液を除去した。残渣を500ml丸底フラス
コ中にいれ、そして250mlの塩化メチレン中に溶
解させた。塩化チオニル(70ml)を撹拌しながら
20分間にわたつて加えた。一夜撹拌した後に、溶
媒を回転蒸発器上で除去して粗生成物を与えた。
これを110〜115゜(0.2トル)において2回蒸留し
て、31gの6−イソチオシアナトカプロイルクロ
ライドを与え、それは4.6〜4.8u(N=C=S)及
び5.5u(COCl)における赤外吸収帯、並びに構造
的に一致する面積比で3.4、2.8及び1.5ppmにおけ
るn.m.r.共鳴(CDCl3溶媒)を有していた。 実施例 この実施例は、例えばS−ペプチドの如きポリ
ペプチドラベルに対するカツプリング用に適して
いるチロキシンの誘導体を生成するための6−イ
ソチオシアナトカプロイルクロライドとチロキシ
ンの反応を説明する。 1ミリモル、すなわち776mg、のチロキシンを
10mlの塩化メチレン中に懸濁させた。これに0.5
mlのピリジンを加え、そして混合物を氷浴中で冷
却した。撹拌されている混合物を次に0.2mlの6
−イソチオシアナトカプロン酸クロライドと一緒
にし、そして撹拌を一夜続けた。溶媒の約半分及
び他の揮発物質を回転蒸発器中で除去し、そして
残渣を最少量のテトラヒドロフラン(THF)中
に溶解させた。THF混合物を分離ろうと中に移
した。混合物を水で2回抽出することにより無機
塩及び未反応物質を除去した。有機層を無水
Na2SO4上で乾燥した。溶媒を蒸発器上で除去す
ると、生成物であるN−(6−イソチオシアナト
カプロイル)チロキシンからなる残渣が残り、そ
れは薄層クロマトグラフイ及び元素分析により同
定された。 実施例 この実施例は、実施例のN−(6−イソチオ
シアナトカプロイル)チロキシンとS−ペプチド
の反応により生成されるS−ペプチドでラベル付
けされたチロキシンの製造を説明する。 2.94mg、すなわち1.36×10-3ミリモル、の市販
のS−ペプチド(Sigma Lot # 99C−8055)
を1.5mlのPH9の0.2Mほう酸塩緩衝液中に溶解さ
せ、そして溶液を室温で20分間撹拌した。この溶
液に、100μのジメチルホルムアミド中の2.09mg
(9.6×10-4ミリモル)のN−(6−イソチオシア
ナトカプロイル)チロキシンを加えた。さらに
50ulのジメチルホルムアミドを加えた。混合物を
一夜撹拌した。 チロキシン−S−ペプチド誘導体は、5′−O−
アセチルウリジン3′−(4−メチルウンベリフエ
ロン−7−イルホスフエート)基質を用いて試験
したときに触媒活性及び免疫反応性の両者を示す
ことが見出されたが、それはさらに以下の実施例
に従つて精製された。 実施例 この実施例は、実施例で製造されたS−ペプ
チドでラベル付けされたチロキシンの精製を説明
する。 セフアデツクスG−25Fカラム(1×23cm)を
製造しそして0.02%ナトリウムアジドを含有して
いる約PH9.5の0.05Mほう酸塩緩衝液で平衡化し
た。実施例からの反応生成物の一部分(0.5ml)
をカラムに適用した。緩衝液を1ml/分の流速で
溶離し、そして1mlフラクシヨンを集めた。フラ
クシヨン14〜25は324nmにおけるチロキシンによ
る吸収に基く望ましい接合体、実施例XIに示され
ている如きS−蛋白質及び基質の存在下での触媒
活性、及び実施例XIIに示されている如き免疫反応
性(チロキシン抗体の存在下での抑制)を有する
ことが見出された。 実施例〜は5,5−ジフエニルヒダントイ
ン(ジランチン)S−ペプチドでラベル付けされ
た分析物の製造に関している。実施例中に記され
ている合成では、ジランチンは改変されて、N−
ヒドロキシこはく酸イミドで誘導された縮合によ
りS−ペプチドにカツプリング可能となる。 実施例 この実施例は、S−ペプチドとカツプリングす
る、5,5−ジフエニルヒダントイン3−(5−
吉草酸)、C.Cook、J.A.Kepler、H.Dix
Christiansen、Res.Comm.Chem.Path.
Pharma.5、767(1973)、の製造を説明する。 ナトリウム5,5−ジフエニルヒダントイン
(Sigma Lot # 64C−0027、1.65g、6.01×
10-3モル)を、乾燥ジメチルホルムアミド(30
ml)を有する100mlの丸底フラスコに加えた。混
合物を撹拌しながら60゜に加熱し、そして1.20g
(6.15×10-3モル)の5−ブロモ吉草酸メチルを
加えた。反応混合物を3時間にわたつて撹拌しな
がら60℃に保つた。それを次に450mlの30%飽和
硫酸アンモニウム中に注いだ。5゜に一夜撹拌した
後にゴム状沈殿が生成した。上澄み液を過し、
そして残渣を5mlの冷メタノールですり砕いた。
粗生成物を過し、そして熱いメタノールから再
結晶化させた。合計収量1.41g(64%)の生成物
である5,5−ジフエニルヒダントイン3−(5
−吉草酸メチルエステル)を得た。 0.89g(2.43ミリモル)の5,5−ジフエニル
ヒダントイン3−(5−吉草酸)メチルエステル
を10%ジオキサン/H2O中の0.5N塩酸50mlの中
で3時間還流した。反応混合物を冷却し、そして
5゜において一夜貯蔵した。粗製結晶性生成物を
過により集め、そして酢酸エチル/ヘキサンから
再結晶化させた。合計収量0.63g(74%)の生成
物である5,5ジフエニルヒダントイン3−(5
−吉草酸)が得られ、それは150〜157゜の融点
(文献融点161〜163)を有していた。生成物を再
び再結晶化させて、152〜153゜の融点を有する精
製された物質を与えた。 実施例 この実施例では5,5−ジフエニル−ヒダント
イン−S−ペプチドでラベル付けされた分析物の
製造で使用された5,5−ジフエニルヒダントイ
ン3−(5−吉草酸N−ヒドロキシサクシンイミ
ジルエステル)の製造を説明する。 21.63mg、すなわち5.8×10-2ミリモル、の実施
例の5,5−ジフエニルヒダントイン3−(5
−吉草酸)を0.66mlの乾燥テトラヒドロフラン中
で8mg(7.0×10-2ミリモル)のN−ヒドロキシ
こはく酸イミド及び15mgのジシクロヘキシルカル
ボジイミドと一緒にした。混合物を一夜放置し
た。反応混合物を10mlの酢酸エチルで希釈し、そ
して過して、ジシクロヘキシル尿素を分離し
た。溶液を0.5mlの0.5M炭酸水素ナトリウムで2
回、0.5mlの水で1回、そして0.5mlの飽和塩化ナ
トリウムで1回洗浄した、溶液を無水硫酸マグネ
シウム上で乾燥し、そして回転蒸発器上で濃縮し
た。結晶性残渣を塩化メチレン/ヘキサンから再
結晶化させて、16mgの生成物を与えた。 実施例 この実施例は実施例で得られた反応生成物か
らの5,5−ジフエニルヒダントイン(ジランチ
ン)S−ペプチドでラベル付けされた分析物の製
造を説明する。 商業的に得られたS−ペプチド(Sigma Lot
# 99C−8055、0.85mg、3.9×10-4ミリモル)
を0.25mlの乾燥ジメチルホルムアミド中に溶解さ
せた。S−ペプチドメチルホルムアミド溶液に、
0.10mlの乾燥ジメチルホルムアミド中の0.92mg、
すなわち20×10-4ミリモルの5,5−ジフエニル
ヒダントイン3−(5−吉草酸)N−ヒドロキシ
サクシンイミジルエステルを加え、その後40ulの
乾燥ジメチルホルムアミド中の0.18mgのN−メチ
ルモルホリンを添加した。この反応混合物を室温
で1週間撹拌し、そして次に5゜において貯蔵し
た。 ジランチンS−ペプチドでラベル付けされた分
析物は、5′−O−アセチルウリジン−3′−(4−
メチルウンベリフエロン−7−イルホスフエー
ト)基質を用いて試験するときには、触媒活性及
び免疫反応性の両者を示すことが見出されたが、
それをさらに以下の実施例に従つて精製した。 実施例 この実施例は実施例で得られた5,5−ジフ
エニルヒダントイン(ジランチン)S−ペプチド
でラベル付けされた分析物の精製を説明する。 ジランチンS−ペプチドでラベル付けされた分
析物をセフアデツクスG−15カラム上のクロマト
グラフイにより精製した。セフアデツクスG−15
(20g)を0.1%ナトリウムアジドを含有している
150mlの0.05MのPH約8のトリエタノールアミン
緩衝液中で再び水和させ、そして1×48cmのカラ
ム中に注いだ。カラムを緩衝液で平衡化させ、そ
して100ulの前記の如くして製造されたラベル付
けされた分析物をカラム上で少部分の緩衝液で洗
浄した。フラクシヨン(1ml)を集め、そして触
媒的及び免疫反応性に関して監視した。200μ
部分の希釈したフラクシヨンを200μの酢酸ナ
トリウム緩衝液又はジランチン抗体、1900μの
封鎖されていない基質である5′−O−アセチルウ
リジン3′−(4メチルウンベリフエロン−7−イ
ルホスフエート)及び200μのS−蛋白質溶液
と一緒にした。 螢光の増加速度を325nmに設定された励起及び
440nmにおける放射を有する商業的に入手できる
Farrand Mark 1螢光計を用いて監視した。指
されているフラクシヨンに対して下記の結果が得
られた: 【表】 フラクシヨン15〜19及び20〜25を別個に貯蔵し
た。貯蔵されたフラクシヨン15〜19を次に実施例
、及びXIに記されている免疫試験で使
用した。 実施例 この実施例はコルチゾルS−ペプチドでラベル
付けされた分析物の製造で使用された21−コルチ
ゾル−(6−イソチオシアナトカプロエート)の
製造を説明する。 トリエチルアミン(0.2ml)を注射器を用いて
0.362gのコルチゾルの2mlのN,N−ジメチル
ホルムアミド中溶液に加えた。混合物を大気水分
を除いたフラスコ中で撹拌し、そして氷水冷却浴
中に浸した。混合物に0.229gの6−イソチオシ
アナト酸クロライドを3分間にわたつて滴々添加
した。反応をシリカゲル薄層クロマトグラフイに
より溶離溶媒として酢酸エチル中の10%メタノー
ルを用いて監視した。生成物は0.7のRf値を有し、
それに比べてコルチゾル自身は0.5のRf値を示し
た。3時間の反応後に、TLCは少量のコルチゾ
ルを示すか又は全く示さなかつた。混合物を次に
5mlのメタノールで処理し、そして蒸発乾固し
た。残渣をメタノール/エーテルから2回結晶化
させて、211mgの白色の針状物(融点105〜108)
を与えた。構造と一致した赤外線及びn.m.r.デー
タが得られた。 実施例 この実施例は実施例で得られた反応生成物か
らのコルチゾル−S−ペプチドでラベル付けされ
た分析物の製造を説明する。 0.35mgのS−ペプチドを0.3mlのPH9.8の0.2Mほ
う酸ナトリウム緩衝液中に溶解させた。撹拌され
ている溶液に、0.02mlのジオキサン中の0.5mgの
21−コルチゾル−(6−イソチオシアナトカプロ
エート)を加えた。さらに0.075mlのジオキサン
を加えて、反応混合物を均質とした。室温におい
て4日間撹拌した後に、混合物を1.0×50cmのセ
フアデツクスG−10カラムを通して、0.05Mトリ
エタノールアミン−HCl緩衝液、PH8、0.1%
NaClで溶離して、精製した。2.45mlのフラクシ
ヨンを集めた。溶離剤をu.v.検出器を用いて監視
した。 主要なバンドはフラクシヨン7、8及び9に溶
離した。実施例で使用された方法による、S−
蛋白質及びウンベリフエロン基質(5′−O−アセ
チルウリジン−3′−(4−メチルウンベリフエロ
ン−7−イルホスフエート)の存在下における触
媒活性の試験は、これらのフラクシヨンが約97%
の溶離されたS−ペプチド活性を有していたこと
を示した。 これらのフラクシヨンの触媒活性はコルチゾル
抗血清の存在下では65〜80%抑制された。ラベル
付けされた分析物の紫外線スペクトルは240nmに
おける特性コルチゾル吸収を有し、そしてこれ及
びコルチゾル自身の吸収エプシロン(11998)か
らラベル付けされた分析物の濃度は7×10-5Mと
推定された。 実施例 XI この実施例は実施例で製造されたチロキシン
−S−ペプチドでラベル付けされた分析物の、S
−蛋白質の存在下での、触媒活性を説明し、そし
てラベル付けされた分析物の濃度に対する触媒活
性の相互関係を示す。 チロキシン−S−ペプチドでラベル付けされた
分析物の回収された触媒活性をそれの濃度の関数
として、S−蛋白質の存在下で監視するためにユ
ニオン・カーバイト・コーポレーシヨン・モデル
500CentrifiChemR分析器を使用した。ウリジン
−3′−α−ナフチルホスフエート/p−ジアゾス
ルフエニル酸を、触媒活性を管視するための基
質/染料組み合わせ物として使用した。下記の試
薬を製造した: a 緩衝液:0.1M酢酸ナトリウム(PH5.0) b S−蛋白質:酢酸ナトリウム緩衝液中1.5×
10-5M c 基質:10.7mlの酢酸ナトリウム緩衝液中の16
mgの新たに封鎖除去されたウリジン−
3′−(α−ナフチルホスフエート)、 d 染料:1.0mlの0.1N HCl、Lot # 031814
中の25mgのジアゾ−p−スルフアニル
酸の1,5−ナフタレンジスルホン酸
安定化塩、 e チロキシン−S−ペプチドでラベル付けされ
た分析物:実施例で製造されたクロマトグラフ
イ貯蔵フラクシヨン14〜25精製された
ラベル付けされた分析物の、酢酸ナト
リウム緩衝液中の、1:40希釈、すな
わち1.0×10-5M、溶液。 Centrifi ChemR分析器は下記の調整値を有し
ていた:ローター温度、30゜;フイルター、
520nm;試験方法、TERM;プリントアウト、
ABS;ABS、1.0u;ブランク、Hold;濃度因
子、0;テストコード、0;T、1分。 5.55mlの酢酸ナトリウム緩衝液、840μの基
質、70ulの染料、及び140μのS−蛋白質からな
る混合物を製造し、そして400μ部分の混合物
をCentrifi ChemR分析器の転移デイスクのみぞ
3〜12の試薬井戸中にピペツトで加えた。それぞ
れ5μ〜40μの種々の量のチロキシンS−ペプ
チド溶液を転移デイスクの対応する試料井戸中に
ピペツトで加え、各井戸中の全量を酢酸ナトリウ
ム緩衝液で40μとした。装填したデイスクをロ
ーター上に置き回転させた。各みぞに対して1分
間隔で吸光度の読みをプリントアウトした。これ
らを最少2乗法線状回帰分析により、ナフトール
及び染料試薬との反応から誘導された発色団生成
物の生成速度に転化した。データを下表2に示
す。一般に、個々の速度測定に対して相関係数は
0.995より大きかつた。 【表】 チロキシン−S−ペプチドの濃度は下式による
発色団生成物の生成速度と直線的関係であつた: 速度(a.u./min.)=0.00245〔チロキシン−S−
ペプチドμ〕−0.00489、 0.9995の相関係数。 これらのデータは、基質の触媒による転化がラ
ベル付けされた分析物の濃度に直接関係している
こと及びこの方法の速度は遠心急速分析器中で、
測定期間にわたる吸光度及び時間の間の線状関係
に従つて簡便にしかも正確に測定できる。 実施例XII〜は、S蛋白質の存在下でのラベ
ル付けされた分析物の触媒活性の回復に関する分
析物に対する抗体の抑制効果を示している。記さ
れているように、螢光及び比色試験の両者が使用
される。 実施例 XII この実施例は螢光試験を用いての、チロキシン
抗体によるチロキシンS−ペプチドの触媒活性の
回復抑制を示している。下記の試薬を製造した: a チロキシン−S−ペプチドでラベル付けされ
た分析物:実施例で製造された生成物を
0.05Mトリエタノールアミン(TEA)緩衝液、
PH8を用いて1/2000の率で希釈した。 b チロキシン抗体:抗血清をTEA緩衝液を用
いて1/200の率で希釈した。 c S−蛋白質:精製された商業用物質をTEA
緩衝液中で2×10-5Mまでとした。 d 基質:50.75mlの0.1M酢酸塩緩衝液、PH5.0中
の約17mgの基質の濃度の新たに封鎖除去された
5′−O−アセチルウリジン−3′−(4−メチル
ウンベリフエロン−7−イルホスフエート)。 この基質を触媒により加水分解して、螢光性生
成物である(4−メチルウンベリフエロン)を与
えた。Farrand Mark螢光計を0.1に設定され
ている目盛りで、速度測定用に使用した。励起は
325nmであり、そして放射は440nmで監視され
た。 表3は示されている試薬を一緒にした後に得ら
れたデータを示す。 【表】 溶液1及び2に対するデータは、チロキシン−
S−ペプチドをS−蛋白質と一緒にしたときには
触媒活性が回復されること、及び触媒活性がS−
蛋白質濃度に関して飽和されているようであるこ
とを示している。溶液3に対するデータは、触媒
活性がS−蛋白質の不存在下で表わされないこと
を示している。溶液4及び5に対するデータは、
チロキシン抗体の存在によるチロキシン−S−ペ
プチドの触媒活性の抑制された回復を示してい
る。抑制率は53%であつた。 実施例 この実施例は、比色計試験を用いての、チロキ
シン抗体によるチロキシン−S−ペプチドの触媒
活性の回復の抑制を説明する。 この実施例で使用された試薬は、実施例XIで使
用されたものと同一である。5.55mlの酢酸塩緩衝
液、840μの基質、70μの染料及び140μのS
−蛋白質からなる混合溶液を実施例XIに記されて
いる如くして製造した。また吸光度の増加速度を
Centrifi ChemR500分析器を用いて実施例XIに記
されている調整値において監視した。チロキシン
抗体を減少していく量の酢酸塩緩衝液で希釈する
ことにより種々の濃度の抗体溶液が得られた。 400μの混合液を分析器のみぞ2〜12の試薬
井戸中にペプチドで加えた。それぞれ10μの減
少していく抗体希釈物を試料井戸4〜12の中に、
20μのチロキシンS−ペプチドでラベル付けさ
れた分析物と共に、ピペツトで加えた。増加して
いく吸光度を装置ローター上に転移デイスクを置
きそして回転させた後に1分間隔で監視した。表
4は結果を記録している: 【表】 データは、1:1抗体希釈付近でプラトー化さ
れている抗体の抑制効果を示している。上記のデ
ータをプロツトすると、1:30より幾分大きい抗
体希釈度における50%抑制があるS−形の滴定曲
線が出きる。 実施例 XI この実施例は螢光計試験を用いるジランチン抗
体によるジランチンS−ペプチドの触媒活性の回
復の抑制を説明する。 下記の試薬を使用した: a ジランチンS−ペプチドでラベル付けされた
分析物:実施例〜中に記されている如くし
て製造された物質、これはPH5の0.1M酢酸ナ
トリウム緩衝液で1/6000の率で希釈されてい
た。 b S−蛋白質:Sigma精製された商業用物質を
PH5の0.1M酢酸ナトリウム緩衝液中で1.47×
10-6Mの濃度にした。 c ジランチン抗体:抗血清を0.1M酢酸ナトリ
ウム緩衝液中で1:50の率で希釈した。 d 基質:新しく封鎖除去された5′−O−アセチ
ルウリジン−3′−(4−メチルウンベリフエロ
ン−7−イルホスフエート)。 Farrand Mark螢光計を、0.1に設定されて
いる目盛で、速度測定用に使用した。励起は
325nmであり、そして放射は440nmで監視され
た。 示されている試薬に150μのS−蛋白質を加
え、そして溶液を30分間培養した。データを表5
に記録する。 【表】 * 溶液1及び2中で使用された物
質は同じであつたが、溶液
3及び4で使用された物質とは異
なつていた。
データはジランチン抗体の存在によるジランチ
ン−S−ペプチドの触媒活性の抑制された回復を
示している。溶液1及び2に対しては抑制率67%
であり、そして溶液3及び4に対しては抑制率は
48%である。 実施例 この実施例は比色計試験を用いての、ジランチ
ン抗体によるS−蛋白質の存在下でのジランチン
−S−ペプチドの触媒活性の回復の抑制を説明す
る。 この実施例では、抗体比色計法での触媒活性の
抑制監視用の基質/染料組み合わせ物としてウリ
ジン−3′−(α−ナフチルホスフエート/p−ジ
アゾ)スルフアニル酸を使用した。下記の試薬が
製造された: a ジランチン−S−ペプチドでラベル付けされ
た分析物:PH5.0の0.1M酢酸ナトリウム緩衝液
を用いて1:600に希釈された、実施例〜
に記されている方法で製造された物質。 b S−蛋白質:PH5.0の0.1M酢酸ナトリウム緩
衝液中で1.53×10-6MまでにされたSigma精製
された商業用物質。 c 基質:新しく封鎖除去されたウリジン−3′−
(α−ナフチルホスフエート)。 d 抗体:ジランチン抗体を0.1M酢酸ナトリウ
ム緩衝液を用いて1:15の率で希釈した。 e 染料:p−ジアゾスルフアニル酸の安定化さ
れた1,5−ナフタレンジスルホン酸塩(25
mg)を1mlの0.1NHCl中に溶解させた。 50ulのジランチン−S−ペプチド、20ulのS−
蛋白質、200μの基質及び25ulの染料からなる溶
液をPH5.0の2052μの0.1M酢酸ナトリウム緩衝
液PH5.0で最終的量とした。470nmにおける溶液
吸光度を、Cary Model 118分光光度計を用いて
速度方式で時々監視した。吸収増加速度(1分当
りの吸収単位、a.u.で測定)は0.05a.u./min.で
あることが見出された。 第二溶液を製造し、そこでは111μの抗体を
対応する量の酢酸ナトリウム緩衝液用に置換し
た。吸収増加速度は0.02a.u./min.であり、それ
はジランチン抗体の存在によるジランチン−S−
ペプチドの触媒活性の回復の60%の抑制率に相当
していた。 実施例 この実施例は遠心急速分析器を用いての、S−
蛋白質の存在下でのジランチン抗体によるジラン
チンS−ペプチドの触媒活性の回復の抑制を説明
する。 この実験は、ナフチル基質の代りに比色計基質
としてウリジン−3′−(4−メチルウンベリフエ
ロン−7−イルホスフエート)を使用しそして分
光光度計の代りに吸収増加速度を監視するために
遠心急速分析器(Centrifi ChemR500)を使用す
るため、実施例とは異なつている。 下記の試薬を使用した: a ジランチン−S−ペプチドでラベル付けされ
た分析物:実施例〜に記されている如くし
て製造された物質を未希釈形で使用した。 b 抗体:PH7.1の0.1Mトリエタノールアミン
(TEA)−HCl緩衝液で1:40の率で希釈され
た抗血清。 c S−蛋白質:精製された物質をPH7.1の0.1M
TEA−HCl緩衝液で1:100の率で希釈して、
1.53×10-6Mの最終的濃度を与えた。 d 基質:17mgの5′−O−アセチル−2′−O−
(テトラヒドロピラン−2−イル)ウリジン
3′−(4メチルウンベリフエロン−7−イルア
ンモニウムホスフエート)を750μの0.05N
HClで30分間封鎖除去することにより5′−O−
アセチルウリジン−3′−(4−メチルウンベリ
フエロン−7−イルホスフエート)基質が得ら
れた。反応混合物を次に、1880μのPH5.0の
0.1M酢酸ナトリウムを加えることにより緩衝
した。使用の直前に、300μのこの濃縮基質
を5094ulの0.01M TEA−HClに加えた。 Centrifi ChemR500分析器に対する下記の調整
値を使用した:ローター温度、30゜;フイルター
340nm;To、10秒;T、2分;ABS、1.0u;ブ
ランク、ホールド;試験方式、Term;プリント
アウト、ABS;濃度係数、0;試験コード、0。 ラベル付けされた分析物及び抗体又は緩衝液を
それぞれ、分析器の転移デイスクのみぞ3〜6の
試料井戸中にピペツトで加え、その後16.6ulの
0.025N水酸化ナトリウムを添加した。S−蛋白
質及び基質を転移デイスクの同じみぞの試料井戸
中にピペツトで加えた。みぞ0及び1には対応す
る量及び等しい量のTEA緩衝液が充填されてい
た。みぞ2では、ジランチンS−ペプチド及び抗
体をTEA緩衝液で置換して、基質ブランクを与
えた。デイスクをローター上に置き、そして回転
させた。吸収を2分間隔で監視し、そしてプリン
トした。時間の函数としての吸収の最少2乗法線
状回帰分析により速度が得られた。 表6はデータをまとめたものである: 【表】 データは、ジランチン抗体の存在によるジラン
チン−S−ペプチドの触媒活性の抑制された回復
を示している。抑制率は30%である。 上記の実施例XI〜は標準的又は参照置換曲
線を作成するための基礎を提供するものであり、
該曲線から未知の分析物濃度が測定できる。下記
の実施例〜XIは対応する基質での種々の比
色計又は螢光計装置を利用する標準的置換曲線を
説明する。 実施例 この実施例はラベル付けされた分析物としてチ
ロキシン−S−ペプチドをそして螢光性基質とし
て5′−O−アセチルウリジン−3′−(4−メチル
ウンベリフエロン−7−イル)ホスフエートを用
いる対照置換曲線の作成を説明する。 下記の試薬を製造した: a チロキシン−S−ペプチドでラベル付けされ
た分析物:実施例〜に記されている方法で
製造された物質をPH5.0の0.1M酢酸ナトリウム
緩衝液中で1:2000の率で希釈した。 b 抗体:抗血清をPH5.0の0.1M酢酸ナトリウム
緩衝液を用いて1:2000の率で希釈した。 c S−蛋白質:精製された物質をPH5.0の0.1M
酢酸ナトリウム緩衝液を用いて2×10-5Mとし
た。 d 基質:17mgの5′−O−アセチル−2′−O−
(テトラヒドロピラン−2−イル)ウリジン
3′−(4−メチルウンベリフエロン−7−イル)
アンモニウムホスフエートを0.01HCl中で45分
間撹拌し、そして次にエーテルで抽出した。PH
5の50mlの0.01M酢酸ナトリウム緩衝液を次に
加えて基質溶液を与えた。 e チロキシン抗体規準 ヒト血清を含んでいる水性媒体中で0ng/
ml、30ng/ml、60ng/ml、120ng/ml及び
240ng/mlのチロキシン濃度を与えるようにチ
ロキシン溶液を新しく製造した。 75マイクロリツトルの標準的チロキシン溶液を
20ulの0.2N水酸化ナトリウムで室温で10分予備
処理した。100マイクロリツトルの抗体及び300ul
のチロキシン−S−ペプチドでラベル付けされた
分析物溶液を次に加え、そして混合物を室温で30
分間培養した。1.8mlの基質及び100μのS−蛋
白質からなる混合物を次に加えた。5分間培養し
た後に、螢光性の増加速度を10分間にわたつて監
視した。 自動的20試料チエンジヤー(モデル047−
