JPH08333398A - コルチゾールについてのイムノアッセイ方法及びそれに使用する試薬 - Google Patents
コルチゾールについてのイムノアッセイ方法及びそれに使用する試薬Info
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- JPH08333398A JPH08333398A JP8068224A JP6822496A JPH08333398A JP H08333398 A JPH08333398 A JP H08333398A JP 8068224 A JP8068224 A JP 8068224A JP 6822496 A JP6822496 A JP 6822496A JP H08333398 A JPH08333398 A JP H08333398A
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- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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- G01N33/743—Steroid hormones
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07J—STEROIDS
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- C07J41/0005—Normal steroids containing one or more nitrogen atoms not belonging to a hetero ring the nitrogen atom being directly linked to the cyclopenta(a)hydro phenanthrene skeleton
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C07K—PEPTIDES
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- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
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- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
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- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 本発明はコルチゾール、特に尿中のコルチゾ
ールについてのイムノアッセイ方法を提供することを課
題とする。 【解決手段】 本発明は、巨大分子にカルボキシル基を
介してカップリングされたハプテンであるコルチゾール
−３−カルボキシメチルオキシム（ｓｙｎ）異性体より
成る免疫原化合物に対する動物の免疫により生産され
た、尿中のコルチゾールを特異的に認識するポリクロー
ナル又はモノクローナル抗体を利用する、コルチゾール
についてのイムノアッセイ方法、アッセイキット、及び
コルチゾールの新規誘導体を提供する。
ールについてのイムノアッセイ方法を提供することを課
題とする。 【解決手段】 本発明は、巨大分子にカルボキシル基を
介してカップリングされたハプテンであるコルチゾール
−３−カルボキシメチルオキシム（ｓｙｎ）異性体より
成る免疫原化合物に対する動物の免疫により生産され
た、尿中のコルチゾールを特異的に認識するポリクロー
ナル又はモノクローナル抗体を利用する、コルチゾール
についてのイムノアッセイ方法、アッセイキット、及び
コルチゾールの新規誘導体を提供する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、コルチゾールに対
して特異的な一定の抗体の驚くべき特性に基づく、抽出
もクロマトグラフィーも必要としないコルチゾールにつ
いての新規のイムノアッセイ方法に関する。
して特異的な一定の抗体の驚くべき特性に基づく、抽出
もクロマトグラフィーも必要としないコルチゾールにつ
いての新規のイムノアッセイ方法に関する。
【０００２】本発明は、詳しくは、抗体自体、それを獲
得するための方法、これらの抗体に基づくコルチゾール
についてのアッセイ方法、及び前記方法の利用を可能と
する試薬キットを提供する。
得するための方法、これらの抗体に基づくコルチゾール
についてのアッセイ方法、及び前記方法の利用を可能と
する試薬キットを提供する。
【０００３】
【従来の技術】主要のグルココルチコイドホルモンであ
るコルチゾールは副腎皮質の線維束及び網様帯において
合成される。これはいくつかの酵素の影響のもとでコレ
ステロールから誘導される。その分泌速度は視床下部−
下垂体のコントロール下にある。ＣＲＦ（コルチコトロ
ピン放出因子）は、ＡＣＴＨを産生する下垂体前葉を活
性化し、このＡＣＴＨは９０％がコルチゾールを占める
コルチコイドを合成する副腎皮質を刺激する。血漿の中
では、大半のコルチゾールは血漿タンパク質、主として
コルチコステロイド結合性グロブリン、アルブミン及び
テストステロンエストラジオール結合性グロブリンに結
合した形態で循環する。それはごくわずかな割合で遊離
形態で存在している。
るコルチゾールは副腎皮質の線維束及び網様帯において
合成される。これはいくつかの酵素の影響のもとでコレ
ステロールから誘導される。その分泌速度は視床下部−
下垂体のコントロール下にある。ＣＲＦ（コルチコトロ
ピン放出因子）は、ＡＣＴＨを産生する下垂体前葉を活
性化し、このＡＣＴＨは９０％がコルチゾールを占める
コルチコイドを合成する副腎皮質を刺激する。血漿の中
では、大半のコルチゾールは血漿タンパク質、主として
コルチコステロイド結合性グロブリン、アルブミン及び
テストステロンエストラジオール結合性グロブリンに結
合した形態で循環する。それはごくわずかな割合で遊離
形態で存在している。
【０００４】視床下部−下垂体−副腎皮質軸線の機能性
診査は大幅にコルチゾールの測定を基礎とする。血清中
のコルチゾールの測定は動的検査の際に本質的に利用さ
れる。遊離の尿性コルチゾールはホルモンの生産率と良
好な相関関係を示し、そして副腎皮質機能亢進症の症例
における最良のホルモン指標であり続けている。
診査は大幅にコルチゾールの測定を基礎とする。血清中
のコルチゾールの測定は動的検査の際に本質的に利用さ
れる。遊離の尿性コルチゾールはホルモンの生産率と良
好な相関関係を示し、そして副腎皮質機能亢進症の症例
における最良のホルモン指標であり続けている。
【０００５】血清中のコルチゾールの直接測定は、他の
全てのステロイドとの対比におけるその概して高いレベ
ルにより助長される。尚、この他の全てのステロイドか
らは、非常に異なる構造を有し、且つ抗コルチゾール抗
体によってはほとんど認識されないアンドロゲンのファ
ミリーに属するデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥ
Ａ）スルフェートは除かれる。市場にある全てのラジオ
イムノアッセイ又は酵素イムノアッセイキットは血清中
のコルチゾールの直接測定のための技術を意図してい
る。これらは往々にして所望の品質を備えている（後述
の第１表参照のこと）。
全てのステロイドとの対比におけるその概して高いレベ
ルにより助長される。尚、この他の全てのステロイドか
らは、非常に異なる構造を有し、且つ抗コルチゾール抗
体によってはほとんど認識されないアンドロゲンのファ
ミリーに属するデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥ
Ａ）スルフェートは除かれる。市場にある全てのラジオ
イムノアッセイ又は酵素イムノアッセイキットは血清中
のコルチゾールの直接測定のための技術を意図してい
る。これらは往々にして所望の品質を備えている（後述
の第１表参照のこと）。
【０００６】一方、尿性コルチゾールの直接測定は、往
々にしてそのほんの一部しか構造及び濃度がわかってい
ない代謝物の蓄積に本質的に基づき、一層困難な操作で
ある。今まで、生物学的媒質中のコルチゾールの最も信
頼性のあるアッセイ方法は、ジクロロメタンによる抽出
段階、それに続く特異性を保障するクロマトグラフィー
を含んでいた。これらの操作はデリケートであり、時間
がかかり、且つ費用がかかる。
々にしてそのほんの一部しか構造及び濃度がわかってい
ない代謝物の蓄積に本質的に基づき、一層困難な操作で
ある。今まで、生物学的媒質中のコルチゾールの最も信
頼性のあるアッセイ方法は、ジクロロメタンによる抽出
段階、それに続く特異性を保障するクロマトグラフィー
を含んでいた。これらの操作はデリケートであり、時間
がかかり、且つ費用がかかる。
【０００７】モノクローナル抗体及びポリクローナル抗
体を、特にコルチゾール−２１−ヘミスクシネート誘導
体、そしてとりわけコルチゾール−３−ＣＭＯ誘導体か
ら作り上げる数多くの試みがなされてきたが、この後者
のケースにおいて、ＣＭＯ基のｓｙｎ／ａｎｔｉ幾何学
異性に関する特異的な特性についての論述はまったくな
い。かかる抗体は尿性コルチゾールの正確な測定を可能
としない。これらは、クロマトグラフィーを経た測定に
より得られる結果と比べ、尿中のコルチゾールの濃度を
過剰評価させてしまう。
体を、特にコルチゾール−２１−ヘミスクシネート誘導
体、そしてとりわけコルチゾール−３−ＣＭＯ誘導体か
ら作り上げる数多くの試みがなされてきたが、この後者
のケースにおいて、ＣＭＯ基のｓｙｎ／ａｎｔｉ幾何学
異性に関する特異的な特性についての論述はまったくな
い。かかる抗体は尿性コルチゾールの正確な測定を可能
としない。これらは、クロマトグラフィーを経た測定に
より得られる結果と比べ、尿中のコルチゾールの濃度を
過剰評価させてしまう。
【０００８】三つの製造業者Codak, Orion及びDSL は尿
性コルチゾールの直接測定を提唱している。しかしなが
ら、後述の第２表に示している通り、これらの方法はサ
ンプルの抽出及びクロマトグラフィーを経た測定より得
られる結果と非常に異なる結果を示してしまう。
性コルチゾールの直接測定を提唱している。しかしなが
ら、後述の第２表に示している通り、これらの方法はサ
ンプルの抽出及びクロマトグラフィーを経た測定より得
られる結果と非常に異なる結果を示してしまう。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】従って、ルーチン使用
にとってはあまりにもめんどうであるクロマトグラフィ
ーによって得られる結果に近似する結果を供する尿性コ
ルチゾールの直接測定のための迅速な方法を獲得するこ
とが所望されるであろう。
にとってはあまりにもめんどうであるクロマトグラフィ
ーによって得られる結果に近似する結果を供する尿性コ
ルチゾールの直接測定のための迅速な方法を獲得するこ
とが所望されるであろう。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本出願人は一定の抗体を
調製しており、そしてこれらは、ポリクローナルであろ
うとモノクローナルであろうと、血清及びその他の生物
学的流体（唾液、脳脊髄液、培養上清物）中のコルチゾ
ールのみならず、尿中のコルチゾールの直接測定を可能
とする特別な特徴を供することを発見した。
調製しており、そしてこれらは、ポリクローナルであろ
うとモノクローナルであろうと、血清及びその他の生物
学的流体（唾液、脳脊髄液、培養上清物）中のコルチゾ
ールのみならず、尿中のコルチゾールの直接測定を可能
とする特別な特徴を供することを発見した。
【００１１】本発明に係る前記抗体は特に、巨大分子に
カップリングされたハプテンであるコルチゾール−３−
カルボキシメチルオキシム（ｓｙｎ異性体）より成る新
規の免疫原によって免疫された動物から得られうる。
カップリングされたハプテンであるコルチゾール−３−
カルボキシメチルオキシム（ｓｙｎ異性体）より成る新
規の免疫原によって免疫された動物から得られうる。
【００１２】従って、本発明の目的は、巨大分子にその
カルボキシル基を介してカップリングされたハプテンで
あるコルチゾール−３−カルボキシメチルオキシム（実
質的に純粋なｓｙｎ異性体）より成る免疫原化合物に対
する動物の免疫により産生された、尿媒質中のコルチゾ
ールを特異的に認識する新規のポリクローナル又はモノ
クローナル抗体である。コルチゾール−３−カルボキシ
メチルオキシムは以降、時折りコルチゾール−３−ＣＭ
Ｏと呼ぶことがある。
カルボキシル基を介してカップリングされたハプテンで
あるコルチゾール−３−カルボキシメチルオキシム（実
質的に純粋なｓｙｎ異性体）より成る免疫原化合物に対
する動物の免疫により産生された、尿媒質中のコルチゾ
ールを特異的に認識する新規のポリクローナル又はモノ
クローナル抗体である。コルチゾール−３−カルボキシ
メチルオキシムは以降、時折りコルチゾール−３−ＣＭ
Ｏと呼ぶことがある。
【００１３】「巨大分子」なる用語は、詳しくは、動物
における抗体産生を誘導するに足りる分子量を有するタ
ンパク質又は多糖類、好ましくは牛血清アルブミン（Ｂ
ＳＡ）を意味する。ほとんどの権威者によれば、５００
０の分子量が十分であると考えられる。
における抗体産生を誘導するに足りる分子量を有するタ
ンパク質又は多糖類、好ましくは牛血清アルブミン（Ｂ
ＳＡ）を意味する。ほとんどの権威者によれば、５００
０の分子量が十分であると考えられる。
【００１４】「カップリング」なる用語は、コルチゾー
ル−３−ＣＭＯ（ｓｙｎ）が巨大分子に、特に共有結
合、例えばエステル又はアミド結合、そして好ましくは
タンパク質のリジンに対するアミド結合を介してカップ
リングされていることを意味する。
ル−３−ＣＭＯ（ｓｙｎ）が巨大分子に、特に共有結
合、例えばエステル又はアミド結合、そして好ましくは
タンパク質のリジンに対するアミド結合を介してカップ
リングされていることを意味する。
【００１５】尿における測定への適用の観点でかかる抗
体を定義する別の手段は、それらをヒスタミンにカップ
リングされたコルチゾール−３−カルボキシメチルオキ
シム（ｓｙｎ）誘導体に対する親和力によって特性決定
することにあり、かかる親和力は、ヒスタミンにカップ
リングされたコルチゾール−３−カルボキシメチルオキ
シム（ａｎｔｉ）誘導体に対する親和力と等しいか又は
強く、その親和力の比は好ましくは１．５より大きい。
体を定義する別の手段は、それらをヒスタミンにカップ
リングされたコルチゾール−３−カルボキシメチルオキ
シム（ｓｙｎ）誘導体に対する親和力によって特性決定
することにあり、かかる親和力は、ヒスタミンにカップ
リングされたコルチゾール−３−カルボキシメチルオキ
シム（ａｎｔｉ）誘導体に対する親和力と等しいか又は
強く、その親和力の比は好ましくは１．５より大きい。
【００１６】
【発明の実施の形態】本発明の特定の態様は、コルチゾ
ール−３−カルボキシメチルオキシム（ｓｙｎ）を牛血
清アルブミン（ＢＳＡ）に、１以上、そして好ましくは
１５〜３１のモル比でカップリングさせることにより成
る。これにより、強力な親和力及び顕著な特異性をもっ
たポリクローナル抗体がマウスで生産され、１時間以内
で抽出もクロマトグラフィーも要らずに患者の尿の中の
コルチゾールの直接測定が可能となる。
ール−３−カルボキシメチルオキシム（ｓｙｎ）を牛血
清アルブミン（ＢＳＡ）に、１以上、そして好ましくは
１５〜３１のモル比でカップリングさせることにより成
る。これにより、強力な親和力及び顕著な特異性をもっ
たポリクローナル抗体がマウスで生産され、１時間以内
で抽出もクロマトグラフィーも要らずに患者の尿の中の
コルチゾールの直接測定が可能となる。
【００１７】マウスのミエローマ細胞をモノクローナル
抗体を産生できるように免疫原コルチゾール−３−カル
ボキシメチルオキシム（ｓｙｎ）−ＢＳＡにより免疫し
たマウスのリンパ球とも融合せしめる。かかるモノクロ
ーナル抗体の特異性は対応のポリクローナル抗体のそれ
と本質的に同等である。
抗体を産生できるように免疫原コルチゾール−３−カル
ボキシメチルオキシム（ｓｙｎ）−ＢＳＡにより免疫し
たマウスのリンパ球とも融合せしめる。かかるモノクロ
ーナル抗体の特異性は対応のポリクローナル抗体のそれ
と本質的に同等である。
【００１８】従って、本発明はかかるモノクローナル抗
体、特に、フランス国パリ市の微生物株国立保存機関に
承認番号Ｉ１５３２で１９９５年２月９日に提出及び寄
託したハイブリドーマＩＭＭＵ−４７３により分泌され
るモノクローナル抗体を提供する。
体、特に、フランス国パリ市の微生物株国立保存機関に
承認番号Ｉ１５３２で１９９５年２月９日に提出及び寄
託したハイブリドーマＩＭＭＵ−４７３により分泌され
るモノクローナル抗体を提供する。
【００１９】上記した、並びに後述の方法及びキットに
利用される抗体は好ましくはモノクローナル抗体であ
る。
利用される抗体は好ましくはモノクローナル抗体であ
る。
【００２０】上記の本発明に係る抗体を獲得するための
方法は限定しない。特に、本発明に係る抗体は、巨大分
子でない担体との複合免疫原により、インビトロでの免
疫を介して、又は免疫をしなくてさえも（Griffiths A.
