JPS5871459A - エストリオ−ル−３−グルクロナイド測定用抗原およびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はエストリオール−３−グルクロナイド免疫学的
測定用抗原−セ−よびその製造法に関するものである。

さらに詳しくは為エストリオール−３−グルクロナイド
の特異抗血清を得るためのハプテン−蛋白結合抗原の新
規合成法に関する。

エストリオールはエストロゲンの一種であ）１遊離型＼
抱合型等が知られている。このうち遊離型は血中には存
在するが尿中には通常出現せず１グルクロン酸抱合型Ｓ
あるいは硫酸抱金型として排せつされる。

なかでも）グルクロン酸抱合型については飄近時１その
生理的意義が注目されるようにｈす１妊婦の血中および
尿中に出現するニス）　ＩＪオール−３−グルクロナイ
ドとエストリオール−１６−グルクロナイドを分画測定
することによシ）胎児胎盤機能を）より適確にとらえる
ことの必要性が指摘されている。

従来１体液中のエストリオールは結合型エストリオール
を加水分解して為遊離型としたのち１抽出後１コ一バー
反応を利用した比色法−または蛍光法あるいは免疫測定
法等を組合せて測定されてきた。しかしながら氷解操作
を必要とするこれらの測定法は）操作が煩雑であシ）総
ニス）　ＩＪオール量から遊離ニス）　ＩＪオール量を
差引くことによって抱合型と蛋白結合型の総量を一応求
めることは出来るが、グルクロン酸抱合型と硫酸抱合型
の分画測定並びにグルクロン酸抱合型のうち１エストリ
オール−３−グルクロナイドとエストリオール−１６−
グルクロナイドの分画測定はほとんど不可能であった。

本発明は体液中のエストリオール−３−グルクロナイド
を免疫学的に測定する時に必要な特異抗体を作製するだ
めのノ・ブテン−蛋白結合抗原の新規な合成法に関する
ものであり為該抗原を用いて作製された抗体を使用する
ことによシ、体液中のエストリオール−３−グルクロナ
イドを共存する類似物質の影響を受けることなく、特異
的に測定することが可能となる。

近時１体液中のホルモンの測定法として注目されている
ラジオイムノアッセイは放射性核種で標識したホルモン
と該ホルモンに対する抗体の結合比が反応液中に加えら
れた抗原−即ち非標識ホルモンの量によって変化するこ
とをｉ！ｌ用した方法であり）感度が高く１多数検体の
測定が可能であることから１臨床検査室に於いて賞月さ
れている。

しかしながら）その特異性に関しては議論の多いところ
である。即ち、一般に体液中には測定対象物質と類似の
構造を有する物質が多数存在しているのでＡ測定に用い
る抗体は測定対象物質とのみ反応するもの）即ち特異性
が高く＼交叉反応性の低いものが要求される。測定対象
物質との結合定数が大で１かつ為特異性の高い抗体が用
意されれば該対象物質を測定するためのラジオイムノア
ッセイは、はぼ確立したことになる。

前述の如く１体液中のエストリオールを従来法で測定す
る場合、一般的には氷解操作が必要になるがラジオイム
ノアッセイにおいては、エストリオールグルクロナイド
と特異的に結合する抗体が用意されれば１水解縁作が不
要となシ１特異的、かつ高感度な測定が可能となるので
１今日ではエストリオールグルクロナイドに限らす１各
種のステロイドホルモンの抱合体を水解せずに免疫学的
に測定するだめの特異抗体の製造法）即ち一特異抗体を
製造するための抗原として１どのような物質を使用すれ
ばよいかという点に免疫学的な測定法を確立するための
研究が進められている。

