JPH01116450A - 新規ステロイド化合物、該化合物の製造方法、および該化合物の使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、新規ステロイド化合物、その製造方法、およ
び前記新規ステロイド化合物を利用して体液中のエスト
ロゲン代謝産物である３種類のエストロゲン−３−グル
クロナイドを同時に測定することからなる前記新規ステ
ロイド化合物の使用方法に関するものである。

［従来の技術］ エストロゲンホルモンは、卵胞ホルモンであるエストロ
ン（以下Ｅ１と略す）、エストラジオール（以下Ｅ２と
略す）、およびエストリオール（以下Ｅ３と略す）の総
称であり、これらは主として女性の卵胞で産生されるも
ので、特に、排卵前の体液中にはエストロゲンホルモン
およびその代謝産物の増加現象が存することから、女性
の卵巣機能や胎児機能、特に卵胞発育の状態を知る手が
かりとしたり、また、排卵期の予測を行なったり、更に
は、不妊症治療のための指針をたてたりするために、体
液中のエストロゲンホルモンおよびその代謝産物の量の
測定が行なわれている。

しかして、前記体液中のエストロゲンホルモンおよびそ
の代謝産物の量の測定には、かってはコーバー反応（に
ｏｂｅｒ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）を利用した比色法または
蛍光法が利用されていたが、最近では、抗原抗体反応を
利用した免疫学的測定法が用いられている。

前記抗原抗体反応を利用した免疫学的測定法は、１９５
９年に、ＢｅｒｓｏｎとＹａｌｏｗによって開発された
ラジオイムノアッセイ法に始まり、その後エンザイムイ
ムノアッセイ法や、ラテックス凝集阻止性等様々な測定
法が開発されてきており、目的とする抗原に対する抗体
の高い特異性が存することによって高度の測定感度が得
られるため、臨床検査の分野で幅広く利用されているの
が実情である。

一般に免疫学的測定法においては、用いる抗体の特異性
が大きな意味を持っており、抗体の特異性が低い場合に
は、非特異的に目的とする被測定物質以外の物質とも抗
体が反応してしまうため、測定値の信頼性が損なわれて
しまう。

そこで抗体の特異性を向上させるために様々な試みが行
なわれており、例えば、高分子物質の免疫学的測定法に
おけるモノクローナル抗体の利用はその代表的な例であ
る。

ところで、エストロゲンのような分子量の小さい物質は
、ハブテンと呼ばれ、そのまま免疫用動物に免疫しても
、生体内では異物として認識されず、抗体が産生されな
いので、免疫用担体と呼ばれる免疫用動物とは異なる動
物から得た高分子物質とハブテンの誘導体とを化学的に
結合させることによって得られた、いわゆる合成多価抗
原を免疫用動物に免疫して抗体を得ている。この合成多
価抗原を免疫用動物に免疫して得られた抗体は、前述の
免疫用担体とハブテンとの結合方法、および免疫用担体
とハブテンとの結合位置等によって、得られる抗体の特
異性が大きく異なってくるために、個々のハブテン抗原
について様々な検討が試みられた。その結果、例えば特
公昭６２−２３８２１号に記載されている抗エストラジ
オールー１７βグルクロナイド抗体のような、分子構造
のわずかな違いを認識する特異性の高い抗体の利用も可
能となってきた。

［発明が解決しようとする問題点］ 然して、主として女性の卵胞で産生される前記エストロ
ゲンホルモンは、該ホルモンのうちのＥｌは、生物活性
が最も強く、ＦＳＨ，ＬＨ分泌調節に関与しており、Ｅ
ｌは、生体内で可逆的にＥｌに変化し、また、Ｅ３は、
Ｅｌ、Ｅｌの代謝物と考えられており、更には、血中で
は、遊離型と抱合体とが共存し、また、尿中では全て抱
合体として存在しているものである。

