JPS62272156A - ウシ脱脂乳中のプロゲステロンの定量方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３、発明の詳細な説明 本発明はウシ脱脂乳中のプロゲステロンの定量方法に関
し、さらに詳しくは、競合反応を利用した酸素免疫法に
よるウシ脱）旧札中のプロゲステロンの定量り法に関す
る。

プロゲステロンは黄体及び胎盤など分泌される卵の着床
を容易にしたり、胎児の生育維持を行なう。従って、血
中のプロゲステロン濃度の測定は、黄体機能を測定する
上で有力な手段の一つであり、家をの繁殖領域において
ら、繁殖生理に関する研究な発情鑑定、妊娠診断、分娩
後の卵巣機能回復状態の観察、卵巣疾患の診断などに応
用されている。

近年、乳牛において乳汁中のプロゲステロン濃度が血中
濃度と同様に黄体１９ｉ能の指標となることが明らかに
され（Ｉｒｃａｐｖ　ｒｔ、ｎ、ｌ　Ｍ、Ｇｗｙｎ、　
　Ｊ　。

Ａ　、　Ｌ　ａｉＢ及びＲ，Ｄ、ＷａｔＬｅｒｓ：Ｊ　
、Ａｇｒ、Ｓｃｉ、＋ｇ−４、１５１、１９７３）、血
液よりも採取し易い乳ｔ１がプロゲステロン測定材料と
して多く用いられるようになってｂな。乳ｊｉ中のプロ
デスゾロンは血中のプロゲステロンが拡散に上り乳ｔ１
に移行したものと考えられており（ＩＩｅａｐ＋　Ｒ，
Ｂ、＋　Ａ。

）１　ｐｎｖｉ　ｌ　Ｉｅ及１／　Ｊ　、　［−、Ｌ　
１ｎｚｅｌｌ：Ｊ　、Ｅｎｄｏｃｒ、、　　６迫−，２
３９，１９７５）、乳汁中のプロゲステロン濃度は血中
の濃度と高い相関を示すことが明ら及びＷ、Ｒ，Ｗａｒ
ｄ：Ｖｅｔ、Ｒｅｃ、、　　１０１　＊　　４５９　。

１９７？）。

これらの乳汁のプロゲステロンを測定する方法として、
従米、（ｉ）放射性同位元素を担持したラジカルを有す
る架橋基によって３位が置換されたプロゲステロンとプ
ロゲステロンの１１位に蛋白質を結合したプロゲステロ
ン−蛋白質複合体に対する抗体を用いた放射免疫検定法
（特開昭５６−１０１５５４号公報）、（ｉｉ）プロゲ
ステロン−斗モシン共役分子、抗プロゲステロン抗体及
び試料を混合し、競合反応を起こさせ、その結果乳汁の
凝固の有無により乳汁中のプロゲステロン濃度を測定す
る方法（特開昭５８　２１４８５（３号公報）、（ｉｉ
ｉ）乳汁の凝固を阻害するＭＸ阻害剤をプロゲステロン
と結合させ、該酵素阻害剤−プロブステロン結合物が乳
汁の凝固を抑制する酵素阻害剤標識免疫検定法に上り乳
汁中のプロゲステロン濃度を測定する方法（特開昭５９
−１７０７６９号公報）等が提案されている。

しかしながら、上記（１）の放射性同位元素を用いる方
法はラジオアイソトープ施設と第一種放射線取扱主任者
の有資格者が必要であるのみならず、乳汁中に含まれる
プロゲステロンを石油エーテル等で抽出する捏作を必要
とし、さらに測定結果が得られるまでに２〜３日を必要
とするため、受精の最適時期を逸する可能性があるなど
の欠点がある。また、乳汁の凝固または凝固阻害に上り
乳汁中のプロゲステロンを測定する上記（ｉｉ）及び（
ｉｉｉ）の方法は、乳汁凝固酵素又は乳汁凝固酸素阻害
剤とプロゲステロンを結合する際に、該ｐＨｒｋｔ：対
する基質を介して結合させるという特殊な技術が必要で
あり、実用的ではない。

