JPH0138479B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規化合物に関するものであり、より
詳しくは生物体液その他の中の種々の化合物を分
析する場合における酵素又は天然もしくは合成の
酵素触媒活性を有するポリペプチド対からの触媒
活性の検出及び測定のために使用するのに適して
いる新規な試験試薬に関するものである。 種々の臨床目的、例えば投薬スケジユールの監
視、ホルモン水準の監視、最近の食物摂取又は生
物有効性のその後の薬理学的動力学、吸収、分解
又は排泄の検査、のためには、種々の薬品などの
濃度をナノモルもしくはピコモル水準で測定する
ことが非常に有利である。周知の如く、放射線免
疫検定によりこの種の分析を実施できる。分析を
行なうためには、認容できる装置又はシステムは
抗血清、標情もしくは既知の濃度の測定しようと
する化合物（すなわち分析物）、測定しようとす
る化合物の放射線ラベル付きの誘導体及び１種も
しくはそれより多い緩衝剤を含有してなければな
らない。抗血清は、例えば測定しようとする化合
物に対応するハプテン−蛋白質配合体（インミノ
ジエン）の接種により免疫にされている物質の採
血により製造される。 周知の如く、放射線免疫検定は一般に、放射能
でラベル付けされた分析物とラベルの付いてない
分析物の間の、抗血清中の抗体上の結合部位につ
いての競争を測定する。抗血清に既知量の試験し
ようとする分析物及び放射能ラベル付きの類似体
を加えることにより、結合又は遊離分析物対分析
物の濃度の投薬量応答曲線が構成される。この免
疫−目盛定めを行なつた後に、次に未知の濃度を
検定するために標準投薬量−応答曲線と比較する
ことができる。この型の検定にとつて重大なこと
は、非放射線活性分析物と有効に競争する放射線
活性分析物が存在するかどうかである。従つて、
試験の最大の精度、正確性、感度、特異性及び再
現性を得るためには、精製された良く特性の決め
られた合成放射性分析物が必要である。 放射線免疫検定方法ではいくつかの欠陥が確認
されている。まず第一に、遊離している放射ラベ
ル付き分析物から抗体に結合された放射ラベル付
き分析物を物理的に分離することが必要である。
さらに、この方法はどちらかといえば労力がかか
ると考えられており、そして必要な装置も同様に
比較的費用がかかり、均質に入手できず、しかも
そのような検定を正確に実施するためには高度に
訓練された熟練技術者の使用を必要としている。
同様に、放射性同位元素ラベル付き分析物は比較
的不安定であり費用がかかり、しかも一般に使用
されている放射性同位元素ラベルに伴なう放射線
露呈の危険性のため非常に厳格な排物廃棄処理問
題を呈する。これらの欠点にもかかわらず、放射
線免疫試験の使用は相当増えている。 しかしながら、臨床研究室での放射線免疫検定
の使用における最近の相当な成長は、ここに記さ
れているような放射線免疫検定方法の欠点を克服
する変法の開発に迫車をかけている。これらの欠
点を克服するために開発された方法は、放射性同
位元素ラベルの代りに酵素又は螢光ラベルを、好
適には物理的分離のための要件を省くこととなる
ラベルの付いた分析物の結合しているもの及び遊
離の断片間の化学的差違を測定できるような条件
と組み合わせて、使用することを主として包含し
ている。後者の簡単さ及び有利な特徴を有する免
疫検定は、物理的分離を必要とする不均質免疫検
定と対比して均質免疫検定と称されている。 従つて、抗体との複合化が生じるときにラベル
の酵素活性が減じられるような酵素−ラベル分析
物の使用に基いている均質な免疫検定システムが
開発された。濃度が測定されるべきラベルの付い
ていない分析物が、抗体と結合している酵素−ラ
ベル分析物と置換し、その結果酵素活性の増加を
生じる。増加した酵素活性（酵素活性の結果とし
て独特の発色団を最終的に生成する“基質”と称
されているものを用いて分光光度計により追跡さ
れている）を増加した分析物濃度に対してプロツ
トすると、標準的置換又は投与量−応答曲線が作
成される。これらを次に未知の濃度の測定用に使
用する。均質酵素免疫検定分野では下記の米国特
許が発行されている。 3817837；3852157；3875011；3966556；
3905871；4065354；4043872；4040907；
4039385；4046636；4067774；4191613；及び
4171244。これらの特許では、分析物用のラベル
は実質的に5000より大きい分子量を有する酵素で
あると記されている。この技術の商業化は、今の
ところは分析物が10^-10Mより大きい分析物の流
体濃度において比較的小さい分子寸法であるよう
な用途にだけ限られている。 上記の均質酵素免疫検定技術の制限のために、
螢光を用いるより感度の大きい均質免疫検定の開
発に向かつて相当な努力が払われてきた。それら
は主として例えば免疫グロブリンの如き比較的大
きい寸法の分子又は例えばインシユリンの如きポ
リペプチドホルモン用の試験に関している。下記
の米国特許がこの型の検定について発行されてい
る；3998943；3996345；4174384；4161515；
4208479及び4160016。これらの特許のほとんどの
ラベルは分析物又は抗体と結合している芳香族螢
光分子を包含している。また全てが抗体又は他の
螢光消光剤を通しての種々の螢光消光方法も包含
しており、その結果消光の程度は試料中に存在し
ている分析物の量と関連している。 反応物−ラベル螢光免疫検定として記されてい
る他の型の方法は、螢光性生成物が酵素で加水分
解されるときには該生成物が放出されるように設
定されている螢光−ラベル分析物の使用を包含し
ている。しかしながら分子の分析物部分に対する
抗体が酵素の加水分解を阻害する。従つて、質量
作用の法則により、螢光は、置換された螢光ラベ
ル分析物の酵素的加水分解のために、増加した分
析物の存在下では強化される。例えば、ラベル付
けされた分析物はβ−ガラクトシル−ウンベリフ
エロン−シソマイシンであるとする。酵素β−ガ
ラクトシダーゼはウンベリフエロン部分から糖を
開裂させ、それは次に螢光を発する。この方法を
記している刊行物には、ジエー エフ バード
（J.F.Burd）、アール シー ウオング（R.C.
Wong）、ジエー イー フイーニー（J.E.
Feeney）、アール ジエー カリコ（R.J.
Carrico）及びアール シー ボグオラスキ（R.
C.Boguolaski）、Clin.Chem.、23、1402（1977）；
バード（Burd）、カリコ（Carrico）、エム シー
フエツター（M.C.Fetter）、他．、Anal.
Biochem.、77、56（1977）及びエフ コーエン
（F.Kohen）、ゼツト ホランダー（Z.
Hollander）及びボグオラスキ（Boguolaski）、
Jour.of Steroid.、11、161（1979）が含まれる。 リボヌクレアーゼは広く分布されそして一般的
に周知のホスホジアステラーゼの１種であり、そ
れは一般にDNAとして知られているデオキシリ
ボ核酸のものではなく一般にRNAとして知られ
ているリボ核酸の3′−ヌクレオチド間りん酸エス
テル結合又は例えばビス（ｐ−ニトロフエニル）
ホスフエートの如き簡単なホスホジエステルのり
ん酸エステル結合の加水分解に特に触媒作用を与
える。リボ核酸の加水分解の機構の研究は文献中
にたくさん記録されている。エフ エム リチヤ
ード（F.M.Ricards）及びエイチ ダブリユ ウ
イツコフ（H.W.Wyckoff）、The Enzymes、（P.
D.Boyer、Ed）．アカデミツクプレス、3d版、４
巻、647〜806頁、ロンドン及びニユーヨーク
（1978）による論評を参照のこと。 これまでリボヌクリアーゼの触媒活性を監視
（追跡）するために多数の有機化合物が使用され
てきた。そのような有機化合物すなわち一般に基
質と称されているものには、リボ核酸自身、環式
りん酸ジエステル、及び天然基質により表わされ
るものと同一もしくは同様の構造拘束を示すモノ
リボヌクレオチド化合物が含まれる。 従つて、例えばリボヌクレアーゼの触媒活性を
監視するための一方法はリボ核酸溶液の使用を包
含している。この方法はリボ核酸溶液の300nｍ
における吸光度の減少を時間の函数として監視す
ることを包含している、M.Kunitz、J.Biol.
Chem.164、563（1946）。その方法は実施が比較的
簡単であるがいくつかの欠陥を有しており、特に
吸収値の減少値度が直線的でなく、各基質溶液の
目盛り定めが必要であり、そして300nｍにおけ
る吸光度減少の直接的監視は臨床試料には実用的
でない。 リボヌクレアーゼ活性を監視するために使用さ
れる他の方法は上記の工程の終点変法である。終
点変法工程では、酵母リボ核酸を酵素試料と一定
時間にわたつて倍養する。残存RNAを過塩素酸
又は酢酸ラウニル／トリフルオロ酢酸を用いて沈
殿させ、そして上澄み液の吸光度を遠心後に測定
する。エス ビ アニインセン（S.B.
