JPH032663A - 酵素発光測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 技術的分野 この発明は、酵素活性を検出するための方法に関するも
のであり、更に詳細には、生物材料中の酵素活性を決定
するための測定法に関するものでもある。

技術分野 正常か疾患かを見分けるための生物学的に重要な特異的
な分子の濃度や活性を臨床的に知るための多くの方法が
ある。測定されているこれら分子の中には生物学的触媒
である酵素類がある。酵素類は、単にその分子が存在す
るか否かを検出する古くから存在する方法で測定するこ
とは出来るが、そのような測定法は酵素活性の高さを知
るための測定法に比べたら有用な方法ではない。例えば
、ある酵素を検出するため、その酵素分子上の特異的な
抗原を検出しようとする免疫学的測定法は抗原性という
性質が変化しない限り、与えられた酵素量を検出するこ
とが出来る。しかし、もしも、その酵素は存在するが酵
素活性が変化しているとき、例えば修飾された基質への
不可逆的な結合、または酵素の活性中心に存在する金属
イオンの障害的影響によって酵素活性が変化を受けてい
るときには、たとえ正確な酵素量は測定出来ても、酵素
活性としては不正確な値が与えられることになる。

酵素量ではなく酵素活性をｎ１定するための技術が最近
使えるようになっている。酵素は基質を産物へと変化さ
せる触媒分子であるので、基質が産物の量的な変化を経
時的に測定することが一般的な測定法となる。そのよう
な測定法の一つに、酵素が働くと有色な産物へと変化す
るような無色の基質を用いる方法がある。酵素を付加し
た免疫吸着剤を使った測定法（ＥＬＩＳＡ）の例にみる
ように、多くのそのような反応系が開発された。そこで
は酵素自身が分析反応における標識物質として使われて
いる。過酸化酵素は、同じ基質と反応産物が使用出来測
定しやすい故に、この種の標識物質としてしばしば使わ
れている。しかしながら、そのような測定法は色の変化
が起きる適当な基質が得られる場合に限って有用であり
、−船釣に使用出来るものではない。

はとんどの酵素に関し、発色による測定法は使えない。

動物細胞のグリコジルトランスフェラーゼ類が発色測定
法が使えない酵素の例である。これらは糖・核酸複合体
の糖部分を伸長しつつある多糖類の特異的水酸基、また
は糖複合体上の伸長しつつある少糖体へと転移させグリ
コシド結合形成を触媒する酵素である。動物細胞におけ
る代表的な糖複合体としては、糖蛋白質、糖脂質やグリ
コサミノグリカンなどがある。

核酸や蛋白質の合成とは異なり、糖複合体の合成に関し
ては鋳型が存在しない。したがって、それらの合成の制
御およびそれらの構造の正確さはグリコジルトランスフ
ェラーゼの発現と正確な特異性に依存している。動物細
胞に何種類のグリコジルトランスフェラーゼが存在して
いるのかは知られていない。しかしながら観察される多
くの種類の糖複合体から考えると、数百種類のグリコジ
ルトランスフェラーゼが存在しているように思える。さ
らに、異なるグリコジルトランスフェラーゼが同じ糖・
核酸複合体と似た受容体を使い、異なる産物を作り出し
ている。以下で論理するように、グリコジルトランスフ
ェラーゼにはこのような性質があるため、一つの組織サ
ンプル中に一種類以上の酵素が存在する場合の特異的活
性測定の際に独得の問題が生じる。

最近のグリコジルトランスフェラーゼ活性の測定では、
放射性同位元素が用いられ、糖・核酸複合体から産物の
配糖体に取り込まれた放射活性測定が行われている。放
射性物質を使わないグリコジルトランスフェラーゼ測定
法が種々開発されているが、これらの測定法の感度は、
現存の放射性物質を使用する測定法に比べ高いとはいえ
ない。

これまで知られている測定法の感度は多くの他の酵素測
定法と同じ位に高いけれど、その程度の感度では１ｐｍ
ｏ、Ｑ　／ｈｒ／ｍｇ細胞蛋白程度の活性しかもたない
多くのグリコジルトランスフェラーゼにとっては低すぎ
る。

グリコジルトランスフェラーゼに関する一つの測定法が
今回の発明者の一人の研究室により報告されている。酵
素ＵＤＰ−ガラクトー：βＤ−ガラクトシル−α１，３
−ガラクトシルトランスフェラーゼの特異的な産物を捕
まえるためにレクチンを使用するという測定法がＣｕＣ
ｕｍｍ１ｎら（Ｊ、Ｂｉｏｇ、Ｃｈｅｍ、１９８８年５
巻５１１頁−５１９頁）により報告されている。放射性
同位元素で標識されたガラクトースが与える側分子であ
るＵＤＰ−ＧＩｃＮＡｃ　（ウリジン−５′ニリン酸−
Ｎ−アセチルガラクトサミン）から受容体分子である糖
蛋白質の末端へ転移され、その産物は反応液からレクチ
ンを使用したアフィニティーカラムにより分離された。

そのカラムへは酵素反応の産物のみが結合し、他のどの
反応物も結合しない。しかしながら、この測定法は時間
がかかること、および放射活性を１ｇノ定するのが困難
であることのため限界がある。

放射性物質による標識に代る、免疫学的ｎ１定法におけ
る他の検出可能な標識物による方法の開発が何年にもわ
たり行なわれてきた。ある酵素は、−船釣には同位元素
標識よりも感度は落ちるが、多くの免疫学的測定法にお
ける標識物としてうまく使われてきた。代表的なものは
、免疫グロブリンを酵素で標識して使用する測定法で一
般には酵素免疫測定法（Ｅ　Ｉ　Ａ）と呼ばれている。

またそのような測定法においては酵素で分析物を標識す
ることも可能である。ＥＩＡの詳細な記述はＭａｒｃｅ
９　　Ｄｅｋｋｅｒ社１９８４年刊行Ｃ，１７Ｌｎｉｃ
ａｌＪ　　ａｎｄ　　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｊ７Ａｓｓ
ａｙｓの１４巻Ｗｉｊ７ｆｒｔｄ　　Ｒ，Ｂｕ１１編の
Ｐｒａｃｔｉｃａ、１７　　１ｍｍｕｎｏａｓｓａｙの
Ｃｈａｐ　ｔ　ｅ　ｒ３にある。

酵素以外にも、化学発光物質や生物発光物質などの非同
位元素が免疫測定法において、同位元素に代わるものと
して使われた。そのような測定法は、発光免疫測定法（
ＬＩＡ）または免疫化学発生測定法（ＩＣＭＡ）と呼ば
れている。これらの標識物質は通常、同位元素と感度に
おいて同等であるが、マーカーである蛋白質（典型的に
はルシフェラーゼ）の非特異的な結合に妨害されること
がよくある。これら測定法は前掲引用書であるＰｒａｃ
ｔｉｃａｊ７　１ｍｍｕｎｏａｓｓａｙのＣｈａｐｔｅ
ｒ５およびＡｃａｄｅｍｉｃ　　ｐｒｅｓｓ社１９８４
年刊行Ａｎａ、１ｌｙｔｉｃａ、Ｑ　　ＡｐｐＩｉｃａ
ｔｉｏｎｓ　　ｏｆ　　Ｂｉｏｇｕｕｍｉｎｅｓｃｅｎ
ｃｅ　　ａｎｄ　　Ｃｈｅｍｉｊ７　ｕｍ１ｎｅｓｃｅ
ｎｃｅの２７３頁〜２７６頁にＰａｔｅｌとＣｏｒｍｉ
ｅｒにより詳細に書かれている。

