JPS5931798A - 合成基質シチヂン３′−りん酸エステル誘導体とこれらを用いたリボヌクレア−ゼ活性の測定方法 - Google Patents
合成基質シチヂン３′−りん酸エステル誘導体とこれらを用いたリボヌクレア−ゼ活性の測定方法Info
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- JPS5931798A JPS5931798A JP57140493A JP14049382A JPS5931798A JP S5931798 A JPS5931798 A JP S5931798A JP 57140493 A JP57140493 A JP 57140493A JP 14049382 A JP14049382 A JP 14049382A JP S5931798 A JPS5931798 A JP S5931798A
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は膵がんの診断に有効な血清中のボヌクレアーゼ
活性の測定方法とその測定に必要な合成基礎シチジン３
’−りん酸エステル誘導体並びにその製造方法に関する
ものである。
活性の測定方法とその測定に必要な合成基礎シチジン３
’−りん酸エステル誘導体並びにその製造方法に関する
ものである。
膵がんによる死亡率は近年増加しており、その理由とし
て初期診断の困難なことが上げられている。
て初期診断の困難なことが上げられている。
そのため、検査が容易で且つ膵がんに特異性のある生科
学的検査法の開発が強く望まれている。膵がん診断のた
めの生化学的検査としては血清中のアミラーゼ、フェリ
チン、エラスターゼ工などの測定が広く行なわれている
が、これらは膵がんと良性疾患、或いは膵がんと他のガ
ンとの判別が即ち特異性に欠けることが広く指摘されて
いる。
学的検査法の開発が強く望まれている。膵がん診断のた
めの生化学的検査としては血清中のアミラーゼ、フェリ
チン、エラスターゼ工などの測定が広く行なわれている
が、これらは膵がんと良性疾患、或いは膵がんと他のガ
ンとの判別が即ち特異性に欠けることが広く指摘されて
いる。
血清中リボヌクレアーゼ活性値が膵がんの場合に特異的
に高値を示すことがレッディ（プロシーチングオフナシ
ョナルアカデミーサイエンス７３巻 ２３０８項 １９
７６年）によって報告され、我が国に於いても多数の研
究者によってその有用性が確認されている。
に高値を示すことがレッディ（プロシーチングオフナシ
ョナルアカデミーサイエンス７３巻 ２３０８項 １９
７６年）によって報告され、我が国に於いても多数の研
究者によってその有用性が確認されている。
膵がんの場合、血清中で上昇するリボヌクレアーゼはリ
ボ核酸のなかでもシトシン塩基を持ったヌクレオチドユ
ニットの３’−りん酸エステルを含むホスホジエステル
結合部分を優先的に加水分解することが知られている。
ボ核酸のなかでもシトシン塩基を持ったヌクレオチドユ
ニットの３’−りん酸エステルを含むホスホジエステル
結合部分を優先的に加水分解することが知られている。
その様なことからレッディ（上記に引用）は合成リボ核
酸であるポリシチジル酸を基質として用いている。この
方法の大略は次の通りである。
酸であるポリシチジル酸を基質として用いている。この
方法の大略は次の通りである。
被検血清とポリシチジル酸とを３７℃、１５分間インキ
ュベートする。次に冷却化で酸を加えて２０分間放置后
、冷却下３０分間遠心分離する。上澄液の一部を取って
みず出希釈した后、シチジル酸の最大吸収波長２７８ｍ
ｍの吸光度を測定する。
ュベートする。次に冷却化で酸を加えて２０分間放置后
、冷却下３０分間遠心分離する。上澄液の一部を取って
みず出希釈した后、シチジル酸の最大吸収波長２７８ｍ
ｍの吸光度を測定する。
このレッディ法の欠点として次の基項が挙げられる。
遠心分離などを含む他段階検査法であるため、多数検体
を短時間に測定することができない。
を短時間に測定することができない。
基礎として用いるポリシチジル酸の分子量によって測定
値が変動する。
値が変動する。
血清希釈法により酵素濃度変化と吸光変化との間に直線
関係が得られない。
関係が得られない。
リボヌクレアーゼ活性が高い場合には基礎不足を生じる
ため血清の希釈再検査を行なわなくてはならない。
ため血清の希釈再検査を行なわなくてはならない。
酵素反応の初速度など速度論的解析ができない。
本発明者らはこれらの事情を考慮し、この検査の汎用性
の向上並びに精度向上を目的として鋭意研究し、リボヌ
クレーゼによってジエステル結合が加水分解されると同
時に遊離する残基にもとづイ吸光度変化を反応素に与え
る新規シチジン３’−りん酸エステル誘導体を発明する
に至った。
の向上並びに精度向上を目的として鋭意研究し、リボヌ
クレーゼによってジエステル結合が加水分解されると同
時に遊離する残基にもとづイ吸光度変化を反応素に与え
る新規シチジン３’−りん酸エステル誘導体を発明する
に至った。
この発明によって従来のポリシジル酸を基質とする方法
では不可能だった自動分析基を用いたレート・アッセイ
法が可能となったことをはじめ、数分以内の短時間で測
定することも可能となった。
では不可能だった自動分析基を用いたレート・アッセイ
法が可能となったことをはじめ、数分以内の短時間で測
定することも可能となった。
又、インジコ生成性の残基を含む基礎を用いる場合いに