D.ら；ＥＭＢＯ Ｊｏｎｒｎａｌ，１３，３２４５−３
２６０，１９９４）、獲得し得る。
方法は限定しない。特に、本発明に係る抗体は、巨大分
子でない担体との複合免疫原により、インビトロでの免
疫を介して、又は免疫をしなくてさえも（Griffiths A.
D.ら；ＥＭＢＯ Ｊｏｎｒｎａｌ，１３，３２４５−３
２６０，１９９４）、獲得し得る。
【００２１】本発明はまた、放射能ラベル（例えばトリ
チウム又は放射性ヨウ素）、酵素、発光又は蛍光ラベル
を固相又は液相において用いる様々なアッセイ技術にお
いて、上記のポリクローナル又はモノクローナル抗体を
基礎とするコルチゾールについてのアッセイ方法を提供
する。かかるラベルはコルチゾール誘導体に、又は本発
明に係るモノクローナルもしくはポリクローナル抗体の
いづれかに、対応のトレーサーを作り上げるために付加
してよい。トリチウム化コルチゾール又はトリチウム化
コルチゾールの誘導体も適当なトレーサーを構成しう
る。
チウム又は放射性ヨウ素）、酵素、発光又は蛍光ラベル
を固相又は液相において用いる様々なアッセイ技術にお
いて、上記のポリクローナル又はモノクローナル抗体を
基礎とするコルチゾールについてのアッセイ方法を提供
する。かかるラベルはコルチゾール誘導体に、又は本発
明に係るモノクローナルもしくはポリクローナル抗体の
いづれかに、対応のトレーサーを作り上げるために付加
してよい。トリチウム化コルチゾール又はトリチウム化
コルチゾールの誘導体も適当なトレーサーを構成しう
る。
【００２２】従って、本発明は、コルチゾールについて
のイムノアッセイであって、（１）上記の抗体を使用す
る、（２）トレーサーを用いる競合アッセイである、及
び（３）そのトレーサーが、ヨウ素化可能である分子で
あるラベルにカルボキシル基を介してカップリングされ
たハプテンであるコルチゾール−３−カルボキシメチル
オキシム（ｓｙｎ）又はコルチゾール−３−カルボキシ
メチルオキシム（ａｎｔｉ）より成る、ことを特徴とす
るイムノアッセイも提供する。
のイムノアッセイであって、（１）上記の抗体を使用す
る、（２）トレーサーを用いる競合アッセイである、及
び（３）そのトレーサーが、ヨウ素化可能である分子で
あるラベルにカルボキシル基を介してカップリングされ
たハプテンであるコルチゾール−３−カルボキシメチル
オキシム（ｓｙｎ）又はコルチゾール−３−カルボキシ
メチルオキシム（ａｎｔｉ）より成る、ことを特徴とす
るイムノアッセイも提供する。
【００２３】カップリングは直接を行うか、又は当業界
に公知のアームを介して行ってよい。
に公知のアームを介して行ってよい。
【００２４】「ヨウ素化可能である分子」なる語は、当
業者に公知であるようなヨウ素化されることのできる分
子を意味し、例えばヒスタミン、ヒスチジン、トリアミ
ン、チロシン、又はヨウ素化可能である残基、例えばフ
ェノールもしくはイミダゾール核を含むペプチドであ
る。
業者に公知であるようなヨウ素化されることのできる分
子を意味し、例えばヒスタミン、ヒスチジン、トリアミ
ン、チロシン、又はヨウ素化可能である残基、例えばフ
ェノールもしくはイミダゾール核を含むペプチドであ
る。
【００２５】本発明の特定の態様は、測定すべきコルチ
ゾールの存在下でインキュベートする固相に固定された
上記の抗体と、コルチゾール−３−カルボキシメチルオ
キシム（ｓｙｎ）又はコルチゾール−３−カルボキシメ
チルオキシム（ａｎｔｉ）を上記のヨウ素化可能である
分子にグラフトすることによって得られる前駆体をヨウ
素−１２５によりラベルすることによって作られる放射
性ヨウ素化トレーサーとを用いることより成る。
ゾールの存在下でインキュベートする固相に固定された
上記の抗体と、コルチゾール−３−カルボキシメチルオ
キシム（ｓｙｎ）又はコルチゾール−３−カルボキシメ
チルオキシム（ａｎｔｉ）を上記のヨウ素化可能である
分子にグラフトすることによって得られる前駆体をヨウ
素−１２５によりラベルすることによって作られる放射
性ヨウ素化トレーサーとを用いることより成る。
【００２６】本発明を利用する好適な条件下で、上記の
方法は、トレーサーを介し、コルチゾール−３−カルボ
キシメチルオキシム（ｓｙｎ）又はコルチゾール−３−
カルボキシメチルオキシム（ａｎｔｉ）を放射性ヨウ素
化ヒスタミンにカップリングすることを特徴とする。
方法は、トレーサーを介し、コルチゾール−３−カルボ
キシメチルオキシム（ｓｙｎ）又はコルチゾール−３−
カルボキシメチルオキシム（ａｎｔｉ）を放射性ヨウ素
化ヒスタミンにカップリングすることを特徴とする。
【００２７】好適な使用条件下で、上記の方法は、放射
性トレーサーをヨウ素化−１２５でヨウ素化することを
特徴とする。
性トレーサーをヨウ素化−１２５でヨウ素化することを
特徴とする。
【００２８】その他のイムノアッセイ技術に従うと、測
定すべきコルチゾールは、酵素又は発光もしくは蛍光分
子にカップリングしたコルチゾール−３−カルボキシメ
チルオキシム（ｓｙｎ）又はコルチゾール−３−カルボ
キシメチルオキシム（ａｎｔｉ）より成るコンジュゲー
トであるトレーサーと競合する。
定すべきコルチゾールは、酵素又は発光もしくは蛍光分
子にカップリングしたコルチゾール−３−カルボキシメ
チルオキシム（ｓｙｎ）又はコルチゾール−３−カルボ
キシメチルオキシム（ａｎｔｉ）より成るコンジュゲー
トであるトレーサーと競合する。
【００２９】本発明に係るポリクローナル又はモノクロ
ーナル抗体は好ましくは固相、チューブ、力価検定プレ
ート又はビーズに固定する。
ーナル抗体は好ましくは固相、チューブ、力価検定プレ
ート又はビーズに固定する。
【００３０】本発明はまた、コルチゾール誘導体、特に
固相に固定されたコルチゾール−３−カルボキシメチル
オキシム（ｓｙｎ又はａｎｔｉ）と、放射能、酵素、発
光又は蛍光分子によりラベルされた上記の抗−コルチゾ
ール抗体とを使用する、コルチゾールについてのイムノ
アッセイ方法を提供する。
固相に固定されたコルチゾール−３−カルボキシメチル
オキシム（ｓｙｎ又はａｎｔｉ）と、放射能、酵素、発
光又は蛍光分子によりラベルされた上記の抗−コルチゾ
ール抗体とを使用する、コルチゾールについてのイムノ
アッセイ方法を提供する。
【００３１】この方法においては、測定すべきコルチゾ
ールを上記の固定化コルチゾール誘導体及びラベルした
本発明に係る抗体の存在下でインキュベートする。
ールを上記の固定化コルチゾール誘導体及びラベルした
本発明に係る抗体の存在下でインキュベートする。
【００３２】本発明はまた上記の抗体を利用する生物学
的流体中のコルチゾールについてアッセイキットを提供
する。
的流体中のコルチゾールについてアッセイキットを提供
する。
【００３３】コルチゾールを直接測定するための第一タ
イプのキットは、本発明に係るコルチゾール−３−カル
ボキシメチルオキシム（ｓｙｎ）−ＢＳＡに対して特異
的な抗体でコーティングされた固相を含んで成る。
イプのキットは、本発明に係るコルチゾール−３−カル
ボキシメチルオキシム（ｓｙｎ）−ＢＳＡに対して特異
的な抗体でコーティングされた固相を含んで成る。
【００３４】この種のキットは好ましくは、酵素に、又
は蛍光もしくは発光分子に、あるいは放射性ヨウ素原子
によりヨウ素化されているヒスタミンに、又はペプチド
に、又はフェノール核もしくはシミダゾール核を含んで
成るアミノ酸誘導体に、カルボキシル基を介してカップ
リングされた「コルチゾール−３−カルボキシメチルオ
キシム（ａｎｔｉ）」又は「コルチゾール−３−カルボ
キシメチルオキシム（ｓｙｎ）」も含む。より一層完璧
なキットは、一又は二式のコルチゾール標準品も含んで
成ることが好都合であり、一方は尿中のコルチゾールの
測定のため、他方は血清中のコルチゾールの測定のため
である。
は蛍光もしくは発光分子に、あるいは放射性ヨウ素原子
によりヨウ素化されているヒスタミンに、又はペプチド
に、又はフェノール核もしくはシミダゾール核を含んで
成るアミノ酸誘導体に、カルボキシル基を介してカップ
リングされた「コルチゾール−３−カルボキシメチルオ
キシム（ａｎｔｉ）」又は「コルチゾール−３−カルボ
キシメチルオキシム（ｓｙｎ）」も含む。より一層完璧
なキットは、一又は二式のコルチゾール標準品も含んで
成ることが好都合であり、一方は尿中のコルチゾールの
測定のため、他方は血清中のコルチゾールの測定のため
である。
【００３５】コルチゾールの直接測定のための第二タイ
プのキットは、放射性ヨウ素、又は発光もしくは蛍光分
子、又は酵素によりラベルされた、本発明に係る「抗−
コルチゾール抗体」トレーサーを含む。この種のキット
は、コルチゾール抗原でコーティングされた固相も含む
ことが好ましく、そしてここでも、好都合には、一又は
好ましくは二式のコルチゾール標準品を含むことが好都
合であり、ここで一方は尿中のコルチゾールの測定のた
めであり、他方は血清中のコルチゾールの測定のためで
ある。
プのキットは、放射性ヨウ素、又は発光もしくは蛍光分
子、又は酵素によりラベルされた、本発明に係る「抗−
コルチゾール抗体」トレーサーを含む。この種のキット
は、コルチゾール抗原でコーティングされた固相も含む
ことが好ましく、そしてここでも、好都合には、一又は
好ましくは二式のコルチゾール標準品を含むことが好都
合であり、ここで一方は尿中のコルチゾールの測定のた
めであり、他方は血清中のコルチゾールの測定のためで
ある。
【００３６】本発明はまた実質的に純粋な形態のコルチ
ゾール−３−カルボキシメチルオキシム（ｓｙｎ）−ヒ
スタミン及びコルチゾール−３−カルボキシメチルオキ
シム（ａｎｔｉ）−ヒスタミンも提供し、これは特体の
特性決定のために、及び放射性ヨウ素化誘導体として使
用できうる。
ゾール−３−カルボキシメチルオキシム（ｓｙｎ）−ヒ
スタミン及びコルチゾール−３−カルボキシメチルオキ
シム（ａｎｔｉ）−ヒスタミンも提供し、これは特体の
特性決定のために、及び放射性ヨウ素化誘導体として使
用できうる。
【００３７】本発明はまた、実質的に純粋な形態のコル
チゾール−３−カルボキシメチルオキシム（ｓｙｎ）、
実質的に純粋なコルチゾール−３−カルボキシメチルオ
キシム（ａｎｔｉ）、そして特に、実質的に純粋な形態
であり、少なくとも９６％の量において主要異性体に富
んでいることがあり、特にコルチゾール−３，２０−ジ
カルボキシメチルオキシムを実質的に含まず、即ち、１
％未満でそれを含み、そして１１位における及び１７位
のジヒドロキシケトン側鎖上における官能基の変換生成
物１％未満を含む（パーセンテージは高性能液体クロマ
トグラフィーにより推定）コルチゾール−３−カルボキ
シメチルオキシム（ｓｙｎ）並びに一層特に、少なくと
も９９％の量において主要異性体に富んでいることがあ
り、特にコルチゾール−３，２０−ジカルボキシメチル
オキシムを実質的に含まず、即ち、１％未満でそれを含
み、そして１１位における及び１７位のジヒドロキシケ
トン側鎖における官能基の変換生成物１％未満を含む
（パーセンテージは高性能液体クロマトグラフィーによ
り推定）コルチゾール−３−カルボキシメチルオキシム
（ａｎｔｉ）も提供する。
チゾール−３−カルボキシメチルオキシム（ｓｙｎ）、
実質的に純粋なコルチゾール−３−カルボキシメチルオ
キシム（ａｎｔｉ）、そして特に、実質的に純粋な形態
であり、少なくとも９６％の量において主要異性体に富
