SE444086B - Homogen specifik bindningsanalysmetod med signalmodulering i miljon kring specifikt bindande partiklar, komposition herfor och anvendning av en sats for genomforande av metoden - Google Patents

Description

*å UT 2Ü 25 30 35 7910042-6 .Q gena metoder radiaaktiva märksubstanser, enzymer och fluoresce- rande molekyler.

Ett alternativ till fysikalisk separering är att binda en av delarna i det homologa paret till en fast bärare, som even- tuellt kan absorbera det vattenhaltiga mediet. Den fasta bära- ren kan då åstadkomma separeringen eftersom den komplexbundna eller associerade liganden och receptorn är bunden till den fas- ta bäraren. Detta möjliggör en relativt enkel separering mellan det vattenhaltiga analysmediet och den fasta bäraren. ne homogena metoderna bygger på bildandet av komplex för modulering av den signal som erhålles från märksubstansen. Den dissocierade konjugerade märksubstansen ger en annan signalnivå än den associerade konjugerade märksubstansen med dess receptor. Üå t.ex. liganden är konjugerad till en stabil fri radikal, med- för aseociationen av konjogatet till dess homologa receptor en avsevärd utjämning av esr-topparna. Med enzymer som märksubstan- ser vartill liqander konjugerats, kan bindningen av receptet till llganderna medföra en sterisk inhibering av substratets när- mande till den aktiva ställningen i enzymet eller alloster modi- fiering av enzymaktiviteten. Förekomsten av ligand i analysmediet minskar mängden tillgänglig receptor för bindning till märkkonju~¿ qatet den påverkar således mängden märkkonjugat sem associeras “ med receptorn. Genom mätning av signalen Érån märksubstansfln kan man därför relatera signalnivån till mängden ligand i aealysme- diet.

Ett alternativ till att använda receptorn för att direkt påverka signalen genom sin volym är möjligheten att sammanföra m: tv epitop eller en polyepitop ligand bildas av monoepitopa ligan- drarflnns det möjlighet att låta receptorer som är olika märkta sammanföras då de är bundna till liganden eller attïmzligand med en märksubstans och receptet med en annan märksubstans, som då ligand och receptor associeras bringar märksubstanserna nära in- till varandra i rymden. nå de olika mårksubstanserna påverkar varandra och i sin tur påverkar graden av iakttagen signal, kom- mer den associerade liganden och receptorn att ge en annan signal- nivå än den dissocierade, märkta receptorn. l märksubstanser som påverkar varandra. Qà en ligand är poly- ha LH 20 30 35 ?91oo42ësï :b Denna teknik har använts med kromoforer som står i ett så- dant förhållande till varandra att en av kromoforerna fluoresce- rar vid en våglängd med en energi som accepteras av den andra kromoforen, som fungerar som en utsläckare. Genom användning av två olika enzymer, där produkten av ett enzym är substratet för det andra enzymet, kan man också observera en ökad omsättning av komplexet, jämfört med,den dissocierade märksubstansen.

Man har inom tekniken för homogen imunoassay koncentrerat .ig på att antingen utnyttja komplexets egenskaper att modulera signalen eller att låta komplexet sammanföra olika märksubstan- ser nära varandra i rymden, vilka märksubstanser är besläktade och ger olika grader av samverkan i förhållande till deras av- stånd från varandra. vid utveckling av immunoassayer finns det många faktorer att P' 'ß fi--l *íllq lnïê luiïïšï; kåfiåli§xxêtëfi. tå häñsyñ små mängder av en ligand är det antingen nödvändigt att ha en märksubstans som kan detekteras i en mycket låg mängd med hög noggrannhet eller att åstadkomma ett flertal händelser associeras UÃ-fi FU . . .ätning av extremt =æ v L de med en separat ligand. En annan faktor är interferens av före~ kommande främmande material och den grad vari interferensen kan minimeras eller avlägsnas. ïtt annat problem som är förknippat med immunoassay är märk» ning, speciellt då liganden eller reeeptorn är oren, Den bakgrund- som härrör från konjugering av märksubstansen med andra förenings ar än de i det homologa paret måste hållas vid ett minimu för att en tillräckligt känslig analys skall erhållas; Hänsyn bör ock» så tas till den lätthet varmed protokoll föres, mätningar utföres, till reproducerbarheten, känsligheten för yttre faktorer och lik- nande; I Engasser och Horvath, Applied Biochem. Bioengineering, Vol. 1, 127 (1976) Academic Press, beskriver kinetiska effekfzr och diffusionseffekter vid immobilisering av enzymer. US PS 3 817 83ï beskriver en homogen enzym~imunoassay. US PS 3 996 345 beskriver homogen immunoassay som utnyttjar tvårkromoforer som utgör en fluorescerande substans ooh en utsläckare. Det är också känt att använda ett flertal enzymer, där substratet till ett enzym utgör Ü produkten av det andra enzymet. En homogen immunoassay som använ¥v -Ji 15 20 30 791oo42-6 4 der en icke~enzymatisk katalysator som märksubstans är också känd; Vidare finns en märkt, flytande diskontinuerlig fas avsedd att anj vändas vid immunoassayer beskriven, liksom en homogen immunoassay som utnyttjar ett enzymsubstrat som märksubstans. US PS 3 853 987V beskriver partiklar vartill konjugerats radioaktiva och fluorescef rande märksubstanser och antikroppar. Se även US PS 4 OO1 400. I Uppfinningen avser en homogen specifik bindningsanalysmetodm' för bestämning av förekomsten i ett prov av en analyt som utgör en del av ett specifikt bindningspar bestående av ligand och dessi homologa receptor, varvid provet i ett vattenhaltigt medium kombiå neras med ett signalalstrande svstem som omfattar en del kenjugewl rad till en pardel för åstadkommande av ett signalmärksubstanskon¿ jugat, varvid nivån av den signal som alstras av det signalalstranm de systemet utgör en indikation på mängden analyt som finns närva5 rande i provet som mätes och jämföras med samma analysmedium med en känd mängd analyt.

Någon separering eller segregering för bestämningen krävs ej§ Förfarandet bygger ej på någon bulkeffekt där man observerar summan av signalen från märksubstanserna på associerade delar, utan bygger istället på en ökning eller minskning av signalen som ett resultat av associationen. Förfarandet utnyttjar en väsentligen likformigt¿ dispergerad, diskontinuerlig fas av diskreta fasta (inklusive löse ningsmedelssvällda) partiklar (kulor) i ett vattenhaltigt analys-j medium. Partiklarna är märkta med en av delarna av det specifika I bindningsparet, Metoden enligt uppfinningen kännetecknas av att ett partikele konjugat dispergeras likformigt i det vattenhaltiga mediet, partikel~ konjugatet omfattar diskreta fasta partiklar vartill en av delarna M i detta par konjugerats och definierar en miljö kring den konjugnå rade delen av detta par som skiljer sig från det vattenhaltiga me? diet, nivån av signalen påverkas av den grad vari det signalalstran- de systemet föreligger i miljön kring dessa partiklar och den grad vari signalmärksubstanskonjugatet är fördelat mellan partikelkonjnfl gatet och vattenhaltigt medium står i förhållande till mängden anafl lyt i det vattenhaltiga mediet, den homologa delen av det specifika bindningsparet införes i det vattenhaltiga mediet då analyten, par; tikelkonjugat och signalmärksubstanskonjugat ger samma del av det; specifika bindningsparet, med det förbehållet att då analyten är en första receptor, den del av paret som är konjugerad till par- _: C) 15 2Ü 30 791oo42-6 tikeln kan vara den homologa liganden eller en receptor för den första receptorn, och delen av signalmärksubstanskonjugatet kan vara en receptor för den första receptorn resp. den homologa li- ganden. \ Partiklarna skapar en fysikalisk eller kemisk miljö som klart skiljer sig från den kontinuerliga vattenhaltiga fasen. Ett signalfl alstrande system finns som ger en detekterbar signal av väsentli- gen olika nivå beroende på om det signalalstrande systemet arbetar' i den fasta eller flytande vattenhaltiga fasen. Genom att fördel- karm-Ta :__ i... 1.1. 19:: i a.. Af. ' 1 1 1 av u~t ignalalstrande systemet mellan fast och fly "S (I) fas ställes i relation till mängden analyt i analysmediet, kommer den iakttagna signalen att vara en funktion av mängden analyt i analysmediet.

Uppfinningen avser vidare en komposition anpassad för använd- ning vid metoden enligt uppfinningen, som omfattar diskreta porösaf fasta partiklar med en storlek i området 50 nm till 100 pm i dia- meter vartill kovalent konjugerats i genomsnitt minst 1 ligandmo- lekyl och minst 1 enzymmolekyl, varvid liganden ej utgör ett enzym. 1 en föredragen komposition utgöres liganden av en poly(aminosyra) och enzymet av en transferas eller hydrolas.

Uppfinningen avser slutligen även användning av en sats som amfattar i kombination i relativa mängder för i huvudsak optime- ring av känsligheten av analysen, ett partikelkonjugat med en del av det specifika bíndnifigsparet konjugerad till diskreta, porösa, fasta partiklar och en del av det signalalstrande systemet valt M ur den grupp som består av enzymer ooh fluorescerande substanser konjugerad till en del av det specifika bindningsparet för åstad- kommande av ett signalmärksubstanskonjugat.

Enligt uppfinningen erhålles ett förfarande för bestämning av låga koncentrationer av organiska föreningar i en stor mängd media, speciellt med fysiologisk aktivitet, som antingen finns naturligt förekommande i fysiologiska vätskor, eller som admini- streras till vertebrater. vid förfarandet användes som analysme- dium en kontinuerlig, flyuærkzvatuaüufltig fas och en diskontinuerliç få 10 fw: L." 20 25 30 35 7910042-e fast fas som består av diskreta små partiklar med relativt låg sedimentationshastighet och som kan ge en miljö som skiljer sig från miljön i den kontinuerliga fasen.

Partiklarna utgör stora diskreta, miljö för en märksubstans som skiljer sig från miljön i bulklös- in ningen, företrädesvis porös, med kanaler eller inskärningar i ytan av ett avsevärt djup där vätskemiljön in kanalen eller ínskärš fasta kulor som ger en ningen avsevärt påverkas av den väsentligen omslutande fasta fa- Ett signalalstranfle svstem finns- som helt eller delvis är íñ »en= _ fördelat mellan de två faserna i förhållande till mängden analyt som finns närvarande i analysmediet. Eftersom den observerade sig~ nalen kommer att skilja sig avsevärt beroende på i vilket utsträckß ning det signalalstrande systemet är fördelat mellan vätskan och den fasta fasen, kommer den uppmätta signalen att återspegla mäng~= den analyt i analysmediet.

Analyten utgöres av en del av ett specifikt bindningspar som ' består av en ligand och dess homologa receptor. Partiklarna eller r som utgör den fasta fasen är bundna direkt eller indirekt,' kovalent eller icke~kovalent till en av delarna i det soecifika bindningsparet. Det finns ett undantag där en specifik typ av receptor till en specifik ligand är analyten, tre specifika bind* ningskomponenter erfordras, nämligen receptor, antireceptor el- ler ligand, som kan vara bunden till partikeln, och ligand resp. antireceptor användes för annan märkning. En receptor som analyt möjliggör således ett antal alternativa konjugat. Dessutom kommer en av delarna i det signalalstrande systemet att vara bunden till eller bindas till den reciproka delen av det specifika bindnings-. paret. Genom lämpligt val av konjugat för det specifika bindnings- paret, kan mängden signalalstrande delar som är bundna till par~ tikeln ställas i förhållande till mängden analyt i analysmediet. vid utförande av förfarandet kombineras det analythaltiga provet, de märkta partiklarna, den märkta specifika bindningspar-j delen, liksom eventuella ytterligare reagens och bestämmas signa-5 len från analysmediet. Genom jämförelse mellan den observerade signalen och en signal som erhållits från ett analysmedium med en känd mängd analyt, kan analyten av intresse bestämmas kvalita~ tivt eller kvantitativt. De diskreta partiklarnas egenskaper kan '1910042-6 utnyttjas på ett antal olika sätt. De kan godtyckligt uppdelas i två kategorier: (1) diffusion: och (2) fysikaliska effekter.

Genom lämpligt val av porösa partiklar kan man påverka den hastighet med vilken en molekyl eller ett molekylaggregat för- 5 flyttar sig genom vätskefasvolymen intill den fasta partikelytan.

Effekten av den steriska volymen och trånga kanaler i partiklar- na blir att migreringshastigheten för en molekyl eller ett mole- kylaggregat mot och bort från partikelytorna minskas, jämfört med migreringshastigheten i bulklösningen, på grund av fysiska 10 hinder och liknande. Man kan således åstadkomma en avsevärd kon- _ E' centrationsgradient mellan den flytande vattenhaltiga fasen i bulkform och den flytande del som finns intill ytan av den fasta fasen. Ett signalalstrande system som är känsligt för koncentra- tionen av en typ av substans kommer att ge väsentligt andra sig- l5 nalnivåer i bulkvätskefasen jämfört med den fasta fasen.

Genom att ha två delar i det signalalstrande systemet som samverkar, dvs en del ger en förening som samverkar med den and- ra delen, kan den lokaliserade koncentrationen av föreningen i den fasta fasen ökas avsevärt jämfört med bulkvätskefasen. I des- 20 sa situationer kommer partikeln ej endast att vara märkt med en del av det specifika bindningsparet, utan också med en del av det signalalstrande systemet.

Den andra effekten är en fysikalisk effekt som ett resultat av partikelns kemiska naterl Den fysikaliska effekten kan iakt- 25 tas som pH,spektroskopiska egenskaper och liknande. I själva ver-l ket skiljer sig den miljö som skapas av partikelytorna, speciellt- i kanalerna eller porerna, för en molekyl avsevärt från miljön i bulklösningen. Då den signalalstrande delen är känslig för mil- jön, kommer man att erhålla en väsentligt annorlunda signal be- 30 roende på om den signalalstrande delen föreligger i den fasta fa- sen eller i bulklösningen. Exempelvis är aktiviteten av ett enzym pH-beroende. Genom lämpligt val av buffert och ett jonbytarharts kan pH på ytan av den fasta fasen ges ett helt annat värde än i bulklösningen. Den enzymatiska aktiviteten kan därför variera be- t 35 roande på fördelningen av enzymet mellan de två faserna.

Polariteten mellan partikeln och bulklösningen kan varieras i hög grad genom användning av en hydrofob partikel. Den hydrofoba¿ 10 lö 20 25 BÜ 35 7910942-e karaktären kan aktivera eller deaktivera ett enzym eller en kro- mo;en, t.ex. en fluorescerande substans.

Den spektroskopiska effekten kan exempllfieras genom använd- ning av opaka, transparenta eller partiellt transparenta (inom ett begränsat vâglängdsområde) partiklar. Det ljus som går in i eller ut från partikeln kan därför regleras. Alternativt kan fos- forescerande märkta (omfattar omslutna) partiklar användas eller partiklar med märksubstanser som kan överföra energi till en kro~ mogen.

Vid utförande av föreliggande förfarande användes minst två reagens: partikelkonjugatet; och de specifikakündningspardelkonâa* gatet. Dessa konjugat varierar beroende på typen av analyt, typen l av signalalstrande system, och typen av-partikel. Genom kovalent bindning av molekyler, speciellt enzymer till partikeln, kan man vidare åstadkomma en koncentrationsgradient, där bulklösningen har en relativt låg koncentration av den speciella föreningen el- ler enzymprodukten. Dessa molekyler kan utgöra en del av det sig- nalalstrande systemet eller endast ge en miljö som påverkar det signalalstrande systemet.

I det följande anges några definitioner som användes i före-Al liggande beskrivning.

Analyt ~ den förening eller komposition som skall mätas, som kan utgöras av en ligand, som är mono- eller polyepitop, antige- nisk eller haptenisk, en enda eller flera föreningar som delar åtminstone en gemensam epitop ställning eller en receptor.

Specifikt bindningspar - två olika molekyler, varav den ena har ett område på ytan eller i en fördjupning som specifikt bin- des till en speciell rymd- och polär organisation av den andra I molekylen. Delarna i det specifika bindningsparet benämnas ligand s och receptor (antiligand).

Ligand - en organisk förening som har en receptor som är na- turligt förekommande eller kan framställas.

Receptor (antiligand) ~ en förening eller komposition som kan känna igen en speciell rymd- och polär organisation av en molekyl, dvs epitop ställning. Exempel på receptorer omfattar na- turligt förekommande receptorer, t.ex. tyroxinbindande globulin, antikroppar. enzymer, Fab~fragment, lecitiner och liknande. æfl Iv-J kf? 20 30 I? 91 üäërërá í~\ «J e meñel för bi qandanašoqen skiljer sig normalt från liqanden genom mer än ere åning av en lígendanaloq till en annan molokyl. Li~ särrninq av ett väàe meå en bindning som förenar llgandanalogen meá en äërne eller mërïsoreiene.

Pnïyfïinwndanflloqš ~ etr flertal lioandrnreælier l1qandnna~ lwowr som är kovalwnt förenade, normalt till en mittkärneq Hirt~ kgrnnn är ett »olyfunrtíonellr marerânïê norweít uolymerir ven* ligen med ett ílerïel Eenkiionella grupper trex. hydroxi, amino, Lylen, e;c= som blndninqsetällon. Mittkàrnan kan vara » atäenläsliq eller olöslig i vatten, lämpligen vattenlösliq, en ar normalt en molekylvikt av minst ca 35 000 och kan ha en mole= ylv'kt upp till 10 miljoner eller mer, vanligen dock under O 99, speciellt under 309 DQQ, Exempel på mittkärnor omšattar yseckarider, polypeptider inkl. proteiner, nukleinsyror, jon- a rharts och liknande. Vattenolösliqa mittkärnor kan vara áe *nma som åe som angivits för pertikeln.

Partikel (fast fas) - partikeln är en diskret, fast parti* kel, som kan vara svälld eller som förblivit osvälld av den fly- tande fasen, och sammansatt av en stor mängd både hydrofoba och hydrofila material. Partiklarna kan vara fasta, ihåliga eller poez rösa, med en väsentligen slät eller oregelbunden yta, med en primärü konkav eller konvex *ïa, lämçligen çorös med kanaler el~ ler inskärningar, som kan varieras avsevärt beroende på storleken av molekylen eller aggregatet som uteslutes, som definierar en miljö som skiljer sig från det medium vari partiklarna är áisper- qeraäe. Partiklarna är lätt dispergerbere i ett vattenhaltigt medium och antingen polyfunkcionaliserade eller polyfunktionali- serbara för bindning till andra molekyler. Beroende på signalalst~¿ ringssystemet kan partiklarna vara väsentligen transparenta för ljus inom ett vâglängdsomrâäe huvudsakligen mellan 300 och 800 nm, lämpligen genom omrâdet eller vara opaka över hela det ultravio- letta och synliga området. iqnalalstrande system - det signalalstrande systemet ka ha en eller flera komponenter. varvid miner en komponent är konjue l r m oerad till en del av ett specifikt bindninqspar. Det signale 10 15 20 30 7 91 0042-16 rande systemet ger en mätbar signal som kan detekteras med hjälp av någon yttre annrdning, vanligen genom mätning av elek- tromagnetisk strålning, och beroende på det använda systemet kan signalnivân variera i den utsträckning som det signalalstrande systemet finns i miljön i partiklarna i den fasta fasen. Mesta- dels omfattar det signalalstrande systemet enzymer och kromofo- rer, varvid kromoforerna omfattar färgämnen som absorberar ljus i det ultravioletta eller synliga området, fosforescerande, fluo- rescerande ochkemiluminescerandesubstanser. Även om mestadel signalen lämpligen är absorbtionen eller emissionen av elektromag-f strålning, vanligen i det ultravioletta eller synliga om- 7 l l s letís rådet, kan elektrokemiska ändringar, termiska ändringar, nefelo- metriska ändringar och liknande också utnyttjas.

