CN111175499A - 一种用于检测睾酮素的elisa试剂盒的制备方法 - Google Patents

一种用于检测睾酮素的elisa试剂盒的制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111175499A
CN111175499A CN202010127257.9A CN202010127257A CN111175499A CN 111175499 A CN111175499 A CN 111175499A CN 202010127257 A CN202010127257 A CN 202010127257A CN 111175499 A CN111175499 A CN 111175499A
Authority
CN
China
Prior art keywords
testosterone
solution
washing
hapten
antigen
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010127257.9A
Other languages
English (en)
Inventor
孙秀兰
高璐
纪剑
张银志
孙嘉笛
徐诗荧
王利平
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangnan University
Original Assignee
Jiangnan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangnan University filed Critical Jiangnan University
Priority to CN202010127257.9A priority Critical patent/CN111175499A/zh
Publication of CN111175499A publication Critical patent/CN111175499A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/535—Production of labelled immunochemicals with enzyme label or co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or enzyme substrates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明公开了一种用于检测睾酮素的ELISA试剂盒的制备方法，属于免疫分析快速检测技术领域。该试剂盒包括孔板、框架、吸水纸、滴管、试剂、说明书，睾酮单克隆抗体、辣根过氧化酶标记羊抗鼠抗体、睾酮标准溶液、底物液、显色液、终止液、浓缩洗涤液。本发明采用间接竞争ELISA检测方法，采用鸡卵清蛋白偶联肟化后的睾酮和高特异性睾酮单克隆抗体检测特异性强，检测范围宽，假阳性率低，可实现快速定量检测，且灵敏度高、误差小，为及时检测提供了极大的便利，能够真正地解决市场需要，适用于食品工业、环境保护和生物化学等领域。

Description

一种用于检测睾酮素的ELISA试剂盒的制备方法
技术领域
本发明涉及一种用于检测睾酮素的ELISA试剂盒的制备方法，属于免疫分析快速检测技术领域。
背景技术
类固醇激素(Steroid hormone)是生物体内产生的一类调节机体代谢功能的微量物质，又称化学信息素。此类物质有较强的蛋白质同化作用，可以提高蛋白质沉积，降低脂肪含量，从而提高饲料转化效率。睾酮(Testosterone，T)是哺乳动物体内常见的具有雄激素作用的类固醇激素。
睾酮可以增加肌肉含量，提高骨骼强度，并在雄性生殖器官的发育中发挥重要作用，因而在临床医学中得到应用。由于睾酮具有促进动物体内营养物质沉积和改善生产的作用，因此在畜牧业上被用作动物饲料添加剂，用以促进动物生长，提高产量，养殖场使用睾酮激素后，可以提高经济效益。外源性睾酮也被运动员非法使用，以提高比赛成绩。然而，长期摄入睾酮类激素会导致消费者内分泌紊乱、性早熟，大大增加致癌、致畸的风险。因此，自1986年以来，欧盟委员会就禁止在肉食性动物养殖中以促进生长为目的使用自然或人工合成的激素，以保护消费者可能因食用激素的残留物或其代谢物而引起的发育问题、神经问题、遗传毒性和癌症问题。