んでいることがあり、特にコルチゾール−３，２０−ジ
カルボキシメチルオキシムを実質的に含まず、即ち、１
％未満でそれを含み、そして１１位における及び１７位
のジヒドロキシケトン側鎖上における官能基の変換生成
物１％未満を含む（パーセンテージは高性能液体クロマ
トグラフィーにより推定）コルチゾール−３−カルボキ
シメチルオキシム（ｓｙｎ）並びに一層特に、少なくと
も９９％の量において主要異性体に富んでいることがあ
り、特にコルチゾール−３，２０−ジカルボキシメチル
オキシムを実質的に含まず、即ち、１％未満でそれを含
み、そして１１位における及び１７位のジヒドロキシケ
トン側鎖における官能基の変換生成物１％未満を含む
（パーセンテージは高性能液体クロマトグラフィーによ
り推定）コルチゾール−３−カルボキシメチルオキシム
（ａｎｔｉ）も提供する。
【００３８】最後に、本発明は巨大分子、特に牛血清ア
ルブミンにカップリングされたコルチゾール−３−カル
ボキシメチルオキシム（ｓｙｎ）を提供する。
ルブミンにカップリングされたコルチゾール−３−カル
ボキシメチルオキシム（ｓｙｎ）を提供する。
【００３９】本発明に係るモノクローナル抗体を分泌す
るハイブリドーマを単離できる条件を以下に説明する。
るハイブリドーマを単離できる条件を以下に説明する。
【００４０】更に以下に示すのは、モノクローナル抗体
の助けを借りる、血清及び尿中のコルチゾールの競合ラ
ジオイムノアッセイタイプの直接測定を例証する実施例
である。これらの実施例は以下の事項に関連する。
の助けを借りる、血清及び尿中のコルチゾールの競合ラ
ジオイムノアッセイタイプの直接測定を例証する実施例
である。これらの実施例は以下の事項に関連する。
【００４１】１．ハプテン コルチゾール−３−ＣＭＯ
の合成、並びにｓｙｎ及びａｎｔｉ異性体の分離。 ２．免疫原コルチゾール−３−ＣＭＯ（ｓｙｎ）−牛血
清アルブミンの調製。 ３．免疫原コルチゾール−３−ＣＭＯ（ａｎｔｉ）−牛
血清アルブミンの調製。 ４．ラベル用前駆体：コルチゾール−３−ＣＭＯ（ｓｙ
ｎ）−ヒスタミン及び対応の放射性ヨウ素化トレーサー
の調製。 ５．ラベル用前駆体：コルチゾール−３−ＣＭＯ（ａｎ
ｔｉ）−ヒスタミン及び対応の放射性ヨウ素化トレーサ
ーの調製。 ６．コルチゾール−３−ＣＭＯ（ｓｙｎ）−ＢＳＡに対
して特異的な抗体。 ７．血清又は血漿中のコルチゾールの直接測定のための
キット。 ８．尿中のコルチゾールの直接測定のためのキット。
の合成、並びにｓｙｎ及びａｎｔｉ異性体の分離。 ２．免疫原コルチゾール−３−ＣＭＯ（ｓｙｎ）−牛血
清アルブミンの調製。 ３．免疫原コルチゾール−３−ＣＭＯ（ａｎｔｉ）−牛
血清アルブミンの調製。 ４．ラベル用前駆体：コルチゾール−３−ＣＭＯ（ｓｙ
ｎ）−ヒスタミン及び対応の放射性ヨウ素化トレーサー
の調製。 ５．ラベル用前駆体：コルチゾール−３−ＣＭＯ（ａｎ
ｔｉ）−ヒスタミン及び対応の放射性ヨウ素化トレーサ
ーの調製。 ６．コルチゾール−３−ＣＭＯ（ｓｙｎ）−ＢＳＡに対
して特異的な抗体。 ７．血清又は血漿中のコルチゾールの直接測定のための
キット。 ８．尿中のコルチゾールの直接測定のためのキット。
【００４２】
【実施例】実施例１：コルチゾール−３−ＣＭＯの合成並びに２種
のｓｙｎ及びａｎｔｉ異性体の分離 工程Ａ：２１−アセトキシコルチゾール（２） コルチゾール（１）（１０．０ｇ；２７．６mmol）を３
００mlの５：１のピリジン−無水酢酸混合物に溶かす。
その反応混合物を７０℃で７５分保ち、次いで減圧のも
とでエバポレートする。微量な最後の無水酢酸をエタノ
ールの添加及び減圧下でのトルエンの共沸蒸留により除
去する。酢酸塩（２）が白色固体の形状で得られる（１
１ｇ；２７．４mmol）。 Ｒf ＝０．３５（クロロホルム−酢酸エチル １：１） ｍ．ｐ．＝２２０−２２４℃（クロロホルム及びメタノ
ールの混合物中での再結晶化後）。1 Ｈ−ＮＭＲ（Ｃ5 Ｄ5 Ｎ）δ１．４１（３Ｈ，ｓ，１
８−ＣＨ3 ）；１．６２（３Ｈ，ｓ，１９−ＣＨ3 ）；
２．１２（３Ｈ，ｓ，２１−ＣＯＣＨ3 ）；４．７（１
Ｈ，ｍ，１１α−Ｈ）；５．３−５．６（４Ｈ，ｑ：Ｊ
＝１７．５Hz，２１−ＣＨ2 Ｏ）；５．８（１Ｈ，ｓ，
４−Ｈ）。
のｓｙｎ及びａｎｔｉ異性体の分離 工程Ａ：２１−アセトキシコルチゾール（２） コルチゾール（１）（１０．０ｇ；２７．６mmol）を３
００mlの５：１のピリジン−無水酢酸混合物に溶かす。
その反応混合物を７０℃で７５分保ち、次いで減圧のも
とでエバポレートする。微量な最後の無水酢酸をエタノ
ールの添加及び減圧下でのトルエンの共沸蒸留により除
去する。酢酸塩（２）が白色固体の形状で得られる（１
１ｇ；２７．４mmol）。 Ｒf ＝０．３５（クロロホルム−酢酸エチル １：１） ｍ．ｐ．＝２２０−２２４℃（クロロホルム及びメタノ
ールの混合物中での再結晶化後）。1 Ｈ−ＮＭＲ（Ｃ5 Ｄ5 Ｎ）δ１．４１（３Ｈ，ｓ，１
８−ＣＨ3 ）；１．６２（３Ｈ，ｓ，１９−ＣＨ3 ）；
２．１２（３Ｈ，ｓ，２１−ＣＯＣＨ3 ）；４．７（１
Ｈ，ｍ，１１α−Ｈ）；５．３−５．６（４Ｈ，ｑ：Ｊ
＝１７．５Hz，２１−ＣＨ2 Ｏ）；５．８（１Ｈ，ｓ，
４−Ｈ）。
【００４３】工程Ｂ：２１−アセトキシコルチゾール−
３−ＣＭＯ（ｓｙｎ＋ａｎｔｉ混合物（３）） 工程Ａで得られた２１−アセトキシコルチゾール（２）
（４．０ｇ；９．９mmol）を１５０mlの無水ピリジンに
溶解する。１５０mlのピリジン中の０−カルボキシメチ
ルヒドロキシルアミンヘミ塩酸塩（１．３ｇ；５．９mm
ol）の溶液をこの溶液に滴下する。この反応媒体を窒素
雰囲気下で周囲温度で１６時間撹拌する。反応の終了を
薄層クロマトグラフィーにより確認し、次いでピリジン
を減圧下でのエバポレーションにより除去する。その残
渣を炭酸水素ナトリウムの飽和水性溶液に吸収させ、次
いでそれをクロロホルムで抽出して非酸夾雑物を除去す
る。その水性相を塩酸の添加によりｐＨ４に酸性化し、
そして酢酸エチルで抽出する。ステロイド含有有機相を
減圧のもとで、トルエンの共沸蒸留により乾燥させる。
３−ＣＭＯ（ｓｙｎ＋ａｎｔｉ混合物（３）） 工程Ａで得られた２１−アセトキシコルチゾール（２）
（４．０ｇ；９．９mmol）を１５０mlの無水ピリジンに
溶解する。１５０mlのピリジン中の０−カルボキシメチ
ルヒドロキシルアミンヘミ塩酸塩（１．３ｇ；５．９mm
ol）の溶液をこの溶液に滴下する。この反応媒体を窒素
雰囲気下で周囲温度で１６時間撹拌する。反応の終了を
薄層クロマトグラフィーにより確認し、次いでピリジン
を減圧下でのエバポレーションにより除去する。その残
渣を炭酸水素ナトリウムの飽和水性溶液に吸収させ、次
いでそれをクロロホルムで抽出して非酸夾雑物を除去す
る。その水性相を塩酸の添加によりｐＨ４に酸性化し、
そして酢酸エチルで抽出する。ステロイド含有有機相を
減圧のもとで、トルエンの共沸蒸留により乾燥させる。
【００４４】得られる生成物は、ｓｙｎ及びａｎｔｉ異
性体（それぞれ４０％及び６０％；％はＮＭＲにより推
定）の混合物を含む２１−アセトキシコルチゾール−３
−ＣＭＯ（３）（４．３ｇ；９．０mmol）である。 Ｒf ＝０．４０（ｓｙｎ）及び（ａｎｔｉ）（クロロホ
ルム−アセトン−酢酸７：２：１）1 Ｈ−ＮＭＲ（Ｃ5 Ｄ5 Ｎ）δ１．３８（３Ｈ，ｓ，１
８−ＣＨ3 ）；１．５３（３Ｈ，ｓ，１９−ＣＨ3 ）；
２．１１（３Ｈ，ｓ，２１−ＣＯＣＨ3 ）；４．６（１
Ｈ，ｍ，１１α−Ｈ）；５．１（２Ｈ，ｓ，ＮＯＣＨ2
ＣＯ）；５．３−５．６（４Ｈ，ｑ：Ｊ＝１７．５Hz，
２１−ＣＨ2 Ｏ）；６．０−６．７（１Ｈ，ｓ，４−Ｈ
ａｎｔｉ及びｓｙｎ）。
性体（それぞれ４０％及び６０％；％はＮＭＲにより推
定）の混合物を含む２１−アセトキシコルチゾール−３
−ＣＭＯ（３）（４．３ｇ；９．０mmol）である。 Ｒf ＝０．４０（ｓｙｎ）及び（ａｎｔｉ）（クロロホ
ルム−アセトン−酢酸７：２：１）1 Ｈ−ＮＭＲ（Ｃ5 Ｄ5 Ｎ）δ１．３８（３Ｈ，ｓ，１
８−ＣＨ3 ）；１．５３（３Ｈ，ｓ，１９−ＣＨ3 ）；
２．１１（３Ｈ，ｓ，２１−ＣＯＣＨ3 ）；４．６（１
Ｈ，ｍ，１１α−Ｈ）；５．１（２Ｈ，ｓ，ＮＯＣＨ2
ＣＯ）；５．３−５．６（４Ｈ，ｑ：Ｊ＝１７．５Hz，
２１−ＣＨ2 Ｏ）；６．０−６．７（１Ｈ，ｓ，４−Ｈ
ａｎｔｉ及びｓｙｎ）。
【００４５】工程Ｃ：コルチゾール−３−ＣＭＯ（ｓｙ
ｎ＋ａｎｔｉ混合物）（４） 工程Ｂで得られる２１−アセトキシコルチゾール−３−
ＣＭＯ（３）（２．０ｇ；４．２mmol）のｓｙｎ及びａ
ｎｔｉ異性体の混合物を３２０mlのメタノールに溶か
し、次いで２０mlの１０％の炭酸水素カリウム水性溶液
を加える。その反応混合物を窒素雰囲気下で周囲温度で
１６時間撹拌し、次いで減圧のもとでエバポレートす
る。その残渣を１００mlの水に吸収させ、次いで塩酸の
添加によりｐＨ４へと酸性化し、次いで酢酸エチルで抽
出する。ステロイド含有有機相を減圧のもとでのトルエ
ンの共沸蒸留によりエバポレーション、次いで乾燥させ
る。
ｎ＋ａｎｔｉ混合物）（４） 工程Ｂで得られる２１−アセトキシコルチゾール−３−
ＣＭＯ（３）（２．０ｇ；４．２mmol）のｓｙｎ及びａ
ｎｔｉ異性体の混合物を３２０mlのメタノールに溶か
し、次いで２０mlの１０％の炭酸水素カリウム水性溶液
を加える。その反応混合物を窒素雰囲気下で周囲温度で
１６時間撹拌し、次いで減圧のもとでエバポレートす
る。その残渣を１００mlの水に吸収させ、次いで塩酸の
添加によりｐＨ４へと酸性化し、次いで酢酸エチルで抽
出する。ステロイド含有有機相を減圧のもとでのトルエ
ンの共沸蒸留によりエバポレーション、次いで乾燥させ
る。
【００４６】得られる生成物は、ｓｙｎ及びａｎｔｉ異
性体の混合物（それぞれ４０％及び６０％；％はＮＭＲ
により推定）を含むコルチゾール−３−ＣＭＯ（４）
（１．６ｇ；３．７mmol）である。 Ｒf ＝０．１９（ｓｙｎ）及び０．２７（ａｎｔｉ）
（クロロホルム−アセトン−酢酸 ７：２：１）。
性体の混合物（それぞれ４０％及び６０％；％はＮＭＲ
により推定）を含むコルチゾール−３−ＣＭＯ（４）
（１．６ｇ；３．７mmol）である。 Ｒf ＝０．１９（ｓｙｎ）及び０．２７（ａｎｔｉ）
（クロロホルム−アセトン−酢酸 ７：２：１）。
【００４７】工程Ｄ：コルチゾール−３−ＣＭＯのｓｙ
ｎ異性体（５）及びａｎｔｉ異性体（６） 工程Ｃで得られるコルチゾール−３−ＣＭＯ誘導体
（０．４８ｇ；１．１mmol）の２種のｓｙｎ及びａｎｔ
ｉ異性体をシリカプレートでのクロマトグラフィーによ
り、クロロホルム−アセトン−酢酸の７：２：１の混合
物による展開によって分離する。０．１７ｇ（０．３９
mmol）のｓｙｎ異性体（５）及び０．２１ｇ（０．４８
mmol）のａｎｔｉ異性体（６）が得られ、それぞれ５〜
１０％の他方の異性体を含む。各異性体を次に、Ｗａｔ
ｅｒｓ Ｃ１８カラム；溶出液：メタノール−水−酢酸
６００：４００：１；流速８ml／分；を利用する高性
能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、純粋な
状態で得る。ｔr （ａｎｔｉ）＝２３分；ｔr （ｓｙ
ｎ）＝２６分。次に溶媒を減圧でエバポレーションす
る。
ｎ異性体（５）及びａｎｔｉ異性体（６） 工程Ｃで得られるコルチゾール−３−ＣＭＯ誘導体
（０．４８ｇ；１．１mmol）の２種のｓｙｎ及びａｎｔ