Anfinsen）、アール アール レツトフイールド
（R.R.Redfield）、ダブリユ エル コエート
（W.L.Choate）、エー ペイジ（A.Page）及びダ
ブリユ アール カロル（W.R.Carrol）、Jour.
Biol.Chem.207、201（1954）。しかしながらこの
方法は出願中のフアリナ（Farina）等の出願中
に記載されている型の均質免疫検定には、主とし
て包含されている沈殿段階のために、非常にやつ
かいである。 上記の工程のさらに別の変法はアール シー
カム（R.C.Kamm）、エー ジー スミス（A.G.
Smith）及びエイチ ライオンズ（H.Lyons）の
Analyt.Biochem.37、333（1970）により報告され
ている。そこに記されている方法は染料である臭
化エチジウムと、加水分解生成物とではなく無傷
の酵母リボ核酸との反応から生じる螢光性反応生
成物の生成に基いている。その方法では、監視さ
れている螢光信号は時間につれて減少する。しか
しながら、時間につれて減少する螢光信号を追跡
するのは不利であり、その理由は酵素濃度の差が
さほどないということが生じたときにこの方法は
感度に欠けるということが生じ得るからである。
さらに、他の欠点は吸収値の減少速度が直線的で
なく各基質溶液の目盛り定めが必要であることで
ある。 リボヌクレアーゼ活性を監視するための他の公
知の基質はモノヌクレチオド基質であるシチジン
2′，3′−ホスフエートである。イー エム クツ
ク（E.M.Crook）、エー ピー マシアス（A.P.
Mathias）及びビー アール ラビン（B.R.
Rabin）、Biochem.J.74、234（1960）。その方法で
は環式りん酸塩環の加水分解に相当する286nｍ
における吸光度増加は２時間にわたつて監視され
て試料のリボヌクレアーゼ活性を測定する。しか
しながら、この方法はFarina他の共に出願中の
出願に記されている型の均質免疫試験方法では使
用できず、その理由は286nｍにおいて起こる分
析試料の干渉があるためである。さらに、基質と
生成物との吸収スペクトルの間の差異は小さく、
吸光係数の比は286nｍにおいて1.495でしかない。 さらに、3′−ウリジル酸、3′−イノシン酸及び
3′−アデニル酸の１−ナフチルエステルを含む、
ある種のモノヌクレオチド−3′−ホスホジエステ
ル類がリボヌクレアーゼ基質として使用されてい
る。これらのナフチルエステル類は種々の源から
のリボヌクレアーゼの基質特異性を区別するため
に使用されている。 H.Sierakowska、M.Zan−Kowalczewska、
及びD.Shugar、Biochem.Biophys.Res.Comm.、
19、138（1965）；M.Zan−Kowalczewska、A.
Sierakowska、及びD.Shugar、Acta.Biochem.
Polon.、13、237（1966）；H.Sierakowska及びD.
Shugar、Acta.Biochem.Polon.、18、143
（1971）；H.Sierakowska、H.Szemplinska、D.
Shugar、Biochem.Biophys.Res.Comm.11、70
（1963）リボヌクレアーゼ−誘導された加水分解
の結果、そのような基質の使用は１−ナフトール
の遊離を生じ、それはジアゾニウム塩と反応して
強い可視吸光度を有するアゾ化合物を生成する。
この方法は検定キツトが別個に包装された染料生
成試薬（すなわちジアゾニウム塩）を含むことが
必要である。モノヌクレオチド−3′−ホスホジエ
ステルの製造方法は周知である。合成法はR.
Kole及びH.SierakowskaのActa.Biochem.
Polon.18、187（1971）及びポーランド特許81969
中に開示されている。 リボヌクレアーゼ活性を運動論的に監視するた
めにはさらに他の化合物が使用されている。その
ような化合物には、１−ナフトール、５−ヒドロ
キシナフトール及び４−メトキシフエノールの
3′−ウリジル酸ホスホジエステルが含まれる。H.
Rubsmen、R.Khandler及びH.Witzel、Hoppe−
Seyler、Z.Physiol.Chem.355、687（1974）。しか
しながら、加水分解生成物は紫外線範囲内で、血
清干渉が生じると予期される280nｍもしくはそ
の付近で、直接監視される。さらに、これらの基
質の製造は長いクロマトグラフイ工程を含む多数
の段階を必要とするため困難である。 従つて、リボヌクレアーゼ活性を監視するため
に相当数の化合物が開発されそして使用されてい
るにもかかわらず、現在知られている基質の種と
の欠点を克服できる別の開発に対しての要望があ
る。 従つて、本発明の一目的は、基質の加水分解か
ら生じる触媒活性の直接的な分光光度計及び螢光
計の両者による監視用に使用できる物質種を含む
新規な基質を提供することである。 他の目的は、接触的に転化されて生成物の外観
が比較的短時間で運動論的に監視できるのに充分
なほど急速に生成物を与えるような新規基質の提
供である。 本発明のさらに他の目的は、極端に低い濃度に
おいてすらリボヌクレアーゼ活性に対して敏感な
新規基質を提供することである。関連目的は種々
の生理学的流体、例えば血清、尿など、の中で低
濃度においてリボヌクレアーゼ活性を容易に検出
できるようにする基質を提供することである。 本発明のさらに他の目的は容易に製造できる基
質を提供することである。 さらに他の目的は長期の加水分解安定性を有す
る封鎖形で貯蔵できる基質を提供することであ
る。関連目的は容易に封鎖除去できる封鎖された
基質を提供することである。 本発明の他の目的は免疫検定を行なう際に使用
できる基質を提供することである。関連目的は均
質免疫検定において使用できる基質を提供するこ
とである。 他の目的は遠心急速分析器中で均質免疫検定を
行なう際に使用できる基質を提供することであ
る。 本発明のこれらの及び他の目的及び利点は下記
の詳細な記載から明らかになるであろう。 本発明では種々の変更や別法に従いうるが、好
適な態様をここに詳しく記す。しかしながら、本
発明を開示されている特定形に限定しようとする
ものではないことは理解すべきである。一方、特
許請求の範囲中に記されている本発明の精神及び
範囲内の全ての変更や別法も、包含されることを
意図する。例えば基質の使用は主として免疫検定
に関して記されているが、基質を加水分解させる
ことのできる成分を有するどんな系をも監視する
ために基質を使用できることは認識すべきであ
る。従つて、基質をリボヌクレアーゼ又はペプチ
ターゼの存在を定量的に検出するために使用でき
る。（S.Levit及びM.S.Joshi、Analytical
Biochemistry、84巻、343〜345頁、1978）。 本発明は分光光度計又は螢光計による手段によ
り容易に検出できる生成物の加水分解による放出
を生じる触媒活性を監視するための新規基質に関
するものである。該基質は出願中のFarina等の
出願に記されている免疫検定方法で特に有用であ
る。 本発明の新規基質は出願中のFarina等の出願
に記されている免疫検定方法における特別の用途
が見出され、そこではポリペプチド対の一方の相
手（パートナー）でラベルされた分析物と、抗体
と、ポリペプチドの相手が、分析しようとする試
料中に一緒に存在している。ポリペプチドでラベ
ルされた分析物は、競争方式で、抗体又はポリペ
プチド相手のいずれかと結合できる。ポリペプチ
ドでラベルされた分析物がそれのポリペプチド相
手と結合するときには触媒活性が与えられるが、
ポリペプチドでラベルされた分析物が抗体と結合
するときには触媒活性は阻害される（すなわち現
われたり又は回復されたりしない）。 システムの平衡化反応のためにそして質量作用
の法則により、分析物は抗体と結合されているポ
リペプチドでラベルされた分析物と置換し、その
結果試料中にポリペプチド相手と結合可能な未結
合のラベルされた分析物が得られる。従つて、分
析物の不存在下では、減少された触媒活性が現わ
れる。しかしながら、分析物が試料中に存在して
いるなら、増加した触媒活性が生じ、これは本発
明の基質の使用により容易に監視できる。触媒活
性はラベルされた分析物が抗体と結合されている
ときには減少しているか又は阻害されるが分析物
の存在下では回復されるであろう。だから、基質
により監視される溶液の触媒活性は試料中に存在
している分析物の濃度と直接関連するであろう。 本発明に従うと、新規基質は下記の式を有す
る： 〔式中、Ｂは3′−位置におけるりん酸エステルの
加水分解を助けることのできるヌクレオチド塩基
であり、 Ｒはウンベリフエロニル、４−メチルウンベリ
フエロニル、３−フラボニル、ｏ−ニトロフエニ
ル、ｍ−ニトロフエニル、ｐ−ニトロフエニル、
ジニトロフエニル、シアノフエニル、アシルフエ
ニル、カルボキシフエニル、フエニルスルホネー
ト、フエニルスルホニル及びフエニルスルホキシ
ドからなる群から選択された部分であり、 R′は水素、アルキル、アルケニル、シクロア
ルキル、アリール、アラアルキル、アシル、オキ
サアルキル、チオアルキル、オキサシクロアルキ
ル及びチオシクロアルキルからなる群から選択さ
れた部分であり、そして R″は水素又はカルシウム、バリウム、リチウ
ム、ナトリウム、アンモニウム、置換されたアン
モニウム及びピリジニウムからなる群から選択さ
れたカチオンである〕 その他にしかも重要なことに、リボヌクレアー
ゼＡ−誘導加水分解の触媒活性を監視するために
適している基質を提供するために合致しなければ
ならないある種の立体的拘束があるようだ。すな
わち、塩基Ｂ並びに位置1′、2′、3′の置換基のト
ランス、シス配置がそれぞれ、適当な基質を提供
するための固定的な構造上の拘束を有しているよ
うだ。しかしながら、4′位置の置換基すなわち
CH₂OR′は、CH₂OR′基が2′及び3′の官能基の両
者に対してシスであるような配置を明らかにとる
ことができて、基質の望ましい属性に影響を与え
ない；A.Holy及びF.Sorn.Biochemica.