睾酮传统的理化检测方法包括液相色谱-质谱(LC-MS)和气相色谱-串联质谱(GC-MS/MS)等方法。这些方法灵敏度高、特异性强，但样品前处理繁琐，不适合大批量的市场监测要求。而免疫学检测方法建立在抗体对抗原的分子识别上，其主要优点是亲合力高、快速、简单、经济实用，能够实现对生物液体的小体积、大批量检测，逐渐成为世界各国有毒有害残留物快速检测的方法之一。
现有王武康等发明的一种检测去甲睾酮(诺龙)的直接竞争酶联免疫测定试剂盒，其提供去甲睾酮抗原合成方案，并用免疫原免疫新西兰大白兔获得去甲睾酮多抗，通过直接竞争酶联免疫测定。其缺点是多抗不具有特异性且不能检测睾酮。
现有何翠红等发明的一种检测人血清中总睾酮的方法，其通过对样品加入内标液，后进行蛋白沉淀并萃取待测物，离心后干燥，再加入复溶剂，对待测样品用高通量的液相色谱串联四级杆质谱仪进行检测。其缺点是样品处理复杂，成本高，耗时长，对实验者操作仪器的要求较高，不能满足目前食品安全检测的快速筛查要求。
现有何庆华等发明的一种用于睾酮残留检测的试剂盒及其制备方法和检测方法，其将肟化的睾酮与牛血清蛋白偶联，包被在微孔上，进行酶联免疫检测。其缺点是BSA本身会产生抗体，特异性抗体会呈假阳性反应。
因此现有技术还有待于改进和发展。
发明内容
技术问题：
针对现有技术存在的上述不足，本发明提供了一种检测睾酮素的ELISA试剂盒的制备方法。本发明采用间接竞争酶联免疫法，通过读取酶标仪检测出的OD值，对样品中睾酮进行定性分析，并快速定量检测动物源性食品中的睾酮。
技术方案：
本发明第一个目的是提供一种检测睾酮素的ELISA试剂盒，所述试剂盒包括孔板、框架、吸水纸、滴管、试剂，其中，所述孔板中包被睾酮半抗原与鸡卵清蛋白偶联得到的完全抗原，所述试剂包括睾酮单克隆抗体、辣根过氧化酶标记羊抗鼠抗体、睾酮标准溶液、底物液、显色液、终止液、浓缩洗涤液。
在本发明的一种实施方式中，所述底物液由醋酸钠、柠檬酸、双氧水配制而成；所述显色液为乙二胺四乙酸；所述终止液为硫酸溶液；所述浓缩洗涤液为含吐温-80的磷酸盐缓冲液。
在本发明的一种实施方式中，所述方法包括如下步骤：
(1)睾酮标准品肟化后得到睾酮半抗原；
(2)将步骤(1)中的睾酮半抗原与鸡卵清蛋白偶联得到睾酮包被抗原，将步骤(1)中的睾酮半抗原与牛血清蛋白偶联得到睾酮免疫抗原；
(3)利用步骤(2)中的睾酮免疫抗原免疫小鼠得到睾酮特异性单克隆抗体；
(4)将步骤(2)中的睾酮包被抗原包被在孔板上。
在本发明的一种实施方式中，所述试剂盒的制备方法，其中，步骤(1)包括以下步骤：
将睾酮标准品溶于无水吡啶，加入睾酮标准品1.5-2倍物质的量的羧甲基羟胺半盐酸，45-55℃搅拌反应30-40min，减压蒸馏去吡啶；残余物用乙酸乙脂溶解，加水洗涤，取上层油样，加入无水硫酸钠干燥，减压蒸馏去乙酸乙脂，残余物用乙醚重结晶捣碎得到睾酮半抗原。
优选地，步骤(1)具体包括以下步骤：
将1mmol睾酮标准品溶于无水吡啶，加入2mmol羧甲基羟胺半盐酸，50℃搅拌反应30min，减压蒸馏去吡啶。残余物用乙酸乙脂溶解，加适量水洗，取上层油样，加入少量无水硫酸钠干燥，减压蒸馏去乙酸乙脂，残余物用乙醚重结晶捣碎得到睾酮半抗原。
在本发明的一种实施方式中，所述试剂盒的制备方法，其中，步骤(2)包括以下步骤：
A液：睾酮半抗原用N，N二甲基甲酰胺搅拌溶解，加入三乙胺，3-5℃下反应1-1.5h，加人氯甲酸异丁脂，继续反应l-1.5h；
B液：BSA、OVA分别溶于磷酸盐缓冲液中，加入N，N二甲基甲酰胺，3-5℃下搅拌反应1-1.5h；
制备A液和B液，将A液逐滴滴加在B液中，3-5℃条件下反应4-5h；先后用磷酸缓冲液和蒸馏水透析2-2.5d，期间多次换液，冷冻干燥保存。
优选地，步骤(2)具体包括以下步骤：
A液：睾酮半抗原用N，N二甲基甲酰胺搅拌溶解，加入三乙胺，4℃下反应1h，加入氯甲酸异丁脂，继续反应l h；
B液：BSA、OVA分别溶于磷酸盐缓冲液中，加入N，N二甲基甲酰胺，4℃下搅拌反应1h；
将A液逐滴滴加在B液中，4℃条件下反应4h。先后用磷酸缓冲液和蒸馏水透析2d，期间多次换液，冷冻干燥-20℃保存即可。