一方、最近に至って脱脂乳中と血中のプロゲステロン濃
度はほぼ同じ値を示すことが明らかにされ（Ｎａｋａｏ
、　Ｔ、　Ａ、Ｓｕｇｉｈａｓｌ＋ｉ＋　Ｎ、Ｓａｇａ
ｔ　Ｎ。

Ｔ　５ｕｎｏｄａ及びに、Ｋａｗａｔａ、　　［３ｒ、
Ｖｅｔ、　　Ｊ、、　　１３９．１０９．１９８３）、
脱脂乳中のプロゲステロンを直接法酵素免疫検定法で定
量することが報告されている（１野　繁、中尾敏彦、角
田修男、河田啓一部、「家畜繁殖誌」第３０巻第１号１
〜８頁、１９８４年３月）。

酵素免疫法は、前述した放射免疫検定法にみられるよう
な欠点がなく、比較的測定繰作が簡便で安価でもあるた
め、その実用化が強く望まれる。

しかし、酵素免疫検定法による脱脂乳中のプロゲステロ
ンの定量は、放射免疫検定法による場合に比べて測定値
の再現性が悪く、すなわち変動係数が大きく、測定値の
信頼性に欠けるという問題があった。

そこで、本発明者らは、酸素免疫検定法による脱脂乳中
のプロゲステロンの定置法における測定法の信頼性を高
める方法について鋭Ｘ研究を行なった結果、プロゲステ
ロンと抗プロゲステロン抗体との反応を、カゼイン濃度
を１．！ｌＪ量％以下に抑え且つある特定濃度の塩化す
）　Ｕラムの存在下に実施すると、プロゲステロンの検
出感度が向上し、しかも測定値の再現性も者しく殴書さ
れることを見い出し本発明を完成するに至った。

しかして、本発明によれば、ウシ脱脂乳中のプロゲステ
ロンを、抗プロゲステロン抗体又は抗プロゲステロン抗
体及びｆｆ１２抗体と酸Ｘ標識プロゲステロンとを用い
る競合反応を利用した酵素免疫法により定量するに際し
て、プロゲステロンと抗プロゲステロン抗体との反応を
、１．５重量％以下の濃度のカゼイン及び０．０３〜１
．２モル濃度の塩化ナトリウムの存在下に行なうことを
ｖｆ徴とするウシ脱脂乳中のプロゲステロンの定量方法
が提供される。

本発明の方法は、プロゲステロンと抗プロゲステロン抗
体との反応を、 （ａ）　１　、５重量％以下の濃度のカゼイン、及ブ（
ｂ）０．０３〜１．２モル濃度の塩化ナトリウムの存在
下に行なうことを特徴とするものであり、このことを除
けば、本発明の方法は、抗プロゲステロン抗体または抗
プロゲステロン抗体及びｆ：ｔＳ２抗体と酵素標識プロ
ゲステロンとを用いる、それ自体既知の競合反応を利用
した酵素免疫法、例えば、石川栄治他編集酵素免疫測定
法第１２８〜１３７頁　医学書院等の文献に記載の方法
を用いて実施することができる。従って、該Ｍ、素免疫
法の詳細な操作法の説明は上記文献に委ね、ここではそ
の該要を述べるにとどめることを了解されたい。

競合反応を利用した酵素免疫法には人別して第一抗体固
相法と二抗体法の２つの方法があり、それぞれの方法の
概要は次のとおりである：（１）第−抗体固相法 抗プロデステロン抗体を、免疫学的に不活性な固体担体
に担持し、得られる固相化抗プロゲステロン抗体を検体
及びＰＩ！素標識プロゲステロンの混合物に加え、競合
反応させｒこのち、該固相化抗体に結合した抗原と該固
相化抗体に結合しない抗原を分離し、次いで抗原と結合
した固相化抗体に基質を加え酵素反応を行なったのち、
基質の減量、生成物の増量などを指標として酵素活性を
測定し、その測定値を標準曲線に外挿するこにより検体
中のプロゲステロンを定量する。