ｉ異性体をシリカプレートでのクロマトグラフィーによ
り、クロロホルム−アセトン−酢酸の７：２：１の混合
物による展開によって分離する。０．１７ｇ（０．３９
mmol）のｓｙｎ異性体（５）及び０．２１ｇ（０．４８
mmol）のａｎｔｉ異性体（６）が得られ、それぞれ５〜
１０％の他方の異性体を含む。各異性体を次に、Ｗａｔ
ｅｒｓ Ｃ１８カラム；溶出液：メタノール−水−酢酸
６００：４００：１；流速８ml／分；を利用する高性
能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、純粋な
状態で得る。ｔr （ａｎｔｉ）＝２３分；ｔr （ｓｙ
ｎ）＝２６分。次に溶媒を減圧でエバポレーションす
る。
【００４８】コルチゾール−３−ＣＭＯの異性体ｓｙｎ
（５） Ｒf ＝０．１９（クロロホルム−アセトン−酢酸 ７：
２：１） ｍ．ｐ．＝１３３−１３６℃（ＨＰＬＣにより分離した
粗生成物） ＵＶ：λmax ＝２５６nm；ε＝１５０００Ｍ-1cm-1 1 Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ3 ＯＤ）δ０．８６（３Ｈ，ｓ，１
８−ＣＨ3 ）；１．３７（３Ｈ，ｓ，１９−ＣＨ3 ）；
４．２−４．７（４Ｈ，ｑ：Ｊ＝１９Hz，２１−ＣＨ2
Ｏ）；４．４（１Ｈ，ｍ，１１α−Ｈ）；４．５（２
Ｈ，ｓ，ＮＯＣＨ 2 ＣＯ）；６．４（１Ｈ，ｓ，４−
Ｈ）。
（５） Ｒf ＝０．１９（クロロホルム−アセトン−酢酸 ７：
２：１） ｍ．ｐ．＝１３３−１３６℃（ＨＰＬＣにより分離した
粗生成物） ＵＶ：λmax ＝２５６nm；ε＝１５０００Ｍ-1cm-1 1 Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ3 ＯＤ）δ０．８６（３Ｈ，ｓ，１
８−ＣＨ3 ）；１．３７（３Ｈ，ｓ，１９−ＣＨ3 ）；
４．２−４．７（４Ｈ，ｑ：Ｊ＝１９Hz，２１−ＣＨ2
Ｏ）；４．４（１Ｈ，ｍ，１１α−Ｈ）；４．５（２
Ｈ，ｓ，ＮＯＣＨ 2 ＣＯ）；６．４（１Ｈ，ｓ，４−
Ｈ）。
【００４９】コルチゾール−３−ＣＭＯの異性体ａｎｔ
ｉ（６） Ｒf ＝０．２７（クロロホルム−アセトン−酢酸 ７：
２：１） ｍ．ｐ．＝２２３−２２７℃（ＨＰＬＣにより分離した
粗生成物） ＵＶ：λmax ２５０nm；ε＝２３０００Ｍ-1cm-1 1 Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ3 ＯＤ）δ０．８６（３Ｈ，ｓ，１
８−ＣＨ3 ）；１．３４（３Ｈ，ｓ，１９−ＣＨ3 ）；
４．２−４．７（４Ｈ，ｑ：Ｊ＝１９Hz，２１−ＣＨ2
Ｏ）；４．４（１Ｈ，ｍ，１１α−Ｈ）；４．５（２
Ｈ，ｓ，ＮＯＣＨ 2 ＣＯ）；５．６（１Ｈ，ｓ，４−
Ｈ）。
ｉ（６） Ｒf ＝０．２７（クロロホルム−アセトン−酢酸 ７：
２：１） ｍ．ｐ．＝２２３−２２７℃（ＨＰＬＣにより分離した
粗生成物） ＵＶ：λmax ２５０nm；ε＝２３０００Ｍ-1cm-1 1 Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ3 ＯＤ）δ０．８６（３Ｈ，ｓ，１
８−ＣＨ3 ）；１．３４（３Ｈ，ｓ，１９−ＣＨ3 ）；
４．２−４．７（４Ｈ，ｑ：Ｊ＝１９Hz，２１−ＣＨ2
Ｏ）；４．４（１Ｈ，ｍ，１１α−Ｈ）；４．５（２
Ｈ，ｓ，ＮＯＣＨ 2 ＣＯ）；５．６（１Ｈ，ｓ，４−
Ｈ）。
【００５０】実施例２：免疫原：牛血清アルブミンにカ
ップリングさせたコルチゾール−３−ＣＭＯの異性体
（ｓｙｎ） 工程Ａ：Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステルの形態で
活性化させたコルチゾール−３−ＣＭＯの異性体（ｓｙ
ｎ）（７） 実施例１の工程Ｄで得られるコルチゾール−３−ＣＭＯ
の異性体（ｓｙｎ）（５）（０．１ｇ；０．２３mmol）
をＮ−ヒドロキシスクシニミド（０．１１ｇ；０．９５
mmol）及びジシクロヘキシルカルボジイミド（０．２１
ｇ；１．０２mmol）の存在下で無水ＴＨＦ２０mlに溶解
させる。その反応混合物を周囲温度で、窒素雰囲気下で
暗所において４時間撹拌し、次いで濾過する。その濾液
を、加熱を施すことなく窒素流のもとで乾くまでエバポ
レーションして粗製の活性化エステル（７）を得る。そ
れは残りの工程のために一般にそのまま使用されうる。
Ｒf ＝０．５４（酢酸エチル）。
ップリングさせたコルチゾール−３−ＣＭＯの異性体
（ｓｙｎ） 工程Ａ：Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステルの形態で
活性化させたコルチゾール−３−ＣＭＯの異性体（ｓｙ
ｎ）（７） 実施例１の工程Ｄで得られるコルチゾール−３−ＣＭＯ
の異性体（ｓｙｎ）（５）（０．１ｇ；０．２３mmol）
をＮ−ヒドロキシスクシニミド（０．１１ｇ；０．９５
mmol）及びジシクロヘキシルカルボジイミド（０．２１
ｇ；１．０２mmol）の存在下で無水ＴＨＦ２０mlに溶解
させる。その反応混合物を周囲温度で、窒素雰囲気下で
暗所において４時間撹拌し、次いで濾過する。その濾液
を、加熱を施すことなく窒素流のもとで乾くまでエバポ
レーションして粗製の活性化エステル（７）を得る。そ
れは残りの工程のために一般にそのまま使用されうる。
Ｒf ＝０．５４（酢酸エチル）。
【００５１】工程Ｂ：免疫原：牛血清アルブミンにカッ
プリングさせたコルチゾール−３−ＣＭＯの異性体（ｓ
ｙｎ）（１１） 牛血清アルブミン（２００mg；約３μmol ）を１０mMの
炭酸水素ナトリウム水性溶液１０mlに溶かし、それに３
mlのＴＨＦを滴下する。工程Ａにおいて得られるＮ−ヒ
ドロキシスクシニミドエステルの形態において活性化さ
れたコルチゾール−３−ＣＭＯの異性体（ｓｙｎ）
（７）（０．０６ｇ；１１３μmol ）を３mlのＴＨＦに
溶解する。次いでこの溶液を牛血清アルブミンの溶液に
滴下する。その反応混合物を周囲温度で１６時間撹拌
し、次いで＋４℃で１０mMの炭酸水素ナトリウム水性溶
液に対して透析する。その透析物を１０mMの炭酸水素ナ
トリウム水性溶液で平衡にしたＳｅｐｈａｒｏｓｅ Ｃ
Ｌ ４Ｂカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いるクロマ
トグラフィーにより分離させる（２８０nmでのＵＶの吸
収により検出）。免疫原を含む画分をプールし、炭酸水
素アンモニウムの添加によりｐＨ７に合わせた脱イオン
水に対して透析し、そして凍結乾燥させる。
プリングさせたコルチゾール−３−ＣＭＯの異性体（ｓ
ｙｎ）（１１） 牛血清アルブミン（２００mg；約３μmol ）を１０mMの
炭酸水素ナトリウム水性溶液１０mlに溶かし、それに３
mlのＴＨＦを滴下する。工程Ａにおいて得られるＮ−ヒ
ドロキシスクシニミドエステルの形態において活性化さ
れたコルチゾール−３−ＣＭＯの異性体（ｓｙｎ）
（７）（０．０６ｇ；１１３μmol ）を３mlのＴＨＦに
溶解する。次いでこの溶液を牛血清アルブミンの溶液に
滴下する。その反応混合物を周囲温度で１６時間撹拌
し、次いで＋４℃で１０mMの炭酸水素ナトリウム水性溶
液に対して透析する。その透析物を１０mMの炭酸水素ナ
トリウム水性溶液で平衡にしたＳｅｐｈａｒｏｓｅ Ｃ
Ｌ ４Ｂカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いるクロマ
トグラフィーにより分離させる（２８０nmでのＵＶの吸
収により検出）。免疫原を含む画分をプールし、炭酸水
素アンモニウムの添加によりｐＨ７に合わせた脱イオン
水に対して透析し、そして凍結乾燥させる。
【００５２】約２５０mgの牛血清アルブミンにカップリ
ングしたコルチゾール−３−ＣＭＯの免疫原異性体（ｓ
ｙｎ）（１１）が得られ、カップリング比は２７〜３１
であった。その化合物の名称をコルチゾール−３−ＣＭ
Ｏ）ｓｙｎ）−ＢＳＡと略する。
ングしたコルチゾール−３−ＣＭＯの免疫原異性体（ｓ
ｙｎ）（１１）が得られ、カップリング比は２７〜３１
であった。その化合物の名称をコルチゾール−３−ＣＭ
Ｏ）ｓｙｎ）−ＢＳＡと略する。
【００５３】実施例３：免疫原：牛血清アルブミンにカ
ップリングさせたコルチゾール−３−ＣＭＯの異性体
（ａｎｔｉ）（１２） 工程Ａ：Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステルの形態に
おいて活性化されたコルチゾール−３−ＣＭＯの異性体
（ａｎｔｉ）（８） 実施例１の工程Ｄで得られるコルチゾール−３−ＣＭＯ
のａｎｔｉ異性体（６）を実施例２の工程Ａに記載の通
りに処理して、粗製活性化エステル（８）を得る。 Ｒf ＝０．６１（酢酸エチル）。
ップリングさせたコルチゾール−３−ＣＭＯの異性体
（ａｎｔｉ）（１２） 工程Ａ：Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステルの形態に
おいて活性化されたコルチゾール−３−ＣＭＯの異性体
（ａｎｔｉ）（８） 実施例１の工程Ｄで得られるコルチゾール−３−ＣＭＯ
のａｎｔｉ異性体（６）を実施例２の工程Ａに記載の通
りに処理して、粗製活性化エステル（８）を得る。 Ｒf ＝０．６１（酢酸エチル）。
【００５４】工程Ｂ：牛血清アルブミンにカップリング
させたコルチゾール−３−ＣＭＯの異性体（ａｎｔｉ）
（１２） 工程Ａで得られるＮ−ヒドロキシスクシニミドエステル
の形態において活性化されたコルチゾール−３−ＣＭＯ
の異性体（ａｎｔｉ）（８）を実施例２の工程Ｂに記載
と同じように処理し、目的の免疫全：コルチゾール−３
−ＣＭＯ（ａｎｔｉ）−ＢＳＡ（１２）を得る。そのカ
ップリング比は２７〜３１である。
させたコルチゾール−３−ＣＭＯの異性体（ａｎｔｉ）
（１２） 工程Ａで得られるＮ−ヒドロキシスクシニミドエステル
の形態において活性化されたコルチゾール−３−ＣＭＯ
の異性体（ａｎｔｉ）（８）を実施例２の工程Ｂに記載
と同じように処理し、目的の免疫全：コルチゾール−３
−ＣＭＯ（ａｎｔｉ）−ＢＳＡ（１２）を得る。そのカ
ップリング比は２７〜３１である。
【００５５】実施例４：ラベル用前駆体：ヒスタミンに
カップリングさせたコルチゾール−３−ＣＭＯの異性体
（ｓｙｎ）（９）及び対応の放射性ヨウ素化トレーサー 工程Ａ：ヒスタミンに付加させたコルチゾール−３−Ｃ
ＭＯの異性体（ｓｙｎ）（９） 塩基性ヒスタミン（０．０５ｇ；０．４５mmol）を１０
mMの炭酸水素ナトリウムの水性溶液１mlに溶かし、次い
で１mlのＴＨＦを加える。実施例２の工程Ａで得られる
Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステルの形態で活性化さ
れたコルチゾール−３−ＣＭＯの異性体（ｓｙｎ）
（７）（０．０３ｇ；０．０５６mmol）を１．５mlのＴ
ＨＦに溶かす。この溶液をヒスタミン溶液に滴下する。
その反応混合物を周囲温度で窒素雰囲気下で１時間撹拌
する。その溶液を塩酸の添加によりｐＨ７に合わせ、次
いで減圧のもとで乾くまでエバポレーションする。次に
この残渣をシリカゲルプレート上でのクロマトグラフィ
ーによる、６０：１０：２のクロロホルム−メタノール
−アンモニアの混合物による展開、それに続くＨＰＬＣ
（Ｓｈａｎｄｏｎ Ｕｌｔｒａｂａｓｅ ５μｌカラ
