JPS6224742B2 - - Google Patents
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Description
本発明はエストリオール―16α―グルクロナイ
ドの免疫学的測定用抗原およびその製造法に関す
るものである。さらに詳しくはエストリオール―
16α―グルクロナイドの特異抗血清を得るための
蛋白ハプテン結合抗原の新規合成法に関する。 エストリオールは卵胞ホルモンであるエストロ
ゲンの一種であり、遊離型（free）、蛋白結合型
（protein―bound）および結合型（conjugated）
が知られている。このうち遊離型は血中には存在
するが、尿中には通常出現せず、結合型、すなわ
ち主としてグルクロン酸抱合型として排せつされ
る。 近時、エストリオールグルクロナイドの生理的
意義が注目されるようになり、血中および尿中の
エストリオール―16α―グルクロナイドの簡便に
して、かつ正確な免疫学的測定法の出現が望まれ
ている。 従来、体液中のエストリオールは検体の中に含
まれる結合型エストリオールを塩酸加熱水解、ま
たはβ―グルクロニダーゼあるいはスルフアター
ゼの如き酵素を用いて水解し、遊離型エストリオ
ールとしたのち、抽出後、コーバー反応（Kober
reac.）を利用した比色法あるいは蛍光法あるい
は免疫測定法などを組合せて測定されてきた。 しかしながら、水解操作を必要とするこれらの
方法は操作で煩雑であり、かつ前述の遊離型、結
合型等の分画測定が不可能である等の欠点を有し
ている。 一方体液中の微量成分の測定法として注目され
つつあるラジオイムノアツセイは放射性核種で標
識したホルモンと、そのホルモンに対する抗体の
結合比が反応液中に加えられた抗原、すなわち非
標識ホルモンの量によつて変化することを利用し
た方法であり、感度が高く、多数検体の測定が可
能であることから臨床検査向きの方法として受け
とめられ、各種ホルモンはもとより、各種薬剤の
血中、尿中濃度を測定する方法として賞用される
に至つている。 このようにラジオイムノアツセイは、特に体液
中のホルモンの定量法として脚光をあびているが
その特異性については、議論の多いところであ
る。 すなわち、一般に体液中には測定対象物質と類
似の構造を有する物質が多数共存しているので、
測定に用いる抗体は測定対象物質とのみ反応する
もの、すなわち交叉反応性のない特異性の高いも
のが要求される。特定の測定対象物質との結合定
数が大で、かつ特異性の高い抗体を用意すること
が出来れば、その特定物質を測定するためのラジ
オイムノアツセイは、ほぼ完成されたことにな
る。 前述の如く、体液中のエストリオールを従来法
で測定する場合、一般的には水解操作が必要にな
るが、ラジオイムノアツセイにおいては、エスト
リオールグルクロナイドと特異的に結合する抗体
が用意されれば、水解操作が不要となり、簡便に
して、かつ高感度、特異的な測定法が誕生するこ
とになるので、今日ではエストリオールグルクロ
ナイドに限らず各種ステロイドホルモンの抱合体
を水解せずに免疫学的に測定するための特異抗体
の製造法、すなわち特異抗体を製造するための抗
原としてどのような物質を選択使用するかという
点に免疫学的測定法を完成させるための努力が傾
注されている。その一つの例として、エストリオ
ールグルクロナイドのグルクロン酸部分のカルボ
キシル基にBSAを結合させた、いわゆる蛋白―
ハプテン結合抗原が合成され、該抗原を用いて作
成された抗体を用いて、エストリオールグルクロ
ナイドを測定する方法が報告されているが、該抗
体は特異性が低く、遊離エストロゲンおよびエス
トラジオール―17―グルクロナイドに対して交叉
反応性を示すので満足出来る結果を与えていない
（P.Samarajeewa，et al：Biochemical Journal
151，369〜376，1975年）。 また、カルボキシフエニルアゾエストリオール
―16α―グルクロナイドのC2位またはC4位に
BSAを結合させた蛋白―ハプテン結合抗原の場
合、該抗原を用いて作製された抗体は、遊離エス
トロゲンに対し2.2％以下という比較的低い交叉
反応性を示し、改良された特異性を示したが、な
お不充分であり、この不充分な特異性はベンゾイ
ル基にBSAを結合させる際に、同時にグルクロ
ン酸部分のカルボン酸にもBSAが結合するため
であると推定されている（J.R.Soares et al：
FEBS Lett.61，263〜266，1976年）。 このような観点から、担体蛋白BSAをステロ
イドＤ環グルクロナイドのグルクロン酸部分のカ
ルボキシル基に結合させないようにすると同時
に、担体蛋白BSAをステロイドのＤ環から離れ
た位置にあるステロイドのＡ環に結合させた報告
がある（T.Nambara et al：J.Pharm.Dyn.１，
55〜61，1978年）。すなわち、ステロイドグルク
ロナイドのＡ環のC2またはC4位にBSAを結合さ
せるために２―アミノエストリオール―16α―
グルクロナイドとBSAをグルタールアルデヒド