（２）二抗体法 第一抗体固相法と原理的には同じであり、先ず検体と＃
稟標識プロゲステロンの混合物に抗プロゲステロン抗体
を加え競合反応させる。反応終了後、抗体に結合した抗
原と非結合の抗原を分離するために、上記抗プロゲステ
ロン抗体を作製した動物のγ−グロブリンに対する抗体
（ｆ５２抗体）又は該第２抗体を担体に結合した固相化
第２抗体を加える。生ずる沈澱を採取し、これに前記第
一抗体固相法と同様に基質を加えてＦｉＦ、索反応させ
、その酵素活性測定値を標準曲線に外挿することｔこよ
り検体中のプロゲステロンを定量する。

［検体の調製１ 本発明の方法において使用される検体は、ウシの脱脂乳
である。ウシから採取した乳汁の脱脂は、乳汁を通常２
ｔ０００−５，０００ｒｐｍで１０〜３０分間遠心分離
し、上層のクリーム層と下層の乳泥を分離除去すること
により行なうことがでさ、中間剤として脱脂乳が回収さ
れる。得られる脱脂乳はそのままプロゲステロンの定量
に供することができ、或いは約−８０〜−１０℃で凍結
するこにより保存試料とし、必要に応じて解凍し、プロ
ゲステロンの定量に供するようにしてもよい。後者の場
合、解凍した脱脂乳は必要に応じて、上記の条件下に予
め遠心分離処理を行なってもよい。

脱脂乳は適宜希釈した後、酵素免疫反応に供することが
できる。希釈液としては、本発明に従う抗原抗体反応及
び酵素反応を阻害しない溶液であればいずれのものでも
使用できるが、好ましくは水、０　、　Ｉ　Ｍ　＋７ン
酸４１衝液などが用いられる。

［抗プロゲ入テロンの抗体］ 本発明の方法に使用される抗プロゲステロン抗体は、そ
れ自体既知の方法、例えば特開昭４８−４９９１８号公
報に記載の方法に従い、プロゲステロンそれ自体又はそ
の化学的変性物（この変性物については特公昭５９−６
３８８号公報参照）と抗原性を有する物質、例えばウシ
血清アルブミン（Ｉ３ＳＡ）との結合体よりなる抗原を
、常法により動物に免疫し、抗体力価が所望の値以上に
達したら、抗血清をその動物から採取することによって
製造することができる。この血清を９１造するに際して
使用される該抗原としては例えば、１１α−ヒドロキシ
プロデステロンヘミサクシネ−１Ｂ８Ａ−プロゲステロ
ンベー（０−ｆＪルゼ番レし壬ル）オキシム−ＢＳＡ、
６−ヒトロキシプロデステロンヘミサクシネー１ＢｓＡ
１１（３−ヒドロキシプロゲステロンへミサクシネー）
−ＢＳＡ、プロゲステロン−２０−（０−力ルボキシメ
チル）オ〜ンムーＢＳＡ′！？の他に、プロゲステロン
１こ例えば家兎血清アルブミン（Ｒ３Ａ）又は卵血清ア
ル１ミン（ＥＡ）等を結合させたプロゲステロン−タン
パク貿結合体を使用することもでき、それらを例えばコ
ンプリート７０インドアツユバント等のアクユバントを
併用するとより有効に抗血清が′９１造される。

一方、これら抗原で免疫することのできる動物としては
、通常、家兎、山羊、めん羊、モルモ・ント等の咄乳動
物が使用される。動物から採取し抗血清は、プロゲステ
ロン又はその化学的変性物との結合に用いられる抗原性
を有する物質により吸収し例えばアルフール沈澱又は塩
析等の如き手段によってγ−グロブリンを分画し、抗プ
ロゲステロン抗本を得る。

前記抗原を作製する時に用いる抗原性を有する物質とし
ては、前記のウシ血清アルブミン＜ＢＳＡ）の他に、例
えば家兎血清フルプミン（Ｒ３Ａ）、ヒト血清７ルブミ
ン（ｈＳＡ）、ウシγ−グロブリン、家兎γ−グロブリ
ン、ヒトγ−グロブリン、破傷風毒素、肺炎球菌多糖体
糖を用いることもできる。