はジエステル結合の加水分解后、水不溶性のインジゴ色
素を生成するため、リボヌクレアーゼのアイスエンザイ
ムを測定する場合極めて好都合である。
はジエステル結合の加水分解后、水不溶性のインジゴ色
素を生成するため、リボヌクレアーゼのアイスエンザイ
ムを測定する場合極めて好都合である。
本発明にかかわる新規合成基礎はＮ２，２’，５’保護
の３′−シチジル酸と発色性を持った共香族性化合物と
を縮合材を用いて結合するか或は、Ｎ４、２’、５’保
護のシチジンと発色性を持った共香族性化合物のリン酸
エステルを結合するかいずれかの方法で基質の中間体を
得た后、保護基を離脱することによって製造することが
出来る。上に述べた発色性を持った今日香族性化合物と
はα−ナフトール、４−メチルウムベリフェロン、ρ−
＝トロフェノール、５−ヨード又は５’置換インドキン
ルであり、基質としてホスホジエステル結合している場
合は特有の色々は傾向を示さないが、一旦加水分解によ
って遊離すると特有の性質を示す化合物のことを指して
いる。
の３′−シチジル酸と発色性を持った共香族性化合物と
を縮合材を用いて結合するか或は、Ｎ４、２’、５’保
護のシチジンと発色性を持った共香族性化合物のリン酸
エステルを結合するかいずれかの方法で基質の中間体を
得た后、保護基を離脱することによって製造することが
出来る。上に述べた発色性を持った今日香族性化合物と
はα−ナフトール、４−メチルウムベリフェロン、ρ−
＝トロフェノール、５−ヨード又は５’置換インドキン
ルであり、基質としてホスホジエステル結合している場
合は特有の色々は傾向を示さないが、一旦加水分解によ
って遊離すると特有の性質を示す化合物のことを指して
いる。
本新規合成基質は通常はアンモニウム塩として取得され
るが、トリエチルアンモニウム塩など他の塩型及び遊離
型として取得することも可能である。
るが、トリエチルアンモニウム塩など他の塩型及び遊離
型として取得することも可能である。
本新規合成基質は牛膵由来のリボヌクレアーゼによって
加水分解を受け、その反応液の着色、紫外部吸収或いは
蛍光強度の変化を不時的に追跡することが出来、従来困
難であったリボヌクレアーゼ活性の速度論的解析を可能
ならしめた。又、人血清中のリボヌクレアー図も本基質
に対して牛膵由来のリボヌクレアーゼと同様に反応した
。
加水分解を受け、その反応液の着色、紫外部吸収或いは
蛍光強度の変化を不時的に追跡することが出来、従来困
難であったリボヌクレアーゼ活性の速度論的解析を可能
ならしめた。又、人血清中のリボヌクレアー図も本基質
に対して牛膵由来のリボヌクレアーゼと同様に反応した
。
以下具体例を示して本発明を説明するが、本実施例をも
って発明の内容を限定しているもではない。
って発明の内容を限定しているもではない。
実施例１
Ｎ，５’−ジアセチル−２’−（１−エトキシエチル）
シチジン ３’−ホスフェート １ミリモルとα−ナフ
トールとをビリジン２０ｃｃにとかし、ジンクロヘキシ
ルカルボジイミド１５ミリモルを加えて室温で４８時間
反応させる。ピリジンを留去后、蒸留残粕をエーテルに
て数回洗浄する。残粕に濃アンモニア・メタノール液（
１：１）を加え、室温にて一晩放置后、濃縮乾固する。
シチジン ３’−ホスフェート １ミリモルとα−ナフ
トールとをビリジン２０ｃｃにとかし、ジンクロヘキシ
ルカルボジイミド１５ミリモルを加えて室温で４８時間
反応させる。ピリジンを留去后、蒸留残粕をエーテルに
て数回洗浄する。残粕に濃アンモニア・メタノール液（
１：１）を加え、室温にて一晩放置后、濃縮乾固する。
残粕を水に溶かし、セファデックスＬＨ−２０型カラム
上に流し、ついで０．１Ｍ トリエチルアンモニウム・
バイオーボネート（ｐＨ８．０）を用いてクロマトグラ
フィー操作を行なう。紫外部吸収モニターで溶離液を調
べ、目的物の中間体である画分を集める。この分画を集
め凍結乾燥して２’−（１−エトキシエチル）シチジン
３′−ホスフェノートのナフチルエステルアンモニウ
ム塩 ０．６５ミリモルを得た。
上に流し、ついで０．１Ｍ トリエチルアンモニウム・
バイオーボネート（ｐＨ８．０）を用いてクロマトグラ
フィー操作を行なう。紫外部吸収モニターで溶離液を調
べ、目的物の中間体である画分を集める。この分画を集
め凍結乾燥して２’−（１−エトキシエチル）シチジン
３′−ホスフェノートのナフチルエステルアンモニウ
ム塩 ０．６５ミリモルを得た。
ペーパークロマトグラフィー（０．０５％さく酸：イソ
プロパノール＝２：８）にてＲｆ０．７９の単一スポッ
トを与えた。この中間体に２０ＣＣの０．１Ｎぎ酸を加
え室温にて３時間かくはんする。この溶液を凍結乾燥し
アンモニウム α−ナフチル ３′−シチジレート〔Ｉ
） ０．６５ミリモルを得た。紫外部吸収スペクトルは
中間体と同じ。ペーパークロマトグラフィー（展開溶剤
は上記と同じ）にてＲｆ０．５８の単一スポットを与え
た。牛膵臓由来のリボヌクレアーゼとインキュベートす
ることによってα−ナフトールを生成した。
プロパノール＝２：８）にてＲｆ０．７９の単一スポッ
トを与えた。この中間体に２０ＣＣの０．１Ｎぎ酸を加
え室温にて３時間かくはんする。この溶液を凍結乾燥し
アンモニウム α−ナフチル ３′−シチジレート〔Ｉ
） ０．６５ミリモルを得た。紫外部吸収スペクトルは
中間体と同じ。ペーパークロマトグラフィー（展開溶剤
は上記と同じ）にてＲｆ０．５８の単一スポットを与え
た。牛膵臓由来のリボヌクレアーゼとインキュベートす