で架橋させる方法、エストリオール―16α―グ
ルクロナイドとBSAをホルマリンの存在下、ア
ルカリ性で反応させて、いわゆるマンニツヒ反応
によりハプテン―BSA結合体を合成する方法お
よびｐ―アミノ安息香酸―BSAをジメチルホ
ルムアミド中でジアゾ化した後、エストリオール
―16α―グルクロナイドを反応させてハプテン―
BSA結合体を合成する方法が報告されている。 本発明において、発明者らはすでに公知となつ
ているエストリオール―16α―グルクロナイド―
BSA結合体を用いて作製された抗体よりもさら
に特異性の高い抗体を作製するためのハプテン―
BSA結合体を鋭意検索した結果、本発明を完成
するに至つたものである。 本発明はエストリオール―16α―グルクロナイ
ドのＤ環グルクロン酸部分にBSAが結合しない
ようにしながら、エストリオールグルクロナイド
のＢ環のC6位にBSAを結合させたハプテン―担
体蛋白結合体の合成法に関する。 本発明に基づいて合成された特許請求の範囲第
１項に記載されている物質、すなわち６―オキソ
エストリオール―16α―グルクロナイド―６―
（Ｏ―カルボキシメチル）オキシム―BSA結合体
を用いて作製された抗体は、すでに公知の方法で
得られたエストリオール―16α―グルクロナイド
―BSA結合体を用いて作製された抗体に比較し
て、ステロイドのＡ環、Ｄ環の認識性が優れてお
り、特異性においても、さらに向上することが明
りようとなり、本発明を完成するに至つたもので
ある。 本発明に基づいて作製された抗体はエストリオ
ール―16α―グルクロナイドのラジオイムノアツ
セイ用として特に好適であるが、ラジオイムノア
ツセイに限らず、羊赤血球またはラテツクスを担
体とする凝集反応および凝集阻止反応に用いるこ
とも可能である。 本発明は、特許請求の範囲第２項イ〜ヘに記載
した工程に基づいて、６―オキソエストリオール
―16α―グルクロナイド―６―（Ｏ―カルボキシ
メチル）オキシム―BSA結合体を合成する方法
に関するものであり、本発明のさらに加わつた特
徴の一つとしてエストリオールグルクロナイドの
グルクロン酸部分の保護基を脱離させる工程、す
なわち特許請求の範囲第２項ヘにおいて、エスト
リオール骨格のC6位におけるＯ―カルボキシメ
チルオキシムとBSAの結合の解離が極めて低く
抑えられた形でグルクロナイドアセテートメチル
エステルの加水分解を完全に進行させることが可
能であること、およびグルクロナイド部分の保護
基を特許請求の範囲第２項ヘに記載した合成工程
の最終段階で脱離させるところにある。 本発明に基づく新規ステロイド化合物は下記の
構成、すなわちイ化学構造式 で示される６―オキソエストリオールを無水炭酸
カリウムの存在下、塩化ベンジルと反応させ６―
オキソエストリオール―３―ベンジルエーテル
（）とする工程、 ロ 化学構造式 で示される６―オキソエストリオール―３―ベン
ジルエーテルとメチル―１―ブロモ―１―デオキ
シ―２，３，４―トリ―Ｏ―アセチル―α―Ｄ―
グルコピラノウロネートを反応させ６―オキソエ
ストリオール―３―ベンジルエーテル―16α―グ
ルクロナイドアセテートメチルエステル（）と
する工程、 ハ 化学構造式 （式中G′は で示されるグルクロニル基を表わす）で示される
６―オキソエストリオール―３―ベンジルエーテ
ル―16α―グルクロナイドアセテートメチルエス
テルを還元して６―オキソエストリオール―16α
―グルクロナイドアセテートメチルエステル
（）とする工程、 ニ 化学構造式 で示される６―オキソエストリオール―16α―グ
ルクロナイドアセテートメチルエステルを酢酸ナ
トリウムの存在下、Ｏ―カルボキシメチルヒドロ
キシルアミン塩酸塩と反応させ、６―オキソエス
トリオール―16α―グルクロナイドアセテートメ
チルエステル―６―（Ｏ―カルボキシメチル）オ
キシム（）とする工程、 ホ 化学構造式 で示される６―オキソエストリオール―16α―グ
ルクロナイドアセテートメチルエステル―６―
（Ｏ―カルボキシメチル）オキシムをBSAと反応
させ６―オキソエストリオール―16α―グルクロ
ナイドアセテートメチルエステル―６―（Ｏ―カ
ルボキシメチル）オキシム―BSA結合体（）
とする工程、 ヘ 化学構造式 で示される６―オキソエストリオール―16α―グ
ルクロナイドアセテートメチルエステル―６―
（Ｏ―カルボキシメチル）オキシム―BSA結合体
を部分的に加水分解する工程、以上のイ，ロ，
ハ，ニ，ホ，ヘの各工程を組み合せることによつ
て製造されるものである。 次に本発明の実施例を示す。 実施例 １ 化学構造式（）で示される市販の化合物、６
―オキソエストリオール812mgを無水エタノール
40mlに溶解し、これに無水炭酸カリウム1.8ｇお
よび塩化ベンジル1.6mlを加え４時間加熱還流
後、反応液をロ過し、ロ液を減圧濃縮後、残留物
を酢酸エチルより再結晶すると、化合物（）
