JPS5833162A - エストリオ−ル−１６α−グルクロナイド測定用抗原およびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はエストリオール−１６α−グルクロナイドの免
疫学的測定用抗原およびその製造法に関するものである
。さらに詳しくはエストリオール−１６αグルクロナイ
ドの特異抗血清を得るだめの蛋白ハプテン結合抗原の新
規合成法に関する。

エストリオールは卵胞ホルモンであるエストロゲンの一
種であり為遊離型（ｆｒｅｅ）、蛋白結合型（ｐｒｏｔ
ｅｉｎ協ｍｌ）および結合型（魚彫圃）が知られている
。このうち遊離型は血中には存在するが、尿中には通常
出限せず、結合型、すなわち主としてグルクロン酸抱合
型として排せつされる。

近時１エストリオールグルクロナイドの生理的意義が注
目されるようになり１血中および尿中のエストリオール
−１６α−グルクロナイドの簡便にして１かつ正確な免
疫学的測定法の出現が望まれている。

従来１体液中のエストリオールは検体の中に含まれる結
合型ニス）　ＩＪオールを塩酸加熱水解、またはβ−グ
ルクロニダーゼあるいはスルファターゼの如き・酵素を
用いて水解しＡ遊離型エストリオールとしたのち１抽出
後１コ一バー反応（Ｋｏｂｅｒ　ｒｅａｃ。

）を利用した比色法あるいは蛍光法あるいは免疫測定法
などを組合せて測定されてきた。

しかしながら１水解操作を必要とするこれらの方法は操
作が煩雑であり島かつ前述の遊離型、結合型等の分画測
定が不可能である等の欠点を有している。

一方体液中の微量成分の測定法として注目されつつある
ラジオイムノアッセイは放射性核種で標識したホルモ／
と、そのホルモンに対する抗体の結合比が反応液中に加
えられた抗原、すなわち非標識ホルモンの量によって変
化することを利用した方法であり１感度が高く１多数検
体の測定が可能であることから臨床検査向きの方法とし
て受けとめられ、各種ホルモンはもとより１各種薬剤の
血中）尿中濃度を測定する方法として賞用されるに至っ
ている。

このようにラジオイムノアッセイは１特に体液中のホル
モンの定量法として脚光をあびているがその特異性につ
いては、議論の多いところである。

すなわち為一般に体液中には測定対象物質と類似の構造
を有する物質が多数共存しているので１測定に用いる抗
体は測定対象物質とのみ反応するもの１すなわち交叉反
応性のない特異性の高いものが要求される。特定の測定
対象物質との結合定数が犬でＡかつ特異性の高い抗体を
用意することが出来れば、その特定物質を測定するため
のラジオイムノアッセイは、はぼ完成されたことになる
。

前述の如く１体液中のニス）　ＩＪオールを従来法で測
定する場合Ａ一般的には氷解操作が必要になるが、ラジ
オイムノアッセイにおいては１エストリオールグルクロ
ナイドと特異的に結合する抗体が用意されれば、氷解操
作が不要となり、簡便にして）かつ高感度、特異的な測
定法が誕生することになるので一今日ではエストリオー
ルグルクロナイド を水解せずに免疫学的に測定するだめの特異抗体の製造
法１すなわち特異抗体を製造するだめの抗原としてどの
ような物質を選択使用するがという点に免疫学的測定法
を完成させるための努力が傾注されている。その一つの
例として一エストリオールグルクロナイドのグルクロン
酸部分のカルボキンル基にＢＳＡを結合させた、いわゆ
る蛋白−ハブテン結合抗原が合成され、該抗原を用いて
作成された抗体を用いて、エストリオールグルクロナイ
ドを測定する方法が報告されているが、該抗体は特異性
が低く、遊離エストロゲンおよびエストラジオールＤ環
グルクロナイドに対して交叉反応性を示すので満足出来
る結果を与えていない（ｐ。

Ｓａｍａｒａｊｅｅｔｕ　、　ｅｔ　ａｌ　：　Ｂｉｏ
ｃｈａｎｉｃａｌ　Ｊ−耐１　５　１　、　３　６　９
　〜３７６、　１９７５年）。

またλカルボキシフェニルアゾエストリオール−１６−
グルクロナイドのＣ，位まだは０４位にＢＳＡを結合さ
せた蛋白−ハブテン結合抗原の場合）該抗原を用いて作
製された抗体は、遊離エストロゲンに対し２．２％以下
という比較的低い交叉反応性を示し、改良された特異性
を示したが、なお不充分であり、この不充分な特異性は
ベンゾイル基にＢＳＡを結合させる際に１同時にグルク
ロン酸部分のカルボン酸にもＢＳＡが結合するためであ
ると推定されている（Ｊ、Ｒ，議ｘｅｔ　ａｌ　：　Ｆ
ＥＢＳ　Ｉｚｔｔ、　６１．２６３〜２６６、１９７６
年）。

このような観点から、担体蛋白ＢＳＡをステロイドＤ環
グルクロナイドのグルクロン酸部分のカルボキ／ル基に
結合させないようにすると同時に、担体蛋白ＢＳＡをス
テロイドのＤ環から離れた位置にあるステロイドのＡ環
に結合きせた報告がある（Ｔ、恥−ユｅｔ　ａｌ　：　
Ｊ、玉石、Ｄｙｎ、　１．５５〜６１．１９７８年）。