67059)を備えたAmincoRフイルター螢光計(モ
デルJ4−7440)を、325nmの励起及び440nmの放
射で用いた。データ点は自動的データ採取システ
ムにより0.5及び10分の時に各試料に対して採取
された。表7に結果をまとめる。 【表】 【表】 上記のデータは、結合されているラベル付けさ
れた分析物の置換がチロキシン分析物の濃度の増
加につれておきるということを示している。置換
曲線を得るためには、2ケ所の点に対するデータ
を平均し、そして%結合分数(%B/Bp)を下
記の式から計算する: B/Bp×100=合計速度−速度Bo/合計速度−速度B
p 〔速度Boは0でない基準に相当する速度であり、
そして速度Bpは0基準溶液に相当するものであ
る〕。 結果を下表8に示す。 【表】 上記のデータは対照置換曲線を作成するために
使用でき、そこでは速度、%B/Bp又はロジツ
ト変形が標準濃度の函数としてプロツトされてい
る。 実施例 この実施例は、比色計基質を遠心急速分析器と
共に使用する場合の未知の濃度の分析物チロキサ
ンの測定用の対照置換曲線の作成を説明する。 下記の試薬を使用した: a チロキシンS−ペプチドでラベル付けされた
分析物:実施例〜に記されている方法で製
造された物質をPH5.0の0.1M酢酸ナトリウム緩
衝液で1:400の率で希釈した。 b 抗体:抗血清をPH5.0の0.1M酢酸ナトリウム
緩衝液で1:300の率で希釈した。 c 基質:ウリジン3′−α−ナフチルホスフエー
ト。 d S−蛋白質S−蛋白質:Sigma精製された高
業用物質を0.1M酢酸ナトリウム緩衝液中で2.5
×10-6Mとした。 e 染料:ジアゾ−p−スルフアニル酸の1,5
−ナフタレンジスルホン酸安定化塩(25mg)を
1mlの0.1N HCl中に溶解させた。 f 標準物:0、40、80、120及び200ng/mlの
濃度のチロキシン標準物をヒト血清含有溶液中
で製造した。 下記の調整値をCentrifi ChemR500遠心急速分
析器に対して使用した:ローター温度、30゜;フ
イルター、520nm;To、10秒;t、2分;
ABS1.0u;ブランク、ホールド;試験方式、
Term;プリントアウト、ABS;濃度係数0;試
験コード0。 標準物(20μ)、抗体及びポリペプチドでラ
ベル付けされた分析物をピペツトで転移デイスク
のみぞを3〜14の試料井戸中に加えた。5μの
染料、300μの基質、及び20μのS−蛋白質の
混合物を対応する試薬中に10ulの酢酸塩緩衝液と
共にピペツトで加えた。充填されている転移デイ
スクをローター上に置き、そして装置を回転させ
た。吸収の読みを2分間隔で10分間にわたつて行
ない、そしてこれらをCentrifi ChemRデータ採
用方式により示した。これらのデータを最少2乗
法回帰分析により速度(a.u./min)に転化した。
表9はデータをまとめたものである: 【表】 各標準濃度に関しての吸収対時間のプロツトを
第1図に示す。速度増加すなわち増加する標準濃
度での曲線の傾斜、はチロキシンによる抗体から
のチロキシン−S−ペプチドでラベル付けされた
分析物の置換を説明する。またデータの直線性も
優れており、相関係数は0.9995以上である。対照
置換曲線は上記のデータから容易に得られる。 第2図は速度対標準物の濃度のプロツトを示
す。速度データは実施例に記されている如く
%B/Bpにも転化できる。第3図は%B/Bp対
標準濃度の対数のプロツトを示している。 表9中のデータは標準濃度における変化に対し
満足のいく速度応答を反映しているが、実際の商
業的試験用には表9から誘導されるものより実質
的に大きい動的応答を供することが一般的にさら
に望ましいであろう。特に0標準及び200ng/ml
標準の間の速度応答は3.5m.a.u./minであり、そ
して約10.0m.a.u./minの値が好適である。 種々の試薬の濃度の適切な考察により、動的応
答範囲が強化できる。 実施例 この実施例はチロキシンでラベル付けされた分
析物及びS−蛋白質の相互転化を説明し、そこで
はS−蛋白質を試料井戸中にピペツトで加え、そ
してラベル付けされた分析物を試薬井戸中にピペ
ツトで加え、それは逆のとりそろえが使用された
前の実施例とは対照的である。さらに、この実施
例は自動的ピペツター(Centrifi ChemRモデル
P−500ピペツター)を用いる転移デイスクの試
料及び試薬井戸中への直接的ピペツト添加用の2
種の試薬溶液の調合を説明する。第三に、この実
施例は、抗体及びS−蛋白質の濃度を増加させる
ことにより実施例で得られたものに比較して
の動的範囲の強化を説明する。 下記の試薬を使用した: a チロキシン−S−ペプチドでラベル付けされ
た分析物:実施例〜に記されている方法で
製造された物質をPH5.0の0.1M酢酸ナトリウム
緩衝液で1:50の率で希釈した。 b 抗体:抗血清をPH5.0の0.1M酢酸ナトリウム
緩衝液で1:30の率で希釈した。 c 基質:ウリジン3′−(α−ナフチルホスフエ
ート) d S−蛋白質:Sigma精製された商業用物質を
0.1M酢酸ナトリウム緩衝液中で6×10-6Mに
した。 e 染料:実施例の如きもの。 f 標準物:実施例の如きもの。 500μの基質、100uの染料、及び250uの
接合物(コンジユゲート)の混合物を製造した。
(試薬A)。 300μの抗体、試薬、300μのS−蛋白質及
び150μの0.1N酢酸ナトリウム緩衝液を一緒に
することにより第二の溶液(試薬B)を製造し
た。 試験用には下記の案を利用した;標準物(20μ
)及び65μの脱イオン化H2OをP−500ピペ
ツターの試料プローブにより転移デイスクの試料
井戸に分配させた。試薬B(50μ)をピペツタ
ーの第二の試薬プローブを用いて試薬井戸に分配
させた。試薬A(250μ)をピペツターの最初の
試薬プローブを用いて転移デイスクの試薬井戸に
分配させた。全部で3回のピペツト操作を同時に
1サイクル中で行なつた。転移デイスクを次に分
析するためにCentrifi ChemR400上に置いた。
Centrifi ChemR用には下記の調整値を使用し
た:温度、30゜;フイルター、520nm;To、10
秒;T、2分;Abs、3.0u;ブランク、ホール
ド;試験方式、Term;プリントアウト、Abs;
濃度係数、0;テストコード、0。下記のデータ
が得られた。 【表】 これらのデータは表9中のものと比較して強化
された動的範囲を示す。ここでは0〜200(ng/
ml)の標準的濃度範囲を包括する速度のひろがり
は、12ミリ吸収単位/分であり、それは実施例
で得られたものの約4倍大きい。さらに、デー
タはある面で診断キツトの実用的デザインに比較
的良く適している試薬混合物の調合も説明してい
る。さらに、この実施例は1個のピペツトサイク
ルを利用する商業用遠心急速分析器を伴なう自動
的ピペツターの使用を説明する。 実施例に説明されている様に、表わされて
いるデータから対照曲線を作成できる。 実施例 この実施例はCentrifi ChemR500遠心急速分析
器に対するジランチン分析物用の対照置換曲線の
作成を説明する。比色計基質である5′−O−アセ
チル−ウリジン−3′−(4−メチルウンベリフエ
ロン−7−イルホスフエート)を使用した。 下記の試薬を製造した: a ジランチン−S−ペプチドでラベル付けされ
た分析物:0.1Mトリエタノールアミン
(TEA)−HCl緩衝液中の、実施例〜に記
されている方法で製造された物質を使用した。 b 抗体:抗ジランチン抗血清をPH7.1の0.1M
TEA−HCl緩衝液で1/20の率により希釈し
た。 c 基質:17mgの5′−O−アセチル2′−O−(テ
トラヒドロピラン−2−イル)ウリジン3′−
(4−メチルウンベリフエロン−7−イルアン
モニウムホスフエート)を750μの0.05N
CHlに加え、そして室温で30分間撹拌した。酢
酸ナトリウム緩衝液(1.880ml、0.1M、PH5.0)
を加えた。使用直前に、300μのこの溶液を
5.094mlのPH7.1の0.1M TEA−HCl緩衝液と一
緒にした。 d S−蛋白質:Sigma精製商業用物質をPH7.1
の0.1M TEA−HCl緩衝液で1:100の率によ
り希釈して1.53×10-6Mの濃度を有する溶液を
与えた。 e ジランチン標準:5,5−ジフエニルヒダン
トインナトリウム塩(Sigmaロツト64C−
0027)の貯蔵溶液を、48mgの1の0.025N水
酸化ナトリウム中に溶解させることにより、製
造した。これを0.025N水酸化ナトリウムで
1:10の率により希釈して4.8ug/mlを有する
溶液を与えた。これをさらに希釈して、19.1、
47.8、95.8、143.6及び191.5ng/mlの濃度を有
する標準溶液を与えた。 Centrifi ChemR500遠心急速分析器は下記の装
置調整値を有していた:ローター温度、30゜;フ
イルター、340nm;To、10秒;T、1分;
ABS1.0u;ブランク、ホールド;試験方式、
Term;プリントアウト、ABS;濃度係数、0;
試験コード0。 抗体、ジランチン−S−ペプチド及び16.6μ
の標準溶液を転移デイスクのみぞ3〜16の試料井
戸の中にピペツトで加えた。S−蛋白質及び
300μの基質を転移デイスクの対応する試薬井
戸のそれぞれの中にピペツトで加えた。転移デイ
スクをローター上に置きそして回転させた。吸収
の読みを1分間隔で5分間にわたつて測定し、そ
してCentrifi ChemRデータ採取単位により示し
た。触媒活性速度(a.u./min.)が吸収の最少2
乗法回帰分析から時間の函数として得られた。 データを下表11にまとめる。 【表】 第4図は速度対標準ジランチン濃度のプロツト
を示している。パーセント結合分数(%B/Bp)
も実施例の如く計算された。第5図は標準濃
度に対するパーセント結合分数のプロツトを示し
ている。第5図の対照置換曲線は、データのロジ
ツト/ロツグ転換の使用により直線化できる。直
線化された第5図の置換曲線を第6図に示す。 第4,5及び6図に示されているデータは大き
さが一つのオーダにわたるジランチンに対する広
い範囲の感度を与える。しかしながら、この濃度
範囲はヒト血清で普通あらわれるものより小さ
い。その結果、血清試料はここに誘導されている
対照置換曲線を用いることにより測定するために
は希釈しなければならない。 実施例 XI この実施例では臨床試料を直接試験できる試験
の構想、(Centrifi ChemR500)遠心急速分析器
に付いている自動的ピペツター(モデルP−500)
の使用、及び自動的データ類別の使用を説明す
る。 下記の試薬を使用した: a ラベル付けされた分析物:実施例〜に記
されている方法で製造された、0.1Mトリエタ
ノールアミン(TEA)−HCl緩衝液中の、ジラ
ンチン−S−ペプチドでラベル付けされた分析
物を使用した。 b 抗体:抗−ジランチン抗血清(150μ)を
900μのPH7.1の0.1M TEA−HClで希釈した。 c 基質:5′−O−アセチル2′−O−(テトラヒ
ドロピラン−2−イル)ウリジン3′−(4−メ
チルウンベリフエロン−7−イルアンモニウム
ホスフエート)(6.4mg)を285.2μの0.05N
HClに加え、そして室温で30分間撹拌した。次
に酢酸ナトリウム緩衝液(714.8μ、0.1M、
PH5.0)を加えた。 d S−蛋白質:Sigma S−蛋白質の12.3×
10-5M溶液を0.1M TEA−HCl緩衝液(PH7.1)
中で製造した。 e ジランチン標準物:5,5−ジフエニルヒダ
ントインナトリウム塩(Sigmaロツト64C−
0027)をヒトの血清中で2.5、5.0、10.0、20.0
及び30.0ug/mlの濃度で製造した。 16μのS−ペプチドでラベル付けされた分析
物、10uのヒトの血清アルブミン、1430μの
TEA−HCl緩衝液及び(c)に記されている基質溶
液の混合物を製造した(試薬1と称する)。150μ
の抗血清、50μのS−蛋白質及び1937.5uの
TEA緩衝液からなる第二の混合物を製造した
(試薬2と称する)。Centrifi ChemRP−500自動
的ピペツターを用いて4uの適当な基準溶液を
同時に45μの脱イオン化されたH2Oで希釈しそ
して転移デイスクの試料井戸の中にピペツトで加
えた。同時にピペツターは250μの試薬1を試
薬井戸の中にそして100uの試薬2を試料井戸
の中に分配させ、Centrifi ChemR500遠心装置の
要素は、試験コード29を用いたこと以外は、実施
例のものと同一であつた。これはCentrifi
ChemR500装置のマイクロプロセツサーユニツト
により自動的なデータ類別を与えた。 下記のデータが得られた。 【表】 マイクロプロセツサーユニツト中に貯蔵されて
いるロジツト−ロツグ基準曲線は、7.4の%標準
偏差を有していた。一般に貯蔵されている曲線か
ら誘導される計算された標準濃度は表12に示され
ている如く分析物の濃度範囲にわたつて実際の標
準濃度と満足のいくように合致した。 上記の案を対照用及び臨床用の両者の試料の直
接的試験用に使用できる。例えば、気体液体クロ
マトグラフイ(glc)測定を基にして23.4ug/ml
のジランチン濃度を有する臨床的試料が上記の対
の試験により23±.7ug/mlの濃度を有している
ことが見出された。同様にglcにより2.0ug/mlの
濃度を有する臨床用試料が3.1±.1ug/mlの濃度
を有していることも見出された。このことは臨床
用試料において予想される分析物濃度範囲にわた
る良好な正確さ及び感度を示している。さらにデ
ータは自動的ピペツト添加及びデータ類別に対す
る試験の適合性を示しており、従つて使用した遠
心急速分析器システムの全能力の利点を利用して
いる。最後に、データは抗体、S−蛋白質及びジ
ランチン−S−蛋白質でラベル付けされた分析物
の濃度を、P−500ピペツターにより自動的に実
施されるものより良好に、あらかじめ希釈するこ
となく臨床用試料の直接測定ができるように調節
できることを示している。 実施例 XII この実施例は二重抗体固相方法の使用によるジ
ランチン分析物及びS−ペプチドでラベル付けさ
れたジチンチン分析物の抗体で結合された部分の
分離を説明し、そして遊離状の(結合されていな
い)相の投薬量応答触媒活性も示す。対照用血清
の分析物濃度の測定用の螢光発生基質として5′−
O−アセチルウリジル−3′−(4−メチルウリジ
ル−3′−(4−メチルウンベリフエロン−7−イ
ル)ホスフエートを使用する触媒活性測定から、
標準置換曲線を作成する。従つてこれらのデータ
は不均質方式試験を例示している。 下記の試薬を製造した: a ジランチン−S−ペプチドでラベル付けされ
た分析物:TEA−HCl緩衝液中のラベル付け
された分析物を実施例〜中に記されている
方法で製造し、120μを2860uのTEA−HCl
緩衝液で希釈した。 b 抗体:抗−ジランチン抗血清(300μ)を
1800uのTEA−HCl緩衝液で希釈した。 c 固相の固定された第二抗体:50mgのBio−
Rad IMMnNOBEADTM、Lot 17003、を50ml
のTEA−HCl緩衝液を用いて復元した。 d 基質:35mgの5′−O−アセチル−2′−O−
(テトラヒドロピラン−2−イル)ウリジル−
3′−(4−メチルウンベリフエロン−7−イル)
アンモニウムホスフエートを1.5mlの0.025M
HClを用いて40分間にわたり室温で封鎖除去
し、そして5mlのエーテルで2回抽出した。残
存エーテルを空気流により除去し、そして酸性
溶液を酢酸塩緩衝液で緩衝して100mlとした。 e 酢酸塩緩衝液:酢酸ナトリウム緩衝液、
0.1M、PH5.0。 f TEA−HCl緩衝液:トリエタノールアミン
−HCl緩衝液、0.05M、PH7.5。 g ジランチン標準物:5,5−ジフエニルヒダ
ントインナトリウム塩の溶液をヒト血清中で実
施例XI中の如くして2.5、5.0、10.0、20.0、
30.0及び40.0ug/mlの濃度で製造した。 h S−蛋白質:Sigma精製された溶液を酢酸塩
緩衝液中で1/20に希釈した。 適当なジランチン標準物(それぞれ8ul)を、
0ug、2.5ug、5ug、10ug、20ug、30ug標準
物としてマークされている二重試験の試験管中に
ピペツトで加えた。100ulの抗体部分を標準物の
各二重検定管中にピペツトで加え、そして生成し
た混合物を撹拌しそして室温で20分間培養した。
それぞれ100ulのジランチン−S−ペプチドでラ
ベル付けされた分析物部分を次に全試験管中にピ
ペツトで加えた。生成した混合物を室温で20分間
培養した。 TEA−HCl緩衝液(108ul)及びジランチン−
S−ペプチドでラベル付けされた分析物(100ul)
を総合的にラベル付けされている二重検定管中に
ピペツトで加えた。生成した混合物を撹拌により
混合し、そして室温において20分間培養した。 次にそれぞれ500ulの第二の抗体溶液を総合的
試験管以外の全ての管中にピペツトで加えた。
TEA−HCl緩衝液(500ul)をピペツトで総合的
試験管中に加えた。生成した混合物を撹拌により
混合し、そして室温で60分間培養した。総合的以
外の全ての試験管を3000−pmで5〜10℃におい
て5分間遠心した。 各管の上澄み液(遊離相)を対応してマークさ
れてある新しい管中に移した。固相を各管中で
0.5mlのTEA緩衝液で再懸濁させ、そして上記の
如く遠心した。上澄み液を傾斜させた。 投与量応答触媒活性を以下の如く測定した。 遊離相及び総合の部分試料(それぞれ50ul)を
それぞれ1.8mlの基質及び50ulのS−蛋白質を用
いて、混合物が325nmにおいて励起されたときの
440nmにおける放射によりフアーランドマーク1
(Farrand Mark1)螢光計を使用して測定して試
験した。 データを下表13にまとめる。もとのデータは改
変されたロツグ−ロジツド・アルゴリズムにより
合わせられ、そこでは無限の及び0標準濃度にお
ける速度は反復方法により得られる。表中の各デ
ータ点は二点の平均を表わしている。 【表】 表中のデータにより分析物濃度の範囲にわたる
許容できる標準曲線を作成される。
合物の分析に関するものであり、そしてより詳し
くはある種の新規なラベル付けされた分析物及び
そのようなラベル付けされた分析物を用いる分析
方法に関するものである。 種々の臨床目的、例えば投薬スケジユールの監
視(モニター)、ホルモン水準の監視、最近の食
物摂取又は生物有効性のその後の薬理学的動力
学、吸収、分解又は排泄の検査のためには、種々
の薬などの濃度をナノモルもしくはピコモル水準
で測定することが非常に有利である。周知の如
く、放射線免疫検定(試験)によりこの分析を実
施できる。分析を行なうためには、認容できるキ
ツト又はシステムは抗血清、標準もしくは既知の
濃度の測定しようとする化合物(すなわち分析
物)、測定しようとする化合物の放射線ラベル付
きの誘導体及び1種もしくはそれより多い緩衝剤
を含有していなければならない。抗血清は、例え
ば測定しようとする化合物に対応するハプテン−
蛋白質接合体(インミノジエン)を接種をして、
免疫にされている動物の採血により製造される。 周知の如く、放射線免疫試験は一般に、放射能
でラベル付けされた分析物とラベルの付いてない
分析物の間の、抗血清中の抗体上の部位の結合競
争を測定する。抗血清に既知量の試験しようとす
る分析物及び放射ラベル付きの類似体を加えるこ
とにより、結合又は遊離状分析物対分析物濃度に
ついての投薬量−応答曲線が設定される。この免
疫−目盛り定めを行なつた後に、未知の濃度を次
に検定するため標準投薬量−応答曲線と比較する
ことができる。この型の検定で重要なことは非放
射性分析物と効果的に競争する放射性分析物が存
在するということである。従つて、試験の最大の
精度、正確性、感度、特異性及び再現性を得るた
めには、精製された良く特性の決められている合
成放射性の分析物が必要である。 放射線免疫試験方法ではいくつかの欠陥が確認
されている。第一に遊離状の放射ラベル付き分析
物から抗体結合された放射ラベル付き分析物を物
理的に分離することが必要である。さらに、この
方法はどちらかといえば労力がかかると考えられ
ており、そして必要な装置にも同様に比較的費用
がかかり、均質に入手できず、しかも該試験を正
確に実施するためには高度に訓練された専門技術
者の使用を必要としている。同様に、放射性同位
元素ラベル付き分析物は比較的不安定であり費用
がかかり、しかも一般に使用されている放射性同
位元素ラベルに伴なう放射線露呈の危険性に起因
する増々厳しくなる排物廃棄問題を呈する。これ
らの欠点にもかかわらず、放射線免疫試験の使用
は相当増えている。 しかしながら、臨床研究での放射線免疫試験の
使用における最近の相当な成長は、ここに記され
ているような放射線免疫試験方法の欠点を克服す
る変法の開発に刺激を与えている。これらの欠点
を克服するために開発された処理方法は、放射性
同位元素ラベルの代りに酵素又は螢光ラベルを、
好適には物理的分離のための条件を省くようなラ
ベルの付いた分析物の結合された部分及び遊離状
部分の間の化学的差違を測定できるような条件と
組み合わせて、使用することを主として包含して
いる。後者の簡単さ及び有利な特徴を有する免疫
試験は、物理的分離を必要とする不均質免疫試験
と対照的に均質免疫試験と称されている。 従つて、抗体との複合化が生じるときにラベル
の酵素活性を減じられるような酵素でラベル付け
された分析物の使用に基いている均質な免疫試験
システムが開発された。それの濃度を測定しよう
とするラベルの付いていない分析物が、抗体と結
合している酵素でラベル付けされた分析物と置換
し、その結果酵素活性の増加を生じる。増加した
酵素活性(酵素活性の結果として独特の発色団を
最終的に生成する“基質”と称されているものを
用いて分光光度計により監視されている)を増加
した分析物濃度に対してプロツトすると、標準的
置換又は投与量−応答曲線が作成される。これら
を次に未知の分析物濃度の測定用に使用する。均
質酵素免疫試験分野では下記の米国特許が発行さ
れている:3817837;3852157;3875011;
3966556;3905871;4065354;4043872;
4040907;4039385;4046636;4067774;4191613
及び4171244。これらの特許では、分析物のラベ
ルは実質的に5000より大きい分子量を有する酵素
であると記されている。この技術の商業化は、分
析物が10-10Mより大きい分析物の流体濃度にお
いて比較的小さい分子寸法であるような用途にだ
け限られている。これらの制限は、大きいポリペ
プチド分析物から誘導された普通使用されている
酵素ラベルは抗分析物抗体との結合により抑制さ
れないという事実から生じる。また、感度制限は
酵素活性から生じる螢光計によるレポーター分子
のないこと及び例えば内因性酵素の如き低濃度の
血清障害の存在から生じる。さらに、酵素ラベル
は再現性のあるようにしかも満足のいく純度で製
造することが難かしい。 上記の均質酵素免疫試験技術の制限のために、
感度のより大きな螢光を用いる均質免疫試験の開
発に向かつて相当な努力が払われてきた。それら
は主として例えば免疫グロブリンの如き比較的大
きい寸法の分子又は例えばインシユリンの如きポ
リペプチドホルモンの検定に関している。下記の
米国特許がこの型の試験用に発行されている:
3998943;3996345;4174384;4161515;4208479
及び4160016。これらの特許のほとんどのラベル
は分析物又は抗体と結合している芳香族螢光分子
を包含している。螢光消光の程度が試料中の分析
物の量に関係するように、すべてが同様に抗体又
は他の螢光消光剤による種々の螢光消光方法を含
んでいる。これらの方法に基く検定は多分、満足
のいくように精製された螢光ラベル付き抗体又は
分析物又は関連の消光剤ラベルの付いた物質種の
製造の難かしさのために商業化されていなかつ
た。また、血清中のバツクグランド螢光並びに血
清の誘導する消光が生じるかもしれない。さら
に、該方法は酵素増幅されていないため、満足の
いく感度ということには問題があるかもしれな
い。 免疫試験の型に関して容易に分類できないよう
なこの分野のさらに他の米国特許には、
3935074;4130462;4160645及び4193983が包括さ
れる。米国特許4160645中に示されている方法は
ラベルとしての電子転移触媒の使用を包含してい
る。触媒(ラベル)は抗体との結合により脱活性
化される。 抗体を製造するために使用されるハプテン接合
物の製造に関するその他の米国特許には、
3884898;3843696;4045420;3888866;
3917582;4025501;4043989;4058511;
4069105;4123431及び4186081が包括される。こ
れらの特許の全ては分析物誘導体及び対応するポ
リペプチド接合物に関しており、ここでポリペプ
チドは抗原性でありそして5000〜106の範囲内の
分子量を有する。例えばアルブミン及びグロブリ
ンの如き蛋白質が特に示されている。 また、均質酵素免疫試験用の予備処理方法も提
唱されている。この分野の米国特許には、
3856469;4056608及び4121975が含まれている。 反応物でラベル付けされた螢光免疫試験として
記されている他の型の方法は、螢光性生成物が酵
素で加水分解されているときには該生成物が放出
されるように設定されている螢光でラベル付けさ
れた分析物の使用を包含している。しかしながら
分子の分析物部分に対する抗体が酵素の加水分解
を抑制する。従つて、質量作用の法則により、置
換された螢光ラベル付き分析物の酵素的加水分解
のために増加した分析物の存在下では螢光は強化
される。例えば、ラベル付き分析物はβ−ガラク
トシル−ウンベリフエロン−シソマイシンであ
る。酵素β−ガラクトシダーゼはウンベリフエロ
ン部分から糖を分裂させ、そこでこれは螢光を発
し得ることとなる。この方法を記している刊行物
には、J.F.Burd、R.C.Wong、J.E.Feeney、R.J.