866mgが白色針状結晶として得られた。 白色針状結晶性化合物（）の分析値 m.p. 187〜189℃ 〔α〕１２ Ｄ ＋15.9゜（Ｃ＝0.09，CHCl3） 元素分析値 Ｃ：76.45，Ｈ：7.25 化学式C25H28O4に対する計算値 Ｃ：76.50，Ｈ：7.19 NMR（CDCl3） 0.81（3H，Ｓ，18―CH3） 3.60（1H，ｄ，Ｊ＝６Hz，17α―Ｈ） 4.10（1H，ｍ，16β―Ｈ） 5.09（2H，Ｓ，３―OCＨ 2C6H5） 7.0〜7.7（8H，m.aromatic Ｈ） 白色針状結晶性化合物（）1.7ｇをベンゼン
76mlに溶解し、炭酸銀1.6ｇを加え脱水後、メチ
ル―１―ブロモ―１―デオキシ―２，３，４―ト
リ―Ｏ―アセチル―α―Ｄ―グルコピラノウロネ
ート２ｇを加えて4.5時間還流後、触媒をロ去
し、ロ液を濃縮後、残留物をシリカゲルのカラム
クロマトグラフイーに付し、ベンゼン／エーテル
（１：１）で溶出後、塩化メチレン／メタノール
より再結晶すると化合物（）180mgが無色針状
結晶として得られた。無色針状結晶性化合物
（）の分析値 m.p. 266〜268℃ 〔α〕１２ Ｄ −13.0゜（Ｃ＝0.12，CHCl3） 元素分析値 Ｃ：64.38，Ｈ：6.10 化学式C38H44O13に対する計算値 Ｃ：64.40，Ｈ：6.26 NMR（CDCl3） 0.81（3H，Ｓ，18―CH3） 2.02（3H，Ｓ，2′―，3′―，4′―OCOCH3） 2.05（3H，Ｓ，2′―，3′―，4′―OCOCH3） 2.06（3H，Ｓ，2′―，3′―，4′―OCOCH3） 3.77（3H，Ｓ，―COOCH3） 4.10（1H，ｍ，5′―Ｈ） 4.58（1H，ｄ，Ｊ＝７Hz，1′―Ｈ） 4.9〜5.40（3H，ｍ，2′―，3′―，4′―Ｈ） 5.08（2H，Ｓ，３―OCH2C6H5） 7.0〜7.7（8H，ｍ，aromatic Ｈ） 無色針状結晶性化合物（）110mgをメタノー
ル60mlに溶解し、５％パラジウム炭200mgを加え
て水素ガス気流中、常温で４時間撹拌後、触媒を
ロ去しロ液を濃縮後、塩化メチレン／メタノール
から再結晶すると化合物（）77mgが無色針状結
晶として得られた。 無色針状結晶性化合物（）の分析値 m.p. 240℃ 〔α〕１２ Ｄ −15.0゜（Ｃ＝0.10，CHCl3） 元素分析値 Ｃ：59.91，Ｈ：6.11 化学式C31H38O13に対する計算値 Ｃ：60.19，Ｈ：6.19 NMR（CDCl3） 0.81（3H，Ｓ，18―CH3） 2.03（3H，Ｓ，2′―，3′―，4′―OCOCH3） 2.05（3H，Ｓ，2′―，3′―，4′―OCOCH3） 2.07（3H，Ｓ，2′―，3′―，4′―OCOCH3） 3.77（3H，Ｓ，―COOCH3） 4.09（1H，ｄ，Ｊ＝10Hz，5′―Ｈ） 4.58（1H，ｄ，Ｊ＝７Hz，1′―Ｈ） 4.90〜5.30（3H，ｍ，2′―，3′―，4′―Ｈ） 7.04（1H，dd，Ｊ＝８，３Hz，２―Ｈ） 7.30（1H，ｄ，Ｊ＝８Hz，１―Ｈ） 7.48（1H，ｄ，Ｊ＝３Hz，４―Ｈ） 無色針状結晶性化合物（）51mgをメタノール
８mlに溶解し、Ｏ―カルボキシメチルヒドロキシ
ルアミン塩酸塩122mgおよび12％酢酸ナトリウム
1.0mlを加え35℃にて3.5時間撹拌後、反応液に水
を加え酢酸エチルで抽出後、溶媒を留去し、油状
物として残渣（）を得る。 油状物質（）のNMR（CD3OD―CDCl3） 0.77（3H，Ｓ，18―CH3） 2.03（3H，Ｓ，2′―，3′―，4′―OCOCH3） 2.05（3H，Ｓ，2′―，3′―，4′―OCOCH3） 2.09（3H，Ｓ，2′―，3′―，4′―OCOCH3） 3.67（1H，ｄ，Ｊ＝５Hz，17α―Ｈ） 3.77（3H，Ｓ，―COOCH3） 4.10（1H，ｄ，Ｊ＝10Hz，5′―Ｈ） 4.65（1H，ｄ，Ｊ＝７Hz，1′―Ｈ） 4.68（2H，Ｓ，＝NOCH2―） 4.90〜5.50（3H，ｍ，2′―，3′―，4′―Ｈ） 6.82（1H，dd，Ｊ＝８，２Hz，２―Ｈ） 7.15（1H，ｄ，Ｊ＝８Hz，１―Ｈ） 7.34（1H，ｄ，Ｊ＝２Hz，４―Ｈ） 油状物質（）50mgをジメチルホルムアミド
1.5mlに溶解し氷冷下、トリ―ｎ―ブチルアミン
50μｌおよびイソブチルクロロフオルメート12.5
μｌを加えてから30分後、氷冷下にてBSA125mg
の含水ジメチルホルムアミドのアルカリ溶液
（H2O：DMF：1N NaOH＝３ml：2.25ml：0.125
ml）に加え、PH7.0〜7.5で一夜撹拌し、得られた
反応液を冷水にて24時間透析後、凍結乾燥に付し
ハプテンBSA結合体（）164mgを得た。 該ハプテンBSA結合体（）163mgを水24mlに
溶解し、5N―NaOH（0.08ml）を加えPH12.0〜
12.5に調整した液を25℃で12時間撹拌する。 次に0.05MM Na NaHCO3で24時間、水で24時
間透析後、凍結乾燥し、化合物（）124mgを得
た。 化合物（）、すなわち６―オキソエストリオ
ール―16α―グルクロナイド―６―（Ｏ―カルボ
キシメチル）オキシム―BSA結合体のBSA1モル
あたりのハプテン結合モル数をUV法により求め
たところ16モルであつた。 実施例 ２ 抗体の作製 体重2.5〜3.0Kgの在来種白色雄ウサギ３羽に６