ム、μＢｏｎｄｏｐａｋＣ１８；溶出液：メタノール−
水−アンモニア ５００：５００：１；流速１ml／分）
により精製する；ｔｒ（ｓｙｎ）＝２５．３分
カップリングさせたコルチゾール−３−ＣＭＯの異性体
（ｓｙｎ）（９）及び対応の放射性ヨウ素化トレーサー 工程Ａ：ヒスタミンに付加させたコルチゾール−３−Ｃ
ＭＯの異性体（ｓｙｎ）（９） 塩基性ヒスタミン（０．０５ｇ；０．４５mmol）を１０
mMの炭酸水素ナトリウムの水性溶液１mlに溶かし、次い
で１mlのＴＨＦを加える。実施例２の工程Ａで得られる
Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステルの形態で活性化さ
れたコルチゾール−３−ＣＭＯの異性体（ｓｙｎ）
（７）（０．０３ｇ；０．０５６mmol）を１．５mlのＴ
ＨＦに溶かす。この溶液をヒスタミン溶液に滴下する。
その反応混合物を周囲温度で窒素雰囲気下で１時間撹拌
する。その溶液を塩酸の添加によりｐＨ７に合わせ、次
いで減圧のもとで乾くまでエバポレーションする。次に
この残渣をシリカゲルプレート上でのクロマトグラフィ
ーによる、６０：１０：２のクロロホルム−メタノール
−アンモニアの混合物による展開、それに続くＨＰＬＣ
（Ｓｈａｎｄｏｎ Ｕｌｔｒａｂａｓｅ ５μｌカラ
ム、μＢｏｎｄｏｐａｋＣ１８；溶出液：メタノール−
水−アンモニア ５００：５００：１；流速１ml／分）
により精製する；ｔｒ（ｓｙｎ）＝２５．３分
【００５６】ヒスタミンによりカップリングされた０．
０２ｇ（０．０３８mmol）の生成物（９）が得られる。
この生成物の名称はコルチゾール−３−ＣＭＯ（ｓｙ
ｎ）−ヒスタミンと略する。
０２ｇ（０．０３８mmol）の生成物（９）が得られる。
この生成物の名称はコルチゾール−３−ＣＭＯ（ｓｙ
ｎ）−ヒスタミンと略する。
【００５７】Ｒf ＝０．２５（クロロホルム−メタノー
ル−アンモニア ６０：１０：２） ｍ．ｐ．＝１２６−１３１℃（ＨＰＬＣにより分離させ
た粗生成物） ＵＶ：λmax ＝２５３nm；ε＝１５０００Ｍ-1cm-1 1 Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ3 ＯＤ）δ０．８７（３Ｈ，ｓ，１
８−ＣＨ3 ）；１．３８（３Ｈ，ｓ，１９−ＣＨ3 ）；
２．８，３．５（各２Ｈ：各ｔ：Ｊ＝７Hz，ＣＨ2 −Ｃ
Ｈ2 −ヒスタミン）；４．２−４．７（４Ｈ，ｑ：Ｊ＝
１９Hz，２１−ＣＨ2 Ｏ）；４．４（１Ｈ，ｍ，１１α
−Ｈ）；４．４（２Ｈ，ｓ，ＮＯＣＨ2ＣＯ）；６．４
（１Ｈ，ｓ，４−Ｈ）；６．８，７．６（各１Ｈ、各
ｓ、ＣＨ−イミダゾール）。
ル−アンモニア ６０：１０：２） ｍ．ｐ．＝１２６−１３１℃（ＨＰＬＣにより分離させ
た粗生成物） ＵＶ：λmax ＝２５３nm；ε＝１５０００Ｍ-1cm-1 1 Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ3 ＯＤ）δ０．８７（３Ｈ，ｓ，１
８−ＣＨ3 ）；１．３８（３Ｈ，ｓ，１９−ＣＨ3 ）；
２．８，３．５（各２Ｈ：各ｔ：Ｊ＝７Hz，ＣＨ2 −Ｃ
Ｈ2 −ヒスタミン）；４．２−４．７（４Ｈ，ｑ：Ｊ＝
１９Hz，２１−ＣＨ2 Ｏ）；４．４（１Ｈ，ｍ，１１α
−Ｈ）；４．４（２Ｈ，ｓ，ＮＯＣＨ2ＣＯ）；６．４
（１Ｈ，ｓ，４−Ｈ）；６．８，７．６（各１Ｈ、各
ｓ、ＣＨ−イミダゾール）。
【００５８】工程Ｂ：コルチゾール−３−ＣＭＯ（ｓｙ
ｎ）−［ 125Ｉ］ヨードヒスタミントレーサー 液体媒質の中で実施するヨウ素１２５によるラベリング
は酸化剤としてのクロラミンＴ及び酸化反応を停止させ
るためのナトリウムメタスルフィットの利用を包括す
る。ヨウ素化プロトコールは以下の通りである：０．２
Ｍのリン酸バッファーｐＨ８．０ ６０μｌの中に希釈
しておいた上記の工程Ａで得られるラベル用前駆体
（９）約２nmを０．２Ｍのリン酸ナトリウムバッファー
ｐＨ８．０中の５mg／mlのクロラミンＴ溶液２０μｌの
存在下で２０μｌの放射性ヨウ素化ナトリウム（１nmol
のＮａ125 Ｉ）溶液で処理する。
ｎ）−［ 125Ｉ］ヨードヒスタミントレーサー 液体媒質の中で実施するヨウ素１２５によるラベリング
は酸化剤としてのクロラミンＴ及び酸化反応を停止させ
るためのナトリウムメタスルフィットの利用を包括す
る。ヨウ素化プロトコールは以下の通りである：０．２
Ｍのリン酸バッファーｐＨ８．０ ６０μｌの中に希釈
しておいた上記の工程Ａで得られるラベル用前駆体
（９）約２nmを０．２Ｍのリン酸ナトリウムバッファー
ｐＨ８．０中の５mg／mlのクロラミンＴ溶液２０μｌの
存在下で２０μｌの放射性ヨウ素化ナトリウム（１nmol
のＮａ125 Ｉ）溶液で処理する。
【００５９】その混合物を周囲温度で２分インキュベー
トし、次いでその反応を１mg／mlのナトリウムメタビス
ルフィット水性溶液の添加により停止させる。その反応
混合物を７００μｌの水に希釈し、次いでＣ１８μＢｏ
ｎｄａｐａｋカラム（逆相）を用いるクロマトグラフィ
ーにより、以下の溶出条件に従って分離させる。
トし、次いでその反応を１mg／mlのナトリウムメタビス
ルフィット水性溶液の添加により停止させる。その反応
混合物を７００μｌの水に希釈し、次いでＣ１８μＢｏ
ｎｄａｐａｋカラム（逆相）を用いるクロマトグラフィ
ーにより、以下の溶出条件に従って分離させる。
【００６０】
【表１】
【００６１】このような溶出条件下では、コルチゾール
−３−ＣＭＯ（ｓｙｎ）−［ 125Ｉ］ヨードヒスタミン
トレーサーは４９min （３７％のアセトニトリル）で溶
出する。
−３−ＣＭＯ（ｓｙｎ）−［ 125Ｉ］ヨードヒスタミン
トレーサーは４９min （３７％のアセトニトリル）で溶
出する。
【００６２】実施例５：ラベル用前駆体：ヒスタミンに
カップリングさせたコルチゾール−３−ＣＭＯの異性体
（ａｎｔｉ）（１０）及び対応の放射性ヨウ素化トレー
サー工程Ａ：ヒスタミンにカップリングさせたコルチゾ
ール−３−ＣＭＯの異性体（ａｎｔｉ）（１０） 実施例３の工程Ａで得られるＮ−ヒドロキシスクシニミ
ドエステルの形態において活性化されたコルチゾール−
３−ＣＭＯの異性体（ａｎｔｉ）（８）を、ｓｙｎ異性
体のケースにおいて上記した通りに処理して目的の化合
物：コルチゾール−３−ＣＭＯ（ａｎｔｉ）ヒスタミン
（１０）を得る。
カップリングさせたコルチゾール−３−ＣＭＯの異性体
（ａｎｔｉ）（１０）及び対応の放射性ヨウ素化トレー
サー工程Ａ：ヒスタミンにカップリングさせたコルチゾ
ール−３−ＣＭＯの異性体（ａｎｔｉ）（１０） 実施例３の工程Ａで得られるＮ−ヒドロキシスクシニミ
ドエステルの形態において活性化されたコルチゾール−
３−ＣＭＯの異性体（ａｎｔｉ）（８）を、ｓｙｎ異性
体のケースにおいて上記した通りに処理して目的の化合
物：コルチゾール−３−ＣＭＯ（ａｎｔｉ）ヒスタミン
（１０）を得る。
【００６３】ｔr （ａｎｔｉ）＝２３．６分（ＨＰＬＣ
条件は上記） Ｒf ＝０．２５（クロロホルム−メタノール−アンモニ
ア ６０：１０：２） ｍ．ｐ．＝１３４−１３８℃（ＨＰＬＣにより分離させ
た粗生成物） ＵＶ：λmax ＝２４７nm；ε＝２３０００Ｍ-1cm-1 1 Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ3 ＯＤ）δ０．８７（３Ｈ，ｓ，１
８−ＣＨ3 ）；１．３５（３Ｈ，ｓ，１９−ＣＨ3 ）；
２．８，３．５（各２Ｈ：各ｔ：Ｊ＝７Hz，ＣＨ2 −Ｃ
Ｈ2 −ヒスタミン）；４．２−４．７（４Ｈ，ｑ：Ｊ＝
１９Hz，２１−ＣＨ2 Ｏ）；４．４（１Ｈ，ｍ，１１α
−Ｈ）；４．４（２Ｈ，ｓ，ＮＯＣＨ2ＣＯ）；５．６
（１Ｈ，ｓ，４−Ｈ）；６．８，７．６（各１Ｈ，各
ｓ，ＣＨ−イミダゾール）。
条件は上記） Ｒf ＝０．２５（クロロホルム−メタノール−アンモニ
ア ６０：１０：２） ｍ．ｐ．＝１３４−１３８℃（ＨＰＬＣにより分離させ
た粗生成物） ＵＶ：λmax ＝２４７nm；ε＝２３０００Ｍ-1cm-1 1 Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ3 ＯＤ）δ０．８７（３Ｈ，ｓ，１
８−ＣＨ3 ）；１．３５（３Ｈ，ｓ，１９−ＣＨ3 ）；
２．８，３．５（各２Ｈ：各ｔ：Ｊ＝７Hz，ＣＨ2 −Ｃ
Ｈ2 −ヒスタミン）；４．２−４．７（４Ｈ，ｑ：Ｊ＝
１９Hz，２１−ＣＨ2 Ｏ）；４．４（１Ｈ，ｍ，１１α
−Ｈ）；４．４（２Ｈ，ｓ，ＮＯＣＨ2ＣＯ）；５．６
（１Ｈ，ｓ，４−Ｈ）；６．８，７．６（各１Ｈ，各
ｓ，ＣＨ−イミダゾール）。
【００６４】工程Ｂ：コルチゾール−３−ＣＭＯ（ａｎ
ｔｉ）−［ 125Ｉ］ヨードヒスタミンエステル 操作は、実施例４の工程Ｂに記載の通りに行う。コルチ
ゾール−３−ＣＭＯ（ａｎｔｉ）−［ 125Ｉ］ヨードヒ
スタミントレーサーは４６分目に溶出する（３５．６％
のアセトニトリル）。
ｔｉ）−［ 125Ｉ］ヨードヒスタミンエステル 操作は、実施例４の工程Ｂに記載の通りに行う。コルチ
ゾール−３−ＣＭＯ（ａｎｔｉ）−［ 125Ｉ］ヨードヒ
スタミントレーサーは４６分目に溶出する（３５．６％
のアセトニトリル）。
【００６５】実施例６：免疫原：コルチゾール−３−Ｃ
ＭＯ（ｓｙｎ）−ＢＳＡにより誘導した抗体 工程Ａ−マウスの免疫 生後６週間の雄のＢａｌｂ／ｃマウスを以下のプログラ
ムに従って免疫する： ０日目：５０／５０のエマルション（１００μｌのＮａ
Ｃｌ／１００μｌの不完全フロインドアジュバント）中
の５０μｇのコルチゾール−３−ＣＭＯ（ｓｙｎ）−Ｂ
ＳＡの腹腔内注射。 ２１日目：５０／５０のエマルション（１００μｌのＮ
ａＣｌ／１００μｌの完全フロインドアジュバント）中
の５０μｇのコルチゾール−３−ＣＭＯ（ｓｙｎ）−Ｂ
ＳＡによる再度の腹腔内注射。 ４２日目：５０／５０のエマルション（１００μｌのＮ
ａＣｌ／１００μｌの完全フロインドアジュバント）中
の５０μｇのコルチゾール−３−ＣＭＯ（ｓｙｎ）−Ｂ
ＳＡによる再度の腹腔内注射。 ６３日目：５０／５０のエマルション（１００μｌのＮ
ａＣｌ／１００μｌの完全フロインドアジュバント）中
の５０μｇのコルチゾール−３−ＣＭＯ（ｓｙｎ）−Ｂ
ＳＡによる再度の腹腔内注射。 ８４日目：５０／５０のエマルション（１００μｌのＮ
ａＣｌ／１００μｌの完全フロインドアジュバント）中
の５０μｇのコルチゾール−３−ＣＭＯ（ｓｙｎ）−Ｂ
ＳＡによる再度の腹腔内注射。 ２４４日目：１００μｌのＮａＣｌ中の１００μｇのコ
ルチゾール−３−ＣＭＯ（ｓｙｎ）−ＢＳＡの静脈内注
射及びその１時間後の３００μｌのＮａＣｌ中のこの免
疫原３００μｇによる再度の腹腔内注射。 ２４７日目：細胞融合。
ＭＯ（ｓｙｎ）−ＢＳＡにより誘導した抗体 工程Ａ−マウスの免疫 生後６週間の雄のＢａｌｂ／ｃマウスを以下のプログラ
ムに従って免疫する： ０日目：５０／５０のエマルション（１００μｌのＮａ
Ｃｌ／１００μｌの不完全フロインドアジュバント）中
の５０μｇのコルチゾール−３−ＣＭＯ（ｓｙｎ）−Ｂ
ＳＡの腹腔内注射。 ２１日目：５０／５０のエマルション（１００μｌのＮ
ａＣｌ／１００μｌの完全フロインドアジュバント）中
の５０μｇのコルチゾール−３−ＣＭＯ（ｓｙｎ）−Ｂ
ＳＡによる再度の腹腔内注射。 ４２日目：５０／５０のエマルション（１００μｌのＮ
ａＣｌ／１００μｌの完全フロインドアジュバント）中