Carrico及びR.C.Boguolaski、Clin.Chem.23、
1402(1977);Burd、Carrico、M.C.Fetter等、
Anal.Biochem.、77、56(1977)及びF.Kohen、
Z.Hollander及びBoguslaski、Jour.of Steroid
Biochem.11、161(1979)が包括される。 さらに別の型の均質非同位元素免疫試験は米国
特許4213893中に開示されており、それは助因子
でラベル付けされた分析物を使用する。これは分
析物をNAD(すなわちニコチンアミド−6(2−
アミノエチルアミノ)−プリンジヌクレオチド)
の誘導体と結合させることによる分析物のラベル
付けを包含している。ラベル付けされた助因子は
分析物としてのエストリオールの環化反応におい
てデヒドロゲナーゼ(例えばアルコールデヒドロ
ゲナーゼ、マレートデヒドロゲナーゼ、すなわち
ADH、MDH)との反応性を保有している。最
終的に、これらの反応で生成したNADPHを螢
光計により監視し、そしてそれが環化速度の尺度
となる。NADPHはエストリオール抗体存在下
ではラベル付けされた助因子の複合体化により還
元する。従つて、環化速度はエストリオールの量
と直接関連があり、そしてエストリオール量の増
加につれて直線的に増加することが見出されてい
る。これはF.Kohen、Z.Hollander、F.Yeager、
R.J.Carrico及びR.C.Boguolaski、67〜79頁、
“Enzyme−labeled Immunoassay of
Hormones and Drugs”、編集S.B.Pal、Walter
de Gruiter、ベルリン及びニユーヨークによる
1978年の刊行物中に記されている。同様なシステ
ムは環化用酵素として乳酸デヒドロゲナーゼ及び
ジアホラーゼを用いるビオチン及び2,4−ジニ
トロフルオロベンゼン分析物に関して記されてい
る(R.J.Carrico、J.E.Christner、R.C.
Boguolaski及びK.K.Young、Anal.Biochem.72、
271(1967))。その方法は体液に共通の内因性助因
子及び減成用酵素により妨害を受けることが指摘
されている(M.J.O′Sullivan、J.W.Bridges及び
V.Mark、Annals of Clinical Biochemistry、
19、221(1977))。 さらに別の型の免疫試験技術はラベルとして酵
素調節剤、すなわち酵素阻害剤又はアロステリツ
ク奏効体を使用する。多数の酵素調節剤がそれら
の個別酵素と共に米国特許4134792中に挙げられ
ている。個々の抗体が酵素調節剤でラベル付けさ
れた分析物と結合するときには、酵素調節剤は培
養混合物中の酵素の活性をもはや阻害できないか
又はその他の影響を与えることができない。従つ
て、遊離状分析物による酵素調整剤ラベル付けさ
れた分析物の置換は酵素調節剤の阻害又はアロス
テリツク効果を回復させる。 ケミカル ラバー カンパニーにより1980年に
発行されたEdward T.Maggioにより編集されて
いる“Enzyme Immunoassay”という題の最近
の論文では、105〜134頁の“Principles of
Homogeneous Enzyme−Immunoassay”とい
う題の章は、ヒト免疫グロブリンG.用の酵素ラ
ベルとしてのリボヌクレアーゼAの使用を言及し
ている。詳細事項は与えられないが、著者は、リ
ボヌクレアーゼAは蛋白質均質酵素免疫試験にお
いてラベルとして使用する可能性を有すると結論
付けている。しかしながら、著者はまた、残念な
ことにリボヌクレアーゼAの偏在性が血清試験中
の内因性酵素からの重大な干渉の可能性を有しそ
して工程の実用性を限定していることも記してい
る。 さらに、リボヌクレアーゼの構造及び性質の研
究が相当行なわれている。例えばリボヌクレアー
ゼの触媒活性を監視するためにこれまでに多くの
有機化合物が使用されてきている。一般的に称さ
れているそのような有機化合物又は基質は、天然
基質により表わされるものと同一もしくは同様な
構造的拘束を示すリボ核酸自身、環式りん酸塩ジ
エステル及びモノリボヌクレオチド化合物を包括
している。 リボヌクレアーゼ活性を動力学的に監視するた
めにはさらに他の化合物も使用されている。その
ような化合物には、1−ナフトール、5−ヒドロ
キシナフトール及び1−4メトキシフエノールの
3′−ウリジル酸ホスホジエステルが含まれる、H.
Rubsmen、R.Khandler及びH.Witzel(Hoppe−
SaylerのZ.Physiol.Chem.355、687(1974))。しか
しながら、加水分解生成物は紫外線範囲内で直接
監視され、これはノナモル又はピコモル範囲での
分析に対して十分感受性でなく、そして臨床試料
に由来する干渉が起きるかもしれない。さらに、
これらの基質の製造は長いクロマトグラフイ工程
を含む多数の段階を必要とするため製造が困難で
ある。 また、リボヌクレアーゼのポリペプチド断片へ
の分裂も研究されている。例えば牛の膵臓のリボ
ヌクレアーゼ(リボヌクレアーゼA)に対するバ
クテリア性プロテアーゼであるスブチリシンの活
性が知られている。短かい20残基ポリペプチド及
び長い104残基ポリペプチドがリボヌクレアーゼ
Aの20番目のペプチド結合(アミノ末端から数え
て)における分裂の結果として生じることが見出
されている。前者はS−ペプチドと称されてお
り、一方後者はS−蛋白質と称されている(F.
M.Richards、Proc.Nat′L.Acad.Sci.U.S.44、162
(1958);F.M.Richard及びP.J.Vithayahil、J.
Biol.Chem.234、1459(1959))。この2種のポリ
ペプチドが容易に結合して非共有複合体(K=
10-8M)を形成し、それは種々の基質例えばRNA
又はシチジン2′,3′−りん酸ジエステルに対して
元の酵素であるリボヌクレアーゼAと同じ触媒活
性を保有することも同様に知られている。しかし
ながら、わかつている限りでは、この知識は免疫
試験技術の開発においては利用されていない。 均質免疫検定の分野に於けるちかごろの活動が
かなりあるということにもかかわらず、現在使用
されている技術の種々の欠点を克服できる別の開
発に対しての要望が残つている。このことは多
分、明らかに広い可能性があるにもかかわらず非
同位元素免疫検定技術が比較的商業的使用に制限
されていることから明白であろう。従つて、それ
らの良く認識された欠点にもかかわらず、単に満
足のいく代りの技術が商業的に入手できないため
に、放射線免疫試験技術が広く用いられ続けてい
る。 従つて、本発明の一目的は広範囲の分析物に広
く適用できる均質免疫試験技術を提供することで
ある。関連するもつと特定の目的は、比較的小さ
い分子量の分析物分子を用いる使用だけに限らな
い均質免疫試験技術を提供することである。 別の目的は比較的高分子量のラベルの使用を必
要としない均質免疫試験方法の提供である。関連
目的は、容易に製造でき、容易に精製されそして
比較的安定であるラベル付けされた分析物を提供
することである。 本発明の他の目的は、分光光度計又は螢光計検
出方式において、希望によりいずれの方式にも共
通する基質を用いて、操作できる均質免疫試験方
法を提供することである。 本発明のさらに別の目的は、優れた感度を得る
ことのできる均質免疫試験方法を提供することで
ある。関連するさらに特定の目的は、基質の触媒
による転換により増幅される螢光計検出方式を用
いる検定を包含している。 さらに別の目的は、商業的に入手できる自動的
分析器、例えば“遠心急速分析器”と一般に称さ
れているもの、の中で使用するのに容易に適して
いる均質免疫試験方法の提供である。 本発明の他の目的は、自動的データ類別に容易
に適応可能な均質免疫試験技術を提供することで
ある。関連するさらに特定の目的は、自動的デー
タ類別用の満足のいく投薬量応答曲線が得られる
ような免疫試験技術を提供することである。 本発明の他の目的はその方法が例えば起り得る
妨害などの如き問題を最少限にするのに充分なほ
ど柔軟性であるような均質免疫試験技術の提供で
ある。 本発明の他の目的及び利点は下記の詳細な説明
及び図面から明白となるであろう。 本発明は種々変更、別の形態にすることができ
るが、ここでは好適態様を詳細に記載する。しか
しながら、本発明を開示されている特定形に限定
しようとするものではないことは理解すべきであ
る。反対に、特許請求の範囲に記されている如き
本発明の精神及び範囲内にはいる全ての改変形を
包括しようと意図するものである。例えば、本発
明のラベル付けされた分析物は主として均質免疫
試験技術と関連して記されているが、本発明は抗
体結合された及び遊離状のポリペプチドでラベル
付けされた分析物の部分を分光光度計又は螢光計
による測定の前に分離するような不均質免疫試験
における使用にも同様に適用できることを認識す
べきである。 一般に、本発明は一方が分析物用のラベルとし
て作用しそして他方が混合物中に存在しているよ
うなポリペプチド対を使用することにより感度の
高い免疫試験方法が提供できるという発見に基い
ている。これのポリペプチドパートナーと組み合
わされたときにラベル付けされた分析物は、特定
の発色団又は螢光団基質に対する触媒活性を有す
る複合体を生成する。さらにそして重要なこと
に、そのようなラベル付けされた分析物の触媒活
性は、分析物に対する抗体の存在下で大きく阻害
される。この阻害は、増加する濃度の分析物を混
合物に加えるときに除かれる。従つて、置換曲線
を作成でき、それは触媒活性又は触媒活性の函数
を分析物濃度に関係づけ、そしてこの参照用又は
標準曲線は未知の分析物濃度の測定を可能にす
る。 満足のいく感度の良い免疫試験方法の提供能力
は以下に記載されているように、適当なポリペプ
チド対、並びに分析物と抗体との反応及びラベル
付けされた分析物とそれのポリペプチドパートナ
ーとの反応の平衡定数を含むある種の媒介変数、
並びに抗体、ラベル付けされた分析物及びポリペ
プチドパートナーの相対的濃度の選択に依存して
いる。 検定案 多種の案が本発明に関連して使用できる。一般
に、本発明の均質免疫試験方法は、(a)媒体中で(1)
分析物を含有している試料、(2)ポリペプチドでラ
ベル付けされた分析物、(3)分析物に特異的な抗
体、(4)ラベル付けされた分析物のポリペプチドと
非共有結合できて触媒活性を有する複合体を形成
するポリペプチドパートナー、(5)及び複合体の触
媒活性によりレポーター分子に転化可能な基質を
一緒にし、(b)基質からレポーター分子への転化速
度又は転化程度を測定し、そして(c)該転化速度又
は転化程度を既知量の分析物を含有する媒体中で
得られたものと比較することからなつている。物
質の添加順序は希望により変化させることがで
き、そしてある場合には培養段階を供することが
望ましい。 試験は多種の商業的に入手できる装置のいずれ
かを使用することにより有利に実施できる。例え
ば、分光光度計技術を用いて分析を行なうために
は、ユニオン・カーバイド・コーポレーシヨン製
のCentrifi ChemR400及び500急速分析器を使用
することが適していると見出されている。一般
に、この型の分析器はNorman G.Anderson、
“Analytical Jechniques for Cell Jractions
XII、A Multiple−Cuvet Rotor for a New
Microanalytical System”、Analytical
Biochemistry、28、545〜562(1969)中に記され
ている。適当な螢光計装置も同様にして商業的に
入手できる。 例に挙げた急速分析器の使用の際には、一案で
は、濃度を測定しようとする分析物、抗体、及び
ポリペプチドでラベル付けされた分析物を含有し
ている試料を分析器の転移デイスクの試料井戸中
にピペツトで加え、ポリペプチドパートナー及び
基質を転移デイスクの試薬井戸中にピペツトで加
え、必要なら混合物を試料井戸中で培養し、そし
て転移デイスクを回転させながら例えば分光光度
計技術の如き適当な手段により基質からレポータ
ー分子への転移速度を監視することによりラベル
付けされた分析物錯体の触媒活性の回復を分析す
ることを包括している。 試薬の添加順序は通常臨界的でないことに注目
すべきである。従つて、希望により、遠心急速分
析器の案に関する添加順序は変更できる。例え
ば、パートナーポリペプチド及びラベル付けされ
た分析物の添加は相互転換でき、そしてこれは検
定感度を強化させることのできるラベル付けされ
た分析物の遅れた添加に相当する。これによりピ
ペツト効率を増加させることができ、その理由は
単独試薬成分でなく混合溶液をピペツトで加える
ことができるからである。この場合、3種のピペ
ツト操作が包含される:(1)分析物試料、(2)抗体及
びポリペプチドパートナー並びに(3)ラベル付けさ
れた分析物及び基質。従つて、前記の市販の急速
分析器を用いると、一つのサイクル中で上記の3
種の操作を実施するために充分な自動的ピペツタ
ーを利用できる。 使用するなら培養段階の時間は主として分析物
の性質に依存して変化するであろう。培養する
と、分析物濃度に関係する、抗体で結合された、
及び遊離状の、ラベル付けされた分析物の平衡又
は動力学的分布をもたらす。抗体との複合体化速
度が拡散支配であるために、例えば薬又は薬代謝
物の如き小さい分析物は短かい培養時間を必要と
するが、例えばポリペプチドホルモンの如き比較
的大きい分子量の分析物は実質的に比較的長い培
養時間を必要とする。従つて、培養時間は約1分
間から約24時間程度までに変化できる。さらに、
分析物、ラベル付けされた分析物及び抗体の培養
混合物が平衡に達することは必要ない。全ての培
養混合物に対する培養時間及び対応するレポータ
ー分子生成物の生成速度の測定値が一定に保たれ
ておりそして同一であるなら、運動論的(カイネ
テイツクな)免疫検定が可能である。運動論的検
定は分析用に必要な全時間を短縮させ、そして上
記のラベル付けされた分析物及びパートナーポリ
ペプチドの相互転化を可能にする。 生成物の出現速度、すなわちレポーター分子生
成速度は、分析物の性質に依存しての分光光度計
又は螢光計により監視できる。約10-9Mより大き
い濃度で存在している分析物に対しては分光光度
計による検出が好適であり、一方低濃度水準で存
在している分析物に関しては、螢光計方法の比較
的大きい固有感度のために螢光計による検出が好
適である。逆に、比較的長い時間が許容できる場
合には例えば35分以上の比較的長時間にわたつて
速度を監視することにより、10-9M以下の濃度の
分析物に対して分光光度計による検出を利用でき
る。 本発明の代表的な検定案に従うことによりそし
て増加する既知の分析物濃度を使用することによ
り、触媒活性(例えばレポーター分子の生成速
度)の標準的すなわち参照曲線、又は分析物濃度
に対する触媒活性の函数、を作成できる。この標
準的すなわち参照曲線を次に、標準的曲線を作成
するために使用されたものと同一の条件において
レポーター分子の生成速度を測定した後に未知の
分析物濃度を測定するために使用できる。 ラベル付けされた分析物、パートナーポリペプ
チド及び抗体が試料中に一緒に存在しているとき
には、ポリペプチドでラベル付けされた分析物は
抗体又はポリペプチドパートナーのいずれかと競
争して結合できる。ポリペプチドでラベル付けさ
れた分析物がそれのポリペプチドパートナーと結
合するときには触媒活性が与えられるが、ポリペ
プチドでラベル付けされた分析物が抗体と結合す
るときには触媒活性は阻害される(すなわち現わ
れないか又は与えられない)。該システムの平衡
反応のためにそして質量作用の法則により、分析
物は抗体と結合されているポリペプチドでラベル
付けされた分析物と置換し、そしてその結果、試
料中に、それのポリペプチドパートナーと結合可
能な未結合のラベル付けされた分析物が得られ
る。従つて、分析物の不存在下では、減じられた
触媒活性が現われる。しかしながら、分析物が試
料中に存在しているなら、増加した触媒活性が生
じそれは監視できる。ラベル付けされた分析物が
抗体と結合しているときには触媒活性は減じられ
るか又は抑制されるが分析物の存在下では回復す
るため、溶液の触媒活性は試料中に存在している
分析物の濃度に直接関連するであろう。 本発明の方法は基本的には6種の反応式の考察
を包含している。どんな免疫試験技術を用いる場
合もそうである様に該方法の基礎は、ラベル付け
された及びラベル付けされていない分析物に対す
る抗体の反応(又は平衡化)速度が一般に同一で
あることである。これらの2種の反応を以下に示
す: A+AbA・Ab (1) A−PP1+AbA−PP1・Ab (2) 〔式中、Aは分析物であり、Abは分析物に対し
て特異的な抗体又はレポーター蛋白質であり、
A・Abは分析物及び抗体の反応により生成した
複合体であり、A−PP1はポリペプチドでラベル
付けされた分析物であり、そしてA−PP1・Ab
はラベル付けされた分析物及び抗体の反応により
生成した複合体である〕。 明らかに、反応(1)及び(2)の速度が一般に同一で
ないなら、競争による結合は生じないであろう。 上記の如く、試料中の分析物の存在は抗体と結
合しているポリペプチドでラベル付けされた分析
物と置換し、その結果未結合のラベル付けされた
分析物は次にそれのポリペプチドパートナーと結
合できる。後者の反応を以下に記す: A−PP1+PP2A−PP1・PP2 (3) 〔式中、A−PP1は前記の如きラベル付けされた
分析物であり、PP2はポリペプチドパートナーで
あり、そしてA−PP1・PP2は非共有触媒複合体
である〕。 非共有触媒複合体は、以下に記されている如
き、基質からレポーター分子への転化に触媒作用
を与える: SA・PP1・PP2 ―――――――――→ P (4) 〔式中、Sは基質であり、そしてPはSから触媒
により誘導されたレポーター分子である〕。 概念的に、考慮すべき他の二反応を以下に記
す: A−PP1・Ab+PP2A−PP1・Ab・PP2 (5) SA・PP1・Ab・PP2 ――――――――――――→ P (6) 〔式中、A−PP1・Abは結合されたラベル付け
された分析物であり、PP2はポリペプチドパート
ナーであり、A−PP1・Ab・PP2はラベル付けさ
れた分析物、抗体及びポリペプチドパートナーの
反応により生成した理論的な三元複合体であり、
Sは基質であり、そしてPはレポーター分子であ
る〕。 満足のいく感度を与えるためには、反応(5)にお
ける三元複合体の生成を最少にするか、又は反応
(6)に従つて三元複合体が基質を生成物に相当程度
まで触媒により転化させてはならない。換言する
と、いずれかの量の三元複合体が反応(5)で生成す
ると、相当量のレポーター分子Pが反応(6)により
生成し、反応(4)で生成したPの量は存在する分析
物の種々の量に適切に関連しないであろう。 これらの6種の反応の効果の考察においては、
抗体、ポリペプチドパートナー及びラベル付けさ
れた分析物の濃度は特定の試験では、基質からの
レポーター分子への転化において異なる量の分析
物が反映されるように選択すべきである。反応(1)
〜(3)に対する平衡定数も考慮にいれるべきであ
る。 特定の試験を計画する指針として望ましい関係
は下記の不等式により説明され、それはある種の
簡単にするための仮定を加えてある式の数学的分
析から誘導される: K3〔Ab〕/K1〔PP2〕〔A−PP1〕+K3 〔式中、K1及びK3は反応(1)及び(3)に対する平衡
定数であり、〔Ab〕は抗体の濃度であり、〔PP2〕
はポリペプチドパートナーの濃度であり、そして
〔A−PP1〕はラベル付けされた分析物の濃度で
ある〕。 この数学的分析は、K1及びK2〔反応(2)に対する
平衡定数)は同一であり、そして反応(5)及び(6)は
全く進行しないと仮定している。 K3〔Ab〕/K1という表現に関しては、〔PP2〕
より小さい1の係数よりはるかに小さい全体値
は、抗体との結合がほとんど生じないという結果
のために、分析物濃度の変化量に関してほんの最
少の応答しか与えない。換言すると、反応(3)で生
成した触媒種は分析物濃度とは独立して生成し、
その結果よくても分析物濃度にかかわりなく存在
する分析物の変化量を区別することは難かしいで
あろう。これは、反応(2)の生成物は最少量しか生
成しないからであろう。一方、抗体の濃度が高す
ぎるか又は平衡定数が上記の表現の全体値が
〔PP2〕の1000倍過剰量となるようなものである
なら、反応(3)における触媒活性種は、変化する分
析物濃度に応答するのに満足のいく量では生成さ
れないであろう。従つて、表現K3〔Ab〕/K1が
〔PP2〕の約2〜100倍、好適には約5〜25倍、で
あるように試験を計画することが一般に望まし
い。 さらに、ラベル付けされた分析物とそれのポリ
ペプチドパートナーとの反応、すなわち反応(3)、
はそれの抗体との反応、すなわち反応(2)と比べて
あまりに大程度まで進められるであろうために、
PP2の濃度が表現K3〔Ab〕/K1に関して高すぎ