しかしながら、これまでに開発されているどの測定法も
一般性、感度、そして酵素活性測定法に望まれるバック
グラウンドの低さに関して満足出来るものはない。した
がって、多くの酵素に簡単に適用出来る単純な直接的な
方法で、酵素の濃度ではなく活性を直接測定できる測定
法が必要とされている。

目　　的 したがって、発明の目的とするところは、特異的に、迅
速に、そして簡単に酵素活性、とくに生物材料中の酵素
活性を測定する方法を提供することである。

また、技術的に大きな変化を伴わないで多くの酵素に適
用出来る酵素活性測定法を提供することも目的としてい
る。

構成 この発明の上記またはそれ以外の目的は、この後でより
明らかとなるように、あるサンプルにおける酵素活性の
存在または高さを測る方法を提供することによって達成
されている。その方法とは一つの反応液に（１）当該酵
素を含んでいると思われるサンプルと（２）当該酵素と
反応することで標識産物を与えるような標識基質を混合
するステップを含んでいる。当該標識物質とは、生物発
光蛋白質を含んでいる。また生物発光蛋白質標識に変え
ることも可能である。上記物質を混合することにより、
一定の時間で当該酵素と当該基質の間で反応がおきる。

それによって当該酵素の存在下で当該産物が生成する。

当該反応液は、当該標識産物または当該標識基質（両方
共ではない）と特異的に結合し、複合体を形成し得る受
容体と混合する。そして、当該生物発光蛋白質の制御下
で光の放射を引きおこすことにより、当該複合体中のま
たは複合体とはならないものすなわち受容体と反応しな
い標識物質中の標識の存在または量を測定する。

実施例 以下、添付の図面を参考に本発明の具体的実施の態様に
ついて詳細に説明する。

この発明は、受容体に結合するという性質で、基質から
区別し得る産物を作り出す酵素であれば、どのような酵
素であってもその活性の強さを測定するための方法を提
供している。基質に結合することなく、産物には十分に
結合する（またはその逆）受容体を使用することによっ
て、生成した産物または反応した基質を簡単に分離し、
定量することが出来る。この発明における方法において
は、基質または産物あるいはその両方を検出するための
標識物質として、生物発光蛋白質、出来るならばルシフ
ェリン分子を結合する能力を持ち、外からの誘導物質に
より誘導される（光る）、光蛋白質が必要である。ある
いはその標識物質に生物発光蛋白質標識へと変化する能
力があれば良い。例えば、基質または産物に結合してい
るビオチン分子で蛋白質標識をしたアビジン複合体を捕
えることにより変化するといったように、標識物質とし
て生物発光蛋白質を用いることによって、多くの利点（
この明細書の後の部分に詳細がある）か得られた。

この方法で、まずグリコジルトランスフェラーゼ類を測
定するため、レクチンを受容体としてまた炭水化物を基
質および産物として利用するように計画した。なぜなら
、これらの酵素は自然界に存在する量が非常に少いため
、活性が非常に低く、したがって酵素活性を測定するこ
とが困難であったからである。この測定法はこの困難な
酵素の測定に有用であることが示されたので、今まで他
の酵素系にも容易に応用出来るようになった。自然界で
の他の特異的な結合性物質、例えばホルモン受容体など
が手に入るようになり、この発明は種々の酵素に応用出
来るようになった。それに加えて、ハイブリドーマ産生
によって高い特異性を持つ単クローン抗体が得られるよ
うになり、この技術は、自然界には受容体が存在しない
物質に対しても応用可能となり、多くの種類の酵素産物
に使われている。

この方法はカバーする範囲は以下に示すようにかなり広
い。酵素を含んでいると思われるサンプルは標準的な技
術によって集められ、検出可能な標識をした酵素の基質
、または測定法の後半で標識可能な基質と混ぜる。基質
もまたその酵素と反応し、検出可能な標識産物（または
後で標識可能な産物）を与える能力のあるものである必
要がある。これらの基本的な物質を混合した反応液は酵
素が触媒する反応に必要な他の物質も含んでいる。

たとえば、その反応が基質に他の物質を共有結合させる
ような反応である場合、他の物質を反応液に入れる必要
がある。テストするサンプル中に酵素があれば、検出出
来る量の産物が作られるための十分な時間が必要である
。酵素に触媒された反応が行われる前または後に産物を
特異的に結合するが、基質とは結合しない（またはその
逆）受容体を反応液に入れる必要がある。行われる反応
の種類に応じて、産物−受容体または基質−受容体複合
体は反応液から分離（異成分１１′ｌ１１定法）される
。

あるいは産物−受容体または基質−受容体を含んでいる
反応液を溶液のまま測定する（同成分測定法）。複合体
となっている物質または複合体とならない可溶性の物質
における検出可能な標識物質の存在（定性的測定法）ま
たは量（定量的測定法）がそれから決定される。

異成分測定や同成分測定を行うのに利用される技術の違
いによって測定の各段階は大きく変化する可能性がある
。基質は、酵素と反応する前または後に生物発光蛋白質
を持っている標識物質へと転換される中間体標識物質で
標識することも可能なので、方法上変化を加えることは
可能である。

４種のそのような変化を第１図乃至第２図に示しである
。第１図では、生物発光蛋白質（Ｌ）で標識された基質
（Ｓ）は酵素（Ｅ）と反応して標識産物（Ｐ）となり、
その産物は第１の受容体（Ｒ１）に結合する。受容体／
標識産物複合体は次に異成分測定法の場合複合体となっ
ていない標識基質と分離される。また同成分測定は分離
する過程なしに行うことが出来る。第２図では、産物と
ではなく基質と複合体を形成する違った受容体（Ｒ２）
が使われている。同成分測定法と異成分測定法は同様に
この変法にとっても可能である。

第３図及び第４図においては、ビオチンで標識された基
質（Ｓ−４）は酵素により産物（Ｐ→）へと変化する。

アビジンに結合した生物発光蛋白質ＣｒＬ）が次に加え
られ、最終的な標識物質を形成する。そして、第１の受
容体が使われ産物との複合体を作るか（第３図）または
第２の受容体により基質との複合体を作るか（第４図）
する。これらの各段階は、他の実施例同様に以下に詳細
が説明しである。

この方法は産物が基質と十分に違うために受容体との結
合作用が基質または産物のどちらか一方とのみ行われる
ような産物を作り出す酵素に関し、その活性を測定する
ために使用することが出来る。

生物学的受容体が持つ特異性が非常に高いために、実際
には、どんな酵素も受容体への結合性によって基質と区
別出来る産物を作る。下の表１は国際分類法に従って酵
素を示している。この分類法はこの明細書中の他の部分
でふれている。