ることによってα−ナフトールを生成した。
同様の方法にてα−ナフトールの代わりに４−メチルウ
ムベリフェロンヌはρ−ニトロフェノールを用いること
により、それぞれアンモニウム ４−メチルウムベリフ
ェル ３’−シチジレート（ＩＩ）又はアンモニウム
Ｐ−ニトロフェニル ３’−シチジレート（ＩＩＩ）を
得た。
ムベリフェロンヌはρ−ニトロフェノールを用いること
により、それぞれアンモニウム ４−メチルウムベリフ
ェル ３’−シチジレート（ＩＩ）又はアンモニウム
Ｐ−ニトロフェニル ３’−シチジレート（ＩＩＩ）を
得た。
実施例２
２’，５’−ジ（１−エトキシエチル）−Ｎ−ジメチル
アミノメチレンシチジン １ミリモルとαーナフチルホ
スホロクロリデート（α−ナフトール １０ミリモルと
オキン塩化りんとをピリジン中で反応させることにより
得る）とをピリジン中で室温２４時間反応させる。ピリ
ジンを留去后、残粕を水にとかし、セファデックスＬＨ
−２０型カラムに流し ０．１Ｍ トリエチルアンモニ
ウム・バイカーボネート（ｐＨ８．０）を用いてクロマ
トグラフィーを行い、目的物の中間体である分画を集め
る。
アミノメチレンシチジン １ミリモルとαーナフチルホ
スホロクロリデート（α−ナフトール １０ミリモルと
オキン塩化りんとをピリジン中で反応させることにより
得る）とをピリジン中で室温２４時間反応させる。ピリ
ジンを留去后、残粕を水にとかし、セファデックスＬＨ
−２０型カラムに流し ０．１Ｍ トリエチルアンモニ
ウム・バイカーボネート（ｐＨ８．０）を用いてクロマ
トグラフィーを行い、目的物の中間体である分画を集め
る。
この分画を凍結乾燥して２’，５’−ジ（１−エトキシ
エチル）−Ｎ−ジメチルアミノメチレンシチジン３′−
ホスフェートのαナフチルエステル０．５２ミリモルを
得た。
エチル）−Ｎ−ジメチルアミノメチレンシチジン３′−
ホスフェートのαナフチルエステル０．５２ミリモルを
得た。
この中間体に２０ＣＣの０．１Ｎぎ酸を加え室温にて３
時間かくはんする。この溶液を凍結乾燥し、アンモニウ
ム α−ナフチル ３′−シチジレート（Ｉ）０．５２
ミリモルを得た。この物質の性質は実施例１で得たもの
と同一であった。
時間かくはんする。この溶液を凍結乾燥し、アンモニウ
ム α−ナフチル ３′−シチジレート（Ｉ）０．５２
ミリモルを得た。この物質の性質は実施例１で得たもの
と同一であった。
αーナフチルホスホロクロリデートの代わりにＮ−アセ
チルーインドキシルホスホロクロリデート及びＮ−アセ
チルー５ーヨードインドキシルホスホロクロリデートを
用い、上記操作のうちピリジン留去后濃アンモニア水を
加え、室温で８時間処理し、ついでアンモニア水を留去
し、セファデックスＬＨ−２０型カラム以降の操作を上
記と同様な方法で行ない、アンモニウムインドキシル３
’−シチジレート（Ｖ）及びアンモニウム ５−ヨード
ーインドキシル ３′−シチジレート（ＩＶ）を得た。
チルーインドキシルホスホロクロリデート及びＮ−アセ
チルー５ーヨードインドキシルホスホロクロリデートを
用い、上記操作のうちピリジン留去后濃アンモニア水を
加え、室温で８時間処理し、ついでアンモニア水を留去
し、セファデックスＬＨ−２０型カラム以降の操作を上
記と同様な方法で行ない、アンモニウムインドキシル３
’−シチジレート（Ｖ）及びアンモニウム ５−ヨード
ーインドキシル ３′−シチジレート（ＩＶ）を得た。
（Ｖ）及び（ＩＶ）は人血清とインキュベートすること
により紫色のインジゴ色素を生成した。
により紫色のインジゴ色素を生成した。
実施例３
アンモニウム α−ナフチル ３’−シチジレート（Ｉ
）を用いたリボヌクレーゼ活性の測定例を次に示す。
）を用いたリボヌクレーゼ活性の測定例を次に示す。
０．０５モル トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン−塩酸緩衝液（ｐＨ６．３、塩化ナトリウムを加えて
最終イオン強度を０．１に調整）に（Ｉ）を１０−４モ
ル／リットルの濃度に溶かし、その３ＣＣを光路長１ｃ
ｍのセルに入れスペクトロホトメーター（日立３３０型
）の波長を３２２ｎｍ、恒温槽の温度を２５℃にセット
する。一方上記と同じ緩衝液に牛膵臓由来の結晶リボヌ
クレアーゼを１０−２ミリグラム／ｃｃの濃度に溶かし
た酵素液０．０５０ｃｃをセルに加え迅速にかくはん后
直ちに吸光度の変化を読む。吸光度は毎分４．７８×１
０−３の割合で直線的に変化した。
ン−塩酸緩衝液（ｐＨ６．３、塩化ナトリウムを加えて
最終イオン強度を０．１に調整）に（Ｉ）を１０−４モ
ル／リットルの濃度に溶かし、その３ＣＣを光路長１ｃ
ｍのセルに入れスペクトロホトメーター（日立３３０型
）の波長を３２２ｎｍ、恒温槽の温度を２５℃にセット
する。一方上記と同じ緩衝液に牛膵臓由来の結晶リボヌ
クレアーゼを１０−２ミリグラム／ｃｃの濃度に溶かし
た酵素液０．０５０ｃｃをセルに加え迅速にかくはん后
直ちに吸光度の変化を読む。吸光度は毎分４．７８×１
０−３の割合で直線的に変化した。
上記牛膵臓由来のリボヌクレアーゼの代りに、献上人血
清及び膵がん患者血清を各１０例づつを摂取し、各血清
０．０５ｃｃづづをとって吸光度変化を求めた結果、膵
がん患者の毎分当りの吸光度変化の平均値は正常な人の
血清のそれよりも３．２倍高い値で統計的に高度に有為
な差を示した。
清及び膵がん患者血清を各１０例づつを摂取し、各血清