Biophysica.Acta.161、264（1968）。 塩基Ｂはある方式では、3′−位置のりん酸塩エ
ステルの酵素−又は触媒−誘導加水分解を助け
る。これは実際には塩基により引きおこされ、加
水分解用の酵素に関する適当な位置に基質を固定
させるのを助ける。さらに、塩基は多分加水分解
に伴なうプロトン転移を助けるであろう。 また、機能的観点からすると、塩基の選択には
もちろん生成物の安定性に対するそれの影響の他
に下記の要素を考慮にいれるべきである：(1)酵素
活性の任意の変調（増加又は減少）、(2)合成の難
度、(3)内因性酵素活性に対する影響及び(4)関与す
る水性又は他の媒体中での溶解度が実質的な程度
まで悪影響を受けてはならない。考慮すべき他の
要素には、加水分解に対する生じうる影響及び非
特異的な媒体誘導加水分解が含まれる。 多種のピリミジン類似体が使用でき、それらに
はウラシル、ジヒドロウラシル、シトシン、ジヒ
ドロシトシン及びハロゲン化されたウラシルが包
含される。さらに、天然の基質であるRNA並び
に種々の合成基質、例えばヌクレオチドホモ重合
体の両者のリボヌクレアーゼ誘導加水分解に対す
る結果から外挿されたデータ、F.M.Richards及
びW.W.Wyckoff、The Enzymes（P.D.Boyers
Ed.）、アカデミツク・プレス、３版、４巻、647
〜806頁（ロンドン及びニユーヨーク、1978）に
基くと、下記のピリミジン同族体が適当なベース
であるはずである： 【式】【式】【式】 【式】 【式】【式】 【式】【式】 【式】【式】 【式】 塩基としてプリン類似体、例えばアデノシン及
びグアノシン、を使用するとリボヌクレアーゼＡ
の触媒活性を監視するための活性基質は与えない
が、これらの塩基はリボヌクレアーゼT₂活性が
含まれているときには有用であると証明されるは
ずである。さらに、他のピリミジン、プリン又は
同様な類似体を前記の官能基の考察と柔盾せずに
使用できる。 好適な基Ｒは下記の４−メチルウンベリフエロ
ニルである： この基は螢光計及び分光光度計免疫検定の両者
に使用できる基質を提供する。従つて、この螢光
は強い分子吸収性を示し、そしてウエラーサイク
ルとして知られている現象、〔A.Weller；Prog.
in Reaction Kineties、１、189（1961）〕の結果
それはアルコール形で長波長に区別される螢光を
発する。この基質は315nｍにおいて吸収しそし
て375nｍにおいて螢光を発する。一方、加水分
解からのアルコール生成物は励起状態で容易にイ
オン化し、そして励起されたアニオンから放射が
生じる。しかしながら、励気されたアニオンは
440〜460nｍにおいて強くしかも有効な放射を示
し、それは基質の螢光放射並びに他の分析物試料
成分の螢光放射からは遠く離れている。従つて、
加水分解生成物である４−メチルウンベリフエロ
ニルは315nｍにおける螢光励起及び460nｍにお
ける放射監視により約４〜５の程度のPHにおいて
検出できる。実質的に試料干渉なしに５×10^-8M
の程度の低い螢光も検出可能であることが見出さ
れた。 比色計レポーター基としての４−メチルウンベ
リフエロニルの使用は、酸化物を生成するための
イオン化の結果アルコール加水分解生成物から生
じる区別された吸光度に基づくものである。基質
中の４−メチルウンベリフエロニル基についての
非イオン化アルコールは、約315nｍの波長にお
いて最大吸収する。しかしながら酸化物アニオン
は360nｍの波長において最大値を有する。基定
状態のアルコールは比較的弱い酸であるため、ア
ニオンの独特の吸収を検出するためには検定媒体
を約６〜８のPHに保たなければならない。一方、
約８より高いPHを使用すると基質の急速な媒体誘
導加水分解を生じるため、それは避けなければな
らない。 他の有用な発色団／螢光団Ｒ基は３−フラボニ
ルである。加水分解生成物のアルコールは容易に
検出できる特異な強い螢光を発する。しかしなが
ら、この分子に関しては、螢光信号はアルミニウ
ム⁽⁺³⁾イオンとのキレート化により顕著に強化さ
れる。３−ヒドロキシフラボン及びアルミニウム
⁽⁺³⁾イオンの溶液は、４−メチルウンベリフエロ
ニルの等モル量溶液からの螢光より20倍強い螢光
を有する。３−ヒドロキシフラボン及びそれのア
ルミニウム−キレート化分子の構造を以下に示
す： 【式】 【式】 多くのイオン化された芳香族アルコールはイオ
ン化されていないアルコールの吸収とは顕著に異
なる吸収を有する。この状態は例えばニトロ、ア
シル又はカルボキシルの如き電子吸引基を有する
多くの芳香族アルコール優勢で、そしてそれらは
吸光度が基質のものと顕著に異なるなら分光光度
計検出方法用の基質中でも使用できる。しかしな
がら、そのような物質は効率的な放射、すなわち
約0.4もしくはそれより大きい量子収量を有する
かどうかわからない。ウンベリフエロン自身は吸
収及び螢光放射条件の両者を満たし、そしてＲ基
に使用でき、並びにここで示されている他の有用
なＲ基の任意の他の置換された化合物又は実際に
そのような条件に同様に合う他の化合物も使用で
きる。さらに、発色団のみが必要であるときに適
している他のＲ基は、オルト及びパラ安息香酸又
はフエノールの酸性度を増加させる電子吸収性及
び共役性置換基を有するアリール基である。その
ような基には、オルト、メタ及びパラニトロフエ
ニル、ジニトロフエニル、シアノフエニル、アシ
ルフエニル、カルボキシフエニル、フエニルスル
ホネート、フエニルスルホニル及びフエニルスル
ホキシドが含まれる。一般に、モノ及びジ−置換
された誘導体の混合物も同様に適している。 基質用の構造式中の有用なR′基の詳しい記載
から多分わかるであろう如く、多種の基が適切に
使用できる。使用の際の特定の基の選択には下記
の機能上の考察を考慮すべきである：(1)関与する
水性もしくは他の媒体中の溶解度が相当程度悪影
響をうけてはいけないこと、(2)合成の難度、(3)内
因性酵素活性に対する効果、(4)酵素活性の変調
（増加又は減少）、及び(5)加水分解及び非特異的な
媒体誘導加水分解に対する効果。換言すると、特
定のR′基の選択は、特定の基が意図する検定に
おいて基質の性能に悪影響を与えない限り、主と
して合成の容易さにより決定されるであろう。
種々のR′基に関しては加水分解速度においてさ
ほど大きくない変化が見出されており、そしてこ
れは基質の性能に影響することもありえる〔R.
Kole、H.Sierakowska、D.Shu ar、Biochem.