尚、前記抱合体には、様々な種類が存在しており、Ｅｌ
には、Ｅｌ−３−グルクロナイド（以下Ｇと略す）、Ｅ
ｌ−３−サルフェート（以下Ｓと略す）が、また、Ｅｌ
には、Ｅｌ−３Ｇ、Ｅｌ−１７βＧ、Ｅｌ−３３％Ｅ２
−１７Ｓ、Ｅｌ−３Ｓ−１７Ｇなどが、更には、Ｅ３に
は、Ｅ３−３０％Ｅ３−１６αＧ％Ｅ３−３Ｓ％　Ｅ３
−１　６　　αＳ１　Ｅ３−３Ｓ−１６６０％　Ｅ３−
３Ｇ−１６αＳなどが存している。

ところで、前記した３種類のエストロゲンホルモンおよ
びそれらによる多様な代謝産物の代謝動態には、大゛き
な個人差があるため、性周期におけるエストロゲンを測
定する場合に、これらのホルモンおよびその代謝産物の
うちの１つを測定し、その結果に基づいて生体内でのエ
ストロゲン動態を判断することは、適切でない場合が存
する。

これに対して、氷菓１の発明の新規ステロイド化合物は
、３ｆ！類のエストロゲン−３−グルクロナイドとのみ
特異的に反応するような抗体を産生し得るもので、その
抗体を用いた免疫学的測定法により、生体内におけるエ
ストロゲンホルモンの動態を精確に把握し得る新規ステ
ロイド化合物を、また、氷菓２の発明は、前述の新規ス
テロイド化合物を、容易、かつ確実に得る方法を、また
、氷菓３の発明は、前記新規ステロイド化合物を使用し
て３ｆＩＩＩ類のエストロゲン−３−グルクロナイドを
同時に測定することからなる新規ステロイド化合物の使
用方法を提供するものである。

［問題点を解決するための手段］ 氷菓１の発明の新規ステロイド化合物は、化学構造式 で表示されるエストロン−３−グルクロナイド−１７−
（ｏ−カルボキシメチル）オキシム−キャリア・プロテ
イン結合体からなるものである。

また氷菓２の発明の新規ステロイド化合物の製造方法は
、 で表示される公知化合物であるエストロンとメチル−１
−ブロモ−１−デオキシ−２，３，４−トリー〇−アセ
チルーα−Ｄ−グルコビラノウロネートとを反応させ、
化学構造式 で表示されるエストロン−３−グルクロナイドアセテー
トメチルエステルを得る工程と、（ロ）前記エストロン
−３−グルクロナイドアセテートメチルエステルと、０
−カルボキシヒドロキシルアミン塩酸塩とを、酢酸ナト
リウムの存在下に反応させ、化学構造式 で表示されるエストロン−３−グルクロナイドアセテー
トメチルエステル−１７−（ｏ−カルボキシメチル）オ
キシムを得る工程と、（八）前記エストロン−３−グル
クロナイドアセテートメチルエステル−１７−（ｏ−カ
ルボキシメチル）オキシムとキャリア・プロテインとを
反応させ、化学構造式 で示されるエストロン−３−グルクロナイドアセテート
メチルエステル−１７−（ｏ−カルボキシメチル）オキ
シム−キャリア・プロテイン結合体を得る工程と、 （ニ）前記エストロン−３−グルクロナイドアセテート
メチルエステル−１７−（ｏ−カルボキシメチル）オキ
シム−キャリア・プロテイン結合体を部分加水分解する
ことによって、化学構造式 で表示される新規ステロイド化合物であるエストロン−
３−グルクロナイド−１７−（ｏ−カルボキシメチル）
オキシム−キャリア°・プロティン結合体を得るもので
ある。

更に、氷菓３の発明は、化学構造式 で表示される新規ステロイド化合物を抗原とする抗体を
利用することによって、抗原抗体反応を利用した免疫学
的測定法により、体液中におけるエストロン−３−グル
クロナイド、エストラジオール−３−グルクロナイド、
およびエストリオール−３−グルクロナイドからなる３
ｆ！類のエストロゲン−３−グルクロナイドを同時測定
することからなる前記新規ステロイド化合物の使用方法
である。