Märksubstans - märksubstansen kan vara en molekyl som är konjuqerad till en annan molekyl och kan väljas godtyckligt vad gäller vilken molekyl som år märksubstanaen. I föreliggande upp- finning är märksubstanserna den specifika bindningsparmolekyl som är konjugerad till partikeln eller en molekyl som utgör en del av det signalalstrande systemet som är konjugerad till en del av det specifika bindningsparet eller till en partikel.

Partikelkonjugat - den partikel vartill bundits, direkt el- ler indirekt, en del av det specifika bindningsparet och, om så är lämpligt, en eller flera delar av det signalalstrande systemet." En avsevärd mängd av de märksubstanser som är konjugerade till partikeln kommer att pâverkas av partikelytan, vanligen inuti lanalerna och porerna i partikeln om sådana finns, så att då den slgnalalstrande delen är bunden till partikeln det finns en egen- skap hos konjugatet som differentierar den signal som erhålles från partikeln från den signal som erhålles från bulklösningen. nindningsparmärksubstana - en del av det specifika bindnings- parnt nom användes för bindning av dess homoïoga del till narti~ keln som är direkt bunden till partikeln.

Signalmärksubstans - en del av det signalalstrande systemet »_ som ar direkt eller indirekt (genom bindning av ett specifikt nlndnxnqspari bunden till en blndningspardel eller till partikeín.

Bindningspardelkonjuqat eller sígnalmärksubstanskonjugat - aongngatet av bindníngspardwïen och en del av det signnlalstrande 10 15 20 30 35 ïåï Gås-liiite systemet (signalmärksubstans). , Märkt ligand, konjugatet av liganddelen av det specifika bindningsparet och en del av det signalalstrande systemet, an» tingen kovalent eller icke-kovalent bundet, vid kovalent före- ning, antingen genom en bindning, en bindningsgrupp eller en mittkärna. Den märkta liganden kan ha en eller flera ligandrar (inkl. ligandanalogerl eller en eller flera märksubstanser eller ett flertal av båda delarna, varvid den sistnämnda benämnas poly(liqandanalog)-polymärksubstans.

Märkt receptor - konjugatet av receptor och en del av det signalalstrande systemet, varvid dessa två är bundna antingen ko- valent eller icke-kovalent, vanligen kovalent genom en bindnings- grupp, varvid det kan finnas en eller flera receptorer bundna till märksubstansen, men vanligen en eller flera märksubstanser bundna till receptorn.

Makromolekylärt reagens ~ ett reagens som kan samverka med en del av det signalalstrande systemet för modulering av signa- len och åtminstone delvis är steriskt förhindrad från att sam- verka med en del av det signalalstrande systemet i partikelkons jugatets miljö genom steriska hinder eller reducerade diffusions- hastigheter. Reagenset har vanligen en minsta moleeyšvikt av ml minst ca 20 000, vanligen minst ca 40 000 och företrädesvis minst ca lüü 000. Reagenset kan helt naturligt ha en sådan molekylvikt eller också kan den aktiva föreningen vara bunden till en mitt- kärna för åstadkommande av önskad molekylvikt.

Fdreliqgande analys utföres i en vattenhaltig zon vid mått- ligt pH, i allmänhet nära optimal analyskänslighet, utan separe~ ring av analyskomponenterna eller produkterna, Analyszonen för bestämning av analyt iordningställes genom användning av ett lämpsl ligt vattenhaltigt medium, normalt buffrat, det okända provet, som kan ha förbehandlats, partikelkonjugatet, bindningspardelkon- f jugatet, samtliga material som erfordras för signalalstringssys- temet för alstrande av en detekterbar signal, liksom delar av det specifika bindningsparet eller analoger därav, såsom erford~ ras. V Förekomsten av liqand eller dess homologa receptor (antili- gand) i det okända provet påverkar fördelningen av det signal~ 10 15 20 N» gjt 30 35 7910042~6 alstrande syst et mellan partikeln eller den fasta fasen och bulklösningen i analysmediet.

Vid utförande av analysen användes normalt ett vattenhaltigt V medium. Andra polära lösningsmedel kan också användas, vanligen syrehaltiga organiska lösningsmedel med från 1-6, vanligen från etrar och liknande. Dessa l-4 kolatomer, inklusive alkoholer, samlösningsmedel finns vanligen närvarande i en mängd av mindre än ca 40 vikt%, företrädesvis mindre än ca 20 vikt%.

Mediets pH ligger normalt i området ca 4-ll, vanligen i om- rådet ca 5-10, och företrädesvis i området ca 6,5-9,5. pH väljes så att en signifikant nivå av specifik bindning av receptorn upprätthålles samtidigt som den signalalstrande förmågan optimerae¿ I vissa fall får man göra en kompromiss mellan dessa två faktorer, Olika buffertar kan användas för att uppnå önskat pH och bibehål~i la pH~värdet under bestämningen. Exempel på buffertar är borat, fosfat, karbonat, Tris, barbital och liknande. Den speciella buffert som användes är ej avgörande för uppfinningen men vid individuella analyser kan en buffert föredras framför en annan.

En måttlig temperatur användes normalt vid utförandet av analysen och vanligen konstant temperatur under mätningsperioden, speciellt för hastighetsbestämningar. Temperaturen vid bestäm- ningen varierar i allmänhet från ca 10-SOOC, vanligen från ca 15-4o°c.

Koncentrationen av analyt som skall analyseras varierar i allmänhet från ca 1o“4 till 1o"15 M, speciellt från ca ia'5 till -13 LO M. Sådana överväganden som om analysen är kvalitativ, semi~' kvantitativ eller kvantitativ, den speciella detekteringstekni- ken och koncentrationen av den analyt som skall undersökas be- stämmer normalt koncentrationen av de övriga reagensen. Även om koncentrationen av de olika reagensen i analysme- diet i allmänhet bestämmas av koncentrationsomrâdet för resp. analyt, bestämmes slutkoncentrationen av varje reagens normalt empiriskt för optimering av analysens känslighet över intresse- området. De totala bindnindsställena i delarna av det specifika bindningsparet som motsvarar analyten skall ej vara mindre än ca 0,1 gånger den minsta koncentrationen av intresse baserad på bindningsställen i analyten och vanligen ej mer än ca 1 000 ggr 10 15 2G 25 30 35 ,: ”phear -§ï_VI,-;I.,««~>e.,_1 .ååh 3%. , y, ”zu :Qljw h” _' ß :mc =._ v , .. h» ¿- «,,._¿¿; .\ .när den maximala koncentrationen av intresse baserad på bindnings- ställen 1 analyten, vanligen ca 0,1 - 190 gånger, företrädes- vis 0,3 - 10 gånger den maximala koncentrationen av intresse.

Med koncentration avses den tillgängliga koncentrationen, dvs koncentrationen vid mättnad och ej nödvändigtvis den verkliga koncentrationen där delar av det specifika bindningsparet even- tuellt ej är lika tillgängliga för bindning.

Beroende på det speciella signalalstrande systemet, liksom det sätt varpå de specifika bindningspardelarna användes, kan mängden av de olika konjugaten varieras inom vida gränser. Exem- pelvis kan man ha ett mycket stort överskott av bindningsparmärk- Å substansen i partikelkonjugatet, genom att först bindningspar- delkonjugatet bringas att reagera med det okända provet, varefw ter kombineras med partikelkonjugatet. Då en konkurrensmetod an- vändes, genom att partikelkonjugatet och bindningspardelkonjuga- tet sättas till det okända provet samtidigt, kan ett stort över- skott av bindningsparmärksubstansen reducera analysens känslig- het. Såsom angivits tidigare kan därför genom användning av olika koncentrationer av de olika reagensen med analyt av ner inom områden av intresse, förhållanden erhållas som kan op- timera analyssvaret.

Den ordning Jari de olika reagensen tillsättes kan variera avsevärt beroende på de speeiella märksubstanserna, den"förening vartill märksnbstansen är konjngerad, typen av konjngat, typen av analyt, samt relativa koncentrationer av analyt och reagens.

Tillsatsordningen påverkas också av om en jämviktsmetod eller en hastighetsmetod användes vid bestämningen.

Eftersom med många receptorer, assooiationen av de speeifika§ bindningspardelarna blir i det närmaste irreversibel under ana- lysperioden, undviker man normalt att kombinera partikelkonjuga- tet med signalmärksubstanskonjugatet före tillsatsen av analyten,f då de två konjugaten är motsvarande delar av det specifika bind- ningsparet. I motsats härtill kan, då de två konjugaten har sam- ma del av det specifika bindningsparet, dessa kombineras före införingen av det okända provet i analysmediet. Oberoende av ty- pen av analyt kan samtliga reagens tillsättas samtidigt och an- tingen en hastighet- eller jämviktsbestämníng göras. koneentratioiï i-f'f:nß'a:r-1;%«fv:-.~z ~ LW 10 15 20 h.) L!! 30 7919042-6 Ett eller flera inkubatíonssteg kan användas vid framställ- Exempelvis kan det vara önskvärt att inka- Det ínkuberínq efter tillsats av parfilkelkonju~ ning av analysmediet. bara en antiqenanalyt med märkt receptor. kan videre vara önskvärt meâ en anära gaten. Om en lnkubatiønsperiod skall användas eller ej och läng~ den av ínkubatísnsperisden beroï i avsevärd qrad på bestàmnings~ sättet ~ hastighet eller jämvikt - och den hasnighet varmed res ceptcrn bindes till liganden. Inkubationsstegen varierar vanligen från ca Q min till 6 h, sgeclellc :rån ca 5 min till 1 h. In= ,5 :_ . nemgezatuzen varierar i allmänhet fran ca 4~50 C, vanw lo I UN kubati n Ph CK DM _»- så fi! =s y..

L!! ëšfi ï." »fil li .

Efter det att reagensen kombinerats skall signalen bestäm- mas. Bestämninqsmetodenäkan bestå 1 observatløn av elektrsmagnee tisk strålning, speciellt ultravicíett och synligt ljus, antingen absørptiøn elle: emisslon, kslorimetrisk, elektrokemisk, nefelo- metrisk eller liknande bestämning. Det är önskvärt att signalen avläses som slektrsmaqnetísk strålning i det ultravioletta eller synliga området, speciellt från ca 250-750 nm, vanligen från 3562650 Câ flm .

Den temperatur vid vilken signalen iakttas varierar i all- mänhet från ca m-so°c, vanligen från ca 1s-4o°c.

Stnndardanalysmedia kan framställas som innehåller kända mängder av analyten. Den iakttagna signalen för standardanalys- mediet kan därefter avsättas så att koncentrationen.relateras nålen, *är en gång en säsnäsrâkurve fssäställäs s ^ a ytan. gå Om en . . , till sl san en g signal direkt relatera till koncentrationen av an d 1 Ti en för mätning av slqnalen varierar bexoende ww- xastlghsts- eller jämviktsmsfed användes; erfnrderlig känslis* 21' ru- , tfpen av siqnalalsåïanèe system och liknanâe. För hastiqh~ hetsmetnder kan tiden mellan avläsningaïna 1 allmänhet vazíeïs från ca 5 s till 6 h, vanligen ca 10 s till l h. vid jämvlkts- metoden kan efter det att ett statíonärt tillstånd uppnåtts en enda avläsning vara tillräcklig eller också lackar två avlàsnlngfl sv sve? näve? lïssšisï tïäsintervslíl Mëwqáen av effekteï sam kan uppnås av pnïtaklarna medför ett stort uxval vid sammanställningen av reaqens för analysen. föl» tande šnëell visar de mest uppenbnxa variaciwnør som är müjliga 10 15 20 25 30 35 med signalalstrande system som utnvttjar ett eller flera enzym.

Listan är icke avsedd att vara uttömmande, utan visar snarare de enklaste och bäst tillgängliga signalalstrande systemen och reagenskombinationerna. Det bör vidare märkas att olika kombina- tioner kan vara att föredra beroende på erforderlig känslighet liksom källan av det okända provet. av analysen, TABELL I Analyt 1 Partikelš konjugat" Ag P ~ Ag Ag P - Ab Ag P - Ab Aq P ~ Ag Ag P- Ab Ag P - Ab Ag P - Ag Ag P ß Ab Ag P ~ Ab Ag P~Ag-Enzl Ag P~Ab-Enzl Ag P-Ab-Enzl Ag P-Ag Ag Av-Ab Ag P-Ag-F Ag P-Ab-F ag ü-Ab~F Ag P-Ag Ab P~Ab Ab V P-Ab-F Ab P-Ag Ab P-Ab l. Ag - ligand Ab - 2. P - Ag -'Ab typen av analyt, Bindningsparï delkonjugat Ab Ab ÅQ Ab A9 Ab Ab A9 Ab-Enz nu Enz Enz Enz Enzl-Enzz Enzl-Enzz Enzl-Enzz Enzl, Ab-Enz, Enzï, Ab~Enzk 2 Enzl, Ag-Enzz 2 Ab-Enzz Ag-Enzz Ab-F Ab-F Ab-Enz Ab-En: Ag-Ena Ab-F Ab-F Ag-Enz Ab-Enz Ag-Enz receptor, vanligen polyvalent partikel konjugerad med antigen partlkel konjugerad med antikropp 1s1ne42~a Signal~ alstrande system Å Reagens' a,b eller c a,b eller c a, b eller Q a GU ~IDNDJOIWDJSDW Ph 0 H1 Ö a,b eller ct a,b eller c¿ 10 IH' UT 20 25 30 35 37910042-6 Ab Å9 Ab A9 ir A9 Ab Å9 Ab Ag - Enzl partikel konjugerad med antigen och enzym Ab - Enzl partikel konjugerad med antikropp och enzym f Ag-F partikel konjugerad med antigen och fluore- ¿ scerande substans I Ab-É partikel konjugerad med antikropp och fluore~ eoerande substans Enz antikropp konjugerad med enzym Enz antigen konjugerad med enzym antikropp konjugerad med två olika enzymer där produkten av det ena utgör substratet Enz,-Enzq .L ¿ för det andra Enzl-Enzz antigen konjugerad med två olika enzymer där produkten av den ena utgör substratet för det andra Enzl, Hb-Ena- antikroppar till s_mma ligand; varav en del är konjugerad till ett enzym och en del är konjugerad till ett annat enzym som använder produkten av det första enzymet som substrat Enzl, Ag-Enzz antigen, gör produkten av det andra enzymet Enz till Enzl, genom att snbstratetförett av enzymen utgör produkten av det andra enzymet antigen konjugerad med ett enzym relaterat till Enzl, genom att substratet för ett av Enzâ J-ß! m FI N $| å Å ÜÜ Q W F antikropp konj gerad med en fluorescerande kromofor (F) litet substrat stort substrat, jämfört med partíkelns porstorlek litet substrat, stor inhibitor jämfört med partíkelnsv porstorlek förening som reagerar med enzym (Enz) under kemilumi-V fluoresceranë nescensoch överföring av energi till de: de substansen som fluorescerar där delar är bundna till olika enzymer, varvid substratet för ett enzym ut* antikropp konjugerad med ett enzym relaterat gor produkten av det andra enzymet u 10 ta äfl 25 30 35 7910042-6 e - antífluorescerande substans f - partikelmiljön påverkar fluorescensen I stället för att göra tabellen alltför utdragen kan den situation då antikropp eller receptor utgör analyten åskådlig- göras i jämförelse med den situation då antigen utgör analyten.

Allmänt gäller att då analyten är en antikropp, symbolen för antigen endast behöver ersättas med symbolen för antikropp och symbolen för antikropp ersättas med symbolen för antigen i de visade exemplen.

Liganden kan vara mono~ eller polyepitop. I de flesta fall kommer denna skillnad ej att påverka det sätt vazpå analysen utföres. Då analyten är en ligand kan den specifika bindnings- pardelen i partikelkonjuqatet antingen vara ligand eller recep~ WO tor. Blndn ller siqnalmärksubstan~ sen) kan ha antingen ligand eller receptor. Då emellertid både partikelkonjngat och bindíngspardelkonjugat har receptor måste . . _ lnqspardelkongugatet (som 1nneh liganden vara polyepitop eller gjorts sådan genom användning av* en poly(liqandanalog) som ytterligare reagens. Detta innebär att en sandwich~teknik användes där liganden bindes till partlkelkon-*l jngatet och ger epitopa ställningar för bindning av bindningspar~ delkonjuqatet till partikelkonjuqatet.

Då receptorn är analyt, kan partikelkonjugatet och bindníngsel pardelkonjugatet ha samma eller olika delar av äet speoifika bindninqsparet, med det förhehållet att receptorn är polyvalent då líqanden finns 1 båda konjugaten.

För det fall att analyten och de två konjugaten samtliga har eller innehåller samma del av det specifika bindníngsparet måste den homologa delen tillsättes och närmare bestämt i poly- epitop form, antingen som en antikropp, eller en polyvalent receptor, då den är en receptet eller som polyhapten (poly(li~ gandanalogäl, då den är en ligand.

Då en enda komponent av det signalalstrande systemet använ~ des som märksubstans kan en eller flera egenskaper hos partikeln utnyttjas för att påverka signalnivån. När två enzymer användes, eller ett enzym och en komhlnation av besläktade kromoforer, kom- mer, även om andra egenskaper hos partikeln kan ha en viss effekt, 10 |..a UI 20 25 30 35 791oo42-6 gg partikeln vanligen primärt att inverka på diffusionshas- g tigheten för en enzymprodukt. På liknande sätt kommer, då ett stort substrat eller en stor inhibitor eller utsläckare användes,fl partikeln primärt att påverka diffusionshastigheten av substra- A tet, inhibitor eller utsläckare till signalmärksubstanskonjugatet_ som bindes till partikeln.

Föreliggande förfarande kan således användas för samtidig bestämning av förekomsten av ett flertal t.ex. två eller fler, analyter, om det signalalstrande systemet har åtminstone ett lika stort antal delar som samverkar på ett additivt eller successivt; sätt. Situationen kan âskådliggöras med hjälp av två antigen-anaf lyter. Genom bindning av antikroppar till antigen-analyterna till partikeln och med hjälp av antikroppar för en antigen-analyt p konjugerad till Enzl och antikroppar för den andra antigen-analys É ten konjugerade till Enzz, varvid Enzl och Enzz är enzymer där A substratet till Enzz utgör produkten av Enzl, och mätning av pros dukten av Enzz, kommer det att ske en ökning av produktionen av Enzz-produkt då b de enzvmerna är bundna till partikeln genom förmedling av antigenen. De två enzymen kan endast bindas till partikeln då båda antigenerna finns närvarande i analysmediet.

Situationen kan omvändas med polyvalenta receptoranalyter eller andra kombinationer användas.

Denna teknik kan också tillämpas om man har den andra analye ten, signalmärksubstansen och förenade reagens som en del av det signalalstrande systemet, som samverkar med de delar av det signaialstrande systemet som är förenade med den första analyten, under alstrande av en signal. Det bör dock märkas att denna till! lämpning visar på förekomsten av båda analyterna, men ej bestäm~_ mer den individuella koncentrationen av resp. analyter.

Då partikelns huvudsakliga effekt är att åstadkomma en miljš för det signalalstrande systemet som klart skiljer sig från bulke lösningen, måste inte bara effekten av en annorlunda miljö på I signaisystemet utan också på associationen av det specifika bind¥ ningsparet beaktas. Mestadels kommer graden av association ellerf bindningskonstanten ej att variera signifikant över relativt vida pH-områden och liknande. även om effekten av partikelns miljö på associationen av det specifika bindningsparet ej avsevärt på-p 10 15 20 25 30 35 7910042-6 verkar resultaten, bör denna effekt ej ignoreras.