Biophys.Acta.289、323（1972）〕。これは使用を
通して決められる。R′としてアセチルを使用す
ることが有用であると見出されている。 同様に、R″基に関しても厳しい条件はなく、
それの選択は合成条件により、特に基質生成物の
単離及び精製に関しての合成条件により決められ
る。R′の場合の如く、R″に関しても意図する検
定において基質の性能に悪影響を与えないような
選択が行なわれる。 本発明の基質はある種の環境下では媒体誘導加
水分解をうけることがあり得、そしてこれは基質
のレポーター分子への望ましくないバツクグラウ
ンドの転換を与える。この媒体誘導加水分解反応
はウンベリフエロン部分では、高いPHすなわち約
８以上では急速に起きるが、それより低いPHでは
非常にゆつくりしか起きない。これらの基質の長
期貯蔵（すなわち１日以上）をしようとするとき
には、このことは関心事となる。低いPH及び比較
的低い温度における貯蔵は加水分解を最少とする
であろう。 しかしながら、本発明の一面に従うと、2′置換
基を容易に除去できる遮蔽基で誘導体化すること
により媒体誘導加水分解が本質的に防がれるとい
うことが見出された。この目的に、長期貯蔵をし
ようとするときの、好適な組成は下記の式 〔式中、Ｒは封鎖基であり、そして Ｒ、R′、R″及びＢは本発明の新規な基質に関
する前記の式に関連して記されているのと同じ成
分である〕 より表わされる。 適当な2′−封鎖基は下記の基準に合致しなけれ
ばならない：(1)他のかぎとなる官能基に影響を与
えることなく容易に加えられ、(2)その後の合成段
階と適合性があり、そしてより詳しくはその様な
段階における望ましくない副反応を最少にするか
もしくはなしにすべきであり、(3)悪い有害な影響
を与えずに長期貯蔵できるほど充分安定であり、
そして(4)ホスホジエステル結合を分裂させずに容
易に除去される。これらの基準、特に最後のも
の、は酸触媒反応又はある種の求核的反応により
導入除去できる封鎖基の使用により最も容易に満
たされる。 従つて、適当な封鎖基Ｒにはシリル、オキサ
アルキル、チオアルキル、オキサシクロアルキル
及びチオアルキルが含まれる。より詳しくは、テ
トラヒドロピラニル、４−メトキシテトラヒドロ
ピラニル、１−エトキシエチル、ｔ−ブチルジメ
チルシリル、トリイソプロピルシリル及びｔ−ブ
チルテトラメチレンシリルが使用できる。最初の
３個の遮蔽基、すなわちテトラヒドロピラニル、
４−メトキシテトラヒドロピラニル及び１−エト
キシエチル、を使用するとケタール構造に導びか
れる。これらの封鎖基は、弱酸、例えば希塩酸も
しくは希酢酸、により、基質分子中の他のかぎと
なる官能基を分裂させることなく、容易に除去さ
れる。同様に、シリル遮蔽基は例えばテトラブチ
ルアンモニウムフルオライドの如き求核性試薬に
より容易に除去される。 Ｒ遮蔽基は基質自身の合成工程中にフラノシ
ド環の2′位置に挿入できる。しかしながら、満足
のいく長期貯蔵特性を与えるのに必須であるとは
信じられていないが、5′−位置における封鎖は合
成中に必要である。合成中の2′−及び5′−位置に
おける封鎖はこのようにして合成中間生成物の早
すぎる加水分解並びに2′−及び5′−位置における
望ましくない反応を防ぐ。5′−位置の遮蔽基は基
質の使用前に除去する必要はなく、そのため2′−
位置の封鎖の場合のように容易に除去できるとい
う条件は存在しない。 本発明の基質を製造するための一方法は、特定
の例示として、中間生成物としての2′−Ｏ−テト
ラヒドロピラニル−5′−Ｏ−アセチル−ウリジル
酸の合成を包含しており、それは次に遊離アルコ
ール系螢光団は発色団と縮合して上記の一般式内
の基質を生成する。合成段階を以下に図式的に示
し、ここでＲ基は前記で論じられている如くであ
る。 これからわかる如く、この方法はジアステレオ
マー対の発生の可能性を除くために5′−アセチル
置換基を使用している。最終的基質中の5′−アセ
チルの存在は前記で論じられている如き基質の触
媒誘導加水分解に評価できるほど影響を与えな
い。封鎖されたりん酸ジエステル種の精製に関す
る上記の式中に示されているクロマトグラフイ工
程は実施する必要はない。2′−位置における脱封
鎖後に、得られた生成物は検定においてさらに精
製せずに使用できるようにするほど充分な精製度
を有する。 りん酸ジエステルの酸触媒脱封鎖は、例えば水
の如きプロトン性溶媒中で緩やかな条件を用いて
希酸を用いて短時間で実施できる。例えば環境温
度の0.01〜0.05モル濃度の希塩酸が適している。
脱封鎖時間は、脱封鎖用試薬の濃度及び脱封鎖反
応を行なう温度により、比較的広い時間にわたつ
て変化できる。一般に、温度が高くなればなるほ
どそして酸の濃度が高くなればなるほど、適切な
反応時間は短かくなる。従つて、反応は約５分間
〜約24時間にわたつて実施できる。厳しすぎる反
応条件の使用は脱封鎖された基質の有害な加水分
解になるかもしれないため、それは避けるべきで
ある。 本発明の基質の第二の製造方法は、ある特定例
として、ターシヤリー−ブチルジメチルシリル封
鎖基の使用を包含しており、そして2′，5′−ジ
（ターシヤリ−ブチルジメチルシリル）−封鎖ウリ
ジンを生成するためのウリジンの直接的シリル化
に基いている。この合成を以下に図式的に示す。 脱封鎖反応は一般に、例えば、テトラブチルア
ンモニウムフルオライドのテトラヒドロフラン中
1M溶液を用いて約15℃〜約30℃の温度において、
約20分〜約30分間の時間にわたつて実施される。 下記の実施例は本発明の単なる説明であり、そ
して本発明の範囲を限定しようとするものではな
い。簡単に云うと、実施例〜XIIは一般に本発明
の基質の一般式内にはいる基質の製造に関するも
のである。下記の実施例〜並びに実施例XI及
びXIIは、前に示した米国出願中のKang等の出願
に示されている実施例〜並びに出願中の
Kangの出願に示されている実施例及びとそ
れぞれ同一である。実施例〜は一般に免
疫検定における本発明の基質の一般式内にはいる
基質の使用を示している。ここに記されている実
施例、及びは、前に示した出願中の
Farina等の出願に示されているそれぞれ実施例
、及びXIと本質的に同じである。 実施例 この実施例はウリジン2′，3′−環式ホスフエー
トの製造を説明する。 10ｇ、0.031モル ウリジン2′−及び3′−ホスフ
エートの混合物の74mlの3N−アンモニア中の溶
液を連続的に60mlのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミ
ド（DMF）及び15ｇ、0.075モル、のジシクロヘ
キシルカルボジイミドの60mlのターシヤリー−ブ
チルアルコール中溶液と混合した。生成した反応
混合物を120℃の油浴中で３時間還流した。 反応混合物の一部分に対して高圧液体クロマト
グラフイ（HPLC）分析を行なつて出発物質が生
成物に転化されたかどうかを測定した。反応生成
物混合物の一部分を真空下で（浴35℃）濃縮し、
残渣を水中に溶かし、そして溶液を5μｍミリポ
ア（Millipora）^Rフイルターを通して過した。
次に試料をワツトマン パルテイシル
（Whatman Partisil）^R10／25SACカラム中に注入
しそして20％の約PH6.25の0.05Mりん酸塩及び80
％の水からなる緩衝液で１ml／分の流速において
溶離した。HPLC分析は出発ウリジンの生成物へ
の定量的転化を示した。 全生成物混合物を次に室温に冷却し、そしてジ
シクロヘキシル尿素沈殿を過により分離し、そ
して20mlのDMFで洗浄した。液を次に真空下
で12〜15トルにおいて約35℃の浴温で蒸発させ、
そして残渣を100mlの水と共に振りその後過し
てジシクロヘキシル尿素を除去した。固体をさら
に20mlの水で洗浄し、そして一緒にした溶液を
150mlのエーテルで２回抽出し、その後真空中で
約35℃の浴温において蒸発乾固した。残渣を液体
窒素トラツプを用いて0.01トルにおいて100ml部
分ずつのピリジンで２回共蒸発させると、ガラス
状生成物であるウリジン2′，3′−環状ホスフエー
トが得られた。 実施例 この実施例は5′−Ｏ−アセチルウリジン2′，
3′−環式りん酸の製造を説明する。 実施例で製造されたウリジン2′，3′−環式り
ん酸を100mlの無水ピリジン及び200mlの無水酢酸
中に溶解させた。溶液を暗所で室温において一夜