なお、前記化学構造式（Ｉ）におけるＧは、ＣＯＯ−Ｎ
−ａ” で表示されるグルクロニル基を表わし、また、化学構造
式（Ｉｌｌ）　、　　（ＩＶ）　、　　（Ｖ）　ニオけ
るＧ′は、式 ％式％ で表示されるアセチル化グルクロニル基を表わすもので
ある。

［実施例］ 以下、本第１．第２．第３の発明たる新規ステロイド化
合物、該化合物の製造方法、および該化合物の使用方法
の具体的な構成を実施例を以って説明する。

実施例１ 化学構造式（１１）で示される市販の化合物たるエスト
ロン０．９ｇをトルエン１００ｍ１　に溶解し、炭酸カ
ドミウム１．１ｇを加えてケタール化装置により脱水し
た後、メチル−１−ブロモ−１−デオキシ−２，３，４
，−トリー〇−アセチルーα−Ｄ−グルコビラノウロネ
ート２．７ｇを加えて８時間還流させた。

次いで、得られた反応液を濾過操作に付し、更に、濾液
を濃縮した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーに
かけ、次いで、ベンゼン／酢酸エチルの溶出液で、酢酸
エチルの割合を０％から５％づつ増すステップワイズで
溶出させた。

しかる後に、薄層クロマトグラフィー（ベンゼン／エー
テル１：ｌ）でＲｆ　Ｏ，５５＋７）　スポットに相当
する溶出物をエタノールから再結晶することにより、化
学構造式（Ｉｌｌ　）に相当する白色結晶物（Ａ、）を
１２９ｍｇを得た。

白色結晶物（Ａ）の分析値 ｍ、ｐ、　　　　　　　　　２２４−２２６　　℃元素
分析値 Ｃ：　６２．２３、　　Ｈ：　６．１７ＩＲＺＩに”ａ
ａａ＊ｃｍ−’　　　１７５ＯＮＭＲ（ＣＤＣＪ！ｓ　
） ０．９０　（３Ｈ，ｓ、　１８−　ＣＨ３）２．０５（
９Ｈ，ｓ、　−０ＣＯＣＨ３）２．８５（２Ｈ，ｍ、　
６−Ｈ） ３．７３　（３Ｈ，ｓ、−ＣＯＯＣＨ３）４．１７　（
Ｉ　Ｈ，ｍ、５’−Ｈ） ５．１７（４Ｈ％ｍ、　１’　−１２′−１３′−１４
’−Ｈ）６．７８（２Ｈ，ｍ、　２−１４−Ｈ）７．１
８　（Ｉ　Ｈ％ｄ１１−Ｈ） 前記白色結晶物（Ａ）の９０ｍｇをエタノール１５ｍ１
に溶解し、０−カルボキシメチルヒドロキシアミン塩酸
塩２２０ｍｇと、６．７％酢酸ナトリウム溶液３．２１
１１１とを加え、３７℃で２０時間攪拌した後、反応液
に３％炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、酢酸エチルで
抽出した。

次いで、抽出液の溶媒を留去した後、残渣を分取し、ク
ロロホルム／メタノール（９：１）のＴＬＣに付し、Ｒ
ｆ　０．４のスポットに相当する溶出物を酢酸エチルで
溶出した。