De komponenter som användes vid analysen är partikelkonjuga-P tet, bindningspardelkonjugatet(n) och de reagens som utgör åter- stående delar av det signalalstrande systemet, liksom analyt, och- om så erfordras, poly(ligandanalog) och polyvalent receptor. vid Eramställnzng av reagensen användes partiklar eller kulor, och de¥ lar av det signalalstrande systemet. I V Ligandanalyterna enligt uppfinningen är monoepitopa eller po* lyepitopa. De polyepitopa ligandanalyterna är normalt poly(amino~ syror) dvs polypeptider och proteiner, polysackarider, nukleinsy-i ror och kombinationer därav. Sådana kombinationer av aggregat om-' fattar bakterier, virus, kromosomer, gener, mitokondrier, kärnor,, cellmembran och liknande..

Mestadels har de polyepitopa ligandanalyter som användes en; ligt uppfinningen en molekylvikt av minst ca 5000, vanligen minst; ca 10 000. Poly(aminosyror} av intresse har i allmänhet en mole~ V kylvikt av från ca 5 000 tiil S 000 000, vanligen från ca 20 000 till 1 000 000; bland hormoner av intresse varierar molekylviktenv vanligen från ca 5 øoo til: so ooo.

Den stora mängden proteiner kan betraktas som en familj av proteiner med liknande strukturella drag, proteiner med speciell biologisk funktion, proteiner relaterade till specifika mikroor- ganismer, speciellt sjukdomsframkallande mikroorganismer, etc. r!! pnßfi 'h 4: :s ïïï ä si”. m Fi I det füljande anges klasser av proteins besläktade: á protaminer; histoner; albuminer; globuliner; skleroproteiner; fosfoproteiner; mukoproteiner: kromoproteiner; lipoproteiner; nukleoproteiner; icke klassade proteiner, t.ex. somatotropin, pro? laktin, insulin, pepsin.

Ett antal proteiner som förekommer i humanplasma är kliniskt värdefulla och omfattar: Prealbumin Aibumin al~1ipoprotein al-syra glykoprotein aí«antitrypsin nl~qlykoprotein Transkortin üktüreíía *I C) 15 20 25 35 791oo42-6 4.68-postalbumin Tryptofan-fattigt al~glykoprotein fl¿X~g1yk0prQtein Tyroxin-bindande globulin Inter-a-trypsin-inhibitor Gc~glcbulin (Gc 1-1) Ceruloølasmin Cholinesteras az-lipoproteiníeri Myoglobin Cwreaktlvt protein az-makraqlcbulín az-HS~glykoprotein än-az-glykoprotein a2-neuramino-glykoprütein Érytropoietin üwlipaprotein Transferrin Hemøpexin ïibrinogen ?lasminogen ëgflglykoprotein I n2-g1ykoprotein II ïmmunoglobulin G (IgG) eller yG~gï0bulin Mal. formel: yzxz eller yzkz Immunoglobulin A (Igå) eller yA-globulin 10 15 20 25 30 Moi. formel: (a2<2)n eller (u2A2)n Immunoglobulin M (IgM) eller VM-globulin Mol.formel (pznz 5 eller (u2A2)5 Immunoglobulin D (IgD) eller yD~globulin (wü) Mol. formel: (özmz) eller (özlz) Immunoglobulin E (IgE) eller VE-globulin (XE) Moi. formel: (ezxz) eller (szlz) Fria K och Y lätta kedjor Komplementfaktorer: C'l C'lq C'lr C'ls C'2 C'3 BIA u2D C'4 C*5 C'6 C'7 C'8 C'9 7910042~6 791004243 Viktiga blodkøagulerinqsfaktorer omfattar: Bíødkoaguleringsfaktorer Internationell beteckning Namn 5 I Fibrinogen II Prøtrombin Iïa Trcmbin ïïl Vävnadstromboplastín V och VI Proaccelerin, accelerator-globulin IG vil Prokönvertin VIII Ancihemøfilt globulin (AflG) _ IX Christmas-faktor, plasma-tromboplastln~~ kompønenf (PTC) X Stuart~Prøwer-faktor, autoprotrom- 15 bin III XI Piasma~tromboplastin-antecedent (PTA) XII Hagemann-faktor XIII Fibrin-stabiliserande fakto; 20 Viktiga proteinhormoner omfattar: Peptid~ och prøteinhørmcner Paratyroidhormoner 25 (paratromon) Tyrokalcitonin Insulin Glukagcn _ Relaxin 30 Erytropøietin Melanotropin (melanocyt-stimulerande hormon; intermedin) " Somatotropin (tillväxthormon) 35 Kortikøtrcpin (adrenokortikotropt hormon) Tyrotropin *fa hå (I) M.

U '» u.) LJ! Føllikel-stimulerande hormon Luteiniserande hormon (mellancell-stimulerande hormon) Luteomammotrøpt hormon (luteotropin, prolaktin) Gonadotropin (koriongonadotrcpín) YNÉí.YÅÉÉÉ.ÉÉ..f-å.ÄQÉFEQ.Q*=-'r bešretin GU *fin Rnqïøtensín T och II Bïadykinin Lafltoqen från humanplarenta 1,- v-mn-“Av ...Jm ...A nu.- -~r...-,~__ šäå _ lw~šhfl,¿xlxuxxun fLân |\_'~ 'Jhkía :Lynfln bx¿tücin Vaflopressin Rv-wafiihu~fak+orer (RFf LRF. Líii* , Tföf, sømatotzøpinwílí” ,. fiÛ?, FSH~RF§ PIF; MTF 7910042-6 Anfifa püíïmëïa mäiêïíal av intresse är mukupolysackaridær och pošïzackaríder.

Exfmpel pà antigæna pcigsackarldær härrörandæ från mikro" üïqañàsmøï awqëš ñêään: åra av mikraørüafiismer ššéënë-fušëênä if i ra ífwzrmrs-fšt i f Stfentoccäüuš pvoqenes D;pLocaucus pneumoniau Nøâsseria mefiinqítiäís Nfiisseriš gonørrhoeae f) ~x'^_*1r'*_' “vs < ß S* f Sflàwßñrhh . Q Føljsackarid Polysackaríd ?o1ysackar1d Csryfiabåståriüm âiphtï;:1ae Polysac arld šüâíñóbäéílius mälleí; Råextrakt Åfitinnhacíïïus whitew ri šzanciscíla tularensis l ipwgacfl _\,'s.fi<~ff;¿: x' id g..- _ (I) 15 20 25 30 35 Pasteurella pestis Polysackarid Pasteurella multocida Kapsel-antigen Brucella aboríus Råextrakt Haemophilus influenzae Polysackarid Haemøphilus pertussis Råextrakt Treponema reiteri Polysackarid Veillonella Lipopolysackarid Erysipelothrix Polysackarid Listeria monocytogenes Polysackarid Chxemobecterium Lipcpølysackafiâ Mycobacterium tuberculosis Salinextrakt av 90% fenolextrahefl, rad mykobakterie- øch polysackaw ridfraktion av aeller och tubere kulin Klebsiella aerogenes Pølysackarid Klebsiella cloacae Polysackarid Salmonella typhøsa Lipopolysackarid, polyšackarid åalmonella typhi~murium; Polysackarid Salmonella derby Salmonella pollorum ëhigella d senteriae Polysackarid Shigella f exneri Shigella sonnei Råextrakt, polysackarid Rickettsiae Râextrakt üandida albicans Polysackarid Entamoeba histolytica Råextrakt ne mikroorganismer sam analyseras kan vara hela, lyserade, malâa eller delade på annat sätt øch den erhållna kompositionen»- eller delen analyserad, t,ex. genom extraktion. Mikroorganismer ; av intresse omfattar: fiorynebacteriq Corynebacterium díptheriae Pneumøggggí -Uiplocøccus pneumoniae §treEtococci Streptococcus pyogenes Streptococcus salivarus 'V7 20 25 30 Staghxlococci ¿3_ Staphylococcis aureusw Staphyløcoccus albus Neisseriae Neisseria meningitídis Neisseria gonørrheae Enfierobacteriaciae Eeeherichia coli Ä Aerøbacter aerogenes r Klebsiella pneumoniae 4 1 Salmonella typhosa Salmonella choleraesius Saímonella typhimurium J Shigella dysenteriae W Shígella schmiçzii Shigella arabinotarda Shigella flexneri Shigella boydii shlqella sanne: J Andra enteritiska baciller Proteus vulgaris Proteus mirabilis Proteus morgani Pseuàømßnas aeruginøsa Alcaligenes faecalis Vibriø cholerae 7910042-6 Køliforma bakterier Salmonellae Shigellae PIOtêUS“âItÉr Hemcphilus-Bordetella~gruppen äemøphilus influenzae, ä.

H.

H.

H.

Bordetella pertussis Pasteurellae Fasteureïla pestís ëasteurella tulareusís ducreyi hemophilus aegypticus parainfluenzae 10 15 20 25 30 7910042-6 Brucellae Brucella melitensis Brucella abortus Brucella suis Aeroba sporbildande baciller Bacillus Bacillus anthracis subtilis Bacillus megaterium Bacillus Anaeroba Clcstriäium Clostridium Clostridium Clostridium Clostridium Clostridium Clostridium Cløstridium Clostridium CEIQUS botulinum tetani perfringens novyi septicum histolyticum tertíum bifermentans sporogenes Mycobacteria Mycobacterium Mycobacterium bovis Mycobacterium avium Mycobacterium leprae sporbildande baciller Mycobacterium paratuberculosis Actinomxcetes Actinomyces Actinomyces Astinomyces israelii bovis naeslundii Nwcardia asteroides äacätàía bfasiliensis n» . M fl. . M Qàí{Qaæicï .__ iieponsmä saiiiáum Treponema pertenue Lwprmspira icterohemf :Hag Caraffluw rêcurïfinfiïš a~ptv«pzra Canlßølâ Lac tuberculosis hominis (svampliknande bakterier) miwnfi Ébiriïïmw Streptobacillus moniliførmis ~%%mmm%mmmwm >;\..4 p» CI» 15 20 30 35 791eo42-6 Mxkoplasma Mycøplasma pneumoniae Andra Eatogener Listeria monoéytogenes Erysipelothrix rhusinpathiae Streptobacillus moniíiformis Donvania granulømatis Bartonella bacillifcrmis Rickettsiae (bakterieliknande parasiter) Rickettsia prowazekii Rickettsia møoserí Rickettsia rickettsii Rickettsia conori Rickettsia australis Rickettsia sibiricus f Rickettsia akari Rickettsia tsutsugamushi Rickettsia burnetii Rickettsia quintana , Chlamydia (icke klassificerbara bakteriella/virala parasitefëj Chlamydiaflarter (benáfiming osäker) Fungi Cryptococcus neøførmans Blastomyces dermatidïa äistaplasma ëapsulatum Cocciáioides imitis Paracoccidiotdes brasiliensis Candiâa albicans Aspergillus fumigatuß Mucor corymbifer (Absidia corymbifera) Rhizopus øryzae Rhizopus arrhizus Phycomycetes Rhizopus nigricans Spørotrichum schenkii Fonsæcaea pedrosoi Fonsecaea compacta Fcnsecaea dermatitiåis Cladosporim carrionii Phialøphora verrucosa 47910042-6 Aspergillus nidulans Madurella mycetomi Madurella grisea Allescheria bóydii 5 Phialøsphcra jeanselmei Microsporum gypseum Trichophyton mentagrmphytes Keratínomyces ajelloi vw Microsporum canis ¿í 10 Trichophyton rubrum M Micrcsperum anäøuini Virus ßdenovirus Hergesvirus Herpes simplex Varicella (vattkoppor) Herpes zøster (bältrøs) 20 virus B Qytomeqalovirus Koggvirus Variola (smittkoppor) Vaccinia 25 Føxvirus bevis Paravaccinia Mollußcum contagiosum Picornavirus Folioviurs 30 Coxsackievirus Echovirus Rhinovirus Myxovirus influensa (A, B och C) 35- ?arainfluensa (1-4) ?åssjakëvírus f tw_ wwwüastle~sjukevírus ...mm-ß-_-.-..,,.¿ ~ .w = « ;.« _ _ 15 20 25 30 35 7916042-6 Mässlingsvirus Boskapspestvirus Valpsjukevirus Respiratory Syncytial Virus Röda Hundvirus êšbovirus Eastern Equine encefalitvirus Western Equine encefalitvirus Sindbis virus Chikuqunya virus SemLiki Forest virus Mayora virus St. Louis encefalitvirus California encefalitvirus Colorado Tick Fever virus Gula febervirus Denguevirus âåaïiašëë Reovirus typ I-3 Hegatit Hepatit A virus Hepatit B virus Tumörvirgg Rausoher Leukemia virus Gross virus Maloney Leukemia virus De monoepitopa liganäanalyterna har i allmänhet en molekyl~ vikt från ca 100 till 209%, vanligen från 125 till 1000. Analy- ter av intresse omfattar íäkemedel, metaboliter, pesticider, för% oreníngar och liknande. Eíand läkemedel kan som exempel anges alkaloider. Exempel på alkaloíder är morfinalkaloider, som om- fattar morfin, kodein, heroin, dextrometorfan, derivat och meta«' boliter därav; kokainalkaíoider, som omfattar kokain och bensoy1“ ekgonin, derivat och metaboliter därav; mjöldryga~alkaloider, som omfattar dietylamid av lyserginsyra; steroidalkaloiåer; iminaw 15 20 25 30 35 791øo42-6 30 zoylalkaloider; kinazolinalkaloider, isokinolinalkaloider; ki- nolinalkaloider; som omfattar kinin och kinidin; diterpenalkaloiflp der, samt derivat och metaboliter därav.

Nästa grupp av läkemedel omfattar steroider, såsom östroge~ ner, gestroqener, androgener, andrenokortikalsteroider, gallsy- ror, kardiotoniska glykosider och aglykoner, som omfattar digoxim och digoxigenin, saponiner och sapogeniner, derivat och metabolif ter därav. Vidare omfattas steroidmimetiska substanser, såsom dietyl stilbestrol.

Nästa grupp av läkemedel är laktamer med fräs 5~6 ringled, som omfattar barbiturat, t.ex. s o a al difenylhydantonin, primidon, etosuximid och metaboliter därav.

Nästa grupp av läkemedel är aminoalkylbensener med alkyl med från 2-3 kolatomer, som omfattar amfetaminer, katekola~ miner, som omfattar efedrin, L~dopa, epinefrin, narcein, papa~ verin och metaboliter och derivat därav.

Nästa gruppenrläkemedelâhfbensheterocykliska föreningar som omfattar oxazepam, klorpromazin, tegretol, imipramin, derivat V och metaboliter därav, varvid heterocykliska ringar utgöres av azepiner, diazepiner och fenotiaziner.

Nästa grupp av läkemedel är puriner, som omfattar teofyl1in,. koffein, metaboliter och derivat därav.

Nästa grupp av läkemedel omfattar de som kan härledas frånn marijuana, som omfattarkannabinoloch tetrahydrokannabinol.

Nästa grupp av läkemedel omfattar vitaminer såsom A, B, E och K, folsyra, tiamin. av läkemedel är prostaglandiner, som skiljer och stället för hydroxylering och omättnad. t.ex. B12, C, D, Nästa grupp sig genom graden som omfattar peni- Nästa grupp av läkemedel är antibiotika, oilin, kloromycetin,«aktinomycetin, tetracyklin, terramycin, me- taboliter och derivat därav.

Nästa grupp av läkemedel är nukleosider och nukleotider, som' omfattar ATP, NAD, FMN, adenosin, guanosin, tymidin, och cytidin med resp. socker- och fosfatsubstituenter.

Nästa grupp av läkemedel är olika individuella läkemedel som omfattar metadon, meprobamat, serotonin, meperidin) amitrip- tylin, nortriptylin, lidokain, prokainamid, acetylprokainamid, 14..._......_... 10 IF' k!! zp 25 30 35 791oo42+s 3! propranolol, griseofulvin, valproinsyra, butyrofenoner, antihisff toaminer, antikolinergiska läkemedel, såsom atrompín, metaboliteš och derivat därav. _ Nästa grupp av föreningar är aminosyror och små peptider som omfattar polyjodotyroniner t.ex. tyroxin, och trijodotyronief oxitocin, ACTH, angiotensin, met- och len-enkefalin, metaboliterg och derivat därav. g Metaboliter relaterade till angivna sjukdomar omfattar spar» gallaktos, fenylpyrodruvsyra och porfy ' min, “in typ 1.

I r _ Nästa grupp av läkemedel är aminoglykosider, s*scm gentamie' cin, kanamicin, tobramycin och amikacin.

Bland pestioider av intresse kan nämnas polyhalogenerade bifenyler, fosfatestrar, tiofosfat, karbamat, polyhalogenerade sulfenamider, metaboliter och derivat därav. N För receptoranalyter varierar molekylvikten i allaänhet från 10 000 till 2 x 106, vanligen från 10 000 till 106. För immunoglobuliner, IgA, IgG, IgE och IgM varierar molekylvikten i allmänhet från ca l6G0 000 till ca 106. Énzymernas molekylviktl varierar normalt från ca l0 000 till 600 000. Molekylvikten för naturliga receptorer varierar kraftigt, men är i allmänhet minst; ca 25 000 och kan vara 106 fattar sådana material som avidln, tyroxin-bindande globulin, eller högre, och dessa receptorer om~Ü tyroxin~binöande prealbumin, transkortin etc.

Liganàanalogen skiljer sig från liganden antingen genom att ett väte eller en funktionalitet ersatts med en binäning eller k en blndníngsgrupp med funktionalitet att bilda en kovalent bínd~' ning med en annan molekyl med en aktiv funktionalitet, såsom bvdrozyl, amino, aryl, tio, olefín, etc., där den erhållna före- ningen skiljer sig från liganden genom mer än substitution av ett väte med den molekyl vartill denna är konjuqerad. Bindningsgrup- pen har normalt från l-20 atomer som ej utgöres av väte, som ut- göres av kol, syre, svavel, kväve eller halogen med ett atomnum- 0 mer av 17-35. De funktionaliteter som beröras omfattar karbonyl, både oxo_och non~oxo, aktivt halogen, diazo, merkapto» etylen, speciellt aktiverad etylen, amino och liknande. Antalet hetero- atomer varierar i allmänhet från ca 0*6, vanligen från ca l-6, lämpligen från ca l-4. En neskrivnlng av bindningegrupper finns Pul CD 15 20 25 30 35 7910042-6 i US PS 3 817 837.

Mesfifldëls är binÖflïfl9S9ruPPe¶na alifatiska, även om aromat¿e~,¿ ka grupper finns med 1 samband med diazo-grupper. I allmänhet är bindningsgruppen en divalent kedja med ca 1-10, vanligen från ca l-6 atomer i kedjan. Syre finns normalt närvarande som oxo eller oki, bundet till kol och väte, lämpligen enbart bundet till kol, under det att kväve normalt finns närvarande som amino, enbart _ bundet till kol, eller amido, under det att svavel förekommer a&n~Ö logt med syre. g Brukliga funktionell r vid ut ormningen av den kovalentß Q O ët U e f rnppen ch den molekyl som skall kofi~ eQ flf bindningen mellan b ndnin jugeras är alkylamin, amid, amidin, tioamid, karbamid, tiokarbaå mid, guanidin och diazo.