の５０μｇのコルチゾール−３−ＣＭＯ（ｓｙｎ）−Ｂ
ＳＡによる再度の腹腔内注射。 ６３日目：５０／５０のエマルション（１００μｌのＮ
ａＣｌ／１００μｌの完全フロインドアジュバント）中
の５０μｇのコルチゾール−３−ＣＭＯ（ｓｙｎ）−Ｂ
ＳＡによる再度の腹腔内注射。 ８４日目：５０／５０のエマルション（１００μｌのＮ
ａＣｌ／１００μｌの完全フロインドアジュバント）中
の５０μｇのコルチゾール−３−ＣＭＯ（ｓｙｎ）−Ｂ
ＳＡによる再度の腹腔内注射。 ２４４日目：１００μｌのＮａＣｌ中の１００μｇのコ
ルチゾール−３−ＣＭＯ（ｓｙｎ）−ＢＳＡの静脈内注
射及びその１時間後の３００μｌのＮａＣｌ中のこの免
疫原３００μｇによる再度の腹腔内注射。 ２４７日目：細胞融合。
【００６６】工程Ｂ−ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ
のプロトコールに従う細胞融合 ａ）２４７日目に選定のマウスを殺し、そしてその脾臓
のサンプルを破砕する。その脾臓細胞をＲＰＭＩ１６４
０培地で洗う。ＲＰＭＩ２０％胎児牛血清（ＦＣＳ），
１％のグルタミン、１％の非必須アミノ酸及び１％のピ
ルビン酸ナトリウムの中に予め培養しておいたミエロー
マ細胞Ｐ３．Ｘ６３．Ａｇ８ ６５３も同じ培地で洗
う。
のプロトコールに従う細胞融合 ａ）２４７日目に選定のマウスを殺し、そしてその脾臓
のサンプルを破砕する。その脾臓細胞をＲＰＭＩ１６４
０培地で洗う。ＲＰＭＩ２０％胎児牛血清（ＦＣＳ），
１％のグルタミン、１％の非必須アミノ酸及び１％のピ
ルビン酸ナトリウムの中に予め培養しておいたミエロー
マ細胞Ｐ３．Ｘ６３．Ａｇ８ ６５３も同じ培地で洗
う。
【００６７】平行して、腹膜マクロファージを、非免疫
Ｂａｌｂ／ｃマウスの腹膜をＲＰＭＩで洗浄することに
より得る。
Ｂａｌｂ／ｃマウスの腹膜をＲＰＭＩで洗浄することに
より得る。
【００６８】ハイブリドーマを形成するため、脾臓細胞
及びミエローマ細胞をチューブの中で、ミエロール細胞
当り５個の脾臓細胞の割合で混合する。遠心後、その細
胞残渣を７５mMのＨｅｐｅｓバッファーｐＨ７．５中の
５０％のポリエチレングリコール８００μｌの中に再懸
濁する。３７℃で１分間の接触時間を経てから、２０ml
のＲＰＭＩ１６４０培地を融合細胞にゆっくり加える。
及びミエローマ細胞をチューブの中で、ミエロール細胞
当り５個の脾臓細胞の割合で混合する。遠心後、その細
胞残渣を７５mMのＨｅｐｅｓバッファーｐＨ７．５中の
５０％のポリエチレングリコール８００μｌの中に再懸
濁する。３７℃で１分間の接触時間を経てから、２０ml
のＲＰＭＩ１６４０培地を融合細胞にゆっくり加える。
【００６９】ｂ）一次培養物を２０％の胎児牛血清（Ｆ
ＣＳ）、並びに下記の添加剤、即ちヒポキサンチン５×
１０-3Ｍ、アミノブテリン２×１０-5Ｍ及びチミジン８
×１０ -4Ｍを含むＲＰＭＩ培地の存在下で９６穴組織培
養プレートの中で生産させる。５×１０3 の腹膜マクロ
ファージ、それに続いて１０5 の融合細胞を各ウェルに
加える。
ＣＳ）、並びに下記の添加剤、即ちヒポキサンチン５×
１０-3Ｍ、アミノブテリン２×１０-5Ｍ及びチミジン８
×１０ -4Ｍを含むＲＰＭＩ培地の存在下で９６穴組織培
養プレートの中で生産させる。５×１０3 の腹膜マクロ
ファージ、それに続いて１０5 の融合細胞を各ウェルに
加える。
【００７０】工程Ｃ−クローニング及びサブクローニン
グ 以下の工程Ｄに記載の方法に従って選択したハイブリド
ーマは、１０，５，２，１及び０．５細胞を腹膜マクロ
ファージ含有マイクロウェルの中にランダムに分注す
る。限界（最大）希釈技術によるクローニングに由来す
る。従って、２通りのサブクローニング操作を実施し、
各クローン及びサブクローンをレプリケートし、次いで
９０％のＦＣＳ及び１０％のジメチルスルホキシド（Ｄ
ＭＳＯ）の中で凍結させる。Ｂａｌｂ／ｃマウス中の腹
水を得るために最終世代のサブクローンを最後にインビ
ボ繁殖に委ね、続いてプロテインＡでのイムノグロブリ
ン精製にかける。
グ 以下の工程Ｄに記載の方法に従って選択したハイブリド
ーマは、１０，５，２，１及び０．５細胞を腹膜マクロ
ファージ含有マイクロウェルの中にランダムに分注す
る。限界（最大）希釈技術によるクローニングに由来す
る。従って、２通りのサブクローニング操作を実施し、
各クローン及びサブクローンをレプリケートし、次いで
９０％のＦＣＳ及び１０％のジメチルスルホキシド（Ｄ
ＭＳＯ）の中で凍結させる。Ｂａｌｂ／ｃマウス中の腹
水を得るために最終世代のサブクローンを最後にインビ
ボ繁殖に委ね、続いてプロテインＡでのイムノグロブリ
ン精製にかける。
【００７１】工程Ｄ−ハイブリド細胞を選択すための技
術 選択は培養上清液で開始する液相ラジオイムノアッセイ
技術により実施する。抗−コルチゾール抗体を含む可能
性のある上清液を放射性コルチゾール（トリチウム化コ
ルチゾール又は放射性ヨウ素でラベルしたコルチゾール
誘導体：コルチゾール−３−ＣＭＯ（抗）−［ 125Ｉ］
ヨードヒスタミン）の溶液とインキュベートする。もし
抗−コルチゾール抗体が存在しているのなら、それらは
放射性ステロイドと結合するであろう。チャーコールデ
キストランとのインキュベーション並びに遊離放射能及
び抗体に固定されていない全ての小分子を除去するため
の遠心を経て、上清液のサンプル（結合画分）を取り出
し、そして測定する。
術 選択は培養上清液で開始する液相ラジオイムノアッセイ
技術により実施する。抗−コルチゾール抗体を含む可能
性のある上清液を放射性コルチゾール（トリチウム化コ
ルチゾール又は放射性ヨウ素でラベルしたコルチゾール
誘導体：コルチゾール−３−ＣＭＯ（抗）−［ 125Ｉ］
ヨードヒスタミン）の溶液とインキュベートする。もし
抗−コルチゾール抗体が存在しているのなら、それらは
放射性ステロイドと結合するであろう。チャーコールデ
キストランとのインキュベーション並びに遊離放射能及
び抗体に固定されていない全ての小分子を除去するため
の遠心を経て、上清液のサンプル（結合画分）を取り出
し、そして測定する。
【００７２】
【表２】
【００７３】1 ０．１Ｍのリン酸ナトリウムバッファ
ー、０．１％のゼラチン、１０mMのアジ化ナトリウムｐ
Ｈ７．２の中で、４，０００倍希釈した免疫原コルチゾ
ール−３−ＣＭＯ（ｓｙｎ）−ＢＳＡにより誘導したマ
ウス抗血清。2 トレーサー：［１，２，６，７− 3Ｈ］コルチゾー
ル（５０〜８０Ci／mmol），１０，０００cpm ／１００
μｌの０．１Ｍのリン酸ナトリウムバッファー、０．１
％のゼラチン、１０mMのアジ化ナトリウム、ｐＨ７．
２。2 トレーサー：コルチゾール−３−ＣＭＯ（ａｎｔ
ｉ）−［ 125Ｉ］ヨードヒスタミン、３５，０００cpm
／１００μｌの０．１Ｍのリン酸ナトリウムバッファ
ー、０．１％のゼラチン、１０mMのアジ化ナトリウム、
ｐＨ７．２。3 バッファー＝０．１Ｍのリン酸ナトリウム、０．１
％のゼラチン、１０mMのアジ化ナトリウム、ｐＨ７．
２。4 含有量０．３ｇ〜０．０３ｇのチャーコールデキス
トラン／１００mlのリン酸バッファー、０．１％のゼラ
チン、１０mMのアジ化ナトリウム、ｐＨ７．２の懸濁
物。
ー、０．１％のゼラチン、１０mMのアジ化ナトリウムｐ
Ｈ７．２の中で、４，０００倍希釈した免疫原コルチゾ
ール−３−ＣＭＯ（ｓｙｎ）−ＢＳＡにより誘導したマ
ウス抗血清。2 トレーサー：［１，２，６，７− 3Ｈ］コルチゾー
ル（５０〜８０Ci／mmol），１０，０００cpm ／１００
μｌの０．１Ｍのリン酸ナトリウムバッファー、０．１
％のゼラチン、１０mMのアジ化ナトリウム、ｐＨ７．
２。2 トレーサー：コルチゾール−３−ＣＭＯ（ａｎｔ
ｉ）−［ 125Ｉ］ヨードヒスタミン、３５，０００cpm
／１００μｌの０．１Ｍのリン酸ナトリウムバッファ
ー、０．１％のゼラチン、１０mMのアジ化ナトリウム、
ｐＨ７．２。3 バッファー＝０．１Ｍのリン酸ナトリウム、０．１
％のゼラチン、１０mMのアジ化ナトリウム、ｐＨ７．
２。4 含有量０．３ｇ〜０．０３ｇのチャーコールデキス
トラン／１００mlのリン酸バッファー、０．１％のゼラ
チン、１０mMのアジ化ナトリウム、ｐＨ７．２の懸濁
物。
【００７４】各クローニング操作の際に抑留する細胞
は、トリチウム化コルチゾールトレーサー及びコルチゾ
ール−３−ＣＭＯ（ａｎｔｉ）−［ 125Ｉ］ヨードヒス
タミントレーサーの両者を、ネガティブサンプルの５倍
より高い検出域値をもって認識する抗−コルチゾール抗
体を分泌するもののみとする。
は、トリチウム化コルチゾールトレーサー及びコルチゾ
ール−３−ＣＭＯ（ａｎｔｉ）−［ 125Ｉ］ヨードヒス
タミントレーサーの両者を、ネガティブサンプルの５倍
より高い検出域値をもって認識する抗−コルチゾール抗
体を分泌するもののみとする。
【００７５】モノクローナル抗体の親和力は、コルチゾ
ール−３−ＣＭＯ（ａｎｔｉ）−［ 125Ｉ］ヨードヒス
タミントレーサーの、下記の２種のラベル用前駆体、即
ち、コルチゾール−３−ＣＭＯ（ａｎｔｉ）−ヒスタミ
ン及びコルチゾール−３−ＣＭＯ（ｓｙｎ）−ヒスタミ
ンによる交換によって測定する。親和力は、トレーサー
の半分を置換する濃度によって評価し（ＣＩ50値で表
示）、なぜならトレーサーは他の構成物と比べて少量で
しか存在していないからである。
ール−３−ＣＭＯ（ａｎｔｉ）−［ 125Ｉ］ヨードヒス
タミントレーサーの、下記の２種のラベル用前駆体、即
ち、コルチゾール−３−ＣＭＯ（ａｎｔｉ）−ヒスタミ
ン及びコルチゾール−３−ＣＭＯ（ｓｙｎ）−ヒスタミ
ンによる交換によって測定する。親和力は、トレーサー
の半分を置換する濃度によって評価し（ＣＩ50値で表
示）、なぜならトレーサーは他の構成物と比べて少量で
しか存在していないからである。
【００７６】以下の表は、免疫原コルチゾール−３−Ｃ
ＭＯ（ｓｙｎ）−ＢＳＡに対して得られる２種のモノク
ローナル抗体のＣＩ50値を示し、ａｎｔｉ異性体よりも
ｓｙｎ異性体によってコルチゾール−３−ＣＭＯ（ａｎ
ｔｉ）−［ 125Ｉ］の多大なる交換が認められた。
ＭＯ（ｓｙｎ）−ＢＳＡに対して得られる２種のモノク
ローナル抗体のＣＩ50値を示し、ａｎｔｉ異性体よりも
ｓｙｎ異性体によってコルチゾール−３−ＣＭＯ（ａｎ
ｔｉ）−［ 125Ｉ］の多大なる交換が認められた。
【００７７】
【表３】
【００７８】このようにして抗体ＩＭＭＵ−４７３を選
んだ。それをパリ市の微生物株国立保存機関に１９９５
年２月９日に番号Ｉ−１５３２で提出及び寄託した。
んだ。それをパリ市の微生物株国立保存機関に１９９５
年２月９日に番号Ｉ−１５３２で提出及び寄託した。
【００７９】実施例７：血清又は血漿中のコルチゾール
の直接測定のためのキット 記載の方法は下記の原理を基礎とする競合ラジオイムノ
アッセイである：測定すべき血清もしくは血漿又は標準
品を、本発明に係る抗−コルチゾールモノクローナル抗
体でコーティングしたチューブの中で、コルチゾール−
３−ＣＭＯ（ｓｙｎ）−［ 125Ｉ］ヨードヒスタミン又
はコルチゾール−３−ＣＭＯ（ａｎｔｉ）−［ 125Ｉ］
ヨードヒスタミントレーサーのいづれかと共にインキュ
ベートする。２２℃でインキュベーション後、チューブ
の中身を吸引により取り出す。結合放射能をガンマーカ
ウンターで測定する。標準曲線を作製する。血清又は血