得られた溶出物をアセトン−エーテルから再結晶するこ
とにより、化学構造式（ＩＶ　）に相当する白色粉末（
Ｂ　）　４５ｍｇを得た。

白色粉末（Ｂ）の分析値 、、９．　　　　　　　　１３３−１３６℃Ｉ　Ｒｖ　
Ｋａ”＋＊ａｍｃｍ−’　　　１７４５Ｎ　Ｍ　Ｒ、（
ＣＤ　Ｃｆｌ　ｓ　／　ＣＤ　ｓ　ＯＤ　）０．８９　
（３Ｈ，ｓ、　１８−　Ｃ）（ｓ）２．０５　（９Ｈ％
ｓ、　−０ＣＯＣＨｓ）２．８５（２Ｈ，ｍ、　６−Ｈ
） ３．７４（３Ｈ，ｓ、−ＣＯＯＣＨ３）４．２０　（Ｉ
　Ｈ，ｍ、５’−Ｈ） ４．７２（２Ｈ，ｍ、　＝ＮＯＣＨ２）５．１０（４Ｈ
％ｍ、　　Ｉ’−１２′−１３′−１４’−Ｈ）６．８
−７．２　（３Ｈ，ｍ％ａｒｏｍａｔｉｃ）前記白色粉
末（Ｂ）の４０ｍｇをジメチルホルムアミド１．５ｍｌ
に溶解し、水冷状態の下に、トリーｎ−ブチルアミン３
１μ℃およびイソブチルクロロフォルメート１０μ２を
加え、３０分後に、同じく水冷状態に維持されているウ
シ血清アルブミン（ＢＳＡ）１００ｍｇの含水ジメチル
ホルムアミドのアルカリ溶液（Ｄ　Ｍ　Ｆ　１．５ｍｌ
　−蒸留水３ｍｌ　−Ｉ　Ｎ　−ＮａＯＨ２５μ４２）
に加え、ｐ）Ｉ７．０に調整した後、４℃にて２４時間
の攪拌反応を行なった。

次いで、得られた前記反応液を、セファデックスＧ−２
５カラムクロマトグラフイーにかけ、蒸留水で溶出し、
更に、溶出された蛋白質分画をまとめて、化学構造式（
Ｖ）に相当するハプテン−ＢＳＡ結合体の水溶液（Ｃ）
を得た。

しかる後に、前記ハブテン−ＢＳＡ結合体の水溶液（Ｃ
）を、５　Ｎ　−ＮａＯＨでｐｌ（１２，０に調整し、
室温にて１２時間攪拌し、更に蒸留水に対して７２時間
の透析を行なった後に凍結乾燥することによって、化学
構造式（１）に相応するＢＳＡ結合体、すなわち、エス
トロン−３−グルクロナイド−１７−（ｏ−カルボキシ
メチル）オキシム−ＢＳＡ結合体１１３ｍｇを得た。

なお、コーバー反応による発色によって、前記ＢＳＡ結
合体１モル当りのハブテン結合モル数を求めたところ、
２５．９モルであった。

実施例２ 前記実施例１で得られた前記化学構造式（ＩＶ）に相応
する白色粉末（Ｂ）の４０ｍｇをジメチルホルムアミド
　１．５ｍｌに溶解し、水冷状態の下に、トリーｎ−ブ
チルアミン３１μｍおよびイソブチルクロロフォルメー
ト１０μｍを加え、３０分後に、同じく水冷状態に維持
されているウサギ血清アルブミン（Ｒ３Ａ）１ＧＯｆｆ
１ｇの含水ジメチルホルムアミド −ＩＮ−ＮａＯ）Ｉ　　２５μｍ）に加え、ｐＨ　７．
０に調整した後、４℃にて２４時間の攪拌反応を行なっ
た。

次いで、得られた反応液を、セファデックスＧ−２５カ
ラムクロマトグラフイーにかけ、蒸留水で溶出し、更に
溶出された蛋白質分画をまとめて、化学構造式（Ｖ）に
相当するハブテン−ＲＳＡ結合体の水溶液（Ｄ）を得た
。

しかる後に、前記ハブテン−ＲＳＡ結合体の水溶液（Ｄ
）を、５　Ｎ　−　ＮａＯＨ　　でｐ）１１２．０に調
整し、室温にて１２時間攪拌し、更に蒸留水に対して７
２時間の透析を行なった後に凍結乾燥することによって
、化学構造式（１）に相応するＲＳＡ結合体、すなわち
、エストロン−３−グルクロナイド−１７−（ｏ−カル
ボキシメチル）オキシム−ＲＳＡ結合体１２１１ａｇを
得た。