在本发明的一种实施方式中，所述试剂盒的制备方法，其中，步骤(4)包括以下步骤：用碳酸盐缓冲液稀释睾酮包被抗原，滴加在孔板中，35-40℃孵育2-3h后倒去包被液，洗涤液清洗后拍干，封闭液滴加在孔板中，35-40℃孵育2-3h后洗涤拍干，其中，所述封闭液为牛血清蛋白溶液。
优选地，步骤(4)具体包括以下步骤：
用碳酸盐缓冲液稀释睾酮包被抗原，滴加在孔板中，37℃孵育2h后倒去包被液，洗涤液清洗后拍干，封闭液滴加在孔板中，37℃孵育2h后洗涤拍干，其中，所述封闭液为牛血清蛋白溶液。
本发明的第二个目的是利用上述试剂盒提供一种检测睾酮的方法，所述方法包括如下步骤：
将标准品或样品加入孔板，后加入睾酮单克隆抗体，35-40℃孵育1-1.5h后洗涤拍干，每孔加入酶标二抗，35-40℃孵育30-40min后洗涤拍干，每孔先后加入底物液和显色液，15-20min后加终止液，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处测定每孔OD值。
优选地，所述方法具体包括：将标准品或样品加入孔板，后加入50μL睾酮单克隆抗体，37℃孵育1h后洗涤拍干，每孔加入酶标二抗，37℃孵育30min后洗涤拍干，每孔先后加入底物液和显色液，15min后加终止液，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处测定每孔OD值。
本发明的有益效果：
(1)本发明方法能够实现定量测定睾酮含量，特异性强、灵敏度高，其中当睾酮浓度为1μg/L～25μg/L时，睾酮浓度的对数值与B/B0值成线性关系，线性方程为Y＝0.59-0.39LogX，R2＝0.9956，检测限可达到0.2617μg/L。
(2)本发明采用间接竞争ELISA检测方法，采用鸡卵清蛋白偶联肟化后的睾酮和高特异性睾酮单克隆抗体，检测特异性强，检测范围宽，假阳性率低，可实现快速定量检测，且灵敏度高、误差小，为及时检测提供了极大的便利。
(3)本发明制备的试剂盒是一种能够真正地解决市场需要，精确度高，稳定性强，操作简单，可重复性高，能够满足工商部门、质检机构、科研高校等检测机构需要的快速检测产品，可供各类粮食谷物加工企业、第三方检测机构、各级政府监管部门等的使用，适用于食品工业、环境保护和生物化学等领域。
附图说明
图1：睾酮标准品、OVA标准品、睾酮半抗原、睾酮包被抗原红外光谱；
图2：睾酮标准品、OVA标准品、睾酮包被抗原紫外光谱；
图3：OVA标准品、睾酮包被抗原SDS-PAGE电泳图；
图4：睾酮ELISA检测试剂盒标准曲线；
图5：睾酮ELISA检测试剂盒的稳定性结果。
具体实施方式
实施例1：睾酮的肟化
具体制备方法如下：
用高浓度反应液一步合成法将睾酮肟化：睾酮标准品溶于无水吡啶，加入羧甲基羟胺半盐酸，50℃搅拌反应后减压蒸馏去吡啶。残余物用乙酸乙脂溶解，加适量水洗，取上层油样，加入少量无水硫酸钠干燥，减压蒸馏去乙酸乙脂，残余物用乙醚重结晶捣碎得到肟化后的睾酮半抗原，于-20℃保存。
将肟化后的睾酮半抗原作红外光谱检测：取样品加入干燥的KBr置于玛瑙乳钵中，在红外灯照射下研磨、混匀，装压片模具在8000N压力下加压，制得厚度1mm的透明KBr样品晶片，上机检测。由图1可知，睾酮标准品在3300cm-1处有一个强吸收峰，这是羟基的特征峰，而人工抗原T-OVA无此吸收峰，表明半抗原衍生化成功。同时，OVA和T-OVA免疫原在2500～3200cm-1和1660～1500cm-1的区域内具有相似的吸收峰，这是OVA中氨基酸的特征峰，说明合成的包被原中含有OVA证明T-OVA中含有睾酮。据此确定T-OVA人工抗原偶联成功。
实施例2：睾酮人工抗原的合成
具体合成方法如下：
将肟化后的睾酮半抗原与OVA偶联，得到睾酮包被抗原：睾酮半抗原用N，N二甲基甲酰胺搅拌溶解，加入三乙胺，4℃下反应后加入氯甲酸异丁脂，继续反应；OVA溶于磷酸盐缓冲液中，加入N，N二甲基甲酰胺，4℃下搅拌反应，逐滴滴加上面反应好的产物，4℃条件下反应。先后用磷酸缓冲液和蒸馏水透析，期间多次换液，冷冻干燥即得到偶联蛋白后的睾酮人工抗原。
将睾酮、OVA标准品以及制备好的睾酮人工抗原稀释至一定浓度后进行紫外扫描光谱鉴定，在200-400nm波长范围内检测其特征吸收峰。由图2可知，睾酮半抗原在255nm处有典型吸收，OVA在280nm处有最大吸收峰，而T-OVA包被原的最大吸收峰则位于220nm处，这说明睾酮人工抗原偶联物最大吸收峰发生蓝移，并与其前体物质有不同的紫外吸收特征，初步表明偶联成功。