０．０５ｃｃづづをとって吸光度変化を求めた結果、膵
がん患者の毎分当りの吸光度変化の平均値は正常な人の
血清のそれよりも３．２倍高い値で統計的に高度に有為
な差を示した。
又これら血清検体の吸光度変化率はポリシチジル酸を用
いて得たリボルクレアーゼ活性値よく相関した。
いて得たリボルクレアーゼ活性値よく相関した。
図は本発明にかかわる新規合成基質シチジン ３’−リ
ん酸エステル誘導体の一般式を示したものであり、式中
ＲはＩ：α−ナフチル基、ＩＩ：４−メチルウベリフェ
リル基、ＩＩＩ：ρ−＝ニトロフェニル基、ＩＶ：５−
ヨード−３インドリル基、Ｖ：３−インドリル基である
ことを示す。 特許出願人 青柳象平 同上 市野元信 手続補正書（方式） 昭和５７年１２月１８日 特許庁長官殿 昭和５７年１２月１６日差出１事件の表
示 昭和５７年特許願第１４０４９３号２発明の名称
合成基質シチジン３’−りん酸エステル誘導体とこ
れらを用いたり ボヌクレアーゼ活性の測定方法 ３補正をする者 事件との関係 特許出願人 住所 千葉県四街道市みそら３町目 １１番 １５号氏
名 青柳象平 ４．代理人 住所 氏名 ５補正命令の日付 昭和５７年１１月３０日６．補正の
対象 明細書の図面の簡単な説明の欄 図面 ７補正の内容 別紙の通り 手続補正書（自発） 昭和５８年７月１３日 特許庁長官 若 杉 和 夫 殿 １、事件の表示 昭和５７年特許願給１４０４９３号 ２、発明の名称 合成基質シチヂン３′−りん酸エステル誘導体とこれら
を用いたりポヌクレアーゼ活性の測定方法 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 ４、補正の対象 願書、明細書及び図面 ５、補正の内容 別紙の通り 明 細 書 １、発明の名称 合成基質シチヂン３′−りん酸エステル誘導体とこれら
を用いたりボヌクレアーゼ活性の測定方法。 ２、特許請求の範囲 （１）図に示した構造式を有するシチヂン３′−りん酸
エステル誘導体及びその塩。 （２）Ｎ２，２’，５’−保護の３′−シチヂル酸とＲ
ＯＨ（Ｒは図示）で示される化合物、但しＲが■又はＶ
の場合はそのＮ保護化合物とを縮合し、ついで縮合物か
ら保膜基をはずすことを特徴とする第１項で規定した化
合物の製造方法。 （３）Ｎ４，２’，５’−保護のシチヂンとＲＯＰＯＣ
Ｌ２（Ｒは図示）で示されるホスホロクロリデート、但
しＲが■又はＶの場合はそのＮ保護のホスホロクロリデ
ートとを縮合し、ついで縮合物から保護基をはずすこと
を特徴とする第１項で規定した化合物の製造方法。 （４）第１項で規定した化合物を基質として用いること
を特徴とするりボヌクレアーゼ活性の測定方法。 ３、発明の詳細な説明 本発明は膵がんの診断に有用な血清中リボヌクレアーゼ
活性の測定方法とその測定に必要な合成基質シチヂン３
′−りん酸エステル誘導体並びにその製造方法に関する
ものである。 膵がんによる死亡率は近年著増しており、その理由とし
て初期診断の困難なことが挙げられている。 そのため、検査が容易で且つ膵がんに特異性のある生化
学的検査法の開発が強く望まれている。膵がん診断のた
めの生化学的検査としては血清中のアミラーゼ、フェリ
チン、エラスターゼエなどの測定が広く行なわれている
が、これらは膵がんと良性疾患、或いは膵がんと他のが
んとの鑑別力即ち特異性に欠けることが広く指摘されて
いる。 血清中リボヌクレアーゼ活性値が膵がんの場合に特異的
に高値を示すことがレッデイ（プロシーヂング オプ
ナショナル アカデミ−サイエンス ７３巻 ２３０８
頁 １９７６年）によって報告され、我が国に於いても
多数の研究者によってその有用性が確認されている。 膵がんの場合、血清中で上昇するりポヌクレアーゼはリ
ポ核酸のなかでもシトシン塩基を持ったヌクレオチドユ
ニットの３′−りん酸エステルを含むホスホジエステル
結合部分を優先的に加水分解することが知られている。 その様なことからレツディ（上記に引用）は合成リボ核
酸であるポリシチヂル酸を基質として用いている。この
方法の大略は次の通りである。 被検血清とポリシチヂル墳とを３７℃、１５分間インキ
ュベートする。次に冷却下で酸を加えて２０分間放置后
、冷却下３０分間遠心分離する。上澄液の一部をとりて
水で希釈した后、シチヂル酸の最大吸収波長２７８ｎｍ
の吸光度を測定する。 このフッディ法の欠点として次の事項が挙げられる。 遠心分離などを含む多段階検査法であるため、多数検体
を短時間に測定することが出来ない。 基質として用いるポリシチヂル酸の分子量によって測定
値が変動する。 血清希釈法による酵素濃度変化と吸光度変化との間に直
線関係が得られない。 リボヌクレアーゼ活性が高い場合には基質不足を生じる
ため血清の希釈再検査を行わなくてはならない。 酵素反応の初速塵など速度論的解析が出来ない。 本発明者らはこれらの事情を考慮し、この検査の汎用性
の向上並びに精度向上を目的として鋭蒼研究し、リボヌ
クレアーゼによってジエステル結合が加水分解されると
同時に遊離する残基にもとづく吸光度変化を反応系に与
える新規シチヂン３′−りん酸エステル誘導体を発明す
るに至った。 この発明によって従来のポリシチヂル酸を基質とする方
法では不可能だった自動分析機を用いたレート・アッセ
イ法が可能となりたことをはじめ、数分以内の短時間で
測定することも可能となった。 又、インジコ生成性の残基を含む基質を用いる場合には
ジエステル結合の加水分解后、水不溶性のインジゴ色素
を生成するため、リボヌクレアーゼのアイソエンザイム