るときには感度はほとんどなくなるであろう。そ
の結果、この場合も分析物濃度の変化量は満足の
いくように区別できないであろう。ポリペプチド
パートナーの濃度が表現K3〔Ab〕/K1に関して
低すぎるなら、逆の状況が起きる。分析物濃度に
関係なく、反応(3)において不適当な量の生成物が
生じるであろう。従つて、ポリペプチドパートナ
ーの濃度を、表現K3〔Ab〕/K1の値より約2〜
100倍低い、好適には約5〜25倍低い、範囲内に
保つことが一般に望ましい。 同様に、ラベル付けされた分析物の濃度及び
K3に関しては、ラベル付けされた分析物の濃度
が予期される分析物濃度のものの約10〜100倍以
内であるべきである。 本発明に従う検定の計画は一般に、典型的な免
疫試験の計画に含まれるものと同様である。本発
明に従う試験の計画例として記すと、準備出発点
は(1)包含される分析物用の適当な抗血清又は抗
体、(2)ラベル付けされた分析物A−PP1及び(3)ポ
リペプチドパートナーPP2の入手である。 A−PP1の濃度を最初に、予測される分析物濃
度のものと一般に同一に定める。次に、PP2の濃
度をK3と同一もしくはそれよりわずかに高く設
定する。ほとんどの場合、ラベル付けされたS−
ペプチド及びS−蛋白質からなるポリペプチド対
に対してはこれは約10-8Mであろう。基質Sの量
は、検出用に分光光度計方式を用いるなら毎分少
なくとも約10ミリ吸収単位の線状速度を与えるの
に充分なほど高く選択すべきである。 次に、適当にラベル付けされた分析物及び上記
で測定されたPP2濃度を用いて抗体希釈に対する
抑制率を測定して、抗体に関する一般的滴定曲線
を作成する。典型的には、抗体の濃度は約50%
(±20もしくは30%)の抑制率を与えるように選
択されるが、10%程度の低い抑制率も使用でき
る。 分析物に対する予測濃度範囲を模する標準的濃
度の分析物を製造し、そして次にあらかじめ定め
られている媒介変数と共に使用して、参照用置換
曲線を与える。この曲線は、予測濃度範囲にわた
つて適当な感度が与えられているかどうかを決め
るため試験されなければならない。 濃度範囲の比較的高い部分において比較的大き
い感度を希望するなら、これは一般に、抗体濃度
を増すことにより与えられる。以上で指針として
記されている定性的不等式を用いてどんな増加選
択量でも決めるべきである。 濃度範囲の比較的低い部分において比較的高い
感度を希望するときには、抗体濃度の減少は役立
つべきである。さらに、そして再び指針としての
定性的不等式を用いると、PP2及びラベル付けさ
れた分析物の濃度を減少させることも有用であ
る。 希望するなら、分析物(及びラベル付けされた
分析物)に対する抗体の結合及び/又はポリペプ
チドパートナーに対するラベル付けされた分析物
の非共有結合を増加もしくは減少させるように平
衡定数K1、K2及びK3を改変させることにより、
さらに細かい調整が得られる。本発明により加え
られる別の媒介変数、すなわちPP2の濃度及びA
−PP1及びPP2の反応は別の追加手段、多分全部
に対してではないかもしれないが、本発明の多用
性に寄与する細かい調整のための追加手段を、先
行の免疫検定技術の多くを越えるものとして与え
るものである。 ここで論議されている媒介変数に適切に注目す
ることにより、特定の試験が分析物濃度の変化量
に対して希望する感度を確実に得ることができ
る。 分析物 本発明の免疫試験方法は、多種の分析物の量的
存在量を測定する際に利用出来る。本発明の方法
により測定するために適している可能な分析物に
は一般に、水性媒体中に少なくとも約10-12Mの
濃度水準で存在しているか又はその中に抽出可能
である複雑な有機分子が包含される。螢光性レポ
ーター分子の存在する実際的検出限度及び抗分析
物抗体どん欲さ即ち結合力定数から濃度限界が生
じる。 実際に、本発明は今までの免疫試験を利用でき
た分析物に対して使用できる。さらに、概念的に
は、本発明はそれに対して特定のレセプターもし
くは結合用蛋白質が入手できるような分析物の濃
度を測定するために使用できる。そのようなレセ
プター又は結合用蛋白質を得ることは、例えば約
100以下の如き極端に低い分子量の分析物を用い
ると非常に難かしくなりはじめる。一方、例えば
106の如き比較的大きい分子量の分析物を用いる
と、本発明に従う分析物のラベル付けの際には触
媒活性の満足のいく抑制が確実に与えられるよう
に注意を払うべきである。 本発明の方法を利用できしかもそれ用の特定の
レセプター又は結合用蛋白質が入手できるような
分析物には例えば、薬及び薬代謝物、鎮静剤、麻
酔物、ステロイド、ビタミン、ポリペプチドホル
モンを含むホルモン、抗原を伴なう腫瘍、免疫グ
ロブリン、酵素、工業的汚染物質、農薬及びそれ
らの代謝物、食品添加物、除草剤及びそれらの代
謝物、香味剤及び食品有毒物が包括される。より
詳しくは、本発明の免疫試験方法はそれぞれの濃
度の下記の分析物の全範囲を試験するために使用
できる;約10-6M〜約10-8Mの濃度範囲(ヒト血
清中)、のジランチン、カンナビノイド、ゲンタ
マイシン、トブラマイシン、メトトレキセート、
ジジトキシン、チロキシン、テストステロン、コ
ルチソル及び免疫グロブリン;約10-8M〜約
10-9Mの濃度範囲(ヒト血清中)のトリヨードチ
ロニン、ジゴキシン、葉酸、アンジオテンシン
、プロゲステロン及びプロスタグランジン
F2;約10-9M〜約10-10Mの濃度範囲(ヒト血清
中)のエストラジオール、ビタミンB12及び成長
ホルモン;約10-10M〜約10-11Mの濃度範囲(ヒ
ト血清中)のインシユリン、パラチロイドホルモ
ン、チロイド刺激ホルモン、カルシトニン、ガス
トリン、黄体ホルモン、卵胞刺激ホルモン、グル
カゴン、ヒト絨毛膜ゴナドトロピン、及びアルド
ステロン;並びに約10-11M〜約10-12Mの濃度
(ヒト血清中)の胎生期癌抗原。 現在では、上記の分析物の大部分は不均質工程
を用いる臨床的放射線免疫試験により一般に測定
されている。本発明の免疫試験方法は前記の分析
物の全範囲を、費用がかかり、有害なそして不安
定な放射性核種ラベルの使用を必要とせずに検定
することが出来る可能性を有する。複雑なガンマ
又はシンチレーシヨン計数器の使用も同様に省略
できる。 ポリペプチドパートナー 適切なポリペプチド対は下記の機能的特徴に合
致しなければならない:(1)少なくとも一員は分析
物又は分析物類似体と共有結合できてポリペプチ
ドでラベル付けされた分析物を形成しなければな
らない、(2)ラベル付けされた分析物は抗体につき
分析物と競争するものでなければならない、(3)ラ
ベル付けされた分析物は、ポリペプチドパートナ
ーと組み合わされたときに、基質をレポーター分
子に適当な検出可能量で転化させるのに充分な触
媒活性を与える、及び(4)均質免疫試験用には、ラ
ベル付けされた分析物とそれのポリペプチドパー
トナーとの組み合わせ物により付与される触媒活
性の回復がラベル付けされた分析物の抗体との複
合体化により阻害される。 概念的には、上記の条件(3)に記されている組み
合わせ現象には酵素性蛋白質内の複数の鎖内相互
作用が伴なわれ、それは安定な三次元構造及び特
別な活性場所の生成をもたらす。大部分非共有性
であるそのような複数の鎖内相互作用は、好適に
は骨組のペプチド鎖に沿つての共有結合の不存在
下においてすら活性場所の再構成を可能にするの
に充分な一体化結合強度を有するものである。 本発明の一面に従う適当なポリペプチド対は、
種々の酵素を分裂させて2個の部分を与えること
により得られる。例えば、ブドウ球菌ヌクレアー
ゼの酵素による分裂並びにウシ、ネズミ、ヒトコ
ブラクダ及びカンガルーの膵臓リボヌクレアーゼ
の例えばスブチリシン、ペプシン及びカルボキシ
ペプチダーゼの如き種々の酵素を用いる酵素によ
る分裂により生成物が生成される。 一方、大腸菌(Escherichia coli)からのZ−
削除突然変異体菌株からのM15蛋白質の場合の如
く、適当なポリペプチド対の一方のパートナーは
突然変異体細菌株から遺伝学的に得られる。この
蛋白質はβ−ガラクトシダーゼ(CB2と称されて
いる)の小さい熱による又は臭化シアン発生部分
の存在下でβ−ガラクトシダーゼ活性を回復す
る。この現象は試験管内補足と称される。 (ウシの)リボヌクレアーゼAのスチリシン誘
導分裂から誘導されたポリペプチド対はS−ペプ
チドすなわち20アミノ酸部分、及びそれによりさ
らに複雑な104アミノ酸残基からなるS−蛋白質
からなつている。これらの部分は、リボヌクレア
ーゼのアミノ末端から数えて20番目のペプチド結
合のところのリボヌクレアーゼAの分裂から生じ
る。S−ペプチドは下記の構造を有する(F.M.
Richards及びH.M.Wyckoff、The Enzymes、
Boyer、P.D.編、3版、4巻、647〜806頁、
Academic Pressロンドン及びニユーヨーク
市): 【表】 S−ペプチド1−20、 同様に周知であるS−蛋白質は下記の構造を有
する: 【表】 S−蛋白質(21−124)。 上記のS−ペプチド及びS−蛋白質の記載で
は、簡単な略語を使用した。 種間ハイブリツドも適しており、例えばPP1は
PP2用のものとは同一でない動物種からの酵素か
ら誘導される。例えば、ヒトコブラクダ、カンガ
ルー及びネズミから誘導されるS−ペプチドもS
−蛋白質、特にウシのS−蛋白質又はヒトコブラ
クダのS−蛋白質の存在下で触媒活性を有するこ
とが見出されている。(J.A.Lenstra、J.J.
Beintema、FEBS Letters、63 89 1976;G.W.
Welling、G.Groen、D.Gakel、W.Gaastra、及
びJ.J.Beintema、FEBS Letters、40 134
1974)。これらの種のポリアミノ酸を以下に示
す: ヒトコブラクダのS−ペプチド 【表】 カンガルーのS−ペプチド 【表】 ネズミの13残基 【表】 ネズミの17残基 H Gly Gln Ser Arg Gln Ser Ser Ala Asp
Lys Phe Lys Asp Gln His Met Asp OH 前記の文献中で論じられている如く、これらの
種からのリボヌクレアーゼから誘導されたS−ペ
プチド又はS−蛋白質が本発明に従う触媒性ポリ
ペプチド対の成分として使用できるようにするの
に充分な相似性が種の間に存在している。 さらに、前記の如く、スブチリシン以外の酵素
からのリボヌクレアーゼA分裂生成物をポリペプ
チド対源として使用できる。リボヌクレアーゼA
の連続的なペプシン及びカルボキシペプチダーゼ
処理が6個のアミノ酸だけ短縮されたポリペプチ
ド鎖を与えることは周知である(RNase 1−
118)。(M.C.Lin、J.Biol.Chem.245 6726、
1970)。このポリペプチドを元のRNaseの残基
111〜124に相当する合成テトラデカペプチドと組
み合わせたときには、本質的にRNaseの完全な
触媒活性が回復される。(M.C.Lin、B.Gutte、S.
Moore及びR.B.Merrifield、J.Biol.Chem.245、
5169、1970;M.C.Lin、B.Guth、D.G.Caldi、S.
Moore及びR.B.Merrifield、J.Biol.Chem.247、
4648、1972)。 また、上記の如く、リボヌクレアーゼA以外の
酵素は酵素により分裂してポリペプチド部分を与
え、それは非共有的に再び組み合わされると触媒
活性を再取得する。ブドウ球菌ヌクレアーゼがそ
のような酵素の一例である。このポリペプチド対
は、ヌクレアーゼT−P(6-48)と称されている42ア
ミノ酸ポリペプチド及びヌクレアーゼT−
P(49,50-149)と称されている100アミノ酸残基であ
る。(H.Jamiuchi及びC.B.Anfinsen、J.Biol.
Chem.244、3864、1969)。 適当なポリペプチド対を得るための別の方法は
突然変異体微生物によるものである。例えば、上
記の如く、大腸菌のZ−削除突然変異体は、酵素
β−ガラクトシダーゼのアミノ酸残基11〜41が欠
落しているM15蛋白質と命名される蛋白を生じ
る。K.E.Langley、M.R.Villarego、A.V.
Fowler、P.J.Zamenhof及びI.Zabin
Proceedings National Academy of Science
72 1254(1975)。M15蛋白質は、正常なβ−ガラ
クトシダーゼの臭化シアン誘導分裂から誘導され
た小さいポリペプチド部分(CB2と称されてい
る)と組み合わされたときには、本質的に完全な
β−ガラクトシダーゼ活性を回復する(K.E.
Langley及びI.Zabin Biochem.15 4866(1976);
S.Lin、M.Villarego、I.Zabin Biochem.
Biophys.Research Commun.40、249(1970)。ま
たD.V.Marinkovic、J.N.Marinkovic、
Biochem.J.155、209(1976)参照)。同様に、
7400の分子量を有するオートクレーブにかけられ
たβ−ガラクトシダーゼからの小さい部分も、
M15蛋白質と混合したときにはβ−ガラクトシダ
ーゼ活性の回復をもたらす(S.L.Morrson及びD.
Zipser J.Mol.Biol.50、359頁(1970)。他の大腸
菌突然変異体蛋白質も、正常酵素の化学的に誘導
されたポリペプチド部分の存在下でβ−ガラクト
シダーゼ活性の回復の同一現象を示す。例えば大
腸菌のlacZX90突然変異体は、CNBr24と称され
ている32個のアミノ酸ポリペプチドの存在下でβ
−ガラクトシダーゼ活性を回復する蛋白質を与え
る。後者はβ−ガラクトシダーゼの臭化シアン分
裂から得られる(J.V.Welply、W.Mandeclic、
A.V.Fowler、I.Zabin、Biochem.Biophys.Res.
Commum.93、223(1980)。 CB2及びM15蛋白質の再組み合わせ用の会合定
数は1−2×109M-1であると評価されること及
びCB2に対する抗体がM15蛋白質を用いる活性の
回復を抑制することに注目すべきである。F.
Celade、I.Zabin、Biochem.18、404(1979)。従
つて、この及び関連するポリペプチド対はここに
記されている免疫試験方法で使用しようとする目
的に特に適している候補である。 好適なポリペプチド対はリボヌクレアーゼAの
スチブリシン誘導分裂から誘導され、そしてS−
ペプチド及びS−蛋白質からなつている。S−ペ
プチド及びS−蛋白質の構造はこれまでに記され
ている。S−蛋白質では、残基26−84、40−95、
58−110及び65−72の間に、ジスルフイド結合が
存在しており、それらがポリペプチドの相当なコ
イル化を生じている。これらのジスルフイド結合
が分裂されるなら、触媒活性も同様に損失される
であろう。これらの結合は従つて元の酵素のもの
に相当するS−蛋白質に対する三次元構造を与え
るのを助けている。この構造は実際に、活性場所
の回復をもたらす会合するS−ペプチド用の鋳型
を提供する。 分裂した酵素は、非共有的に再び組み合わされ
ると、元の酵素の触媒活性の本質的に全てを望ま
しくは回復すべきである。最少でも、基質な検出
可能量のレポーター分子に、媒体又は他の非特定
媒体で誘導される方法の速度より実質的に大きい
速度で転化させて、希望する感度及び正確さを与
えるのに充分な活性が回復されなければならな
い。多分10又は5%以下の如き低い触媒回復率で
も満足である。また、解離用の平衡定数は一般に
少なくとも約105そして約1011M-1より小さいも
のであるべきである。S−ペプチド、S−蛋白ポ
リペプチド対の望ましい性質の一つは、該対がほ
とんどの分析物と、再び組み合わされた改質S−
ペプチド、S−蛋白質対の触媒活性を実質的に感
じることなく、結合する多種の結合部位にある。
対中の多くのリジン残基中のエプシロンアミノ基
は、分析物又は分析物類似体のS−ペプチド又は
S−蛋白質と都合よく共有カツプリングさせるた
めの多数の部位を与える。リジン残基はS−ペプ
チド中の位置1及び7にあり、そしてS−蛋白質
中の位置31,37,41,61,66,91,
98及び104にある。さらに、各ポリペプチド
における骨組に由来する単一アルフアーアミノ基
が分析物へのカツプリング用に利用できる。さら
に、これらのポリペプチドパートナーには、結合
用場所として利用できる下記の基が含まれてい
る:カルボキシル、グルタメート、アスパルテー
ト、ヒスチジン及びチロシン。 しかしながら、S−ペプチド又はS−蛋白質構
造を例えば分析物のラベル付けの如き目的用に改
変するときには、触媒回復に対する効果を考慮に
いれるべきである。例えばアミノ基を考えると、
S−ペプチドのエプシロン−アミノ基の全部又は
一部のグアニジノ化又はアセチル化は触媒活性の
回復を相当遅延させないはずである。さらに、S
−蛋白質のリシン残基41の保護は触媒活性の保有
に関して重大であろう。例えばグアニジノ、アセ
チル、トリフルオロアセチル、ジニトロフエニル
及び種々のポリアミノ酸鎖の如き基の、種々のリ
ジン残基に対する結合は、リジン41上のエプシロ
ン−アミノ基が改変されているとき以外は、S−
ペプチド、S−蛋白質再組み合わせ対の触媒活性
を相当遅らせるものでないはずである
(Richards及びWyckoffの前記引用文献、678
頁)。従つて、エプシロン−アミノリジン基の結
合による有用なラベル付けされた分析物の生成用
にS−蛋白質を使用することは、位置41におけ
るリジン基が未修飾のままであるなら、有効であ
るはずである。 S−ペプチドの位置2及び9におけるグルタメ
ート残基又は位置14におけるアスパルテート残
基でのメチルエステル生成は、触媒活性を相当保
有する生成物を与えるはずである。しかしなが
ら、全てのカルボキシル基の完全な誘導化は、そ
れが触媒活性を完全に減じるため、避けなければ
ならない。S−蛋白質では、位置53におけるア
スパルテート残基に相当する1個のカルボキシル
基の改変は多分触媒活性を減じないであろう。 S−ペプチドの位置12及びS−蛋白質の位置
119におけるヒスチジン基は触媒活性の保有に
関して臨界的であろう。これらのヒスチジン基
は、ここで論じようとしている天然基質(RNA)
又は種々の合成ヌクレオチド基質の加水分解によ
るりん酸エステル結合分裂を促進する求核種とし
て触媒位置内で良く関与していると信じられてい
る。ポリペプチド部分中のヒスチジン基の改変は
触媒活性の完全損失を生じるであろう。従つて、
アルキル化又はジアゾニウム塩反応によるヒスチ
ジン残基の改変は多分避けなければならない。 分析物との結合がポリペプチドラベル上の官能
基の一部の改変又は誘導化のための主な理由であ
るが、これは他の理由のためにも望ましいという
ことは認識すべきである。例えば、生成したラベ
ル付けされた分析物の負荷に影響を与えるためポ
リペプチドラベルを修飾することが有用であり得
る。従つて、一例として、S−ペプチドのエプシ
ロン−アミノ基の全て又は一部のグアニジノ化は
酸性のより少ないラベル化された分析物を与える
であろう。このことは検定感度を強めるための抗
体及びS−蛋白質の間の競争平衡を変化させる一
方法を提供する際の助けになる。 リボヌクレアーゼAの分裂から誘導されるS−
ペプチド、S−蛋白質ポリペプチド対以外のポリ
ペプチド対も、本発明で使用するために適してい
る。そのような対は望ましい接触活性を与えるよ
うな方法で再び組み合わせられるであろう。特
に、ある種のポリペプチドはS−蛋白質とそのよ
うに再組み合わせすることが見出されている。そ
のような対には例えば、S−ペプチドの残基1〜
13及び2〜13からなるポリペプチドが含まれる。
また、下記のポリアミノ酸がS−蛋白質用の有用
なポリペプチドパートナーであるはずである:1
又は2〜14;1又は2〜15;1又は2〜16;1又
は2〜17;1又は2〜18;1又は2〜19、及び1
又は2〜20(F.M.Finn及びK.Hotmann、
Accounts of Chem.Research、6、170(1973))。 さらに、ラベル付けされた分析物の生成用に使
用できる広い範囲の合成S−ペプチド類似体があ
る。そのような類似体はS−蛋白質の存在下で触
媒活性を示しそして分析物に対するカツプリング
用に適する官能基を与えるべきである。従つて、
文献に鑑みて、S−ペプチド沿いのある種の残基
が他のアミノ酸と置換でき、そしてS−蛋白質の
存在下で依然として望ましい触媒活性を与えるで
あろう。例えば、リジン又はオルニチン残基は位
置10においてアルギニンと置換できなくてはな
らない(A.Rochi、F.Marchiori、L.Maroder、
A.Fontana及びE.Scoffone、Gazz Chim.Ital.96、
1537、1966)。10−オルニチン置換されたペプチ
ドは位置4及び5において、これらの位置におけ
るアラニン残基の代りにセリン残基により置換さ
れていることもできるはずである。(L.Maroder、
A.Rochi、F.Marchiori、A.Fontana及びE.