すなわち）ステロイドグルクロナイドの”環のＣ嘗また
は０４位にＢＳＡを結合させるために０２−アミノエス
トリオール−１６−グルクロナイドとＢＳＡをゲルター
ルアルデヒドで架橋させる方法１リエストリオール−１
６−グルクロナイドとＢＳＡをホルマリンの存在下λア
ルカリ性で反応させて、いわゆるマンニッヒ反応により
ハプテン−ＢＳＡ結合体を合成する方法および（Ｄｐ−
アミノ安息香酸−ＢＳＡをジメチルホルムアミド中でジ
アゾ化した後、エストリオール−１６−グルクロナイド
を反応させてハプテン−ＢＳＡ結合体を合成する方法が
報告されている。

本発明において１発明者らはすでに公知となっているエ
ストリオール−１６−グルクロナイド−ＢＳＡ結合体を
用いて作製された抗体よりもさらに特異性の高い抗体を
作製するためのハプテン−ＢＳＡ結合体を鋭意検索した
結果、本発明を完成するに至ったものである。

本発明はエストリオール−１６−グルクロナイドのＤ環
グルクロン酸部分にＢＳＡが結合しないようにしなから
１エストリオールグルクロナイドのＢ環のＣ６位にＢＳ
Ａを結合させたハプテン−担体蛋白結合体の合成法に関
する。

本発明に基づいて合成された特許請求の範囲第１項に記
載されている物質、すなわち６−オキソエストリオール
−１６−グルクロナイド−６−（０−カルボキンメチル
）オキツム−ＢＳＡ結合体を用いて作製された抗体は＼
すでに公知の方法で得られたエストリオール−１６−グ
ルクロナイド−ＢＳＡ結合体を用いて作製された抗体に
比較して１ステロイドのＡ環、Ｄ環の認識性が優れてお
υ１特異性においても、さらに向上することが明りよう
となり１本発明を完成するに至ったものである。

本発明に基づいて作製された抗体はニス）　ＩＪオール
−１６ａ−グルクロナイドのラジオイムノアッセイ用と
して特に好適であるが、ラジオイムノアッセイに限らず
）羊赤崩球またはラテックスを担体とする凝集反応およ
び凝集阻止反応に用いることも可能である。

本発明は１特許請求の範囲第２項イ）〜へ）に記載した
工程に基づいて１６−オキノエス）　ＩＪオール＝１６
−グルクロナイド−６−（０−カルボキンメチル）オキ
ー／ムーＢＳＡ結合体を合成する方法に関するものであ
り＼本発明のさらに加わった特徴の一つとしてエストリ
オールグルクロナイドのグルクロア酸部分の保護基を脱
離させる工程、すなわち特許請求の範囲第２項へ）にお
いて、エストリオール骨格のＣ，位における〇−カルボ
キンメチルオキ／ムとＢＳＡの結合の解離が極めて低く
抑えられた形でグルクロナイドアセテートメチルエステ
ルの加水分解を完全に進行させることが可能であること
飄およびグルクロナイド部分の保護基を特許請求の範囲
第２項へ）に記載した合成工程の最終段階で脱離させる
ところにある。

本発明に基づく新規ステロイド化合物は下記の構成Ａす
なわちイ）化学構造式 ０ で示される６−オキソエストリオールを無水炭酸カリウ
ムの存在下１塩化ベンジルと反応させ６−オキソエスト
リオール−３−ベンジルエーテル（■）とする工程、 で示される６−オキツエヌトリオールー３−ベンジルエ
ーテルとメチル−１−フロモー１−デオキシ−２１３，
４−）ソー０−アセチルーα−Ｄ−グルコピラノウロネ
ートを反応させ６−オキソエストリオール−３−ベンジ
ルエーテル−１６−グルクロナイドアセテートメチルエ
ステルＯＶ）とするコニ程＼ハ）化学構造式　　　、っ （式中Ｇ′は ０００ＣＨ。

で示されるグルクロニル基を表わす）で示される６−オ
キソエストリオール−３−ベンジルエーテル−１６−グ
ルクロナイドアセテートメチルエステルを還元して６−
オキソエストリオール−１６−グルクロナイドアセテー
トメチルエステル（Ｖ）とする工程） 二）化学構造式 で示される６−オキソエストリオール−１６−グルクロ
ナイドアセテートメチルエステルを酢酸ナトリウムの存
在下λ０−カルボキ゛／メテルヒドロキンルアミン塩酸
塩と反応させ、６−オキソエストリオール−１６−グル
クロナイドアセテートメチルエステル−６−（０−カル
ホキ／メチル）オキシム（ＶＩ）とする工程、で示され
る６−オキソエストリオール−１６−グルクロナイドア
セテートメチルエステル−６−（０−カルボキシメチル
）オキシムをＢＳＡと反応させ６−オキソエストリオー
ル−１６−ゲルクロナイドブセテートメテルエステルー
６−（０−カルボキシメチル）オキンムーＢＳＡ結合体
（〜１１）とする工程為 へ）　化学構造式 ％式％ で示される６−オキソエストリオール−１６−グルクロ
ナイドアセテートメチルエステル−６−（０−力ルボキ
／メチル）オキンムーＢＳＡ結合体を部分的に加水分解
する工程、以上のイ）、口）＼・・）、二）１ホ）、へ
）の各工程を組み合せることによって製造されるもので
ある。