を測定する場合極めて好都合である。 本発明Ｋかかわる新規合成基質はＮ”、２’、５’保護
の３′−シチヂル酸と発色性を持りた芳香族性化合物と
を縮合剤を用いて結合するか或いは、Ｎ’、２’、５′
保護のシチヂンと発色性を持った芳香族性化合物のリン
酸エステルを結合するか何れかの方決で基質の中間体を
得た后、保護基を離脱することによって製造することが
出来る。上に述べた発色性を持った芳香族性化合物とは
α−ナフトール。 ４−メチルウムベリフエｐン、か１−二トρフェノール
、５−ヨード又は５無置換インドキシルであり、基質と
してホスホジエステル結合している場合は特有の色又は
螢光を示さないが、一旦加水分解によって遊離すると特
有の性質を示す化食物のことを指している。 本新規合成基質は通常はトリエチルアンモニウム塩とし
て取得されるが、アンモニウム塩など他の塩型及び遊離
型として取得することも可能である。 本新規合成基質は午睡由来のりボヌクレアーゼによって
加水分解を受け、その反応液の着色、紫外部吸収或いは
螢光強度の変化を径時的に追跡することが出来、従来困
難であったりボヌクレアーゼ活性の速度論的解析を可能
ならしめた。又、人血清中のりボヌクレアーゼも本基質
に対して午睡由来のりポヌクレアーゼと同様に反応した
。 以下具体例を示して本発明を説明するが、本実施例をも
って発明の内容を限定しているものではない。 実施例 １ Ｎ、５′−ジアセチル−２’−（１−エトキシエチル）
シチヂン ３′−ホスフェート １ミリモルとα−ナフ
トールとをピリジン２０ Ｃ，Ｃ，にとかし、ジシクロ
ヘキシルカルボジイミド１５ミリモルを加えて室温で４
８時間反応させる。ピリジンを溜去后、蒸溜残渣をエー
テルにて数回洗浄する。残渣に濃アンモニア・メタノー
ル液（１：１）を加え、室温にて１晩放置后、濃縮乾固
する。残渣を水に溶かし、セファデックスＩ、Ｈ−２０
聾カラム上に流し、次いでＱ、ＩＭ）！Ｊエチルアンモ
ニウム・パイカーボネート（ｐＨ８，０）を用いてクロ
マトグラフィー操作を行なう。紫外部吸収モニターで溶
離液を調べ、目的物の中間体である両分を集める。 この分画を集め凍結乾燥して２’−（１−エトキシエチ
ル）シチヂン ３′−ホスフェートのαナフチルエステ
ルトリエチルアンモニウム塩０．６５ミリモルｆｔ 得
り。λＦ′Ｏ：２７３ｎｍ、ξ”０：１．０４ｍａｘ
２７３ ×１ひ、ペーパークロマトグラフィー（０，０５チさく
酸：イソプロパノール＝２：８）にてＲｆｏ、７９の単
一スポットを与えた。この中間体１ｃ ２０ Ｃ，Ｃ０
の０．ＩＮ ぎ酸を加え室温にて３時間攪拌する。 この溶液を凍結乾燥しトリエチルアンモニウムα−ナフ
チル ３′−シチヂレー） 〔Ｉ） ０．６５ミリモル
を得た。紫外部吸収スペクトルは中間体と同じ。ペーパ
ークロマトグラフィー〔展開溶剤は上記と同Ｌ ） Ｋ
テＲｆ０．５ ｇ の単一スポットを与えた。午睡臓
由来のりポヌクレアーゼとインキュベートすることによ
ってα−ナフトールを生成した。 同様の方法にてα−ナフトール０代わりに４−メチルウ
ムベリフエｐン又はシーニド−フェノールを用いること
により、それぞれトリエチルアンモニウム ４−メチル
ウムベリフェリル ３′−シチヂレート〔■〕又はトリ
エチルアンモニウム ｐ−二トｐフェニル ３′−シチ
ヂレー） ＣＩＩＩ）を得た。 実施例 ２゜ ２／ 、 ５１−ジ（１−エトキシエチル）−Ｎ−ジメ
チル７ミノメチレンシチヂン １ミリモルとα−ナフチ
ルホスホロクｐリゾート（α−ナフトール１０ミリモル
とオキシ環化りんとをピリジン中で反応させることによ
り、得る）とをピリジン中で室温２４時間反応させる。 ピリジンを漏失后、残渣を水にとかし、セファデックス
ＬＩ（−２０型カラムにｉＬ ０．ＩＭ ）リエ
チルアンモニウム・バイヵーボネー） （ｐＨ８，０）
を用いてりｐマドグラフィーを行ない、目的物の中間体
である分画を集める。この分画を凍結乾燥して２’ 、
５’−ジ（１−エトキシエチル）−Ｎ−ジメチル７ミ
ノメチレンシチヂン３′−ホスフェートのα−ナフチル
エステル トリエチルアンモニウム塩０．５２ミ！Ｉモ
ルＨ，Ｏ、Ｈ！０ ・ を得た。λ 、３１５ｎｍ、 ξ 、３．２７
Ｘ １０４゜ｍａｘ
３１５この中間体に２０ Ｃ，Ｃ，の０．ＩＮぎ酸を加
え室温にて３時間攪拌する。この溶液を凍結乾燥し、ト
リエチルアンモニウム α−ナフチル ３′−シチヂレ
ー）ＣＩ）０．５２ミ！Ｊモルを得た。この物質の性質
は実施例１で得たものと同一であった。 α−ナフチルホスホｐクロリデートの代りにＮ −７セ
チルーインドキシルホスホロクロリデート及びＮ−７セ
チルー５−ヨードインドキシルホスホｐりｐリゾートを
用い、上記操作のうちピリジン榴去后濃アンモニア水を
加え、室温で８時間処理し、ついでアンモニア水を漏失
し、セファデックスＬＨ−２０型カラム以降の操作を上
記と同様な方法で行ない、トリエチルアンモニウム イ
ンドキシル ３′−シチヂレー） （Ｖ）及びトリエチ
ルアンモニウム ５−ヨード−インドキシル ３′−シ
チヂレー） ＯＶ＋を得た。 ＥＶ）及び［、Ｉｖ）は人血清とインキュベートすると
とＫより紫色のインジゴ色素を生成した。 実施例 ３゜ ９− トリエチルアンモニウム α−ナフチル ３′−シチヂ
レート〔Ｉ〕を用いたりボヌクレアーゼ活性の測定例を
次に示す。 ０．０５モル トリス（ヒドロキシメチル）アミンメタ
ン−塩酸緩衝液［ｐＨ６，３，塩化ナトリウムを加えて