Scoffone、J.Amer.Chem.Soc.91、3921、1961)。
同様に、チロシン残基は同じオルニチン置換され
たポリアミノ酸中で8位置におけるフエニルアラ
ニンと置換されていることもできるはずである。
(R.Rochi、L.Meroder、F.Marchiori、E.
Ferrarese、及びE.Scoffone、J.Amer.CHem.
Soc.90、5885、1968;F.Marchiori、R.Rochi、
L.Maroder、及びE.Scoffone、Gazz.Chim.
Ital.96、1549、1966)。 好適なポリペプチドパートナー(すなわちS−
ペプチド及びS−蛋白質)に関しては、等モル量
混合物の培養が、例えばリボ核酸(RNA)及び
シチジン2′,3′−りん酸ジエステルの如き種々の
物質に対する天然蛋白質であるリボヌクレアーゼ
Aの酵素活性の本質的に完全な回復をもたらすこ
とが見出されている。さらに、S−ペプチドでラ
ベル付けされた分析物とそれのポリペプチドパー
トナーであるS−蛋白質との再組み合わせから生
成したラベル付けされた分析物複合体が、基質で
あるモノヌクレオチド3′−ホスホジエステルに対
するS−ペプチド、S−蛋白質複合体の触媒活性
を回復することが見出されている。 ラベル付けされた分析物 機能的には、本発明で使用するために適するラ
ベル付けされた分析物は、ポリペプチドパートナ
ーに露呈されたときの触媒活性を与えるそれらの
能力により、そして結合時の触媒活性の随伴損失
を伴なう分析物に対して特定な抗体又は特定なレ
セプター蛋白質と組み合わされるそれらの能力に
より特徴づけられている。また、そのようなラベ
ル付けされた分析物が例えば製造及び使用時に遭
遇するような種々の反応条件下で種々の試薬に対
して良好な安定性を示し、そして容易に精製され
ることが望ましい。 化学的には、本発明のラベル付けされた分析物
は一般にポリペプチドパートナーの一方と化学的
に結合している分析物からなつている。ある場合
には、分析物もしくはポリペプチドパートナー又
は両者が結合を実施するために適している官能基
を含有している。分析物に対してより典型的な他
の状態では、1種以上の官能基を分子中に加える
ことにより類似体を生成することが望ましいか又
は必要である。実際に、ラベル付けされた分析物
の生成を促進するため又は望ましい触媒活性を確
実に保有させるためには、官能基が存在していて
もなお結合を実施する類似体を生成することが望
ましいか又は必須である。さらに、ある状況下で
は分析物とポリペプチドパートナーを空間的に分
離しまた結合させるための結合のための基を利用
することが適している。本発明で使用されるポリ
ペプチドラベル、例えばS−ペプチド、が酵素ラ
ベルより小さい分子である傾向がありその結果特
性の決定及び正確な構造決定が促進されるという
ことも注目すべきである。最後に、ある種の検定
では1個より多い分析物分子を単独のポリペプチ
ドラベル分子に結合させることが望ましいが、他
の試験では1個より多いポリペプチドラベル分子
を単独の分析物分子に結合させることが好まし
い。 一般に、本発明のポリペプチドでラベル付けさ
れた分析物は式 An−Xo−Zp−Yo−〔PP1〕p 〔式中、Aは分析物であり、 XはA及びZ又はYと結合している成分であ
り、Zは存在しているならX及びYと結合してい
る架橋基であり、 YはPP1及びZ又はXと結合している成分であ
り、 PP1はポリペプチドパートナーであり、 m、n及びpは1〜約8の整数であり、そして
oは0又は1〜約8の整数でありそれは通常の場
合nと同じ値を有する〕 により表わされる。 1個より多い分析物分子が単独のポリペプチド
分子と結合しているときには、ラベル付けされた
分析物は式 〔A−X−(Z)p−Y〕o−PP1 〔式中、A、X、Z、Y及びPP1は前の式中と同
じ意味を有し、oは0又は1であり、そしてnは
1より大きい整数である〕 により表わされる。一般に、nは約8より大きい
値を越えずそしてより一般的には3より大きくな
いであろう。 1個より多いポリペプチド分子が単独の分析物
分子と結合しているなら、式は A〔X−(Zp)−Y−PP1〕o 〔式中、A、X、Z、Y、PP1、n及びoはすぐ
前の式中に記されている意味を有する(すなわ
ち、1個より多い分析物分子が単独のポリペプチ
ド分子と結合している)〕 となる。 本発明のラベル付けされた分析物の製造におい
ては、m、n及びpのうちの最も小さい値が、分
析物及びラベルの両者の相当する構造決定物の破
壊を最少にするために、免疫反応性及び触媒活性
回復の両者の保持を一般的に与えている。一方、
免疫反応性又は触媒回復の抗体に基く抑制が強化
されるなら、比較的高い値が有利となり得る。最
適値は、包含される特定の試験に対して実験によ
り容易に決定できる。 多くの分析物は分子中の適当な位置に、結合可
能な1個以上の官能基を含有している。しかしな
がら、ある分析物に対しては、分析物分子に例え
ばアミノ、カルボキシル、ヒドロキシル及びチオ
ールの如き官能基を加えることが必要である。同
様に、ポリペプチドラベルは一般に、一例とし
て、部分Yを与える結合に適している多くの遊離
アミノ基を含んでいるであろう。従つて、S−ペ
プチドをラベルとして使用するときには、3個の
アミノ基が存在しており、そしてこれらのうちの
1個もしくは全てを、S−蛋白質の存在下で接触
活性の損失を伴なわずに結合に使用できる。しか
しながら、ある場合には、しばしば遭遇するカル
ボキシル、ヒドロキシル及びチオール官能基を包
含するような他のポリペプチド官能基を使用する
ことが有用である。例えば、そのような他の官能
基は、種々の反応平衡、例えばK2及びK3、が関
与している限りにおいては、望ましく使用されて
有利な結果が生じる。 分析物及びポリペプチドラベル用に使用される
官能基の性質に従つて好適であり、そして同一で
あつてもよい部分X及びYを以下に示す。 【表】 【表】 最後に示されている例では、ジアゾニウム塩
は、アミノ基と酸性亜硝酸ナトリウム又は他の適
当な試薬との反応及びその後の例えばチロシルな
どの如きヒドロキシルフエニル成分との反応によ
り生成できる。ヒドロキシル基は示されているパ
ラ位置及びオルト位置に置かれ、そして残りの結
合(パラ位置に示されている)は環上の他の位置
に置かれている。 基Zは結合基X及びYを架橋している。それは
全ての場合に必ずしも必要ではなく、その理由は
分析物及びポリペプチドラベル用の特定の官能基
はある場合には架橋基の介入の必要なしに適当に
一緒に結合できるからである。一般に、架橋基Z
は、存在しているときには、炭素数が1〜10のア
ルキレン基、炭素数が1〜約10のアルケニレン
基、炭素数が約4〜約10のシクロアルキレン基、
炭素数が約2〜約10のオキソアルキレン基及び炭
素数が6〜約10のアリーレン基である。 架橋基Zの機能は、それにより免疫反応性、触
媒活性の回復及び抗−分析物抗体による触媒活性
の抑制が最適にされるような他の構造的パラメー
ターを与えることである。従つて、架橋基は、官
能基的な意味では、分析物及びラベルを分離する
ための化学的に不活性な空間的腕を供する。さら
に、以下で論じられている如く、これは2官能性
試薬の使用時には製造を助ける。例えば、炭素数
が50の如き比較的長い鎖の架橋基の使用は最初の
二つの官能基条件を満たすが、ラベルが抗体から
はるかに遠ざけられているため第三の条件は満た
さない。一方、ある場合には極端に短かい鎖長の
架橋基は免疫反応性及び多分触媒活性の損失をも
たらすであろう。 本発明の一面に従うと、分析物及びポリペプチ
ドラベルは、分析物及びポリペプチドラベル分子
の両者と両立し得る反応性を有する官能基を含ん
でいるある種の二官能性分子を使用することによ
り、一緒に結合できる。多くのそのような二官能
性分子が知られており、そして適当な例にはグル
タルアルデヒド、ビスイソチオシアネート、ビス
イソシアネート、イソチオシアナト−イソシアネ
ート、ハロゲン−イソシアネート及びイソチオシ
アネート、トリメチルシリルで封鎖したヒドロキ
シイソシアネートなどが含まれる。特に有用な二
官能性分子は、米国特許4064151に示されている
方法に従つて製造される6−イソチオシアナト−
カプロイルクロライドである(H.K.
Kricheldorf、Angew.Chem.87、515(1975)も参
照せよ)。この化合物の酸塩化物基はイソチオシ
アナト基より反応性であり、そして好適には分析
物分子上のアミノ又はヒドロキシル官能基と反応
する。生成したイソチオシアナト誘導化された分
析物類似体を次にポリペプチドの遊離アミノ基と
反応させてポリペプチドでラベル付けされた分析
物を生成できる。このようにして生成されたラベ
ル付けされた分析物において、 Xは−O−C(=O)−又は−NH−C(=O)−
であり、 Zは−(CH2)5であり、そして Yは−NH−C(=S)−HN−である。 ラベル付けされた分析物を生成するための他の
一般的方法は、分析物又はポリペプチドラベル上
の残存官能基の活性化及びその後の生成した生成
物と他の成分との反応を包括している。一例とし
て、ポリペプチドラベル上のカルボキシル基はゲ
ンタマイシン分子上の官能基とより反応性である
誘導体に転化でき、そして生成した生成物を次に
ゲンタマイシンと縮合させてラベル付けされた分
析物を生成できる。一方、ジランチンにラベル付
けするためには、ジランチン分子に加えられてい
るカルボキシル基を誘導体化でき、そして生成し
た生成物を次にポリペプチドラベルと反応させ
る。誘導体化を実施するための適当な物質の例に
は、イソブチリルクロライド、N−ヒドロキシこ
はく酸イミド又は水溶性カルボジイミドが包括さ
れる。 種々の分析物のラベル付け案を以下に示す。 鎮痙剤 ジランチン、フエノバルビタール、プリミドン
及びエトサクシミドからなる鎮痙剤群用の好適な
ラベル付けされた分析物はバルビツール酸構造を
反映しており、そして以下に一般的に示されてい
る如く6又は5員環内に環式アミド又は環式ラク
タム官能基を含んでいる: 種々の分析物に対するR基を以下に示す: 【表】 【表】 特に、ジランチン用の好適なラベル付けされた
分析物は下記のものである: 〔ここで、XはN−CH2であり、Yは−CO−
NHであり、そしてZは(CH2)3である〕。 ある種の免疫試験では、ラベル付けされた分析
物中に遊離NH−基を保有することが有利であ
る。そのような場合、ジランチンの誘導体はラベ
ル付けされた分析物として使用できる。従つて、
例えば、そのようなラベル付けされた分析物は、
アミノ基をフエニル環にそれのニトロ化及び還元
により加え、6−イソチオシアナトカプロイルク
ロライドと反応させ、そして最後にジランチンイ
ソチオシアナト誘導体をポリペプチドラベルの遊
離アミノ基と反応させることにより供給される。
生成したラベル付けされた分析物を以下に示す: この場合、Xは−NH−CO−であり、Yは−
NH−CS−NH−であり、そしてZは−(CH2)5
−である。 チロキシン及びトリアイオドチロニン チロキシン用の好適なラベル付けされた分析物
を以下に示す: これは6−イソチオシアナトカプロイルクロラ
イドを使用することにより製造でき、そしてX、
Y及びZはこの二官能性試薬を用いてラベル付け
されたジランチン生成物に関して記されているも
のと同じである。 チロキシンでラベル付けされた分析物は、アミ
ノ基が例えばトリフルオロアセチルの如き容易に
除去される封鎖基により保護されているようなチ
ロキシンをS−ペプチド又は他のポリペプチドラ
ベルと縮合させることによつても直接得られる。
下記のチロキシンでラベル付けされた分析物が最
終的に得られる: この場合、架橋基はなく、そしてX及びYは−
CO−NHである。 トリヨードチロニンでラベル付けされた分析物
も同様にして製造できる。 リドケイン リドケインの免疫試験用に適しているラベル付
けされた分析物は、p−アミノリドケインと6−
イソチオシアナトカプロイルクロライドの反応及
びその後のポリペプチドラベルとの反応から製造
できる。生じた生成物の構造を以下に示す: テオフイリン テオフイリン並びにそれの異性体であるカフエ
イン及びテオブロミンは、それらの構造が似てい
るため並びに紅茶及びコーヒー中のカフエインの
存在のために、妨害問題が生じる。特定のテオフ
イリン抗体との反応性を確実にするために、テオ
フイリンでラベル付けされたポリペプチドは、5
及び7位置が置換されていないようなテオフイリ
ン中に存在しているメチル置換様式を保有すべき
である。テオフイリン、カフエイン及びテオブロ
ミンに対するの構造を以下に示す: 【式】 【式】 【式】 従つて、テオフイリンに対する位置1のメチル
基のところにおけるポリペプチドラベルの結合
は、適当なテオフイリンでラベル付けされたポリ
ペプチドを与えるはずである。これは位置5及び
7における区別された未置換窒素原子が、ラベル
付けされた分析物中に保持されるという事実から
生じる。この状況下で検定に使用される抗体はハ
プテンのテオフイリン基が位置5及び7に未置換
窒素原子を保有している免疫原からも誘導される
はずである。この構造を以下に示す: 同様に、3−メチル位置及び多分6位置におけ
るテオフイリンの誘導体も上記と同じ理由のため
に使用できる。 アンフエタミン アンフエタミンでラベル付けされた分析物は例
えば6−イソチオシアナトカプロイルクロライド
の如き二官能性カツプリング剤の使用により直接
誘導できる。生成した構造を以下に示す: 麻酔剤アルカロイド モルフイネ、ヘロイン及びコデインからなる群
の麻酔剤アルカロイドは以下に示されている如き
関連構造を有する: 【式】 【式】 【式】 適当なモルフイネ及びコデインでラベル付けさ
れたポリペプチドはモルフイネ又はコデインと二
官能性試薬との反応により供されるべきである。
例えば、モルフイネ又はコデインと6−イソチオ
シアナトカプロイルクロライドの反応は、生じる
遊離イソチオシアナト官能性によりポリペプチド
ラベルと結合可能な誘導体を与える。さらに、モ
ルフイネ及びコデインの誘導体はポリペプチドで
ラベル付けするための分析物類似体として適当に
使用できる。例えば、モルフイネ及びコデインは
p−アミノ安息香酸からのジアゾニウム塩と結合
でき、そして生成した生成物を次にポリペプチド
ラベルと縮合させる。同様に、この方法はヘロイ
ンは遊離ヒドロキシル基を有していないためにヘ
ロイン用にも提案される。 抗生物質アミノグルコシド 抗生物質であるアミノグルコシド、ゲンタマイ
シン、シソマイシン及びトブラマイシンにポリペ
プチドを、二官能性試薬の使用によりラベル付け
できる。ゲンタマイシン、シソマイシン及びトブ
ラマイシンは全て、例えば6−イソチオシアナト
カプロイルクロライドの如き二官能性試薬を用い
てポリペプチドラベルと直接カツプリングさせる
ための結合場所を与える多数の遊離アミノ基を有
している。ゲンタマイシンは、ポリペプチド上の
遊離カルボキシル基をN−ヒドロキシこはく酸イ
ミド又は水溶性カルボジイミドとの反応により活
性化しそして次にゲンタマイシンと縮合させてラ
ベル付けされた分析物を生成することによつても
ラベル付けされる。 心臓薬グリコシド 心臓薬グリコシドジゴキシン及びジジトキシン
用のラベル付けされた分析物は二官能性試薬の使
用により製造できる。ジゴキシン及びジジトキシ
ンの両者は多数の遊離ヒドロキシル基を有し、そ
れは二官能性試薬である6−イソチオシアナトカ
プロイルクロライドと反応すると、イソチオシア
ナト誘導体を与え、それはポリペプチドの遊離ア
ミノ基と反応してラベル付けされた分析物を生成
する。提唱される構造を以下に示す: コルチゾル ジゴキシン及びジジトキシンに関する上記の方
法をコルチゾルにも同様に適用出来るべきであ
る。コルチゾルの適当な構造を以下に示す: テストステロン ポリペプチドでラベル付けされたテストステロ
ンに提唱される組成物はコルチゾル用に示されて
いるのと同じ型の合成により得られる。この組成
物を以下に示す。 一方、活性化された6−カルボキシメチルオキ
シム誘導体はテストステロンをポリペプチドラベ
ルにカツプリングさせるために使用できる。 プロゲステロン プロゲステロンでラベル付けされた分析物は、
ポリペプチドラベルを用いて、プロゲステロンの
活性化された6−カルボキシルメチルオキシム誘
導体とポリペプチドとの反応により供されて下記
の組成を与える: ポリアミノ酸分析物 ラベル付けされたポリアミノ酸分析物、例えば
インシユリン、パラチロイドホルモン、チロイド
刺激ホルモン、黄体刺激ホルモン、アンジオテン
シン、成長ホルモン、免疫グロブリン及び酵
素、は数種の方法により供される。 一方法は分析物のアミノ基をポリペプチドラベ
ルと結合させるための例えばグルタルアルデヒド
の如き二官能性剤の使用を包含している。生成す
る一般的構造を以下に示す: 〔ポリアミノ酸分析物〕−〔N=CH−(CH2)2 −CN=N〕o−PP1 他の方法は例えばイソブチリルクロライド又は
N−ヒドロキシこはく酸イミド/カルボジイミド
の如き試薬を用いる遊離カルボキシル基の活性化
を包括している。分析物又はポリペプチドラベル
のカルボキシル基は活性化されそしてその後第二
成分(すなわちいずれも誘導化されていない分析
物又はラベル)とカツプリング反応させる。二種
の生成物の構造はこのようにして得られる: 〔ポリアミノ酸分析物〕−C(=O)−NH −〔PP1〕o 〔ポリアミノ酸分析物〕o−NH−C(=O) −〔PP1〕 後者の構造は、特に例えば活性化出来る3個だ
けのアミノ基があるようなS−ペプチドの如き比
較的小さいポリペプチドラベルを用いると、ラベ
ル化された分析物の性質のより多くの調節を行な
うべきである。 第三の方法はマレイミド基を有する二官能性基
を用いるポリペプチドラベルの改変を包含してい
る。これらの基は次にポリアミノ酸分析物のSH
基と反応することができる。下記の型の組成物が
このようにして得られる: 基 質 前記の如く基質は、ポリペプチド対又はより正
確にはラベル付けされた分析物複合体により作用
を受けるため、その後必然的に基質の実際の性質
はポリペプチド対の触媒性質に依存する。機能的
には、基質は発色団及び/又は螢光発生団生成物
をポリペプチド対で誘導される触媒放出を受け、
該生成物は対応する分光光度計又は螢光計により
特に検出できる。さらに、基質からの生成物(す
なわちレポーター分子)への触媒による転化が例
えば1時間以下の如き比較的短時間にわたつて生
成物の出現を運動論的に監視できるほど充分急速
であることが望ましい。これには一般に、発色団
基質は10-9Mより大きい濃度で存在している分析
物用に使用され、一方螢光発生基質は10-9M以下
の分析物濃度に利用することが望ましい。 レポーター分子の出現速度が、測定期間にわた
る時間の線状もしくはほゞ線状の函数であること
が望ましい。基質が容易に製造できること及び緩
衝液媒体中又は凍結乾燥形で最低1週間、そして
好適には少なくとも3ケ月間にわたつて貯蔵でき
るのに充分な安定性を有することもさらに望まし
い。 試験では、基質濃度は試験工程中に基質の枯渇
が生じないほど充分高くなければならない。換言
すると、基質の転換速度は試験期間中に基質濃度
と独立してなければならない。一般に、10-4M〜
10-2Mの間の基質の濃度が認容できるはずであ
る。 好適なポリペプチド対と共に用いるためには、
リボヌクレアーゼAによりレポーター分子へ酵素
的に転化される基質を使用することが好適であ
る。酵素ブドウ球菌ヌクレアーゼから誘導される
ポリペプチド対には、適当な基質は天然酵素によ
りレポーター分子に転化されるものである。例え
ば、デオキシチミジン5′−りん酸のパラニトロフ
エニルエステル誘導体を利用できる。P.