次に本発明−の実施例を示す。

実施例１゜ 化学構造式（ｎ）で示される市販の化合物、６−オキソ
エストリオール８１２ｍｇを無水エタノール４０ｍ１に
溶解し１これに無水炭酸カリウム１．８ｇおよび塩化ベ
ンジル１．６ｍｌを加え４時間加熱還流後、反応液を口
過し、０液を減圧濃縮後、残留物を酢酸エチルより再結
晶すると、化合物（［］）８６６■が白色針状結晶とし
て得られた。

白色針状結晶性化合物（ｍ）の分析値 ｍ、ｐ、　　１８７〜１８９℃ 元素分析値 Ｃ：　７６．４５　、　Ｈ：　７．２５化学式ｃ、ＩＨ
Ｉ　ＩＯ２に対する計算値Ｃ：　　７６．５０　　、Ｈ
：　　７．１９ＮＭＲ（ＣＤＯｓ） ［８１（３Ｈ，Ｓ、ｌ８−ＣＨ，） ３；６０　　（ＩＨ，α、Ｊ−６七、１７α−Ｈ）４．
１０　　（ＩＨ，ｍ、１６β−Ｈ）５．０９　　（２Ｈ
，Ｓ、３−０（４，Ｃ，Ｈ，）７．０〜７．７　　（８
Ｈ，ｍ、噴究１ｃＨ）白色針状結晶性化合物（ＩＩＩ）
　１．７９をベノゼン７６ｍ１に溶解し、炭酸銀１．６
ｇを加え脱水後・メチル−１−プロモー１−デオキノー
２．３．４−）ソー０−アセチルーα−Ｄ−グルコピラ
ノウロネート２９を加えて４．５時間還流後、触媒を０
去し、０液を濃縮後、残留物を７リカゲルのカラムクロ
マトグラフィーに（ｔｌ、＼ベンモノ／エーテル（１：
１）で溶出後、塩化メチレン／メタノールより再結晶す
ると化合物（■）　１８０■が無色針状結晶として得ら
れた。

無色針状結晶性化合物（ＩＶ）の分析値ｍ、ｐ、　　２
６６〜２６８℃ ［ａ］′Ｄ′−１３，０”（Ｃ＝０．１２．ＣＨＱＩ）
元素分析値 Ｃ：　６４．３８　、　Ｈ：　６．１０化学式Ｃ１＠Ｈ
４４０１１に対する計算値Ｃ：　６４．４０　、　Ｈ：
　６．２６ＮＭＲ（ＣＤＯｓ） ０．８１　　（３Ｈ，Ｓ、ｌ８−ＣＨ，）２．０２　　
　（３Ｈ，Ｓ、２’−，３’−，４−ＯＣＯＣＨ，）２
．０５　　　（３Ｈ，Ｓ、２’、３’−，４’−０ＣＯ
ＣＨ，）２．０６　　（３Ｈ，Ｓ、２’、３′−，４’
−０ＣＯＣＨ，）３．７７　　（３Ｈ，Ｓ、７ＣＯＯＣ
Ｒ，）４．１０　　（ＩＨ，ｍ、５’−Ｈ） ４　、５８　　（ＩＨ，ｄ、　Ｊ＝　７Ｈｚ、　１’−
Ｈ）４．９〜５．４０　　（３Ｈ，ｍ、　２’−、３’
−、４’Ｈ）５．０８　　（２Ｈ，Ｓ、３−ＯＣＨ，Ｃ
，Ｈ，）７、０　−−７．７　　（８Ｈ，ｍ、　ａｒ’
ＣｎａｔｉＱＨ）無色針状結晶性化合物（■）　１１０
■をメタノール６０ｍ１に溶解し、５９６パラジウム炭
２００■を加えて水素ガス気流中）常温で４時開攪拌後
、触媒を０去し０液を濃縮後１塩化メチレン／メタノー
ルから再結晶すると化合物（Ｖ）７７■が無色針状結晶
として得られた。

無色針状結晶性化合物（Ｖ）の分析値 ｍ、Ｐ、　　　　２４０　　℃ 元素分析値 Ｃ、５９，９１、Ｈ：　６．１１ 化学式ＣＩＩＨＩＩＯ１１に対する計算値Ｃ：　６０．
１９　、　Ｈ：　６．１９ＮＭＲ（ＣＤ（ｉｓ） ０．８１　　（３Ｈ，Ｓ、１８−Ｃｌ、　）２．０３　
　（３Ｈ，Ｓ、２’−，３’−，４’−０ＣＯＣＨ，）
２．０５　　　（３Ｈ，Ｓ、２’−，３’−，４’−０
ＣＯＣＲ，）２．０７　　（３Ｈ，Ｓ、２−．３−．４
’−０ＣＯＣＲ，）３．７７　　（３Ｈ，Ｓ、−ＣＯＯ
ＣＨ，）４．０９　　（ＩＨ，ｄ、Ｊ＝１０七、　５’
−Ｈ）４．５８　　（ＩＨ，ｄ、Ｊ＝７七、　１’−Ｈ
）４．９０　−５．３０　　（３Ｈ，ｍ、２’＋、３’
＋、４−Ｈ）７．０４　　（ＩＨ，ｄｄ、Ｊ＝８．３七
、　２−Ｈ）７．３０　　（ＩＨ，ｄ、Ｊ＝８豫、　１
−Ｈ）７．４８　　（ＩＨ，ｄ、Ｊ：３七、４−Ｈ）無
色針状結晶性化合物（Ｖ）５１■をメタノール８ｍ１！
に溶解し、０−力ルポキシメチルヒドロキー７ルアミン
塩酸塩１２２■および１２％酢酸ナトリウム１．０ｍｌ
を加え３５℃にて３．５時間攪拌後）反応液に水を加え
酢酸エチルで抽出後Ａ溶媒を留去し、油状物として残↓
（ＶＩ）を得る。

