JPS6390763A - カテコ−ルエストロゲンのイムノアツセイキツド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （技術分野） この発明は、カテコールエストロゲンのイムノアッセイ
に関するものである。さらに詳しくは、カテコールエス
トロゲンのイムノアッセイキッドに関するものである。

（背景技術） カテコールエストロゲンは、乳ガンに関係するホルモン
として重要なエストロゲンの主要な代謝産物のひとつで
あり、生理・代謝の観点から注目されている物質である
。

エストロゲンとの類似性については、すてにカテコール
エストロゲンには乳ガン細胞に対して促進的に作用する
場合と、抑制的に作用する場合があることが報告されて
おり、エストロゲンと同様に、カテコールエストロゲン
は乳ガンに深くかかわっている物質であることが知られ
ている。

また一方では、このカテコールエストロゲンについては
、黄体形成ホルモンやプロラクチン分泌に及ぼす影響な
どの脳内生理作用、子宮向性作用など、中枢、末梢にお
けるその特異な作用についての関心が高まっている。

しかしながら、このカテコールエストロゲンは体内に極
微量（フェントモルのオーダー）しか存在しないため、
その検出は極めて難しく、カテコールエストロゲンの生
理、代謝作用について正確に判定することは困難であっ
た。

このため、カテコールエストロゲンの極微量検出の方法
を実現することが強く望まれていた。

特にこのことは、今後の乳ガンの診断にとっても重要な
ことである。カテコールエストロゲンと乳ガンとの関連
が正確に判定できるようになるならば、現在、必ずしも
明確にその根拠が明らか番こされていない卵巣除去によ
るホルモンコントロール、その乳ガン治療への応用につ
いても妥当性が明らかになる。乳ガンの適正な診断と、
乳ガン患者からの卵巣摘出の可否の判定などに大きな福
音をもたらすことになる。

（発明の目的） この発明は、以上のような事情を鑑みてなされたもので
あり、生理、代謝作ｍが注目されているカテコールエス
トロゲンの極微量の検出、測定をも可能とするカテコー
ルエストロゲンのイムノアッセイキッドを提供すること
を目的としている。

（発明の開示） この発明のイムノアッセイキッドは、カテコールエスト
ロゲンに対して特異性を有する抗体の産生のために１次
式で示されるカテコールエストロゲンのタンパク質複合
体をひとつの要素として用いることを最も大きな特徴と
している。

Ｉ″２ （式中のΔは、±Ｎ−０−または一〇−ＧＯ−１ｎは、
１〜４の整数、−Ｎ　Ｈ−Ｐはタンパク質からアミノ基
の水素原子ｔｉｌｌを除いた残基、Ｒ７およびＲ２は、
各々別異に■（またはＯＨを示す）このカナ：１−ルエ
ストロゲンのタンパク質複合体ｍは、たとえば、Ａが＝
Ｎ−０−１ｎが１、−　Ｎ　Ｈ−Ｐがウシ血清アルブミ
ン残基である場合（１１）には、２−ヒドロキシエスト
ロンまたは４−ヒドロキシエストロン［１ｉｉ）より、
次の反応式に従って製造することができる。

すなわち、２−ヒドロキシエストロン跋なは４−ヒドロ
キシエストロン（ｉｌｉ）をカルボキシメチルハイドロ
キシ、ルアミンと縮合反応させて２−ヒドロキシエスト
ロン−１７−（０−カルボキシメチル）オキシムまたは
４−ヒドロキシエストロン−１７−（０−力ルポキシメ
チル）オキシム（１ｖ）に誘導し、キャリアタンパクと
してのウシ血清アルブミン（ＤＳＡ）と結合させて、目
的の夕ンパク質複合体のハプテン−ＢＳＡ（ｉｔ）を合
成する。出発物質の２−ヒドロキシエストロンまたは４
−しドロキシエストロン（ＩＩＩ）は、エストロン（３
−ヒドロキシエストラ−１，３，５（１０）−トリエン
−１７−オン）（Ｖ）より、次の反応式に従って合成す
ることができる。

この発明のイムノアッセイの対象となるカテコールエス
トロゲンは、式中の（ｖｌ）ｍｉ）の４種の物質（カテ
コールエストラジオールおよびカテコールエストロン）
である。