表１ 酵素の国際分類法 （分類名、コード番号、触媒する反応の種類）１、オキ
シド−リダクターゼ類 （酸化−還元反応類） １．１　−ＣＨ−ＯＨへ反応するもの １．２−Ｃ鞠Ｏ〃 １．３−ＣＨ−ＣＨ−〃 １．４　−ＣＨ−ＮＨ２〃 １．５−ＣＨ−ＮＨ−〃 １．６　　ＮＡＤＨ，ＡＮＤＰＨへ反応するもの２、ト
ランスフェラーゼ類 （官能基の転移反応） ２．１１炭素基類 ２．２　　アルデヒド又はケト基類 ２．３　　アシル基類 ２．４　　グリコジル基類 ２．７　　フォスフエイト基類 ２．８８−含有基類 ３、ハイドロラーゼ類 （加水分解反応類） ３，１　エステル結合類 ３．２　グリコジル結合類 ３．４　　ペプチド結合類 ３．５　　他のＣ−Ｎ結合類 ３．６　　酸無水物 ４、リアーゼ類 （二重結合への付加反応） ４、　１　−Ｃ−Ｃ ４、２−Ｃ−０ ４，３−Ｃ−Ｎ− ５８イソメラーゼ類 （異性化反応） ５．１　　アセマーゼ類 ６、リガーゼ類 （ＡＴＰ分解を伴う共有結合形成） ６、ＩＣ−０ ６，２Ｃ−３ ６，３Ｃ−Ｎ ６．４Ｃ−に の発明での方法は掲載しであるどの酵素にも、また掲載
していないどの酵素にも使うことが出来る。明細書のこ
れからの議論で明らかとなるように、この明細書の記述
によれば、酵素の基質、酵素、酵素の産物そして受容体
すべては変わり得るものであり、測定の条件に合った物
質の組合わせを得るために生化学的分析技術において納
得の行くもので置き換えることが出来る。

この発明は分析する酵素の基質または産物いずれかの受
容体が自然界に存在するときは非常に容易に実行できる
。たとえば、高い特異性を持って炭水化物鎖の末端部分
を認識する多くの特異的なレクチン類がある。例を挙げ
ると、レクチンが認識できる末端の炭水化物が、欠損し
ている炭水化物鎖を基質として選らぶことにより、グリ
コジルトランスフェラーゼがその欠損している炭水化物
を付加した場合、レクチンはその産物に結合するものと
して使用出来る。その他の自然界に存在する受容体−酵
素の組合せの例として、ホルモン受容体とホルモン生産
に関与する酵素、輸送に関する蛋白質（例えばチロキシ
ン結合性グロブリン）と輸送された物質を合成する酵素
などがある。

反応液中の産物は、分析する酵素によって直接作られる
産物である必要はない。たとえば、脂質スクアレンから
コレステロールの生合成は一連の酵素によって制御され
ている。スクアレン２，３−エポキサイドは酵素スクア
レンオキシプサイクラーゼにより環状化されラノステロ
ールとなる。

さらにいくつかの段階を経て、テノステロールはコレス
テロールとなる。しなしながら、生産されたコレステロ
ールの量を測定することによってスクアレンオキシプサ
イクラーゼを測定するように反応液は簡単に作ることが
できる。そのような反応液は次のようなものを含んでい
る。すなわち、標識されたスクアレン（又は酵素の実際
の基質であるスクアレン２，３−エポキサイドの前駆体
を標識したもの）、ラノステロールからコレステロール
を作るために必要な酵素、これら酵素は過剰に加え、ス
クアレンオキシプサイクラーゼによる反応段階が全体の
反応過程の律速段階となるようにする。そしてコレステ
ロール産生に必要な共役因子頂または中間体類などであ
る。代謝経路やその他の酵素経路において、どのような
酵素活性も測定できるように、産物・基質・受容体の組
合せを同様な方法で作ることによりコレステロール生合
成系以外の酵素系にも手を加えることが出来る。

したがって、ここで使っている“基質”と“産物″とい
う言葉は、分析すべき酵素の直接の基質または産物を意
味する必要はなく、その酵素を含む反応系における他の
基質または産物をも意味する。

もし自然界で、基質または産物の受容体が得られないと
きには、適当な受容体を免疫学的手法で作り出すことが
出来る。単クローン抗体は、その高い特異性故に受容体
としてすぐれている。ただし、抗血清は適当な状況にお
いて使われねばならない。単クローン抗体や特異的抗血
清を調製するとき、Ｂ細胞（生体内でも試験管内でも）
を結合してほしい物質（基質または産物）で刺激する。

基質や産物には普通標識が存在しているが、標識そのも
のに対する抗体産生を避けるため、通常は標識されてい
ない物質で刺激する。抗血清または単クローン化された
抗体産生細胞は、次に結合すべき物質との結合性を検討
することによって選ばれる。第２次スクリーニングは、
抗体と非選択的な物質との間に結合性があるものを除く
ために行われる（すなわち、もし受容体が産物と結合す
べきときには基質とは結合しないように）。例えば、基
質が結合出来るようなアフィニティーカラムを使うと、
基質に結合親和性を持っていない抗体はカラムを素通り
するので抗体を除くことが出来る。

もしも標識された物質を免疫源として用いた場合、この
第２次選択により、分子の標識部位に対し結合活性を持
つ抗体を除くことができる。ハイブリドーマを調製する
ことにより単クローン抗体を作製する技術はよく確立し
てあり、今回は詳細を述べる必要はない。

酵素と基質が反応するための反応液は、−船釣には酵素
にとって都合によいｐＨを持つように調製された水溶液
である。反応液はまた、反応が進行するために必要な他
の物質も含んでいる。例えば、もしも酵素がトランスフ
ェラーゼであった場合、反応液は基質が転位されるべき
物質も含んでいる。酵素がオキシドリダクターゼである
場合、水素イオンの供給源または受けとる側の物質（す
なわちＮＡＤＨ）もまた加えられる。反応液の他の物質
は、分析すべき酵素の性質から明らかとなる。

サンプルは分析すべき酵素を含むと思われるどんなもの
でもかまわない。そして集められるサンプルに関する標
準的方法に従って扱われる。典型的サンプルとしては、
血液（血清、血漿または全血として）、尿、唾液、糞便
、組織サンプルのようなものがある。サンプルは、その
ままの形で使用することもあり、また酵素測定に都合良
いように種々の操作を加えて使用することもある。たと
えば、もし酵素が通常、細胞の細胞質に存在するもので
あれ、細胞膜を破壊してその酵素を反応液中にａ離させ
る必要がある。

酵素が働きかける基質は２つの基本的構造を持っている
ことを考慮して選ばれる。その第１は酵素の活性である
。すなわち基質とそれから作られる産物とは受容体の特
異的結合反応によって区別されなければいけない。生物
学的な結合システムの特異性は非常に高いため、この点
は普通には問題とはならない。特殊な基質が測定にとっ
て適しているか否かは、選んだ受容体の基質とその酵素
反応産物への結合性を調べることにより容易に判定でき
る。もし必要ならば、放射性同位元素標識、たとえば非
特異的トリチウム標識などはこの種のスクリーニングに
とっては十分使用できる。