Bindningsgrupper som är speciellt användbara för konjugerinq till polypeptider är sådana som omfattar karboxylsyror som kan användas tillsammans med diimider, eller som blandade anhydridef med karbonatmonoestrar eller som aktiva karboxylsyraestrar, t,efi, N~hydroxisuccinimid eller p-nitrofenyl. Kväveanaloger kan anväåw das son imidoestrar. Aldehyder kan användas för att bilda iminef under betingelser för reduktiv aminering, t.ex. i närvaro av bof- hydrider, för framställning av alkylaminer. Andra non-oxo-karbot nylgrupper som kan användas omfattar isocyanat och isotiocyanatÄ Vidare kan aktiv halid användas, speciellt bromacetylgrupper. i I de flesta fall har liganden en eller flera funktionella grupper som kan användas som ställe för bindning av bindningsgragfå pen. Speciellt användbara är hydroxi, amino och aryl, speciellt] aktiverade arylgrupper. Oximer kan också framställas av oxo~funk« tionaliteter och hydroxylen användas som ställe för förening med en bindningsgrupp, såsom karboximetyl. i Valet av bindningsgrupp kan variera avsevärt, beroende på de funktionaliteter som finns närvarande i líganden, i den förening vartill liganden skall konjugeras, typen och längden av önskad bindningsgrupp och liknande.

Det signalalstrande systemet har minst en del, vanligen två delar, och ger en detekterbar signal i analysmediet. Nivån av den iakttagna signalen påverkas av fördelningen av det signalalst~¿ rande systemet mellan partikeln och bulklösningen, partikelns fas~ Å 791 0042*d 35 ta miljö och vätskemiljön i det vattennaltiga mediet. Paztikelnsr egenskaper måste därför påverka nivån av den signal som iakttas J jämfört med den signal som skulle iakttas från det signalsalstran~ de systemet i bulklösning i frånvaro av partiklarna. Det är vida* 5 re önskvärt att det signalalstrande systemet ger upphov till fles ra mätbara händelser som svar på bindningen mellan delarna i ettl enda specifikt bindningspar (förstärkning).

Signalalstrande system av primärt intresse är sådana som omr fattar katalysatorer, antingen enzymatiska eller icke-enzymatis« CD ka, speciellt enzymatiska, eller kromoforer som absorberar eller» emitterar ljus, speciellt fluorescerande substanser och kemilurië nescerande substanser, liksom kombinationer av dessa tvâ typer av system. Även om ovan angivna märksubstanser normalt användes kan också andra typer av märksubstanser användas, såsom stabila 15 fria radikaler, omfattande bildande eller sönderdelning därav, märksubstanser för potentiometrisk bestämning och liknande.

Den första typen av system som behandlas är de som omfattar» enzymer.

Såsom visats i tabell ï kan ett signalalstrande system om~ , 20 fatta ett enda enzym. Genom användning av ett enzym där effekten å' av partikelmiljön påverkar omsättningshastigheten, varvid omsättfi I ningshastigheten antingen ökas eller minskas, kommer den observee rade signalen att variera med fördelningen av enzymet mellan part tiklarna eller den fasta fasen och bulklösningen. Eftersom enzy~ 25 mer är känsliga för pH, hydrofeba ytcr, jenstyrka och liknande, speciellt pH, kan den enzymatiska omsättningen moduleras genom användning av lämpliga partiklar. vid val av enzym påverkar, förutom effekten av partikeln på y_ enzymets omsättningshastighet, även andra skäl valet av enzym. if “ 30 Dessa skäl omfattar enzymets stabilitet, önskvärdheten av en hög l:' omsättningshastighet, hastighetens känslighet för variationer i den fysikaliska miljön, typen av substrat och produkt, speciellt förmågan att mäta substratet eller produkten, företrädesvis pro- É dukten, enzymets tillgänglighet, effekten av konjugering av en- A É 35 zymet på enzymets egenskaper, effekten av enzymaktiviteten på \ material som kan finnas närvarande i provlösningar, enzymets mo- lekylvikt och liknande. 'i i 1 i i š usuelsafl. 791øa42~s Nedan anges olika kategorier av enzym i enlighet med den klassificering som gjorts av International Union of Biochemist- ry.

TABELL II * JJK l. Oxiodoreduktaser 1.1 Verkar på CH-OH-gruppen i donatorn 1.1.1 Med NAD eller NADP som acceptor 'A 1.1.2 Med en cytokrom som aoceptox ¿; 10 1.1.3 Med 02 som aoceptor l.l.99 Med andra aooeptorer 1.2 Verkar på aldehyd- eller ketogruppen i donatorn. 1.2.1 Med NAD eller NADP som acceptor 1.2.2 Med en cytokrom som aoceptor 15 1.2.3 Med 02 som acceptor w 1.2.4 Med lipoat som aoceptor l.2.99 Med andra acoeptorer 1.3 Verkar på CH-CH-gruppen i donatorn l.3.l Med NAD eller NAD? som acceptor 20 1.3.2 Med en cytokrom som acoeptor 1.3.3 Med 02 som acceptor l.3.99 Med andra acceptorer 1.4 Verkar på CH-NH2-gruppen i donatvrn l.4.l Med HAD eller NADP som acceptor 25 1.4.3 Med 02 som aoeeptor ' 1.5 Verkar på C-NH-gruppen i donatorn 1.5.1 Med NAD eller NADP som aoceptor 1.5.3 Med 02 som acoeptor 1.6 Verkar på reducerad NAD eller NAD? som donator 30 1.6.1 Med NAD eller NAD? som acceptor 1.6.2 Med en cytokrom som acceptor _ 1.6.4 Med en disulfidförening som accepror .É 1.6.5 Med en kinon eller besläktad förenlng vf som acceptor f 35 1.6.6 Med en kväveheltig grupp som acceptor f l.6.99 Med andra acceptorer lf 10 15 20 30 35 107 108 1.9 1.9.3 Med 02 som acceptor V 1.9.6 Med en kvävehaltig grupp som acceptor 1.10 Verkar pådifenoleroch besläktade substanser som donawl turer 1.10.3 Med Ö2 som acceptor 1 Verkar på HZOZ som acceptor . 2 Verkar på väte som donator - 1- Verkar på enkla âofiatorer under införlivande av syre (oxygenaser) àš 7916042-6 Verkar på afidra kvävehaltiga föreningar som donatorer 1.7.3 ' 1.7.99 Verkar på svavelgrupper i donatorn Med 02 som acceptor Med anfira acceptorer 1.8.1 Med NAD eller NADP som acceptor 1.8.3 Med 02 som acceptor 1.8.4 .Meå en disulfidförening som acceptor 1.8.5 Med en kinon eller besläktad förening som,acceptor 1.8.6 Meá en kvävehaltig qrupp som acceptor Verkar på hemgrupper i donatorn Verkar på sammanparade donatorer under införlivande av syre i en donator (hydroxylaser) 1.14.l' Användning av reducerad NAD eller NAD? som en donator í.l4.2 Användning av askorba: som en donator l.14.3 Användning av reducerad pteridin som en donator Traníeraser 2.1 Överför grupper med ett kol 2.1.1 Metyltransferaser 2.1.2 Hydroximetyl-, íormyl- och besläktade transferaser 2.1.3 Karboxyl- och karbamoyltransferaser 2.1.4 Amidinotransferaser 2.2 överför aldehyd- eller ketonrester 2.3 Acyltransferaser I 2.3.1 Acyltransferaser 2.3.2 Aminoacyltransferaser f-l CI 15 20 l\1 UT 30 35 3. 191oo42~s 2.4 2.5 2.6 2.7 2Ü8 36 Glykosyltransferaser 2I4Iï 2.4.2 Hexosyltransferaser Pentosyltransferaser Överför álkyl eller besläktade grupper Överför kvävehaltiga grupper 2.6.1 2.6.3 Aminotransferaser Qximinotransferaser Överför fosfiørhaltiga grupper 2.7.1 2.7.4 2.7.5 2.7.6 2.7.7 2.7.8 Fosfotransferaser med en alkohglgrupp som acceptor Fflšfütranåfêïâäëï meá en karbøxylgrupp sam acceptor Ffisfotransferaser med en kvävehaltig grupp som acceptor Fosfctransferaser med en fosfo-grupp sam acceptor Fosfotransferaser, kylära Polyfosføtransferaser Nukleotidyltransferaser Transferaser för andra substituerade fosfo- grupper överför svavelhaltiga grupper 2.8.1 2.3.2 2.8.3 Hydrolaser 3.1 Verkar på 3.2 3.1.1 3.1.2 3.1.3 3.1.4 3.1.5 3.1.6 Verkar på 3.2.1 3.2.2 3.2.3 Svaveltransferaser Sulfctransferaser CoA~transferaser estërbindningar Karboxylsyraester-hydrolaser Tiolester-hydrolaser Fosforsyramonoester~hydrolaser Fosforsyradiester-hydrølaser Trifosforsyramonoester-hydrølaser Svavelsyraester-hydrolaser glykosylföreningar Glykosidhydrclaser Hydrolyserar N~glykosy1föreningar Hydrølysexar S~glykosy1föreningar synbarligen intramole- " 10 15 20 30 35 3? 7910G42~6 3.3 Verkar på eterbindningar 3.3.1 Tioeterhydrolaser 3.4 Verkar på peptidbindningar (peptidhydrolaser) Z 3.4.1 a-Aminoacylpeptidhydrolaser É 3.4.2 Peptidyl-aminosyrahydrolaser 42 3.4.3 Dipeptidhydrølaser 3.4.4 Peptidy1-peptidhydrolaser 3.5 Verkar på andra C-N bindningar än peptid-bindningar 3.5.1 I linjära amider 3.5.2 I cykliska amider 3.5.3 I linjära amidiner 3.5.4 I cykliska amidiner 3.5.5 I cyanider 3.5.99 I andra föreningar 3.5 Verkar på syraanhydridbindningar 3.6.1 I fosførylhaltiga anhydrider 3.7 Verkar på C-C-bindningar 3.7.1 I ketoniska substanser 3.8 Verkar på halidbindningar 3.8.1 I C-halidföreningar 3.8.2 I P-halidföreningar 3.9 Verkar på P-N-bindningar Lyaser 4.1 Kol-kollyaser 4.1.1 Karboxilyaser 4.1.2 Aldehydlyaser 4.1.3 Ketosyralyaser 4.2 Kol-syrelyaser 4.2.1 Hydrolyaser 4.2.99 Andra kol~syrelyaser 4.3 Kol-kvävelyaser 4.3.1 Ammoniak-lyaser 4.3.2 Amidinlyaser 4.4 Kcl~svavel1yaser 4.3 Kol-halidlyaser ä: .äê ñnñïa ïyaënv än LW IG 20 25 30 35 Isomeraser 5.1 Racemaser och epimeraser 5.1.1 Verkar på aminosyror och derivat 5.1.2 Verkar på hydroxisyror och derivat 5.1.3 Verkar på kolhydrater och derivat 5.l.99 Verkan på andra föreningar .2 Cis-transisvmeraser .3 Intramolekylära oxidoreduktaser 3.3.1 Ger inre omvandling av aldoser och ketoser 5.3.2 Ger inre omvandling av keto- och enolgruppeä 5.3.3 Transponerar C=C-bindningar 5.4 Intramolekylära transferaser 5.4.1 överför acylgrupper 5.4.2 överför fosforylgrupper 5.4.99 överför andra grupper 5.5 Intramolekylära lyaser 5.99 Andra isomeraser 7910942-6 38 Ligaser eller syntetaser 6.1 6.2 Bildar C-0 bindningar 6.1.1 Aminosyra-RNA-ligaser Bildar C-S bindningar ' 6.2.1 Syra~tiolligaser Bilda: C-N indningar 6.3.1 Syra-ammoniakligaser (amidsyntetaser) 6.3.2 Syra~am1nosyraligaser (peptidsyntetaser) 6.3.3 Cykloligaser N 6.3.4 AAndra C-N ligaser 6.3.5 C-N ligaser med glutamin som N-donator Av speciellt intresse är enzymer i klass l Bildar C-C bindningar oxidoredukta- ser och klass 3 hydrolaser. även om enzymer i klass 2. transfe- raser, klass 4 lyaser och klass 5 isomeraser också kan vara av intresse i speciella situationer.

I följande tabell anges specifika subklasser av enzymer och 3” 191oo42~6 fg§1A specifika enzymer inom subklassen som är av speciellt lhtresse.§A¿ L Bland oxidoreduktaser är speciellt de som rör NAD eller NADP, syre eller väteperoxld av intresse. Bland hydrolaser är sådana som rör fosfat och glykosider av speciellt intresse. 5 TABELL III l. Oxidoreduktaser _ 10 1.1 Verkar på CM-OK gruppen i åünatorn Ü A 1.1.1 Med NAD eller NAD? sem accepter “J 1. alkoholdehydrogenas J 6. glyceroldehydrøgenas 2?. laktatdehydrogenas 15 37. malatdehydrogenas 49. glukos~6~fosfatdehydrogenas W" 1.1.3 Med 02 som acceptor 4. glukosoxidas gelektasexidas 20 1.2 Verkar på aldehyd- eller ketogruppen i donatorn 1.2.1 Med NAD eller NADP sem acceptor 12. glyceraldehyd-Bwfosfatdehydrogenas 1.2.3 Med 02 som acceptor 2. xentinoxídas 25 luciferes 1.4 Verkar på CH-NH2-gruppen i dønatorn 1.4.3 Med 02 som acceptør 2. L-aminøsyra~cxidas 3. D-aminosyra-oxidas 30 1.6 Verkar på reducerad NAD eller NADP som donator l.6.99 Med andra acceptorer diaforas Å- 1.7 Verkar på andra kvävehaltiga föreningar SOM å0nat0r 1.7.3 Med 02 sem acceptor 35 3. urikas 1.11 Vefkar på H20? som acceptor }l}1.¶ 7910042-6 6. katalas 7. peroxidas 2. Transferaser 5 2.7 Övepför føsforhaltiga grupper 2.7.1 Fosfortransferaser med CH-OH som acceptor 1. hexokinas 2. glukokinas 15. ribokinas 19 28. triøkinas 40. pyruvatkinas 2.7.5 1. fosføglukomutas 3. Hydrolaser 15 3.1 Verkar på esterbindningar 3.1.1 Karboxyïsyraester-hydrolaser 3.1.2 7. chølinesteras 8. pseudo-cholinesteras 3.1.3 Fasførsïra-möñøester~hydrolaser 20 1. . alkalisk fosfatas 2. sur fosfatas 9. glukos-6-fosfatas 11. fruktosdifosfatas 3.1.4 Fcsførsyra=diester-hydrolaser 25 1. fosfod1@sL-ras 3. fosfolipas C 3.2 Verkar på glykosylföreningar 3.2.1 Glykosidhydrolaser 1. a-amylas 30 2. 8~amy1as 4. cellulas 17. muramidas 18. neuraminidas 21. 8-glukøsidas 35 23. 6-galaktosidas 31. ßßglukurcnidas 35. hyalurøniáas 1910042-s i3.2.2 Hydrolyserar N-glykosylföreningar 5. nvnas “ 4. Lyaser 5 4.1 Kol-kollyaser 4.1.2 Aldehydlyaser 13. aldolas 4.2.l_ Hydrolyaser 1. kolsyra~annydras ,. 16 5. lsømeraser 5.4 Intramolekylära transferaser 5.4.2 överför fosforylgrupper triosfosfat~isomeras 15 Ovan angivna enzymer kan användas separat eller i kombina-- tien eller tillsammans med andra enzymer, då de andra enzymen 20 utgör delar av det signalalstrande systemet och kan användas soe konjngat eller kan vara okonjugerade om de samverkar med en pro# dukt av det konjugerade enzymet eller ger en produkt som samver¿ kar med en produkt av det konjugerade enzymet eller samverkar med en signalmärksubstans som utgör ett substrat.

Av speciellt intresse vid föreliggande uppfinning är använd» ih) Lu ningen av kopplade katalysatører, vanligen två eller flera enzy4 mer, varvid prcdukten av ett enzym fungerar som substrat för det andra enzymet eller de två enzymen var för sig producerar en U produkt sam samverkar i det signalalstrande systemet. Då det föle«: 3G ta enzymet är bundet till en partikel øch signalmärksubstanskona * jugatet har ett andra enzym, ger pariikeln en miljö sem ökar den lokaliserade koncentratienen av produkten av det första enzymer É _ _ i miljön för det andra enzymet, jämföra ned bulklösningen. Omsa:æ~ 5 §f“l ningen av det andra enzymet av det företa enzymeus produkt kommer §¿ 35 därför att bli större vid den fasta ytan av partikeln än i bulk~: V" läsningen. Detta kømer att medföra en ökning av den øbserverade *en 10 15 20 h! UI 30 7910042-§ Q signalen då signalmärksubstanskonjugatet är bundet genom inver- kan av ett specifikt bindningspar till ytan av partlkeln.

Olika knmbinationer av enzymer kan användas. Vid en uppsättÄ ning kombinationer användes förmågan att mäta NAD och NAD? ellerr reducerade produkter därav. I dessa kømbinatloner användes oxide~Ü reduktaser beroende på NAD med ett enzym som ger ett substrat för oxidoreduktaserna; En stor mängd enzymtyper och reaktioner kan användas för framställning av substratet, varvid många av enzymerna deltar i kplhydratmetabolismen. Ett avsevärt antal av dessa enzymer är invecklade i bildandet och transformationen av"~; fosfatestrar. Bland andra inbegripna reaktioner kan nämnas spjälk» ning av kol~kol-bindningar med hjälp av lyaser, isomerisering omfattanëe keto~aldehydomvandlingar, oeh eekarboxylering.

Av speciellt intresse är kombinationer som omfattar socker,_ varvid i ett första steg en transferas, hyärolas, lyas eller isø~A menas, speciellt omfattande en fosfatestex, ger ett substrat av en NAD(P) beroende oxidoreduktas. Speciellt användbara är mano- fosfat-monosackarider med från 3-6 koletomer eom enzymsubstrat vid oxídoreduktasreaktienen.

I följande tabell anges ett antal exempel där föregângsföre~ ningar för oxldoreduktaser bildas och fërleppet av reaktionen av de NAD~beroende enzymen följas genom omvandling av NAQ eller fiADP till eller från dess reducerade form. I varje exempel är båda enzymen eignalmärksubstaneer.