［固体担体１ 第一抗体固相法において、抗プロゲステロン抗体を担持
するための免疫学的に不活性な固体担体としては、例え
ば、ポリスチレン、ナイロン、ポリエチレン、ガラス、
アルミナ、などの有機又は無機の固体から成るチ１−プ
、球状体、板状板などが用いられるが、直径３〜８１６
１の球状体を用いるのが好ましい。

該担体への抗プロゲステロン抗体の結合はａＩ！Ｊ埋的
又は化学的のいずれであってもよい。物理的結合は、抗
体溶液と固体担体とを接触させることにより行なうこと
ができ、また、化学的結合は、抗体のアミ７基又はカル
ボキシル基と結合しうるカルボキシル基又はアミ７基を
有する固体担体を抗体とアミド化反応させることにより
行なうことができろ。

［酵素Ｐ５ａプロゲステロン］ 酵′７ｉ、標識プロゲステロンは、プロゲステロン分子
に存在する反応性基を利用して、プロゲステロンにＰｙ
ｌ、累を化学的に結合させたものであり、それ自身既知
の方法で調製することがＣ″きる。例えばプロゲステロ
ンの３位また２０位のカルボニル基をＯ−（カルボキシ
メチル で０−（カルボキシルメチル）オキシムに変換すること
によりカルボキシル基を導入する。或いはプロゲステロ
ンの６位、１１位または１６位などに微生物学的または
化学的な方法により水酸基を導入し、次いで無水コハク
酸と反応させることにより水酸基をヘミサクシネートに
変換する。上記の如くしてカルボキシル基を導入した後
、酸無水物法又はカルボジイミド法などの方法により、
該カルボキシル基に酵素を結合させれば、目的とする酵
素標識プロゲステロンが得られる１石川栄治他編集　酸
素免疫測定法１２８−１３７７Ｘ　医学書院発行参照１
。

ここで用いる酵素標識プロゲステロンは、抗体製造の際
抗原蛋白を結合したと異なる邪侍に酸素を標識したプロ
ゲステロン、例えば抗体を製造するのに１１α−ヒドロ
キシプロゲステロンヘミサクシネートを用いたなら、酵
素を標識するにはプロゲステロン−３−（〇ーカルボキ
シメチル）オキシムを用いるなど、異種のプロゲステロ
ン誘導体を用いるのが好ましい。

［酵　ＸＩ Ｊ−記プロゲステロンの標識に用いうる酵素としては、
脱脂乳成分中に存在する物質によって阻害されず、抗原
−抗体反応に影響を及ぼさずに、かつ酸素活性を失うこ
となくプロゲステロンと結合するものであればいずれの
ものでも良く、例えばβーガラクトシグーゼ、パーオキ
シダーゼ、アルカリホスファターゼ、カラターゼ、グル
フースオキシグーゼ、アセチルコリンエステラーゼなど
が挙げられる。

［基　質１ 本発明で用いられる基質は酵素活性測定法により異なる
ものが用いられる６酵素活性測定法は吸光度法、蛍光法
、化学発光法及び電気化学的方法などが挙げられ、プロ
ゲステロンの測定にはいずれの方法も用いることができ
る。例えば、酵素にパーオキシダーゼを用いた時は、基
質として５−アミノサリチル酸、ｏ−７二二レンジアミ
ン、＋ラミン、３−（ｐ−ヒドロキシフェニル）プロピ
オン酸、ルミノールなどが用いられ；酵素がβ−〃ラク
トシダーゼの場合は、基質として。−二トロ７工／−ル
ーβーＤー〃ラクトピラノシド、４−メチルウンベリフ
ェリールーβ−Ｄ−γラクトピラノシドなどが用いられ
；アルカリホスファターゼを用いる場合には、基質とし
てはｐ−ニトロ７エ７ールリン酸又は４−メチルウンベ
リフェリルリン酸などが挙げることができる。

本発明は、重連したように、以上に述べた競合反応を利
用した酵素免疫法により、ウシ脱脂乳中のプロゲステロ
ンを定量する（こ際して、プロゲステロンと抗プロゲス
テロン抗体との反応を （ａ）　１　、　５　ｍ景％以下の濃度のカゼイン、及
び（ｂ）０．０３〜１．２モル濃度の塩化ナトリウムの
存在下 に行なうことを特徴とするものである。