（：）：乙、：島Ｉｌｌ　　　　　　（Ｈ：ａπ“１．
、：ヱコ：：）（’ｔ＝乙、：霞　　　　（ｌｌｔ：Ｏ
“′９・Ｒ１！：：：）（ｖｉｉ） この発明の抗体産生に用いるカテコールエストロゲンの
式（１）で示される一ＮＨ−Ｐ基を形成するタンパク質
は、ウシ血清アルブミンに限定されることなく、通常に
免疫化学の分野でハプテンに対して使用されているもの
であれば特に制限はない０ｇ通には、アルブミン、グロ
ブリンなどを使用する。特にウシ血清アルブミンやウサ
ギ血清アルブミンが好適に用いられる。

得られたカテコールエストロゲン、タンパク質複合体（
１）を用いて、カテコールエストロゲンに対して特異的
な抗体を産生ずるには、この複合体（１）を動物（ウシ
、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、ラット、マウスなど）
の生体に非経口投与し、該生体内に抗体を産生させる。

その後、該生体から体液（たとえば血液）を採取する０
通常は、抗体を含む血清、すなわち抗血清の形態におい
て使用する。

この発明は、以上の抗体を用いてカテコールエストロゲ
ンのイムノアッセイを行うものであるが、抗体との組合
せで用いるＨ識抗原としては、カテコールエストロゲン
を適宜な方法で標識化したものを使用する。この標識化
のためには放射性物質、酵素、蛍光物質、発光物質、な
どの適宜なものを用いることができる。また、これらの
Ｉ［物質のカテコールエストロゲン内への導入位置は、
得られたｖＡ識抗原の免疫活性が保持されている限り、
特に制限はない、Ｈ，Ｃ，！、　　■などの放射性元素
による標識化も有効である。

この発明のイムノアッセイのキッドは、これらの標識化
されたカテコールエストロゲンと、上記の抗体とからな
っている。このイムノアッセイキッドは、特に、乳ガン
の発生、増殖、あるいは抑制にかかわっていることが推
察されるカテコールエストロゲン特性の検出、定量に有
用なものである。その他、乳ガンに限定されずに、生体
の脳をはじめとする諸組織での生理、代謝を判断するた
めにも欠かせないものである。

乳ガンについては、生体の体液中のカテコールエストロ
ゲンの極微量の検出によって、ガン発生、その進行、さ
らには卵巣摘出の判断に重要な指凛を与えるものと示唆
される。この点に関しては、たとえば、乳ガンとの関係
が示唆されているエストロゲンの場合と同様に、カテコ
ールエストロゲンスルホトランスフェラーゼおよびカテ
コールエストロゲンスルファターゼの酵素活性のアッセ
イ方法、アッセイキッドとしても、この発明は有用であ
る。

以下、実施例を示し、さらに詳しくこの発明を説明する
。この発明は、これら実施例に限定されるものではない
、イムノアッセイの具体繰作条件などは、適宜に選択で
きるものである。

実施例　１ （カテコールエストロゲン抗体産生試薬の合成）（ａ）
２．３−ジヒドロキシエストラ−１，３，５（１０）−
）ジエン−１フーオン（式（ｉｉｉ）　）１００■およ
びアスコルビン酸５０■をメタノール１０ｎ＋Ｉに溶解
し、カルボキシメチルヒドロキシルアミン塩酸塩１００
■を加え、窒素気流中、室温で一夜攪拌した。

減圧下に反応液の溶媒を留去し、残渣に０．０５　Ｎ−
塩酸１０ｍ１を加え、酢酸エチルエステルで３回抽出処
理した。有機層を２回水洗し、無水硫酸ナトリウムで乾
燥後、減圧下に溶媒を留去した。

残渣骨を酢酸エチルエステル−エーテルで再結晶し、２
−ヒドロキシエストロン−１７−（０−力ルボキシメチ
ル）オキシム（式（ｉｖｙ）６０ｍｇを黄色針状晶とし
て得た。

（ｂ）上記生成物オキシム（式（ｉｖ））５０■をジオ
キサン２ｍｌに溶解し、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
７０■および１−エチル−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）カルボジイミド塩酸塩１００■の１Ｍリン酸緩衝液
（ＤＨ６，５＞　４０　ａ＋Ｉ溶液中に滴下し、遮光し
、ｐｌ＋　６．５．４０℃の温度で一夜攪拌した。

反応液はｏ、ｏｏｔ％アスコルビン１ｉＱ２ｊ中で１時
間透析し、さらに透析操作を繰り返し、凍結乾燥後、ハ
プテン−ＢＳＡ　（式（ｉｔ）、Ｒ１＝ＯＨ，Ｒ２＝ｆ
（）１２０■を淡黄色粉末として得た。