最終イオン強度を０□１に調整］にＣＩ）を１０−４モ
ル／リットルの濃度に溶かし、その３１ｃｃ、を光路長
１１Ｍのセルに入れスペクトルホトメーター（日立３３
０型）の波長を３２２ ｎｍ 、恒温槽の温度を２５′
０にセットする。一方上記と同じ緩衝液に牛・膵臓由来
の結晶リボヌクレアーゼを１０” ｉリグラム／ＣＣの
濃度に溶かした酵素液０．０５０Ｃ１１１゜をセルに加
え迅速に攪拌−后直ちに吸光度の変化を読む。吸光度は
毎分４．７８ Ｘ １０ の割合で直線的に変化した
。 上記牛・膵臓由来のりポヌクレアーゼの代りに、健常人
血清及び膵がん患者血清を各１０例づつを採取し、各血
清０．０５０ Ｃｒ、づつをとって吸光度変化を求めた
結果、膵がん患者の毎分当りの吸光度変化の平均値は正
常な人の血清のそれよりも３．２１０− 倍高い値で統計的に高度に有意な差を示した。 又、これら血清検体の吸光度変化率はポリシチヂル酸を
用いて得たりポヌクレアーゼ活性値とよく相関した。 ４、図面の簡単な説明 第１図は本発明にかかわる新規合成基質シチヂン ３′
−りん酸エステル誘導体の一般式を示したものであり、
式中ＲはＩ：α−ナフチル基、■：４−メチルウムベリ
フエリル基、＋ｎ ： ｐ−二トμフェニルＭ、ＩＶ：
５−ヨード−３−インドリル基、ｖ：３−インドリル基
であることを示す。 特許出願人 青 柳 象 平 同 −ヒ 市 野 元 信１１− 第１図
ん酸エステル誘導体の一般式を示したものであり、式中
ＲはＩ：α−ナフチル基、ＩＩ：４−メチルウベリフェ
リル基、ＩＩＩ：ρ−＝ニトロフェニル基、ＩＶ：５−
ヨード−３インドリル基、Ｖ：３−インドリル基である
ことを示す。 特許出願人 青柳象平 同上 市野元信 手続補正書（方式） 昭和５７年１２月１８日 特許庁長官殿 昭和５７年１２月１６日差出１事件の表
示 昭和５７年特許願第１４０４９３号２発明の名称
合成基質シチジン３’−りん酸エステル誘導体とこ
れらを用いたり ボヌクレアーゼ活性の測定方法 ３補正をする者 事件との関係 特許出願人 住所 千葉県四街道市みそら３町目 １１番 １５号氏
名 青柳象平 ４．代理人 住所 氏名 ５補正命令の日付 昭和５７年１１月３０日６．補正の
対象 明細書の図面の簡単な説明の欄 図面 ７補正の内容 別紙の通り 手続補正書（自発） 昭和５８年７月１３日 特許庁長官 若 杉 和 夫 殿 １、事件の表示 昭和５７年特許願給１４０４９３号 ２、発明の名称 合成基質シチヂン３′−りん酸エステル誘導体とこれら
を用いたりポヌクレアーゼ活性の測定方法 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 ４、補正の対象 願書、明細書及び図面 ５、補正の内容 別紙の通り 明 細 書 １、発明の名称 合成基質シチヂン３′−りん酸エステル誘導体とこれら
を用いたりボヌクレアーゼ活性の測定方法。 ２、特許請求の範囲 （１）図に示した構造式を有するシチヂン３′−りん酸
エステル誘導体及びその塩。 （２）Ｎ２，２’，５’−保護の３′−シチヂル酸とＲ
ＯＨ（Ｒは図示）で示される化合物、但しＲが■又はＶ
の場合はそのＮ保護化合物とを縮合し、ついで縮合物か
ら保膜基をはずすことを特徴とする第１項で規定した化
合物の製造方法。 （３）Ｎ４，２’，５’−保護のシチヂンとＲＯＰＯＣ
Ｌ２（Ｒは図示）で示されるホスホロクロリデート、但
しＲが■又はＶの場合はそのＮ保護のホスホロクロリデ
ートとを縮合し、ついで縮合物から保護基をはずすこと
を特徴とする第１項で規定した化合物の製造方法。 （４）第１項で規定した化合物を基質として用いること
を特徴とするりボヌクレアーゼ活性の測定方法。 ３、発明の詳細な説明 本発明は膵がんの診断に有用な血清中リボヌクレアーゼ
活性の測定方法とその測定に必要な合成基質シチヂン３
′−りん酸エステル誘導体並びにその製造方法に関する
ものである。 膵がんによる死亡率は近年著増しており、その理由とし
て初期診断の困難なことが挙げられている。 そのため、検査が容易で且つ膵がんに特異性のある生化
学的検査法の開発が強く望まれている。膵がん診断のた
めの生化学的検査としては血清中のアミラーゼ、フェリ
チン、エラスターゼエなどの測定が広く行なわれている
が、これらは膵がんと良性疾患、或いは膵がんと他のが
んとの鑑別力即ち特異性に欠けることが広く指摘されて
いる。 血清中リボヌクレアーゼ活性値が膵がんの場合に特異的
に高値を示すことがレッデイ（プロシーヂング オプ
ナショナル アカデミ−サイエンス ７３巻 ２３０８
頁 １９７６年）によって報告され、我が国に於いても
多数の研究者によってその有用性が確認されている。 膵がんの場合、血清中で上昇するりポヌクレアーゼはリ
ポ核酸のなかでもシトシン塩基を持ったヌクレオチドユ
ニットの３′−りん酸エステルを含むホスホジエステル
結合部分を優先的に加水分解することが知られている。 その様なことからレツディ（上記に引用）は合成リボ核
酸であるポリシチヂル酸を基質として用いている。この
方法の大略は次の通りである。 被検血清とポリシチヂル墳とを３７℃、１５分間インキ
ュベートする。次に冷却下で酸を加えて２０分間放置后
、冷却下３０分間遠心分離する。上澄液の一部をとりて
水で希釈した后、シチヂル酸の最大吸収波長２７８ｎｍ
の吸光度を測定する。 このフッディ法の欠点として次の事項が挙げられる。 遠心分離などを含む多段階検査法であるため、多数検体
を短時間に測定することが出来ない。 基質として用いるポリシチヂル酸の分子量によって測定