将OVA标准品以及制备好的睾酮人工抗原压片进行红外光谱检测：由图1可知，OVA和T-OVA免疫原在2500～3200cm-1和1660～1500cm-1的区域内具有相似的吸收峰，这是OVA中氨基酸的特征峰，说明合成的包被原中含有OVA证明T-OVA中含有睾酮。
所得完全抗原SDS-PAGE电泳图如图3所示，由图可得OVA的条带相比T-OVA的条带较深且宽，向下移动的距离稍远，表明T-OVA的迁移速率比OVA的迁移速率小，偶联后的包被原的分子质量比载体OVA的分子质量大，证明偶联抗原制备成功。
实施例3：睾酮ELISA检测试剂盒标准曲线的绘制
标准曲线的绘制方法是：
将实施例2制得的睾酮包被抗原用碳酸盐缓冲液稀释，滴加在孔板中，37℃孵育2h后倒去包被液，洗涤液清洗后拍干，按照睾酮标准品浓度为0ppb、1ppb、5ppb、10ppb、20ppb、25ppb系列浓度滴加标准品，后加入50μL睾酮单克隆抗体，37℃孵育1h后洗涤拍干，每孔加入酶标二抗，37℃孵育30min后洗涤拍干，每孔先后加入底物液和显色液，15min后加终止液，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处测定每孔OD值。
如图4所示为OD值随睾酮标准品浓度的变化曲线，当睾酮浓度为1μg/L～25μg/L时，睾酮浓度的对数值与B/B0值成线性关系，线性方程为Y＝0.59-0.39LogX，R2＝0.9956，检测限可达到0.2617μg/L。
实施例4：睾酮ELISA检测试剂盒稳定性测试
用碳酸盐缓冲液稀释睾酮包被抗原，滴加在孔板中，37℃孵育2h后倒去包被液，洗涤液清洗后拍干，封闭液滴加在孔板中，37℃孵育2h后洗涤拍干，待孔板晾干后真空包装，于-20℃保存。分别于第3天、第7天、第10天、第14天按照实施例5的方法进行检测。如图5所示，试剂盒稳定性良好。
实施例5：样品的制备与处理方法
取样品(猪肉)均质物加入乙腈，充分振荡，后离心取上清液，加入QuEChERS净化粉(无水硫酸镁500mg、中性氧化铝500mg、PSA200mg)，混匀后离心取上清，在56℃条件下氮吹至全干，加入甲醇-PBS混合溶液振荡，取混合后溶液用于分析实验。
实施例6：睾酮ELISA检测试剂盒的制备与检测方法
用碳酸盐缓冲液稀释睾酮包被抗原，滴加在孔板中，37℃孵育2h后倒去包被液，洗涤液清洗后拍干，封闭液滴加在孔板中，37℃孵育2h后洗涤拍干，待孔板晾干后真空包装。
每个试剂盒包括孔板、框架、吸水纸、滴管、试剂、说明书，睾酮单克隆抗体、辣根过氧化酶标记羊抗鼠抗体、睾酮标准溶液、底物液、显色液、终止液、浓缩洗涤液。其中，孔板中包被睾酮半抗原与鸡卵清蛋白偶联得到的完全抗原。
其中，底物液由醋酸钠、柠檬酸、双氧水配制而成；显色液为乙二胺四乙酸；终止液为硫酸溶液；所述浓缩洗涤液为含吐温-80的磷酸盐缓冲液。
试剂盒具体检测方法：将标准品或样品加入孔板，后加入50μL睾酮单克隆抗体，37℃孵育1h后洗涤拍干，每孔加入酶标二抗，37℃孵育30min后洗涤拍干，每孔先后加入底物液和显色液，15min后加终止液，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处测定每孔OD值。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种用于检测睾酮素的ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括孔板、框架、吸水纸、滴管、试剂，其中，所述孔板中包被睾酮半抗原与鸡卵清蛋白偶联得到的完全抗原，所述试剂包括睾酮单克隆抗体、辣根过氧化酶标记羊抗鼠抗体、睾酮标准溶液、底物液、显色液、终止液、浓缩洗涤液。
2.根据权利要求1所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述底物液由醋酸钠、柠檬酸、双氧水配制而成。
3.根据权利要求1所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述显色液为乙二胺四乙酸。
4.根据权利要求1所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述终止液为硫酸溶液。