その一つの例として、エストロゲン−３−グルクロナイ
ドのグルクロン酸部分のカルボキシル基にＢＳＡを結合
させた１いわゆるノ１ブテンー蛋白結合抗原が合成され
九該抗原を用いて作製された抗体を用いて為エストロゲ
ン−３−グルクロナイドを測定する方法が報告されてい
るが、該抗体は特異性が低く）遊離ニス゛トロゲンおよ
びエストロゲン−１６−グルクロナイド等に対して交叉
反応性を示すので１満足出来る結果を与えていない。（
Ｐ　、　Ｓａｍａｒａｊｅｅｔｉａｅｔ　ａｌ　：　Ｂ
ｉｏｃｈｅｔｎｉｃａｌ　Ｊ班ｍ１１５１．３６９−３
７６、１９７５年） また、カルボキシフェニルアゾエストリオール−１６−
グルクロナイドのＣ３位または０４位にカーポジイミド
法を用いてＢＡＡを結合させたハブテン−蛋白結合抗原
の場合１該抗原を用いて作製された抗体は）遊離エスト
ロゲンに対し１２．２％以下という比較的低い交叉反応
性を示し、改良された特異性を示したがＡなお不充分で
あり１この不充分な特異性はベンゾイル基にＢＳＡを結
合させる際に同時にグルクロン酸部分のカルボン酸にも
ＢＳＡが結合するためであると推定されている。（、Ｔ
、Ｒ。

５ａａｒｅｓ　ｅｔ　ａｌ　：　ＦＥＢＳ　Ｉｅｔｔ、
　６１．２６３〜２６６、１９７６年） まだ、エストロンサルフェートのＣ，位ＩＣＢＳＡヲ結
合させる方法（Ｔ　、　Ｎａｍｂａｒａ　ｅｔ　ａｌ　
：　Ｊ　、　５ｔｅｒｏｉｄ　Ｂｉｏ−ｃｈａｎ　、　
１３　、１０７５　、１９８０年）、エストロゲｙＤ環
グルクロナイドのＣｍ　ｉたはＣ４位にＢＳＡを結合さ
せる方法（Ｔ、　−ｎｅｔ　ａｌ　：　Ｊ、　５ｔｅｒ
ｏｉｄ　Ｂｉｏｃｈａｎ、　９．７８５、１９７８年、
Ｊ、−エ、恥、　１．５５．１９７８年）の場合１ハプ
テン−蛋白結合抗原を用いて作製された抗体は）いずれ
もハプテンに対して高い特異性を示すことがら、ノ・ブ
テンとＢＳＡの結合部位から離れているハプテン分子の
一部分が九抗原性決定部位となっていること＼抗体の特
異性は該抗原性決定部位に向けられているととが理解さ
れる。

このことはエストロゲン−３〜グルクロナイドの場合１
Ａ環Ｃ３位に近隣するＣ９あるいはＣ１位に担体蛋白を
結合させた抗原よりも、Ｂ環０６位に担体蛋白を結合さ
せた抗原の方がＡ環の構造を良好に認識する抗体を産生
させる上で有利であることを示している。

しかしながら、目下のところ）エストリオール−３″″
グルクロナイドの０６位にＢＳＡを結合させることによ
りヘエストリオールー３−グルクロナイドに対する特異
抗血清を得るだめのハプテン−蛋白結合抗原の合成法に
ついての報告はない。

このような観点から、本発明者等は）エストリオール−
３−グルクロナイドを免疫学的に測定する時に使用出来
る特異性の高い抗体を作製することを目的として１ハプ
テン−ＢＳＡ結合体を鋭意検索した結果）本発明を完成
するに至ったものである。

本発明は）エストリオール−３−グルクロナイドのＡ環
グルクロン酸部位にＢＳＡが結合しないようにしなから
）ステロイド骨格Ｂ環のＣ６位にＢＡＡを結合させたハ
プテン−ＢＳＡ結合体の合成法に関する。

本発明に基づいて合成された特許請求の範囲第１項に記
載されている物質１すなわち、６−オキソエストリオー
ル−６−クルクロナイ）”−６−（０−カルボキシメチ
ル）オキシム−ＢＳＡ結合体を用いて作製された抗体は
＼すでに公知の方法で得られたエストリオール−３−グ
ルクロナイド〜ＢＳＡ結合体を用いて作製された抗体に
比較してステロイドのＡ環構造の認識性が特に優れてお
！ｌｌＸ特異性においてもさらに向上することが明シよ
うとカシ１本発明を完成した。