基質としての第２の基本的に重要なことは、基質と酵素
の結合を阻害しないで、生物発光蛋白質により検出可能
に標識されるということである。

生物材料を非常に多くの種類の検出可能なマーカーで標
識するということは臨床化学の中で高度に発展している
分野である。生物発光マーカー類は良く知られており、
そのような標識物質を他の分子に結合させる技術もある
。非常に多くの刊行物や特許に多くの種類の物質を標識
する技術がかかれている。分析物への生物発光標識の結
合を記述している例としては、１９８７年６月５日に出
願され“Ｂｌｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　Ｉｍｍｕｎｏ
ａｓｓａｇｓ　ＵｔＩｌｌｚｉｎｇＣｏｅｌｅｎｔｅｒ
ａｔｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ　Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅｓ　ａ
ｎｄ　ＰｈｏｔｏｐｒＯｔｅｌｎＳ”と題する米国特許
出願第０５９．１３７号”Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ　ｏｒ　
Ｑｕａｎｔｆｆ’ｙｆｎｇ　５ｕｂｓｔａｎｃｅｓ　Ｕ
ｓｎｇ　Ｌａｂｅｌｌｌｎｇ　ＴｅｃｈｎｉυＥＳ”と
題する米国特許第４．４７８．８１７号そして“Ｂｌｏ
ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　Ｔｒａｃｅｒ　Ｃｏｍｐｏｓ
ｉｔｉｏｎａｎｄ　Ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　Ｕｓｅ　ｉｎ
　［ｌｌ１ｌＩｌｕｓａｓｓａｙ″と題する米国特許第
４，６０４，３６４号などがあります。

この発明の方法において使用されている特殊な生物発光
標識は、ルシフェリンまたは他の光を放射する分子（適
当な条件下の光放射も含む）へ結合出来る蛋白質または
関連分子（たとえば糖蛋白質である。驚いたことに、生
物発光蛋白質類は酵素基質類に酵素との反応を阻害する
ことなく、また生物発光蛋白質の光放射能力を阻害する
ことなく結合できることがわかっている。さらに、生物
発光蛋白質は修飾して標識物質として使うとき、化学発
光標識物質よりも収率が良い。生物発光蛋白質類は、放
射性同位元素標識や化学発光標識のような他の標識物質
と同等に見えるが、実際には多くの生物学的に興味ある
部質は標識物質として生物発光蛋白質類を使用しないと
検出できない。

多くの生物発光蛋白質標識物質が入手可能である。より
詳細に引用した米国特許４，４７８，８１７号と米国特
許第４．６０４，３８４号そして１９８７年６月５日に
出願された米国特許出願第０５９，１３７号にはこの発
明に実際に使える生物発光蛋白質標識物質類が記述され
ている。さらに、Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ社１９８２年
刊行の５ｅｒｌｏとＰａｚｚａｌ　１編、Ｌｕｍ１ｎｅ
ｓｃｅｎｔＡｓｓａｙｓ第１巻の１１５頁から１２５頁
には異成分免疫測定にホタルのルシフェラーゼを使い、
ピコモル量のメソトレキセートとトリニトロトルエンを
検出したという例が示されている。

この発明における生物発光標識物質として組換え技術に
よって調製した蛋白質類も使用される。

１９８８年２月２９日に出願された米国特許出願第１６
５，４２２号および１９８８年３月１７日に出願された
第１７３，０４５号にはコエレントレイト由来の光景白
質であるアポエクオリンを発現するための多くの組換え
ＤＮＡベクターが記述されている。

特に、蛋白質標識物質として好ましいのは光蛋白質類で
ある（ルシフェラーゼ類に酵素的に働く他の生物発光蛋
白質ではない）。この発明における光景白質は、酸素の
存在下で直ちに発光することなく実際の発光分子（すな
わちルシフェリン）に結合する能力があるという点で、
発光反応を制御するルシフェラーゼのような酵素と容易
に区別することができる。

腔腸動物由来光蛋白質はこの発明の実施において特に有
用である。腔腸動物由来光蛋白質の例としては、アエク
オリン、オペリン、メミオプシン、そしてベロビンなど
がある。これらの分子については多くの技術的な刊行物
の中に記載がある。たとえばＷａｒｄらのＰｒｏｃ、　
Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓａｒ　、　ＵＳＡ（１９７
５）７２；２５３０−２５３４である。そのような腔腸
動物由来蛋白質は遊離のカルシウムイオンが存在しない
状態で安定であり、腔腸動物ルシフェリンとその蛋白に
結合している酸素の両方を含んでいる。

ここで使っている“発光分子”という言葉は、ルシフェ
リンおよび光放射の実際の供給源である光蛋白質類へ結
合する（かまたはルシフェラーゼによって働かされる）
同様な小さな有機分子を示している。腔腸動物由来光量
白質類の生物発光の誘起剤であるカルシウムを光景白質
で標識した溶液に加えると、ルシフェリン分子によって
波長約４６９ｎｍに最大を持つ青い光が放射される。そ
のような標識物質は、１９８７年６月５日に出願された
米国特許出願第０５９．１３７号に詳細に記述されてお
り、それはここに参考文献として引用する。

遺伝子工学によって調製された光景白質は１９８８年２
月２４日に出願された米国特許出願第１６５４２２号と
１９８８年３月１７日に出願された第１７３．０４５号
に記述されており、両方とも“Ｒｅｃｏａ＋ｂｉｎａｎ
ｔ　ＤＮＡ　Ｖｅｃｔｏｒｓ　Ｃａｐｒｅ　ｏｆ’　Ｅ
ｘｐｒｅｓｓｌｎｇ　Ａｐｏａｅｑｕ。

ｒＩｎ　’　と題されています。

ここで記述されている光景白質の特に有利な点は、結合
している発光分子なしで使えるためバックブラウンドの
発光を減らすことが出来る点である。発光分子と反応し
直ちに光を放射するルシフェラーゼやその他の酵素分子
を使った場合の問題点の一つは、種々の表面や反応液中
に存在する分子へ非特異的に結合する蛋白質性物質の性
質である。ルシフェリンまたは他の発光分子を発光させ
るために溶液に加えると、バックグラウンドの発光が生
じる。光景白質は誘起剤となる他の分子を発光に必要と
するので、発光分子を含んでいない光蛋白質類は、反応
溶液中の表面をあらかじめコートするのに用いることが
できる。そのような蛋白質類はアポ光蛋白質と呼ぶ。発
光分子を結合させた光景白質を次に標識物質として使用
する。

発光分子がアポ光蛋白質上に結合するかしないかの条件
はコントロールできるので、反応液にとって条件を選ぶ
ことにより先玉白質間で発光分子の交換を起こせる。こ
のような環境下において、標識物質として使用される光
景白質のみが外からの誘起剤（腔腸動物由来光蛋白質に
とってはカルシウムイオン）によって誘起された時に発
光する。

なぜならバックグラウンドの発光を抑えるために使用し
ているアポ光蛋白質類は発光分子を含んでいないからで
ある。この発明（そしてその多くの実施例）において使
われる優れた技術は、本出願と同じ日に出願されている
特許出願に記述されており、　”Ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ
　Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ　５ｏｎｓｉｔｌｖｉｔｙ　Ｉ
ｎＬｕｍ１ｎｅｓｃｅｎｃｅ　Ａｓ５ａｙｓ”　と題さ
れている。

酵素と検出が可能に標識されている基質を含んでいる反
応液を調製した後、酵素と基質の間の反応が行われるに
は十分な時間が必要である。酵素類はそれぞれ違なる反
応速度を持つので、その時間は個々の調べる酵素によっ
て異なる。一般的な速度は数秒から数分まで変化するが
反応の遅い酵素については、さらに長い反応時間が必要
である。

酵素活性は、与えられた時間内に行われた反応の量を決
定することにより一般には測定されるので、正確な反応
の開始時間と終始時間を測る方法が必要である。はとん
どの場合、反応はサンプルを標識または非標識基質と混
合することにより開始する。反応は多くの方法によって
終始させることが出来るが、その方法は酵素または測定
法の種類あるいはその両方に依存している。たとえば反
応液のｐＨを変化させ（たとえば酸を加えることにより
）、酵素活性が大巾に抑制されるｐＨにしてしまう。