5.根据权利要求1-4任一所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述浓缩洗涤液为含吐温-80的磷酸盐缓冲液。
6.权利要求1所述ELISA试剂盒的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)睾酮标准品肟化后得到睾酮半抗原；
(2)将步骤(1)中的睾酮半抗原与鸡卵清蛋白偶联得到睾酮包被抗原，将步骤(1)中的睾酮半抗原与牛血清蛋白偶联得到睾酮免疫抗原；
(3)利用步骤(2)中的睾酮免疫抗原免疫小鼠得到睾酮特异性单克隆抗体；
(4)将步骤(2)中的睾酮包被抗原包被在孔板上。
7.根据权利要求6所述试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤(1)包括以下步骤：
将睾酮标准品溶于无水吡啶，加入睾酮标准品1.5-2倍物质的量的羧甲基羟胺半盐酸，45-55℃搅拌反应30-40min，减压蒸馏去吡啶；残余物用乙酸乙脂溶解，加水洗涤，取上层油样，加入无水硫酸钠干燥，减压蒸馏去乙酸乙脂，残余物用乙醚重结晶捣碎得到睾酮半抗原。
8.根据权利要求6所述试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤(2)包括以下步骤：
A液：睾酮半抗原用N，N二甲基甲酰胺搅拌溶解，加入三乙胺，3-5℃下反应1-1.5h，加人氯甲酸异丁脂，继续反应l-1.5h；
B液：BSA、OVA分别溶于磷酸盐缓冲液中，加入N，N二甲基甲酰胺，3-5℃下搅拌反应1-1.5h；
制备A液和B液，将A液逐滴滴加在B液中，3-5℃条件下反应4-5h；先后用磷酸缓冲液和蒸馏水透析2-2.5d，期间多次换液，冷冻干燥保存。
9.根据权利要求6所述试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤(4)包括以下步骤：
用碳酸盐缓冲液稀释睾酮包被抗原，滴加在孔板中，35-40℃孵育2-3h后倒去包被液，洗涤液清洗后拍干，封闭液滴加在孔板中，35-40℃孵育2-3h后洗涤拍干，其中，所述封闭液为牛血清蛋白溶液。
10.权利要求1所述试剂盒的检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
将标准品或样品加入孔板，后加入睾酮单克隆抗体，35-40℃孵育1-1.5h后洗涤拍干，每孔加入酶标二抗，35-40℃孵育30-40min后洗涤拍干，每孔先后加入底物液和显色液，15-20min后加终止液，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处测定每孔OD值。
CN202010127257.9A 2020-02-28 2020-02-28 一种用于检测睾酮素的elisa试剂盒的制备方法 Pending CN111175499A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010127257.9A CN111175499A (zh) 2020-02-28 2020-02-28 一种用于检测睾酮素的elisa试剂盒的制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010127257.9A CN111175499A (zh) 2020-02-28 2020-02-28 一种用于检测睾酮素的elisa试剂盒的制备方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111175499A true CN111175499A (zh) 2020-05-19

Family

ID=70653293

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010127257.9A Pending CN111175499A (zh) 2020-02-28 2020-02-28 一种用于检测睾酮素的elisa试剂盒的制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111175499A (zh)

Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040171069A1 (en) * 2001-05-14 2004-09-02 Cook Christian John Kinetic assay
CN101105498A (zh) * 2007-08-08 2008-01-16 中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所 人、大鼠、小鼠hsp70双抗夹心法检测试剂盒
US20090286266A1 (en) * 2005-06-13 2009-11-19 Centro De Investigacion En Materiales Avanzados Cimav Method of Determining The Sex of Birds, Reptiles and Mammals Using Steroid Hormones
CN102585007A (zh) * 2012-02-27 2012-07-18 华中农业大学 用于检测β-胡萝卜素类色素的单克隆抗体及酶联免疫方法与试剂盒
CN102633864A (zh) * 2012-03-28 2012-08-15 南方医科大学 一种gpc3抗原多肽，抗gpc3的多克隆抗体及其应用
CN102998461A (zh) * 2012-11-19 2013-03-27 杭州市质量技术监督检测院 乳及蛋白饮品中小麦球蛋白快速定性检测试剂及制备方法
CN103048444A (zh) * 2012-11-29 2013-04-17 塔里木大学 一种家兔抗苦马豆素抗体的elisa检测方法及试剂盒
CN103116031A (zh) * 2013-02-20 2013-05-22 河南科技学院 一种群勃龙残留快速检测试纸卡及其制备方法
CN107015010A (zh) * 2017-06-09 2017-08-04 深圳大学 一种用于睾酮残留检测的试剂盒及其制备方法和检测方法
CN109061147A (zh) * 2018-09-21 2018-12-21 中国烟草总公司郑州烟草研究院 一种检测二甲戊灵的试纸条及其制备方法和应用
CN110305139A (zh) * 2019-06-14 2019-10-08 深圳市疾病预防控制中心（深圳市卫生检验中心、深圳市预防医学研究所） 毒黄素半抗原、人工抗原、抗体及其合成方法和应用

Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040171069A1 (en) * 2001-05-14 2004-09-02 Cook Christian John Kinetic assay
US20090286266A1 (en) * 2005-06-13 2009-11-19 Centro De Investigacion En Materiales Avanzados Cimav Method of Determining The Sex of Birds, Reptiles and Mammals Using Steroid Hormones
CN101105498A (zh) * 2007-08-08 2008-01-16 中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所 人、大鼠、小鼠hsp70双抗夹心法检测试剂盒
CN102585007A (zh) * 2012-02-27 2012-07-18 华中农业大学 用于检测β-胡萝卜素类色素的单克隆抗体及酶联免疫方法与试剂盒
CN102633864A (zh) * 2012-03-28 2012-08-15 南方医科大学 一种gpc3抗原多肽，抗gpc3的多克隆抗体及其应用
CN102998461A (zh) * 2012-11-19 2013-03-27 杭州市质量技术监督检测院 乳及蛋白饮品中小麦球蛋白快速定性检测试剂及制备方法
CN103048444A (zh) * 2012-11-29 2013-04-17 塔里木大学 一种家兔抗苦马豆素抗体的elisa检测方法及试剂盒
CN103116031A (zh) * 2013-02-20 2013-05-22 河南科技学院 一种群勃龙残留快速检测试纸卡及其制备方法
CN107015010A (zh) * 2017-06-09 2017-08-04 深圳大学 一种用于睾酮残留检测的试剂盒及其制备方法和检测方法