/D - nå J nv nv il år 0! lf... »mä + Hwfinñowfn »m«møwHo»fln~om-Q mocmuæncxaflmaona flmunfinuom no Ål.. mmndz + z + umwmowfiæuwuafiw Jil! momz + amwmowcouwumfixouøænfifl umwmownouæumflxouøwzfifl ;l¥I| msmafimnmwflmuwuæflm mmnæz + ufluøwmxnflmfmßw :nur mn @|@|u Asia »mwmø~fi@~>møx=Hm|@.H omz + umpxmfi .nïu mgæz + »«>:~>@ maa + um>fiu>m :JTI and + »m>:u>mHo:wowmow Qæz + umumou~>umu>Hw ill.mmmz + umwmoucouwumflxoucæafiø umumowcoumumwxouwænwu Alf! umwmowfiw|:ø»mumflxonwænHv mmdz + umuwu>~møwmcw|m.l¶| omz + mam»mmzmwHmuwu»~m vmuflænmwflmuwuhflm + mvcoawumflxouwmswfl nl!! mwv|w-|m0uxfluu xmnmz + umcounxzfimxmaw .Ali moflz + umwmowvmamoxmflm mmm + umwmowßwfmoxsww 1011 man + moxøflw cofluxmmu wwnmmæflwm >H Qdmmáà 5 4 0 5 G l l 2 mfinmvouwænww sfiouflxwccøøæ wmumwmcw xmwfimxflm mmcmmounænww emsmsflouwuafimna wmumëomflsgmwmowmøfiuu mønwmouwænwfi uumwmøwsmømoxsfim mmumwmom xmflflmxfim wmcwmounænwmumuxmfi mmn«xum>:uæß mmcmwouflæzwfl fmomefiouwuæflm WMUNMWOW MWMHNMHQ mmfimmouuænwfl nmnvæsæøflæumuæflm mmflowflm mmcmmounænwø numwmogomumoxsfim mmaflxoxwn Eæucm ,__ Jwu. ('\l Q 'Y . nt! e~å 4 fw! a v-b -4-«-3<'”'x I !"*-4~1' « “lr-ä +»:¶1=.,+a<:4 å :_ Ar fihüïflwflx . vi? “fw é mmdz + uæumnäåmoxoaa 4' mæz + umuufluomfi mmcwmøuømnmflumuufluomfl AÄÄ umuu«oom« .llll umuwsoxmnmflu mmuficoxm Hïøïw .Ü fb mama + umumumfimxo Ål... næä + »mámfi mmcwmouflanmmumfimë HÅÄ W. _ umfimë ...ll- umumñnw mmumssw ÜNJ .oH 4 »Ez + .Écßw Ål mnäz + våflåmuwum “fiëwwouwwflhwwfionøxfim H44 w flmsmnfiæuøum Ål; umšfiæm mmflæxonumxwflunumšflumm .THJ .m ...I mæmwmoufimnmw W mama + umcoumxmlfimanwwaw lll. mmz + umwmömowswoxsflm .bmwmowewnmoxøflm MÅÅ unwmowswamoxsfim .Älv umwwomifirwoxsfimnu mmusëoxnfimoumow Näim .w Tmuuoww 5 .Ü 5 nu 5 Ü 5 .l l 2 2 3 3 w _ _ i u: __ _ _ : _ i W. _ f 10 15 20 h.) Lif! 'ao 191oo42~s En annan kombination av enzymer ømfattar bildande av väteperioxid, varvid den peroxidaskatalyserade reaktionen av vätepericxiden med ett kemiluminescerande material, t.ex. lu- minol, ger ljus. Förutøm luminol kan andra 2,3-diväte-1,4-fta- lazindioner användas. Dessa omfattar 5~amino-6,7,8-trimetoxi~ och dimetylamino[cà bensanalogen. Andra föreningar är 2,4,5- trifenylimidazoler, med lofin, som gemensamt namn för utgângs~ föreningen, och para-dimetylamino- cch - metoxisubstituerade! föreningar är också användbara. De kemiluminescarande förening en kan utgöra_den direkta ljuskällan eller kan samverka med en acceptør, såsom 9,iü~dibromantracen, som sedan emitterar ljus.

Alternativt kan ett stort antal föregångsföreningar till färg” ämnen användas som undergår enzymatiskt katalyserade reaktio- ner med väteperoxid under bildande av den färgade formen som kan påvisas.

I följande tabaíl anges ett antal av dessa reaktioner där båda enzymen utgör signalmärksubstanser. innïfišš sæš cøcwvflxowmæfi lll! .møwfiwwüuwm + NONm mmwwxønunafiouxøumu AÅMIW. momm + mnæmfifiuø lll. mo + cflsmx mmwflxocflucmx mäå f”. fiuwflzuvmm Åfll vufzuvmm + Nowm mmfimumx ÜÜÅ N w m. wmwfifio O m + umvduäfi ...ll .0 + :ficmfimum :mnæwocwëmåw måïfi Å m mëëwmuwu lll! näämfiäflwrø + mo? mmfiåxøwwm fifiá Nomm + cfiouçmfiflm ulf! mo + »man wmxwus mät" "N a: + umfiwmmmmm lol... Mmwñå» + wøwm mmnflxouwm ÜÉÅ _ NONÉ + »mcounxnam .Älv wo + møxsüw mmmwxomoxsflm måå f~ 6 _ coflxmwu mwcmmwflwm mwucm fiuommumx 2 :Eæucm å. nu nU 4' i!! 9 b qqmmäw 7.. 5 nu cd Û 5 Ü 5 1.. 1... 2 2 3 3 n, a. m i 10 15 20 25 30 35 Q? 191oo42-6 Nästa serie av reaktioner är sådana som är baserade på tvâ reaktioner omfattande vatten, normalt de två reaktioner som omfattar hydrolaser, även om syntetaser också kan använ~ das. i 1 H3 7910042°6 mcëmmumw till Nømm + ~ocæwomcflfioäæmouo~äm|@.~ flocmuoucflfiocmwouøfixflvnw.~ .lila maflocmäoncfifiocwwouofixflflzw.m »m~mouo~>m + n mmz + mom Lon! ofim + wflæmnumx cfiflwcmouuwcnm + cfluawfina .lill wfifiwcmouuficumacfluswflun mwfificmouuflcnmøcfluøwflaa nlïll uaHficmouuflsomncfluøæflnqsflæfioumaa cflwfiøuuflocou + flflcousxsdwnm lll wwcøusxsfimom:cfiæfimuwfiøcmu flficousxsamamscflmfimuwfiocwu llfll umumwnfluoflzs cflflonuowflcøuøxsflmum:nfimfimuwaocww woxsfim + mwxøawwouuflcom LåluuflmøxsfiwaaamnAflwsmuouuflcnmvafi @«mox=Hw»n»m».H>=w«@~»fi=»@.|« .lill moxsfimanamøfiæmoamuæmoxsflmzasanouqoAfiæsmuøuuflcumvnfi moxzqm + cwuæufium .lll mflwoxsflmumßfiflcflummflflmsfi wflwoxnfimum nfiæcflumuwfimnfi till umamumocøënnflmoxnflmnmnfiæcflumuflfimafi coumwfififlwnëfl LJII vflmouxmflmmumøflæumwflfiflmnssafi w~wo»xmHmw|m -H>»@w-Hm@en«H ;;||_@|@|v~mø»xmH@w|@-~»u@~flHHwnes:H møwwxmæw wfinmmæwmm Hb Aflmmdß 0 2 10 15 wmwflxoumm mmumwmow xwflflmxflm mmuwua>mm@z mmwuu wmwflummmocflëm wmnflumwmocwëflncfifioum mmmflcouøxnflmam mmuwummcfiflonu mmuflmøxawmam wmfiæëmoxsflm mfiwflwoxsflmnm mmuwumwflæumum mmnflwouxmfimmam mmumwmcm xmwfløxfim ëwficm 25 30 m.~.m m.m.w M.m.m H.v.m ~.e.m ~.~.m H.H.m ~.~.m ~.~.m fi.N.m ~.H.m ~.N.m m.fi.M HMOWÜNMX lëæncm 35 lll) l elHf 791øo42~s Nästa serie av kømbinationer omfattar framställning av ett feel substrat 1 ett första steg för ett enzym som kan donera eller ¿f“ uppta elektroner från en acceptor eller donatcr, vilket medför få en avsevärd förändring i absorbtionsspektret för acceptorn eller fifvi 5 donatørn. Medstadels är ået andra enzymet en oxidoreduktas, spe- Äf _ ciellt dehydrogenaser och oxidaser. I denna serie är båda en- Vl . zymer signalmärksubstanser. w » 10 15 êfÛ in 20 25 30 35 .. 1 __., ._v_..w\éæf_s.fifnäyffuxâf_ Aflmuwunwwuw flocmuoflcwflocmwoncäxfiufi + maæz mmcmmoummnww 1llll Honmwovcfiflocüwøuofixwuu + mmcmz umøaz umumofløwu mm.A.~ mmnæz + wmsmmfimuwum .llll mama + Hccmuw mm:wwouwmsmv|MonoxHm ~.~.~ .@ ^mv mcëmmuww + muæwxfiuuw .l!I|. Hocwuowcflifiocmuouofixflmcw.N + vænwøfimvmoæ mmvwxowænwflflm m.~.~ wænwnflmuwom + mnmawæsmwfimumuæflmlu :lll umumouumnmonfiuunxwxowwsw mmfiowfimønfluwxøwfl ~.H.w .W 1 mmuxsvmu fimv umcøwfinmmuwmuomwwmw + Qwz All! vmmowflnmæuuwwømwmcfi + amma nun Eouxouæu ~.w.fi æaæz + uwnmwfimumum nlll Qmz + Hocmuw mmcwmoucænmwuflonoxflm w.H.H .W . wmcwwouwæswfl ^mv wcëmmuww + umcøxsfimanzøumxsw Llfl cfiuflnmmmu + uflcoxnfimnn numcflunflm mm.H.~ mmcmwouwæsww nu mmocz + ccuxmfiuwsocøxmflmon _lli.momz + moxnflmcmam zmoxsflm ~.«.H .M KO Gav ÜCEWWHNN + Umwmnvw mMCQWO-.fifläßmmu ocoumumqxouwwnww 111: uumfincwfiæuwa + msmzfloumoæflmug aumwmowfioumuæflw mm.«.H m:m|äouwu>Hw|q .AT| Houmuafim + maa mmcflxfioumoæflm ~.ß,~ za Mñmv waewwumw + t uænwufimucflmuwn lïl umwflsmouwencflflmcww + cflflonu mmcwmoumæsæncflflonu mm.~,H L¿ cfifiono All! _w«uo~x:«Hønu~>usu:n mmuwuwwnfiflonu H.H.m ,fi AW nu nu cofluxmmn mwnmmmfiwm - ucm wuomwuæx nl :Ewwgm 01 UI wH> uqmmæa 5 Ü 5 Ü % 5 l l 2 2 30 35 10 15 20 25 30 I »J h!! 791oa42~s sr/ vid föreliggande uppfinning använöes därför kombinationer där en första enzymatisk reaktlcn ger ett substrat för en andra enzymatisk reaktion. Üen andra enzymatiska reaktionen ger en förening som kan bestämmas spektrofotometriskt genom absorption av ljus, speciellt över 300 nm, lämpligen över 350 nm, företrä- desvie över 400 nm, genom fluorescens, då det emitterade ljuset har en våglängd större än 350 nm, lämpligen större än 400 nm, företrädesvis större än 450 nm eller genom kemiluminescens. Ex- tinktiønskoefficienten bör vara större än 103 mGl"lem“l, lämpli~ gen större än 104 för absorption över angivna våglängder= ¿ Som ett alternativ till att ha ett första enzym vars produkt: utgör eubetratet för ett andra enzym, kan ett enzym användas som 7 ger en produkt som samverkar med en andra förening. Den andrav föreningen kan finnas 1 mediet från början sem en märksubstans. kan bildas genom en enzymatiek reaktion, eller kan reagera gencm inverkan av en icke~enzymatisk katalysator. De två fenomen som _ berörs är normalt antingen (1) energiöverföring från en excic@yn¿@ molekyl till en annan melekyl som àärigenem blir exçiteraä, var» vid den andra molekylen emitterar ljus, eller (2) framställning av en förening som kan reagera genom samverkan med en icke-enzy~ matisk katalysator för framställning av en förening som normalt N abeornerar ljus vid relativt långa vàglänqåer. Följande tabell visar ett antal av dessa kombinatiuner áà aignalmärksubstanserna är enzymet een äen understrukna föreningen.

X Ilšïíš a :mumëuownfiæcwwfiuu...uuuwcowow + nå: lll! .Hzw + mmæz ^cflcm>oo~,,n _ _ mmcmwømfiæcmfl mQ *mv mcämmufiu + G42 .llll cmm0Hofl>H>»mE + mmmz fiumwflsmoumëcdflmcuww müæz + um>:uæm nlfll Qdz + umuxmfi mmcæmøuflænmøwmumwfl ~@H.~ .w nmumëuowufiæcmwfluunouuficøfiow 1z§:I; + 9% Ål! råd šåïšmfiwufiwømwfluuaøwpflcøwofi + mmæz Mvuwflntmvffiáuqzfiåv mmcwwøwñæßmfi mQ~v M.~.H .m øn + umumouuocoëicfimuwwuöflflu nlïllrwmwmounocoëacfimommuonflm :wwwmøusøcoålïmumwuøflfiw + umflmuwocfiñm All.umwfiowaøcøëvcfimummuøsflu + numfimuuocwäm 04 f tumfimuwonflsm nl|| Newm + Hocflæflfi mmmwmmwmm M ~M.fl rg umwwowuocoëzcfimümwuøsfiw Alla umwmowwnacwwummuonfiw mmumwmow xmflflflmfim m.M.fi ,m >n + fiwmumwuonwwmflmuflmouxmfimmumvæoasë lill fcwmumwuonæuñflæflfimouxmfimmomvuccoë ~m«mummuon~w nâfimflfimouxmfimwnmvuocoë + couwwfififimnšs lll. cflwummuonfiwAfiævfimouxmfimmomvnøcoë +.Eouww«HHwnEfi »XGÛHÜWHHHNDEÜ mi' 92 + COHÜNHHMÜQED cwwummuoøflw \ ...Hwflwmøu mflmmvfaocofi .All :flwomwuosfiwÚmämovxmflmmumvflw mmfifimon.._f.åw Naim” M. cofluxmwp mmmmmwflwm mmflflflflflww J;fflå@flA 7910042-6 Hwnb Jßmmëfi nu V). 5 Ü a... Û al. Ä v., u..

...L 25 7910042~6 >S + CwwUwwH0Ufiw [Ill äcflwümwuøflfiw umfimuwocfiäm + ...cfiwumwuosfiw .lvl :flmumwnoflflu + rumflmuwocfiñm .mßfiwofiam .ål Now* + .Bfiåfl mmfixnzwßouvzña fiSJ .w ^.muu0uv 15 20 25 E). 3 30 ~_ w w 10 15 20 25 30 35 791oo42-6 W Även om ovanstående belysande kombinationer begränsats till * två komponenter som märksubstanser är det uppenßart att också tre eller flera komponenter kan användas. Det finns fördelar och Û nackdelar med att öka antalet märksubstanser i dtt signalalst- L rande systemet. Om man har tre märksubstanser, t.ex. tre enzymer,: kan det andra och det tredje enzymet, om produkten av ett utgör f substratet för nästa, utgöra del av partikelkonjugatet och det första enzymet som märksubstans vara bunden till den specifika binda: ningspardelen. Härigenom kommer från början en mindre signal att produceras som ett resultat av det första enzymet i bulklösning~ en. Det bör dock märkas att koncentrationerna på ytorna av par- tiklarna av produkterna från enzymerna i successiva reaktions- serier kommer att bli allt mindre ju större antal reaktioner som måste inträffa. Ju långsammare den totala reaktionen blir och ju större antalet reaktioner som måste inträffa blir desto längre tidsperiod kommer således att krävas för erhållande av en mätbar signal. Man måste därför i viss grad kompromissa mellan: att minimera bakgrundvärdet och att minimera tiden fram till en mätbar signal.

I det signalalstrande systemet kan antingen ett eller ett flertal enzym användas och partikelns egenskaper kan användas på ett flertal olika sätt för att påverka enzymreaktionerna. med ett enda enzym kan partikeln ge en miljö som har en sigfi nifikant effekt på enzymats omsättninqshastighet, beroende på typen av partikel. Detta kan utgöra ett resultat av ett annat pH~värde, jonstyrka, hydrofob miljö etc. intill partikeln jäm* fört med bulklösningen. Man kan därför tillsätta salter, buffer- tar; joniska polymerer, hjälpläsninqsmedel eller liknande och genom lämpligt val av partikel skapa en avsevärd gradient i egen~¿ skaperna mellan bulklösningen och partikelmiljön.

Alternativt kan man använda partiklarna för att åstadkomma en annan diffusionshastighet. Det signalalstrande systemet kom- mer då att utnyttja ett enzymmärkt bindningspardelkonjugat och ett makromolekylärt enzymsubstrat eller inhibitor t.ex. antien~ zym, pseudosubstrat, eller irreversibel inhibitor. Speciellt an~ vändbara enzyminhibitorer är irreversibla inhibitorer riktade mot det aktiva stället. Exempel på sådana inhihitórer är fluoro~m: v11 10 15 20 25 30 35 791àa42-s fosfonat som reagerar med cholinesteras och aryl-kvicksil- versalter som reagerar med sulfhydrylgrupper i hydrolaser. Al- ternativt kan icke~knnkurrerande inhibitorer användas såsom sul~¿ fonamider för kolsyraanhydras. En lämplig inhibitor bör vara ko~“ valent konjugerad till en stor makromolekyl i en ställning som ej påverkar deninhiberandeeffekten av inhibítorn. Det enzym- märkta bindningspardelkonjugatet som blir bundet till partikeln kommer ej att reagera med den makromolekylära föreningen i någon¶ särskild utsträckning, vilket däremot är fallet med enzymet i bulklösningenl Effekten av att associera enzymet med partikeln bör ge en åtminstone 2-faldig, lämpligen 10-faldig och företrädesvis l00~faldig hastighetsdifferens jämfört med om enzymet fanns 1 bulklösningen. t Ovanstående teknik kan också utnyttjas då mer än ett enzym finns närvarande i partikelmiljön. Då t.ex. två sekvensiella enzymer utnyttjas kan en enzymreceptor t.ex. antíenzym, användass som då den är bunden till enzymet avsevärt minskar hastigheten av enzymomsättningen. Enzym i bulklösnlngen komer att inhiberas under det att enzym i partikelmiljön kommer att skyddas. Effekten blir att bakgrundssignalen väsentligen elimineras.

Dessutom kan reagens sättas till analysmediet som är sterisåf E uteslntna från nartikelkonjugatet och fungerar som scanvengers och minskar den signal som alstras i bulkíäsnlnqen. Dessa kan on? fatta reagens som tar hand om produkten från det första enzymet 1 i bulklösningen, som antingen har bildats av det första enzymet i bulklösningen eller avgivits från den partikel vartill det fören ta enzymet bundits. fiessa reagens omfattar ens"mer som skiljer sig från det första och det andra enzymet, receptorer får produkf ten av det första enzymet eller kemiska reaktionskompgnenter som reagerar med en sådan produkt.

En stor mängd icke-enzymatiska katalysatorer finns beskrivna Den ícke~enzymatiska katalysatorn använder som reaktionskomponens ter en första förening som reagerar genom överföring av en elek~' tron och en andra förening som reagerar genom överföring av två elektroner, varvid de två reaktionskomponenterna endast kan rea~f gera med varandra långsamt om ens alls, i frånvaro av katalysatefnt 10 15 20 k.) L!! 30 35 7910042-6 5G Förutom enzymer som märksubstanser kan även kromogena mate~, rial utnyttjas som märksubstanser, speciellt föreningar som fluef orescerar eller kemiluminescerar. Genom bindning av den kromogene märksubstansen till en del av det specifika bindningsparet, och genom att denähomologa delen är bunden till den fasta fasen kom~f mer när de två delarna associeras, den kromogena märksubstansen att införas i det fasta fasen. Då miljön i den fasta fasen påverg kar fluorescensen, kan den observerade signalen ställas i rela- tion till fördelningen av den fluorescerande substansen mellan fast och flytande fas. Alternativt blir genom tillsatsxsom makroï molekylär reaktionskomponent av en receptor för den kromogena delen (antikromogen), som eventuellt kan vara konjugerad till en utsläokare, eller en makromolekylär reaktionskomponent som rea- gerar med den kromogena delen, diffusionshastigheten av den tilšw satta reaktionskomponenten in i partikeln avsevärt lägre än dii~V fusionshastigheten i bulklösningen. Åskådliggörande exempel på reaktionskomponenter är sådana kemikalier såsom persyror, t.ex. perkarboxylsyror, opaka absorhtionsmedel t.ex. träkol, ooh lik- nande. Då reaktionen mellan de makromolekylära reaktionskomponent terna och kromogenen medför en utsläckning av kromogenen, kommer: ju mer kromogen som finns i den fasta fasen den hastighet med vilken den observerade signalen minskar att bli desto långsamma~: re. En teknik liknande denna, som utnyttjar antikroppar för att inhibera bindingen av antikromogenen till kromogenen finns be= skriven i US PS 3 998 943.