反応を終始させる他の技術には、大過剰の阻害剤を加え
る、酵素を不活化するため反応液を熱する、反応速度を
下げるため反応液を冷やす、そして酵素の構造を変形さ
せてしまうため界面活性剤その他の試薬を加えるなどが
ある。もし反応が固相表面（固相受容体と呼ぶ）へ付着
した固相受容体に産物が吸着するという形で行われたな
らば、反応は反応液を同相受容体から除（ことによって
終始させることが出来る。たとえば、もしも受容体がマ
イクロタイタープレートの穴の壁に付着しているならば
、反応液は急速に吸い上げることが出来、手動または自
動の洗滌装置で洗うことが出来る。もしも産物よりも基
質の方と結合する受容体が使われているときには、反応
液への受容体の添加による基質が受容体に結合し、そし
て基質は酵素とは反応しなくなる。しかしながら、この
場合や酵素を不活化しないような同様の場合には、平衡
が乱れることのないように注意すべきである。

なぜなら、酵素はしばしば逆反応を触媒する能力があり
（この場合には産物から基質を作る）したがって、もし
、酵素と反応液の取り除かれていない物質の間に接触が
続いていると、間違った結果を得る可能性がある。これ
は多くの反応においては問題ではない。なぜなら、他の
反応は反応する可能性のある物質を反応液から除くこと
を行うからである。例えば産物を加水分解したり、逆反
応が行かないような形に変換したりする。反応集結の他
の変法は技術的に自明の方法である。

使われる測定法によって異なるが、適当な時間で受容体
は特異的に検出可能な標識産物と結合して産物−受容体
複合体を作るかまたは検出可能な標識基質と結合し基質
−受容体複合体を作るために反応液と混合する。

前に示したように、受容体を選ぶには、２つの物質の一
つとは特異的な結合はせず他方に特異的に結合するもの
を選ぶ。結合親和性の絶対値は比較的重要ではない。し
かしながら、結合親和性が高ければ測定の感度は上がり
、より少ない量のまたより少ない活性の酵素を測定出来
る。非特異的な結合親和性ではなく、特異的な結合親和
性とは受容体の標的分子上の結合部位に相互作用する能
力をいう。受容体（Ｒ）の標的分子（Ｔ）が相互作用し
、複合体（Ｒ−Ｔ；ここてはＣとして示す）を形成する
反応Ｒ＋Ｔ−＋Ｃにおける結合定数（ＫＡ：Ｍ−’の単
位で表現される）は一般的には少くとも抗体−標的（リ
ガンド）相互作用では１０７である。抗体結合反応にと
っての結合定数は１０１２にも及ぶことが知られている
。他の種のりガント−受容体相互作用にとっての結合定
数はさらにずっと高くなる。例えばビオチン−アビジン
の相互作用は約１０１５の結合定数を持つ。ホルモン−
受容体相互作用の結合定数はしばしばこれに近いか、こ
れを越えることもある。

結合定数の絶対値よりもっと重要なのは、結合が期待さ
れていない他の物質への結合定数に対する結合が期待さ
れている標的への結合定数の比率である。例えば、もし
産物への結合が期待されているとき、この結合反応の結
合定数が受容体と基質間の相互作用の結合定数の少くと
も１０３位であることが望ましい。この比率が１０５な
らばより良く、また少くとも１０７ならばさらに良いこ
とになる。

相対的な結合親和性は産物と基質の限られた数の受容体
結合部位への競合によって測定することが容易にできる
（酵素が存在しない条件で）。

必要ならば、生物発光蛋白質を、酵素による産物形成の
後に産物または基質に結合させることも出来る。この付
加は望むならば酵素反応に先立ち基質へ標識物質を付加
させる方法と同じ方法で行うことが出来るが、酵素反応
が行われている反応液の条件下で結合する非共有結合型
結合基を使うのも良い。例えば、ビオチンとアビジンの
強い結合反応により溶液中の産物に産物生成の後に標識
物質を結合させることができる。基質上に結合している
ビオチンにアビジンは結合するので、アビジン、ストレ
プトアビジンが望ましいが、は基質に直接的にも間接的
にも結合できるビチオン化した発光試薬、たとえばビオ
チン化アエクオリンを次に反応液中に加えると、基質を
光蛋白質で標識することができる。アビジン−ビチオン
複合体を使って有機分子に標識物質を結合させるいくつ
かの技術はＨｓｕらにより、１９８１年Ｊ、　ＨｉＳｔ
Ｏｅｈｅｍ、　Ｃｙｔｏｃｈｅｍ　ｏ　２９巻５７７頁
’　ＩｍｍｕｎＯｐｅｒＯＸＩｄａｓｅ　Ｔｅｃｈｎｌ
ｑｕｅｓ：　Ａ　ＣｏＬＩｌｐａｒｉｓｏｎ　Ｂｅｔｗ
ｅｅｎ　ＡＢＣ＆　Ｕｎ！ａｂｅｌｅｄ　（ＰＡＰ）　
Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ”の中に記述されている。

ひとたび受容体と反応液中の適切な物質の間で結合反応
が行われると、次に２つの検出可能なもの１つにおける
検出可能な標識物質の存在と量を検出するための各段階
の操作が行われる。応用することの出来る多くの種類の
測定法があるため、使用する技術は場合によって大きく
変化する。たとえば、同成分測定法においては、発光消
滅やエネルギー移動が行われ、発光消滅剤が付いた（ま
たはエネルギー受容剤が付いた）受容体と複合体を形成
している標識を単に可溶性基質や産物分子と結合してい
る標識から区別される。

もし反応が、固相と液相を分離出来、受容体が結合する
標的が標識された産物であるような異成分測定法である
ならば、固相受容体複合体から反応液を分離することに
よって、同相の受容体複合体の標識かまたは液相の非複
合体で検出可能に標識されている基質の標識を測定する
ことができる。

検出可能な標識で２つの物質のうち１つの存在と量を決
定するのに必要な特別な操作技術は、使われている標識
物質の種類と測定法の種類により容易に臨床化学的に決
定される。（すなわち、同成分か異成分か、測定するの
は産物かまたは未反応の基質か）。光蛋白質が標識とし
て使われているときには、発光を誘導する適当な誘導剤
を測定すべき反応液に加えた後発光を測定する。

可能性のある測定法の一例として、この発明の方法によ
るグリコジルトランスフェラーゼ類の測定について、こ
こでより詳細に議論する。この測定をどのようにして行
うかに関するより詳細な解説を与えることに加え、この
測定材料は以前の測定技術では容易には測れなかった酵
素活性を測定するための酵素捕獲法の使用を示した。

この例においては、分析すべき酵素はＵＤＰＧａｌ：５
−Ｄ−ＧＩｃＮＡｃ　（β１．４）　ｇａｌａｃｔｏｓ
ｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅである。測定に用いる基本
的な物質は第５図に示しである。図示されているように
、この測定に使用する２つの基本的な試薬は組換えアエ
クオリンとストレプトアビジンである。天然のアエクオ
リンはクラゲＡｅｑｕｏｒｅａ　ｖｉｃｔｏｒｉａから
とれる２０゜０００ダルトンの生物発光蛋白質である。