保つた。この時点で、反応生成物の部分標本を
HPLCにより実施例で与えられている条件下で
分析した。HPLCは1.7分において１個の主ピー
クを示し、それは生成物である5′−Ｏ−アセチル
ウリジン2′，3′−環式りん酸を示している。全生
成物混合物を0.1〜１トルにおいて約35℃の浴温
で液体窒素トラツプを用いて蒸発乾固させた。残
渣を50mlずつのピリジンと２回共−蒸発させて残
留無水酢酸を除去し、そして次に100mlの50％水
性ピリジン中に溶解させた。室温において１時間
撹拌した後に、溶液を室温において0.05トルで蒸
発乾固させると、生成物である5′−Ｏ−アセチル
ウリジン2′，3′−環式りん酸が得られた。 実施例 この実施例は5′−Ｏ−アセチルウリジン3′−ホ
スフエートのアンモニウム塩の製造を説明する。 実施例で製造されたガラス状生成物である
5′−Ｏ−アセチルウリジン2′，3′−環式りん酸を
200mlの20％水性ピリジン中に溶解させた。この
溶液に５mlの水中の50mgの膵臓のリボヌクレアー
ゼを加えた。混合物を室温で一夜約15時間にわた
つて暗所で撹拌しながら保つた。この時点で、反
応生成物の一部分をHPLCにより実施例に与え
られている条件下で分析した。HPLCは4.5分に
おいて１個の主ピークを示し、それは生成物であ
る5′−Ｏ−アセチルウリジン−3′−ホスフエート
を示している。生成物混合物を次にDowex^R50W
−X8の2.2×４cmイオン交換樹脂カラム中に通
し、そこの中では100〜200メツシユの水素イオン
形樹脂は使用前にピリジニウム形に転化されてい
た。樹脂を300mlの20％水性ピリジンで溶離した。
溶離剤溶液を0.1〜１トルにおいて約35℃の浴温
で濃縮して油状残渣とした。油状残渣を５mlの水
及び200mlのテトラヒドロフラン（THF）の中に
溶解させた。溶液に27％NH₄OHを、もはや沈殿
が生成しなくなるまで、撹拌しながら滴々添加し
た。約３mlのNH₄OHが加えられた。混合物を一
夜冷たく保ち、過し、そして連続的に50mlの
THF及び50mlのアセトンで洗浄して、5′−Ｏ−
アセチルウリジン3′−ホスフエートのアンモニウ
ム塩を含有している生成物を集めた。 実施例 この実施例は5′−Ｏ−アセチル−2′−Ｏ（テト
ラヒドロピラン−２−イル）ウリジン3′−アンモ
ニウムホスフエートの製造を説明する。 12ｇ、0.026モル、の微粉状の実施例で製造
された5′−Ｏ−アセチルウリジン3′−ホスフエー
トのアンモニウム塩、160mlの無水Ｎ，Ｎ−ジメ
チルホルムアミド、及び70mlのジヒドロピランの
撹拌されている懸濁液を−20℃に冷却し、そして
14.2mlのジオキサン中の5M塩化水素で15分間に
わたり大気酸素を排しながら処理した。冷却用浴
を次に除き、そして透明溶液が得られるまですな
わち約２時間撹拌を続けた。室温で一夜貯蔵した
後に、混合物を−20℃に冷却し、そして12mlのト
リエチルアミン及び３mlの水酸化アンモニウムで
処理し、その後生成した懸濁液を500mlのTHF及
び500mlのエーテルの中に注いだ。中程度の多孔
性の焼結ガラスろうと上に集められた沈殿を50ml
ずつのエーテルで３回洗浄し、そして空気乾燥し
た。固体を次に0.1％のトリエチルアミンを含有
している200mlのクロロホルムと共にすり砕き、
そして再び吸引収集した。この工程をアセトン及
びその後0.1％トリエチルアミン含有アセトンを
用いて繰返した。最初は空気中でのそして次に
0.01トルにおける、空気乾燥後に、アンモニウム
塩生成物が得られた。 実施例 この実施例5′−Ｏ−アセチル−2′−Ｏ−（テト
ラヒドロピラン−２−イル）ウリジン−3′−（４
−メチルウンベリフエロン−７−イル）アンモニ
ウムホスフエートの製造を説明する。 1.00ｇ（2.01ミリモル）の実施例で製造され
た5′−Ｏ−アセチル−2′−Ｏ−（テトラヒドロピ
ラン−２−イル）ウリジンアンモニウムホスフエ
ート及び0.531（3.00ミリモル）の４−メチルウン
ベリフエロン及び1.52ｇ（5.02ミリモル）の２，
４，６−トリイソプロピルベンゼンスルホニルク
ロライドの６ｍの乾燥ピリジン中のものからなる
混合物を大気中の水分を除いて撹拌した。混合物
は室温における約30分後に徐々に均質な黄色溶液
となりはじめた。約１時間後に、ピリジンHCl塩
が沈殿した。一夜撹拌した後に、６mlの水を加
え、そして撹拌をさらに２時間続けた。混合物を
室温において真空中で液体窒素トラツプを用いて
濃縮し、そして固体生成物混合物を15mlの水中に
溶解させた。溶液を１回の抽出当り50mlのエーテ
ルを用いて、未反応の４−メチルウンベリフエロ
ンのほとんどが除かれるまで、５回抽出し、それ
は溶液が325nｍにおいて励起されたときの450n
ｍにおける螢光放射の減少により示された。水溶
液を真空中で凍結乾燥し、5′−Ｏ−アセチル−
2′−Ｏ−（テトラヒドロピラン−２−イル）ウリ
ジン−3′−（４−メチルウンベリフエロン−７−
イル）アンモニウムホスフエートを含有する生成
物を与えた。 実施例 この実施例は5′−Ｏ−アセチルウリジン−3′−
（４−メチルウンベリフエロン−７−イル）アン
モニウムホスフエートの製造を説明する。 使用前に、実施例で製造された5′−Ｏ−アセ
チル−2′−Ｏ−（テトラヒドロピラン−２−イル）
ウリジン−3′−（４−メチルウンベリフエロン−
７−イル）アンモニウムホスフエートを含有して
いる生成物を塩酸を用いて容易に脱封鎖した。 2′，5′−の脱封鎖されたホスホジエステルを含
有している15mgの生成物を１mlの0.01N HClに
加えて透明溶液を与えた。45分後に、生成物溶液
を１mlのエーテルで６回抽出して、残留４−メチ
ルウンベリフエロンを除去した。次に窒素を水溶
液中に吹きこんで残りの根跡量のエーテルを除去
した。PHが約5.0の0.1N酢酸ナトリウム緩衝液で
100mlに希釈することにより処理溶液を製造した。
基質は処理緩衝液中で４℃において少なくとも２
日間安定であつた。 実施例 この実施例は5′−Ｏ−アセチルウリジン3′−ホ
スフエートのカルシウム塩の製造を説明する。 実施例及びに記されている如くして（４ｇ
のウリジン2′−及び3′−りん酸異性体の混合物を
用いて）製造された5′−Ｏ−アセチルウリジン
2′，3′−環式りん酸を100mlの20％水性ピリジン
中に溶解させた。溶液に50mgの膵臓のリボヌクレ
アーゼＡを加えた。溶液を暗所で室温において15
時間撹拌した。 Dowex^R−50カラム中を通すことによりリボヌ
クレアーゼＡを除去した後に、溶液の一部分を
HPLCにより実施例に与えられている条件下で
分析した。分析は1.7分の所に非常に少量の出発
環式ホスフエートをそして4.5分のところに主生
成物ピークを示した。 さらに20mgのリボヌクレアーゼＡを残りの生成
物混合物に加え、そして混合物を室温においてさ
らに３時間撹拌した。生成物溶液を、160mlの20
％水性ピリジンで溶離することにより、Dowex^R
−50（１×５cm）カラム中に通した。溶液を約50
mlに濃縮し、そして５ｇの塩化カルシウムを含有
している1000mlの無水エタノール中に注いだ。混
合物を室温で２時間撹拌しそして次に放置してカ
ルシウム塩を沈殿させた。沈殿を3000rpmにおけ
る約５〜10分間の遠心により集め、その後エタノ
ールで繰返し洗浄し（７×150ml）、そして遠心し
た。 カルシウム塩ケーキを150mlずつのエーテルで
２回洗浄しそして空気中で乾燥した。真空中でさ
らに乾燥した後に、5′−Ｏ−アセチルウリジン
3′−ホスフエートのカルシウム塩を含有している
13.1ｇの生成物が得られ、それは4.5分における
１個の主生成物ピークを示すHPLC分析（上記の
条件下）により確認された。 実施例 この実施例は、2′−封鎖試薬として５，６−ジ
ヒドロ−４−メトキシ−2H−ピランを使用する
5′−Ｏ−アセチル−2′−Ｏ−（４−メトキシテト
ラヒドロピラン−４−イル）ウリジン−3′−カル
シウムホスフエートの製造を説明する。 １ｇの実施例で製造された5′−Ｏ−アセチル
ウリジン3′−カルシウムホスフエートを８mlの乾
燥Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中に溶解させ
た。この溶液に5.0ｇの５，６−ジヒドロ−４−
メトキシ−2H−ピランを加えた。溶液をアセト
ン−氷浴中で０℃以下に冷却した。撹拌されてい