Förutom fluorescerande molekyler kan också kemiluminesceran+ de molekyler användas, som överför energi till en acoeptor, som därefter fluorescerar. kan begränsas till den fasta fasen genom bindning av ett enzym som ett signalmärksubstanskonjugat till partikeln, vilket enzym ger den kemiluminescerande reaktionen, och med en acceptor som en märksubstans bunden till den specifika bindningspardelen. kan. 'den ökade, lokaliserade koncentrationen av den kemiluminescerandef substansen på den fasta fasen som åstadkommas genom association av signalmärksubstanskonjugatet och partikeln följas.

Fluorescerande substanser av intresse kan uppdelas i ett flertal kategorier med vissa primära funktíonaliteter. Dessa pri~o i : 3 1 ä .i 'å š i š š s 2 a* W 10 15 20 k) Ul 30 35 å” '7910042-6 mära funktionaliteter omfattar 1- och 2-amlnonaftalen, p, p'- diaminostilbener, pyrener, kvaternära fenantridinsalter, 9- aminoakridiner, p, p'-diaminoben ofenoniminer, antracener, oxakarbocyanin,nærocyanin,3-aminoekvilenin, perylen, bis-ben - 1,2-bensofenazin, retinol, bis- tetracyklín, sterofenol, oxazole, bis-p-oxazolylbensen, 3-aminopyridiniumsalter, hsllebrigenin, 2-oxo-3~kromen, indol, xanten, ben imidazolylfenylamin, kumarin, fenoxazin, metansr och flavín.

Individuella fluorescerande föreningar som har funktionali- teter för bindning eller som kan modifieras så att de omfattar sådana funktionalitetsr omfattar dansylklorid, fluorescerande substanser såsom 3,öwdinydroxi-9-fenylxanthydfol, rodaminisotio- cyanat, N~fenyl-1-aminofl8-sulfonatonaftalen,N-fenyl~2-amino~6~ sulfonatonaftalen, 4-acstamido~4-isotiocyanatostilben-2,2'~di- 2-toluidinonaftalen-6~sulfonat, etidíumbromid, sulfonsyra,pyren~3~sulfonsyra, N-fenyl, N-metyl-2~amino~naftalen-6-sulfonat, atebrin, auromin~O,2~(9'-antroyl)palmitat, dansylfosfatidyletanoí~ amin, N,N'-dioktadecyl-oxakarbocyanin, N,N'~dihexyl-oxaksrbocya- nin, merocyanin, 4-(3'~pyrsnyl)butyrat, d~3~aminodesoxi~akvile- nin, 12-(9'~antroyl)stæarat, 2-metylantracen, 9-vinylantracen, 2,2'-(vinylan-p-fenylsn)bis~bensoxazol, p~bis{2-(4-metyl-5- fenyloxazolyl)}benzen, 6~dímetylamino-l,2~ben ofenazin, retinol, bis(3'~aminopyridinium)-l,lG~dekandiyl-dijodid, sulfonaftyl~ hydrazon av hellebrigenín, klortetracyklin, N-(7-dimetylamino~4 -metyl~2-oxo~ 3-kromenyl)-maleimid, N-ip-(2~ben imidazoyl}~feny1šw maleimid, N~(4~fl orantyl)maleimid, bisšhomovanillinsyraš, re- sazarin, 4-kloro-7-nitro-2.1.3~bensooxadia2ol, merocyanin 540, resorufin, rose bengal och 2,4-difenyl~3(2H)~furanon.

Bet bör märkas att absorbtions- och emissionsegenskaperna hos det bundna färgämnet kan skilja sig från det icke bundna färgämnet. vid hänvisning till olika våglängdsområden och egen- skaper av färgämnena avses därför färgämnana som de användes och ej det färgämne som är okonjugerat och karakteriserat i ett godf1 tyckligt lösningsmedel.

En alternativ ljuskälla som detekterbar signal är en kemi- luminescerande källa. Denlumniluminescerands källan omfattar en 7-hydroxiw salicylat, strofantidin, porfyriner, triarylf 10 15 20 25 30 35 7910042-6 förening som blir elektronisktexciteradgenom en kemisk reaktion V och som sedan emitterar ljus som används som detekterbar signal eller ger energi till en fluorescerande acceptor.

Ett åtskilligt antal familjer av föreningar har visat sig ge kemiluminescens under en mängd olika betingelser. En familj av föreningar är 2,3~diväte~ l,4¿ftalazindion. Den mest använda föreningen är luminol. som är 5-aminoföreningen. Andra förening» ar som tillhör familjen omfattar 5~amino~6,7,8~trimetoxi- och dimetylamino~[ca]bensanalogen. Dessa föreningar kan fås att lu- minescera med alkalisk väteperoxid eller kalciumhypoklorit och bas. En annan familj av föreningar är 2,4.S-trifenyl-imidazoler, med lofin som gemensamt namn för moderprodukten. Kemiluminesce- rande analoger omfattar para-dimetylamino- och -metoxisubstitu- enter. Även om ovan angivna märksubstanser normalt användes kan även andra typer av märksubstanser användas, såsom stabila, fria radikaler, inklusive bildning och sönderdelning därav, märksub- stanser för potentiometrisk bestämning och liknande.- En stor mängd partiklar kan användas enligt uppfinningen.

Partiklarna är lämpligen porösa eller mikroretikulära, dvs har _ ytor öppna mot bulklösningen, som är större än ca 50% omgivna av partikelmaterialet. Dessa ytor kan utgöras av djupa porer, kana- brott, inskärningar eller liknande.

De partiklar som användes väljas så att en miljö skapas för en eller flera delar av det signalalstrande systemet som möjlig- gör differentiering mellan den signalmärksubstans som är bunden _ till partikelytan och den signalmärksubstans som finns i bulklös~§ ler, ningen; Genom lämpligt val av makromolekylära reaktionskomponen- ter kan tillgängligheten av en signalmärksubstans på partikely- tan begränsas till den makromolekylära reaktionskomponenten. Po- rerna eller kanalerna i partikeln väljes så att de möjliggör tillträde av åtminstone en del av det signalalstrande systemet och ofta så att de inniberar tillträde av åtminstone en, vanligen en, del av det signalalstrande systemet. I De porösa partiklarna kan ha olika porstorlekar. Porstorle- ken väljes i överensstämmelse med egenskaperna av den partikel som användes- Då diffusionshastigheten är en signifikant faktor 10 5.4 Un 20 25 30 35 791oo42-6 användes en avskärningsstorlek mellan de molekyler som måste dif~ É fundera in i porerna och de molekyler som är inhiberade från att diffundera in i porerna. Avskärningsstorleken kan variera från 10 0OO~tal, t.ex. 20 000, vanligen 40 000 till miljoner i mole- kylvikt, 20 000 000, vanligen 10 000 000, den finns kommersiellt tillgängliga.

Partikelns storlek är begränsad av följande faktorer. Partiks larna bör vara relativt stabilt dispergerade under analystiden och lämpligen längre, En oändlig stabilitet i analysmediet krävs dock ej. Partikelstorleken bör vara tillräckligt liten för att ett stort antal partiklar skall kunna finnas i lösningen. Man vill alltså inte se några kraftiga fluktueringar i signalen, varvid en, eller några få partiklar som passerar igenom ljusstràlens väg avs' sevärt förändrar den observerade signalen. Partiklarna har därför t.ex. och olika områ~ f 'lñfl .nu o vu n AMF 1 1 till. lvu run, mestade s en diameter ca 500 nm till 25 pm. Porstorleken varierar i allmänhet från ca 0,l nm till under 750 um, vanligen högst ca 500 nm. . 0 g H Partikelstorleken kan varieras och ytarean okas genom sön~ 2.: i omradet ca BG nr derdelning av större partiklar till mindre partiklar på mekanisk väg, såsom genom malning, ljudbehandling, omröring etc..

En stor mängd material kan användas för partiklarna. Många material finns kommersiellt tillgängliga eller också kan kommer- siellt tillgängliga material modifieras så att materialets egen-fö skaper ändras. , Partiklarna kan härledas från naturligt förekomande material, naturligt förekommande material som är syntetiskt modifierade ocn5 syntetiska material. Av speciellt intresse är polysackårider, spar ciellt tvärbundna polysaakarider, såsom agaros, som finns till- 0 gänglig som "Sepharose", dextran, tillgänglig som ”Sephadex” och "Sephacy1", cellulosa, stärkelse och liknande. Andra material _ omfattar polyakrylamider, polystyren, polyvínylalkohol, sampoly- f merer av hydroxietylmetakrylat och metylmetakrylat, silikoner, glaser, som finns tillgängliga som ”Bioglas", träkol och liknande; Partiklarna bör vara polyfunktionella eller kunna polyfunkti§ onaliseras. En stor mängd funktionella grupper finns tillgängliga _ _eller kan införlivas. Funktionella grupper omfattar karboxylsyrori aldhyder, aminogrupper, cyanogrupper, etylengrupper, hydroxylgrnpf 10 15 20 25 30 35 bö 191no42-s per, merkaptogrupper och liknande. Det sätt varpå en stor mängd L föreningar bindes till de olika partiklarna är väl känt och finnsf riktligt dokumenterat i litteraturen. Se t.ex. Cuatrecases, J. V Biol. Chem. gjš, 3059 (1970).

Bindningsgruppernas längd kan variera avsevärt beroende på typen av den förening som skall bindas, effekten av avståndet mellan märksubstansen och partikeln på märksubstansens egenskaper,ï märksubstansens möjligheter till tvärbinding och liknande. H Partikeln, vare sig den är svälld eller osvälld av det vat- tenhaltiga mediet, kommer att definiera en volym i det vattenhal- v tiga mediet där miljön av vätskan i partikelmiljön skiljer sig från miljön av vätskan i bulklösningen. Dvs vätskan i porerna och? /eller kanalerna och/eller på ytan av partikeln komer att pâver- ' kas kemiskt och fysikaliskt av partiklarna.

Om man vill åstadkomma en pH~gradient, kan partikeln substi- tueras med positivt eller negativt laddade grupper, såsom ammo- nium, sulfonat, karboxylat och liknande, eller ett enzym fästas till partikeln som har en produkt med annan aciditet än substra- tet. Genom användning av en buffert medenirelativt svag buffert- kapacitet kan en pH-gradient uppnås mellan partikeln och nulklös-_ ningen. ' Beroende på typen av partikeln kan diffusionshastigheten hindras jämfört med bulklösningen. Storleken av kanalerna, typen av kanaler, raka eller kurvade, och den kemiska typen av partik~ larna kan samtliga påverka diffusionshastigheten för en molekyl i en kanal eller por.g Partikelkonjugatet är alltid konjugerat till en av delarna i det specifika bindningsparet. Konjugeringen kan vara direkt eller indirekt. Med direkt konjugering avses kovalent bindning av den specifika bindningspardelmärksubstansen till partikeln.

Alternativt kan man använda en receptor för den specifika bind~ , ningspardelen. ett orent preparat av en komplementär del bindas kovalent till á partikeln. En icke-kovalent bindning av den icke renade specifikaf pardelen ger då en partikel märkt med den signalmärkta eller omärke ta homologa pardelen fri från föroreningar. Det erhållna parti~ kelkonjugatet kan då användas vid analysen med dess komplementäre 10 l5 20 30 35 7916042-6 signalmärkta konjugat.

En modifiering av ovanstående situation kan utnyttjas då analyten är en receptor såsom human Igß. En allergen som igen- kännas av Ig kan då bindas kovalent till partikeln. Som en del av signalmärksubstanskonjugatet kan då användas anti(human IgE) från får. Vid analysen kommer human IgE-analyten att bindas till allergenet på partikeln och signalmärksubstanskonjugatet (anti (human IgE)) att bindas till human IgE som är bundet till partitš keln. Denna situation skiljer sig från den vanliga situationen genom att bindningen av,analyten till partikeln under analysen ger vad som definierats som partikelkonjugatet. Pâ liknande säti kan också andra receptorer såsom IgA, Igü, IgM, enzymer, specif¿¿ ka receptorer såsom får östriol, biotin eller andra läkemedel etn. användas.

I själva verket finns det två specifika bindningspar där samma förening fungerar som antigen i det ena paret och som re* f ceptor i det andra, under det att de komplementära delarna till analyten i vart och ett av de specifika bindingsparen ej behöver ha något förhållande som ligand och receptor.

Förhållandet mellan den specifika bindningspardelen och mow lekylvikten av partikeln varierar avsevärt beroende på typen av partikel, tillgänglig ytarea, tillgängliga bindningsställen och» liknande. Det kommer att finnas i genomsnitt minst ca l specifit bindningspardel per partikel och i allmänhet minst ca l per lxl05 molekylvikt, vanligen minst ca l per lxl07 molekylvikt.

För många av de signalalstrande systemen kan en eller flera signalmärksubstanser andra än i signalmärksubstanskonjugatet ana vändas, vanligen kevalent bundna till partikeln, Såsom angivits tidigare kan dessa märksubstanser vara enzymer, katalysatorer, kromogener, elektrnnëverföringsmedel, fosforescerande substanse: eller liknande. Förhållandet mellan signalmärksubstansen och païÉ tikelmolekylvikten varierar avsevärt beroende på typen av märkfl. substans, liksom på typen av signalalstrande system. Då det finna en signalmärksubstans, komer det att finnas i genomsnitt minstf ca l signalmärksubstans per partikel och i allmänhet minst ca l per lxl03 molekylvikt, vanligen minst l per lxl06 molekylvikt.

Nya kompositioner kan framställas som partikelkonjugat. Speå 10 15 20 h) UI 30 35 791oo42-6 ciellt kan någon av de hapteniska eller antigeniska ligandrar som angivits i analytsektionen eller någon av receptorerna kon-^ jugeras till partikeln i samverkan med en del av det signalalst- rande systemet.

Av speciellt intresse är konjugat med partiklar av"poly(a-“ minosyror), såsom albuminer, globuliner, speciellt immunoglobu- liner, hormoner, sjukdomsspecifika antigener t.ex. CEA, lipopro- teiner, glykop-oteiner och liknande, liksom polysackarider, så- som aminoglykosider, lipopolysackarider, neuraminsyror och lik- nande, i samverkan med märksubstanser, såsom enzymer och kromo- gener t.ex. fluorescerande substanser och utsläckare.

Exempel på partikelkonjugat som kan användas enligt uppfin- ningen är polysackaridpartiklar, såsom agaros,¶dextran och cel- lulosa konjuqerad med minst en poly(aminosyra)antigenmolekyl och minst en del av det signalalstrande systemet, såsom ett enzym, kromogen, kemiluminescerande substans, elektronöverföringsmcdel eller fosforescerande substans. Föredragna enzymer har beskrivits: ovan. Såsom angivits bör enzymen ha en produkt som är substratet för nästa enzym eller vice versa. Speciellt är hydrolaser använd-- bara, såsom fosfataser, glykosidaser och esteraser, transferaser, såsom kineser, och oxidoreduktaser, såsom dehydrogenaser och per-1 oxidaser. Som kromogener är fluorescerande substanser, utsläcka- rewochkemiluminescerande substanser speciellt användbara. Som katalysatorer är Meldola-blått speciellt användbar, under det att, som fosforescerande substanser polycykli:ka aromatiska färeningar och sällsynta jordartsmetallkelat är av speciellt intresse.

Konjugeringen av märksubstanser till ligandrar och recepto- rer har omfattande beskrivits i litteraturen, speciellt i ovan citerade referenser. Molförhållandet mellan märksubstans och spent cifik bindningspardel varierar avsevärt beroende på typen av märk~ substans liksom på typen av specifik bindningspardel.

Exempel på konjugat omfattar enzym-ligand eller -receptor- konjugat, substrat- eller cofaktor-ligand eller -receptorkonjugatà kromogen-ligand eller -receptor, katalysator-ligand eller -recep-É torkonjugat, där en eller flera av märksubstanserna kan finnas närvarande i konjugatet. Ligandrar och märksubstanser har be- skrivits tidigare. Likaså är konjugeringen konventionell och har 10 15 20 25 35 7910042-6 beskrivits och finns beskriven i känd teknik.

Olika tilläggsmaterial kan användas vid föreliggande analy- ser. Speciellt kan enzymsubstrat, cofaktorer och inhibitorer vara konjugerade till mittkärnor på ett sådant sätt, att de be~ varar sin effekt, men förhindras från att tränga in i partikel- porerna. Då ett enzymsubstrat är bundet till en mittkärna kommer enzymreaktíonen mestadels att äga rum i bulklösningen, så att enzymet i partikeln blir relativt inaktivt. Om ett enzym~spccifik bindninqspardelkonjugat användes blir härigenom den detekterade mindre ju mer av konjugatet som finns bundet i paitikeln.

Då enzyminhibitorer användes blir i motsats härtill enzymet i bulklösningen väsentligen inhiberat, under det att enzymet i partikeln blir skyddat från inhibitorn. l både kärnor som beskrivits signalen Olika mittkärnor kan användas, för partiklarna, liksom andra kärnor, såsom polypeptider, protei~ ner, nukleinsyror, andra syntetiska polymerer och liknande.

Reagensen kan också av praktiska skäl tillhandahållas som satser, där reagensen finns i förbestämda förhållanden, så att analysens känslighet väsentligen optimeras inom intresseområdet, Efter rekonstitution av reagensen dispergeras partikelkonjugatet normalt i ett vattenhaltigt medium av väsentligen samma densitet som partikeln, så att partiklarna förblir väsentligen likformigt dispergerade eller dispergerbara. Genom användning av tillsatser med bög densitet eller inställning av partiklarnas densitet kan önskad densitet uppnås.

Av speciellt intresse som ytterligare reagens i det signal- alstrande systemet: då enzymer användes, scavenger makromoleky- r »och antienzymer; då kromogener användes, antifluorescerande 30 substanser, eventuellt bärande utsläckare, entikemiluminiscerane de substanser, scavenger makromolekylära reagens bärande ntsläck~ nte och kromoqenreaktanter, som skapar eller förstör den kromo= fora funktionaliteten.

Signalmärksubstanskonjugatet kan finnas i samma eller någon annan behållare, som partikelkonjugatet, beroende på om de spe~ eifika bindnšnqspardelarne är samme resp” olika. Båda konjuqaten kan vara lyofíliserade eller föreligga i ett koncentrat i ett 10 15 25 30 35 .randra. 7910042-6 vattenhaltigt medium med stabillsatorer, såsom bakterlostatika, bakteriotider och proteiner. Det ena eller båda av reagensen kan omfatta buffertar, delar av det signalalstrande systemet såsom enzymsubstrat och cofakterer eller liknande.

I vissa fall kan det vara önskvärt att ha partikelkonjuga- tet och signalmärksubstanskonjugatet som ett enda reagens, med de specifika bindningspardelarna icke-kovalent bundna till va- Kombinationen kan förframställas eller framställas in situ.

Uppfinningen belyses närmare genom följande exempel.