実施例　２ （抗カテコールエストロゲン抗血清の産生）実施例１に
おいて得られたハプテン−ＢＳＡ４■を注射用生理食塩
水０，５ｍｌに溶解し、フロイント完全アジュバント（
Ｆｒｃｕｎｄ’Ｓ　ＣｏｍｐｌｅｔｅａｄｊｌＪＶａ−
ｎｊ　）　　０．５ｍｌを加えて３０分間激しく攪拌し
た。

懸濁液１ｍｌを白色雄性家兎（１，５〜２．５ｋｇ＝）
に２ケ月間は隔週で、それ以後は１ケ月番こ１回の頻度
で脚部および背部に皮下投与した。投与開始２ケ月以後
、１ケ月ごとに最終投与から８〜１０日後、耳静脈から
採血（１〜２ｍ１）した。

室温で１時間放置後、８００Ｘｇ、４℃で１５分間遠心
処理し、抗血清を得た。

さらに７〜８ケ月後、最終投与から８日目、頚動脈から
全採血したのち、上記と同様の操作に従い、抗血清を得
た。得られた抗血清は一２０℃で冷却保存した。

実施例　４ （抗血清の抗体価、希釈度） 実施例３において得られた抗血清の力価は、×５０、×
１００、×２００、×５００、ｘｔｏｏｏ、Ｘ５０００
倍の各希釈率によって標準曲線を作成した。

抗体価は次のようにして測定した。

〔３Ｈ〕カテコールエストロゲン（約 ５．０ＯＯｄｐ鵬）およびカテコールエストロゲン（０
，０５〜１．０ｎＯ＞に、希釈抗血清（１：５０．１０
０．２００、５００．１，０００．５，０００）　　０
．０５　Ｍホウ酸ＩＩＬ街液（ＩＩＨ７，４）　　（０
，０５％ＢＳＡ、０．０６％ウシ血清γ−グロブリン、
０．０１％Ｎ　ａ　Ｎ　３　．０．０５％アスコルビン
酸）溶液（０，２５ｍｌ　）を加え、３７℃の温度で１
時間インキュベートした１次いで５０％（ＮＨ４＞２Ｓ
ｏ４　（０，２５ｍ１）を加え、攪拌し、室温で１５分
間放置した。

８００Ｘｒで１５分間遠心分離したのち、その上清（０
，２＋ｎｌ）にシンチレータ−（１０ｍｌ　）を加え、
放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定した
。

このようにして、抗血清と５０％の結合を示す希釈倍率
を抗体価とした。このとき、アッセイに最適な希釈倍率
を求め、標準曲線を作成した。

２−ヒドロキシエストロンは、Ｏ，ＯＳ〜１．０ｎｇの
測定範囲において、×２００、×５００、ｘ２，０００
倍希釈抗血清での阻害差（％）は、それぞれ２０．４０
．０（％）であったため、５００倍を最適希釈率とし、
標準曲線を作成した（添附図面の第１図）、また、４−
１−ドロキシエストロンの０，０５〜１．Ｏｎｇの測定
範囲での抗血清の最適希釈倍率は５００倍であった（第
２図参照）。

実施例　５ （交叉反応性・ラジオイムノアッセイ）得られた抗血清
について、他のカテコールエストロゲンとの交叉反応性
について検討した。

すなわち、（６，７−３Ｈ）　２−ヒドロキシエストロ
ンまたは（６，７−３Ｈ）　２−ヒドロキシエストラジ
オールを用いたとき、抗ヒドロキシエストロン抗血清に
対する４種のカテコールエストロゲン（２−ヒドロキシ
エストロン、２−ヒドロキシエストラジオール、４−ヒ
ドロキシエストロン、４−ヒドロキシエストラジオール
）の交叉反応性をラジオイムノアッセイによって求めた
。

ラジオイムノアッセイは次の方法によって行った。

〔３Ｈ〕カテコールエストロゲン（約 ５、ＯＯＯｄｐｍ）およびカテコールエストロゲン（０
，０５〜１０．０ｎｏ＞または試料に、希釈抗血清（１
：５００　）　　（０，２５ｍｌ）を加え、４℃で１８
時間インキュベートした０次いで５０％（Ｎ　Ｈａ　）
　２　ＳＯａ　　（０−２５ｍｌ　）を加え、攪拌し、
室温で１５分間放置した。

ｓ　ｏ　ＯＸ（＋で１５分間遠心分離し、その上清（０
，２＋ａｌ）にシンチレータ−＜　１０　ｍｌ　）を加
え、放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定
した。