る混合物に1.4mlのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミ
ド中5M塩化水素を水分排除雰囲気下で滴々添加
した。約20分後に、冷却浴を除去し、そして反応
混合物を室温において一夜15時間撹拌した。この
混合物をアセトン−氷浴中で再び冷却し、そして
25mlのトリエチルアミンを撹拌しながら滴々添加
した。生成物混合物を100mlのエーテル中に注ぎ
そして過して白色の粉末を集めた。粉末を100
mlのエーテルで洗浄し、その後100mlのクロロホ
ルム中１％トリエチルアミンで洗浄した。 固体を最初は空気乾燥し、そして次にさらに真
空中で乾燥して、5′−Ｏ−アセチル−2′−Ｏ−
（４−メトキシテトラヒドロピラン−４−イル）
ウリジン−3′−カルシウムホスフエートを含有し
ている1.398ｇの生成物を与えた。 0.01Mりん酸塩緩衝液、PH6.3での溶離、流速
１ml／分、253nｍにおける紫外線検出という条
件のワツトマン パルテイシル（Whatman
Partisil^R）PXS10／25SAXカラム上でのHPLC
は3.4分において生成物を示すが、出発物質は4.7
分間の保有時間を有していた。 実施例 この実施例は5′−Ｏ−アセチル−2′−Ｏ−（４
−メトキシテトラヒドロピラン−４−イル）ウリ
ジン−3′−（４−メチルウンベリフエロン−７−
イル）ホスフエートの製造を説明する。 1.1ｇの水素イオン形のバイオ−ラド（Bio−
Rad）AG^R50W−X8カチオン交換樹脂をピリジ
ニウム形に転化した。カラムに、冷たい50％ピリ
ジン溶液中に溶解されている、実施例で製造さ
れた5′−Ｏ−アセチル−2′−Ｏ−（４−メトキシ
テトラヒドロピラン−４−イル）ウリジン3′−カ
ルシウムホスフエートを含有している100mgの生
成物を加え、そしてカラムを270mlの50％ピリジ
ン溶液で溶離した。溶出溶液を氷水浴中で冷却さ
れているフラスコ中で集めた。溶出溶液を回転蒸
発器上でドライアイストラツプを用いて約25℃の
浴温において15mlに濃縮した。残りの溶液を真空
中で液体窒素トラツプ（0.05トル）を用いて室温
でさらに濃縮すると、ガラス状残渣が得られた。
残渣を、乾燥ピリジンと共に２回蒸発させること
によりさらに乾燥した。 最後に、残渣を１mlの乾燥ピリジン中に溶解さ
せ、そして混合物に52.72mgの４−メチルウンベ
リフエロン及び102.7mgの２，４，６−トリイソ
プロピルベンゼンスルホニルクロライドを加え
た。混合物を氷−水浴中で撹拌しながら15分間冷
却した。生成した黄色溶液を室温でさらに２時間
撹拌し、そして約４〜８℃で一夜すなわち約15時
間撹拌した。全生成物混合物を次に３mlのテトラ
エチルアンモニウムブロマイドの飽和溶液と共に
５分間撹拌し、そして次にクロロホルムで５回抽
出した。クロロホルム層を真空中で濃縮して635
mgの淡灰色の固体の粗生成物を生成した。 ホスホジエステルを、炭酸水素アンモニウム緩
衝液で溶離されるアニオン交換カラムクロマトグ
ラフイによりさらに精製した。適当な部分を、実
施例に与えられている方法で封鎖除去した後
に、RNaseを用いる検定により同定した。この
ようにして同定された部分を集めそして濃縮して
137mgの固体を与え、それを次にメタノール中に
溶解させそして真空中で繰返し蒸発させて炭酸水
素アンモニウムを除去した。その結果、5′−Ｏ−
アセチル−2′−Ｏ−（４−メトキシテトラヒドロ
ピラン−４−イル）ウリジン3′−（４−メチルウ
ンベリフエロン−７−イル）ホスフエートを含有
している59mgの生成物が得られた。 実施例 この実施例は5′−Ｏ−アセチル−2′−Ｏ−（４
−メトキシテトラヒドロピラン−４−イル）ウリ
ジン3′−フラボニルホスフエートの製造を説明す
る。 実施例で製造された2′−Ｏ−（４−メトキシ
テトラピラン−４−イル）−5′−Ｏ−アセチル−
3′−ウリジンカルシウムホスフエートを含有して
いる50mgの生成物を、ピリジニウム形のバイオ−
ラド（Bio−Rad）AG^R50W−X8、カチオン交換
カラム中に通すことにより、ピリジニウム塩に転
化した。ピリジン溶液を真空中で濃縮し、そして
乾燥ピリジンと共に繰返し蒸発させることにより
さらに乾燥すると、ガス状残渣が得られた。 ガラス状残渣を１mlの乾燥ピリジン中に溶解さ
せ、そして溶液に35.6ｇの３−ヒドロキシフラボ
ン及び51.4mgの２，４，６−トリイソプロピルベ
ンゼンスルホニルクロライドを、氷水浴中で窒素
範囲中で撹拌しながら加えた。15分後に、混合物
を室温まで暖め、そして週末まで、約３日間撹拌
した。 反応混合物を次に生成物の生成に関して監視し
た。反応混合物の0.3ml部分を１mlの飽和テトラ
アセチルアンモニウムブロマイドと共に撹拌し、
そしてクロロホルムで４回抽出した。クロロホル
ムを蒸発させ、そして生成した黄色の固体を
0.01N HClで40分間処理した。溶液を次にPH５
において４×10^-3M塩化アルミニウム⁽及び１％
ジメチルスルホキシドを含有している0.1M酢酸
塩緩衝液で緩衝させた。生成した緩衝された溶液
は、リボヌクレアーゼ（RNase）酵素の存在下
で、アルミニウムキレート化３−ヒドロキシフラ
ボンの螢光放射特性を生じ、それにより希望する
生成物が生成したことを示した。 反応混合物の残部を２mlのテトラエチルアンモ
ニウムブロマイドの飽和溶液と共に５分間撹拌し
た。混合物を次にクロロホルムで４回抽出した。
クロロホルム層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥
し、そして濃縮して、0.355ｇの黄色の固体生成
物を与えた。生成物を2.5×6.5cmのシリカゲルカ
ラム上でクロマトグラフイによりさらに精製し、
そしてクロロホルム中10％メタノールで溶離し
た。それぞれ100mlの分画を集め、そして９、10
及び11の分画は、酸中で脱封鎖してそして
RNaseを用いて検定したときに、正の基質活性
を有することを示した。 ９、10及び11の分画を一緒にしそして濃縮する
と、5′−Ｏ−アセチル−2′−Ｏ−（４−メトキシ
テトラヒドロピラン−４−イル）ウリジン3′−フ
ラボニルホスフエートを含有している160mgの生
成物が得られた。 実施例 XI この実施例は2′，5′−ビス−ｔ−ブチルジメチ
ルシリルウリジンの製造を説明する。 2′，5′−ビス−ｔ−ブチルジメチルシリル−ウ
リジンの製造においては、11.39ｇ、0.0466モル、
のウリジンを80mlのピリジン中に、室温において
約５分間撹拌することにより、溶解させた。次
に、21.09ｇ、0.140モル、のｔ−ブチルジメチル
シリルクロライドをピリジン溶液に加え、そして
混合物を乾燥管の付いたフラスコ中で室温におい
て約62時間撹拌した。反応混合物を150mlのエー
テルで希釈し、そして次に過して、ピリジン−
HClを除去した。エーテル−ピリジン液を回転
蒸発器上で濃縮し、そして次に高真空下で液体窒
素トラツプを用いて濃縮した。 シリカゲル上での２容量部のエーテル及び１容
量部のヘキサンからなる溶媒を用いる反応生成物
混合物の一部分の薄層クロマトグラフイは、それ
ぞれRf0.65、0.5及び0.3において三成分を示した。 油状の反応生成物混合物の残部を、粒子寸法
0.063〜0.2mm及び70〜230メツシユ（ASTM）の
シリカゲル60（EM^R試薬、ロツト番号7953179）
からなる4.2×44cmシリカゲルカラム上に於て、
２容量部のヘキサン及び１容量部の酢酸エチルか
らなる溶媒を用いてクロマトグラフイにかけて、
反応生成物混合物の三成分を分離した。上記の条
件下で薄層クロマトグラフイにより同定された、
0.5Rfを有する部分を一緒にした。さらに、Rf0.3
及び0.65成分を含有している部分を再びクロマト
グラフイにかけて別のRf0.5生成物を単離した。
Rf0.5を有する成分を含有していると見出された
全ての部分を一緒にした。一緒にされた収量は
8.961ｇ、すなわち40.5％、であつた。生成物の
融点（123〜125℃）及びn.m.r.スペクトル
（CDCl₃）から、生成物が2′，5′−ビス−ｔ−ブチ
ルメチルシリルウリジンであることを確認した。 実施例 XII この実施例は2′，5′−ビス−ターシヤリー−ブ
チルジメチルシリル−3′−ウリジン（４−メチル
ウンベリフエロン−７−イル）ホスフエートの製