Samtliga procentangivelser och delar är om annat ej angives beräknade med avseende på vikten, förutom blandningar av vätskor som är beräknade med avseende på volymen. Samtliga temperaturer är angivna i grader Celsius. Följande förkortningar användes: GGPBH glukos»6-fosfat~dehydrogenas; HK hexokinas; HIgG human -y-globulin; EDTA etylen»diaminotetraättiksyra; NHS N~hydroxi- succinimid; NADH nikotinamid-adenin-dinukleotid reducerad; Ranti HIgG kanin-anti(human Igå); ONPG o-nitrofenyl~galaktosid; RIgG kanin-IgG; ESA kaninserumalbumin; OAc acetat; AP alkalisk fos- PBS fosfatbuffrad salin; B-Me B-merkaptoetanol; EDCI etyl- dimetylaminopropyl-karbeüiimid. fatas; Exempel l. Framställning av "Sepharose“ 48 konjugat med GGPDH oeh HIgG Till en reaktionskolv sattes 2,5 mg GSPDH, 16 mg glukos-6- fosfat, 90 mg NADH, 0,ïü mg HIQG samt 0,25 g fuktig cyanogenbro- mid-aktiverad “Sepharose“ 48 (från Pharmacia, tvättad i 1 mM HCl, ' 200 ml) i 0,1 M natrlumbikarbonat,pH 8,1, 6,5 M NaCl, och bland- ningen omrördes vid 40 1 sex timmar, varefter omrördes vid tums* temperatur. Till lösningen sattes därefter 0,25 ml 1 M 2-am1no- propanol, pH 8,0 och reaktienen omrördes över natten vid 40. Reak~: tionsblandningen tvättades därefter genom centrifugering med 3x2 ml 0,1 M borat, pH 8,5, l M NaCl, följt av 2x2 ml 0,lM nat- rimnbikarbonac, 0,5 n Nacl, pH 8,1, 0,05% azid. efter analys av enzymaktiviteten tvättades proven ånyo och suspenderadee 1 0,1 M natriumbikarbonat, 2 mg/ml bovinserumalbumin, 0,05% aeid. 10 F; UT 20 25 30 35 1910042-e En portion av 2,5 pl av en total volym av 1,4 ml med ca 0,5 ml* packade kulor,,uppvisade en enzymaktivitet av 12,1 U/ml.

Mängden HIgG visade sig vara 129 pg/ml eller 10,6 pg/U av enzymet.

Exempel 2. Konjugering av kanin~antiHIgG med HK Till en reaktionekolv sattes 10,2 mg kanin-antiHIgG 1 1,2 m1 f! 'f ll :mm-Fad- vCLY 7 fi. TH vnkfi 'Eflflfflfl fl 'I m1 lll-L Uj-h UL JJLJ-'JÅ-Gb' till lya' .DV [HPL LllJ-Llip VQI; IHJ- SO pl av en 10 mg/ml läsning (tillsatt i portioner på 25 pl) av meta-maleimidobensoeyra NHS ester och blandningen omrördes Å 4 mAO-nu-'l fFrs-vvmnm-I A nal-s UJJuC u] .L .Lvmluunußu sauna i 30 minuter vid rumstemperatur. Reaktionsblandningen kromato- grafèrades därefter på en 2,5 x 25 om G50 kolonn ekvilibrerad med N2~spolat 0,l M fosfat, pH 6, 10 mM EDTA och fraktioner på 2 ml uppsamlades. Fraktionerna 14 till lö slogs samman. Till 3,7 ml 0,1 M fosfat, pH 7,5, 10 mM EDTA innehållande l3,5 mg HK, sattes 50 pl 2 M glukos och 0,4 ml DMF och blandningen omrördee under kväve vid rumetemperatur. Till lusning sattes 100 pl i fyra portioner av en 20 mg/ml lösning av S-acetylmerkaptobärn~ stensyraanhydrid i DMF under en tid av ca l timme. Efter det att tillsatsen avslutats och en ytterligare period av l0 minuter för reaktionen tillsattes 0,4 ml 1 M hydroxylamin, pH 7,5, under : omröring under kväve och blandningen omrördes 1 60 minuter vid rumstemperatur, Reaktionsblandningen kromatograferades därefter på en 2,5 x 25 cm G50 kolonn i 0,1 M fosfat, pH 6, l0 mM EDTA, spelades med kväve och eluerades i fraktioner på 2 ml, varvid fraktioner- na 16-19 sammanslogs. Den totala volymen av de sammanslagna frake tionerna var 7,5, som innehöll 8,96 mg protein. Analys: 5,7 SH grupper per hexokinas. Eftersom hexokinas innehåller 4 SH grup- per, hade approximativt två ytterligare SH grupper adderats per hexokinas. Till 7,3 ml av den ovan framställda hexokinas- lösningen sattes 3,5 ml av derivatet av kanin-antiHIgG (5,25 mg),* varvid det vattenhaltiga mediet utgjordes av 0,l M fosfat, pH 6, 10 mM EDTA, 30 mM glukos, och spolades med kväve. Blandningen fick reagera vid 4° i 48 timmar.

Reaktionsblandningen kromatograferades därefter på en "Bio~ gel" ASM kolonn i 0,1 M fosfat, pH 7, 10 mM EDTA, 2 mM B~Me 0,02%: “pâ 10 f-n ífl 20 25 30 35 * **-^'>'~»,,~-w== ~'~'s§-<ßïn'~*ïfi azid, kolonnen spelades med kväve och blandningen påfördes ko- lonnen i 6 ml och eluerades i fraktioner på 3,5 ml. Fraktioner- na 45 till 68 sammanslogs och koncentrerades till ca 8 ml. Det erhållna konjugatet vieade sig ha ca 0,36 U/932,9 mg HK och 2,50 mg antiHIgG kopplades.

Märkning av RIgG (kanin~¶*globulin) med C14 bärnstenssyraanhydrid Exempel 3. 2 ml RIgG-lösning dialyserades mot 350 ml 0,l M natriumfos- fatbuffert, pH 7,6, under 48 h med ett byte. Den dialyserade löst; ningen hade en koncentration av 13,0 mg/ml RIgG (enligt UV). A C14-bärnstenssyraanhydrid (50 pCi, 0,7 mg) spå des l:l0 med "kall¿ bärnsšenssyraanhydrid och löstes i aceton till en 0,1 M lösning ro.1n ._ - cpm/¿umol).' Denne läsning (30 pl) sattes vid rumstempe- ratur under omröring till 0,88 ml (ll,4 mg) av den dialyserade RIgG-lösningen. Efter omröring i 40 min tillsattes 155 Pl 2 M hydroxylamin-HCI, pH 8,0. Efter omröring i ytterligare 2 h dia- lyserades reaktionsblandningen vid 40 mot 350 ml 0,05 M natrium~ fosfatbuffert, pH 7,0, under 72 h med sex byten. Den dielysera~ de lönningen (l,07 ml) hade en koncentration av 11,0 mg/ml RIgG och 1,37 x 106 cpm/Vml^ (10 bärnstenssyraanhydrid per RXQG).

Exempel 4. Funktíonalíserinq av Rïgü med eulfhydrylgrupper.

S~acetylmerkaptobärnstenseyraanhydrid (l,85 mg) i 25 pl torr DM? sattes långsamt vid rumstemperatur till en omrörd lös- 0 ning av 5,5 mg RIgG (föregående exempel) i 1,0 ml 0,05 M natriumwf id fosfat, pH 7,5, med 0,02 ä EDTÅ, under kväveatmosfär. Efter em* röring 1 io min tillsattes 0,1 m1 1,0 M heyarøxylamin-ncn pn 1,5,jf och omröringen fortsattee i ytterligare l0 min. Reaktionsbland- ningen kromatograferades på en 0,9xl0,5 cm G-25 fin "Sephadex" kolonn (avgasad och mättad med argon) med 0,05 M natrlumfosfat- buffert, pH 5,0, med 0,02 M EDTA (avgasad ech mättad med argon).

Fraktioner på 0,8 ml uppsamlades med en hastighet av 0,125 ml/ min. Fraktionerna 5-7 sammanslogs och gav 2,5 ml innehållande 4,3 mg RIQG (baserat på radioaktiv räkning). 10 F; UI 20 25 30 35 791 0042-6 Exempel 5. Funktlenallsering av alkalisk fosfatas med maleimlåogrupper En suspension av alkalisk fosfatas (l ml, 5,0 mg, 5075 I.U.) nedcentrifugerades, den överstående vätskan avlägsnades, det ut- M' fällda enzymet löstes l 1,0 ml 0,05 M natriumfosfatbuffert, pH 7,0, och dialyseraded mot 500 ml av samma buffert i kyla under 48 h med fyra byten. Den dialyserade lösningen omrördes och 0,4 mg m={N=raleimiäo)bensoesyra=N=hydroxisuocinlmiàester l 40 pl torr UMF tillsattes. Efter omröring i 30 min avslutades reaktio-' nen genom tillsats av 0,4 ml l M natriumacetatbuffert, pH 5,0.

Reaktionsblandningen kromatograferades på en 0,9x25 cm G-25 fin "Sephadex"~kolonn med 0,02 M natriumacetatbuffert, pH 5,0; frak- tioner på 1,0 ml uppsamlades med en flödeshastighet av 0,125 ml/ 41 “I ...1 .a 7 slogs samman och gav 4,l5 ml ^ o)o Mali 'I Q leu 4: ; J-n ._ _.¶- /min. Fraktionerna 6 ocn mg alkalisk fosfatas (på basis av U.V Exempel 6. Konjugerlng av RIgG och alkalisk fosfatas.

Lösningen av alkalisk fosfatas gjordes 0,02 M 1 EDTA och pH ställdes på 6,5. Lösningen omrördes under kväve och RIgG-SH~ lösningen (exempel 4) tillsattes långsamt. pH ställdes på 6,7 och reektlonsblandningen omxöräes vid rumstemperatur i 3 h och över natten vid 4°. Efter tillsats av 0,2 ml 0,01 M merkaptoeta~ nol~lösning och omröring i rumstemperatur i 30 min hölls reak- tionsblandningen vid 4° unâer 72 h. Lösningen koncentrerades till en volym av l mlri "Amioon" genom ett PM30 "Diaflo" ultra- filter och kromatogragerades på en l,5x 87 cm 1,5 M "Biogel A" kolonn med 0,1 M Tris-HCl pH 7,6 med 0,05 M NaCl och l mM MgCl2.

Fraktloner med en volym av 1,0 ml uppsamlades vid en ílödeshes~ tighet av 5 ml/h. Fraktionerna 46~48 (RIgG-AP-I) och 49~60 (RIgG-AP-II) sammanslogs och gav.2,75 ml resp. 12,1 ml. Efter be» stämning av konjugatets egenskaper stabiliserades lösningarna med NaN3, 0,05%, och äggalbumin, 1 mg/ml.

Nedan anges produktens egenskaper, bestämåa genom raäieaktl~ vitetsräkning och Ülv.-absorbans, IH 13 P-l U! 20 25 30 35 7910042-6 Konjugat Total mängd AP/RIgG % bundet % enzymatisk (mg) molförhållande enzym ektivitet RIgG-AP-I l,l6 l,75 100% 4,9% Exempel 7. Konjugerlng av B-0-galaktosldas och HIgG (human IgG) till kulor av "Sepharose" 4B B-D-galaktosidas (1,0 mg, 300 I.U.) som 0,2 ml susoeneion nedcentrifugerades, löstes i 1,0 ml 0,1 M natriumbikarbonne,fl 0,5 M NaCl och dialyeerades mot 1 liter av denna buffert vid 4 under 24 h med ett byte. Cyanogenbromidaktiverade kulor av “Se- pharose" 4B (100 mg) svälldes och tvättades med l0*3 M HClelös- ning i 15 min. Till de svällda_kulorna sattes 1,0 mg ß-D~galak- tosidas och l,0 mg HIgG i 5 ml 0,1 M natriumbikarbonatbuffert med 0,5 M Naül i ett provrör som roterades ände-till-ände i 2 h vid rumstemperatur. Icke bundet material tvättades bort med kopp- lingsbuffert och eventuella återstående aktiva grupper bringades att reagera med l M 2-propanolamin vid pH 8,0 i 2 h. Tre tvätt- cykler användes för att avlägsna icke-kovalent absorberade pro- teiner, varvid varje cykel bestod av en tvättning med 0,1 ä na- :riumeeetatbuffert innehållande 0,5 M Nefll fäljd av en med 0,1 M Tris-HC1, pH 8,0, buffert innehållande 0,05 M NaC1 och l mM MgCl2. Kulorna suspenderades i 1,5 ml 0,1 M Tris-HCI, pH 7,0, buffert med 0,1 M NaCl, 1 mM Mgclz och 0,05% NaN3.

O tvåttninq Exempel 8. Framställning av 4~metylumbelliferyl-ß~D(-)- galaktopyranosid~6-fosfat a. 4~metylumbelliferyl-tet:e-0-(tzimecylsilyl)-5-D-{-)-galakee- pfrenoeåd (4=HUGetetïe~G?HS} 3,0 g 4-metylumbelliferyl-ß-D-(~)-galaktopyranosid, 18 mi he* xametyldisilazan och 12 ml klortrimetylsilan omrördes i 80 ml torr pyridin över natten vid rumstemperatur under argonešomosfär. 10 15 20 25 30 35 7l910042~6 j Reaktionsblandningen indunstades till torrhet under reducerat tryck, eter tillsattes och de vita kristallerna avlägsnades ge- ” nom filtrering. Den överstående vätskan avdunstades och gav vita_“3 kristaller som omkristalliserades ur 30 ml hexan över natten i kyla varvid erhölls 4,?5 g (80%) fina, vita kristaller med smält* f punkten 135-l37,5°, tunnskiktskromatografl på kiseldioxid, Rf 0167, eter-hexan 2:1. b. 4~metylumbelliferyl-2,3,4~tri-O-(trimetylsilyl)-B-D*(*)* qalaktopyranosid (4-MUG-tri-OTMS) 4,7 g 4«MUG-tetra~üTMS suependeradee 1 206 ml kall, torr fimetanol. Den kylda (OÜF omrörda suspensionen behandlades med 50 ml vattenfri metanalsom skakats med 220 mg K2CO3. Suspensionenl löstes under omröring l 45 min och den erhållna lösningen neutraflí liserades noggrannt med en utspädd lösning av isättika i torr me~l tanol. Metanolen avlägenades i vakuum vid rumstemperatur. Åter- stoden upptogs 1 eter, etern filtrerades och avdunstades därefterfl varvid erhölls 3,2 g vita kristaller (tunnskiktskromatografl på kiseldiokid, Rf 0,28, eter-hexan 2?l). c. _ 4~metylumbelliferyl-B-D-(~)-galaktopyranosld~6-cyanoetyl~ }íosfat 3,2 g 4~MUG-tri~üTMS, 2-cyanoetylfosforsyra (framställd av 3,3 q av dihydratet av hariumsaltet) och lö g dicyklohexyl~karbo“l diimid i 50 ml torr pyridin omrördes vid rumstemperatur i 6ü h. 26 ml vatten tillsattee ooh lösningen omrördes i G min. Blanu~ ningen indunstades till torrhet, försattes med 750 ml metanol, l30 ml vatten och 5,3 ml ättiksyra varefter blandningen omrördnn V över natten. Fällningen filtrerades och metanol avdunstades un» der reducerat tryck varvid erhölls 8 g av en gummiliknanne olja, som kromatograferades på en 3,5x80 cm torr kolonn av silitagel med CHCI3-CH30H-H20 50:35:5. Kolonnen skara 1 åtta lika stora delar och produkten extraherades från den tredje delen uppifrån med metanol. Den grumliga metanollösningen koncentrerades till en liten volym, grumligheten avlägsnades genom centrifugering och lösningen koncentrerades varvid erhölls 2,1 g av en gulaktig É olja. øljan löstes i 5 ml metanol och 100 ml aceton tillsattes.

Man erhölls 1,5 g av ett vitt pulver. U.v. och NMR visade på en renhet av 50%. Tunnskiktskromatograíi på kíseldoxid gav Rf e 0,45, cnc13-cnaon-H20 (so=as:s). v: m, .J wygvyïvií¿¿ï-fi;â.,ušf l0 15 20 25 30 35 'Sf-w->»<;ge;zæ,,gwqwaç,çhfi"^' ~~-.-. -wv 4-.=e«-a--.v.»e. »flm- _» 'v v- - - .I;wç,<,,frxaw;;,aaçfl ' ' v, 191ea42-6 fav d. 4-metylumbelliferyl-6-D~(~)-galaktopyranosid-6-fpsfat H _ 1,5 g rå cyanoetyl-förening löstes i en lösning av 42 ml " å sas Nu4on och 18 ml vatten men uppvärmaes 1 2,5 n vid ss°. Lös- ningen centrifugerades och den överstående vätskan indunstades varvid erhölls en gulaktig olja som kristalliserade vid tillsats av 12 ml metanol. De vita kristallerna tvättades två gånger med aceton och gav 0,85 g. Detta material kromatograferades genom preparativ tunnskiktskromatografi med CHCI3-CH3OH-H20 (60:35:5) och extraherades från kiseldioxiden med metanol. Lösningen kon- centrerades till en liten volym, aceton tillsattes och 0,51 g vita kristaller separerade. Tunnskiktskromatografi på kiseldioxifi gav Rf 0,64 i iPrOH-58% NH4OH~H2O (60:5:35). Föreningen hade en renhet av 77% enligt U.V. och enzymatisk hydrolys med hjälp av alkalisk fosfatas och B-D-galaktosidas.

Exempel 9. Konjugering av HIgG och 5-galaktosidas.

En reaktionsblandning framställdes genom kombination av 4 ml HIgG (8,34 mg/ml, 50 mM fosfatbuffert, pH 7,0), 2,17 ml fee* fatbuffert, pH 7,0, och 20 pl av en DMF lösning av m-(N-maleimi~: dyl)bensoesyra-N-hydroxisuccinimidester (10 mg/ml) tillsattes un* der hastig omröring. Efter 30 min under N2 vid rumstemperatur _ tilleattes l ml l M NaOAc för inställning av på på 5. Elandnin§~ en kromatograferades därefter på "Sephadex“ G25-F (2,4x20 cm), eluerades med 20 mM Naüño, pH 5,0, innehållande 0,15 M NaCl med en hastighet av 30 ml/h, och fraktioner på 6,6 ml uppsamlades.

Fraktionerna 5-7 slogs samman; Cysteinanalye visade ca ? maleim¿ä~ of grupper per HIgG.

Den maleimidmodifierade HIgG späddes med fosfatbuffert var- ha-Ü efter tillsattes 3-galaktosidaslösning i 50 mM fosfatbnffert, pH 7,0 (0,67 g/ml), till 2 ml för åstadkommande av en slulig rent; tionsvolym av 14,1 ml. Följande tabell visar de olika lösnings~ l mängder som tillsattes för de tre preparaten. l0 15 20 25 30 35 791oa42-6 Maleimid Fosfatbuffert, pH 7 Konjugat HIgG 0,5 M 0,05 M rå Ei EL El 1 1,5 2,54 0,15 10,45 2 ' 5,0 8,45 0,50 7,60 3 11,85 20,03 '1,2s - Reaktionen utfördes vld rumstemperatur unáer 21 h unåer N2. Evenel àende e A tuella àterst . mal imidgrupper bringafies att reagera med cystein-HCl. Lösningarna koncentrerades under N2 med en Amícon ultrafiltreringsanordning över ett PM30 membran (konjugaten 1 och 2), PMlO membran (konjugat 3) till en slutvolym inklusive tvättning av ca 2 ml. De tre proven kromatograferades på "Biogel”Ü ASM (82xl,5 cm) med PBS, 0,05% NaN3, l mM Mg(OAc)2, eluerades med 4-8 ml/h och fraktioner på ca 2,5 ml uppsamlades. Med konju- gat 3 som exempel sammanslogs fraktionerna 25-34 och analyseradeuå Ca 67% av enzymaktiviteten återvanns som konjugatprodukt. På basifi av radioaktiv räkning av radioaktivt märkt HIgG hade totalt ca 81% av HIgG återvunnits. Koncentrationen av enzym var 31,45 pg/mig under det att koncentrationen av HIgG var 83,4 pg/ml. ' Exempel l0i Framställning av kanineantiåälgë) (Ranti HIgG)) konjugerad till “Sepharose" 4B kulor Till ett reaktionskärl sattes 2 ml innehållande 7,5 mg ka- nin-anti(HIgG) i 0,1 M NaHCO3, pH 8,l,0,5M NaCloch 0,9 g CNBr~ aktiverad “Sepharose" AB kulor och blandningen omrördes vid 40 i 6 h, varefter omrördes vid rumstemperatur i 2 h. Till blanäning- en sattes därefter 0,1 volym lM 2-aminopropanol, pH 8,0, och blandningen omrördes over natten vid 4°. Üenom användning av ra* dioaktiv Ranti(HIgG) kunde påvisas att 6,6 mg hade kopplats.