―オキソエストリオール―16α―グルクロナイド
６―（Ｏ―カルボキシメチル）オキシム―BSA
結合体を抗原とすることにより、以下の如く免疫
した。 すなわち抗原２mgを滅菌等張食塩溶液0.5mlに
溶解させ、これをフロイント・コンプリート・ア
ジユバンド0.5mlにてエマルジヨンにし、このエ
マルジヨンをウサギの肩甲部および足蹠数ケ所に
皮下投与した。以後２ケ月にわたつて２週間毎に
同様の投与を繰返し、さらに１ケ月の間隔を置い
て同様の投与を行つた。 最後の投与（第５回目の投与）から１週間後に
このウサギの耳静脈から10mlを採取し、これを
3000回転、10分間の遠心分離にかけ、得られた抗
血清を−20℃にて保存した。 使用時においては、上記抗血清を解凍し、
BSA0.06％、牛―γ―グロブリン0.05％を含む
0.05Mホウ酸緩衝液（PH8.0）で１：3000の希釈
率で希釈し標準曲線を作製した。 測定操作 エストリオール―16α―グルクロナイドを含む
試料にエストリオール―16α―グルクロナイド―
６，７，―3H（約7500dpm）および抗血清0.25ml
を添加し、４℃で１時間孵置する。次いで50％硫
酸アンモニア溶液0.25mlを添加し、４℃に20分間
放置後、3000回転で15分間遠心し、得られた上澄
液0.2mlをとり、放射活性を計測する。 交叉反応性について ６―オキソエストリオール―16α―グルクロナ
イド６―（Ｏ―カルボキシメチル）オキシム―
BSA結合体で免疫したウサギから得られた前述
の抗血清の特異性を32種のステロイドを用いて、
その交叉反応性を、エストリオール―16α―グル
クロナイド―3Hの本抗血清への結合量を半減さ
せるのに必要な各種ステロイドの量を標準曲線よ
り求めることによつて調べた結果を第１表に示
す。 第１表の交叉反応の欄における数値は、非標識
エストリオール―16α―グルクロナイドの50％阻
止量を100とし、これに対する各種ステロイドの
読みの比率の逆数を百分率で表示したものであ
る。
ドの免疫学的測定用抗原およびその製造法に関す
るものである。さらに詳しくはエストリオール―
16α―グルクロナイドの特異抗血清を得るための
蛋白ハプテン結合抗原の新規合成法に関する。 エストリオールは卵胞ホルモンであるエストロ
ゲンの一種であり、遊離型（free）、蛋白結合型
（protein―bound）および結合型（conjugated）
が知られている。このうち遊離型は血中には存在
するが、尿中には通常出現せず、結合型、すなわ
ち主としてグルクロン酸抱合型として排せつされ
る。 近時、エストリオールグルクロナイドの生理的
意義が注目されるようになり、血中および尿中の
エストリオール―16α―グルクロナイドの簡便に
して、かつ正確な免疫学的測定法の出現が望まれ
ている。 従来、体液中のエストリオールは検体の中に含
まれる結合型エストリオールを塩酸加熱水解、ま
たはβ―グルクロニダーゼあるいはスルフアター
ゼの如き酵素を用いて水解し、遊離型エストリオ
ールとしたのち、抽出後、コーバー反応（Kober
reac.）を利用した比色法あるいは蛍光法あるい
は免疫測定法などを組合せて測定されてきた。 しかしながら、水解操作を必要とするこれらの
方法は操作で煩雑であり、かつ前述の遊離型、結
合型等の分画測定が不可能である等の欠点を有し
ている。 一方体液中の微量成分の測定法として注目され
つつあるラジオイムノアツセイは放射性核種で標
識したホルモンと、そのホルモンに対する抗体の
結合比が反応液中に加えられた抗原、すなわち非
標識ホルモンの量によつて変化することを利用し
た方法であり、感度が高く、多数検体の測定が可
能であることから臨床検査向きの方法として受け
とめられ、各種ホルモンはもとより、各種薬剤の
血中、尿中濃度を測定する方法として賞用される
に至つている。 このようにラジオイムノアツセイは、特に体液
中のホルモンの定量法として脚光をあびているが
その特異性については、議論の多いところであ
る。 すなわち、一般に体液中には測定対象物質と類
似の構造を有する物質が多数共存しているので、
測定に用いる抗体は測定対象物質とのみ反応する
もの、すなわち交叉反応性のない特異性の高いも
のが要求される。特定の測定対象物質との結合定
数が大で、かつ特異性の高い抗体を用意すること
が出来れば、その特定物質を測定するためのラジ
オイムノアツセイは、ほぼ完成されたことにな
る。 前述の如く、体液中のエストリオールを従来法
で測定する場合、一般的には水解操作が必要にな
るが、ラジオイムノアツセイにおいては、エスト
リオールグルクロナイドと特異的に結合する抗体
が用意されれば、水解操作が不要となり、簡便に
して、かつ高感度、特異的な測定法が誕生するこ
とになるので、今日ではエストリオールグルクロ
ナイドに限らず各種ステロイドホルモンの抱合体
を水解せずに免疫学的に測定するための特異抗体
の製造法、すなわち特異抗体を製造するための抗
原としてどのような物質を選択使用するかという
点に免疫学的測定法を完成させるための努力が傾
注されている。その一つの例として、エストリオ