造を説明する。 この実施例では、2′，5′−ビス−ターシヤリー
−ブチルジメチルシリル−ウリジンをホスホリル
化して反応中間生成物を生成し、それを４−メチ
ルウンベリフエロンと反応させた。 丸底フラスコ中で、0.2386ｇの2′，5′−ビス−
ターシヤリー−ブチルメチルシリルウリジンを５
mlの乾燥ピリジン中に溶解させた。溶液を真空中
で蒸発乾固した。残渣固体を７mlの乾燥テトラヒ
ドロフラン及び４mlのピリジン中に再び溶解さ
せ、そして氷水浴中で大気水分を排しながら撹拌
しながら冷却した。撹拌されている冷溶液に0.5
mlのオキシ塩化りんを、空気の漏れない注射器を
用いて加えた。混合物を冷却用浴中で５分間、そ
して次に室温で1.5時間撹拌した。ピリジンHCl
塩がフラスコの底に沈殿した。 中間生成物の生成を監視するために、反応混合
物の一部分を薄層クロマトグラフイにより分析し
た。クロマトグラフイはシリカゲル板上で、５：
２：３の容量比の酢酸エチル、クロロホルム及び
ヘキサンからなる溶媒システムを用いて行なわれ
た。分析はもともとのものの付近のRfを有する
成分を示した。しかしながら、Rf0.55を有する成
分は存在せず、そのことはウリジン出発物質は完
全に消費されたことを示している。 反応混合物の残部を真空中で液体窒素トラツプ
を用いて濃縮して未反応のオキシ塩化りんを除去
した。残渣に0.107ｇの４−メチルウンベリフエ
ロンを加え、そして混合物を氷−水浴中で大気水
分を排するために窒素雰囲気下で冷却した。混合
物に、４mlの乾燥ピリジンを加え、そして生成し
た溶液を室温で40分間撹拌した。 生成した淡黄色溶液の一部分を薄層クロマトグ
ラフイにより上記と同じ条件下で分析した。2′，
5′−ビス−ターシヤリー−ブチルジメチルシリル
3′−ウリジン−（４−メチルウンベリフエロン−
７−イル）ホスフエートであると信じられている
新しい螢光スポツトが見出された。 溶液の残りを真空中で濃縮してガラス状の油と
した。油を５mlのテトラヒドロフラン（THF）
中に懸濁させた。THF溶液に20mlのエーテルを
加え、そして混合物を冷たい室中に約４〜８℃に
おいて貯蔵すると生成物が沈殿した。生成物を
過により集めそしてP₂O₅上で真空中で乾燥して
0.572ｇの淡灰色の粉末を与えた。この方法で得
られた生成物はn.m.r.により2′，5′−ビス−ター
シヤリー−ブチルジメチルシリルウリジン3′−
（４−メチルウンベリフエロン−７−イル）ホス
フエートを含有していることが確認された。 2′，5′−ビス−ターシヤリー−ブチルジメチル
シリル−ウリジン−3′−（４−メチルウンベリフ
エロン−７−イル）ホスフエートを実施例に示
されているのと同じ工程で脱封鎖して3′−ウリジ
ン−（４−メチルウンベリフエロン）ホスフエー
トを生成し、それは酵素検定により同定された。
リボヌクレアーゼ（RNase）酵素を用いる検定
では、検定混合物は325nｍにおいて励起されそ
して3′−ウリジン（４−メチルウンベリフエロン
−７−イル）ホスフエートの酵素加水分解から生
じる螢光性４−メチルウンベリフエロンの450n
ｍにおける放射が監視された。 実施例 この実施例はラベルされた分析物としてチロキ
シン−Ｓ−ペプチドをそして螢光性基質として
5′−Ｏ−アセチルウリジン−3′−（４−メチルウ
ンベリフエロン−７−イル）ホスフエートを用い
る対照置換曲線の作成を説明する。下記の試薬を
製造した： ａ チロキシン−Ｓ−ペプチドでラベルされた分
析物： 米国出願中のFarina他の実施例〜に記
されている方法で製造された物質をPH5.0の
0.1M酢酸ナトリウム緩衝液中で１：2000の率
により希釈した。 ｂ 抗体：抗血をPH5.0の0.1M酢酸ナトリウム緩
衝液を用いて１：2000の率により希釈した。 ｃ Ｓ−蛋白質：精製された物質をPH5.0の0.1M
酢酸ナトリウム緩衝液を用いて２×10^-5Mとし
た。 ｄ 基質：17mgの5′−Ｏ−アセチル−2′−Ｏ−
（テトラヒドロピラン−２−イル）ウリジン
3′−（４−メチルウンベリフエロン−７−イル）
アンホニウムホスフエートを0.01HCl中で45分
間撹拌し、そして次にエーテルで抽出した。PH
５の50mlの0.01M酢酸ナトリウム緩衝液を次に
加えて基質溶液を与えた。 ｅ チロキシン抗体規準 人間の血清を含んでいる水性媒体中で0n
ｇ／ml、30nｇ／ml、60nｇ／ml、120nｇ／ml、
及び240nｇ／mlのチロキシン濃度を与えるよ
うなチロキシン溶液を新しく製造した。 75マイクロリツトルの標準的チロキシン溶液を
20μの0.5N水酸化ナトリウムで室温において10
分間予備処理した。100マイクロリツトルの抗体
及び300μのチロキシン−Ｓ−ペプチドでラベ
ルされた分析物溶液を次に加え、そして混合物を
室温で30分間培養した。1.8mlの基質及び100μ
のＳ−蛋白質からなる混合物を次に加えた。５分
間培養した後に、螢光性の増加速度を10分間にわ
たつて監視した。 自動20試料チエンジヤー（モデル047−67059）
を備えたAminco^Rフイルター螢光計（モデルJ4
−7440）を用いて、325nｍの励起及び440nｍの
放射を使つた。データ点は自動的データ採取シス
テムにより０、５及び10分の時刻に各試料に対し
て採取した。表１に結果をまとめる。 【表】 上記のデータは、結合されているラベルされた
分析物の置換がチロキシン分析物の濃度の増加に
つれておきるということを示している。置換曲線
を得るためには、２ケ所の点に対するデータを平
均し、そして％結合分数（％Ｂ／Bo）を下記の
式から計算する： Ｂ／Bo×100＝合計速度−速度Bn／合計速度−速
度Bo 〔速度Bnは０でない基準に相当する速度であり、
そして速度Boは０基準溶液に相当するものであ
る〕。 結果を下表２に示す。 【表】 上記のデータは対照置換曲線を作成するために
使用でき、そこでは速度、％Ｂ／Bo又はロジツ
ト変形か標準濃度の函数としてプロツトされてい
る。 実施例 この実施例はセントリフイケム（Centrifi
Chem^R）500遠心急速分析器に対するジランチン
分析物用の対照置換曲線の作成を説明する。比色
計基質である5′−Ｏ−アセチル−ウリジン−3′−
（４−メチルウンベリフエロン−７−イルホスフ
エートを使用した。 下記の試薬を製造した： ａ ジランチン−Ｓ−ペプチドでラベルされた分
析物： 0.1Mトリエタノールアミン（TEA）−HCl緩
衝液中の、出願中のFarina他の実施例〜
に記されている方法で製造された物質を使用し
た。 ｂ 抗体：抗ジランチン抗血清をPH7.1の0.1M
TEA−HCl緩衝液で１／20の率により希釈し
た。 ｃ 基質：17mgの5′−Ｏ−アセチル2′−Ｏ−（テ
トラヒドロピラン−２−イル）ウリジン3′−
（４−メチルウンベリフエロン−７−イルアン
モニウムホスフエート）を75μの0.05N HCl
に加え、そして室温で30分間撹拌した。酢酸ナ
トリウム緩衝液（1880ml、0.1M、PH5.0）を加
えた。使用直前に、300μのこの溶液を5094
mlのPH7.1の0.1M TEA−HCl緩衝液と一緒に
した。 ｄ Ｓ−蛋白質：Sigma精製市販物質をPH7.1の
0.1M TEA−HCl緩衝液で１：100の率により
希釈して1.53×10^-6Mの濃度を有する溶液を与
えた。 ｅ ジランチン標準：５，５−ジフエニルヒダン
トインナトリウム塩（Sigmaロツト64C−
0027）の貯蔵溶液を、48mgの１の0.025N水
酸化ナトリウム中に溶解させることにより、製
造した。これを0.025N水酸化ナトリウムで
１：10の率により希釈して4.8μｇ／mlを有する
溶液を与えた。これをさらに希釈して、19.1、
47.8、95.8、143.6及び191.5nｇ／mlの濃度を有
する標準溶液を与えた。 Centrifi Chem^R500遠心急速分析器は下記の
装置設定を有していた：ヨーター温度、30゜；
フイルター、340nｍ；To、10秒；Ｔ、１分；
ABS1.0μ；ブランク、支持；試験方式、
Term；プリントアウト、ABS；濃度因子、
０；試験コード０。 抗体、ジランチン−Ｓ−ペプチド及び16.6μ
の標準溶液を転移デイスクのみぞ３〜16の試料だ
めの中にピペツトで加えた。Ｓ−蛋白質及び
300μの基質を転移デイスクの対応する試薬だ
めのそれぞれの中にピペツトで加えた。転移デイ
スクをローター上に置きそして回転させた。吸収