漿の未知の値をこの曲線の助けを借りる外挿により決定
する。
の直接測定のためのキット 記載の方法は下記の原理を基礎とする競合ラジオイムノ
アッセイである：測定すべき血清もしくは血漿又は標準
品を、本発明に係る抗−コルチゾールモノクローナル抗
体でコーティングしたチューブの中で、コルチゾール−
３−ＣＭＯ（ｓｙｎ）−［ 125Ｉ］ヨードヒスタミン又
はコルチゾール−３−ＣＭＯ（ａｎｔｉ）−［ 125Ｉ］
ヨードヒスタミントレーサーのいづれかと共にインキュ
ベートする。２２℃でインキュベーション後、チューブ
の中身を吸引により取り出す。結合放射能をガンマーカ
ウンターで測定する。標準曲線を作製する。血清又は血
漿の未知の値をこの曲線の助けを借りる外挿により決定
する。
【００８０】血清及び血漿中のコルチゾールの直接測定
のために用いる試薬及びプロトコールは：
のために用いる試薬及びプロトコールは：
【００８１】試薬： ・ステロイドを除去したヒト血清中のコルチゾール標準
品：２０mMのアジ化ナトリウムを含む：ｐＨ７．２：
０；２０；７０；２００；７００；及び２，０００nMの
６通りの濃度について確立（０；７．２５；２５．３
７；７２．５；２５３．７５及び７２５ng／ml）。 ・実施例４及び５のコルチゾール−３−ＣＭＯ（ｓｙ
ｎ）−［ 125Ｉ］ヨードヒスタミン又はコルチゾール−
３−ＣＭＯ（ａｎｔｉ）−［ 125Ｉ］ヨードヒスタミン
トレーサー；０．１Ｍのリン酸バッファー、０．１％の
ゼラチン、１０mMのアジ化ナトリウム及び３．５６μＭ
のダナゾール、ｐＨ７．２ １ml当り１５０，０００cp
m に調節。 ・本発明に係る抗−コルチゾールモノクローナル抗体Ｉ
ＭＭＵ−４７３でコーティングしたチューブ。固相にこ
れらの抗体をコーティングする技術は仏国出願２，５４
３，９７２に記載したものとする。
品：２０mMのアジ化ナトリウムを含む：ｐＨ７．２：
０；２０；７０；２００；７００；及び２，０００nMの
６通りの濃度について確立（０；７．２５；２５．３
７；７２．５；２５３．７５及び７２５ng／ml）。 ・実施例４及び５のコルチゾール−３−ＣＭＯ（ｓｙ
ｎ）−［ 125Ｉ］ヨードヒスタミン又はコルチゾール−
３−ＣＭＯ（ａｎｔｉ）−［ 125Ｉ］ヨードヒスタミン
トレーサー；０．１Ｍのリン酸バッファー、０．１％の
ゼラチン、１０mMのアジ化ナトリウム及び３．５６μＭ
のダナゾール、ｐＨ７．２ １ml当り１５０，０００cp
m に調節。 ・本発明に係る抗−コルチゾールモノクローナル抗体Ｉ
ＭＭＵ−４７３でコーティングしたチューブ。固相にこ
れらの抗体をコーティングする技術は仏国出願２，５４
３，９７２に記載したものとする。
【００８２】患者由来の８７人の血清の試験 プロトコール：ステロイドを除去しておいた２５μｌの
ヒト血清コルチゾール標準品又は測定すべき２５μｌの
生物学的サンプル、及び０．５mlの放射性ラベル化コル
チゾールトレーサーを本発明に係るモノクローナル抗体
でコーティングしたチューブに入れる。撹拌（４００rp
m ）しながら２２℃での１時間のインキュベーションの
後、チューブの中身を取り出し、そしてチューブに固定
された結合放射能をガンマーカウンターで測定する。
ヒト血清コルチゾール標準品又は測定すべき２５μｌの
生物学的サンプル、及び０．５mlの放射性ラベル化コル
チゾールトレーサーを本発明に係るモノクローナル抗体
でコーティングしたチューブに入れる。撹拌（４００rp
m ）しながら２２℃での１時間のインキュベーションの
後、チューブの中身を取り出し、そしてチューブに固定
された結合放射能をガンマーカウンターで測定する。
【００８３】本発明に従うコルチゾールの直接測定を、
ＳＥＰカートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ）で同一の血清をク
ロマトグラフィーにかけた後に実施した測定と比較す
る。図１は上記の２通りの方法の測定値間の相関を示
す。クロマトグラフィーの後の測定により得られる値を
横座標に示し、そして直接測定により得られる値を縦座
標に示し、共にng／mlで表示する。その結果は、この直
接測定とクロマトグラフィー後に実施した測定との間で
の完璧な相関性を示す（試験した血清数＝８７）。
ＳＥＰカートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ）で同一の血清をク
ロマトグラフィーにかけた後に実施した測定と比較す
る。図１は上記の２通りの方法の測定値間の相関を示
す。クロマトグラフィーの後の測定により得られる値を
横座標に示し、そして直接測定により得られる値を縦座
標に示し、共にng／mlで表示する。その結果は、この直
接測定とクロマトグラフィー後に実施した測定との間で
の完璧な相関性を示す（試験した血清数＝８７）。
【００８４】相関は以下の通りである： Ｙ（直接）＝０．９８×（クロマト）＋１１．３９ ｒ＝０．９２ 尚、Ｙは直接測定により得られる値；Ｘはクロマトグラ
フィー後の測定により得られる値；ｒは相関係数を示
す。
フィー後の測定により得られる値；ｒは相関係数を示
す。
【００８５】実施例８：尿中のコルチゾールの直接測定
のためのキット これも競合ラジオイムノアッセイ技術であり、その原理
は既に実施例７に記載してある。この方法において、モ
ノクローナル抗体ＩＭＭＵ−４７３でコーティングした
チューブ及びトレーサー、コルチゾール−３−ＣＭＯ
（ｓｙｎ）−［ 1 25Ｉ］ヨードヒスタミン又はコルチゾ
ール−３−ＣＭＯ（ａｎｔｉ）−［ 125Ｉ］ヨードヒス
タミンは、血清の直接測定のためのプロトコールに用い
たものと同じである。標準品のみが異なる：それは少量
の牛血清アルブミン緩衝化している（以降参照）。
のためのキット これも競合ラジオイムノアッセイ技術であり、その原理
は既に実施例７に記載してある。この方法において、モ
ノクローナル抗体ＩＭＭＵ−４７３でコーティングした
チューブ及びトレーサー、コルチゾール−３−ＣＭＯ
（ｓｙｎ）−［ 1 25Ｉ］ヨードヒスタミン又はコルチゾ
ール−３−ＣＭＯ（ａｎｔｉ）−［ 125Ｉ］ヨードヒス
タミンは、血清の直接測定のためのプロトコールに用い
たものと同じである。標準品のみが異なる：それは少量
の牛血清アルブミン緩衝化している（以降参照）。
【００８６】尿の直接測定に適用する試薬及びプロトコ
ールは以下の通りである： 試薬： ・０．１Ｍのリン酸バッファー、ＢＳＡ３ｇ／Ｌ中のコ
ルチゾール標準品：２０mMのアジ化ナトリウムを含む：
ｐＨ７．２：０；２０；７０；２００；７００；及び
２，０００nMの６通りの濃度について確立（０；７．２
５；２５．３７；７２．５；２５３．７５及び７２５ng
／ml）。 ・コルチゾール−３−ＣＭＯ（ｓｙｎ）−［ 125Ｉ］ヨ
ードヒスタミン又はコルチゾール−３−ＣＭＯ（ａｎｔ
ｉ）−［ 125Ｉ］ヨードヒスタミントレーサー；０．１
Ｍのリン酸バッファー、０．１％のゼラチン、１０mMの
アジ化ナトリウム及び３．５６μＭのダナゾール、ｐＨ
７．２ １ml当り１５０，０００cpm に調節。 ・本発明に係る抗−コルチゾールモノクローナル抗体Ｉ
ＭＭＵ−４７３でコーティングしたチューブ。
ールは以下の通りである： 試薬： ・０．１Ｍのリン酸バッファー、ＢＳＡ３ｇ／Ｌ中のコ
ルチゾール標準品：２０mMのアジ化ナトリウムを含む：
ｐＨ７．２：０；２０；７０；２００；７００；及び
２，０００nMの６通りの濃度について確立（０；７．２
５；２５．３７；７２．５；２５３．７５及び７２５ng
／ml）。 ・コルチゾール−３−ＣＭＯ（ｓｙｎ）−［ 125Ｉ］ヨ
ードヒスタミン又はコルチゾール−３−ＣＭＯ（ａｎｔ
ｉ）−［ 125Ｉ］ヨードヒスタミントレーサー；０．１
Ｍのリン酸バッファー、０．１％のゼラチン、１０mMの
アジ化ナトリウム及び３．５６μＭのダナゾール、ｐＨ
７．２ １ml当り１５０，０００cpm に調節。 ・本発明に係る抗−コルチゾールモノクローナル抗体Ｉ
ＭＭＵ−４７３でコーティングしたチューブ。
【００８７】患者由来の１６５人の尿の試験 プロトコール：アッセイすべき５０μｌの緩衝化コルチ
ゾール標準品を、０．５mlのコルチゾール−３−ＣＭＯ
（ｓｙｎ）−［ 125Ｉ］ヨードヒスタミン又はコルチゾ
ール−３−ＣＭＯ（ａｎｔｉ）−［ 125Ｉ］ヨードヒス
タミントレーサーと共に、モノクローナル抗体ＩＭＭＵ
−４７３でコーティングしたチューブの中でインキュベ
ートする。撹拌（４００rpm ）しながら２２℃での１時
間のインキュベーションの後、チューブの中身を取り出
し、そしてチューブに固定された結合放射能をガンマー
カウンターで測定する。
ゾール標準品を、０．５mlのコルチゾール−３−ＣＭＯ
（ｓｙｎ）−［ 125Ｉ］ヨードヒスタミン又はコルチゾ
ール−３−ＣＭＯ（ａｎｔｉ）−［ 125Ｉ］ヨードヒス
タミントレーサーと共に、モノクローナル抗体ＩＭＭＵ
−４７３でコーティングしたチューブの中でインキュベ
ートする。撹拌（４００rpm ）しながら２２℃での１時
間のインキュベーションの後、チューブの中身を取り出
し、そしてチューブに固定された結合放射能をガンマー
カウンターで測定する。
【００８８】これらの直接測定を、ＳＥＰカートリッジ
（Ｗａｔｅｒｓ）で尿をクロマトグラフィーにかけた後
に実施した測定と比較する。
（Ｗａｔｅｒｓ）で尿をクロマトグラフィーにかけた後
に実施した測定と比較する。
【００８９】図２は１６５人分の尿サンプルについての
上記の２通りの方法の測定値間の相関を示す。クロマト
グラフィーの後の測定により得られる値を横座標に示
し、そして直接測定により得られる値を縦座標に示し、
共にng／mlで表示する。その相関は非常に良好である。
上記の２通りの方法の測定値間の相関を示す。クロマト
グラフィーの後の測定により得られる値を横座標に示
し、そして直接測定により得られる値を縦座標に示し、
共にng／mlで表示する。その相関は非常に良好である。
【００９０】相関は以下の通りである： Ｙ（直接）＝１．０９×（クロマト）＋５．３ γ＝０．９５ 尚、Ｙは直接測定により得られる値；Ｘはクロマトグラ
フィー後の測定により得られる値；γは相関係数を示
す。
フィー後の測定により得られる値；γは相関係数を示
す。
【００９１】第２表は、本発明に係る方法及びクロマト
グラフィーを経る対照方法と対比させての、従来技術の
尿中のコルチゾールの直接測定のための２通りの方法を
利用して得られる結果を示す。本発明に係る方法のみが
正確な結果を供する；他の２通りの方法は平均して２倍
以上に尿サンプルの濃度を過剰評価してしまう。
グラフィーを経る対照方法と対比させての、従来技術の
尿中のコルチゾールの直接測定のための２通りの方法を
利用して得られる結果を示す。本発明に係る方法のみが
正確な結果を供する；他の２通りの方法は平均して２倍
以上に尿サンプルの濃度を過剰評価してしまう。
【００９２】
【表４】
【００９３】
【表５】
【００９４】これらの結果は、試験した尿サンプルそれ
ぞれについての、本発明の方法と対照の方法（クロマト
グラフィー）との間で良好な相関が得られることを示
す。
ぞれについての、本発明の方法と対照の方法（クロマト
グラフィー）との間で良好な相関が得られることを示
す。
【図１】血清中のコルチゾールについての、本発明に係
る方法とクロマトグラフィー後の方法との測定値の相関
を示す。
る方法とクロマトグラフィー後の方法との測定値の相関