油状物質（ＶＩ）のＮ　Ｍ　Ｒ（ＣＤ、ＣＤ　−ＣＤＣ
ｌ５　）０．７７　　（３Ｈ，Ｓ、ＩＩＬＣＨ，）２．
０３　　　（３Ｈ，Ｓ、２’−，３’−，４’−０ＣＯ
ＣＩ（、）２、０５　　（３Ｈ，Ｓ　、　２’Ｌ、　３
’Ｌ、　４’ＬＯＧＯＣＲ，）２、０９　　（３Ｈ，Ｓ
、　２’−、３’−、４’−０ＣＯＣＲ，）Ｊ３．６７
　　（ＩＨ，ｄ、Ｊ＝＝５七、１７α−Ｈ）３．７７　
　（３）１．Ｓ、−Ｃｏ○ＣＨ，）４．１０　　（ＩＨ
，ｄ、Ｊ＝１０凱♂−Ｈ）４、６５　　（１Ｂ、　ｄ、
　Ｊ＝７池、　１’−Ｈ）４＋６８　　（２Ｈ，Ｓ、＝
ＮＯＣＨ，−）４、９０−５．５０　　（３Ｈ，ｒｎ、
　２’−、３’−、４’−Ｈ）６．８２　　（ＩＨ，ｄ
ｄ、Ｊ＝８．２Ｈｚ、２−Ｈ）７．１５　　（ＩＨ，ｄ
、Ｊ＝８七、　１−Ｈ）７．３４　　（ＩＨ，ｄ、Ｊ＝
＝２七、　４−Ｈ）油状物質（Ｖｌ）５０■をジメチル
ホルムアミド１．５ｍｌに溶解し水冷下、トリーｎ−ブ
チルアミン５０μおよびインブチルクロロフォルメート
１２．５μを加えてから３０分後１氷冷下にてＢＳＡ　
１２Ｓ■の含水ジメチルホルムアミドのアルカリ溶１（
ＨｔＯ：ＤＭＦ　：ＩＮＮａＯＨ＝３ｍＪ：２．２５ｍ
１：０，１２５ｍ１）に加え、ｐＨ７，０〜７．５で一
夜攪拌し、得られた反応液を冷水にて２４時間透析後、
凍結乾燥に付し・・グテンＢＳＡ結合体（■）１６４■
を得た。

該ハプテンＢＳＡ結合体（■）１６３■を水２４ｍ１に
溶解し、５Ｎ−ＮａＯｔ（（０，０８ｍ／りを加えｐＨ
１２，３〜１２．５に調整した液を２５℃で１２時間攪
拌する。

次に０．０５Ｍ−阻ＨＣＯ，で２４時間、水で２４時間
透析後、凍結乾燥し、化合物（１）１２４ｍｇを得た。

化合物（Ｉ）、すなわち６−オキソエストリオール−１
６α−グルクロナイド−６−（０−カルホ゛キノメチル
）オキ／ムーＢＳＡ結合体のＢＳＡ　１モルあたりのハ
ブテン結合モル数をＵＶ法により求めたところ１６モル
であった。

実施例２゜ 抗体の作製 体重２．５〜３．ＯＫｇの存来種白色雄ウサギ３羽に６
−オキソエストリオール−１６α−グルクロナイド６−
（〇−力ルボキ／メチル）オキ／ムーＢＳＡ　結合体を
抗原とすることによシ１以下の如く免疫した。

す危わち抗原２■を滅菌等張食塩溶液０．５ｍｌに溶解
させ、これをフロイント・コンプリート・アジュバント
０．５ｍｌにてエマルジョンにし）このエマルジョンを
ウサギの肩甲部および足Ｖ数ケ所に皮下投与した。以後
２ケ月にわたって２週間毎に同様の投与を繰返し＼さら
に１ケ月の間隔を置いて同様の投与を行った。

最後の投与（第５回目の投与）から１週間後にこのウサ
ギの耳静脈から１０ｍ１を採取し）これを３０００回転
、１０分間の遠ノし・分離にかけ１得られた抗血清を一
２０℃にて保存した。

使用時においては、上記抗血清を解凍し、ＢＳＡＯ１０
６％牛−１−グロブリフ０．０５９６を含む０．０５Ｍ
ホウ酸緩衝液（ｐＨ８，０）で１．３０００の希釈率で
希釈し標準曲線を作製した。

測定操作 エストリオール−１６α−グルクロナイドを含む試料に
エストリオール−１６α−グルクロナイド−６，７゜−
ａＨ（約７５００　ｄｐｍ　）および抗血清０．２５ｍ
１を添加し、４℃で１時間装置する。次いで５０％硫酸
アンモニア溶液０．２５＋＋＋ｌを添加し、４℃に２０
分間放置後、　３０００回転で１５分間遠心し１得られ
た上澄液０．２ｍｌをと９１放射活性を測定する。