本発明に基づいて作製された抗体は、エストリオール−
３−グルクロナイドのラジオイムノアッセイ用として特
に好適であるが１ラジオイムノアツセイに限らず、羊赤
血球またはボリスチレンラテンクス粒子を担体とする凝
集反応および凝集阻止反応に用いることも可能である。

本発明は１特許請求の範囲第２項イ）〜二）に記載した
工程に基づいて６−オキソエストリオール−３−グルク
ロナイド−６−（０−カルボキシメチル）オキシム−Ｂ
ＳＡ結合体を合成する方法に関するものであるが１本発
明のさらに加わった特徴の一つとして）エストリオール
−３−グルクロナイドのグルクロン酸部分の保護基を合
成工程の最終段階１すなわち）特許請求の範囲第２項二
）に記載した工程において脱離させることにある。

本発明に基づくエストリオール−３−グルクロナイド測
定用の抗原として用いられる新規ステロイＮＯＣ鳥Ｃ０
ＮＨ−ＢＳＡ で示される６−オキソエストリオール−３−グルクロナ
イド−６−（０−カルボキシメチル）オキシム−ＢＳＡ
結合体である。

本発明による新規ステロイド化合物は下記の構で示され
る６−オキツエストリオールー１６，１７−ジアセテー
トをメチル−（２，３，４−トリー〇−アセチルー１α
−プロモー１−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシド）ウロ
ネートと反応させ６−オキツエストリオールー１６．１
７−ジアセテート−３−グルクロナイド−トリアセテー
トメチルエステル（ＴＩＴ　）とする工程、口）化で示
される６−オキツエストリオールーｉａ’、ｉ７−ジア
セテート−３−グルクロナイド　トリアセテートメチル
エステルを酢酸ナトリウムの存在下、０−力ルボキシメ
チルヒドロキシルアミン塩酸塩と反応させ６−オキツエ
ストリオールー１６．１７−ジアセテート−３−グルク
ロナイド−トリアセテートメチルエステル−６−（０−
カルボキシメチル）オキシム（ＩＶ）で示される６−オ
キツエストリオールー１６．１７−ジアセテート−３−
グルクロナイド−トリアセテートメチルエステル−６−
（０−力ルポキシメチル）オキシムをＢＳＡと反応させ
６−オキツエストリオールー１６゜１７−ジアセテート
−３−グルクロナイド−トリアセテートメチルエステル
−６−（０−カルボキシメチル）オキシム−ＢＳＡ結合
体とする工程、二）化学構造式　　　　　　　　　　　
　　　〇−ＣＯＣＨ。

で示される６−オキツエストリオールー１６，１７−ジ
アセテート−３−グルクロナイド−トリアセテートメチ
ルエステル−６−（０−力ルボキシメチル）オキシム−
ＢＳＡ結合体（Ｖ）を部分的に加水分解する工程１以上
のイ）１０）１ハ）１二）の各工程を組合せることによ
って製造されるものである。

次に本発明の実施例を示す。

実施例１゜ 化学構造式（ＩＩ）で示される市販の化合物、６−オキ
ツエストリオールー１６．１７−ジアセテート３００ｍ
９をトルエン５０ｍ１に溶解後１炭酸カドミウム３００
■を加え１ケタール化装置により脱水後入メチルｒ２．
３．４−）　ＩＪ−０−７セ−Ｆ−／Ｉ／　−１ａ−フ
Ｊモー１−チオキシーＤ−グルコピラノシド）ウロネー
ト３００■を加え）１４時間還流後、シリカゲルカラム
クロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル１　：１）
に付す。次いで分取ＴＬＣ（ヘキサン／酢酸エチル３：
２）に付し、Ｒｆ値０．２３の両分を酢酸エチルで溶出
後）減圧濃縮した後１メタノールから再結晶すると為化
合物（■）　１０５■が無色針状結晶として得られた。