なお、コーバー反応による発色によって、前記ＲＳＡ結
合体１モル当りのハブテン結合モル数を求めたところ、
２０．２モルであった。

実施例３ 前記実施例１で得られた前記化学構造式（ＩＶ）に相応
する白色粉末（Ｂ）の４０ｍｇをジメチルホルムアミド
　１．Ｆｖｌに溶解し、水冷状態の下に、トリーｎ−ブ
チルアミン３１μｍおよびイソブチルクロロフォルメー
ト１０μ℃を加え、３０分後に、同じく水冷状態に維持
されているキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ
）５０μｍｇの含水ジメチルホルムアミドのアルカリ溶
液（　Ｄ　Ｍ　Ｆ　　１．５ｍｌ−蒸留水３　ｍｌ　−
　Ｉ　Ｎ　−ＮａＯＨ２　５μ２）に加え、ｐＨ　７．
０に調整した後、４℃にて２４時間の攪拌反応を行なっ
た。

次いで、得られた反応液を、セファデックスＧ−２５カ
ラムクロマトグラフイーにかけ、蒸留水で溶出し、更に
溶出された蛋白質分画をまとめて、化学構造式（Ｖ）に
相当するハブテン−ＫＬＨ結合体の水溶液（Ｅ）を得た
。

しかる後に、前記ハブテン−ＫＬＨ結合体の水溶液（Ｅ
）を、５　Ｎ　−　ＮａＯＨ　　でｐ）１１２．０に調
整し、室温にて１２時間攪拌し、更に蒸留水に対して７
２時間の透析を行なった後に凍結乾燥することによって
、化学構造式（１）に相応するＫＬＨ結合体、すなわち
、エストロン−３−グルクロナイド−１　７　−　（ｏ
−カルボキシメチル）オキシム−ＫＬＨ結合体６２ｍｇ
を得た。

なお、コーバー反応による発色によって、前記ＫＬＨ結
合体１モル当りのハブテン結合モル数を求めたところ、
１１．２そルであった。

実施例４ 抗体の作製（ウサギの免疫） 体ｉ２．５−３．（１Ｋｇの在来種の白色ウサギ３羽に
、エストロン−３−グルクロナイド−１７−（０−カル
ボキシメチル）オキシム−ＢＳＡ結合体からなる抗原を
、以下のごとく免疫した。

すなわち抗原３ｆｆ１ｇを生理食塩溶液１．５ｍｌに溶
解させ、これをフロイント・コンプリート・アジュバン
ト　１．５１１１１にてエマルジョンにし、このエマル
ジョンをウサギの足筬に１羽につきｌｌｌ１ｌずつ皮内
に投与した。以下２か月にわたって２週間毎にウサギの
背部皮下に投与し、最後の投与（第５回目の投与）から
１週間後に、このウサギの耳静脈から１０ｍ１を採決し
、これを３０００回転１０分間の遠心分離にかけ、抗血
清を得た。

抗体の精製 抗血清を等量の１　ｍｇ／ｍｌのＢ　Ｓ　Ａ　、　Ｏ，
１５Ｍ塩化ナトリウム含有０．０２Ｍリン酸緩衝液ｐＨ
７，２と混合し、４℃にて１２時間静置後、析出したＢ
ＳＡ−抗ＢＳＡ抗原抗体結合物を８０００回転２０分間
の遠心分離により除き、上清を得た。次いで、この上清
から４０％飽和硫酸アンモニウム塩析法により、γグロ
ブリン分画を塩析させ、８０００回転２０分間の遠心分
離によって沈澱物を得た。しかる後に、この沈澱物を０
．１５Ｍ塩化ナトリウム含有０．［１２Ｍリン酸緩衝液
ｐ）Ｉ　７．２に溶解し、同じＵ街液に対して２４時間
透析後、２８０ｎｍにおける吸光度によって調整し、１
％の抗エストロンー３−グルクロナイド抗体溶液を得た
。