ここで［プロゲステロンと抗プロゲステロン抗体との反
応］とは、検体である脱脂乳又はプロゲステロン標準液
と酵素標識プロゲステロンを加え混合し、該混合物に抗
プロゲステロン抗体を加え競合反応させることをいう。

検体の脱脂乳は固体差や搾乳時期等にもよるが一般には
２．６−３．５重量％の濃度でカゼインを含んでいる。

従って、カゼイン濃度が１．５重責％以下、好ましくは
０．００３〜１．０＠呈％、さらに好ましくは０．０３
〜０．７５重量％である条件下で一ヒ記反応を行なわせ
るためには、該反応時の反応液中のカゼイン濃度が上記
範囲内となるよう、必要に応じて検体のＩＢＩ！ｉ脂乳
を希釈しておくのが好適である。

一方、上記のプロゲステロンと抗プロゲステロン抗体と
の反応を、上記濃度の塩化ナトリウムの存在下で行なう
ためには、反応時の反応液中の塩化ナトリウム濃度が上
記範囲内になるよう予め計算された量の塩化す）　＋７
ウムを検体である脱脂乳に加えるか、または脱脂乳を希
釈する希釈液に加えればよい。また、予め計算された量
の塩化ナトリウムを酵素標識プロゲステロン溶液に加え
ておけば、脱）ｌ￥を乳の測定及び標準曲線の作成の両
方に用いることができ好都合である。

上記反応時の塩化ナトリウムの好適濃度は０゜０３〜１
．２モル濃度、殊に０．０６〜０．６モル濃度の範囲内
である。

なお、標準曲線の作成は、従来法と同様に、検体の代り
に、脱プロゲステロン脱脂乳及び標準プロゲステロン液
を用いて行なうことができるが、本発明の方法において
は、脱プロゲステロン脱脂乳の代りにカゼインそれ自体
を用いることもできる。勿論、標準曲線の作成に当って
も、プロゲステロンと抗プロゲステロン抗体との反応に
際して、カゼイン濃度及び塩化ナトリウム濃度はそれぞ
れ前記（ａ）及び（ｂ）の範囲内にすべきである。

本発明は脱脂乳中のプロゲステロンの測定法であるが、
本発明で得られる標準曲線を用いて血清中のプロゲステ
ロンを測定することも可能である。

プロゲステロンは乳汁の他、血清に含まれていることも
知られており、臨床検査所などにおいてはウシ乳汁中の
プロゲステロン測定時に血清中のプロゲステロンも測定
しなければならないことが多々生じていた。この時、ウ
シの乳汁中のプロゲステロン測定に使用した標準曲線は
ウシ・の乳汁にしか使用することができず、血清中のプ
ロゲステロンの測定には改めて標準曲線を作成していた
。

血清中のプロゲステロンを測定する時は以下に示すＴ−
備処理を必要とする。

血清に石油エーテル、エチルエーテル、ヘキサンなどの
実質的に水−不混和性のエーテル類又は脂肪族炭化水素
溶媒を加えて約５〜２０分間振盪する。該溶媒層を分取
し、蒸発乾固したのち、１゜５重量％以下のカゼインを
含有する０、ＩＭリンＰｔｌ暖衝漱（ｐＩ−１７，０）
の一定量を加える。該方法１こより得られた血清中のプ
ロゲステロンは脱脂乳中のプロゲステロンを測定したと
同様な方法により測定することができる。かくして得ら
れた値（吸ｉ光度）は、脱脂乳中のプロゲステロンの定
量に用いた標準曲線に外挿することによぞ）血清中のプ
ロゲステロン値を求めることができる。

以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが
、本発明はこれに限定されるものではない。

実施例　１ （１）１１α−ヒドロキシプロデスブロン　ヘミサクシ
ネート−ＢＳＡの構造 １１α−ヒドロキシプロゲステロン　へミサクシネー）
３０ｍｇをＮ、Ｎ−ツメチルホルムアミド０゜７５ｍｇ
に°）８解し、これ５２４°Ｃ以下で）リーｎ−ブナル
アミン１６μ！を添加したのち、イリプチルクロロカー
ボネート８．４μ２を加え３０分間攪拌を続けた。該溶
液に予めＢＳＡ８７ＩＩ１ｇを２．１　ｎｌの精製水に
て溶解し、ＩＮ水酸化す）　＋７ウム液１１２μｌ及び
ジメチルホルムアミド１．５ｍｇを順次加え混合した。