その蛋白質の１モルは約１モルの腔腸動物発色団ルシフ
ェリンを含んでいる。

その蛋白質は青色光（λ１．□４６９ｎｍ）をカルシウ
ムイオンの存在下で発光する。また量的にはアエクオリ
ンは１０−１９らら１０−２°モルで検出可能である。

このアエクオリンの量は１ｇ中約１０００〜１００００
分子と同等である。アポアエクオリン（ルシフェリン分
子を含まない蛋白質）をコードする遺伝子がクローン化
され、この蛋白質は上に述べたように組換えアボアエク
オリンとして得られるようになった。組換えアボアエク
オリンは合成した腔腸動物ルシフェリン。溶存酸素そし
て２−メリカプトエタノールと混合することで高い収率
で組換えアエクオリンに変化する。組換えアエクオリン
は商品化されている試薬を使ってビオチン化する。第２
の試薬はストレプトアビジンであり、Ｓｔｒｅｐｔｏｍ
ｙｃｅｓ　ａｖｉｄｉｎｉｉからとれる分子量６０．０
００ダルトンのビオチン結合性蛋白質である。この蛋白
質１モルは高い親和力（約１０−１５ＭのＫｏ）で４モ
ルのビチオンに結合する。ストレプトアビジンは商品化
されている。第５図に示す典型的な測定法において、末
端のＧＩｃＮＡｃ残基を含む糖蛋白質は共有結合でスト
レプトアビジンに結合しており、酵素ＵＤＰＧａｌ：β
−Ｄ−ＧＩｃＮＡＣ（β１，４）−ｇａｌａｃｔｏｓｙ
ｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅを受は入れるものとして使用
された。その酵素の反応産物はＧａ１β１−４ＧｌｃＮ
Ａｃ結合を持っている。反応の後、ビオチン化した組換
えアエクオリンを反応液に加えると、産物と基質の両方
にあるストレプトアビジン上のビオチン結合部位と結合
し、複合体を作る。

基質とその他の物質から酵素反応の産物を単離するため
に、レクチンＲ１ｃｉｎｕｓ　ｃｏｍｍｕｎｉｓ凝集素
−■を固定化したカラムに反応液を通す、。この植物性
凝集素は高い親和性でＣａｔβｌ−４ＧＩｃＮＡｃ−糖
蛋白質という末端配列を持つ糖複合体に結合するがこの
構造の異性体、すなわちＧａｌ　β１．３ＧｌｃＮＡｃ
　−糖蛋白質やＧａｌ　α１，４ＧｌｃＮＡｃ−糖蛋白
質には結合しない。レクチンが結合した糖蛋白質−スト
レプトアビジン産物は、レクチンにとって競合的なリガ
ンドであるラクトースを含む緩衝液でレクチンカラムか
ら溶出される。産物の全量は次に、溶出液にカルシウム
イオンを加えアエクオリンにより産生される光を測定す
ることにより決定される。

この系の発光は十秒以内におこる、そして産生される全
部の光は、もとのサンプル中に存在している酵素の活性
と直接関連している。

グリコジルトランスフェラーゼ反応の受入側の糖蛋白質
（基質）はフィブリノーゲンから調製出来る。手短かに
述べると、フィブリノーゲンをプロナーゼ分解すること
により調製されたフィブリノーゲン糖蛋白質類が出発物
質として使われる。

フィブリノーゲン糖蛋白質類に存在する２本に分れた側
鎖はＣｏｎＡカラムを使用したアフィニテークロマトグ
ラフィで単離される。非結合性の物質は洗い流し、結合
している糖蛋白質はα−メチルマンノシド溶液で溶出す
る。後の実験の部に詳細があるように、一連の操作の後
、シアル酸、ガラクトースの存在しないフィブリノーゲ
ン糖蛋白質が得られる。反応において基質として働くこ
の物質は、以下の例で詳細を示すように商品化された試
薬を使ってストレプトアビジンと共有結合で結合させる
。

この酵素測定法では、反応液にはストレプトアビジン−
糖蛋白質複合体（ＳＧＰ）　、ＵＤＰ−Ｇａ１、塩化マ
ンガン、そして緩衝液が含まれる。反応は３７℃で行わ
れ、その後、反応は反応液を４℃に冷やし、上に示され
ているようにビオチン化アエクオリンの添加の前に酵素
活性を止める。続く例に見られるように、この技術によ
る測定結果は、ガラクトシルトランスフェラーゼ活性の
検出感度を従来の放射性同位元素法に比べると少くとも
１０’倍上げることができたことを示している。

同じ技術は他のグリコジルトランスフェラーゼ類、すな
わちＵＤＰＧａｌ　：　βＬ　、　４Ｇｌｃ（ＮＡｃ）
−（β１，３）ｇａＩａｃｔｏｓｙ！ｔｒａｎｓｆ’ｅ
ｒａｓｅやＣＭＰＮｅｕＡｃ：Ｃａｔβ１，３（４９Ｇ
ｌｃ−ＮＡｃ（ａ　ｌ　、　３）ｓｉａｌｙｌｔｒａｎ
ｓｆｅｒａｓｅなどにも使用できる。酵素ＵＤＰＧａｌ
　：　β１，４Ｇｌｃ（ＮＡｃ）　（β１，３）ｇａｌ
ａｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅはＧａｌ　βＬ
４　ＧＩＣ（ＮＡＣ）−糖の配列を含む少糖類の末端の
ガラクトース残基にα１．３結合でガラクトースを付加
する。その酵素は糖複合体上の末端のＧａｌ　α１−３
Ｇａｌ配列の合成を担っている。すべてのヒトの血清は
このエピトープに対する自然に生じた抗体を多量に（循
環しているＩｇＧの約１％）持っている。ヒトにおける
このグリコジルトランスフェラーゼの誤った発現のため
、抗原エピトープの合成に至り、自己免疫過程の開始が
行われた可能性がある。このグリコジルトランスフェラ
ーゼの基本的測定法は、上に述べたＵＤＰＧａｌ：β−
Ｄ−Ｇ　Ｉ　ｃＮＡｃ　（β１，４）ｇａｌａｃｔｏｓ
ｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅの測定法と同じである。変
化しているところは、受けとる側の構造、受けとる側分
子と産物を分離するためのレクチンを固定化したアフィ
ニティーカラムの特異性、そして糖核酸などである。糖
核酸（ＵＤＰ　Ｇａ１）は同じであるが、それを受けと
る側の糖蛋白質はストレプトアビジンが結合したフィブ
リノーゲン糖蛋白質のシアル酸のない誘導体である。そ
して、レクチンカラムはＧｒ１ｒｆ’。

ｎｌａ　ｓｉｍｐ！ｊｃｉｆ’ｏｌｉａ　Ｉから得られ
るレクチンを使って調製される。このレクチンはＧａｌ
　αｌ　、　３Ｇａｌ　−糖という末端配列を持つ少糖
類に結合する。カラムに結合した糖蛋白質−ストレプト
アビジン産物はメチルαガラクトシドまたは、ラフィノ
ースのようにα結合したガラクトースで終っている少糖
類と共に溶出される。