（６，７−３Ｈ）　４−ヒドロキシエストロンまたは（
６，７−３Ｈ）　４−ヒドロキシエストラジオールにつ
いても同様に行った。

交叉反応性は、抗血清の結合に対して標識抗原の５０％
阻害を示す値により交叉反応性を算出した。

次の表に示したように、それぞれほぼ１００％の交叉反
応性を示した。

このことは、１７位のカルボニル基を介してＢＳＡと縮
合させた実施例１の抗原を免疫して１％られな抗血清で
あるため、エストロゲンの構造上の１７位のカルボニル
基あるいは水酸基の変化に影響されないことを示してい
る。このため、カテコールエストロゲンとカテコールエ
ストラジオールとからなるカテコールエストロゲンの総
量として、アッセイが可能となる。

実施例　６ （カテコールエストロゲン　スルホトランスフェラーゼ
・アッセイ） ４種のカテコールエストロゲンを基質としたときの、細
胞質および細胞膜分画におけるスルホトランスフェラー
ゼによって生成するカテコールエストロゲンの硫酸抱合
体の量をラジオイムノアッセイにより測定し、この酵素
の活性を求めた。ラジオイムノアッセイには、実施例４
〜５によって確立された方法を用いた。

すなわち、カテコールエストロゲン（０，５〜１０μＨ
）およびＰＡＰＳ　（４０μＨ）に、乳ガン細胞（ラッ
ト乳ガン）の細胞質分画（０，５■１０．５ｍｌ＞ある
いは細ｍ膜分画（０，５＠ｒ／　０．５＋ｍｌ　）を加
え、３７℃で３０分間インキュベートした。

ついでエーテルで抽出（０，５＋ｍ１Ｘ２）Ｌ、水層（
０，０５ｍｌ　）にアリールスルファターゼ（１０μＱ
　）　　０．２Ｍアセテート＃ｌ衝滴液ｐＨ５，５）溶
液（０，５ｍ１）を加え、５５℃で１時間インキュベー
トした。さらに反応液をエーテルで抽出（０，５ｍｌ×
２）し、有機層を窒素ガスで乾固した。

実施例５に従ってカテコールエストロゲンの量を測定し
た。同時にブランクテストとして、熱処理各分画を用い
たものについても行って測定値を補正した。

４−ヒドロキシエストロンについて、このアッセイによ
って得られた硫酸抱合体の生成量は、第３図のとおりで
あった。添加回収テストの結果は、次の表に示したとお
りである。

２−ヒドロキシエストロン−モノ−サルフェート、４−
ヒドロキシエストラジオール−モノ−サルフェートは１
０〜５ｏｎｏの範囲で、また２−ヒドロキシエストラジ
オール−モノ−サルフェート、４−ヒドロキシエストロ
ン−モノ−サルフェートは５〜５０ｎＱの範囲で一定の
回収率であり、良好な再現性で定量できることが明らか
になった。

また、カテコールエストロゲンスルホトランスフェラー
ゼのｖｅａｘ　　（酵素最大速度）とＫｍ（ミハイル定
数）を求めたところ、細胞質分画にこの酵素は局在化し
ていることがわかった。

【図面の簡単な説明】

第１図および第２図は、各々２−ヒドロキシエストロン
および４−ヒドロキシエストロンの標準曲線を示したも
のである。 第３図は、４−ヒドロキシエストロンの硫酸抱合体生成
量との関係を示したものである。 代理人　弁理士　　　西　澤　利　夫 第　　１　　図 ２−ヒドロキシエストロン （ｎｇ） 第　　２　　図 ４−ヒドロキシニストロ／ （ｎｇ）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）次の式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中のＡは、＝Ｎ−Ｏ−または−Ｏ−ＣＯ−、ｎは、
   １〜４の整数、−ＮＨ−Ｐはタンパク質からアミノ基の
   水素原子１個を除いた残基、Ｒ＿１およびＲ＿２は、各
   々別異にＨまたはＯＨを示す） で示される抗体産生用試薬を抗原とすることにより製造
   されたカテコールエストロゲンに対して特異性を示す抗
   体と、標識化したカテコールエストロゲンとからなるカ
   テコールエストロゲンのイムノアッセイキッド。 （２）放射性同位元素によって標識化したカテコールエ
   ストロゲンを用いる特許請求の範囲第 （１）項記載のカテコールエストロゲンのイムノアッセ
   イキッド。 （３）乳ガンにおけるカテコールエストロゲン特性の検
   出に用いる特許請求の範囲第（１）項または第（２）項
   記載のカテコールエストロゲンのイムノアッセイキッド
   。 （４）乳ガンの診断に用いる特許請求の範囲第（１）項
   または第（２）項記載のカテコールエストロゲンのイム
   ノアッセイキッド。