該混合液を８℃で攪拌し、１時間後にＩＮ水酸化ナトリ
ウム液７．５μｌを加え、さらに３．５時間攪拌した６
次いでセファデックスＧ−２５によるデル濾過を行い、
未反応の１１ａ−ヒドロキシプロゲステロン　ヘミサク
シネート及び）’Ｌ−ｎ−ブチルアミン等の低分子試薬
を分離した。次いで該溶液を精製水に対し透析したのち
、凍結乾燥して１１α−ヒドロキシプロゲステロン　ヘ
ミサクシネート−ＢＳＡを粉末として得た。

（２）抗プロゲステロン抗体の製造 上記（１）で製造した１１α−ヒドロキシプロゲステロ
ン　へミサクシネー）−ＢＳＡ　　１ａ＋ｇを０゜５鎖
ｅの生理食塩液に溶解し、それにコンプリート７０イン
ドアツユバント１ｍｌを加えて充分に混和し、家兎の皮
下に注射した。この注射を３週間隔で行い、抗体価の上
昇を確認後全採ｄ１Ｌ血清を分離後−７０℃で保存した
。

（３）　抗プロゲステロン抗体担持ビーズの製造上記（
２）で得た抗血清より硫安分画法によりＩＢＧを分離し
、そのＩｇＧ１帰ｇを０．１Ｍリン酸榎衝液（ｐＨ７，
０）１．０００ｃａｌに溶解した。該溶解液に２０００
個のポリスチレンビーズ（直径６ｍｍ）を加え、４℃で
２４時ｎｉ１ゆるやかに攪拌した。反応終了後、ポリス
チレンビーズを上記した緩衝液で洗浄し、次いで０．１
％Ｂ　Ｓ　Ａ含有０．１ＭＩＪン酸緩衝液（ｐｉ−１７
、０）に加え冷所に保存した。

（４）　　プロゲステロン−３−（ｏ−カルボキシメチ
ル）オキシム−β−Ｄ４ラクトシグーゼの製造プロゲス
テロン−３−（ｏ−カルボキシメチル）オキシム２．０
ｍｇをジオキサンに溶解し、３．０ｔａｇのカルボッイ
ミド及び２　、０　ｍｇのＮ−ヒドロキシサクシンイミ
ドを加え、室温で２時間インキニベートした。反応終了
後、１１ａ１の水を加えたのち軽く振盪し次いで１．Ｏ
ｍｌの酢酸エチルで抽出する。酢酸エチル層を分取した
のち蒸発留去し、次いでジクロルメタン１０ＩＩ１１を
加え溶解し、活性エステルのモル濃度を吸光度（２４Ｏ
ｎＬ１）測定により求めた。ジクロルメタンを蒸発留去
したのち、ジオキサン５−１を加え溶解し、その２００
μｌにモル比１／８０となるように０．１Ｍリンａａ衝
液（ｐＨ７。

０）に溶解したβ−がラクトシグーゼ１．０檀ｌを加え
水中２時間穏やかに攪拌した０反応混合物を０゜１　Ｍ
　＋７ン酸緩衝液（ｐｌ−１７、０）に対して透析した
のち透析内液を採取し、プロゲステロン−３−（０−力
ルポキシメチル）オキシム−β−Ｄ−〃ラクトシグーゼ
を得た。

（５）　標準曲線の作成 下記＠１表に示したプロゲステロンとなるように０．０
３％カゼイン含有０．１リンＭ酸促衝液（ｐＨ７，０＞
を希釈液として用いて希釈系列を作製し、次に示す方法
により標準曲線を作成した。

（ａ）　　各小試験管に各濃度の標準溶液をそれぞれ１
００μｒずつ採取し、これに上記（４）で製造ＬＪ：０
．２８Ｍ塩化テＦリウム含有プロゲステロン−３−（ｏ
−カルボキシメチル ラクトシグーゼ溶液１００μｅを加え混合した。