同じ測定法（わずかな変化を持つ）は酵素ＣＭＰＮｅｕ
Ａｃ：Ｇａｌ　β１，３（４）ＧＩｃＮＡｃ−（α１，
３）ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅにもまた使用
できる。この酵素はＮｅｕＡｃをＣＭＰ　ＮｅｕＡｃか
らＧａｌ　βＬ　、　３　（４）ＧｌｃＮＡｃ−糖の末
端配列を持つ少糖類へ転移させる。酵素ＣＭＰ−Ｎｅｕ
Ａｃ：Ｇａβ１．．３（４）ＧｌｃＮＡｃ（αｔ、３）
ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅは動物細胞の筒抜
合体の生合成で糖鎖の伸長を終結させる重要な酵素であ
る。この反応の産物であるＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌ−
糖はヒト細胞から分離されたインフルエンザウィルス（
ＨＢ型）の細胞表面レセプターである。上に記述したＵ
ＤＰＧａｌ：β−Ｄ−ＧｌｃＮＡＣ（β１，４）ｇａｌ
ａｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆ’ｅｒａｓｅの測定との違
いは、糖核酸として、ＣＭＰＮｅｕＡｃを用いること、
受は入れ側分子としてフィブリノーゲン糖蛋白質のシア
ル酸の存在しない誘導体を用いることである。

レクチンカラ１１はＭａａｃｋｉａ　ａｍｕｒｅｎｓｉ
ｓからの白血球凝集素を使って調製される。このレクチ
ンはこの酵素の産物であるＮｅｕＡｃ　β２，３　Ｇａ
ｌ　βｌ　、　３Ｇ　ｌ　ｃＮＡＣ−糖という末端配列
を持つ少糖類に結合する。

このレクチンへのシアル酸の存在しない糖蛋白質−スト
レプトアビジンアエクオリンの産物の結合により、もと
の基質や関連あるか違う酵素により作られた他の産物か
らその産物を分離する。

上に述べた例のすべてがグリコジルトランスフェラーゼ
についての例であるが、この技術をどんな酵素応用する
ために必要とされる考えは上や以下の例の記述から技術
的には容易に理解出来るであろう。ここで述べているよ
うに受容体によって基質と産物とが区別できさえすれば
理論的には、上のＴａｂｌｅ　１に示されているどの酵
素の反応もまた実際にすべての知られている酵素にとっ
てもこの反応系は適用できる。

以下の例は実例として示したもので、これに限定しよう
とするものではない。

例 測定法が実行できるか否かを確かめる研究は、商品化さ
れている（シグマ社　セントルイス）酵素ＬＩＤＰＧａ
ｌ：β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ（β１，４）ｇａｌａｃｔｏ
ｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅを使って行われた。測定
の基本は第５図に示しである。

この測定において、ＧＩｃＮＡｃを末端に持つ糖蛋白質
にストレプトアビジンを共有結合で結合させ、酵素ＵＤ
ＰＧａｌ：β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ（βＬ、４）ｇａｌａ
ｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅにより転移を受け
る側の分子として使った。酵素反応の産物はその末端に
Ｇａｌ　β１−４ＧＩｃＮＡＣ結合を持っている。反応
後、ビオチン化組換えアエクオリンを加え、産物と反応
物にあるストレプトアビジンのすべてのビオチン結合部
位に反応させた。化の反応物からこの酵素反応産物を分
離するため、反応液をレクチンＲ１ｃｉｎｕｓ　ｃｏｍ
Ｌｌｌｕｎｉｓ凝集素−■を結合させたカラムを通した
。この植物性レクチンは高い親和性でＧａｌ　β１，４
ＧＩｃＮＡｃ−筒抜合体という末端配列を持つ筒抜合体
に結合するが、この構造の異性体、たとえばＧａｌ　β
１，３ＧＩｃＮＡＣ−筒抜合体やＧａｌ　β１．４Ｇｌ
ｃＮＡｃ−筒抜合体とは結合しない（ＭｅｒｋｌｅとＣ
ｕＣｕｍｍ１ｎ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｒｇｙｍ
ｅｌ、（１９８７）　１３８：　２３２−２５９）　、
レクチンに結合した糖蛋白質−ストレプトアビジンはレ
クチンカラムからレクチンへの競合的リガンドであるラ
クトースを１１００ｎ含む緩衝液で溶出した。産物の全
量は、カルシウムイオン添加によりアエクオリンにより
作られる光を測ることにより決定した。

発光は１０秒以内に起きた。そして、生成した全部の光
は、サンプル中に存在する酵素量と直接関連している。

ガラクトシルトランスフェラーゼ反応の受は入れ画分子
はフィブリノーゲンから前に示されている方法（ｃｏｍ
ｍｌｎｇｓとＫｏｒｎｆｅｌｄ、　Ｊ、　Ｂｌｏｌ、　
Ｃｈｅｎ、　（１９８２）２５７：１１２３５−１１２
４０）で調製した。手短かに述べると、１グラムのフィ
ブリノーゲン（シグマ化学会社）をプロナーゼ分解して
得られたフィブリノーゲン糖蛋白質が出発材料として用
いられた。

フィブリノーゲン糖蛋白質上に存在する２つに分岐した
糖鎖を得るために、Ｃｏｎ　Ａ−セファロースの１００
ｍ１のカラムを使ってアフィニティークロマトグラフィ
を行った。非結合性物質はＴＢＳ（１０Ｍ　Ｔｒｉｓ、
　１ｍＭ　ＣａＣｌ２．１ｍＭＭｎＣΩ２および０．０
２％ＮａＮ　３　、ｐＨ８，０）で洗った。１０ＩＩＩ
Ｍα−メチマンノシドで溶出した結合性糖蛋白質を集め
、塩やハブテン様の糖を除くためにセファデックスＧ−
２５のカラムでクロマトグラフィを行った。

フェノール硫酸法で検出したボイドボリュームに存在す
る糖蛋白質を集め乾燥した。それは典型的な２本の鎖に
分かれているＮ−結合型少糖類であり末端にシアル酸を
持ち、下に示すようにフコース残基を持っていない。

ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβｌ−
２Ｍａｎａ　ｌ−８Ｍａｎβｌ−４ＧｌｃＮＡｃβｌ−
４ＧＩｃＮＡｃβＡｓｎＮｅｕＡｃａ　２−３Ｇａｌβ
Ｌ−４ＧｌｃＮＡｃβｌ−２Ｍａｎａ　ｌ−３シアル酸
を緩和な酸加水分解によって糖蛋白質から除いた。そし
て結果として生じるシアル酸を含まない誘導体をなた豆
のβ−ガラクトシダーゼで強く切断し、下に示すような
シアル酸もガラクトースも含まないフィブリノーゲン糖
蛋白質を得た。

ＧｌｃＮＡｃβｌ−２Ｍａｎ　ａ　１−６Ｍａｎβｌ−
４ＧｌｃＮＡｃβｌ−４ＧＩｃＮＡｃ　／３　ＡｓｎＧ
ｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−３ シアル酸とガラクトースを含まないフィブリノーゲン糖
蛋白質はストレプトアビジンと共有結合で結合させた。