交叉反応性について ６−オキソエストリオール−１６α−グルクロナイド６
−（０−カルボキンメチル）オキー／ムーＢＳＡ結合体
で免疫したウサギから得られた前述の抗血清の特異性を
３２種のステロイドを用いて１その交叉反ＩＥ、性ヲ為
　エストリオール−１６α−グルクロナイド−ＩＢの本
抗血清への結合量を半減させるのにｌ・要な各！重ヌテ
ロイドの量を標準曲線より求めることによって調べた結
果を第１表に示す。

第１衣の交叉反応の欄における数値は、１ト標識エスト
リオール−１６α−グルクロナイドの５０％阻１Ｌ量を
１００といこれに７１する各種ステロイドの読みの比率
の逆数を百分率で表示したものである。

抗エストリオールー１６α−グルクロナイド血清と特定
ステロイドとの交叉反応百分率 ステロイド　　　　　　　交叉反応百分率（％）匝ｔｒ
１ｏ１−１６−ｇｌｕｃｕｒａｎｉ市　　　　　　　１
°ＯＥｓｔｒａｄｉｏｌ−１７−ｇｌ蔭箭ｄｅ　　　　
　　　　＜　Ｏ、ＯＯＩＥｓｔ７□岬、ａｎｉｄｅ　　
　　　　　　　（Ｑ　、　Ｇ　ＯＩＦｇｔｒａＭｏｌ−
３−帥−セｄｅ　　　　　　　　＜　０　、００１２＝
１％ｒｏｇｅｓｔｒａｄｉｏｌ−２−帥ケ髄ｄｅ　　　
　　　Ｏ−３６０２−Ｈ％ｒｏｘｙｅａ岱社ｏ１−１７
−−苅ｄｄｅ　　　　　＜　０　、００１飴を凶ｏ１−
１７−ｇｌｕｃｕｚ−市−３−祇Δ艶　　　〈０・００
１助ｔｒａｄｉｏｌ−３−卵τ皿市　　　　　　　（０
，００１馳ｔｒｉｏ１−１７−吠ｍｍ論　　　　　　　
　３．２６６Ｅｓｔｒｉｏｌ−１６−ｇＪｕｃｕｒａｎ
ｉｄｅ−３−５ｕｌｆａｔｅ　　　　　　Ｏ・０９４Ｔ
ｅｓｔｏｓｔｅｒａｎｅ−１７−帥ニｄｄｅ　　　　　
　　＜　０　、０　ＯＬ晟庇坊直４−帥医ｍ１ｄｅ　　
　　　　　＜　０・００１ｈ卯油ｏ１−３−帥す−ｄｅ
　　　　　　　　（０、００１胎を藺ｏ１−３−虹血艶
　　　　　　　　（０，００１Ｅｓｔ藺ｏ１−１７−証
血彷　　　　　　　　く０・００１２−−ｗｅｓｔｒａ
ｃｉｉｏｌ−３−ｓｕｌｆａｔｅ　　　　　　＜　０　
、００１ＦＢｔｒｉｏｌ−３−ｓｕｌｆａｔｅ　　　　
　　　　　　＜　Ｏ、ＯＯ１噛声−肺頂加コ■亡ａ馳　
　　　　（０，００１Ｅｓｔｒｏｎｅ　　　　　　　　
　　　　　　（０、ＯＯ１２−取欲可ｅｓｔ蔭　　　　
　　　　　　（０，００１２−Ｍｅｔｈｏｘｙｅｓｔｒ
ａＭｏｌ　　　　　　　　　　＜　０　、００１Ｂｓｔ
ｒａＭｏｌ　　　　　　　　　　　　　　（０、００１
２−取世万田を翻ｏ１　　　　　　　　　　　（０，０
０１２−Ｍｅｔｈｏｘｙｅｓｔｒａｄｉｏｌ　　　　　
　　　　　　　　　　　　（０、００１Ｅｓｔｒｉｏｌ
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　Ｏ、０６５１６−Ｅｐｉｅｓｔｒｉｏｌ　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　０　、０５２Ｔｅ
ｓｔｓｔｓｒｃｒｇ　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　＜　０　、００１雇庶切ｍｒｅ　　　　
　　　　　　　　　（０、００１雇庶（２）ｅｄｉｏｌ
　　　　　　　　　　　　＜　０．００１）篩ｄη生拍
丘ｂＩ彷ｒｏｎｅ　　　　　　　　　　　　　　（０、
００１１６α−Ｍ工ψ匈韻耳郷凪艶直　　　　（０，０
０１Ｐｒｏｇｐｓｔｅｒａｎａ　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　（０、００１Ｃｏｒｔｉ８０１　　
　　　　　　　　　　　　＜　０　、００１第１表の結
果より＼本発明の新規化合物を利用した抗原による抗体
を使用したもののエストロゲンに対する特異性が他のも
のに比較してきわめて高く１交叉反応が低く抑えられて
いることが明りようである。

特許出願人 栄研化学株式会社」 手続補正書（自発） 昭和５６年１０月１３日 特許庁長官　　島１）春樹　殿 １、事件の表示 昭和５６年特許出願第１３０１８０号 ２、発明の名称 ノクテイヨウコウケノ エストリオールー１６α−グルクロナイド測定用抗原３
、補正をする者 事件との関係　本人 ブ／豹つホ／コウ 住所　東京都文京区本郷１丁目３３番８号エイケンカカ
ク 氏名　栄研化学株式会社 明細書中「特許請求の範囲」λおよび［発明の（２）　
　明細書箱７頁１行目の１（戸馳１ｎ−光）　　−・、
」をｊ　（ｐｒｏｔｅｉｎ−積立）　　−・−ｊと補正
する。