試薬の調製 前述した１％の抗エストロンー３−グルクロナイド抗体
溶液を０．２ＭアンモニウムＭｌｒ液ｐＨ８，２で稀釈
し、１０％のポリスチレンラテックス粒子懸濁液（粒径
Ｑ、ｌＧ９ミクロン、ダウ・ケミカル製）を加え、３７
℃にて１時間インキュベートする。冷却後１％ＢＳＡ含
有０．２Ｍアンモニウム）１衝液ｐＨ８，２に懸濁させ
、０．１％抗体結合ラテックス懸濁液を得た。

測定操作 抗体結合ラテックス懸濁液３００μ℃、検体８０μ℃、
凝集用合成多価抗原としてエストロン−３−グルクロナ
イド−１７−（ｏ−カルボキシメチル）オキシム−Ｒ３
Ａ結合体５μｇ　／　ｍ　１１の２０μｍを用い、抗体
結合ラテックス懸濁液と凝集用合成多価抗原との凝集を
検体中のハブテンが阻止する反応を、′全自動免疫化学
分析装置ＬＡ−２０００（ＡＬＣ，アルファチック製）
を用いて、光学的に測定した。

交叉反応性について エストロン−３−グルクロナイド−１７−（０−カルボ
キシメチル）オキシム−ＢＳＡ結合体で免疫したウサギ
から得られた前述の抗血清の特異性を調べるために、２
２種のステロイドを用いてその交叉反応性を求めた結果
を第１表に示す。第１表の交叉反応の欄における数値は
、前述した抗体結合ラテックス粒子と凝集用合成多価抗
原との凝集を、エストロン−３−グルクロナイドが５０
％阻止する時の濃度を、各種のステロイドが５０％阻止
する時の濃度で割った百分率で表示したものである。

第１表 第１表の結果より、本発明の新規ステロイド化合物を利
用した抗原による抗体を使用したものは、エストロン−
３−グルクロナイド、エストラジオール−３−グルクロ
ナイド、およびエストリオール−３−グルクロナイドに
対する特異性が他のものに比較して極めて高く、交叉反
応が低く抑えられていることが明瞭である。

［発明の作用および効果］ 氷菓１の発明の新規ステロイド化合物は、エストロゲン
−グルクロン酸抱合体の中でも、特に排泄量の多い３位
抱合体であるエストロゲン−３−グルクロナイドにのみ
、特異的に反応する抗体の作製に必要な免疫用抗原とし
て利用し得るものである。すなわち、前記新規ステロイ
ド化合物であるエストロン−３−グルクロナイド−１７
−（ｏ−カルボキシメチル）オキシム−キャリア・プロ
テイン結合体を用いて作製された抗体は、エストロン−
３−グルクロナイド、エストラジオール−３−グルクロ
ナイド、およびエストリオール−３−グルクロナイドに
対して、路間等な反応性を示し、なおかつ、その他のス
テロイドとは反応することのないものであるから、生体
内におけるエストロゲンホルモンの動態を精確に把握し
得るという作用、効果を奏するものである。

また、氷菓２の発明は、エストロン−３−グルクロナイ
ドの１７位ケトン基を０−カルボキシヒドロキシルアミ
ン塩酸塩と反応させることにより１７位を０−カルボキ
シメチルオキシムとし、更に、キャリア・プロテインと
反応させることによって、エストロン−３−グルクロナ
イドのＡ環の構造を変化させることなく１７位で、キャ
リア・プロテインと結合されている前述の新規ステロイ
ド化合物を得るものであり、前記氷菓１の発明の新規ス
テロイド化合物が、容易かつ確実に得られるという作用
、効果を奏するものである。