手短に述べると、その糖蛋白質をエッペンドルフチュー
ブ中で乾燥させ、酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６，０の中
で５０　Ｈ＋ｏｌ／ｍｌニンヒドリン４０μｇと反応さ
せた。その産物をＢ１１Ｇｅ１　ＰＩＯ（Ｉ　Ｘ２釦１
）のカラムに通し、ＰｈｅｕＩＩｌａｎｎｓ　ｐｕｒｐ
ｌｅと未反応のニンヒドリンから活性化された糖蛋白質
を分離した。カラムのボイドボリュームを凍結乾燥した
サンプルは乾燥するや否やすぐとり出し、２０Ｍｇの０
．１７ＭＫＨ２ＰＯ４１）Ｈ７，５に再び溶かした。ス
トレプトアビジン（５ｍｇ）を２５μｇの０．１７ＭＫ
Ｈ２ＰＯ４ｐＨ７，５と５μｇのＮａＣＮＢＨ３のＫＨ
２ＰＯ４の溶液（０，０８２ｇ　　ＮａＣＮＢＨ３／ｍ
　１　０．１７ＭＫＨ２Ｐ　０４　、ｐ　Ｈ７，５）で
溶かし、活性化された糖蛋白質に加えた。その反応液は
室温で一夜反応させ、そしてストレプトアビジン−糖蛋
白質複合体（ＳＧｐ）はＣｏｎＡカラムを使って親和性
を利用して精製した。そして１００ｍＭのカコジレイト
緩衝液ｐＨ６，５の溶液中で凍結保存した。

酵素測定用の反応液にはｐＨ６，５のカコジレイト緩衝
液中に２　ｕ　ｇ　Ｓ　Ｇ　ｐ　、　５０　ｎ　ｍｏｌ
ＵＤＰ−Ｇａおよび１μｍｏｌのＭｎｔＪ！２が含まれ
ている。測定に用いる酵素の量は１〜１０μＶである。

反応液は３７℃で最大２時間まで反応させ、反応は２０
Ｍｇの２００ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐ　Ｈ８，０を添加する
ことで終止させた。その反応の最後に、反応液を４℃に
冷やし、１μｇのビオチン化アエクオリン（ＢＡＥＱ）
を加えた。この反応液を氷上で３０分間置き反応させた
。サンプルをＲｉｃｉｎｕｓ　ｃｏｍｍｕｎ１ｃ凝集素
−Ｉを結合させたカラムに通し、結合したガラクトシル
化した５Ｇｐ−ＢＡＥＱ産物をラクトース溶出によって
カラムから回収した。結合画分の一部（５００ｇｇ）を
バイアルに入れ、産物は１００μｇのカルシウム含有測
定緩衝液（０゜１Ｍ　　ＣａＣｌ７２．０．００４％　
ＮａＮ３、ｐＨ７，５）を注入することにより放出され
る光としてＢｅｒｔｈｏｌｄ分光光度計で検出した。

実験によれば、酵素活性の関数として発生された金光即
ち全ホトンが示された。光は産生されたフェントモルの
ビオチン化アエクオリン結合産物に変換された。この変
換には、分っている濃度の先玉白質を使い行われた測定
により作られた絶対的な光の標準値が使われた。その結
果、このｎ１定技術によるグリコジルトランスフェラー
ゼ活性の検定における感度は従来の放射性同位元素を用
いる方法に比べ、高価な放射性同位元素標識の試薬や放
射性物質廃棄の問題もなしに、少くとも１０３倍も高い
ことが示された。

以上、本発明の具体的実施の態様について詳細に説明し
たが、本発明はこれら具体例にのみ限定されるべきもの
ではなく、本発明の技術的範囲を逸脱することなしに種
々の変形が可能であることは勿論である。

【図面の簡単な説明】

第１図乃至第４図は本発明の種々の実施例を示した各概
略図、第５図は特定の測定に適用した場合の本発明の１
実施例の概略図、である。 図面の浄書（内容に変更なし） −Ｌ 一−ρ−Ｌ −Ｌ 一一一一−Ｐ−Ｌ ＳＬ　＋　Ｒ１−Ｐ−Ｌ Ｒ２＃Ｓ−Ｌ ＋　Ｐ−Ｌ ＦＩＧ。 ＦＩＧ。 ５−ｅ）−Ｌ ＋Ｐ−＠ヒＬ Ｓ＝）−Ｌ　＋　Ｐ−４’−Ｌ ＄−４）−Ｌ　＋ Ｒ１・Ｐ　−４）−Ｌ ＦＩＧ、　３ Ｒ２”　Ｓ　−ｅ）−Ｌ　＋　Ｐ　４　）−ＬＦＩＧ、
　４

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、サンプル内の酵素の活性レベルを決定する方法にお
   いて、 （ａ）反応媒体内において （１）前記酵素を含有すると思われるサンプルと、 （２）標識産物を与えるために前記酵素と反応可能であ
   る前記酵素用の標識基質と を、結合させ、 （ｂ）前記反応媒体内において前記酵素と前記基質との
   間で反応を行なわせて、その際 に前記酵素の存在下において前記産物が 形成され、 （ｃ）前記反応を行なわせる前か又は後に、前記反応媒
   体を前記産物又は前記基質のい ずれか一方のみと特に結合可能な受容体 と結合させて複合体を形成し、 （ｄ）前記反応媒体内の前記複合体又は非複合体内の標
   識体の存在又は量を決定し、 前記標識体が生物発光タンパク質を有することを特徴と
   する方法。 ２、特許請求の範囲第１項において、前記受容体が固体
   表面に付着されており、固相複合体が前記受容体と前記
   検知可能な標識産物又は基質との間に形成されることを
   特徴とする方法。 ３、特許請求の範囲第２項において、前記標識基質は液
   相反応媒体中に存在しており且つ前記固相複合体は前記
   決定を行なう前に前記液相反応媒体から分離されること
   を特徴とする方法。 ４、特許請求の範囲第１項において、前記受容体は単ク
   ローン抗体であり、前記抗体はそれが前記基質と結合す
   る親和性の少なくとも１０＾５倍の親和性で前記生成物
   と結合するものであることを特徴とする方法。 ５、サンプル内の酵素の活動レベルを決定する方法にお
   いて、前記酵素を含有すると思われるサンプルを反応媒
   体内において前記酵素と反応可能な基質と結合させて産
   物を形成し且つ形成された産物又は反応した基質の量を
   酵素活性測定値として決定し、前記産物又は前記基質を
   前記産物又は基質に対し特定の結合親和性を持った受容
   体と結合させることにより生成物を未反応基質から区別
   し、その際に前記結合により非複合基質及び産物から区
   別可能な複合体を形成し、前記産物又は前記基質に関す
   る生物発光タンパク質標識体を使用して前記反応媒体内
   の前記複合体又は非複合体での前記産物又は前記基質を
   検知することを特徴とする方法。 ６、特許請求の範囲第５項において、前記生物発光タン
   パク質が光タンパク質であることを特徴とする方法。 ７、特許請求の範囲第６項において、前記光タンパク質
   がアエクオリン（ａｅｑｕｏｒｉｎ）であることを特徴
   とする方法。 ８、特許請求の範囲第５項において、前記複合体は前記
   基質の実質的不存在下において生成物及び受容体を有す
   ることを特徴とする方法。 ９、特許請求の範囲第８項において、前記基質はビオチ
   ン−アビジン又はビオチン−ストレプトアビジン複合体
   を有するリンクグループを具備する前記標識体に付着し
   ていることを特徴とする方法。 １０、特許請求の範囲第９項において、前記受容体がレ
   クチンであることを特徴とする方法。 １１、特許請求の範囲第１０項において、前記産物及び
   前記基質はビオチン付炭水化物であり且つ前記生物発光
   タンパク質標識体が前記ビオチンを前記生物発光タンパ
   ク質及びアビジンを有する複合体と結合させることによ
   る前記反応の後に前記産物又は前記基質へ付着されるこ
   とを特徴とする方法。