値が変動する。 血清希釈法による酵素濃度変化と吸光度変化との間に直
線関係が得られない。 リボヌクレアーゼ活性が高い場合には基質不足を生じる
ため血清の希釈再検査を行わなくてはならない。 酵素反応の初速塵など速度論的解析が出来ない。 本発明者らはこれらの事情を考慮し、この検査の汎用性
の向上並びに精度向上を目的として鋭蒼研究し、リボヌ
クレアーゼによってジエステル結合が加水分解されると
同時に遊離する残基にもとづく吸光度変化を反応系に与
える新規シチヂン３′−りん酸エステル誘導体を発明す
るに至った。 この発明によって従来のポリシチヂル酸を基質とする方
法では不可能だった自動分析機を用いたレート・アッセ
イ法が可能となりたことをはじめ、数分以内の短時間で
測定することも可能となった。 又、インジコ生成性の残基を含む基質を用いる場合には
ジエステル結合の加水分解后、水不溶性のインジゴ色素
を生成するため、リボヌクレアーゼのアイソエンザイム
を測定する場合極めて好都合である。 本発明Ｋかかわる新規合成基質はＮ”、２’、５’保護
の３′−シチヂル酸と発色性を持りた芳香族性化合物と
を縮合剤を用いて結合するか或いは、Ｎ’、２’、５′
保護のシチヂンと発色性を持った芳香族性化合物のリン
酸エステルを結合するか何れかの方決で基質の中間体を
得た后、保護基を離脱することによって製造することが
出来る。上に述べた発色性を持った芳香族性化合物とは
α−ナフトール。 ４−メチルウムベリフエｐン、か１−二トρフェノール
、５−ヨード又は５無置換インドキシルであり、基質と
してホスホジエステル結合している場合は特有の色又は
螢光を示さないが、一旦加水分解によって遊離すると特
有の性質を示す化食物のことを指している。 本新規合成基質は通常はトリエチルアンモニウム塩とし
て取得されるが、アンモニウム塩など他の塩型及び遊離
型として取得することも可能である。 本新規合成基質は午睡由来のりボヌクレアーゼによって
加水分解を受け、その反応液の着色、紫外部吸収或いは
螢光強度の変化を径時的に追跡することが出来、従来困
難であったりボヌクレアーゼ活性の速度論的解析を可能
ならしめた。又、人血清中のりボヌクレアーゼも本基質
に対して午睡由来のりポヌクレアーゼと同様に反応した
。 以下具体例を示して本発明を説明するが、本実施例をも
って発明の内容を限定しているものではない。 実施例 １ Ｎ、５′−ジアセチル−２’−（１−エトキシエチル）
シチヂン ３′−ホスフェート １ミリモルとα−ナフ
トールとをピリジン２０ Ｃ，Ｃ，にとかし、ジシクロ
ヘキシルカルボジイミド１５ミリモルを加えて室温で４
８時間反応させる。ピリジンを溜去后、蒸溜残渣をエー
テルにて数回洗浄する。残渣に濃アンモニア・メタノー
ル液（１：１）を加え、室温にて１晩放置后、濃縮乾固
する。残渣を水に溶かし、セファデックスＩ、Ｈ−２０
聾カラム上に流し、次いでＱ、ＩＭ）！Ｊエチルアンモ
ニウム・パイカーボネート（ｐＨ８，０）を用いてクロ
マトグラフィー操作を行なう。紫外部吸収モニターで溶
離液を調べ、目的物の中間体である両分を集める。 この分画を集め凍結乾燥して２’−（１−エトキシエチ
ル）シチヂン ３′−ホスフェートのαナフチルエステ
ルトリエチルアンモニウム塩０．６５ミリモルｆｔ 得
り。λＦ′Ｏ：２７３ｎｍ、ξ”０：１．０４ｍａｘ
２７３ ×１ひ、ペーパークロマトグラフィー（０，０５チさく
酸：イソプロパノール＝２：８）にてＲｆｏ、７９の単
一スポットを与えた。この中間体１ｃ ２０ Ｃ，Ｃ０
の０．ＩＮ ぎ酸を加え室温にて３時間攪拌する。 この溶液を凍結乾燥しトリエチルアンモニウムα−ナフ
チル ３′−シチヂレー） 〔Ｉ） ０．６５ミリモル
を得た。紫外部吸収スペクトルは中間体と同じ。ペーパ
ークロマトグラフィー〔展開溶剤は上記と同Ｌ ） Ｋ
テＲｆ０．５ ｇ の単一スポットを与えた。午睡臓
由来のりポヌクレアーゼとインキュベートすることによ
ってα−ナフトールを生成した。 同様の方法にてα−ナフトール０代わりに４−メチルウ
ムベリフエｐン又はシーニド−フェノールを用いること
により、それぞれトリエチルアンモニウム ４−メチル
ウムベリフェリル ３′−シチヂレート〔■〕又はトリ
エチルアンモニウム ｐ−二トｐフェニル ３′−シチ
ヂレー） ＣＩＩＩ）を得た。 実施例 ２゜ ２／ 、 ５１−ジ（１−エトキシエチル）−Ｎ−ジメ
チル７ミノメチレンシチヂン １ミリモルとα−ナフチ
ルホスホロクｐリゾート（α−ナフトール１０ミリモル
とオキシ環化りんとをピリジン中で反応させることによ
り、得る）とをピリジン中で室温２４時間反応させる。 ピリジンを漏失后、残渣を水にとかし、セファデックス
ＬＩ（−２０型カラムにｉＬ ０．ＩＭ ）リエ
チルアンモニウム・バイヵーボネー） （ｐＨ８，０）
を用いてりｐマドグラフィーを行ない、目的物の中間体
である分画を集める。この分画を凍結乾燥して２’ 、
５’−ジ（１−エトキシエチル）−Ｎ−ジメチル７ミ
ノメチレンシチヂン３′−ホスフェートのα−ナフチル
エステル トリエチルアンモニウム塩０．５２ミ！Ｉモ
ルＨ，Ｏ、Ｈ！０ ・ を得た。λ 、３１５ｎｍ、 ξ 、３．２７
Ｘ １０４゜ｍａｘ
３１５この中間体に２０ Ｃ，Ｃ，の０．ＩＮぎ酸を加
え室温にて３時間攪拌する。この溶液を凍結乾燥し、ト
リエチルアンモニウム α−ナフチル ３′−シチヂレ
ー）ＣＩ）０．５２ミ！Ｊモルを得た。この物質の性質