Kulorna (protein ungefär 5 mg/ml packade kulor) tvättades genom suspension 1 lxPBš (0,5 h) och centrifugerades därešter (3x). Efter suspension i ca l/3 vol/vol PBS späddes 0,5 ml av de suspenderade kulorna (ungefär 0,2 ml kulor) meä unšefär 1,5 10 15 20 25 30 35 7910042-*6 ml PBS, och lösningen infördes i den lilla sonden i en anordning av modell Wl85 från Ultrasonic Inc, effekt 60 watt, inställning ungefär 1,5, provet kyldes i isbad och ljudbehandladea i 3 min, varefter det eentrifugeradee een ljndbenandlades i ytterligare 2 min.

Exempel ll. Framställning av konjugat av o-nitrofenyl~ß- galaktosid och dextran. a. Till 7 ml av en 1,8 N Na-kloroacetatlösning och 3 ml vatten sattes 2 g dextran T2000 (Pharmacia), varefter tillsattes 10 m1_ 2,5 N vattenhaltig NaOH, och blandningen upphettades vid 70-75° i 1,5 h och fick stå över natten. Till blandningen sattes 2 ml isättika och därefter dialyserades blandningen mot 10 l 5%-ig vattenhaltig HOAc (4x24 h) och därefter mot avfioniserat 320, 10 l (4x24 h). Genom användning av radioaktivt märkt klorcacetat framkom att det var ca 1,21 pmol karboximetyl per mg dextran. b. Till 80 ml av en vattenhaltig lösning innehållande 1,96 pmol~ av den karboximetyldextran som framställts ovan sattes 8 ml (40 W: mmol) N,N'-bis-(3-aminooropyllpiperazin och 18 g (90 mmol) EDCI och lösningen fick stå vid rumstemperatur i 24 h. Reaktionsblandfl ningen dialyserades därefter mot 12 l avjoniserat vatten innehå1~: lande 150 g K2HPO4 och 75 g KHZPO4 (4x24 n) och antalet amino~ grupper bestämdes med hjälp av tri~nitrobeneeneulfoneyra till 68% av tillgängliga karboxigrupper. _ c. Till 10 ml DMF sattes 387 mg 2-nitro-5-karboxifeny1~B-galakwi tosid,“249 mg EDCI och 151 mg N-hydroxisuccinimid och blandning~ en omrördes vid rumstemperatur 1 h. Till 10 ml av den vattenhal-x tiga lösningen som innehöll aminosubstituerad dextran som fram- ställts ovan (9,2 mM med avseende på aminogrupper) sattes 2,5 ml av den ovan framställda NHS-estern och reaktionsblandningen fick_ stå vid rumstemperatur i 24 h. Reaktionsblandningen dialyaerades' mot vatten (4x) och produkten analyserades med avseende på o-nitw rofenyl-5-galaktosidgrupper (ONPG). Produkterna visade sig vara 7,0 mM/ml med avseende på ONPG-grupper enligt U.V. 10 20 30 35 7910642-6 För att åskådliggöra föreliggande uppfinning utfördes en analys av HIgG. I följande tabell anges använda reagens.

Analgskomgonenter "Sephe:eee“ 43-(G-5-PDH)-HIgG-konjugat ( Ex. 1) ~2Û mg kulor/ml 15-? U/ml Q-5-PDE uyv _ 8,0 pg/ml älgG 2) Kanin~antiCñïgëj-hexokinaâ-köfi'uqat LI l4l;5 pg/ml kenjugat 65 pg/ml kanin-anti{HIgG) 7šf§ pg/ml HK HK/kanln*anti(HIqG) 1,7 molförhållunde . +31* . lime; 3) Inkubationsbuffert SG mä Tïiš-HCI, ZÖÖ mM NaCl, 3 mü NAD, 3 mM ATP, 100 mM glukos, 6 mM MgCl2. 20%(vikt/vol)g/ml sackaros. 0,05% NaN 3: pH 8,0 š För utförande av aáalysen sättes 8 pl kulor till 50 pl av inkubatíonsbufferten som innehåller varierande mängder human IgG. Till inkubationsblandningen sättas 8 pl av kanin*anti(HIgG)- HK~konjugatet och proven inkuberas i 30 min vid 37°â Till bland- ningen sättes därefter l ml analysbuffert, pfbvet vírvlas i ea 3 s och aspireras omedelbart in 1 en Stasar III spektrofotometer.

Hastigheten för NADH-framställningen kontrolleras i 2 min vid 37° vid 340 nM. Qesultaten anges i följande tabell. 10 15 20 25 30 35 7910042'6 TABELL IX Prav ng nxg “A340/2 mi” medelvärde sn cvæ 1 1248 123, 125 125,5 3.5 2.3 2 416 129, 133 131 2,5 2,1 3 139 129, 131, 125 129,3 1,5 1,1 4 46,2 147, 149 143 1,4 1,0 5 15,4 151, 155, 157 157,7 1,0 4,5 6' 5,14 177, 155 166 15,5 9,3 7 1,11 115, 155 155 = 2,3 1,7 Ovanstående data kan sammanfattas till en standard för bestäm~ ning av antigen (human IgG) i ett okänt prov.

Följande analys visar användningen av kopplade enzymer, al- kalisk fosfatas och ß-galaktosidas för framställning av en fluo- rescerande fiörening av en icke-fluorescerande förening.

Analyskomgonenter Inkubationsbuffart - 0,1 M Tr1s-HC1 pa 5,0, 50 mm Nac1, 1 mM MgCl2, 0,05% NaN3, 1 mg/ml äggalbumin * 0,75 mg/ml 4~MUG-5-P 1 9,1 M Tris-HC1 pH 8,0, 50 mM NaCl, 1 mM MqCl9 Substratlösning Utsläckande lös- V ning ~ 0,4 M glycín - Na0H, pä 10,3 "Sepharose" 4B-ß-D-ga1aktosidas=HIgG- som framställts, spådd 1:4 med inkubationsbuffert utan äggalbumin spääfl 1:4 med inkubationsbuf- fert 3 lösningar 1 inkubationsbuffert. nzgc-AP-11 - HIgG och icke-immunogen RIgG - 7910042*6 Analysgrøtokoll 1. Förinkubatiens åIgG=AP=II (20 Pl) sättas till 100 Fl inkn= bationebuffert sem innehåller HIgG 1 nedan angivna mängder: UI O "' 1 \ 300 600 1200 flmUl-b- ~ Proverna omröres 1 1 h vid rumstemperatur. 2. Inkubation: 20 pl suspension av kulor tillsättes och proven hållas 2 h vid rumstemperatur. 3. Reaktion: 0,35 ml substratlöeninq tillsättes, virvlas och får stå vid rumstemperatur utan omröring 1 5 nin. 25 4. Utsläckningz 0,5 ml utsläckningslösning tillsättes, virvlas och fluorescensen mätas (Yex~365, yèm-447).

Följente filuereseenevëtden :eg1stze;aäes för proven 1 - 7: ao 3393 ng arga 1o“1° M Hxgc g 1 o Q 457, 4ø4 2 24 1,5 411 3 aa ' s 372 4 1so 9,4 aus, sno ss s søo 1s,a 231 6 eoo 31,5 211 _ f 7 1209 vs :zei :es itu-I 1:9 15 20 25 30 35 45 7910042-6 Dessa värden kan eammanställas till en standardkurva för bestämning av antigen {HIgG) i ett okänt prov.

En analys av HIgG utfördes på följande sätt under använd- ning av ljudbehandlade kulor av "Sepharose“ 4B konjugerade med Ranti HIgG. Använda material var "Sepharese" 4B-RantiHIgG sus~ penderad i en mängd av 0,l ml/ml i buffert (PBS, 5 mM NaN3).

ONPG-dextran ( 2 M molvikt), 10 mM NaN3, 0,l% RSA, HIgG-ß-ga- (4 mM) i PBS, 0,l% RSA, 5 mM NaN3, ßegalaktosidae) och Rlgü eller äïgö laktoeidaskønjugatet (1) D,l mM Mg(0Ac)2 (Qpg/ml (50 mg/ml) i PBS, 10 mM NaN3. I Följande schema används: 50 Pl kulor eller 50 Pl buffert slås samman med 50 pl RIgG eller HIgG eller buffert och inkube- ras i 30 min vid rumstemperatur, varefter tillsättes 50 Pl en- zymkonjugat. Efter inkubering i 30 min vid rumstemperatur till? ai sättas 0,1 ml ONPG-dextransubstrat och 0,8 ml buffert, 0,l% RSA, 0,1 mM Mg till en slutlig velym av l,O5 ml som genast aspireras till en spektrofotometercell. Reaktionsblandningen avläsas dåre efter vid 37° vid 420 nm genøm att avläsningar gdres 10 och 40 s>Å efter tillsatsen av substratet. Resultaten anges sem A00/min.

H 1 Haetigïet % 2 Ror Kulor RIgG HIQG Buffert min aktivitet l - - + ~ 0,920 103 2 - - = + 0,894 lüü 3 + - - + 0,428 48 4 + - + - 0,906 101 l. + finns närvarande; - ej närvarande 2. Procentuell aktivitet av enzymkonjugatet för sig självt i buffert med substrat.

Ovanstående resultat visar att kulorna inhiherar reaktionen mellan galaktosidaskonjugatet och det makromolekylära substratet då konjugatet är bundet till kulorna, men ej påverkar galaktosi~ dasen då konjugatet ej är bundet till kulorna. När HIgG tillsät~ tes för att bloekera bindningen av HIgG-B~galaktosidaskonjugatet till kulorna bibehåller äalaktosidasen sin aktivitet. a? ïl 791oo42-s En liknande analys som den som beskrivits ovan utfördes med Å hjälp av följande reagens: _ Buffert: PBS, 0,l% RSA, 5 mM NaN3, 0,1 mM Mg(OAc) Partiklar: Ranti-HIgG i buffert i en mängd av 0,02 ml/ml 5 Konjugat: Ex. 9 i buffert vid 9 pg B-galaktosidas/ml HIgG: 5,0 mgßml i PBS, 5 mM NaN3, spådd vidare såsom angivits. e Substrat: ONPG-dextran (2 M molvikt}, 4 mä GNPG i FBÉ, 5 mM NaN3 Analysen utfördes enligt följande: 50 pl av konjugatlösning- en, 50 pl HIgG-lösning och 50 pl av partiklarna slogs samman med 100 pl buffert och de utspädda reagensen slogs samman i denna ord ning. Inkubering sker vid rumstemperatur i 3 n. Till blandningen 15 sättes 0,1 ml substrat och 0,4 ml buffert och denna aspireras därefter i en spektrofetometercell och avläses vid 379 10 och 40 efter tillsatsen av snbstratet. Resultaten anges i fölfiande ta- bell: _ V I HIgG 2 Hastighet Aktivitet 20 Rör Partiklar spadning (min *l) % l ~ inf. 0,776 '(100) 2 + inf. 0,186 24 3 + 16384 0,150 19 4 + 4096 0,196 25 25 5 + 1024 0,328 42 6 + 256 0,548 71 7 + 54 0,702 90 8 + 16 0,762 98 9 + ß 0,768 99 ao 10 + 1 0,762 98 1. - buffert; + partiklar 2. inf. - HIgG-lösning substituerad med buffert.

HIgG-lösningen spädes i serie fyra gånger. 35 Ovanstående resultat visar en analys av HIgG som täcker ett koncentrationsområde av cirka 103 , varierande från ca 3 till 0,03 pm. 7910042-6 Föreliggande förfarande medför en ny lämplig teknik för mät~ ff ning av extremt låga koncentrationer av en stor mängd ligandrar, Vis Ifidehaptenaoch antigena, och receptorer. Förfarandet är snabbt, kräver endast en kort mätningstid och kan tillämpas på en stor mängd utrustning som för närvarande finns tillgänglig i handeln.

Förfarandet kräver heller ej något rent antigen eller'ren anti~ kropp för framställning av de olika reagensen. Så länge som det finns ett signifikant antal delar av det specifika bindningsga- ret bundna till partikeln påverkar ej andra yttre material hund* * na till partikeln analysen. På liknande sätt som för den homolo~, ga delen, som är märkt, kommer den avsevärda ökning av signalen som kan observeras som ett resultat av att delarna i det signal-"Ü alstrande systemet i partikeln kombineras, att minska effekten av bakgrunden från bulklösningen.

Föreliggande förfarande är ytterst mångsidigt genom att det gör det möjligt att använda en stor mängd olika kombinationer förf alstring av signaler. Genom variation av typen av partikel kan vidare systemets känslighet ökas ytterligare. Dessutom möjliggör föreliggande system en avsevärd minskning av bakgrunden, genom 7 tillföring av makromolekylära material som kan samverka med ma~ V terialen 1 bulklösningen. så att deras förmåga att påverka den detekterbara signalen minskar. När t.ex. enzymer användes i kom* bination kan en inhititer för enzymet i bulklösningen användas som har tillräcklig storlek för att väsentligen förhindra att enzymet i partikeln inhiberas. n Uppfinningen avser även de ändringar och modifieringar som kan utföras inom ramen för bifogade krav.

Claims (13)

7910042-6 ?ÄTÉNT"ï“ " k bindning analy metoá för bestämning

1. Homogen specif S s av förekcmsren i et ref a: en analyt som utqör en del av :àende av ligand och dess hømöløqä rèêepror, varviä prø"et i ett vatàenhdltigt medium änmhânßraa mflâ Qrt :inn trandø system äwm wwïattar æn f a del konjuaerad till en pardel r âstaâkommanfle av ett signal- m H »4 “1 o märksubstanskonjugat, v .id nivån av den Rignal som alstras å» av åst siqnalaïëíranñê ryà ärvt utgör vn ind11at1on på mänodon anaïvr finm Finna närvarande i prøvct :cm mätas cch jämfüres mßfl fiammn annïvëfiëfiinm mëå fifi äänd månad nnxl f, R Q n n Q ~ ä § C E n Q å a v att ett partikclkoxjuq;L ¿¿;;@y,¿¿¿% ïikïfirwiqfi i det vrtåenhaltiaa mædiet, pflrïikvlkonjuçatvt f omfattar ñifikrêta a (Il ta partik;ar vartill en av delarna i âbtta nar køníunerats och definierar en mrliç Lrrng den kon- Öetía par som skíljér aífi ;rin áot vatten- fïY 1 i än av signalen påverkas av fi;t sígfialalætrandæ syatemet försliggar 1 miljën krrnc dessa kïar ss; åsn :rar vari æiflnaímärksubstfinskfinsunatwr är -._ 1... Éöfäælar mëïïan pavtíkëïköfijnfintvä ngn vatï~n%1ïïiæb wcñium r r i Ffivñfiïíænflê till nänqdæn flnnlyï L u~t tzïtrnhnítífia mgäigfi, ign hqg@1¿q; døïen av døt äpovífikn hwfidnïnçfiçflrfif införas i det vattenhaltiga maâiet då analyren, partikelkon- jagat øch siqnalmärksubstanskonjuqat ger samma del av det speciíika bindningsparet, med ået förbehåííeh att áå analyten är en första receptor, den del av paret sam är konjugerad till partikeln kan vara den homolcga liganden eller en raceptor för den första receptorn, och delen av signalmärksubstanskon- jugatet kan vara en receptør för den första receptorn resp. 01.- ëfi hfimöiøga íiqanden.

2. H@L@d enligt krav 1, k ä n n Q t Q v P n a d a v att analyten är en ligand, den vattenhaltiga fasen är en Ãuffl ïert med ett pH 1 ømràdet 6.5 ~ 9,5 øch áe diskreta disparger~ Bara fasta partiklarna är porösa.

3. Päïi Metød enligt krav Z, k ä n n e t e c k n a d a v att ikeïkonjuqatet har en ligand som specifik bindníngsparåsl, 7910042-6 sígnalmärksubstanskonjugatet har en antlligand som specifik bindningspardel och det signalalstrande systemet har ett enzym som en del.

4. Metod enligt krav 2, k ä n n e t e c k n a d a\v att partikelkonjugatet omfattar dispergerbara porösa diskreta partiklar vartill konjugerats en av delarna av det specifika bindningsparet och ett första enzym, och signalmärkeubstans* konjugatet omfattar ett andra enzym konjugerat till en del av det epeoifik oindn qäparet, varvid det första och det G 1n andra enzymet med lämpli a substrat och cofïktorer definierar det signalaletrande systemet och det första och det andïa enzymet står i ett sådant förhållande att produkten av det ena utgör substratet för det andra.

5. Metod enligt krav 4, k ä n n e t e c k n a d ' a v 7att det första enzymet är aíkalisk fosfatae, det andra enzymet är glykosidas och substratet är en fosforylerad glykosidyl- eter av en fluorescerande hydroxylförening, som endast fluorescerar som fri hydroxyl under analysbetingelserna.

6. Metod enligt krav 4, k ä n n e t e c k n a d a v att ett av enzymen är glukos-6~fosfatasdehydrogenas, och det andra av enzymen är en Hexokinas med glukos som substrat.

7. Metod enligt krav 3, k ä n n e t e c k n a d a v att signalmärkeubstanskonjugatet omfattat ett första enzym kon~ juqerat till antillcand. *fav

8. Metod enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a d a v att analyten är en antillgand, den vattenhaltiga fasen är buffrad vid ett pH i området 6,5 - 9,5 och de diskreta dispetgerbara fasta partiklarna är porösa.

9. - Komposition k ä n n e t e c k n a d a v att den är ““Passad för användning vid en metod enligt krav 1 och om~ fattfir diskreta porösa fasta partiklar med en storlek i om- råfièïâonm till 100 um i diameter vartill kovalent konjugerats i Üünomq v. Hítt minst ï ligandmolekyl och minst 1 enzymmolekyl, 'aïvlâ líqanden ej utgör ett enzym. Q* 191oo42-6

10. Komposition enligt krav 9, k ä n n e t e c k n a d a v att liganden är en poly(aminosyra) och enzymet är en transferas.

11. Komposition enligt krav 9, k ä n n e t e c k n a d a v att líqanden är en poly(aminosyra) och enzymet en hydrolas.

12. Komposition k ä n n e t e c k n a d a v att den är anpassad för användning vid en metod enligt krav 1 och mfattar diskreta porösa fasta partiklar av en storlek i området 500 nm till 25 um i diameter vartill kovalent kon- jugerats i genomsnitt minst 1 antikroppmolekyl och minst 1 enzymmolekyl.

13. Användning av en sats vid en metod enligt krav 1, vilken saås omfattar i kombination i relativa mängder för i huvudsak opti~ merínq av känsligheten av analysen, ett partíkelkonjugat med en del av det speciíika bindningsparet konjugerad till diskreta; porösa, fasta partiklar och en del av det signalalstrande systemet valt ur den grupp som består av enzymer och fluoresce«: rande substanser konjugerad till en del av det specifika bind~ ningsparet för åstadkommande av ett signalmärksubstanskonjugatlf