CN109061147A (zh) * 2018-09-21 2018-12-21 中国烟草总公司郑州烟草研究院 一种检测二甲戊灵的试纸条及其制备方法和应用
CN110305139A (zh) * 2019-06-14 2019-10-08 深圳市疾病预防控制中心（深圳市卫生检验中心、深圳市预防医学研究所） 毒黄素半抗原、人工抗原、抗体及其合成方法和应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JURASEK, M等: "Highly sensitive avidin-biotin ELISA for detection of nandrolone and testosterone in dietary supplements", 《DRUG TESTING AND ANALYSIS》 *
刘丽强: "动物源性食品中违禁促生长激素的免疫快速检测技术研究", 《中国博士学位论文全文数据库工程科技Ⅰ辑》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1811443A (zh) 一种检测19－去甲睾酮的方法及其专用酶联免疫试剂盒
CN101614747A (zh) 泌乳素时间分辨免疫荧光分析法及试剂盒
CN1153908A (zh) 一种检测黄曲霉毒素b1的试剂盒及其检测方法
CN105759045A (zh) 一种针对黄曲霉毒素b1的检测方法
CN109180519B (zh) 一种喹乙醇代谢物抗原、抗体及酶联免疫检测试剂盒与检测方法
CN101614748A (zh) 促卵泡激素时间分辨免疫荧光分析法及试剂盒
CN110133306A (zh) 检测西马特罗的酶联免疫试剂盒及其应用
CN105759044A (zh) 一种针对黄曲霉毒素m1的检测方法
CN111175499A (zh) 一种用于检测睾酮素的elisa试剂盒的制备方法
Li et al. Rapid determination of chloramphenicol residues in aquaculture tissues by immunochromatographic assay
CN101561439A (zh) 一种呋喃妥因残留酶联免疫检测试剂盒
CN108359642B (zh) 一种虾原肌球蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞及其应用
CN102998464A (zh) 脱氢表雄酮酶联免疫吸附测定试剂盒的研制方法
CN110058028A (zh) 一种24,25-双羟基维生素d免疫检测试剂盒及其应用
CN111377888B (zh) 一种闹羊花毒素iii半抗原及其制备方法与应用
CN115160282A (zh) 桔青霉素半抗原及其制备方法、人工抗原、酶联免疫试剂盒与检测方法
CN109628409B (zh) 一种分泌抗莱克多巴胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
CN112142756A (zh) 黄曲霉毒素m1半抗原与全抗原制备及其快速转移定量试剂盒制备与应用
CN109061168B (zh) 检测地克珠利的酶联免疫试剂盒及其应用
CN117069580B (zh) 一种三氯生半抗原及其制备方法和应用
CN113582923A (zh) 一种喹哪啶半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法与应用
CN113109325A (zh) 一种胃蛋白酶原i酶促化学发光检测试剂盒及其制备方法与应用
CN103163302B (zh) 一种采用定向交叉偶联技术制备的短肽抗体试剂盒
CN118271235B (zh) 农产品中二硫代氨基甲酸酯类农药的快速检测方法及其检测装置
CN113125728A (zh) 一种检测杂色曲霉毒素的酶联免疫试剂盒制备

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20200519

RJ01 Rejection of invention patent application after publication