（ｂ）　　上記混合液に上記（３）で製造した抗プロゲ
ステロン抗体担持ビーズを１個ずつ加え、２〜１０°Ｃ
で９０分間インキュベーションした。

（ｃ）　　反応終了後、水冷した０．１５Ｍ塩化ナトリ
ウム溶液約２＋１１を加え、軽く振盪後アスピレータ−
で溶液を吸引除去する。この操作を再度繰り返す。

（ｄ）　　次いで、１０ｍＭｏ−二トロフェノールーβ
ーＤーｆｆラクトビラノンド溶液５００μ２を採取し、
各小試験管に加え攪拌したのち、３７゛Ｃで４５分Ｉ′
１１静置した。

（ｃ）　　Ｏ．］Ｍ炭酸ナトリウム溶ｉ２，Ｏ＋ａ５を
加え酵素反応を停止し、分光光度計を用い４２０ｒ＋ｍ
で吸光度を測定した。その結果をｍｌｉ及ｒＪ第１図に
示す。

第１表 （６）脱脂乳中プロゲステロンの測定 非妊娠の牛より１性周期にわたって約２０日問毎日早朝
に搾乳し、その牛乳を３０００・ｒｐｍで２０分間遠心
分離し脂肪を除去した。該脱脂乳５０μ！に精製水５０
μｌを加え希釈したのち、上記（４）で得た０、２８Ｍ
塩化ナトリウム含有プロゲステロン−３−（ｏ−カルボ
キシメチルＤーｆｆラクトシグーゼ溶ｗＬ１００μｒを
加え混合したのち、上記（３）で製造した抗プロゲステ
ロン抗体担持ビーズを１個加え、２〜１０℃で９０分間
静置した．次いで水冷した０．１５Ｍ塩化ナトリウム溶
液約２鴫ｌを加え軽く振盪後アスピレータ−で溶液を吸
引除去した。該操作を再度繰り返したのち、１０輸Ｍｏ
ーニトロ７エ／ールーβ−Ｄ−〃ラクトピラ／シト溶ｇ
ｓｏｏμｉを試験管に加え攪拌し、３７℃で３０分間静
置した。０．１Ｍ炭酸す）　＋７ウム溶ｗＬ２．０ＩＩ
ｌｌを加え反応を停止したのち、反応液を４２Ｏｎ＋ｓ
の波長で吸光度を測定した。

得られた吸光度の値を上記（５）で作成した標準曲線に
外挿し、脱脂乳中のプロゲステロン呈を測定した。その
結果をｔＩＳ２図に示す。

その際コントロールとして同じ脱脂乳から石油エーテル
で抽出したプロゲステロンを検体として、ラジオイムノ
アッセイ法（Ｇ　、　Ｅ　、Ａ　ｂｒａｌ＋ａｎ　ｅｔ
　ａｌ。

Ｊ．ＣＩｉｎ．　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ，　ＭｅＬａｂ
．　Ｖｏ１３　２　　６　１９（１９７１）参照）によ
る測定を行った。その結果も第２図に併せて示す。

【図面の簡単な説明】

ｆＩＳ１図は各濃度のプロゲステロン標準液を用いて得
られたプロゲステロンの標準曲線であり、縦紬は４２０
ｎｍにおける吸光度を示す。 第２図は本願発明方法及びラジオイムノアッセイ法よる
脱脂乳中のプロゲステロン測定結果であり、実線は本願
発明方法、破線はラジオイムノアッセイ法により得られ
た値を示す。 手続補正書（自発） 昭和６２年６月１３日

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、ウシ脱脂乳中のプロゲステロンを、抗プロゲステロ
   ン抗体又は抗プロデステロン抗体及び第２抗体と酵素標
   識プロゲステロンとを用いる競合反応を利用した酵素免
   疫法により定量するに際して、プロゲステロンと抗プロ
   ゲステロン抗体との反応を、１．５重量％以下の濃度の
   カゼイン及び０．０３〜１．２モル濃度の塩化ナトリウ
   ムの存在下に行なうことを特徴とするウシ脱脂乳中のプ
   ロゲステロンの定量方法。