ールグルクロナイドのグルクロン酸部分のカルボ
キシル基にBSAを結合させた、いわゆる蛋白―
ハプテン結合抗原が合成され、該抗原を用いて作
成された抗体を用いて、エストリオールグルクロ
ナイドを測定する方法が報告されているが、該抗
体は特異性が低く、遊離エストロゲンおよびエス
トラジオール―17―グルクロナイドに対して交叉
反応性を示すので満足出来る結果を与えていない
（P.Samarajeewa，et al：Biochemical Journal
151，369〜376，1975年）。 また、カルボキシフエニルアゾエストリオール
―16α―グルクロナイドのC2位またはC4位に
BSAを結合させた蛋白―ハプテン結合抗原の場
合、該抗原を用いて作製された抗体は、遊離エス
トロゲンに対し2.2％以下という比較的低い交叉
反応性を示し、改良された特異性を示したが、な
お不充分であり、この不充分な特異性はベンゾイ
ル基にBSAを結合させる際に、同時にグルクロ
ン酸部分のカルボン酸にもBSAが結合するため
であると推定されている（J.R.Soares et al：
FEBS Lett.61，263〜266，1976年）。 このような観点から、担体蛋白BSAをステロ
イドＤ環グルクロナイドのグルクロン酸部分のカ
ルボキシル基に結合させないようにすると同時
に、担体蛋白BSAをステロイドのＤ環から離れ
た位置にあるステロイドのＡ環に結合させた報告
がある（T.Nambara et al：J.Pharm.Dyn.１，
55〜61，1978年）。すなわち、ステロイドグルク
ロナイドのＡ環のC2またはC4位にBSAを結合さ
せるために２―アミノエストリオール―16α―
グルクロナイドとBSAをグルタールアルデヒド
で架橋させる方法、エストリオール―16α―グ
ルクロナイドとBSAをホルマリンの存在下、ア
ルカリ性で反応させて、いわゆるマンニツヒ反応
によりハプテン―BSA結合体を合成する方法お
よびｐ―アミノ安息香酸―BSAをジメチルホ
ルムアミド中でジアゾ化した後、エストリオール
―16α―グルクロナイドを反応させてハプテン―
BSA結合体を合成する方法が報告されている。 本発明において、発明者らはすでに公知となつ
ているエストリオール―16α―グルクロナイド―
BSA結合体を用いて作製された抗体よりもさら
に特異性の高い抗体を作製するためのハプテン―
BSA結合体を鋭意検索した結果、本発明を完成
するに至つたものである。 本発明はエストリオール―16α―グルクロナイ
ドのＤ環グルクロン酸部分にBSAが結合しない
ようにしながら、エストリオールグルクロナイド
のＢ環のC6位にBSAを結合させたハプテン―担
体蛋白結合体の合成法に関する。 本発明に基づいて合成された特許請求の範囲第
１項に記載されている物質、すなわち６―オキソ
エストリオール―16α―グルクロナイド―６―
（Ｏ―カルボキシメチル）オキシム―BSA結合体
を用いて作製された抗体は、すでに公知の方法で
得られたエストリオール―16α―グルクロナイド
―BSA結合体を用いて作製された抗体に比較し
て、ステロイドのＡ環、Ｄ環の認識性が優れてお
り、特異性においても、さらに向上することが明
りようとなり、本発明を完成するに至つたもので
ある。 本発明に基づいて作製された抗体はエストリオ
ール―16α―グルクロナイドのラジオイムノアツ
セイ用として特に好適であるが、ラジオイムノア
ツセイに限らず、羊赤血球またはラテツクスを担
体とする凝集反応および凝集阻止反応に用いるこ
とも可能である。 本発明は、特許請求の範囲第２項イ〜ヘに記載
した工程に基づいて、６―オキソエストリオール
―16α―グルクロナイド―６―（Ｏ―カルボキシ
メチル）オキシム―BSA結合体を合成する方法
に関するものであり、本発明のさらに加わつた特
徴の一つとしてエストリオールグルクロナイドの
グルクロン酸部分の保護基を脱離させる工程、す
なわち特許請求の範囲第２項ヘにおいて、エスト
リオール骨格のC6位におけるＯ―カルボキシメ
チルオキシムとBSAの結合の解離が極めて低く
抑えられた形でグルクロナイドアセテートメチル
エステルの加水分解を完全に進行させることが可
能であること、およびグルクロナイド部分の保護
基を特許請求の範囲第２項ヘに記載した合成工程
の最終段階で脱離させるところにある。 本発明に基づく新規ステロイド化合物は下記の
構成、すなわちイ化学構造式 で示される６―オキソエストリオールを無水炭酸
カリウムの存在下、塩化ベンジルと反応させ６―
オキソエストリオール―３―ベンジルエーテル
（）とする工程、 ロ 化学構造式 で示される６―オキソエストリオール―３―ベン
ジルエーテルとメチル―１―ブロモ―１―デオキ
シ―２，３，４―トリ―Ｏ―アセチル―α―Ｄ―
グルコピラノウロネートを反応させ６―オキソエ
ストリオール―３―ベンジルエーテル―16α―グ
ルクロナイドアセテートメチルエステル（）と
する工程、 ハ 化学構造式 （式中G′は で示されるグルクロニル基を表わす）で示される
６―オキソエストリオール―３―ベンジルエーテ
ル―16α―グルクロナイドアセテートメチルエス