は実施例１で得たものと同一であった。 α−ナフチルホスホｐクロリデートの代りにＮ −７セ
チルーインドキシルホスホロクロリデート及びＮ−７セ
チルー５−ヨードインドキシルホスホｐりｐリゾートを
用い、上記操作のうちピリジン榴去后濃アンモニア水を
加え、室温で８時間処理し、ついでアンモニア水を漏失
し、セファデックスＬＨ−２０型カラム以降の操作を上
記と同様な方法で行ない、トリエチルアンモニウム イ
ンドキシル ３′−シチヂレー） （Ｖ）及びトリエチ
ルアンモニウム ５−ヨード−インドキシル ３′−シ
チヂレー） ＯＶ＋を得た。 ＥＶ）及び［、Ｉｖ）は人血清とインキュベートすると
とＫより紫色のインジゴ色素を生成した。 実施例 ３゜ ９− トリエチルアンモニウム α−ナフチル ３′−シチヂ
レート〔Ｉ〕を用いたりボヌクレアーゼ活性の測定例を
次に示す。 ０．０５モル トリス（ヒドロキシメチル）アミンメタ
ン−塩酸緩衝液［ｐＨ６，３，塩化ナトリウムを加えて
最終イオン強度を０□１に調整］にＣＩ）を１０−４モ
ル／リットルの濃度に溶かし、その３１ｃｃ、を光路長
１１Ｍのセルに入れスペクトルホトメーター（日立３３
０型）の波長を３２２ ｎｍ 、恒温槽の温度を２５′
０にセットする。一方上記と同じ緩衝液に牛・膵臓由来
の結晶リボヌクレアーゼを１０” ｉリグラム／ＣＣの
濃度に溶かした酵素液０．０５０Ｃ１１１゜をセルに加
え迅速に攪拌−后直ちに吸光度の変化を読む。吸光度は
毎分４．７８ Ｘ １０ の割合で直線的に変化した
。 上記牛・膵臓由来のりポヌクレアーゼの代りに、健常人
血清及び膵がん患者血清を各１０例づつを採取し、各血
清０．０５０ Ｃｒ、づつをとって吸光度変化を求めた
結果、膵がん患者の毎分当りの吸光度変化の平均値は正
常な人の血清のそれよりも３．２１０− 倍高い値で統計的に高度に有意な差を示した。 又、これら血清検体の吸光度変化率はポリシチヂル酸を
用いて得たりポヌクレアーゼ活性値とよく相関した。 ４、図面の簡単な説明 第１図は本発明にかかわる新規合成基質シチヂン ３′
−りん酸エステル誘導体の一般式を示したものであり、
式中ＲはＩ：α−ナフチル基、■：４−メチルウムベリ
フエリル基、＋ｎ ： ｐ−二トμフェニルＭ、ＩＶ：
５−ヨード−３−インドリル基、ｖ：３−インドリル基
であることを示す。 特許出願人 青 柳 象 平 同 −ヒ 市 野 元 信１１− 第１図
Claims (4)
- （１）図に示した構造式を有するシチジン３’−りん酸
エステル誘導体及びその塩。 - （２）Ｎ４，２’，５’−保護の３′−シチジル酸とＲ
ＯＨ（Ｒは図示）で示される化合物、但しＲがＩＶ又は
Ｖの場合はそのＮ保護化合物とを縮合し、ついで縮合物
から保護基をはずすことを特徴とする第１項で規定した
化合物の製造方法。 - （３）ん４，２’，５’−保護のシチジンとＲＯＰＯＣ
Ｌ２（Ｒは図示）で示されるホスホロクロリデート、但
しＲがＩＶまたはＶの場合はそのＮ保護のホスホロクロ
リデートとを縮合し、ついで縮合物から保護基をはずす
ことを特徴とする第１項で規定した化合物の製造方法。 - （４）第１項で規定した化合物を基質として用いること
を特徴とするリボヌクレアーで活性の測定方法
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57140493A JPS5931798A (ja) | 1982-08-14 | 1982-08-14 | 合成基質シチヂン３′−りん酸エステル誘導体とこれらを用いたリボヌクレア−ゼ活性の測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57140493A JPS5931798A (ja) | 1982-08-14 | 1982-08-14 | 合成基質シチヂン３′−りん酸エステル誘導体とこれらを用いたリボヌクレア−ゼ活性の測定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5931798A true JPS5931798A (ja) | 1984-02-20 |
Family
ID=15269900
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57140493A Pending JPS5931798A (ja) | 1982-08-14 | 1982-08-14 | 合成基質シチヂン３′−りん酸エステル誘導体とこれらを用いたリボヌクレア−ゼ活性の測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5931798A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0594214U (ja) * | 1991-08-05 | 1993-12-24 | 文子 黒田 | 自転車用レインカバーコート |
-
1982
- 1982-08-14 JP JP57140493A patent/JPS5931798A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0594214U (ja) * | 1991-08-05 | 1993-12-24 | 文子 黒田 | 自転車用レインカバーコート |
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