更にまた、氷菓３の発明は、前記氷菓１の発明の新規ス
テロイド化合物によって得られた抗体の有する特異性を
利用して、体液中の３種類のエストロゲンホルモンの代
謝産物、すなわち、エストロゲン−グルクロン酸抱合体
の中でも特に排泄量が多いとされている３位抱合体であ
るエストロン−３−グルクロナイド、エストラジオール
−３−グルクロナイド、およびエストリオール−３−グ
ルクロナイドの３種類のエストロゲンホルモンの代謝産
物を同時に測定することからなる前記新規ステロイド化
合物の使用方法であり、生体内におけるエストロゲンホ
ルモンの動態を精確に把握するのに、優れた作用。

効果を奏するものである。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）化学構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼・・・（ I ） 〔式中、Ｇは、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で表示されるグルクロニル基を表わす〕 で表示されるエストロン−３−グルクロナイド−１７−
   （ｏ−カルボキシメチル）オキシム−キャリア・プロテ
   イン結合体からなることを特徴とする新規ステロイド化
   合物。
2. （２）キャリア・プロテインが、ウシ血清アルブミン、
   ウサギ血清アルブミン、またはキーホールリンペットヘ
   モシアニンの免疫用担体からなる抗原のいずれかである
   特許請求の範囲第１項記載の新規ステロイド化合物。
3. （３）（イ）化学構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼・・・（II） で表示されるエストロンとメチル−１−ブロモ−１−デ
   オキシ−２，３，４−トリ−ｏ−アセチル−α−Ｄ−グ
   ルコピラノウロネートとを反応させ、化学構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼・・・（III） 〔式中、Ｇ′は、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で表示されるアセチル化グルクロニル基を表わす〕で表
   示されるエストロン−３−グルクロナイドアセテートメ
   チルエステルを得る工程と、（ロ）前記エストロン−３
   −グルクロナイドアセテートメチルエステルと、ｏ−カ
   ルボキシヒドロキシルアミン塩酸塩とを、酢酸ナトリウ
   ムの存在下に反応させ、化学構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼・・・（IV） で表示されるエストロン−３−グルクロナイドアセテー
   トメチルエステル−１７−（ｏ−カルボキシメチル）オ
   キシムを得る工程と、（ハ）前記エストロン−３−グル
   クロナイドアセテートメチルエステル−１７−（ｏ−カ
   ルボキシメチル）オキシムとキャリア・プロテインとを
   反応させ、化学構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼・・・（Ｖ） で示されるエストロン−３−グルクロナイドアセテート
   メチルエステル−１７−（ｏ−カルボキシメチル）オキ
   シム−キャリア・プロテイン結合体を得る工程と、 （ニ）前記エストロン−３−グルクロナイドアセテート
   メチルエステル−１７−（ｏ−カルボキシメチル）オキ
   シム−キャリア・プロテイン結合体を部分加水分解する
   ことによって、化学構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼・・・（ I ） 〔式中、Ｇは、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で表示されるグルクロニル基を表わす〕 で表示されるエストロン−３−グルクロナイド−１７−
   （ｏ−カルボキシメチル）オキシム−キャリア・プロテ
   イン結合体を得ることを特徴とするエストロン−３−グ
   ルクロナイド−１７−（ｏ−カルボキシメチル）オキシ
   ム−キャリア・プロテイン結合体の製造方法。 １）化学構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼・・・（ I ） 〔式中、Ｇは、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で表示されるグルクロニル基を表わす〕 で表示されるステロイド化合物を抗原とする抗体を利用
   する免疫学的測定法によって、体液中におけるエストロ
   ン−３−グルクロナイド、エストラジオール−３−グル
   クロナイド、およびエストリオール−３−グルクロナイ
   ドの３種類のエストロゲン−３−グルクロナイドを同時
   測定することを特徴とするエストロン−３−グルクロナ
   イド−１７−（ｏ−カルボキシメチル）オキシム−キャ
   リア・プロテイン結合体からなるステロイド化合物の使
   用方法。