テルを還元して６―オキソエストリオール―16α
―グルクロナイドアセテートメチルエステル
（）とする工程、 ニ 化学構造式 で示される６―オキソエストリオール―16α―グ
ルクロナイドアセテートメチルエステルを酢酸ナ
トリウムの存在下、Ｏ―カルボキシメチルヒドロ
キシルアミン塩酸塩と反応させ、６―オキソエス
トリオール―16α―グルクロナイドアセテートメ
チルエステル―６―（Ｏ―カルボキシメチル）オ
キシム（）とする工程、 ホ 化学構造式 で示される６―オキソエストリオール―16α―グ
ルクロナイドアセテートメチルエステル―６―
（Ｏ―カルボキシメチル）オキシムをBSAと反応
させ６―オキソエストリオール―16α―グルクロ
ナイドアセテートメチルエステル―６―（Ｏ―カ
ルボキシメチル）オキシム―BSA結合体（）
とする工程、 ヘ 化学構造式 で示される６―オキソエストリオール―16α―グ
ルクロナイドアセテートメチルエステル―６―
（Ｏ―カルボキシメチル）オキシム―BSA結合体
を部分的に加水分解する工程、以上のイ，ロ，
ハ，ニ，ホ，ヘの各工程を組み合せることによつ
て製造されるものである。 次に本発明の実施例を示す。 実施例 １ 化学構造式（）で示される市販の化合物、６
―オキソエストリオール812mgを無水エタノール
40mlに溶解し、これに無水炭酸カリウム1.8ｇお
よび塩化ベンジル1.6mlを加え４時間加熱還流
後、反応液をロ過し、ロ液を減圧濃縮後、残留物
を酢酸エチルより再結晶すると、化合物（）
866mgが白色針状結晶として得られた。 白色針状結晶性化合物（）の分析値 m.p. 187〜189℃ 〔α〕１２ Ｄ ＋15.9゜（Ｃ＝0.09，CHCl3） 元素分析値 Ｃ：76.45，Ｈ：7.25 化学式C25H28O4に対する計算値 Ｃ：76.50，Ｈ：7.19 NMR（CDCl3） 0.81（3H，Ｓ，18―CH3） 3.60（1H，ｄ，Ｊ＝６Hz，17α―Ｈ） 4.10（1H，ｍ，16β―Ｈ） 5.09（2H，Ｓ，３―OCＨ 2C6H5） 7.0〜7.7（8H，m.aromatic Ｈ） 白色針状結晶性化合物（）1.7ｇをベンゼン
76mlに溶解し、炭酸銀1.6ｇを加え脱水後、メチ
ル―１―ブロモ―１―デオキシ―２，３，４―ト
リ―Ｏ―アセチル―α―Ｄ―グルコピラノウロネ
ート２ｇを加えて4.5時間還流後、触媒をロ去
し、ロ液を濃縮後、残留物をシリカゲルのカラム
クロマトグラフイーに付し、ベンゼン／エーテル
（１：１）で溶出後、塩化メチレン／メタノール
より再結晶すると化合物（）180mgが無色針状
結晶として得られた。無色針状結晶性化合物
（）の分析値 m.p. 266〜268℃ 〔α〕１２ Ｄ −13.0゜（Ｃ＝0.12，CHCl3） 元素分析値 Ｃ：64.38，Ｈ：6.10 化学式C38H44O13に対する計算値 Ｃ：64.40，Ｈ：6.26 NMR（CDCl3） 0.81（3H，Ｓ，18―CH3） 2.02（3H，Ｓ，2′―，3′―，4′―OCOCH3） 2.05（3H，Ｓ，2′―，3′―，4′―OCOCH3） 2.06（3H，Ｓ，2′―，3′―，4′―OCOCH3） 3.77（3H，Ｓ，―COOCH3） 4.10（1H，ｍ，5′―Ｈ） 4.58（1H，ｄ，Ｊ＝７Hz，1′―Ｈ） 4.9〜5.40（3H，ｍ，2′―，3′―，4′―Ｈ） 5.08（2H，Ｓ，３―OCH2C6H5） 7.0〜7.7（8H，ｍ，aromatic Ｈ） 無色針状結晶性化合物（）110mgをメタノー
ル60mlに溶解し、５％パラジウム炭200mgを加え
て水素ガス気流中、常温で４時間撹拌後、触媒を
ロ去しロ液を濃縮後、塩化メチレン／メタノール
から再結晶すると化合物（）77mgが無色針状結
晶として得られた。 無色針状結晶性化合物（）の分析値 m.p. 240℃ 〔α〕１２ Ｄ −15.0゜（Ｃ＝0.10，CHCl3） 元素分析値 Ｃ：59.91，Ｈ：6.11 化学式C31H38O13に対する計算値 Ｃ：60.19，Ｈ：6.19 NMR（CDCl3） 0.81（3H，Ｓ，18―CH3） 2.03（3H，Ｓ，2′―，3′―，4′―OCOCH3） 2.05（3H，Ｓ，2′―，3′―，4′―OCOCH3） 2.07（3H，Ｓ，2′―，3′―，4′―OCOCH3） 3.77（3H，Ｓ，―COOCH3） 4.09（1H，ｄ，Ｊ＝10Hz，5′―Ｈ） 4.58（1H，ｄ，Ｊ＝７Hz，1′―Ｈ） 4.90〜5.30（3H，ｍ，2′―，3′―，4′―Ｈ） 7.04（1H，dd，Ｊ＝８，３Hz，２―Ｈ） 7.30（1H，ｄ，Ｊ＝８Hz，１―Ｈ） 7.48（1H，ｄ，Ｊ＝３Hz，４―Ｈ） 無色針状結晶性化合物（）51mgをメタノール
８mlに溶解し、Ｏ―カルボキシメチルヒドロキシ
ルアミン塩酸塩122mgおよび12％酢酸ナトリウム
1.0mlを加え35℃にて3.5時間撹拌後、反応液に水
を加え酢酸エチルで抽出後、溶媒を留去し、油状