Cuatrecasas、M Wilchek及びC.B.Anfinsen、
“The Action of Staphyloccal Nuclease on
Synthetic Substrates”、Synthetic Substrate
of Staphyloccas Nuclease、8巻、No.6、2277
−83頁、1969年6月。β−ガラクトシドに関する
ポリペプチド対用には、適当な基質は商業的に入
手できるo−ニトロフエニルβ−ガラクトシドで
ある。 しかしながら、S−ペプチド及びS−蛋白質ポ
リペプチド用には、基質として一般的に好適な構
造は以下の如くである。 〔式中:Bはヌクレオチドベース、例えばピリミ
ジン類似体、例えばウラシルであり、それは3′位
置におけるりん酸エステルの触媒もしくは酵素に
よる加水分解を助けることができる〕。 Rはウンベリフエロニル、4−メチルウンベリ
フエロニル、3−フラボニル、o−ニトロフエニ
ル、m−ニトロフエニル、p−ニトロフエニル、
ジニトロフエニル、シアノフエニル、アシルフエ
ニル、カルボキシフエニル、フエニルスルホネー
ト、フエニルスルホニル及びフエニルスルホキシ
ドからなる群から選択される部分であり、 R′は水素、アルキル、アルケニル、シクロアル
キル、アリール、アラアルキル、アシル、オキサ
アルキル、チオアルキル、オキサシクロアルキル
及びチオシクロアルキルからなる群から選択され
た成分であり、 R″は水素又はカルシウム、バリウム、リチウ
ム、ナトリウム、アンモニウム、置換されたアン
モニウム及びピリジニウムからなる群から選択さ
れたカチオンである。 一般に、好適な基質の製造方法は数種ある。一
方法は中間生成物としての2′−O−テトラヒドロ
ピラニル−5′−O−アセチル−ウリジリン酸の合
成を包括しており、それを次に遊離アルコール性
螢光団又は発色団と縮合させ、一方第二の方法は
t−ブチルジメチルシリル封鎖基の使用を包含し
ており、そしてウリジンを直接シリル化して2′,
5′−封鎖されたウリジンを生成することに基いて
いる。好適な基質及びそれらの製造方法は、これ
と同一日付で出願されたすでに確認された共に出
願中の出願においてより完全に記されている。 また、適当な基質はさらに、Rがナフチルであ
る上記の構造からなつている。この場合、基質の
触媒による加水分解で得られる遊離ナフチルはジ
アゾニウム塩との反応により検出され、該塩はス
ルフアニル酸から誘導される。最終的生成物は
500ナノメートルにおける可視範囲内の強い吸収
を有するアゾ染料である。この基質はチロキシン
の比色計試験用に有用であることが見出されてい
る。 プリンベース、例えばアデノシン及びグアニジ
ン、は(上記の構造においてピリミジンベース用
に置換されているときには)リボヌクレアーゼA
又は関連ポリペプチド対の触媒活性を監視するた
めに適当な基質を与えないであろうが、プリンベ
ースを含有している基質は、他のポリペプチド対
の使用時には有用であるべきである。例えば、後
者は微生物で誘導されたリボヌクレアーゼT2の
活性を監視するためには有用であろうし、T2は
プリンベース又はT2から誘導されたポリペプチ
ドパートナーに対する活性を有する。 他のポリペプチド対により供される特定の触媒
活性のために有用である基質は周知である。さら
に、現存の文献の鑑み、特定のポリペプチド対に
より発現される酵素活性に対する適当な基質が設
計される。 ここに記載の好適な基質はある種の環境下では
媒体誘導加水分解をうけ得るものであり、そして
これは基質のレポーター分子への望ましくないバ
ツクグランドとしての変換を与える。この媒体誘
導加水分解反応はある基質中では高いPHすなわち
約8以上では急速に起きるが、それより低いPHで
は非常にゆつくりしか起きない。これらの基質の
長期貯蔵(すなわち1日以上)をしようとすると
きには、このことは関心事となる。低いPH及び比
較的低い温度における貯蔵は加水分解を最少とす
るであろう。 しかしながら、2′置換基を容易に除去できる封
鎖基で誘導することにより媒体誘導加水分解が本
質的に防がれるということが見出された。従つ
て、長期貯蔵をしようとするときの、好適な組成
は下記の式 R′又は【式】 〔式中、Rは封鎖基であり、そしてR、R′、
R″及びBは基質に関する前記の式に関連して記
されているのと同じ部分である〕 により表わされる。 適当な2′−封鎖基は下記の基準に合致しなけれ
ばならない;(1)他の重要な官能基に影響を与える
ことなく容易に加えられ、(2)その後の合成段階と
適合性があり、そしてより特定すると該段階にお
ける望ましくない副反応を最少にするかもしくは
無しにすべきであり、(3)悪い有害な影響を与えず
に長期貯蔵できるほど充分に安定であり、そして
(4)ホスホジエステル結合を分裂させずに容易に除
去される。これらの基準、特に最後のもの、は酸
触媒反応により加えられそして除去できる封鎖基
の使用により最も容易に満たされる。 従つて、適当な封鎖基Rはシリル、オキサア
ルキル、チオアルキル、オキサシクロアルキル及
びチオアルキルが含まれる。より特定すると、テ
トラヒドロピラニル、4−メトキシテトラヒドロ
ピラニル、1−エトキシエチル、t−ブチルジメ
トシリル、が使用できる。最初の3個の遮蔽基、
すなわちテトラヒドロピラニル、4−メトキシテ
トラヒドロピラニル及び1−エトキシエチル、を
使用するとケタール構造を与える。これらの封鎖
基は、弱酸、例えば希塩酸もしくは希酢酸、によ
り、基質分子中の他の重要な官能基を分裂させる
ことなく、容易に除去される。同様に、シリル封
鎖基は例えばテトラブチルアンモニウムフルオラ
イドの如き試薬により容易に除去される。 R封鎖基は基質目身の合成工程中にフラノサ
イド環の2′位置に挿入できる。しかしながら、満
足のいく長期貯蔵特性用に必須であることは信じ
られていないが、5′−位置における封鎖は合成中
に必要である。合成中の2′−及び5′−位置におけ
る封鎖はこのようにして合成中間生成物の早すぎ
る加水分解並びに2′−及び5′−位置における望ま
しくない反応の発生を防ぐ。5′−位置の封鎖基は
基質の使用前に除去する必要はなく、そのため
2′−位置の封鎖の場合のように容易に除去できる
ことという条件は存在しない。 他の成分 試験の実施においては、種々の理由のために他
の成分を加えることが有用である。多くのそのよ
うな添加物が知られている。これらの中で下記の
ものが挙げられる:試薬の貯蔵性を改良するため
の静菌剤;例えば免疫反応性を改良するためもし
くは触媒活性を変化させるための緩衝液;免疫反
応性を強化するための例えばNaclの如きイオン
性強化剤;例えば内因性の酵素活性を減じるか又
は除去するための阻害剤の如き試薬;触媒活性強
化剤、及び内因性蛋白質用の封鎖剤。 今までの免疫試験方法で使用されている数種の
添加物を希望により本発明と共に使用することも
できる。しかしながら、そのような追加成分が本
発明に従う検定を実施するためにここで示されて
いる基準に悪影響を与えない点を確認するために
注意を払うべきである。例えば、いくらか阻害も
同様に生じるので使用されるポリペプチド対が
RNase活性を示すようなりん酸緩衝液を使用す
ることは普通は望ましくない。 他の一般的考察 ある場合又は全ての場合には、使用する試薬を
精製することが有用であり、そして実際に必要で
ある。例えば、内因性酵素活性を除くための、例
えばS−蛋白質の如き市販級ポリペプチドパート
ナーPP2の精製が一般に必要である。ペプチドラ
ベルPP1の精製は実施できるが、単に生成したラ
ベル付けされた分析物を精製することが一般に満
足である。精製技術は良く知られており、そして
クロマトグラフイ技術が適している。基質も精製
できるが、ここに記されている好適な基質ではこ
れは必要ないことが見出されている。 改良された貯蔵条件が必要なら、試験試薬の一
部の凍結乾燥化が必要である。適当な技術は周知
である。 本発明に従う検定を室温条件下で行なうことが
一般に望ましい。しかしながら、反応平衡K1、
K2及びK3の強化又は遅延は、温度を変化させる
と生じる。これは、本発明の方法用に融通性を付
与するためには考慮にいれられるであろう他のパ
ラメーターである。 試験に対するPHの効果も同様に考慮すべきであ
る。例えば、チロキシンの試験では、PHが5から
約7に高まるにつれて免疫反応性が減じられるこ
とが見出されている。ここに記されているりん酸
ナフチル基質は5のPHにおいて適当に使用できる
が、好適なウンベリフエロン型基質は、比色計方
式での有用な操作用には、約6〜約8の範囲内の
PHを必要とする。PHに関する感度は、分析物分子
により塩基性の大きい基を加えながら、ラベル付
けされた分析物の負荷特性を変化させることによ
り多分克服できるであろう。またチロキシン用の
さらに強い抗血清の使用は助けとなるはずであ
る。結合化学性(例えば結合基の場所、型)を改
変することも助けとなる。 主な試薬(すなわち抗体、基質、ラベル付けさ
れた分析物及びポリペプチドパートナー)は、例
えば特定の分析物用の予期される濃度範囲を模す
るか又は包括する一連の標準的分析物溶液の如き
必要なもしくは望ましい追加成分と一緒になつて
特定の試験用のキツトの形に典型的に包装される
であろう。さらに、そして使用する特定の基質の
条件により、下記のものが包含される:(1)封鎖形
で輸送するために包装する場合には基質用の封鎖
解除試薬、(2)戻した試薬の希釈用又はPH調節用の
緩衝液、及び(3)必要なら、染料生成剤(例えばこ
こに記されているりん酸ナフチル基質を使用する
ならジアゾニウム塩)。さらに、例えば内因性の
分析物結合用蛋白質の如き可能な干渉を最少化も
しくは除去するために必要なら、予備処理溶液が
供される。 種々の成分を、安定性、輸送及び他の条件によ
り、溶液又は凍結乾燥形でキツト中に包装でき
る。各成分又は試薬を別個に包装できる。一方、
(1)試験の正確性が相当悪影響されず(例えばラベ
ル付けされた分析物及びポリペプチドパートナー
を触媒活性種の早過ぎる生成をもたらすであろう
環境下で一緒にするときには生じるであろう)、
そして(2)成分がなんらかの方法で分解されない
(例えば過度の媒体誘導加水分解による基質の転
化)限り、2種以上の成分を1個の包装物中で一
緒にすることができる。 一緒にする包装の一形式は、ラベル付けされた
分析物及び基質を一緒に包装しそして抗体及びポ
リペプチドパートナーを第二の包装物中で一緒に
することを包含している。典型的にはウンベリフ
エロン型の好適な基質を使用するときの如く、こ
の方式における基質は過度の媒体誘導加水分解を
防止するための適当に緩衝された封鎖解除形であ
ることもできる。6以下のPHを使用すべきであ
り、約5の値が満足のいくものである。比色計検
出方式用には、試験で6以上のPHを与えるために
適する緩衝液の別個の包装物がこの場合必要であ
る。 別の一緒にする方装方式は、ラベル付けされた
分析物及び基質を別個に包装しながら抗体及びポ
リペプチドパートナーを一緒にすることを包含し
ている。これは、前記の急速分析器で使用できる
よう案に融通性を与えるため又は基質を封鎖形で
包装することにより基質の媒体誘導加水分解を最
少化するために有用である。後者の場合、別個に
包装された封鎖解除剤が必要であろう。また、適
当な試験PHを与えるための緩衝液包装物も必要で
ある。 他の一緒にする包装様式は、抗体及び基質を一
緒にすることを包含している。ラベル付けされた
分析物及びポリペプチドパートナーは、他の追加
成分もそうであるように別個に包装される。 種々の成分をキツト中に別個に包装するか又は
ある様式で一緒にするかどうかにかかわらず、こ
こに記されている補助成分(例えば静菌剤)を適
当な成分包装物に加えることができる。 ここで記されている技術の評論は均質免疫試験
用の方法の提供時に向けられているが、A−
PP1/PP2免疫試験ラベル系用に不均質方式も使
用できることに注目すべきである。これは融通
性、製造の容易さ、安定性及び例えばS−ペプチ
ドから誘導されたものの如きA−PP1でラベル付
けされた分析物の検出能力のために現在の不均質
酵素免疫試験と比べて有利である。さらに、不均
質方式が均質方式より好適であるなら特別な状況
が生じるかもしれない。例えば、不均質方式は例
えば内因性酵素活性の如き血清に基く妨害を除く
ために他の選択を行なうこともできる。また、不
均質免疫試験用に独自の自動化装置を利用でき、
そしてA−PP1/PP2免疫試験ラベル系はその系
のより完全な有用性の表現を可能にできる。 不均質免疫試験案は下記の段階を包含してい
る: (1) 適当な緩衝液媒体中での分析物、ポリペプチ
ドでラベル付けされた分析物及び抗−分析物抗
血清の培養; (2) 抗体結合された及び遊離状のポリペプチドで
ラベル付けされた分析物の物理的分離;及び (3) 対応するPP2及び基質を加えそして基質から
のレポーター分子への転化を測定することによ
る、抗体結合されたラベル付けされた分析物及
び/又は遊離状のラベル付けされた分析物の測
定。 段階(2)は、分析物抗体に対する固有第二抗体の
使用、例えばポリエチレングリコールの如き試薬
を用いてのAb゜A−PP1複合体の沈殿、又はおそ
らくクロマトグラフイにより、容易に達成され
る。 遊離状A−PP1部分の測定は均質方式で実施さ
れるが、結合された部分の測定は固相抗体複合体
からのラベル付けされた分析物のストリツピング
を必要とする(なぜならA−PP1は通常結合され
ているときには触媒活性を回復しないからであ
る)。これは過剰のPP2の添加により又は尿素の
如き他の試薬の使用により達成され、それらは抗
体複合体の解離用に普通使用されている。一方、
A−PP1は、抗体を複合体化することにより、抑
制されないように計画できる。これは実際にPP1
ラベルを抗体との分析物の複合体化の影響から絶
縁するような非常に大きいZ基を用いることによ
り行なわれる。比色計及び螢光計検出方式の両者
が、均質免疫試験を用いるときの如く、可能であ
る。 下記の実施例は本発明を単に説明するためのも
のであり、そしてそれの範囲を限定しようとする
ものではない。簡単に云うと、実施例〜は一
般にチロキシン、S−ペプチドでラベル付けされ
た分析物の製造及び特性決定に関している。実施
例〜は一般に5,5−ジフエニルヒダントイ
ン−(ジランチン)−S−ペプチドでラベル付けさ
れた分析物の製造及び特性決定に関している。実
施例〜はコルチゾル−S−ペプチドでラベル
付けされた分析物の製造及び特性決定に関してい
る。実施例XIはS−蛋白質の存在下でのチロキシ
ン−S−ペプチドでラベル付けされた分析物の触
媒活性を説明する。実施例XII〜は抗体の存在
により生じる触媒回復の抑制を説明する。実施例
〜は一般に、標準的又は参照用曲線の製
造に関している。実施例XIは対照用及び臨床用
試験の免疫試験に関している。実施例XIIは不均
質方式免疫試験に関している。断わらない限り温
度は摂氏温度である。 実施例では、下記の略語が使用されている。 a.u.=吸収単位 g=グラム ml=ミリリツトル mg=ミリグラム m moles=ミリモル μ=マイクロリツトル min=分 nm=ナノメートル %=パーセント M=モル cm=センチメートル na=ナノアンプ ma=ミリアンプ m.a.u.=ミリ吸収単位 T.=温度 ABS.=吸光度 N=規定 ng=ナノグラム MV=ミリボルト μg=マイクログラム TIC=薄層クロマトグラフイー u.v.=紫外線 i.r.=赤外線 n.m.r.=核磁気共鳴 実施例 この実施例は、ラベル付けされた分析物の製造
において結合基として使用するための二官能性試
薬である6−イソチオシアナトカプロイルクロラ
イドの製造を説明する。 二官能性化合物は二官能性イソシアネートが得
られている米国特許4130526中に示されている方
法と同様な方法に従つて製造された。下記の反応
が使われた: オーブン乾燥されそして窒素冷却された2丸
底フラスコは窒素入口、圧力均等化滴下ろうと及
び機械的スタラーが備えられていた。500mlのテ
トラヒドロフラン(リンデ4A分子ふるい上で乾
燥)中の6−アミノカプロン酸(66.02g、0.5モ
ル)の混合物をフラスコに加えた。混合物を窒素
下で20分間撹拌した後に、240mlのトリエチルア
ミン(1.7モル、リンデ4A分子ふるい上で乾燥)
を撹拌しながら加えた。20分間撹拌した後に、36
mlの二硫化炭素(0.6モル)を45分間にわたつて
滴々添加した。反応混合物を一夜撹拌し、そして
250mlのテトラヒドロフランで希釈した。次に225
mlのトリメチルシリルクロライドを2.5時間にわ
たつて滴々添加した。白色沈殿が生成した。反応
混合物を7時間にわたつて撹拌しながら静かに還
流させた。冷却後に、反応混合物を空気の不存在
下で過した。沈殿を乾燥テトラヒドロフランで
洗浄し、そして赤金色の液を集めた、このテト
ラヒドロフラン溶液を真空中で室温において濃縮
して、溶液を除去した。残渣を500ml丸底フラス
コ中にいれ、そして250mlの塩化メチレン中に溶
解させた。塩化チオニル(70ml)を撹拌しながら
20分間にわたつて加えた。一夜撹拌した後に、溶
媒を回転蒸発器上で除去して粗生成物を与えた。
これを110〜115゜(0.2トル)において2回蒸留し
て、31gの6−イソチオシアナトカプロイルクロ
ライドを与え、それは4.6〜4.8u(N=C=S)及
び5.5u(COCl)における赤外吸収帯、並びに構造
的に一致する面積比で3.4、2.8及び1.5ppmにおけ
るn.m.r.共鳴(CDCl3溶媒)を有していた。 実施例 この実施例は、例えばS−ペプチドの如きポリ
ペプチドラベルに対するカツプリング用に適して
いるチロキシンの誘導体を生成するための6−イ
ソチオシアナトカプロイルクロライドとチロキシ
ンの反応を説明する。 1ミリモル、すなわち776mg、のチロキシンを
10mlの塩化メチレン中に懸濁させた。これに0.5
mlのピリジンを加え、そして混合物を氷浴中で冷
却した。撹拌されている混合物を次に0.2mlの6
−イソチオシアナトカプロン酸クロライドと一緒
にし、そして撹拌を一夜続けた。溶媒の約半分及
び他の揮発物質を回転蒸発器中で除去し、そして
残渣を最少量のテトラヒドロフラン(THF)中
に溶解させた。THF混合物を分離ろうと中に移
した。混合物を水で2回抽出することにより無機
塩及び未反応物質を除去した。有機層を無水
Na2SO4上で乾燥した。溶媒を蒸発器上で除去す
ると、生成物であるN−(6−イソチオシアナト
カプロイル)チロキシンからなる残渣が残り、そ
れは薄層クロマトグラフイ及び元素分析により同
定された。 実施例 この実施例は、実施例のN−(6−イソチオ
シアナトカプロイル)チロキシンとS−ペプチド
の反応により生成されるS−ペプチドでラベル付
けされたチロキシンの製造を説明する。 2.94mg、すなわち1.36×10-3ミリモル、の市販
のS−ペプチド(Sigma Lot # 99C−8055)
を1.5mlのPH9の0.2Mほう酸塩緩衝液中に溶解さ
せ、そして溶液を室温で20分間撹拌した。この溶
液に、100μのジメチルホルムアミド中の2.09mg
(9.6×10-4ミリモル)のN−(6−イソチオシア
ナトカプロイル)チロキシンを加えた。さらに
50ulのジメチルホルムアミドを加えた。混合物を
一夜撹拌した。 チロキシン−S−ペプチド誘導体は、5′−O−
アセチルウリジン3′−(4−メチルウンベリフエ
ロン−7−イルホスフエート)基質を用いて試験
したときに触媒活性及び免疫反応性の両者を示す
ことが見出されたが、それはさらに以下の実施例
に従つて精製された。 実施例 この実施例は、実施例で製造されたS−ペプ
チドでラベル付けされたチロキシンの精製を説明
する。 セフアデツクスG−25Fカラム(1×23cm)を
製造しそして0.02%ナトリウムアジドを含有して
いる約PH9.5の0.05Mほう酸塩緩衝液で平衡化し
た。実施例からの反応生成物の一部分(0.5ml)
をカラムに適用した。緩衝液を1ml/分の流速で
溶離し、そして1mlフラクシヨンを集めた。フラ
クシヨン14〜25は324nmにおけるチロキシンによ
る吸収に基く望ましい接合体、実施例XIに示され
ている如きS−蛋白質及び基質の存在下での触媒
活性、及び実施例XIIに示されている如き免疫反応
性(チロキシン抗体の存在下での抑制)を有する
ことが見出された。 実施例〜は5,5−ジフエニルヒダントイ
ン(ジランチン)S−ペプチドでラベル付けされ
た分析物の製造に関している。実施例中に記され
ている合成では、ジランチンは改変されて、N−
ヒドロキシこはく酸イミドで誘導された縮合によ
りS−ペプチドにカツプリング可能となる。 実施例 この実施例は、S−ペプチドとカツプリングす
る、5,5−ジフエニルヒダントイン3−(5−
吉草酸)、C.Cook、J.A.Kepler、H.Dix
Christiansen、Res.Comm.Chem.Path.