値の読みを１分間隔で５分間にわたつて測定し、
そしてCentrifi Chem^Rデータ採取単位により示
した。触媒活性速度（a.u.／分）が吸収値の最少
平方回帰分析から時間の函数として得られた。 データを下表３にまとめる。 【表】 実施例 この実施例は臨床試料を直接検定できる検定計
画、セントリフイケム（Centri Chem^R）500遠心
急速分析器に付いている自動的ピペツター（モデ
ルＰ−500）の使用、及び自動的データ類別の使
用を説明する。 下記の試薬を使用した： ａ ラベル付けされた分析物： 0.1Mトリエタノールアミン（TEA）−HCl緩
衝液中の、出願中のフアリナ（Farina）等の
実施例〜に記されている方法で製造された
ジランチン−Ｓ−ペプチドラベル分析物を使
用。 ｂ 抗体：抗ジランチン抗血清（150μ）をPH
7.1の0.1M TEA−HCl緩衝液900μで希釈し
た。 ｃ 基質：5′−Ｏ−アセチル2′−Ｏ−（テトラヒ
ドロピラン−２−イル）ウリジン3′−（４−メ
チルウンベリフエロン−７−イルアンモニウム
ホスフエート）（6.4mg）を285μの0.05N HCl
に加え、そして室温で30分間撹拌した。酢酸ナ
トリウム緩衝液（714.8ml、0.1M、PH5.0）を加
えた。 ｄ Ｓ−蛋白質：Sigma Ｓ−蛋白質の12.3×
10^-5M溶液を0.1M TEA−HCl緩衝液（PH7.1）
中で製造した。 ｅ ジランチン基準：５，５−ジフエニルヒダン
トインナトリウム塩（Sigmaロツト64C−
0027）を人間の血清中で2.5、5.0、10.0、20.0
及び30.0μｇ／mlの濃度で製造した。 16μのＳ−ペプチドでラベル付けされた分析
物、10μの人間の血清アルブミン、1430μの
TEA−HCl緩衝液及び(c)に記されている基質溶
液の混合物を製造した（試薬１と称する）。150μ
の抗体、50μのＳ−蛋白質及び1937.5μの
TEA緩衝液からなる第二の混合物を製造した
（試薬２と称する）。Centrifi Chem^RＰ−500自動
的ピペツターを用いて4μの適当な基準溶液を
同時に45μの脱イオン化されたH₂Oで希釈しそ
して転移デイスクの試料だめの中にピペツトで加
えた。同時にピペツターは250μの試薬１を試
薬だめの中にそして100μの試薬２を試料だめ
の中に分配させた。セントリフイケム（Centrifi
Chem^R）500遠心高速分析装置のパラメータは、
試験コード29を用いたこと以外は、実施例の
ものと同一であつた。これはセントリフイケム
（Centrifi Chem^R）500装置のマイクロプロセツ
サー単位により自動的なデータ類別を与えた。 下記のデータが得られた。 【表】 【表】 マイクロプロセツサー単位中に貯蔵されている
ロジツト−ログ基準曲線は、7.4の％標準偏差を
有していた。一般に貯蔵されている曲線から誘導
される計算された標準濃度は表４に示されている
如く分析物濃度範囲にわたつて実際の標準濃度と
満足のいくように合致した。 上記の原案を対照用及び臨床用の両者の試料の
直接的検定に使用できる。例えば、気液クロマト
グラフイ（glc）測定を基にして23.4μｇ／mlのジ
ランチン濃度を有する臨床的試料が上記の対の検
定により23.3±．7μｇ／mlの濃度を有しているこ
とが見出された。同様にglcにより2.0μｇ／mlの
濃度を有する臨床用試料が3.1±．1μｇ／mlの濃
度を有していることも見出された。このことは臨
床用試料において予想される分析物濃度範囲にわ
たる良好な正確性及び感度を示している。さら
に、データは自動的ピペツト添加及びデータ類別
に対するこの検定の適合性を示しており、従つて
使用した遠心高速分析器システムの全能力の利点
を利用している。最後に、データは抗体、Ｓ−蛋
白質及びジランチン−Ｓ−蛋白質でラベルされた
分析物の濃度の調整を実証しており、Ｐ−500ピ
ペツターにより自動的に実施されるものより良好
に、あらかじめ希釈することなく臨床用試料の直
接の測定を可能にしている。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 下記の構造式 〔式中、Ｂは3′−位置におけるりん酸エステルの
   加水分解を助けることのできるヌクレオチド塩基
   であり、 Ｒはウンベリフエロニル、４−メチルウンベリ
   フエロニル、３−フラボニル、ｏ−ニトロフエニ
   ル、ｍ−ニトロフエニル、ｐ−ニトロフエニル、
   ジニトロフエニル、シアノフエニル、アシルフエ
   ニル、カルボキシフエニル、フエニルスルホネー
   ト、フエニルスルホニル及びフエニルスルホキシ
   ドからなる群から選択された部分であり、 R′は水素、アルキル、アルケニル、シクロア
   ルキル、アリール、アラアルキル、アシル、オキ
   サアルキル、チオアルキル、オキサシクロアルキ
   ル及びチオシクロアルキルからなる群から選択さ
   れた部分であり、そして R″は水素又はカルシウム、バリウム、リチウ
   ム、ナトリウム、アンモニウム、置換されたアン
   モニウム及びピリジニウムからなる群から選択さ
   れたカチオンである〕 を有する基質であり、該基質は3′−位置において
   りん酸エステルの酵素誘導加水分解をうけて分光
   光度計又は螢光計により追跡（モニター）できる
   ような物質種を生成可能であるような基質。 ２ Ｂがピリミジン類似体である、特許請求の範
   囲第１項記載の基質。 ３ Ｂがウラシル、ジヒドロウラシル、シトシ
   ン、ジヒドロシトシン及びハロゲン化されたウラ
   シルからなる群から選択された一員である、特許
   請求の範囲第２項記載の基質。 ４ Ｂがウラシルである、特許請求の範囲第２項
   記載の基質。 ５ Ｒがウンベリフエロニルである、特許請求の
   範囲第１項記載の基質。 ６ Ｒが４−メチルウンベリフエロニルである、
   特許請求の範囲第１項記載の基質。 ７ Ｒがフラボニルである、特許請求の範囲第１
   項記載の基質。 ８ R′がアセチルである、特許請求の範囲第１
   項記載の基質。 ９ R″がカルシウムである、特許請求の範囲第
   １項記載の基質。 １０ R″がアンモニウム又は置換されたアンモ
   ニウムからなる群から選択された一員である、特
   許請求の範囲第１項記載の基質。 １１ りん酸エステルの3′−位置における媒体誘
   導加水分解に対して少なくとも本質的に安定であ
   りそして下記の構造式 〔式中、Ｂは基質の脱封鎖後にりん酸エステルの
   3′−位置における加水分解を助けることのできる
   ヌクレオチド塩基であり、 Ｒはウンベリフエロニル、４−メチルウンベリ
   フエロニル、３−フラボニル、ｏ−ニトロフエニ
   ル、ｍ−ニトロフエニル、ｐ−ニトロフエニル、
   ジニトロフエニル、シアノフエニル、アシルフエ
   ニル、カルボキシフエニル、フエニルスルホネー
   ト、フエニルスルホニル及びフエニルスルホキシ
   ドからなる群から選択された部分であり、 R′は水素、アルキル、シクロアルキル、アリ
   ール、アラアルキル、アシル、オキサアルキル及
   びオキサシクロアルキルからなる群から選択され
   た部分であり、 R″は水素又はカルシウム、バリウム、リチウ
   ム、ナトリウム、アンモニウム、置換されたアン
   モニウム及びピリジニウムからなる群から選択さ
   れたカチオンであり、 Ｒはりん酸エステルの3′位置における媒体誘
   導加水分解を本質的に防止することのできる封鎖
   基であり、Ｒは除去されてりん酸エステルの
   3′位置における触媒誘導加水分解をうけて分光光
   度計又は螢光計により追跡（モニター）可能な物
   質種を生成する能力により特徴づけられている基
   質を与えることができる〕 を有する基質。 １２ 5′位置における成分がＲである、特許請
   求の範囲第１１項記載の基質。 １３ Ｒがテトラヒドロピラニル、４−メトキ
   シテトラヒドロピラニル、１−エトキシエチル及
   びｔ−ブチルジメチルシリルからなる群から選択
   された一員である、特許請求の範囲第１２項記載
   の基質。 １４ Ｒがｔ−ブチルジメチルシリルである、
   特許請求の範囲第１３項記載の基質。 １５ R′がアセチルでありそしてＲがテトラ
   ヒドロピラン−２−イルである、特許請求の範囲
   第１１項記載の基質。