物として残渣（）を得る。 油状物質（）のNMR（CD3OD―CDCl3） 0.77（3H，Ｓ，18―CH3） 2.03（3H，Ｓ，2′―，3′―，4′―OCOCH3） 2.05（3H，Ｓ，2′―，3′―，4′―OCOCH3） 2.09（3H，Ｓ，2′―，3′―，4′―OCOCH3） 3.67（1H，ｄ，Ｊ＝５Hz，17α―Ｈ） 3.77（3H，Ｓ，―COOCH3） 4.10（1H，ｄ，Ｊ＝10Hz，5′―Ｈ） 4.65（1H，ｄ，Ｊ＝７Hz，1′―Ｈ） 4.68（2H，Ｓ，＝NOCH2―） 4.90〜5.50（3H，ｍ，2′―，3′―，4′―Ｈ） 6.82（1H，dd，Ｊ＝８，２Hz，２―Ｈ） 7.15（1H，ｄ，Ｊ＝８Hz，１―Ｈ） 7.34（1H，ｄ，Ｊ＝２Hz，４―Ｈ） 油状物質（）50mgをジメチルホルムアミド
1.5mlに溶解し氷冷下、トリ―ｎ―ブチルアミン
50μｌおよびイソブチルクロロフオルメート12.5
μｌを加えてから30分後、氷冷下にてBSA125mg
の含水ジメチルホルムアミドのアルカリ溶液
（H2O：DMF：1N NaOH＝３ml：2.25ml：0.125
ml）に加え、PH7.0〜7.5で一夜撹拌し、得られた
反応液を冷水にて24時間透析後、凍結乾燥に付し
ハプテンBSA結合体（）164mgを得た。 該ハプテンBSA結合体（）163mgを水24mlに
溶解し、5N―NaOH（0.08ml）を加えPH12.0〜
12.5に調整した液を25℃で12時間撹拌する。 次に0.05MM Na NaHCO3で24時間、水で24時
間透析後、凍結乾燥し、化合物（）124mgを得
た。 化合物（）、すなわち６―オキソエストリオ
ール―16α―グルクロナイド―６―（Ｏ―カルボ
キシメチル）オキシム―BSA結合体のBSA1モル
あたりのハプテン結合モル数をUV法により求め
たところ16モルであつた。 実施例 ２ 抗体の作製 体重2.5〜3.0Kgの在来種白色雄ウサギ３羽に６
―オキソエストリオール―16α―グルクロナイド
６―（Ｏ―カルボキシメチル）オキシム―BSA
結合体を抗原とすることにより、以下の如く免疫
した。 すなわち抗原２mgを滅菌等張食塩溶液0.5mlに
溶解させ、これをフロイント・コンプリート・ア
ジユバンド0.5mlにてエマルジヨンにし、このエ
マルジヨンをウサギの肩甲部および足蹠数ケ所に
皮下投与した。以後２ケ月にわたつて２週間毎に
同様の投与を繰返し、さらに１ケ月の間隔を置い
て同様の投与を行つた。 最後の投与（第５回目の投与）から１週間後に
このウサギの耳静脈から10mlを採取し、これを
3000回転、10分間の遠心分離にかけ、得られた抗
血清を−20℃にて保存した。 使用時においては、上記抗血清を解凍し、
BSA0.06％、牛―γ―グロブリン0.05％を含む
0.05Mホウ酸緩衝液（PH8.0）で１：3000の希釈
率で希釈し標準曲線を作製した。 測定操作 エストリオール―16α―グルクロナイドを含む
試料にエストリオール―16α―グルクロナイド―
６，７，―3H（約7500dpm）および抗血清0.25ml
を添加し、４℃で１時間孵置する。次いで50％硫
酸アンモニア溶液0.25mlを添加し、４℃に20分間
放置後、3000回転で15分間遠心し、得られた上澄
液0.2mlをとり、放射活性を計測する。 交叉反応性について ６―オキソエストリオール―16α―グルクロナ
イド６―（Ｏ―カルボキシメチル）オキシム―
BSA結合体で免疫したウサギから得られた前述
の抗血清の特異性を32種のステロイドを用いて、
その交叉反応性を、エストリオール―16α―グル
クロナイド―3Hの本抗血清への結合量を半減さ
せるのに必要な各種ステロイドの量を標準曲線よ
り求めることによつて調べた結果を第１表に示
す。 第１表の交叉反応の欄における数値は、非標識
エストリオール―16α―グルクロナイドの50％阻
止量を100とし、これに対する各種ステロイドの
読みの比率の逆数を百分率で表示したものであ
る。
【表】
第１表の結果より、本発明の新規化合物を利用
した抗原による抗体を使用したもののエストロゲ
ンに対する特異性が他のものに比較してきわめて
高く、交叉反応が低く抑えられていることが明り
ようである。
した抗原による抗体を使用したもののエストロゲ
ンに対する特異性が他のものに比較してきわめて
高く、交叉反応が低く抑えられていることが明り
ようである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 化学構造式 で示される６―オキソエストリオール―16α―グ
ルクロナイド―６―（ｏ―カルボキシメチル）オ
キシム―BSA結合体（式中―NH―BSAは牛血清
アルブミン残基を表わし、Ｇは で示されるグルクロニル基を表わす、以下同様） から成るエストリオール―16α―グルクロナイド
測定用抗原。 ２ イ 化学構造式 で示される６―オキソエストリオールを無水炭酸
カリウムの存在下、塩化ベンジルと反応させ６―
オキソエストリオール―３―ベンジルエーテル
（）とする工程、 ロ 化学構造式 で示される６―オキソエストリオール―３―ベン
ジルエーテルとメチル―１―ブロモ―１―デオキ
シ―２，３，４―トリ―ｏ―アセチル―α―Ｄ―
グルコピラノウロネートを反応させ６―オキソエ
ストリオール―３―ベンジルエーテル―16α―グ