無色針状結晶性化合物（ｍ）の分析値 ｍ、ｐ、　　２３０”〜’２３１．５’″元素分析値 Ｃ：　５９．７０　、Ｈ：　６．１４ 化学式Ｃｊ８Ｈ４！ＯｊＢに対する計算値Ｃ：　５９，
８３　、Ｈ：　５．９８ ＮＭＲ（ＣＤＯｓ） ’０．８７　　（３Ｈ，ｓ、　ｌ８−ＣＨ，）２．０４
．２．１０　　　（１２Ｈ，３Ｈ，ｅａｃｈｓ、１６−
．１７−．２’、３−．４′−〇〇〇〇も　） ３．７２　　　（３Ｈ，ｓ、Ｃ００ＣＨ，）４、．２５
　　　（ＩＨ，ｍ、５’＝Ｈ）４．９５　　　（ＩＨ，
ｄ、Ｊニア七、　１’−Ｈ）５．３０　　　（５Ｈ，ｍ
、１６β−、１７ａ−、２’−、３’−、４’−Ｈ）７
．２２　　　（２Ｈ，ｍ、ａｒａＩａｔｉｃＨ）７．６
０　　　（ＩＨ，ｄ、Ｊ＝２七、４−）１）無色針跡結
晶性化合物（ｍ）８０■をメタノール／酢酸エチル（５
：１）１８ｍ／に溶解し１０−カルボキシメチルヒドロ
キシルアミン塩酸塩１９０■および１０９６酢酸す）　
ＩＪウム溶液１．０ｍｌを加えＡ３５℃で１２時間攪拌
後＼反応液に水を加え１酢酸エチルで抽出する。抽出液
を水洗乾燥後為溶媒を留去しＡ残査をエーテルから再結
晶すると化合物（ＩＶ）６０■が無色針状結晶として得
られた。

無色針状結晶性化合物（ＩＶ）の分析値ｍ、ｐ、　　　
　１８３＠〜１８５’ ０ （α）　　　　−５８，６”　（Ｃ＝　０．４７　、　
ＣＨＣｌ５）元素分析値 Ｃ：　５５．２９　、　Ｈ：　５，６９　、Ｎ　：　１
．８９化学式ＣＩ？Ｈ４Ｂｏｌ？Ｎ・１÷４０に対する
計算値ｃ　　：　５５．３６　、Ｈ：　６，０３　、Ｎ
　　：　１．７４ＮＭＲ（ＣＤ（ｌｓ） ０．８２　　　（３Ｈ，ｓ、１８−ＣＨｓ）２．０２　
　　　（１５Ｈ，ｍ、１６−．１７−．２’＋、３’−
，４’０ＣＯＣＨｓ　）３．７５　　　（３Ｈ，ｓ、Ｃ
００ＣＨ，）４．２０（ＩＨ，ｍ、５’−Ｈ） ４．７０　　　（２Ｈ，ｓ、＝ＮＯＣＨ，−）４．９５
　　　（ＩＨ，ｄ、Ｊ＝７七、　１′−Ｈ）５．０５〜
５．４０　　　（５Ｈ，ｍ、　１６β−、１７ａ−、２
’＋、　３’−、４’−Ｈ） ６．９５　　　（ＩＨ，ｄｄ、、Ｔ＝＝８．２七、２−
Ｈ）７．２０　　　（ＩＨ，ｄ、Ｊ＝＝８豫、　１−Ｈ
）７．５０　　　　（ＩＨ，ｄ、Ｊ＝２七、　４−Ｈ）
無色針状結晶性化合物（ＩＶ）　６０■をジメチルホル
ムアミド（以下ＤＭＦと略称す）２．４ｍｌに溶解し・
水冷下）トリーｎ−ブチルアミン８０Ｊｊ１およびイソ
プチルクロロフオルメー）１８Ｐ１を添加し３０分後１
氷冷下）ＢＳＡ　１９２■を含有する含水ＤＭＦ’ノア
／’カリ溶液（Ｈ，０３、６ｍｌ　−ＤＭＦ　４　、８
　ｍｌ−ＩＮ　ＮａＯＨ０，２ｍｌ）を加え、ｐＩ（７
，０〜７．５に調整後、４℃で１５時間攪拌し１得られ
た反応液を冷水にて２３時間透析後）凍結乾燥に付し１
ハプテン−ＢＳＡ結合体（Ｖ）　２７５■を得た。