を示す。
【図２】尿中のコルチゾールについての、本発明に係る
方法とクロマトグラフィー後の方法との測定値の相関を
示す。
方法とクロマトグラフィー後の方法との測定値の相関を
示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/534 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｄ // Ａ６１Ｋ 39/395 Ｎ 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ０７Ｍ 5:00 (72)発明者 ニナ ルピ−シェン フランス国，13011 マルセイユ，ラ バ レンティーヌ，パルク デ ７ コリー ヌ，リュ イレール キュルタル，35 (72)発明者 エリザベート マプス フランス国，69110 スト フォワイ レ リオン，ブルバール ドゥ ルーロプ 35 (72)発明者 カテリーヌ フルニエ フランス国，69110 スト フォワイ レ リオン，リュ ポール ラファーギュ 60 (72)発明者 シュリストフ バランド フランス国，13007 マルセイユ，リュ デンドゥーム 327 (72)発明者 サンドリーヌ ポルテュエジ フランス国，13001 マルセイユ，ブルバ ール ロングシャム 67 (72)発明者 イブ−クロード キュイロン フランス国，69110 スト フォワイ レ リオン，アレ デ フレネ 37
Claims (18)
- 【請求項１】 尿媒質中のコルチゾールを特異的に認識
するポリクローナル又はモノクローナル抗体であって、
そのカルボキシ官能基により巨大分子にカップリングさ
れたハプテンであるコルチゾール−３−カルボキシメチ
ルオキシム（ｓｙｎ異性体）より成る免疫原化合物に対
する動物の免疫により製造される抗体。 - 【請求項２】 尿媒質中のコルチゾールを特異的に認識
するポリクローナル又はモノクローナル抗体であって、
誘導体であるコルチゾール−３−カルボキシメチルオキ
シム（ｓｙｎ）−ヒスタミンに対するこの抗体の親和力
（ＣＩ５０）が、コルチゾール−３−カルボキシメチル
オキシム（ａｎｔｉ）−ヒスタミンに対する親和力より
も１倍以上高いことを特徴とする、抗体。 - 【請求項３】 尿媒質中のコルチゾールを特異的に認識
するポリクローナル又はモノクローナル抗体であって、
誘導体であるコルチゾール−３−カルボキシメチルオキ
シム（ｓｙｎ）−ヒスタミンに対するこの抗体の親和力
（ＣＩ５０）が、コルチゾール−３−カルボキシメチル
オキシム（ａｎｔｉ）−ヒスタミンに対する親和力より
も１．５倍以上高いことを特徴とする、抗体。 - 【請求項４】 前記免疫原が、ハプテンであるコルチゾ
ール−３−カルボキシメチルオキシム（ｓｙｎ）であっ
て牛血清アルブミンと１以上のカップリング比でカップ
リングされているものより成ることを特徴とする、請求
項１記載のポリクローナル又はモノクローナル抗体。 - 【請求項５】 前記カップリング比が１５〜３１である
ことを特徴とする、請求項４記載のポリクローナル又は
モノクローナル抗体。 - 【請求項６】 フランス国パリ市の微生物株国立保存機
関（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ
ｓ Ｃｕｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓ
ｍｅｓ）に承認番号Ｉ−１５３２のもとで１９９５年２
月２９日提出及び寄託したハイブリドーマＩＭＭＵ−４
７３により産生される抗体。 - 【請求項７】 コルチゾールについてのイムノアッセイ
方法であって、請求項１〜６のいづれか１項記載の抗体
を使用する、このアッセイはトレーサーを用いる競合ア
ッセイである、及びこのトレーサーは、ヨウ素化可能で
ある分子であるラベルにそのカルボキシル基を介してカ
ップリングされたハプテンであるコルチゾール−３−カ
ルボキシメチルオキシム（ｓｙｎ）もしくはコルチゾー
ル−３−カルボキシメチルオキシム（ａｎｔｉ）より成
るか、又はこのトレーサーはトリチウム化コルチゾール
もしくはトリチウム化コルチゾール誘導体である、こと
を特徴とする方法。 - 【請求項８】 トレーサーを介して、コルチゾール−３
−カルボキシメチルオキシム（ｓｙｎ）又はコルチゾー
ル−３−カルボキシメチルオキシム（ａｎｔｉ）が放射
性ヨウ素化ヒスタミンにカップリングされていることを
特徴とする、請求項７記載のコルチゾールについてのイ
ムノアッセイ方法。 - 【請求項９】 前記トレーサーがヨウ素−１２５により
ヨウ素化されていることを特徴とする、請求項７又は８
記載のコルチゾールについてのイムノアッセイ方法。 - 【請求項１０】 コルチゾールについてのイムノアッセ
イ方法であって、請求項１〜６のいづれか１項記載の抗
体を使用する、及びアッセイすべきコルチゾールが、酵
素又は発光もしくは蛍光分子にカップリングされたコル
チゾール−３−カルボキシメチルオキシム（ｓｙｎ）又
はコルチゾール−３−カルボキシメチルオキシム（ａｎ
ｔｉ）より成るコンジュゲートであるトレーサーと競合
する、ことを特徴とする方法。 - 【請求項１１】 コルチゾールについてのイムノアッセ
イ方法であって、固相に固定されたコルチゾール−３−
カルボキシメチルオキシム（ｓｙｎ）又はコルチゾール
−３−カルボキシメチルオキシム（ａｎｔｉ）と、放射
能、酵素、発光又は蛍光分子によりラベルされた請求項
１〜６のいづれか１項記載の抗−コルチゾール抗体とを
使用する方法。 - 【請求項１２】 前記抗体がモノクローナル抗体である
ことを特徴とする、請求項７〜１１のいづれか１項記載
のコルチゾールについてのイムノアッセイ方法。 - 【請求項１３】 請求項１〜６のいづれか１項記載の抗
体を利用する、生物学的流体中のコルチゾールのついて
のアッセイキット。 - 【請求項１４】 実質的に純粋なコルチゾール−３−カ
ルボキシメチルオキシム（ｓｙｎ）。 - 【請求項１５】 実質的に純粋なコルチゾール−３−カ
ルボキシメチルオキシム（ａｎｔｉ）。 - 【請求項１６】 実質的に純粋なコルチゾール−３−カ
ルボキシメチルオキシム（ｓｙｎ）−ヒスタミン。 - 【請求項１７】 実質的に純粋なコルチゾール−３−カ
ルボキシメチルオキシム（ａｎｔｉ）−ヒスタミン。 - 【請求項１８】 実質的に純粋な、巨大分子にカップリ
ングされたコルチゾール−３−カルボキシメチルオキシ
ム（ｓｙｎ）。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9503749 | 1995-03-24 | ||
| FR9503749A FR2732115B1 (fr) | 1995-03-24 | 1995-03-24 | Procede de dosage immunologique du cortisol, notamment urinaire, et reactifs utilises |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08333398A true JPH08333398A (ja) | 1996-12-17 |
Family
ID=9477578
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8068224A Pending JPH08333398A (ja) | 1995-03-24 | 1996-03-25 | コルチゾールについてのイムノアッセイ方法及びそれに使用する試薬 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5910575A (ja) |
| EP (1) | EP0733903B1 (ja) |
| JP (1) | JPH08333398A (ja) |
| AT (1) | ATE213838T1 (ja) |
| CA (1) | CA2172451A1 (ja) |
| DE (1) | DE69619416T2 (ja) |
| ES (1) | ES2171639T3 (ja) |
| FR (1) | FR2732115B1 (ja) |
| PT (1) | PT733903E (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2012108027A (ja) * | 2010-11-18 | 2012-06-07 | Nippon Telegr & Teleph Corp <Ntt> | 分析方法 |
| JP2013083631A (ja) * | 2011-09-26 | 2013-05-09 | Fujifilm Corp | 蛍光粒子を用いたコルチゾール免疫アッセイ |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2763692B1 (fr) * | 1997-05-22 | 1999-07-09 | Agronomique Inst Nat Rech | Diagnostic in vitro des encephalopathies subaigues spongiformes transmissibles, par dosage de metabolites du cortisol |
| US5912114A (en) * | 1997-09-12 | 1999-06-15 | Johnson & Johnson Medical, Inc. | Wound diagnosis by quantitating cortisol in wound fluids |
| WO2003015871A2 (en) * | 2001-07-25 | 2003-02-27 | University Of North Carolina At Chapel Hill | Method and apparatus for rapid determination of ligand-protein binding using charcoal adsorption |
| US20080227222A1 (en) * | 2007-03-13 | 2008-09-18 | Cullum Malford E | Method for the detection of target molecules by fluorescence polarization using peptide mimics |
| JP5223237B2 (ja) * | 2007-05-14 | 2013-06-26 | ソニー株式会社 | 検出用核酸鎖及び物質間の結合又は相互作用検出方法 |
| DE102008022609B4 (de) | 2008-05-05 | 2011-07-28 | Otto-von-Guericke-Universität Magdeburg Medizinische Fakultät, 39120 | Verfahren zum Nachweis des Vorkommens von Nierensteinen und/oder Entzündungen der ableitenden Harnwege |
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