Pharma.5、767(1973)、の製造を説明する。 ナトリウム5,5−ジフエニルヒダントイン
(Sigma Lot # 64C−0027、1.65g、6.01×
10-3モル)を、乾燥ジメチルホルムアミド(30
ml)を有する100mlの丸底フラスコに加えた。混
合物を撹拌しながら60゜に加熱し、そして1.20g
(6.15×10-3モル)の5−ブロモ吉草酸メチルを
加えた。反応混合物を3時間にわたつて撹拌しな
がら60℃に保つた。それを次に450mlの30%飽和
硫酸アンモニウム中に注いだ。5゜に一夜撹拌した
後にゴム状沈殿が生成した。上澄み液を過し、
そして残渣を5mlの冷メタノールですり砕いた。
粗生成物を過し、そして熱いメタノールから再
結晶化させた。合計収量1.41g(64%)の生成物
である5,5−ジフエニルヒダントイン3−(5
−吉草酸メチルエステル)を得た。 0.89g(2.43ミリモル)の5,5−ジフエニル
ヒダントイン3−(5−吉草酸)メチルエステル
を10%ジオキサン/H2O中の0.5N塩酸50mlの中
で3時間還流した。反応混合物を冷却し、そして
5゜において一夜貯蔵した。粗製結晶性生成物を
過により集め、そして酢酸エチル/ヘキサンから
再結晶化させた。合計収量0.63g(74%)の生成
物である5,5ジフエニルヒダントイン3−(5
−吉草酸)が得られ、それは150〜157゜の融点
(文献融点161〜163)を有していた。生成物を再
び再結晶化させて、152〜153゜の融点を有する精
製された物質を与えた。 実施例 この実施例では5,5−ジフエニル−ヒダント
イン−S−ペプチドでラベル付けされた分析物の
製造で使用された5,5−ジフエニルヒダントイ
ン3−(5−吉草酸N−ヒドロキシサクシンイミ
ジルエステル)の製造を説明する。 21.63mg、すなわち5.8×10-2ミリモル、の実施
例の5,5−ジフエニルヒダントイン3−(5
−吉草酸)を0.66mlの乾燥テトラヒドロフラン中
で8mg(7.0×10-2ミリモル)のN−ヒドロキシ
こはく酸イミド及び15mgのジシクロヘキシルカル
ボジイミドと一緒にした。混合物を一夜放置し
た。反応混合物を10mlの酢酸エチルで希釈し、そ
して過して、ジシクロヘキシル尿素を分離し
た。溶液を0.5mlの0.5M炭酸水素ナトリウムで2
回、0.5mlの水で1回、そして0.5mlの飽和塩化ナ
トリウムで1回洗浄した、溶液を無水硫酸マグネ
シウム上で乾燥し、そして回転蒸発器上で濃縮し
た。結晶性残渣を塩化メチレン/ヘキサンから再
結晶化させて、16mgの生成物を与えた。 実施例 この実施例は実施例で得られた反応生成物か
らの5,5−ジフエニルヒダントイン(ジランチ
ン)S−ペプチドでラベル付けされた分析物の製
造を説明する。 商業的に得られたS−ペプチド(Sigma Lot
# 99C−8055、0.85mg、3.9×10-4ミリモル)
を0.25mlの乾燥ジメチルホルムアミド中に溶解さ
せた。S−ペプチドメチルホルムアミド溶液に、
0.10mlの乾燥ジメチルホルムアミド中の0.92mg、
すなわち20×10-4ミリモルの5,5−ジフエニル
ヒダントイン3−(5−吉草酸)N−ヒドロキシ
サクシンイミジルエステルを加え、その後40ulの
乾燥ジメチルホルムアミド中の0.18mgのN−メチ
ルモルホリンを添加した。この反応混合物を室温
で1週間撹拌し、そして次に5゜において貯蔵し
た。 ジランチンS−ペプチドでラベル付けされた分
析物は、5′−O−アセチルウリジン−3′−(4−
メチルウンベリフエロン−7−イルホスフエー
ト)基質を用いて試験するときには、触媒活性及
び免疫反応性の両者を示すことが見出されたが、
それをさらに以下の実施例に従つて精製した。 実施例 この実施例は実施例で得られた5,5−ジフ
エニルヒダントイン(ジランチン)S−ペプチド
でラベル付けされた分析物の精製を説明する。 ジランチンS−ペプチドでラベル付けされた分
析物をセフアデツクスG−15カラム上のクロマト
グラフイにより精製した。セフアデツクスG−15
(20g)を0.1%ナトリウムアジドを含有している
150mlの0.05MのPH約8のトリエタノールアミン
緩衝液中で再び水和させ、そして1×48cmのカラ
ム中に注いだ。カラムを緩衝液で平衡化させ、そ
して100ulの前記の如くして製造されたラベル付
けされた分析物をカラム上で少部分の緩衝液で洗
浄した。フラクシヨン(1ml)を集め、そして触
媒的及び免疫反応性に関して監視した。200μ
部分の希釈したフラクシヨンを200μの酢酸ナ
トリウム緩衝液又はジランチン抗体、1900μの
封鎖されていない基質である5′−O−アセチルウ
リジン3′−(4メチルウンベリフエロン−7−イ
ルホスフエート)及び200μのS−蛋白質溶液
と一緒にした。 螢光の増加速度を325nmに設定された励起及び
440nmにおける放射を有する商業的に入手できる
Farrand Mark 1螢光計を用いて監視した。指
されているフラクシヨンに対して下記の結果が得
られた: 【表】 フラクシヨン15〜19及び20〜25を別個に貯蔵し
た。貯蔵されたフラクシヨン15〜19を次に実施例
、及びXIに記されている免疫試験で使
用した。 実施例 この実施例はコルチゾルS−ペプチドでラベル
付けされた分析物の製造で使用された21−コルチ
ゾル−(6−イソチオシアナトカプロエート)の
製造を説明する。 トリエチルアミン(0.2ml)を注射器を用いて
0.362gのコルチゾルの2mlのN,N−ジメチル
ホルムアミド中溶液に加えた。混合物を大気水分
を除いたフラスコ中で撹拌し、そして氷水冷却浴
中に浸した。混合物に0.229gの6−イソチオシ
アナト酸クロライドを3分間にわたつて滴々添加
した。反応をシリカゲル薄層クロマトグラフイに
より溶離溶媒として酢酸エチル中の10%メタノー
ルを用いて監視した。生成物は0.7のRf値を有し、
それに比べてコルチゾル自身は0.5のRf値を示し
た。3時間の反応後に、TLCは少量のコルチゾ
ルを示すか又は全く示さなかつた。混合物を次に
5mlのメタノールで処理し、そして蒸発乾固し
た。残渣をメタノール/エーテルから2回結晶化
させて、211mgの白色の針状物(融点105〜108)
を与えた。構造と一致した赤外線及びn.m.r.デー
タが得られた。 実施例 この実施例は実施例で得られた反応生成物か
らのコルチゾル−S−ペプチドでラベル付けされ
た分析物の製造を説明する。 0.35mgのS−ペプチドを0.3mlのPH9.8の0.2Mほ
う酸ナトリウム緩衝液中に溶解させた。撹拌され
ている溶液に、0.02mlのジオキサン中の0.5mgの
21−コルチゾル−(6−イソチオシアナトカプロ
エート)を加えた。さらに0.075mlのジオキサン
を加えて、反応混合物を均質とした。室温におい
て4日間撹拌した後に、混合物を1.0×50cmのセ
フアデツクスG−10カラムを通して、0.05Mトリ
エタノールアミン−HCl緩衝液、PH8、0.1%
NaClで溶離して、精製した。2.45mlのフラクシ
ヨンを集めた。溶離剤をu.v.検出器を用いて監視
した。 主要なバンドはフラクシヨン7、8及び9に溶
離した。実施例で使用された方法による、S−
蛋白質及びウンベリフエロン基質(5′−O−アセ
チルウリジン−3′−(4−メチルウンベリフエロ
ン−7−イルホスフエート)の存在下における触
媒活性の試験は、これらのフラクシヨンが約97%
の溶離されたS−ペプチド活性を有していたこと
を示した。 これらのフラクシヨンの触媒活性はコルチゾル
抗血清の存在下では65〜80%抑制された。ラベル
付けされた分析物の紫外線スペクトルは240nmに
おける特性コルチゾル吸収を有し、そしてこれ及
びコルチゾル自身の吸収エプシロン(11998)か
らラベル付けされた分析物の濃度は7×10-5Mと
推定された。 実施例 XI この実施例は実施例で製造されたチロキシン
−S−ペプチドでラベル付けされた分析物の、S
−蛋白質の存在下での、触媒活性を説明し、そし
てラベル付けされた分析物の濃度に対する触媒活
性の相互関係を示す。 チロキシン−S−ペプチドでラベル付けされた
分析物の回収された触媒活性をそれの濃度の関数
として、S−蛋白質の存在下で監視するためにユ
ニオン・カーバイト・コーポレーシヨン・モデル
500CentrifiChemR分析器を使用した。ウリジン
−3′−α−ナフチルホスフエート/p−ジアゾス
ルフエニル酸を、触媒活性を管視するための基
質/染料組み合わせ物として使用した。下記の試
薬を製造した: a 緩衝液:0.1M酢酸ナトリウム(PH5.0) b S−蛋白質:酢酸ナトリウム緩衝液中1.5×
10-5M c 基質:10.7mlの酢酸ナトリウム緩衝液中の16
mgの新たに封鎖除去されたウリジン−
3′−(α−ナフチルホスフエート)、 d 染料:1.0mlの0.1N HCl、Lot # 031814
中の25mgのジアゾ−p−スルフアニル
酸の1,5−ナフタレンジスルホン酸
安定化塩、 e チロキシン−S−ペプチドでラベル付けされ
た分析物:実施例で製造されたクロマトグラフ
イ貯蔵フラクシヨン14〜25精製された
ラベル付けされた分析物の、酢酸ナト
リウム緩衝液中の、1:40希釈、すな
わち1.0×10-5M、溶液。 Centrifi ChemR分析器は下記の調整値を有し
ていた:ローター温度、30゜;フイルター、
520nm;試験方法、TERM;プリントアウト、
ABS;ABS、1.0u;ブランク、Hold;濃度因
子、0;テストコード、0;T、1分。 5.55mlの酢酸ナトリウム緩衝液、840μの基
質、70ulの染料、及び140μのS−蛋白質からな
る混合物を製造し、そして400μ部分の混合物
をCentrifi ChemR分析器の転移デイスクのみぞ
3〜12の試薬井戸中にピペツトで加えた。それぞ
れ5μ〜40μの種々の量のチロキシンS−ペプ
チド溶液を転移デイスクの対応する試料井戸中に
ピペツトで加え、各井戸中の全量を酢酸ナトリウ
ム緩衝液で40μとした。装填したデイスクをロ
ーター上に置き回転させた。各みぞに対して1分
間隔で吸光度の読みをプリントアウトした。これ
らを最少2乗法線状回帰分析により、ナフトール
及び染料試薬との反応から誘導された発色団生成
物の生成速度に転化した。データを下表2に示
す。一般に、個々の速度測定に対して相関係数は
0.995より大きかつた。 【表】 チロキシン−S−ペプチドの濃度は下式による
発色団生成物の生成速度と直線的関係であつた: 速度(a.u./min.)=0.00245〔チロキシン−S−
ペプチドμ〕−0.00489、 0.9995の相関係数。 これらのデータは、基質の触媒による転化がラ
ベル付けされた分析物の濃度に直接関係している
こと及びこの方法の速度は遠心急速分析器中で、
測定期間にわたる吸光度及び時間の間の線状関係
に従つて簡便にしかも正確に測定できる。 実施例XII〜は、S蛋白質の存在下でのラベ
ル付けされた分析物の触媒活性の回復に関する分
析物に対する抗体の抑制効果を示している。記さ
れているように、螢光及び比色試験の両者が使用
される。 実施例 XII この実施例は螢光試験を用いての、チロキシン
抗体によるチロキシンS−ペプチドの触媒活性の
回復抑制を示している。下記の試薬を製造した: a チロキシン−S−ペプチドでラベル付けされ
た分析物:実施例で製造された生成物を
0.05Mトリエタノールアミン(TEA)緩衝液、
PH8を用いて1/2000の率で希釈した。 b チロキシン抗体:抗血清をTEA緩衝液を用
いて1/200の率で希釈した。 c S−蛋白質:精製された商業用物質をTEA
緩衝液中で2×10-5Mまでとした。 d 基質:50.75mlの0.1M酢酸塩緩衝液、PH5.0中
の約17mgの基質の濃度の新たに封鎖除去された
5′−O−アセチルウリジン−3′−(4−メチル
ウンベリフエロン−7−イルホスフエート)。 この基質を触媒により加水分解して、螢光性生
成物である(4−メチルウンベリフエロン)を与
えた。Farrand Mark螢光計を0.1に設定され
ている目盛りで、速度測定用に使用した。励起は
325nmであり、そして放射は440nmで監視され
た。 表3は示されている試薬を一緒にした後に得ら
れたデータを示す。 【表】 溶液1及び2に対するデータは、チロキシン−
S−ペプチドをS−蛋白質と一緒にしたときには
触媒活性が回復されること、及び触媒活性がS−
蛋白質濃度に関して飽和されているようであるこ
とを示している。溶液3に対するデータは、触媒
活性がS−蛋白質の不存在下で表わされないこと
を示している。溶液4及び5に対するデータは、
チロキシン抗体の存在によるチロキシン−S−ペ
プチドの触媒活性の抑制された回復を示してい
る。抑制率は53%であつた。 実施例 この実施例は、比色計試験を用いての、チロキ
シン抗体によるチロキシン−S−ペプチドの触媒
活性の回復の抑制を説明する。 この実施例で使用された試薬は、実施例XIで使
用されたものと同一である。5.55mlの酢酸塩緩衝
液、840μの基質、70μの染料及び140μのS
−蛋白質からなる混合溶液を実施例XIに記されて
いる如くして製造した。また吸光度の増加速度を
Centrifi ChemR500分析器を用いて実施例XIに記
されている調整値において監視した。チロキシン
抗体を減少していく量の酢酸塩緩衝液で希釈する
ことにより種々の濃度の抗体溶液が得られた。 400μの混合液を分析器のみぞ2〜12の試薬
井戸中にペプチドで加えた。それぞれ10μの減
少していく抗体希釈物を試料井戸4〜12の中に、
20μのチロキシンS−ペプチドでラベル付けさ
れた分析物と共に、ピペツトで加えた。増加して
いく吸光度を装置ローター上に転移デイスクを置
きそして回転させた後に1分間隔で監視した。表
4は結果を記録している: 【表】 データは、1:1抗体希釈付近でプラトー化さ
れている抗体の抑制効果を示している。上記のデ
ータをプロツトすると、1:30より幾分大きい抗
体希釈度における50%抑制があるS−形の滴定曲
線が出きる。 実施例 XI この実施例は螢光計試験を用いるジランチン抗
体によるジランチンS−ペプチドの触媒活性の回
復の抑制を説明する。 下記の試薬を使用した: a ジランチンS−ペプチドでラベル付けされた
分析物:実施例〜中に記されている如くし
て製造された物質、これはPH5の0.1M酢酸ナ
トリウム緩衝液で1/6000の率で希釈されてい
た。 b S−蛋白質:Sigma精製された商業用物質を
PH5の0.1M酢酸ナトリウム緩衝液中で1.47×
10-6Mの濃度にした。 c ジランチン抗体:抗血清を0.1M酢酸ナトリ
ウム緩衝液中で1:50の率で希釈した。 d 基質:新しく封鎖除去された5′−O−アセチ
ルウリジン−3′−(4−メチルウンベリフエロ
ン−7−イルホスフエート)。 Farrand Mark螢光計を、0.1に設定されて
いる目盛で、速度測定用に使用した。励起は
325nmであり、そして放射は440nmで監視され
た。 示されている試薬に150μのS−蛋白質を加
え、そして溶液を30分間培養した。データを表5
に記録する。 【表】 * 溶液1及び2中で使用された物
質は同じであつたが、溶液
3及び4で使用された物質とは異
なつていた。
データはジランチン抗体の存在によるジランチ
ン−S−ペプチドの触媒活性の抑制された回復を
示している。溶液1及び2に対しては抑制率67%
であり、そして溶液3及び4に対しては抑制率は
48%である。 実施例 この実施例は比色計試験を用いての、ジランチ
ン抗体によるS−蛋白質の存在下でのジランチン
−S−ペプチドの触媒活性の回復の抑制を説明す
る。 この実施例では、抗体比色計法での触媒活性の
抑制監視用の基質/染料組み合わせ物としてウリ
ジン−3′−(α−ナフチルホスフエート/p−ジ
アゾ)スルフアニル酸を使用した。下記の試薬が
製造された: a ジランチン−S−ペプチドでラベル付けされ
た分析物:PH5.0の0.1M酢酸ナトリウム緩衝液
を用いて1:600に希釈された、実施例〜
に記されている方法で製造された物質。 b S−蛋白質:PH5.0の0.1M酢酸ナトリウム緩
衝液中で1.53×10-6MまでにされたSigma精製
された商業用物質。 c 基質:新しく封鎖除去されたウリジン−3′−
(α−ナフチルホスフエート)。 d 抗体:ジランチン抗体を0.1M酢酸ナトリウ
ム緩衝液を用いて1:15の率で希釈した。 e 染料:p−ジアゾスルフアニル酸の安定化さ
れた1,5−ナフタレンジスルホン酸塩(25
mg)を1mlの0.1NHCl中に溶解させた。 50ulのジランチン−S−ペプチド、20ulのS−
蛋白質、200μの基質及び25ulの染料からなる溶
液をPH5.0の2052μの0.1M酢酸ナトリウム緩衝
液PH5.0で最終的量とした。470nmにおける溶液
吸光度を、Cary Model 118分光光度計を用いて
速度方式で時々監視した。吸収増加速度(1分当
りの吸収単位、a.u.で測定)は0.05a.u./min.で
あることが見出された。 第二溶液を製造し、そこでは111μの抗体を
対応する量の酢酸ナトリウム緩衝液用に置換し
た。吸収増加速度は0.02a.u./min.であり、それ
はジランチン抗体の存在によるジランチン−S−
ペプチドの触媒活性の回復の60%の抑制率に相当
していた。 実施例 この実施例は遠心急速分析器を用いての、S−
蛋白質の存在下でのジランチン抗体によるジラン
チンS−ペプチドの触媒活性の回復の抑制を説明
する。 この実験は、ナフチル基質の代りに比色計基質
としてウリジン−3′−(4−メチルウンベリフエ
ロン−7−イルホスフエート)を使用しそして分
光光度計の代りに吸収増加速度を監視するために
遠心急速分析器(Centrifi ChemR500)を使用す
るため、実施例とは異なつている。 下記の試薬を使用した: a ジランチン−S−ペプチドでラベル付けされ
た分析物:実施例〜に記されている如くし
て製造された物質を未希釈形で使用した。 b 抗体:PH7.1の0.1Mトリエタノールアミン
(TEA)−HCl緩衝液で1:40の率で希釈され
た抗血清。 c S−蛋白質:精製された物質をPH7.1の0.1M
TEA−HCl緩衝液で1:100の率で希釈して、
1.53×10-6Mの最終的濃度を与えた。 d 基質:17mgの5′−O−アセチル−2′−O−
(テトラヒドロピラン−2−イル)ウリジン
3′−(4メチルウンベリフエロン−7−イルア
ンモニウムホスフエート)を750μの0.05N
HClで30分間封鎖除去することにより5′−O−
アセチルウリジン−3′−(4−メチルウンベリ
フエロン−7−イルホスフエート)基質が得ら
れた。反応混合物を次に、1880μのPH5.0の
0.1M酢酸ナトリウムを加えることにより緩衝
した。使用の直前に、300μのこの濃縮基質
を5094ulの0.01M TEA−HClに加えた。 Centrifi ChemR500分析器に対する下記の調整
値を使用した:ローター温度、30゜;フイルター
340nm;To、10秒;T、2分;ABS、1.0u;ブ
ランク、ホールド;試験方式、Term;プリント
アウト、ABS;濃度係数、0;試験コード、0。 ラベル付けされた分析物及び抗体又は緩衝液を
それぞれ、分析器の転移デイスクのみぞ3〜6の
試料井戸中にピペツトで加え、その後16.6ulの
0.025N水酸化ナトリウムを添加した。S−蛋白
質及び基質を転移デイスクの同じみぞの試料井戸
中にピペツトで加えた。みぞ0及び1には対応す
る量及び等しい量のTEA緩衝液が充填されてい
た。みぞ2では、ジランチンS−ペプチド及び抗
体をTEA緩衝液で置換して、基質ブランクを与
えた。デイスクをローター上に置き、そして回転
させた。吸収を2分間隔で監視し、そしてプリン
トした。時間の函数としての吸収の最少2乗法線
状回帰分析により速度が得られた。 表6はデータをまとめたものである: 【表】 データは、ジランチン抗体の存在によるジラン
チン−S−ペプチドの触媒活性の抑制された回復
を示している。抑制率は30%である。 上記の実施例XI〜は標準的又は参照置換曲
線を作成するための基礎を提供するものであり、
該曲線から未知の分析物濃度が測定できる。下記
の実施例〜XIは対応する基質での種々の比
色計又は螢光計装置を利用する標準的置換曲線を
説明する。 実施例 この実施例はラベル付けされた分析物としてチ
ロキシン−S−ペプチドをそして螢光性基質とし
て5′−O−アセチルウリジン−3′−(4−メチル
ウンベリフエロン−7−イル)ホスフエートを用
いる対照置換曲線の作成を説明する。 下記の試薬を製造した: a チロキシン−S−ペプチドでラベル付けされ
た分析物:実施例〜に記されている方法で
製造された物質をPH5.0の0.1M酢酸ナトリウム
緩衝液中で1:2000の率で希釈した。 b 抗体:抗血清をPH5.0の0.1M酢酸ナトリウム
緩衝液を用いて1:2000の率で希釈した。 c S−蛋白質:精製された物質をPH5.0の0.1M
酢酸ナトリウム緩衝液を用いて2×10-5Mとし
た。 d 基質:17mgの5′−O−アセチル−2′−O−
(テトラヒドロピラン−2−イル)ウリジン
3′−(4−メチルウンベリフエロン−7−イル)
アンモニウムホスフエートを0.01HCl中で45分
間撹拌し、そして次にエーテルで抽出した。PH
5の50mlの0.01M酢酸ナトリウム緩衝液を次に
加えて基質溶液を与えた。 e チロキシン抗体規準 ヒト血清を含んでいる水性媒体中で0ng/
ml、30ng/ml、60ng/ml、120ng/ml及び
240ng/mlのチロキシン濃度を与えるようにチ
ロキシン溶液を新しく製造した。 75マイクロリツトルの標準的チロキシン溶液を
20ulの0.2N水酸化ナトリウムで室温で10分予備
処理した。100マイクロリツトルの抗体及び300ul
のチロキシン−S−ペプチドでラベル付けされた
分析物溶液を次に加え、そして混合物を室温で30
分間培養した。1.8mlの基質及び100μのS−蛋
白質からなる混合物を次に加えた。5分間培養し
た後に、螢光性の増加速度を10分間にわたつて監
視した。 自動的20試料チエンジヤー(モデル047−
67059)を備えたAmincoRフイルター螢光計(モ
デルJ4−7440)を、325nmの励起及び440nmの放
射で用いた。データ点は自動的データ採取システ
ムにより0.5及び10分の時に各試料に対して採取
された。表7に結果をまとめる。 【表】 【表】 上記のデータは、結合されているラベル付けさ
れた分析物の置換がチロキシン分析物の濃度の増
加につれておきるということを示している。置換
曲線を得るためには、2ケ所の点に対するデータ
を平均し、そして%結合分数(%B/Bp)を下
記の式から計算する: B/Bp×100=合計速度−速度Bo/合計速度−速度B
p 〔速度Boは0でない基準に相当する速度であり、
そして速度Bpは0基準溶液に相当するものであ
る〕。 結果を下表8に示す。 【表】 上記のデータは対照置換曲線を作成するために
使用でき、そこでは速度、%B/Bp又はロジツ
ト変形が標準濃度の函数としてプロツトされてい
る。 実施例 この実施例は、比色計基質を遠心急速分析器と
共に使用する場合の未知の濃度の分析物チロキサ
ンの測定用の対照置換曲線の作成を説明する。 下記の試薬を使用した: a チロキシンS−ペプチドでラベル付けされた
分析物:実施例〜に記されている方法で製
造された物質をPH5.0の0.1M酢酸ナトリウム緩
衝液で1:400の率で希釈した。 b 抗体:抗血清をPH5.0の0.1M酢酸ナトリウム
緩衝液で1:300の率で希釈した。 c 基質:ウリジン3′−α−ナフチルホスフエー
ト。 d S−蛋白質S−蛋白質:Sigma精製された高
業用物質を0.1M酢酸ナトリウム緩衝液中で2.5
×10-6Mとした。 e 染料:ジアゾ−p−スルフアニル酸の1,5
−ナフタレンジスルホン酸安定化塩(25mg)を
1mlの0.1N HCl中に溶解させた。 f 標準物:0、40、80、120及び200ng/mlの
濃度のチロキシン標準物をヒト血清含有溶液中
で製造した。 下記の調整値をCentrifi ChemR500遠心急速分
析器に対して使用した:ローター温度、30゜;フ
イルター、520nm;To、10秒;t、2分;
ABS1.0u;ブランク、ホールド;試験方式、
Term;プリントアウト、ABS;濃度係数0;試
験コード0。 標準物(20μ)、抗体及びポリペプチドでラ
ベル付けされた分析物をピペツトで転移デイスク
のみぞを3〜14の試料井戸中に加えた。5μの
染料、300μの基質、及び20μのS−蛋白質の
混合物を対応する試薬中に10ulの酢酸塩緩衝液と
共にピペツトで加えた。充填されている転移デイ
スクをローター上に置き、そして装置を回転させ
た。吸収の読みを2分間隔で10分間にわたつて行
ない、そしてこれらをCentrifi ChemRデータ採
用方式により示した。これらのデータを最少2乗
法回帰分析により速度(a.u./min)に転化した。
表9はデータをまとめたものである: 【表】 各標準濃度に関しての吸収対時間のプロツトを
第1図に示す。速度増加すなわち増加する標準濃
度での曲線の傾斜、はチロキシンによる抗体から
のチロキシン−S−ペプチドでラベル付けされた
分析物の置換を説明する。またデータの直線性も
優れており、相関係数は0.9995以上である。対照
置換曲線は上記のデータから容易に得られる。 第2図は速度対標準物の濃度のプロツトを示
す。速度データは実施例に記されている如く
%B/Bpにも転化できる。第3図は%B/Bp対
標準濃度の対数のプロツトを示している。 表9中のデータは標準濃度における変化に対し
満足のいく速度応答を反映しているが、実際の商
業的試験用には表9から誘導されるものより実質
的に大きい動的応答を供することが一般的にさら
に望ましいであろう。特に0標準及び200ng/ml
標準の間の速度応答は3.5m.a.u./minであり、そ
して約10.0m.a.u./minの値が好適である。 種々の試薬の濃度の適切な考察により、動的応
答範囲が強化できる。 実施例 この実施例はチロキシンでラベル付けされた分