（３）　　明細書第７頁３行目の「・・・出限せず・・
・」を「・・・出現せず・・・」と補正する。

（４）　　明細書箱８頁１３行目の１に去っている。」
を「に至っている。」と補正する。

（５）　　明細書第１０頁１０行目の１・・・Ｄ環・・
・」を「・・・−１７−・・・」と補正する。

（６）　　明細書第１０頁１５行目の「−１６−グルク
ロナイド・・・」を「−１６α−グルクロナイド・・・
」と補正する。

（７）、明細書１１頁１行目の１・・・交叉反応性・・
・」を「・・・交叉反応性・・・」と補正する。

（８）　　明細書第１１頁９行目の［ドＣ環グルクロナ
イド・・・］を［ドＤ環グルクロナイド・・・」と補正
する。

（９）　　明細書簡１１頁１３行目の「σ、　Ｋｗｌ：
ａｒａ　ｅｔ　ａｌ。

・・・」を「σ１回−工ｅｔ牡・・・」と補正する。

（１０）明細書第１１頁１６行目の「・・・−１６−グ
ルクロナイド・・・」を「・・・−１６α−グルクロナ
イド・・・」と補正する。

（１１）明細書第１２頁１行目の「・・・−１６−グル
クロナイド・・・」を「・・・−１６α−グルクロナイ
ド・・・」と補正する。

（１２）明細書第１２頁６行目の１・・・−１６−グル
クロナイド・・・」を「・・・−１６α−グルクロナイ
ド・・・」と補正する。

（１３）明細書第１２頁１０行目の「・・・−１６−グ
ルクロナイド・・・」を「・・・−１６α−グルクロナ
イド・・・」と補正する。

（１４）明細書第１２頁１３行目の「・・・するに去」
を「・・・するに至」と補正する。

（１５）明細書第１２頁１５行目の「・・・−１６−グ
ルクロナイド・・・」を「・・・−１６α−グルクロナ
イド・・・」と補正する。

（１６）明細書箱１３頁５行目の「・・・−１６−グル
クイド・・・・」と補正する。

（１７）明細書第１３頁８行目の「・・・−１６−グル
クロナイド・・・」を「・・・−１６α−グルクロナイ
ド・・・」と補正する。

（１８）明細書第１３頁１２行目の「明を発明するに去
った・・・」を「明を完成するに至った・・・十と補正
する。

（１９）明細書第１４頁４行目の「−１６−グルクロナ
イド・・・」を「−１６α−グルクロナイド・・・」と
補正する。

（２０）明細書第１５頁１３行目の「・・・−１６−グ
ルクロナイド・・・」を「・・・−１６α−グルクロナ
イド・・・」と補正する。

（２１）明細書第１６頁８行目の「１６−グルクロナイ
ド・・・」を［１６α−グルクロナイド・・・］と補正
する。

（２２）明細書第１６頁９行目の「・・・−１６−グル
クロ」を「・・・−１６α−グルクロ」と補正する。

（２３）明細書第１７頁２行目の「・・・−１６−グル
クロ」を「・・・−１６二−グルクロ」と補正する。

（２４）明細書第１７頁５行目の「・・・−１６」を「
°°・−１６α　」と補正する。

（２５）明細書第１７頁１０行目の「・・・−１６−グ
ルクロ」ヲ「・・・−１６α−グルクロ」と補正する（
２６）明細書第１７頁１３行目の「・・・−１６−グル
クロナイド・・・」を「・・・・−１６α−グルクロナ
イド・・・」と補正する。