ハブテｙ−ＢＳＡ結合体（Ｖ）２７５１１１９を水５０
ｍ１溶解後、５’Ｎ、ＮａＯＨニテｐＨ１２，０〜１２
．５　Ｋ１１４整した液を２５℃で１８時間攪拌する。

次に冷水で２２時間透析後、凍結乾燥し１化合物（ｉ）
２３２■を得た。

化合物（Ｔ））すなわち６−オキソエストリオール−３
−グルクロナイド−６−（０−カルボキシメチル）オキ
シム−ＢＳＡ結合体のＢＳＡ　１モル当シのノーブテン
結合モル数をＵＶ法によシ求めたところ３４モルであっ
た。

実施例２゜ 抗体の作成（ウサギの免疫） 体重２．５〜３．０　ｋｇの在来種白色ウサギ３羽に６
−オキソエストリオール−３−グルクロナイド−６−（
０−カルボキシメチル）オキシム−ＢＳＡ結合体抗原を
以下の如く免疫した。

すなわち九抗原２■を滅菌生理食塩液０．５ｍｌに溶解
させ１これをフロイント・コンプリート・アジュバント
０．５−にてエマルジョンにし）このエマルジョンをウ
サギの肩甲部および足ａ数ケ所に皮下投与した。以後２
ケ月にわたって２週間毎に同様の投与を行った。最後の
投与（第５回目の投与）から１週間後に１このウサギの
耳静脈力・ら１０ｍｅを採血し）これを３０００回転１
１０分間の遠心分離にかけ１得られた抗血清を一２０℃
に保存した。使用時においては１該抗血清を解凍し、Ｂ
ＳＡ　Ｏ。

０６　％、牛−γ−グロブリン０．０５％を含む０．０
５Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８，０）を用いて１：３０００
の希釈率で希釈しＡ標準曲線を作成した。

測定操作 ニストリオ−Ａ／−３−グルクロナイドを含む試料にエ
ストリオール−３−グルクロナイド−６，７−Ｈ（約７
５００　ｄｐｍ　）および抗血清０．２５　ｍｅを添加
し１４℃で１時間装置する。次いで５０％硫安溶液０．
２５ｍ１を添加し１４℃で２０分間放置後、　ａｏｏｏ
回転で１５分間遠心し１得られた上澄液０．２ｍ／をと
シ１放射活性を計測する。

交叉反応性について ６−オキソエストリオール−３−グルクロナイド−６−
（０−カルボキシメチル）オキシム−ＢＳＡ結合体で免
疫したウサギから得られた前述の抗血清の特異性を調べ
るために為３２種のステロイドを用いてその交叉反応性
をエストリオール−３−グルクロナイド−６，７−Ｈの
本抗血清への結合量を標準曲線よシ求めた結果を第１表
に示す。

第１表の交叉反応の欄における数値は為非標識エストリ
オール−３−グルクロナイドの５０９６阻止量を１００
とじ九これに対する各種ステロイドの読みの比率の逆数
を百分率で示したものである。

第１表の結果よシ１本発明の新規化合物を利用した抗原
による抗体を使用したもののエストリオール−３−グル
クロナイドに対する特異性が他のものに比較して１極め
て高く１交叉反応が低く抑えられていることが明シよう
である。