析物及びS−蛋白質の相互転化を説明し、そこで
はS−蛋白質を試料井戸中にピペツトで加え、そ
してラベル付けされた分析物を試薬井戸中にピペ
ツトで加え、それは逆のとりそろえが使用された
前の実施例とは対照的である。さらに、この実施
例は自動的ピペツター(Centrifi ChemRモデル
P−500ピペツター)を用いる転移デイスクの試
料及び試薬井戸中への直接的ピペツト添加用の2
種の試薬溶液の調合を説明する。第三に、この実
施例は、抗体及びS−蛋白質の濃度を増加させる
ことにより実施例で得られたものに比較して
の動的範囲の強化を説明する。 下記の試薬を使用した: a チロキシン−S−ペプチドでラベル付けされ
た分析物:実施例〜に記されている方法で
製造された物質をPH5.0の0.1M酢酸ナトリウム
緩衝液で1:50の率で希釈した。 b 抗体:抗血清をPH5.0の0.1M酢酸ナトリウム
緩衝液で1:30の率で希釈した。 c 基質:ウリジン3′−(α−ナフチルホスフエ
ート) d S−蛋白質:Sigma精製された商業用物質を
0.1M酢酸ナトリウム緩衝液中で6×10-6Mに
した。 e 染料:実施例の如きもの。 f 標準物:実施例の如きもの。 500μの基質、100uの染料、及び250uの
接合物(コンジユゲート)の混合物を製造した。
(試薬A)。 300μの抗体、試薬、300μのS−蛋白質及
び150μの0.1N酢酸ナトリウム緩衝液を一緒に
することにより第二の溶液(試薬B)を製造し
た。 試験用には下記の案を利用した;標準物(20μ
)及び65μの脱イオン化H2OをP−500ピペ
ツターの試料プローブにより転移デイスクの試料
井戸に分配させた。試薬B(50μ)をピペツタ
ーの第二の試薬プローブを用いて試薬井戸に分配
させた。試薬A(250μ)をピペツターの最初の
試薬プローブを用いて転移デイスクの試薬井戸に
分配させた。全部で3回のピペツト操作を同時に
1サイクル中で行なつた。転移デイスクを次に分
析するためにCentrifi ChemR400上に置いた。
Centrifi ChemR用には下記の調整値を使用し
た:温度、30゜;フイルター、520nm;To、10
秒;T、2分;Abs、3.0u;ブランク、ホール
ド;試験方式、Term;プリントアウト、Abs;
濃度係数、0;テストコード、0。下記のデータ
が得られた。 【表】 これらのデータは表9中のものと比較して強化
された動的範囲を示す。ここでは0〜200(ng/
ml)の標準的濃度範囲を包括する速度のひろがり
は、12ミリ吸収単位/分であり、それは実施例
で得られたものの約4倍大きい。さらに、デー
タはある面で診断キツトの実用的デザインに比較
的良く適している試薬混合物の調合も説明してい
る。さらに、この実施例は1個のピペツトサイク
ルを利用する商業用遠心急速分析器を伴なう自動
的ピペツターの使用を説明する。 実施例に説明されている様に、表わされて
いるデータから対照曲線を作成できる。 実施例 この実施例はCentrifi ChemR500遠心急速分析
器に対するジランチン分析物用の対照置換曲線の
作成を説明する。比色計基質である5′−O−アセ
チル−ウリジン−3′−(4−メチルウンベリフエ
ロン−7−イルホスフエート)を使用した。 下記の試薬を製造した: a ジランチン−S−ペプチドでラベル付けされ
た分析物:0.1Mトリエタノールアミン
(TEA)−HCl緩衝液中の、実施例〜に記
されている方法で製造された物質を使用した。 b 抗体:抗ジランチン抗血清をPH7.1の0.1M
TEA−HCl緩衝液で1/20の率により希釈し
た。 c 基質:17mgの5′−O−アセチル2′−O−(テ
トラヒドロピラン−2−イル)ウリジン3′−
(4−メチルウンベリフエロン−7−イルアン
モニウムホスフエート)を750μの0.05N
CHlに加え、そして室温で30分間撹拌した。酢
酸ナトリウム緩衝液(1.880ml、0.1M、PH5.0)
を加えた。使用直前に、300μのこの溶液を
5.094mlのPH7.1の0.1M TEA−HCl緩衝液と一
緒にした。 d S−蛋白質:Sigma精製商業用物質をPH7.1
の0.1M TEA−HCl緩衝液で1:100の率によ
り希釈して1.53×10-6Mの濃度を有する溶液を
与えた。 e ジランチン標準:5,5−ジフエニルヒダン
トインナトリウム塩(Sigmaロツト64C−
0027)の貯蔵溶液を、48mgの1の0.025N水
酸化ナトリウム中に溶解させることにより、製
造した。これを0.025N水酸化ナトリウムで
1:10の率により希釈して4.8ug/mlを有する
溶液を与えた。これをさらに希釈して、19.1、
47.8、95.8、143.6及び191.5ng/mlの濃度を有
する標準溶液を与えた。 Centrifi ChemR500遠心急速分析器は下記の装
置調整値を有していた:ローター温度、30゜;フ
イルター、340nm;To、10秒;T、1分;
ABS1.0u;ブランク、ホールド;試験方式、
Term;プリントアウト、ABS;濃度係数、0;
試験コード0。 抗体、ジランチン−S−ペプチド及び16.6μ
の標準溶液を転移デイスクのみぞ3〜16の試料井
戸の中にピペツトで加えた。S−蛋白質及び
300μの基質を転移デイスクの対応する試薬井
戸のそれぞれの中にピペツトで加えた。転移デイ
スクをローター上に置きそして回転させた。吸収
の読みを1分間隔で5分間にわたつて測定し、そ
してCentrifi ChemRデータ採取単位により示し
た。触媒活性速度(a.u./min.)が吸収の最少2
乗法回帰分析から時間の函数として得られた。 データを下表11にまとめる。 【表】 第4図は速度対標準ジランチン濃度のプロツト
を示している。パーセント結合分数(%B/Bp)
も実施例の如く計算された。第5図は標準濃
度に対するパーセント結合分数のプロツトを示し
ている。第5図の対照置換曲線は、データのロジ
ツト/ロツグ転換の使用により直線化できる。直
線化された第5図の置換曲線を第6図に示す。 第4,5及び6図に示されているデータは大き
さが一つのオーダにわたるジランチンに対する広
い範囲の感度を与える。しかしながら、この濃度
範囲はヒト血清で普通あらわれるものより小さ
い。その結果、血清試料はここに誘導されている
対照置換曲線を用いることにより測定するために
は希釈しなければならない。 実施例 XI この実施例では臨床試料を直接試験できる試験
の構想、(Centrifi ChemR500)遠心急速分析器
に付いている自動的ピペツター(モデルP−500)
の使用、及び自動的データ類別の使用を説明す
る。 下記の試薬を使用した: a ラベル付けされた分析物:実施例〜に記
されている方法で製造された、0.1Mトリエタ
ノールアミン(TEA)−HCl緩衝液中の、ジラ
ンチン−S−ペプチドでラベル付けされた分析
物を使用した。 b 抗体:抗−ジランチン抗血清(150μ)を
900μのPH7.1の0.1M TEA−HClで希釈した。 c 基質:5′−O−アセチル2′−O−(テトラヒ
ドロピラン−2−イル)ウリジン3′−(4−メ
チルウンベリフエロン−7−イルアンモニウム
ホスフエート)(6.4mg)を285.2μの0.05N
HClに加え、そして室温で30分間撹拌した。次
に酢酸ナトリウム緩衝液(714.8μ、0.1M、
PH5.0)を加えた。 d S−蛋白質:Sigma S−蛋白質の12.3×
10-5M溶液を0.1M TEA−HCl緩衝液(PH7.1)
中で製造した。 e ジランチン標準物:5,5−ジフエニルヒダ
ントインナトリウム塩(Sigmaロツト64C−
0027)をヒトの血清中で2.5、5.0、10.0、20.0
及び30.0ug/mlの濃度で製造した。 16μのS−ペプチドでラベル付けされた分析
物、10uのヒトの血清アルブミン、1430μの
TEA−HCl緩衝液及び(c)に記されている基質溶
液の混合物を製造した(試薬1と称する)。150μ
の抗血清、50μのS−蛋白質及び1937.5uの
TEA緩衝液からなる第二の混合物を製造した
(試薬2と称する)。Centrifi ChemRP−500自動
的ピペツターを用いて4uの適当な基準溶液を
同時に45μの脱イオン化されたH2Oで希釈しそ
して転移デイスクの試料井戸の中にピペツトで加
えた。同時にピペツターは250μの試薬1を試
薬井戸の中にそして100uの試薬2を試料井戸
の中に分配させ、Centrifi ChemR500遠心装置の
要素は、試験コード29を用いたこと以外は、実施
例のものと同一であつた。これはCentrifi
ChemR500装置のマイクロプロセツサーユニツト
により自動的なデータ類別を与えた。 下記のデータが得られた。 【表】 マイクロプロセツサーユニツト中に貯蔵されて
いるロジツト−ロツグ基準曲線は、7.4の%標準
偏差を有していた。一般に貯蔵されている曲線か
ら誘導される計算された標準濃度は表12に示され
ている如く分析物の濃度範囲にわたつて実際の標
準濃度と満足のいくように合致した。 上記の案を対照用及び臨床用の両者の試料の直
接的試験用に使用できる。例えば、気体液体クロ
マトグラフイ(glc)測定を基にして23.4ug/ml
のジランチン濃度を有する臨床的試料が上記の対
の試験により23±.7ug/mlの濃度を有している
ことが見出された。同様にglcにより2.0ug/mlの
濃度を有する臨床用試料が3.1±.1ug/mlの濃度
を有していることも見出された。このことは臨床
用試料において予想される分析物濃度範囲にわた
る良好な正確さ及び感度を示している。さらにデ
ータは自動的ピペツト添加及びデータ類別に対す
る試験の適合性を示しており、従つて使用した遠
心急速分析器システムの全能力の利点を利用して
いる。最後に、データは抗体、S−蛋白質及びジ
ランチン−S−蛋白質でラベル付けされた分析物
の濃度を、P−500ピペツターにより自動的に実
施されるものより良好に、あらかじめ希釈するこ
となく臨床用試料の直接測定ができるように調節
できることを示している。 実施例 XII この実施例は二重抗体固相方法の使用によるジ
ランチン分析物及びS−ペプチドでラベル付けさ
れたジチンチン分析物の抗体で結合された部分の
分離を説明し、そして遊離状の(結合されていな
い)相の投薬量応答触媒活性も示す。対照用血清
の分析物濃度の測定用の螢光発生基質として5′−
O−アセチルウリジル−3′−(4−メチルウリジ
ル−3′−(4−メチルウンベリフエロン−7−イ
ル)ホスフエートを使用する触媒活性測定から、
標準置換曲線を作成する。従つてこれらのデータ
は不均質方式試験を例示している。 下記の試薬を製造した: a ジランチン−S−ペプチドでラベル付けされ
た分析物:TEA−HCl緩衝液中のラベル付け
された分析物を実施例〜中に記されている
方法で製造し、120μを2860uのTEA−HCl
緩衝液で希釈した。 b 抗体:抗−ジランチン抗血清(300μ)を
1800uのTEA−HCl緩衝液で希釈した。 c 固相の固定された第二抗体:50mgのBio−
Rad IMMnNOBEADTM、Lot 17003、を50ml
のTEA−HCl緩衝液を用いて復元した。 d 基質:35mgの5′−O−アセチル−2′−O−
(テトラヒドロピラン−2−イル)ウリジル−
3′−(4−メチルウンベリフエロン−7−イル)
アンモニウムホスフエートを1.5mlの0.025M
HClを用いて40分間にわたり室温で封鎖除去
し、そして5mlのエーテルで2回抽出した。残
存エーテルを空気流により除去し、そして酸性
溶液を酢酸塩緩衝液で緩衝して100mlとした。 e 酢酸塩緩衝液:酢酸ナトリウム緩衝液、
0.1M、PH5.0。 f TEA−HCl緩衝液:トリエタノールアミン
−HCl緩衝液、0.05M、PH7.5。 g ジランチン標準物:5,5−ジフエニルヒダ
ントインナトリウム塩の溶液をヒト血清中で実
施例XI中の如くして2.5、5.0、10.0、20.0、
30.0及び40.0ug/mlの濃度で製造した。 h S−蛋白質:Sigma精製された溶液を酢酸塩
緩衝液中で1/20に希釈した。 適当なジランチン標準物(それぞれ8ul)を、
0ug、2.5ug、5ug、10ug、20ug、30ug標準
物としてマークされている二重試験の試験管中に
ピペツトで加えた。100ulの抗体部分を標準物の
各二重検定管中にピペツトで加え、そして生成し
た混合物を撹拌しそして室温で20分間培養した。
それぞれ100ulのジランチン−S−ペプチドでラ
ベル付けされた分析物部分を次に全試験管中にピ
ペツトで加えた。生成した混合物を室温で20分間
培養した。 TEA−HCl緩衝液(108ul)及びジランチン−
S−ペプチドでラベル付けされた分析物(100ul)
を総合的にラベル付けされている二重検定管中に
ピペツトで加えた。生成した混合物を撹拌により
混合し、そして室温において20分間培養した。 次にそれぞれ500ulの第二の抗体溶液を総合的
試験管以外の全ての管中にピペツトで加えた。
TEA−HCl緩衝液(500ul)をピペツトで総合的
試験管中に加えた。生成した混合物を撹拌により
混合し、そして室温で60分間培養した。総合的以
外の全ての試験管を3000−pmで5〜10℃におい
て5分間遠心した。 各管の上澄み液(遊離相)を対応してマークさ
れてある新しい管中に移した。固相を各管中で
0.5mlのTEA緩衝液で再懸濁させ、そして上記の
如く遠心した。上澄み液を傾斜させた。 投与量応答触媒活性を以下の如く測定した。 遊離相及び総合の部分試料(それぞれ50ul)を
それぞれ1.8mlの基質及び50ulのS−蛋白質を用
いて、混合物が325nmにおいて励起されたときの
440nmにおける放射によりフアーランドマーク1
(Farrand Mark1)螢光計を使用して測定して試
験した。 データを下表13にまとめる。もとのデータは改
変されたロツグ−ロジツド・アルゴリズムにより
合わせられ、そこでは無限の及び0標準濃度にお
ける速度は反復方法により得られる。表中の各デ
ータ点は二点の平均を表わしている。 【表】 表中のデータにより分析物濃度の範囲にわたる
許容できる標準曲線を作成される。
第1図は分析物チロキシンの種々の濃度に関す
る吸収性対時間のグラフであり、そしてそれは速
度測定の直線性並びにチロキシン濃度の増加に伴
なう速度(傾斜)の増加を説明する。第2図は分
析物チロキシンに関するレポーター分子の生成速
度対濃度のグラフである。第3図は分析物チロキ
シンに関する、抗体結合されたラベル付けされた
分析物パーセント対標準濃度の対数のグラフであ
る。第4図は分析物ジランチンに関するレポータ
ー分子の生成速度対濃度のグラフである。第5図
は分析物ジランチンに関する抗体結合されたラベ
ル付けされた分析物パーセント対標準濃度の対数
のグラフである。第6図は第5図からのデータの
ロジツト/ロツグ転換を用いることにより得られ
た、第5図の直線状置換曲線のグラフである。
る吸収性対時間のグラフであり、そしてそれは速
度測定の直線性並びにチロキシン濃度の増加に伴
なう速度(傾斜)の増加を説明する。第2図は分
析物チロキシンに関するレポーター分子の生成速
度対濃度のグラフである。第3図は分析物チロキ
シンに関する、抗体結合されたラベル付けされた
分析物パーセント対標準濃度の対数のグラフであ
る。第4図は分析物ジランチンに関するレポータ
ー分子の生成速度対濃度のグラフである。第5図
は分析物ジランチンに関する抗体結合されたラベ
ル付けされた分析物パーセント対標準濃度の対数
のグラフである。第6図は第5図からのデータの
ロジツト/ロツグ転換を用いることにより得られ
た、第5図の直線状置換曲線のグラフである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1 既知の分析物を未知の濃度で含有している試
料中の分析物の量を測定する方法において、 (a) 媒体中で、(1)該試料、(2)ポリペプチドでラベ
ル付けされた分析物、(3)該分析物に特異的な抗
体、(4)ポリペプチドでラベル付けされた分析物
と非共有結合できて触媒活性を有する複合体を
生成するポリペプチドパートナー、及び(5)該複
合体の触媒活性によりレポーター分子に変換可
能な基質を一緒にし、ここで該ポリペプチドで
ラベル付けされた分析物は該抗体及び該ポリペ
プチドパートナーと結合でき、該抗体は分析物
の不存在下で触媒活性複合体の生成を阻害し、
該抗体、ポリペプチドパートナー及びポリペプ
チドでラベル付けされた分析物の濃度は、試料
中の分析物の変化量が複合体の触媒活性の関数
として、該基質から該レポーター分子への変換
に対して直接相関関係を有するように決定し、 (b) 該基質からの該レポーター分子への変換を測
定し、そして (c) 該基質からの該レポーター分子への変換を既
知の濃度の該分析物を用いて得られた変換と比
較することからなる方法。 2 ポリペプチドパートナーとポリペプチドでラ
ベル付けされた分析物の非共有結合により生成し
た複合体がリボヌクレアーゼの触媒活性特性を示
す、特許請求の範囲第1項記載の方法。 3 該複合体がリボヌクレアーゼAの触媒活性特
性を示す、特許請求の範囲第2項記載の方法。 4 分析物のポリペプチドラベルがS−ペプチド
又はそれの類似体であり、そしてポリペプチドパ
ートナーがS−蛋白質又はそれの類似体である、
特許請求の範囲第2項記載の方法。 5 分析物のポリペプチドラベルがS−蛋白質又
はそれの類似体であり、そしてポリペプチドパー
トナーがS−ペプチド又はそれの類似体である、
特許請求の範囲第2項記載の方法。 6 ポリペプチドラベル及びポリペプチドパート
ナーの少なくとも一方が酵素を開裂させて得られ
る、特許請求の範囲第1項記載の方法。 7 ポリペプチドラベル及びポリペプチドパート
ナーが元の酵素の開裂断片である、特許請求の範
囲第6項記載の方法。 8 ポリペプチドパートナーとポリペプチドでラ
ベル付けされた分析物の非共有結合により生成し
た複合体が該元の酵素の触媒活性の少なくとも5
%を回復している、特許請求の範囲第7項記載の
方法。 9 該複合体の平衡定数が約105M-1〜約1011M-1
である、特許請求の範囲第1項記載の方法。 10 該分析物が少なくとも約100〜約106の分子
量を有する、特許請求の範囲第1項記載の方法。 11 該分析物が薬もしくはそれの代謝産物、鎮
静剤、麻酔剤、ホルモン、ステロイド、ビタミ
ン、ポリペプチドホルモン、抗原を伴う腫瘍、免
疫グロブリン、酵素、工業的汚染物質、農薬もし
くはそれの代謝産物、食品添加物、除草剤もしく
はそれの代謝産物、香味剤、又は食品毒物からな
る群から選択される一員である、特許請求の範囲
第1項記載の方法。 12 該分析物がジランチン、エトサクシミド、
フエノバルビタール、プリミドン、リドケイン、
テオフイリン、モルフイン、コデイン、ヘロイ
ン、大麻、ゲンタマイシン、トブラマイシン、メ
ソトレキセート、ジジトキシン、チロキシン、テ
ストステロン、コルチゾル、免疫グロブリン、ト
リヨードチロニン、ジゴキシン、葉酸、アンジオ
テンシン、プロゲステロン、プロスタグランジ
ンF2、エストロゲン類、ビタミンB12、成長ホル
モン、甲状腺刺激ホルモン、カルシトニン、ガス
トリン、黄体ホルモン、卵胞刺激ホルモン、グル
カゴン、ヒト絨毛膜ゴナドトロピン、アルドステ
ロン又は胎生期癌抗原からなる群から選択され
る、特許請求の範囲第1項記載の方法。 13 該分析物がジランチンである、特許請求の
範囲第12項記載の方法。 14 該分析物がチロキシンである、特許請求の
範囲第12項記載の方法。 15 該分析物がコルチゾルである、特許請求の
範囲第12項記載の方法。 16 該分析物がジランチンであり、ジランチン
用のポリペプチドラベルがS−ペプチドまたはそ
れの類似体であり、そしてポリペプチドパートナ
ーがS−蛋白質又はそれの類似体である、特許請
求の範囲第1項記載の方法。 17 該分析物がチロキシンであり、チロキシン
のためのポリペプチドラベルがS−ペプチド又は
それの類似体であり、そしてポリペプチドパート
ナーがS−蛋白質又はそれの類似体である、特許
請求の範囲第1項記載の方法。 18 該分析物がコルチゾルであり、コルチゾル
用のポリペプチドラベルがS−ペプチド又はそれ
の類似体であり、そしてポリペプチドパートナー
がS−蛋白質又はそれの類似体である、特許請求
の範囲第1項記載の方法。 19 抗体が、少なくとも約10%の阻害を与える
のに充分な濃度で、存在している、特許請求の範
囲第1項記載の方法。 20 抗体が、少なくとも約50%の阻害を与える
のに充分な濃度で、存在している、特許請求の範
囲第19項記載の方法。 21 基質が、速度測定期間にわたつて本質的に
直線的な速度を与えるような、濃度で存在してい
る、特許請求の範囲第1項記載の方法。 22 基質が約10-4〜約10-2モルの濃度で存在し
ている、特許請求の範囲第1項記載の方法。 23 基質が下記の構造式: [式中、Bは3′−位置におけるりん酸エステルの
加水分解を助けることのできるヌクレオチド塩基
であり、 Rはウンベリフエロニル、4−メチルウンベリ
フエロニル、3−フラボニル、o−ニトロフエニ
ル、m−ニトロフエニル、p−ニトロフエニル、
ジニトロフエニル、シアノフエニル、アシルフエ
ニル、カルボキシフエニル、フエニルスルホネー
ト、フエニルスルホニル及びフエニルスルホキシ
ドからなる群から選択された成分であり、 R′は水素、アルキル、アルケニル、シクロア
ルキル、アリール、アラアルキル、アシル、オキ
サアルキル、チオアルキル、オキサシクロアルキ
ル及びチオシクロアルキルからなる群から選択さ
れた成分であり、そして R″は水素又はカルシウム、バリウム、リチウ
ム、ナトリウム、アンモニウム、置換されたアン
モニウム及びピリジニウムからなる群から選択さ
れたカチオンである] を有する、特許請求の範囲第1項記載の方法。 24 Bがウラシルであり、Rが4−メチルウン
ベリフエロニルであり、R′がアセチルであり、
そしてR″がカルシウム、ピリジニウム又はナト
リウムからなる群から選択された一員である、特
許請求の範囲第23項記載の方法。 25 基質からレポーター分子への変換速度を測
定する、特許請求の範囲第1項記載の方法。 26 該速度を分光光度計で測定する、特許請求
の範囲第25項記載の方法。 27 該速度を蛍光計により測定する、特許請求
の範囲第25項記載の方法。 28 下記の成分:(1)ポリペプチドでラベル付け
された分析物、(2)分析物に特異的な抗体、(3)ポリ
ペプチドでラベル付けされた分析物と非共有結合
できて触媒活性を有する複合体を形成するポリペ
プチドパートナー及び(4)複合体の触媒活性により
レポーター分子に変換可能な基質、を含んでおり
分析物の検定を実施するさいに使用するためのキ
ツト。 29 分析物に対する予測される濃度範囲を包括
している一組の標準分析物溶液を含んでいる、特
許請求の範囲第28項記載のキツト。 30 検定のためのPH調節用緩衝液を含んでい
る、特許請求の範囲第28項記載のキツト。 31 各成分が別個に包装されている、特許請求
の範囲第28項記載のキツト。 32 ポリペプチドでラベル付けされた分析物及
び基質を一緒に包装し、そして抗体及びポリペプ
チドパートナーを一緒に包装した、特許請求の範
囲第28項記載のキツト。 33 抗体及びポリペプチドパートナーを一緒に
包装した、特許請求の範囲第28項記載のキツ
ト。 34 抗体及び基質を一緒に包装した、特許請求
の範囲第28項記載のキツト。 35 (a) 媒体中で、(1)試料、(2)ポリペプチドで
ラベル付けされた分析物及び(3)該分析物に特異
的な抗体を一緒にし、 (b) 抗体と結合されたポリペプチドでラベル付け
された分析物を遊離のポリペプチドでラベル付
けされた分析物から分離し、 (c) ポリペプチドでラベル付けされた分析物と非
共有結合して触媒活性を有する複合体を生成で
きるポリペプチドパートナーと、該複合体の触
媒活性によりレポーター分子に変換可能な基質
とを加え、該基質からレポーター分子への変換
を測定することにより、(1)抗体と結合されたポ
リペプチドでラベル付けされている分析物と(2)
遊離のポリペプチドでラベル付けされた分析物
とのうちの少なくとも一方の量を測定し、そし
て (d) 該基質からレポーター分子への変換を既知の
濃度の該分析物を用いて得られた変換と比較す
る ことからなる、未知の濃度で存在している既知の
分析物を含有している試料の不均一系免疫検定の
実施方法。 36 分析物を含有している試料の検定の実施に
おいて使用するための、下記式 An−Xo−Zp−Yo−[PP1]p [式中、Aは分析物であり、 XはA及びZ又はYと結合している部分であ
り、YはPP1及びZ又はXと結合している部分で
あり;ZはX及びYと結合している架橋基であ
り;PP1はポリペプチドであり、m、n及びpは
1〜約8の整数であり、そしてoは0または1〜
約8の整数であり、該ポリペプチドでラベル付け
された分析物は分析物に対して特異的な抗体との
結合に関して分析物と競争でき、そして該ポリペ
プチドでラベル付けされた分析物は第二のポリペ
プチドパートナーPP2と非共有結合できて、基質
を検出可能なレポーター分子に変換させ得る触媒
活性を有する複合体を生成する]を有するポリペ
プチドでラベル付けされた分析物。 37 X及びYが からなる群から選択された員であり、そしてZが
炭素数が1〜約10のアルキレン、炭素数が1〜約
10のアルケニレン、炭素数が約4〜約10のシクロ
アルキレン、炭素数が約2〜約10のオキソアルキ
レン及び炭素数が約6〜約10のアリーレンからな
る群から選択された一員である、特許請求の範囲
第36項記載のポリペプチドでラベル付けされた
分析物。 38 Xが からなる群から選択された一員である、特許請求
の範囲第37項記載のポリペプチドでラベル付け
された分析物。 39 PP1がS−ペプチド類似体であり、そして
PP2がS−蛋白質又はそれの類似体である、特許
請求の範囲第37項記載のポリペプチドでラベル
付けされた分析物。
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