（２７）明細書第１８頁５行目の１・・・−１６−グル
クロ」を［・・・−１６α−グルクロ」と補正する。

−）明細書第１９頁１３行目の［０，８１（３Ｈ，Ｓ。

００．］を「０．８１　　（３）１．ｓ、　　・・・」
と補正する。

（２９）明細書第１９頁１４行目の「３．６０　　（３
Ｈ，α。

・・・」を「３．６０　　（３Ｈ，ｄ、　　・・・」と
補正する。

（３０）明細書部１９頁１６行目のｌ”５．０９　　（
２Ｈ，Ｓ。

・・・」を「５．０９　　（２Ｈ，ｓ、　　・・・」と
補正する。

（３１）明細書第２１頁１行目の［０，８１（３Ｈ，Ｓ
、・・′・」を「０．８１　　（３Ｈ，ｓ、　　・・・
」と補正する。

（３２）明細書第２１頁２行目の「２．０２　　（３Ｈ
，Ｓ、　　・・・」を「２．０２　　（３Ｈ，ｓ、　　
・・・」と補正する。

（３３）明細書第２１頁３行目の「２．０５　　（３Ｈ
，Ｓ、　　・・・」を［２，０５（３Ｈ，８，−−・ｊ
と補正する。

（３４）明細書筒２１頁４行目の１２．０６　　（３Ｈ
，Ｓ、　　・・・」を「２．０６　　（３Ｈ１ｓ、　　
・・・」と補正する。

（３５）明細書第２１頁５行目のｌ’−３，７７（３Ｈ
，Ｓ、　　・・・」を「３．７７　　（３Ｈ，ｓ、　　
・・・」と補正する。

（３６）明細書第２１頁９行目のｌ’−５，０８（２Ｈ
，Ｓ、　　・９．」を［５，０８（２Ｈ，ｓ、　　・・
・」と補正する。

（３？）　　ｓＪ］、ｍｉｌ第２２Ｊｊ８行目ノｒＯ，
８１（３Ｈ，Ｓ、　　。

・・」をｌ’−０，８１（３Ｈ，ｓ、　　・・・Ｊと補
正する。

（３８）　　明細ｔｉ２２頁９行［ｏｒ２．０３　　（
３）（、ｓ、・−・Ｊ　ヲ［２，０３（３Ｈ，ｓ、　　
・・・Ｊ　色補正する。

（３０）明細書記２２頁１０行目の［２，０５（３Ｈ，
Ｓ、・、・］を［２，０５（３Ｈ，ｓ、　　・・・］と
補正する。

（４０）明細書第２２頁１１行目の１２．０７　　（３
Ｈ，Ｓ、・・・」を「２．０７　　（３Ｈ，ｓ、　　・
・・」と補正する。

（４１）明細書第２２頁１２行目の「３．７７　　（３
Ｈ，Ｓ、・・・」を「３．７７　　（３Ｈ，ｓ、　　・
・・」と補正する。

（４２）明細書筒２３頁９行目の「０．７７　　（３Ｈ
，Ｓ、　　・・・」を「０．７７　　（３Ｈ，ｓ、　　
・・・」と補正する。

（４３）明細書筒２３頁１０行目の「２．０３　　（３
Ｈ，Ｓ、・・・」を「２．０３　　（３Ｈ，ｓ、　　・
・・」と補正する。

（４４）　　明細書第２３頁１１行目のｌ’−２，０５
（３Ｈ，Ｓ、・る。

（４５）明細書箱２３頁１２行目のｉ２．０９　　（３
Ｈ，Ｓ。

・・・」を「２．０９　　（３Ｈ，ｓ、　　・・・」と
補正する。

（４６）明細書第２３頁１４行目のｌ’−３，７７（３
Ｈ，Ｓ。

・・・」を「３．７７　　（３）（、ｓ、　　・・・」
と補正する。

（４７）明細書筒２３頁１７行目の「４．６８　　（２
Ｈ，Ｓ。

・・・」を［４，６８（２Ｈ，ｓ、　　・・・］と補正
する。

（４Ｂ）明細書箱２４頁１５行目の「・・・ｐＨ１２・
３」を「・・・ｐＨ１２，ＯＪと補正する。

（４ｇ）明細書第２４頁１７行目の「次に０．０５Ｍ−
Ｋｉ、ＨＣＯ。

・・・」を「次に０．０５Ｍ阻ＨＣＯ１・・・」と補正
する。

（５０）明細書第２５頁４行目の「・・・のＢＳＡ　Ｉ
　Ｍあたシの・・・」を「・・・のＢＳＡ　１モルあた
りの・・・」と補正する。

（５１）明細書第２５頁５行目の「ン結合Ｍ数をＵＶ法
により求めたところ１６Ｍであ」を［ン結合モル数をＵ
Ｖ法により求めたところ１６モルでお」と補正する。

（５２）明細書第２５頁９行目の「・・・の在来種・・
・」を「・・・の在来種・・・」と補正する。

（５３）明細書２６頁８行目の１０．０６％牛ゴーグロ
ブリン・・・」を１０．０６％、牛−γ−グロブリン・
・・」と補正する。

（５４）明細書２７頁１行目の「・・・を測定する。

」を「・・・を計測する。」と補正する。

（５５）　、明細書箱２８頁１４行目の「ＦＢｔｒｉｏ
ｌ−１６−ｇｌｕｃｕｒａｎｉｄｅ−３−一切」を「艶
ｔｒｉｏｌ−１６−ｇ１回咥曇３−凪迂負、馳」と補正
する。