特許出願人 栄研化学株式会社 手続補正書（自発） 昭和５６年１１月１７日 特許庁長官　島ロコ　要衝　殿 １、事件の表示 昭和５６年特許出願第１６８８３３号 ２、発明の名称 ３、補正をする者 事件との関係　本人 ブンｈウホンゴウ 住所　東京都文京区本郷１丁目３３番８号４、補正の対
象 明細書中「発明の詳細な説明」の欄 Ｊ−魁・・・」ヲ「・・・Ｂｉｏｃｈｅｍ、　、Ｔ　、
　、　、　、　ｊと補正する。

（２）明細書第１１頁６行目の「・・・１０７５．　　
・・・」を「・・・１０７５〜１０７９．・・・」と補
正する。

（３）明細書第１１頁８行目から９行目にかけての「・
・・７８５　・・・」を「・・・７８５〜７９０・・・
」と補正する。

（４）明細書第１１頁９行目の「・・・５５．・・・」
を「・・・５５〜５９．・・・」と補正する。

（５）明細書簡１３頁４行目の「・・・ジオール−６−
グルクロ・・・Ｊｔ−ｒ・・・ジオール−３−グルクロ
・・・」と補正する。

（６）明細書簡１４頁１２行目の［ド化合は、・・・コ
を「ド化合物はＡ　・・・」と補正する。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 で示される６−オキソエストリオール−３−グルクロナ
   イド−６−（〇−カルボキシメチル）オキシム−ＢＳＡ
   結合体（式中−ＩＩ（−ＵＳＡは牛血清アルブミン残基
   を表わし１Ｇは ｏｏ　Ｎａ で示されるグルクロニル基を表わす。以下同様。 ）から成るエストリオール−３−グルクロナイド測定用
   抗原。 で示される６−オキツエストリオールー１６．１７−ジ
   アセテート　（■）をメチル（２，３，４−ト１リー０
   −アセチルー１α−プロモー１−デオキシ−Ｄ〜グルコ
   ピラノシド）ウロネートと反応させ６−オキツエストリ
   オールー１６．１７−ジアセテート−３−グルクロナイ
   ドトリアセテートメチルエステル（Ｉｌｌ　）とする工
   （式中Ｇ′は ＣＯＯＣＨ。 で示されるグルクロニル基を表わす。以下同様。 ）で示される６−オキツエストリオーＡ、−１６．１７
   ジアセテートー３−グルクロナイド−トリアセテートメ
   チルエステル（ＩＩＩ　’）を酢酸ナトリウムの存在下
   １０−カルボキシメチルヒドロキシルアミン塩酸塩と反
   応させ６−オキツエヌトリオールー１６．１７ジアセテ
   ートー３−グルクロナイド−トリアセテートメチルエス
   テル−６−（０−カルボキシメチル）オキで示される６
   −オキンエストリオー／Ｉ／−１６，１７−ジアセテー
   ト−３−グルクロナイド−トリアセテートメチルエステ
   ル−６−（０−カルボキシメチル）オキシム（ＩＶ）を
   牛血清アルブミンと反応させ６−オキツエストリオール
   ー１６．１７−ジアセテート−３−グルクロナイド−ト
   リアセテートメチルエステル−６−（０−カルボキシメ
   チル）オキシム−ＢＳＡ結合で示される６−オキツエス
   トリオールー１６．１７−ジアセテート−３−グルクロ
   ナイド−トリアセテート６−（０−カルボキシメチル）
   オキシム−ＢＳＡ結合体（Ｖ）を部分的に加水分解する
   ことを特徴とする化学構造式 で示される６−オキソエストリオール−３−グルクロナ
   イド−６−（０−カルボキ７メチ７＋／）オキシム−Ｂ
   ＳＡ結合体（Ｉ）の製造法。 ３°）　イＢ　’ｉ−ｔ’＃　’ｌｌｉ　Ｋ　　　　　
   ｏ。 で示される６−オキソエストリオール−３−グルクロナ
   イド−６−（０−カルボキシメチル）オキシム−ＢＳＡ
   結合体から成るエストリオール−３−グルクロナイドの
   免疫学的測定に使用する抗体作製用抗原。