ルクロナイドアセテートメチルエステル（） とする工程、 ハ 化学構造式 （式中G′は で示されるグルクロニル基を表わす、以下同様） で示される６―オキソエストリオール―３―ベン
ジルエーテル―16α―グルクロナイドアセテート
メチルエステルを還元して、６―オキソエストリ
オール―16α―グルクロナイドアセテートメチル
エステル（）とする工程、 ニ 化学構造式 で示される６―オキソエストリオール―16α―グ
ルクロナイドアセテートメチルエステルを酢酸ナ
トリウムの存在下、ｏ―カルボキシメチルヒドド
ロキシルアミン塩酸塩と反応させ６―オキソエス
トリオール―16α―グルクロナイドアセテートメ
チルエステル―６―（ｏ―カルボキシメチル）オ
キシム（）とする工程、 ホ 化学構造式 で示される６―オキソエストリオール―16α―グ
ルクロナイドアセテートメチルエステル―６―
（ｏ―カルボキシメチル）オキシムを牛血清アル
ブミン（以下、BSAと略称す）と反応させ６―
オキソエストリオール―16α―グルクロナイドア
セテートメチルエステル―６―（ｏ―カルボキシ
メチル）オキシム―BSA結合体（）とする工
程、 ヘ 化学構造式 で示される６―オキソエストリオール―16α―グ
ルクロナイドアセテートメチルエステル―６―
（ｏ―カルボキシメチル）オキシム―BSA結合体
を部分的に加水分解することを特徴とする化学構
造式 で示される６―オキソエストリオール―16α―グ
ルクロナイド―６―（ｏ―カルボキシメチル）オ
キシム―BSA結合体の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56130180A JPS5833162A (ja) | 1981-08-21 | 1981-08-21 | エストリオ−ル−１６α−グルクロナイド測定用抗原およびその製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56130180A JPS5833162A (ja) | 1981-08-21 | 1981-08-21 | エストリオ−ル−１６α−グルクロナイド測定用抗原およびその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5833162A JPS5833162A (ja) | 1983-02-26 |
| JPS6224742B2 true JPS6224742B2 (ja) | 1987-05-29 |
Family
ID=15027962
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56130180A Granted JPS5833162A (ja) | 1981-08-21 | 1981-08-21 | エストリオ−ル−１６α−グルクロナイド測定用抗原およびその製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5833162A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6338824U (ja) * | 1986-08-29 | 1988-03-12 | ||
| JPH07308226A (ja) * | 1993-12-06 | 1995-11-28 | Weitech Dewert Gmbh | 偏平昇降エレメント |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5854009A (en) * | 1995-09-19 | 1998-12-29 | Immuna Care Corporation | Method of detecting estrogen-sensitive pathologies |
| EP1625854B1 (en) * | 2004-08-09 | 2008-10-15 | Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts | Albumin conjugates containing a glucuronic linker |
-
1981
- 1981-08-21 JP JP56130180A patent/JPS5833162A/ja active Granted
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6338824U (ja) * | 1986-08-29 | 1988-03-12 | ||
| JPH07308226A (ja) * | 1993-12-06 | 1995-11-28 | Weitech Dewert Gmbh | 偏平昇降エレメント |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5833162A (ja) | 1983-02-26 |
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