（５６）明細書画２８頁１５行目の「Ｔ田訪切１−１７
−μ（２）■雇、ｄ８Ｊヲｒ’Ｉ’部剪紮ルー１７−４
屏π論」と補正する。

（５７）明細書第２８頁１７行目の「ト迎ｍｌＯコ、−
３−以心耀市」を「ｈ苧葺己０１−３−鼻双ｄｄｅｊと
補正する。

（５８）明細書第２８頁２５行目ｃｒ）　「２−Ｍｅ危
ｑｅ！３ｔｒａｄｉｏｌ　ｊを「２−Ｍｅ拍−歇藷」と
補正する。

（５９）明細書第２６頁６行目の［Ｔｅ５ｔｓｔｅｒｃ
ｎｅ　Ｊを「Ｔｅ５ｔ■如ワ」と補正する。

以上 ２、特許請求の範囲 で示される６−オキツユスト１ノオールー１６α−グル
クロナイド−６−（〇−カルボキシメチル）オキシム−
ＢＳＡ結合体（式中−Ｎ　Ｈ−Ｂ　Ｓ　Ａは牛血清アル
ブミン残基を表わし１Ｇは １　−　＋ Ｃ００鬼 で示されるグルクロニル基を表わす、以下同様）力）ら
成るエストリオール−１６α−グルクロニル）’　ｍｌ
ｌ定用抗原Ｏ 「別紙２」 で示される６−オキソエストリオールを無水炭酸カリウ
ムの在存下、塩化ベンジルと反応させ６−オキソエスト
リオール−３−ベンジルエーテル（ＩＩＩ）　トｆる工
程１ で示される６−オキソエストリオール−３−ベンジルエ
ーテルとメチル−１−プロモー１−デオキシ−２，３，
４−トリー〇−アセチルーα−Ｄ−グルコピラノウロネ
ートを５一応させ６−オキソエストリオール−３−ベン
ジルエーテル−１６σ−グルクロナイドアセテートメチ
ルエ「別紙３ｊ ステル（ＩＶ）とする工程、 （式中Ｇ′は Ｃ００ＣＩ（ｓ で示されるグルクロニル基を表わす）以下同様）で示さ
れる６−オキソエストリオール−３−ベンジルエーテル
−１６α−グルクロナイドアセテートメチルエステルヲ
還元して、６−オキソエストリオール−１６α−グルク
ロナイドアセテートメチルエステル（■）とする工程、 ニ）化学構造式 で示される６−オキソエストリオール−１６α−グルク
ロナイドアセテートメチルエステルを酢酸ナトリウムの
存在下）〇−カルボキシメチルヒドロキ／ルアミン塩酸
塩と反応させ６−オキソエストリオール−１６α−グル
クロナイドアセテートメチルエステル−６−（〇−カル
ボキシメチル）オキシム（Ｖｌ）とする工程１で示され
る６−オキソエストリオール−１６α−グルクロナイド
アセテートメチルエステル−６−（０−カルボキシメチ
ル）オキシムを牛血清アルブミン（以下１、、、τ賎　
１）」 ＢＳＡと略称す）と反応させ６−オキソエストリオール
−１６α−グルクロナイドアセテートメチルエステル−
６−（０−カルボキンメチル）オキシム−ＢＳＡ結合体
（■）とする工程、 で示される６−オキソエストリオール−１６α−グルク
ロナイドアセテートメチルエステル−６−（０−カルボ
キシメチル）オキシム−ＢＳＡ結合体を部分的に加水分
解することを特徴とする化学構造式で示される６−オキ
ソエストリオール−１６α−クルクロナイド−６−（０
−カルボキシメチル）オキシム−Ｂ「別紙６」 ＳＡ結合体の製造法。

で示される化合物から成ることを特徴とするエストリオ
ール−１６α−グルクロナイドの免疫学的測定に使用す
る抗体作成用抗原。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）化学構造式 ％式％ で示される６−オキソエストリオール−１６α−グルク
   ロナイド−６−（〇−力ルボキシメチル）オキツム−Ｂ
   Ｓｊ結合体（式中−ＮＨ−ＢＳＡは牛血清アルブミン残
   基を表わし、Ｇは １−　＋ Ｃｏｏ　　Ｎａ で示されるグルクロニル基を表ｅ成るエストリオール−
   １６α−グルクロナイド測定用抗原。
2. （２）イ）化学構造式　。Ｈ で示きれる６−オキンエストリオ〜ルを無水炭酸カリウ
   ムの存在下１塩化ペノジルと反応させ６−オキ（ｍ） ノエストリオールー３−ペンジルエーテπする工程１ ＼ で示される６−オキソエストリオール−３−ベンジルエ
   ーテルとメチル−１−ブロモ−１−デオキシ−２，３，
   ４−トリー〇−アセチル−α−Ｄ−グルコビラノウロネ
   ートを反応させ６−オキソエストリオール−３−ベンジ
   ルエーテル−１６〜グルクロナイドアセテートメチルエ
   ステ÷４Ｌ九−る工程、 （式中Ｇ′は ＣＯＯＣＨ。 と互↓且見 で示されるグルクロニル基を表わす）で示される６−オ
   キソエストリオール−３−ベンジルエーテル−１６−グ
   ルクロナイドアセテートメチルエステルを還元して、６
   −オキソエストリオール−１６−グルクロナイー人ｙ」 ドアセテートメチルエスアルとする工程、で示される６
   −オキソエストリオール−１６−グルクロナイドアセテ
   ートメチルエステルを酢酸ナトリウムの存在下、〇−カ
   ルぎキシメチルヒドロキンルアミン塩酸塩と反応させ６
   −オキシエストリオール−１６−グルクロナイドアセテ
   ートメチルエステル−６−（Ｏ−カルホキ／メチル）オ
   キ／÷￥→る工程１Ｎ　ＯＣＨ，ＣＯＯＨ で示される６−オキソエストリオール−１６−グルクロ
   ナイドアセテートメチルエステル−６−（０−カルホキ
   ／メチル）オキシムを牛血清アルブミン（以下。 ＢＳＡと略称す）と反応させ６−オキソエストリオール
   −１６−グルクロナイドアセテートメチルニス結合体と
   する工程、 Ｎ０ＣＨ，Ｃ０ＮＨ−ＢＳＡ で示される６−オキソエストリオール−１６−グルクロ
   ナイドアセテートメチルエステル−６−（０−カルボキ
   シメチル）オキシム−ＢＳＡ結合体を部分的に加水分解
   することを特徴とする化学構造式で示される６−オキソ
   エストリオール−１６−グルクロナイド−６−（０−力
   ルボキシメチル）オキシム−ＢＳＡ結合体の製造法。 Ｎ　ＯＣＨ，ＣＯＮ　ＨＢ　Ｓ　Ａ で示される化合物から成ることを特徴とするエストリオ
   ール−１６α−グルクロナイドの免疫学的測定に使用す
   る抗体作成用抗原。